KR101957336B1 - 동물성 오일 발효물을 포함하는 수중유형 에멀젼 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

동물성 오일 발효물을 포함하는 수중유형 에멀젼 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물성 오일 발효물을 포함하는 수중유형 에멀젼 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 수중유형 에멀젼 조성물은 동물성 오일 발효물을 포함하여 항주름, 항염증 및 항산화 효과를 나타내며, 특정 수성 성분을 일정 함량비로 포함하여 보습효과를 나타낸다.
또한, 본 발명에 따른 수중유형 에멀젼 조성물은 동물성 오일 발효물과 특정 수성 성분 및 비이온성 계면활성제를 일정 함량비로 포함하여 전상온도법(PIT)을 사용한 단순한 공정만으로 나노화할 수 있고, 나노화될 경우 피부 흡수율 및 유화 안정성이 증가되어 기능성 화장료 소재로 사용될 수 있는 효과가 있다.
나아가, 본 발명에 따른 제조방법은 일정 범위의 나노 입자 크기와 유화 안정성이 확보된 수중유형 에멀젼 조성물을 얻을 수 있는 효과가 있다.

Description

동물성 오일 발효물을 포함하는 수중유형 에멀젼 조성물 및 이의 제조방법{An oil-in-water type emulsion composition containing fermented product of animal oil and method of manufacturing thereof}
본 발명은 동물성 오일 발효물을 포함하는 수중유형 에멀젼 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
동물성 오일이란 동물로부터 얻어진 기름을 의미하는 것으로, 동물 유지, 동물성 지방 등으로도 불린다.
최근, 식물성 원료 화장품에 이어 동물성 원료 화장품에 대한 관심이 증가되고 있는데, 동물성 원료의 경우 사람 피부와 가장 유사한 조직 구조를 가져 영양분이 빠르고 안전하게 흡수되는 장점이 있기 때문이다.
이에 따라, 동물성 오일의 기능을 향상시켜 양질의 오일을 만들기 위한 기술들이 개발되고 있는데, 한국 등록특허 제10-1768058호에서는 표면 장력이 감소하여 유화 활성이 증진된 미생물에 의해 발효된 동물성 오일 발효물을 개시하고 있다.
한편, 화장품의 기능을 확보하기 위해서는 수용성 성분, 유용성 성분, 분말 등 다양한 물질을 혼합하여 제재화 하여야 하기 때문에 에멀젼의 형태를 취하는 경우가 많고, 다양한 사용 목적과 사용 방법을 만족시키기 위해 여러가지 유화기술이 필수적으로 발전되고 있다.
이 중, PIT(Phase Inversion Temperature) 유화방법은 전상온도 유화라고도 하며, 온도가 상승하면 비이온성 계면활성제 친수부의 수화정도가 하락되고 HLB(hydrophilic lipophilic balance)가 변하는 것을 이용한 유화방법이다.
일반적으로, 계면활성제는 특정한 온도의 수용액상에서 친수성과 친유성이 균형을 이루게 되는데, 이 온도를 계면활성제의 전상온도(Phase Inversion Temperature)라고 한다. 전상온도에서는 친수부의 물에 대한 곡률이 양에서 음으로 변화하며 계면활성제의 회합수는 무한대가 된다. 이때는 계면활성제가 유상과 수상이 공존하며 바이컨티니어스상(bi-continuous phase)인 투명한 겔 상태로 존재하게 되고, 이때 유화하면 작은 나노 입자의 에멀젼을 얻을 수 있다.
이와 관련하여, 한국 등록특허 제10-1714618호에서는 PIT 시스템에 의해 제조되는 수중유형 나노입자 에멀젼 화장료 조성물의 제조방법이 개시되어 있으나, 일정 나노 입자크기와 유화 안정도를 얻기 위해 냉각 후 고압형 유화기를 사용하여 2차 유화시키는 단계가 요구된다.
대한민국 등록특허 제10-1768058호 대한민국 등록특허 제10-1714618호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 동물성 오일의 효능을 극대화 할 수 있는 수중유형 에멀젼 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 동물성 오일 발효물 100 중량부에 대하여, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르(Polyoxyethylene Oleyl Ether)를 포함하는 비이온성 계면활성제 10 내지 100 중량부, 글리세린(Glycerin) 10 내지 100 중량부 및 탈이온수(DI water) 10 내지 100 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 수중유형 에멀젼 조성물을 제공한다.
상기 수중유형 에멀젼 조성물은 입자의 평균 직경이 20 내지 200 nm 인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 동물성 오일 발효물은 마유 발효물인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르는 올레스-6(Oleth-6) 및 올레스-10(Oleth-10)의 혼합물인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르는 올레스-8(Oleth-8)인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르는 올레스-3(Oleth-3) 및 올레스-15(Oleth-15)의 혼합물인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명은 동물성 오일 발효물 100 중량부에 대하여, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르(Polyoxyethylene Oleyl Ether)를 포함하는 비이온성 계면활성제 10 내지 100 중량부, 글리세린(Glycerin) 10 내지 100 중량부 및 탈이온수(DI water) 10 내지 100 중량부를 포함하는 수중유형 에멀젼 조성물을 준비하는 단계;
상기 수중유형 에멀젼 조성물을 80 ~ 90 ℃의 온도범위로 가열한 후, 서서히 온도를 낮추어 투명한 바이컨티니어스상(bi-continuous phase) 조성물을 제조하는 단계; 및
상기 투명한 바이컨티니어스상(bi-continuous phase) 조성물을 냉각하여 나노화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 수중유형 나노 에멀젼 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 수중유형 에멀젼 조성물은 동물성 오일 발효물을 포함하여 항주름, 항염증 및 항산화 효과를 나타내며, 특정 수성 성분을 일정 함량비로 포함하여 보습효과를 나타낸다.
또한, 본 발명에 따른 수중유형 에멀젼 조성물은 동물성 오일 발효물과 특정 수성 성분 및 비이온성 계면활성제를 일정 함량비로 포함하여 전상온도법(PIT)을 사용한 단순한 공정만으로 나노화할 수 있고, 나노화될 경우 피부 흡수율 및 유화 안정성이 증가되어 기능성 화장료 소재로 사용될 수 있는 효과가 있다.
나아가, 본 발명에 따른 제조방법은 일정 범위의 나노 입자 크기와 유화 안정성이 확보된 수중유형 에멀젼 조성물을 얻을 수 있는 효과가 있다.
도 1은 실험예 1에 따른 올레아놀산(Oleanolic acid)의 엘라스타아제(elastase) 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 실험예 1에 따른 발효마유의 엘라스타아제 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 실험예 2에 따른 발효마유의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실험예 2에 따른 NG-메틸-L-아르기닌 아세테이트 염(NG-Methyl-L-arginine acetate salt)의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 실험예 2에 따른 발효마유의 RAW 264.7 세포에서의 산화질소(NO) 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 실험예 2에 따른 발효마유의 RAW 264.7 세포에서의 산화질소(NO) 생성 억제율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실험예 3에 따른 아스코르브산(Ascorbic acid)의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 실험예 3에 따른 발효마유의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 9는 실험예 4에 따른 실시예 1 조성물의 입도 분석 결과이다.
도 10은 실험예 4에 따른 실시예 2 조성물의 입도 분석 결과이다.
도 11은 실험예 4에 따른 실시예 3 조성물의 입도 분석 결과이다.
도 12는 실험예 5에 따른 실시예 1 조성물의 제타전위 측정 결과이다.
도 13은 실험예 5에 따른 실시예 2 조성물의 제타전위 측정 결과이다.
도 14는 실험예 5에 따른 실시예 3 조성물의 제타전위 측정 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 명세서 및 청구범위에 사용되는 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명은 동물성 오일 발효물을 포함하는 수중유형 에멀젼 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 동물성 오일 발효물 100 중량부에 대하여, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르(Polyoxyethylene Oleyl Ether)를 포함하는 비이온성 계면활성제 10 내지 100 중량부, 글리세린(Glycerin) 10 내지 100 중량부 및 탈이온수(DI water) 10 내지 100 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 수중유형 에멀젼 조성물을 제공한다.
보다 상세하게는, 동물성 오일 발효물 100 중량부에 대하여, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르(Polyoxyethylene Oleyl Ether)를 포함하는 비이온성 계면활성제 10 내지 100 중량부, 글리세린(Glycerin) 10 내지 100 중량부 및 탈이온수(DI water) 10 내지 100 중량부를 포함할 수 있고, 바람직하게는 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르(Polyoxyethylene Oleyl Ether)를 포함하는 비이온성 계면활성제 20 내지 80 중량부, 글리세린(Glycerin) 20 내지 80 중량부 및 탈이온수(DI water) 20 내지 80 중량부를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르(Polyoxyethylene Oleyl Ether)를 포함하는 비이온성 계면활성제 30 내지 70 중량부, 글리세린(Glycerin) 30 내지 70 중량부 및 탈이온수(DI water) 30 내지 70 중량부를 포함할 수 있다.
만일, 상기 비이온성 계면활성제가 상기 기재된 범위를 초과하여 포함될 경우 동물성 오일 발효물의 함량이 상대적으로 낮아져 동물성 오일 발효물의 효능이 저하될 수 있고, 상기 기재된 범위 미만으로 포함될 경우 유화 안정성이 저하될 수 있다.
또한, 상기 글리세린 및 탈이온수가 상기 기재된 범위를 초과하여 포함될 경우 동물성 오일 발효물의 효능이 저하되고 에멀젼 조성물의 끈적임이 증가할 수 있고, 상기 기재된 범위 미만으로 포함될 경우 화장료 조성물로 사용시 보습 기능이 저하될 수 있다.
상기 수중유형 에멀젼 조성물은 입자의 평균 직경이 20 내지 200 nm 인 것을 특징으로 할 수 있다.
보다 상세하게는, 상기 수중유형 에멀젼 조성물은 입자의 평균 직경이 20 내지 200 nm 일 수 있고, 바람직하게는 30 내지 150 nm 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 40 내지 120 nm 일 수 있다.
만일, 상기 수중유형 에멀젼 조성물 입자가 상기 기재된 범위를 초과한 평균 직경을 가질 경우 피부 흡수율 및 유화 안정성이 저하될 수 있고, 상기 기재된 범위 미만의 평균 직경을 가질 경우 전상온도법(PIT)에 의한 유화시 고압 공정과 같은 추가적인 공정이 요구될 수 있다.
상기 동물성 오일 발효물은 마유 발효물인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 마유(馬油, horse oil)는 말의 지방 조직에서 추출한 지방 성분으로서, 염증을 가라앉게 해주며 열을 제거하는 작용이 있어 화상에 매우 효과적인 것으로 알려져 있으며, 사람의 피부를 보호하는 피지의 주요 성분으로 강력한 항균 작용을 하는 팔미톨레산이 다량 함유되어 있어 피부에 천연보호막을 형성시켜 고보습 효과를 주는 것으로 알려져 있다. 또한, 비타민 E가 풍부해 잔주름이나 노화 예방에 유익한 것으로 알려져있다. 뿐만 아니라, 마유는 피지에 가장 가까운 성분으로, 지방산의 구성비, 유분, 수분의 밸런스도 거의 같기 때문에 인간의 피부와 친화성이 높으며, 불포화지방산이 약 60% 이상 포함되어 있어 피부에 불포화지방산을 공급할 수 있는 물질로 알려져 있다.
상기 마유 발효물은 칸디다 속(Candida sp.) 미생물에 의해 발효된 것일 수 있고, 바람직하게는 칸디다 봄비콜라(Candida bombicola)에 의해 발효된 것일 수 있다.
상기 칸디다 속 미생물은 기탁번호 KCTC13058BP인 칸디다 봄비콜라(Candida bombicola BB-106)일 수 있다.
상기 마유 발효물은 발효되지 않은 마유와 비교하여 낮는 융해온도, 낮은 표면장력, 높은 유화활성 및 높은 피부 흡수력이 나타나는 효과가 있다.
상기 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르는 비이온성 계면활성제로, 올레일알콜과 폴리에틸렌글리콜로부터 합성된 고분자이며, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 의미한다.
Figure 112018067026116-pat00001
상기 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르는 올레스-6(Oleth-6) 및 올레스-10(Oleth-10)의 혼합물인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 올레스-6(Oleth-6)은 화학식 1에서 n이 6인 경우를 의미하고, 상기 올레스-10(Oleth-10)은 화학식 1에서 n이 10인 경우를 의미한다.
상기 혼합물은 올레스-6(Oleth-6) 및 올레스-10(Oleth-10)을 1 : 0.01 ~ 10 중량비로 포함할 수 있고, 바람직하게는 1 : 0.1 ~ 5 중량비로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 : 0.5 ~ 2 중량비로 포함할 수 있다.
만일, 상기 올레스-6(Oleth-6) 및 올레스-10(Oleth-10)의 중량비가 상기 기재된 범위를 벗어날 경우, 수중유형 에멀젼 조성물의 입자 크기가 나노화되지 않거나, 특정 범위의 평균 입자 직경을 갖는 수중유형 나노 에멀젼 조성물이 형성되지 않는 문제점이 있을 수 있다.
상기 특정 범위의 평균 입자 직경은 20 내지 200 nm일 수 있다.
상기 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르는 올레스-8(Oleth-8)인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 올레스-8(Oleth-8)은 화학식 1에서 n이 8인 경우를 의미한다.
상기 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르는 올레스-3(Oleth-3) 및 올레스-15(Oleth-15)의 혼합물인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 올레스-3(Oleth-3)은 화학식 1에서 n이 3인 경우를 의미하고, 상기 올레스-15(Oleth-15)는 화학식 1에서 n이 15인 경우를 의미한다.
상기 혼합물은 올레스-3(Oleth-3) 및 올레스-15(Oleth-15)를 1 : 0.01 ~ 10 중량비로 포함할 수 있고, 바람직하게는 1 : 0.1 ~ 5 중량비로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 : 0.5 ~ 2 중량비로 포함할 수 있다.
만일, 상기 올레스-3(Oleth-3) 및 올레스-15(Oleth-15)의 중량비가 상기 기재된 범위를 벗어날 경우, 수중유형 에멀젼 조성물의 입자 크기가 나노화되지 않거나, 특정 범위의 평균 입자 직경을 갖는 수중유형 나노 에멀젼 조성물이 형성되지 않는 문제점이 있을 수 있다.
상기 특정 범위의 평균 입자 직경은 20 내지 200 nm일 수 있다.
또한, 본 발명은 동물성 오일 발효물 100 중량부에 대하여, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르(Polyoxyethylene Oleyl Ether)를 포함하는 비이온성 계면활성제 10 내지 100 중량부, 글리세린(Glycerin) 10 내지 100 중량부 및 탈이온수(DI water) 10 내지 100 중량부를 포함하는 수중유형 에멀젼 조성물을 준비하는 단계;
상기 수중유형 에멀젼 조성물을 80 ~ 90 ℃의 온도범위로 가열한 후, 서서히 온도를 낮추어 투명한 바이컨티니어스상(bi-continuous phase) 조성물을 제조하는 단계; 및
상기 투명한 바이컨티니어스상(bi-continuous phase) 조성물을 냉각하여 나노화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 수중유형 나노 에멀젼 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 수중유형 에멀젼 조성물을 준비하는 단계에 있어서, 상기 수중유형 에멀젼 조성물은 동물성 오일 발효물 100 중량부에 대하여, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르(Polyoxyethylene Oleyl Ether)를 포함하는 비이온성 계면활성제 10 내지 100 중량부, 글리세린(Glycerin) 10 내지 100 중량부 및 탈이온수(DI water) 10 내지 100 중량부를 포함할 수 있고, 바람직하게는 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르(Polyoxyethylene Oleyl Ether)를 포함하는 비이온성 계면활성제 20 내지 80 중량부, 글리세린(Glycerin) 20 내지 80 중량부 및 탈이온수(DI water) 20 내지 80 중량부를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르(Polyoxyethylene Oleyl Ether)를 포함하는 비이온성 계면활성제 30 내지 70 중량부, 글리세린(Glycerin) 30 내지 70 중량부 및 탈이온수(DI water) 30 내지 70 중량부를 포함할 수 있다.
만일, 상기 비이온성 계면활성제가 상기 기재된 범위를 초과하여 포함될 경우 동물성 오일 발효물의 함량이 상대적으로 낮아져 동물성 오일 발효물의 효능이 저하될 수 있고, 상기 기재된 범위 미만으로 포함될 경우 유화 안정성이 저하될 수 있다.
또한, 상기 글리세린 및 탈이온수가 상기 기재된 범위를 초과하여 포함될 경우 동물성 오일 발효물의 효능이 저하되고 에멀젼 조성물의 끈적임이 증가할 수 있고, 상기 기재된 범위 미만으로 포함될 경우 화장료 조성물로 사용시 보습 기능이 저하될 수 있다.
상기 수중유형 에멀젼 조성물은 입자의 평균 직경이 20 내지 200 nm 인 것을 특징으로 할 수 있다.
보다 상세하게는, 상기 수중유형 에멀젼 조성물은 입자의 평균 직경이 20 내지 200 nm 일 수 있고, 바람직하게는 30 내지 150 nm 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 40 내지 120 nm 일 수 있다.
만일, 상기 수중유형 에멀젼 조성물 입자가 상기 기재된 범위를 초과한 평균 직경을 가질 경우 피부 흡수율 및 유화 안정성이 저하될 수 있고, 상기 기재된 범위 미만의 평균 직경을 가질 경우 전상온도법(PIT)에 의한 유화시 고압 공정과 같은 추가적인 공정이 요구될 수 있다.
상기 동물성 오일 발효물은 마유 발효물인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 마유 발효물은 칸디다 속(Candida sp.) 미생물에 의해 발효된 것일 수 있고, 바람직하게는 칸디다 봄비콜라(Candida bombicola)에 의해 발효된 것일 수 있다.
상기 칸디다 속 미생물은 기탁번호 KCTC13058BP인 칸디다 봄비콜라(Candida bombicola BB-106)일 수 있다.
상기 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르는 올레스-6(Oleth-6) 및 올레스-10(Oleth-10)의 혼합물인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 혼합물은 올레스-6(Oleth-6) 및 올레스-10(Oleth-10)을 1 : 0.01 ~ 10 중량비로 포함할 수 있고, 바람직하게는 1 : 0.1 ~ 5 중량비로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 : 0.5 ~ 2 중량비로 포함할 수 있다.
만일, 상기 올레스-6(Oleth-6) 및 올레스-10(Oleth-10)의 중량비가 상기 기재된 범위를 벗어날 경우 유화 안정도가 저하되는 문제점이 있다.
상기 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르는 올레스-8(Oleth-8)인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르는 올레스-3(Oleth-3) 및 올레스-15(Oleth-15)의 혼합물인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 혼합물은 올레스-3(Oleth-3) 및 올레스-15(Oleth-15)를 1 : 0.01 ~ 10 중량비로 포함할 수 있고, 바람직하게는 1 : 0.1 ~ 5 중량비로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 : 0.5 ~ 2 중량비로 포함할 수 있다.
만일, 상기 올레스-3(Oleth-3) 및 올레스-15(Oleth-15)의 중량비가 상기 기재된 범위를 벗어날 경우 유화 안정도가 저하되는 문제점이 있다.
상기 투명한 바이컨티니어스상(bi-continuous phase) 조성물을 제조하는 단계는 상기 수중유형 에멀젼 조성물을 80 ~ 90 ℃의 온도범위로 가열하는 것을 특징으로 할수 있다.
보다 상세하게는, 상기 수중유형 에멀젼 조성물을 80 ~ 90 ℃의 온도범위로 가열한 후, 서서히 온도를 낮추어 투명한 바이컨티니어스상(bi-continuous phase) 조성물을 제조할 수 있다.
일례로, 상기 비이온성 계면활성제의 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르로 올레스-6(Oleth-6) 및 올레스-10(Oleth-10)의 혼합물, 올레스-8(Oleth-8) 또는 올레스-3(Oleth-3) 및 올레스-15(Oleth-15)의 혼합물이 사용될 경우, 이들의 전상온도는 각각 50 ~ 60 ℃, 30 ~ 40 ℃, 60 ~ 70 ℃ 로, 상기 수중유형 에멀젼 조성물을 80 ~ 90 ℃로 가열 후 온도를 서서히 낮추면 각각의 전상 온도에서 투명한 바이컨티니어스상 조성물이 생성된다.
상기 투명한 바이컨티니어스상(bi-continuous phase) 조성물을 냉각하여 나노화는 단계는 실온(25 ℃)의 탈이온수를 추가하여 급냉시키는 방법에 의하여 진행될 수 있다.
상기 수중유형 나노 에멀젼 조성물의 제조방법은, 특정 구성 및 함량을 가진 수중유형 에멀젼 조성물을 80 ~ 90 ℃의 온도범위로 가열 후 온도를 낮추어 투명한 바이컨티니어스상(bi-continuous phase) 조성물을 생성한 뒤, 실온(25 ℃)의 탈이온수를 추가하여 급냉시키는 간단한 공정만으로 추가적인 고압공정 없이 일정 범위의 나노 입자 크기와 유화 안정성이 확보된 에멀젼 조성물을 얻을 수 있는 효과가 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
<제조예 1> 칸디다 속 미생물에 의한 동물성 오일 발효물 생산
본 제조예에서는 동물성 오일로 마유를 이용하여 칸디다 속 미생물에 의한 동물성 오일 발효물을 제조하였다.
배양액(글루코오스 15 g/L, 마유 100 g/L, 이스트 추출물 5 g/L, 말트 추출물 5 g/L, NH4NO3 2 g/L, KH2PO4 1g/L, MgSO4 0.5 g/L 함유) 50 L에 칸디다 봄비콜라(Candida bombicola BB106)를 접종하여 25 ℃, 200 rpm, 호기 조건 하에서 24시간 동안 전배양한 후, 마유 100 L를 첨가하고 1 M HCl 용액으로 pH를 5 내지 6으로 조정하여 25 ℃, 150 rpm, 호기 조건 하에서 상기 칸디다 속 미생물을 배양하였다.
이후, 시간대별(3, 7, 12, 24, 48, 72, 96, 120h)로 각각 배양액을 0.3 내지 0.5 L 씩 취하여 발효마유 부분만을 회수하였다. 또한, 회수된 발효 마유를 정제하고 표면장력을 측정하여 동물성 오일의 발효 정도를 확인하였다. 표면장력 측정 결과, 동물성 오일 첨가 후 배양 약 120시간에서 발효마유의 표면장력이 최저임을 확인하였고, 그 이후에는 변화를 나타내지 않았다. 표면장력은 Ring method를 이용하여 측정하였고, 측정기기는 Kruss Processor Tensiometer K12를 이용하였다.
<실험예 1> 발효마유의 엘라스타아제(elastase) 저해 활성 확인 실험
1. 실험방법
기질로서 N-석시닐-(알라닌)3-p-니트로아닐라이드(N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide, S4760, sigma)를 사용하여 실온에서 5분간 생성되는 p-니트로아닐라이드의 생성량을 410 nM 에서 측정하였다.
즉, 양성 대조군인 올레아놀산 및 상기 제조예 1에서 제조된 발효마유를 각 농도별로 제조하여 20 ㎕씩 epp.tube에 취하고, 기질로 1.6 nM N-석시닐-(알라닌)3-p-니트로아닐라이드 100 ㎕와 0.4 U/mL 돼지 췌장 유래 엘라스타아제 용액 20 ㎕, 10 mM tris-HCl 버퍼(pH 8.0) 60 ㎕를 차례로 첨가하여 5분간 실온에서 반응시킨 다음 410 nM에서 흡광도를 측정하여 엘라스타아제 억제율을 구하였다.
엘라스타아제 억제율( % )=100-(시료 첨가군 흡광도/무첨가군 흡광도)*100
모든 실험 결과의 통계적 유의성은 Microsoft사의 Office Excel 2007의 t-test(Paired t-test, 양측 검증) 기능을 이용하여 확인하였으며, p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
2. 실험결과
2-1. 양성 대조군 올레아놀산의 엘라스타아제 저해활성
항주름 활성을 가지는 것으로 알려진 올레아놀산을 양성 대조군으로 한 엘라스타아제 저해활성 확인 시험결과를 하기 표 1에 나타내었다. 그 결과, 시험농도 범위에서 농도의존적인 엘라스타아제 저해 활성을 나타내어 (IC50 : 18.7196 ug/ml), 본 시험 과정에 문제가 없음을 확인할 수 있었다(도 1 참조).
엘라스타아제 저해활성 (% of control) 통계분석
(p-value)
농도(㎍/ml) 1차 2차 3차 평균 표준편차
0 0.29% 1.17% -1.46% 0.00% 1.34%
0.78125 4.59% 3.36% 3.45% 3.80% 0.69% 0.0024
1.5625 7.40% 6.96% 4.33% 6.23% 1.66% 0.0081
3.125 9.33% 11.61% 9.42% 10.12% 1.29% 0.0007
6.25 33.21% 33.65% 33.65% 33.50% 0.25% 0.0004
12.5 48.74% 50.50% 50.50% 49.91% 1.01% <0.001
25 61.73% 63.22% 63.31% 62.76% 0.89% <0.001
50 69.28% 69.63% 70.07% 69.66% 0.40% <0.001
2-2. 발효마유 시료의 엘라스타아제 저해 활성
발효마유 시료의 엘라스타아제 저해 활성을 기질로서 N-석시닐-(알라닌)3-p-니트로아닐라이드를, 효소원으로 돼지 췌장 유래 엘라스타아제를 이용하여 확인하였으며 그 결과를 표 2에 나타내었다.
그 결과, 발효마유 시료는 0.001563 내지 0.1 % 범위에서 농도 의존적이며, 통계적으로 유의하게 엘라스타아제 억제 활성 (IC50 : 0.006 %)을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 2 참조).
엘라스타아제 저해활성 (% of control) 통계분석
(p-value)
농도(%) 1차 2차 3차 평균 표준편차
0 -0.64516 0.493359 0.151803 -9.5E-15 0.584243
0.001563 22.12524 24.06072 22.12524 22.7704 1.117452 <0.001
0.003125 36.35674 38.63378 38.97533 37.98861 1.423529 <0.001
0.00625 53.54839 54.4592 53.32068 53.77609 0.602448 <0.001
0.0125 64.25047 65.04744 64.70588 64.66793 0.399835 <0.001
0.025 68.23529 69.37381 68.57685 68.72865 0.584243 <0.001
0.05 70.28463 70.51233 71.42315 70.74004 0.602448 <0.001
0.1 74.04175 73.58634 72.22011 73.28273 0.948007 <0.001
결과적으로, 발효마유는 주름 개선에 효능이 있는 것으로 판단되었다.
<실험예 2> 발효마유의 NO 생성 억제 실험
1. 실험방법
1-1. 세포배양
마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 10 % 소태아혈청(fetal bovine serum) 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지를 이용하여 100 mm 세포배양 디쉬를 사용하여 5% CO2 배양기에 배양하였다. 컨플루언스(confluence)에 도달한 세포는 스크랩퍼를 사용하여 계대 배양하여 유지하였다.
1-2. 세포 생존율 실험
살아있는 세포 내의 미토콘드리아에 존재하는 탈수소효소는 테트라졸리움염(Tetrazolium Salt,WST)에서 포마잔(formazan)이라는 발색물질을 생성한다. 따라서 이를 측정하여 살아있는 세포의 수를 측정할 수 있다. 96 웰 세포 배양 플레이트에 1×104 cells/웰 농도의 RAW 264.7 세포를 10 % 소태아혈청(fetal bovine serum), 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배양액으로 24시간 배양하였다. 그 후 시료가 농도 별로 포함된 DMEM 배지로 교체하여 48시간 배양하고, 배양이 끝난 세포에 EZ-CYTOX 시약을 이용하고 450 nM에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 측정하였다.
세포 생존율 = (시료 첨가군의 흡광도/무처리군 흡광도)*100
1-3. 시험 물질 처리
RAW 264.7 세포를 2×105 cells/dish 밀도로 24 웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 플레이트에 부착 시킨다 염증반응을 유발하기 위해 1 ㎍/㎖ 농도의 LPS (리포폴리사카라이드)와 시험물질을 함유한 새로운 배지를 처리하여 24시간 배양하였다.
1-4. 산화질소 (NO) 생성량 측정 실험
RAW 264.7 세포에서 생성되어 배양액에 존재하는 NO 수준을 Griess 반응을 기본으로 하는 NO detection kit (intron)를 사용하여 측정하였다 NO가 존재한다고 추정되는 배양액을 96 웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후 N1 버퍼 (설파닐아마이드) 50 ㎕를 넣어 10분간 실온에서 반응 시킨다 이어서 N2 버퍼 (나프틸에틸렌디아민) 50 ㎕를 넣고 10분간 실온에서 반응 시킨 후 540 nM에서 흡광도 측정 하였다 각 NO 생성량은 nitrite standard를 이용하여 얻은 표준검량곡선을 이용하여 산출 하였다 양성 대조군은 nMLA (50μM)을 사용하였다.
모든 실험 결과의 통계적 유의성은 Microsoft사의 Office Excel 2007의 t-test (independent t-test, 양측검증, 이분산가정) 기능을 이용하여 확인하였으며, p 값이 005 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
2. 실험결과
2-1. 세포 독성시험
(1) 발효마유
발효마유가 RAW 264.7 세포 생존율에 미치는 영향을 확인하였으며, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
나타낸 바와 같이, 발효마유는 0.05 % 이하의 농도에서 90 % 이상의 세포생존율을 나타내었다(도 3참조).
농도(%) 세포 생존율(%) 평균 표준편차
1 반복 2 반복 3 반복
0 102.84 92.45 104.71 100.00 6.60
0.0016 108.92 108.27 123.61 113.60 8.68
0.00313 109.95 118.18 121.46 116.53 5.93
0.00625 116.31 132.50 117.90 122.24 8.92
0.0125 123.71 139.05 123.99 128.91 8.78
0.025 131.00 123.99 125.30 126.76 3.73
0.05 107.05 108.55 103.87 106.49 2.39
0.1 79.73 82.35 77.11 79.73 2.62
(2) 양성 대조군 NG-메틸-L-아르기닌 아세테이트 염
양성 대조군으로 사용한 NG-메틸-L-아르기닌 아세테이트 염(NG-Methyl-L-arginine acetate salt, nMLA)의 RAW 264.7 세포 생존율에 미치는 영향을 확인하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다. 나타낸 바와 같이, 100 μM 이하의 농도에서90 % 이상의 세포 생존율을 나타내었다(도 4 참조).
농도(uM)
세포 생존율(%) 평균 표준편차
1 반복 2 반복 3 반복
0 102.92 97.34 99.73 100.00 2.80
1.5625 106.43 109.46 101.01 105.63 4.28
3.125 117.19 112.17 107.63 112.33 4.79
6.25 96.07 103.16 104.84 101.36 4.66
12.5 99.97 94.07 97.18 97.08 2.95
25 111.13 101.33 107.79 106.75 4.98
50 116.08 115.44 101.89 111.13 8.02
100 99.57 102.84 106.11 102.84 3.27
2-2. NO production에 미치는 영향
세포 독성을 나타내지 않는 0.05 % 이하의 농도범위에서 발효마유가 RAW 264.7 세포의 산화질소(NO) 생성에 미치는 영향을 확인한 결과를 표 5에 나타내었다.
그 결과, 발효마유는 0.0016 내지 0.05 % 농도 범위에서 농도의존적인 NO 생성 억제 양상을 나타내었으며, 자극제 단독 처리군에 대해서 통계적으로 유의한 수준의 억제 효과를 나타내었다. 특히 0.05 % 농도에서는 39.67 %의 NO 생성 억제율을 보여, RAW 264.7 세포의 NO 생성을 저해하는 효과를 확인 할 수 있었다(도 5 및 도 6 참조).
구분 (%) 산화질소 (uM of control) 표준편차 통계분석
(p-value)
1반복 2반복 3반복 평균(uM)
control -1.96 -1.88 -1.96 -1.93 0.042
Control+LPS(1ug/mL) 22.97 23.19 23.71 23.29 0.377
0.0016 19.22 19.59 18.63 19.15 0.482 <0.001
0.0031 19.07 19.22 18.49 18.93 0.389 <0.001
0.0063 17.90 18.71 19.59 18.73 0.846 0.005
0.0125 17.31 18.12 19.00 18.14 0.846 0.003
0.025 16.13 16.50 17.90 16.84 0.931 0.003
0.05 14.07 13.85 14.22 14.05 0.185 <0.001
nMLA(50uM) 8.41 8.19 8.26 8.29 0.112 <0.001
결과적으로, 발효마유는 통계적으로 유의하게 NO 생성을 저해하여 항염 및 자극 완화에 효과적임을 알 수 있었다.
<실험예 3> 발효마유의 항산화 성능 시험 (DPPH assay)
1. 실험방법
시료를 최종 농도 예비 실험을 통해 50 % 정도의 프리라디칼 소거 활성을 나타낼 수 있는 적절한 농도 범위로 희석하여 준비하며, 대조군으로 아스코르브산(Ascorbic acid)를 사용하였다. 각 시험 물질 250 ㎕에 0.1 mM DPPH 250 ㎕을 넣고 35 ℃에서 20 분간 반응 시킨 다음, 520 nM에서 흡광도를 측정하여 DPPH 라디칼의 농도를 확인하였다.
프리라디칼 소거 활성(%)=100 - (시험물질 첨가군 흡광도/무첨가군 흡광도)*100
모든 실험 결과의 통계적 유의성은 Microsoft사의 Office Excel 2007의 t-test (Welch'st-test, 이분산가정, 양측검증) 기능을 이용하여 확인하였으며, p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
2. 실험결과
2-1. 양성 대조군 아스코르브산(Ascorbic acid)의 항산화 활성
항산화 활성을 가지는 것으로 알려진 아스코르브산(Ascorbic acid)를 양성 대조군으로 한 DPPH 라디칼 소거 활성 시험 결과를 표 6에 나타내었다.
그 결과, 시험농도 범위에서 농도 의존적인 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내어 (IC50 : 118 ug/ml) 본 시험 과정에 문제가 없음을 확인할 수 있었다(도 7 참조).
프리라디칼 소거활성(% of control) 통계분석
(p-value)
농도(ug/ml) 1차 2차 3차 평균 표준편차
0 0.45% 0.45% -0.90% 0.00% 0.78%
0.15625 9.87% 8.52% 4.48% 7.62% 2.80% 0.0344
0.3125 16.59% 15.25% 13.90% 15.25% 1.35% <0.001
0.625 30.04% 28.70% 26.01% 28.25% 2.05% <0.001
1.25 54.26% 52.91% 50.22% 52.47% 2.05% <0.001
2.5 66.37% 66.37% 66.37% 66.37% 0.00% <0.001
5 74.44% 71.75% 74.44% 73.54% 1.55% <0.001
10 86.55% 86.55% 86.55% 86.55% 0.00% <0.001
2-2. 발효마유의 항산화 활성
발효마유의 항산화 활성을 DPPH 라디칼 소거 활성 시험을 통해 확인하였으며 그 결과를 표 7에 나타내었다.
나타낸 바와 같이, 발효마유는 0.3125 내지 5 % 범위에서 농도 의존적이고 통계적으로 유의한(p<0.05) 수준의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었다. IC50은 2.16 %로 확인되어 우수한 항산화 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다(도 8 참조).
프리라디칼 소거활성(% of control) 통계분석
(p-value)
농도(%) 1차 2차 3차 평균 표준편차
0 3.42% -0.68% -2.74% 0.00% 3.14%
0.15625 -0.68% 3.42% 1.37% 1.37% 2.05% 0.5666
0.3125 9.59% 9.59% 5.48% 8.22% 2.37% 0.0253
0.625 19.86% 19.86% 15.75% 18.49% 2.37% 0.0017
1.25 30.14% 28.08% 30.14% 29.45% 1.19% 0.0014
2.5 56.85% 54.79% 58.90% 56.85% 2.05% <0.001
5 87.67% 85.62% 87.67% 86.99% 1.19% <0.001
결론적으로, 발효마유는 우수한 항산화 활성을 가지는 것을 알 수 있었다.
<실시예 1> Oleth-6 및 Oleth-10 계면활성제를 사용한 수중유형 나노 에멀젼 조성물의 제조
발효마유 100 중량부를 기준으로 하여, 글리세린 50 중량부, 탈이온수(DI water) 50 중량부를 첨가한 뒤, Oleth-6 및 Oleth-10 이 1 : 1 중량비로 함유된 비이온성 계면활성제를 50 중량부 첨가하여 수중유형 에멀젼 조성물을 준비하였다.
동물성 오일 발효물로 상기 제조예 1에서 제조된 발효마유를 사용하였다.
상기 준비된 수중유형 에멀젼 조성물을 교반기를 사용하여 교반하고, 80 ~ 90 ℃로 가열한 후, 50 ~ 60 ℃ 까지 천천히 온도를 낮추어 투명한 바이컨티니어스상(bi-continuous phase) 조성물을 제조하였다.
다음으로, 상기 투명한 바이컨티니어스상(bi-continuous phase) 조성물을 냉각함으로써 나노화하여 수중유형 나노 에멀젼 조성물을 제조하였다.
<실시예 2> Oleth-8 계면활성제를 사용한 수중유형 나노 에멀젼 조성물의 제조
발효마유 100 중량부를 기준으로 하여, 글리세린 50 중량부, 탈이온수(DI water) 50 중량부를 첨가한 뒤, Oleth-8이 함유된 비이온성 계면활성제를 50 중량부 첨가하여 수중유형 에멀젼 조성물을 준비하였다.
동물성 오일 발효물로 상기 제조예 1에서 제조된 발효마유를 사용하였다.
상기 준비된 수중유형 에멀젼 조성물을 교반기를 사용하여 교반하고, 80 ~ 90 ℃로 가열한 후, 30 ~ 40 ℃ 까지 천천히 온도를 낮추어 투명한 바이컨티니어스상(bi-continuous phase) 조성물을 제조하였다.
다음으로, 상기 투명한 바이컨티니어스상(bi-continuous phase)을 냉각함으로써 나노화하여 수중유형 나노 에멀젼 조성물을 제조하였다.
<실시예 3> Oleth-3 및 Oleth-15 계면활성제를 사용한 수중유형 나노 에멀젼 조성물의 제조
발효마유 100 중량부를 기준으로 하여, 글리세린 50 중량부, 탈이온수(DI water) 50 중량부를 첨가한 뒤, Oleth-3 및 Oleth-15 가 1 : 1 중량비로 함유된 비이온성 계면활성제를 50 중량부 첨가하여 수중유형 에멀젼 조성물을 준비하였다.
동물성 오일 발효물로 상기 제조예 1에서 제조된 발효마유를 사용하였다.
상기 준비된 수중유형 에멀젼 조성물을 교반기를 사용하여 교반하고, 80 ~ 90 ℃로 가열한 후, 60 ~ 70 ℃ 까지 천천히 온도를 낮추어 투명한 바이컨티니어스상(bi-continuous phase) 조성물을 제조하였다.
다음으로, 상기 투명한 바이컨티니어스상(bi-continuous phase) 조성물을 냉각함으로써 나노화하여 수중유형 나노 에멀젼 조성물을 제조하였다.
<실험예 4> 나노 에멀젼 조성물의 입도분석
KS A ISO 13320 : 2014에 따라 동적광산란(Dynamic light scattering)법을 이용하여 상기 실시예 1 내지 3 에서 제조된 나노 에멀젼 조성물의 입도를 측정하였다.
입도 분석장비로는 Zetasizer nano ZS90 (Malvern)을 사용하였으며, 그 결과를 표8 및 도 9 내지 11에 나타내었다.
나타낸 바와 같이, 실시예 1 내지 3 입자의 평균직경은 각각 48.92 nM, 111.2 nM, 61.42 nM 인 것을 확인할 수 있었다.
평균직경 (nm)
실시예 1 48.92
실시예 2 112.2
실시예 3 61.42
<실험예 5> 나노 에멀젼 조성물의 제타전위 측정
ISO 13099-2에 따라 상기 실시예 1 내지 3에서 제조된 나노 에멀젼 조성물의 제타전위를 측정하였으며, 분석장비로는 Zetasizer nano ZS90 (Malvern)을 사용하였다.
표 9 및 도 12 내지 14에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 내지 3에서 제조된 나노 에멀젼 조성물의 평균 제타전위는 각각 -59.1 kmV, -38.4 kmV, -37.5 kmV 값을 나타냈다.
결과적으로, 실시예 1 내지 3에서 제조된 나노 에멀젼 조성물의 제타전위는 절대값으로 30 mV 보다 큰 값을 나타내어, 나노 에멀젼 조성물의 유화 안정성이 확보됨을 확인할 수 있었다.
Zeta Potential (mV)
실시예 1 -59.1
실시예 2 -38.4
실시예 3 -37.5

Claims (7)

  1. 동물성 오일 발효물 100 중량부에 대하여, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르(Polyoxyethylene Oleyl Ether)를 포함하는 비이온성 계면활성제 30 내지 70 중량부, 글리세린(Glycerin) 30 내지 70 중량부 및 탈이온수(DI water) 30 내지 70 중량부를 포함하고,
    입자의 평균 직경이 20 내지 200 nm이며,
    상기 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르는 올레스-6(Oleth-6) 및 올레스-10(Oleth-10)의 혼합물, 올레스-8(Oleth-8), 또는 올레스-3(Oleth-3) 및 올레스-15(Oleth-15)의 혼합물인 것을 특징으로 하는 수중유형 에멀젼 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 동물성 오일 발효물은 마유 발효물인 것을 특징으로 하는 수중유형 에멀젼 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 동물성 오일 발효물 100 중량부에 대하여, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르(Polyoxyethylene Oleyl Ether)를 포함하는 비이온성 계면활성제 30 내지 70 중량부, 글리세린(Glycerin) 30 내지 70 중량부 및 탈이온수(DI water) 30 내지 70 중량부를 포함하고,
    상기 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르는 올레스-6(Oleth-6) 및 올레스-10(Oleth-10)의 혼합물, 올레스-8(Oleth-8), 또는 올레스-3(Oleth-3) 및 올레스-15(Oleth-15)의 혼합물인 것을 특징으로 하는 수중유형 에멀젼 조성물을 준비하는 단계;
    상기 수중유형 에멀젼 조성물을 80 ~ 90 ℃의 온도범위로 가열한 후, 30 ~ 70 ℃의 온도범위로 온도를 낮추어 투명한 바이컨티니어스상(bi-continuous phase) 조성물을 제조하는 단계; 및
    상기 투명한 바이컨티니어스상(bi-continuous phase) 조성물을 냉각하여 나노화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 수중유형 나노 에멀젼 조성물의 제조방법.
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