KR101956142B1 - 단백질 분비 향상을 위한 발현 벡터 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 목표는 발효 공정에서의 단백질의 생산 수율을 증가시키기 위하여 숙주 세포로부터 단백질의 분비를 향상시키는 것이다. 이는 a) 프로모터 서열 및 b) 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터에 의해 달성된다. 상기 단백질은 신호 펩티드 및 추가적인 아미노산 서열을 포함하며, 상기 신호 펩티드는 서열 2에 명시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열, 또는 서열 4에 명시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열, 또는 서열 6에 명시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 상기 신호 펩티드는 상기 서열들 중 하나 이상과 구조적으로 상동인 아미노산 서열을 포함한다.
Description
본 발명은 생물공학, 더 구체적으로는 미생물 단백질 합성 분야에 속한다. 본 발명은 특히 단백질을 제조하기 위한 발현 벡터에 관한 것으로써, 더하여 그와 같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제시한다. 본 발명은 또한 단백질 제조에 있어서의 그와 같은 발현 벡터 및 숙주 세포의 방법 및 용도에 관한 것이다.
단백질의 제조를 위하여, 관심 단백질의 유전자를 발현하는 숙주 세포, 더 구체적으로는 미생물이 사용될 수 있다. 관심 단백질의 유전자 (트랜스진)는 일반적으로 숙주 세포에 의해 그것이 발현되는 방식으로 숙주 세포에 도입된다. 종종, 그것은 유전자 발현을 가능케 하는 하나 이상의 프로모터 서열 (프로모터)과 함께 소위 발현 벡터상에 존재한다.
산업-규모의 생물공학적 생산의 경우, 문제의 숙주 세포는 세포의 대사 특성에 맞게 개조된 발효기에서 배양된다. 배양 동안, 숙주 세포는 공급된 기질을 대사하여 원하는 생성물을 형성시키는데, 발효 종료 후 그것은 보통 생산 생물체로부터 분리되어, 발효기 슬러리 및/또는 발효기 배지로부터 정제 및/또는 농축된다.
발효에서 매우 높은 생성물 수율을 수득하는 것은 본질적으로 바람직하다. 생성물 수율이 다수의 인자에 따라 달라지는데, 예를 들어 숙주 세포는 보통 실제로 원하는 생성물 이외에도 일반적으로 관심의 대상이 되지 않는 다수의 다른 물질들을 형성시킨다. 또한, 트랜스진의 발현 및 그에 따른 생성물 수율은 실질적으로 사용되는 발현 시스템에 따라 달라진다. 예를 들어, 국제 특허 출원 WO 91/02792호는 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)로부터의 유전자 조절 서열, 더 구체적으로는 바실루스 리케니포르미스 프로모터의 제어하에 있는 최적화된 바실루스 리케니포르미스 균주에서, 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)로부터의 알칼리성 프로테아제의 향상된 발효 생산에 대해 개시하고 있다.
단백질, 예를 들어 가수분해 효소의 산업적 생산의 경우, 바람직한 것은 다량의 단백질을 배양 상청액으로 분비함으로써 세포내 생산에서는 필수적인 복잡한 세포 붕괴를 잉여화할 수 있는 숙주 세포를 사용하는 것이다. 이와 같은 목적에는, 비용-효과적인 배양 배지를 사용하여 효율적인 고도-세포-밀도 발효 절차로 배양될 수 있으며 배양 상청액으로 리터 당 많은 그램수의 표적 단백질을 분비할 수 있는 숙주 세포, 예를 들어 바실루스 종을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 분비될 단백질은 숙주 세포로 도입되어 있으며 분비될 단백질을 코딩하고 있는 발현 벡터에 의해 발현된다. 발현되는 단백질은 보통 숙주 세포로부터의 그의 외수송을 야기하는 신호 펩티드 (신호 서열)를 포함한다. 상기 신호 펩티드는 보통은 숙주 세포에서 번역된 폴리펩티드 사슬의 일부이나, 숙주 세포의 내부 또는 외부에서 단백질로부터 그것이 추가적으로 번역후 절단될 수도 있다.
그러나, 특히 이종유래 단백질의 이와 같은 세포외 생산에는, 분비 과정의 최적화를 위한 수많은 애로사항 및 상응하는 고도의 요구사항이 존재한다. 이러한 애로사항 중 하나는 숙주 세포로부터의 표적 단백질의 효율적인 외수송을 가능케 하는 신호 펩티드의 선택이다. 신호 펩티드는 원칙적으로 단백질, 더 구체적으로는 효소와 새롭게 조합될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Brockmeier et al. (J. Mol. Biol. 362, pages 393-402 (2006))]은 큐티나제의 예를 사용하여 신호 펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 전략에 대해 기술하고 있다. 그러나, 모든 신호 펩티드가 똑같이 발효 조건, 더 구체적으로는 산업용 또는 산업-규모의 발효 조건하에서 적정한 단백질의 외수송을 야기하는 것은 아니다.
따라서, 본 발명의 목적은 숙주 세포로부터의 단백질의 분비를 향상시키고, 결과적으로 발효 절차에서의 단백질 생산 수율을 증가시키는 것이다.
본 발명은 하기를 포함하는 발현 벡터를 제공한다:
a) 프로모터 서열, 및
b) 신호 펩티드 및 추가적인 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열로서, 상기 신호 펩티드는 서열 2에 명시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열, 또는 서열 4에 명시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열, 또는 서열 6에 명시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열, 또는 이들 서열 중 하나 이상과 구조적으로 상동 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 서열.
놀랍게도, 상기 신호 펩티드를 갖는 단백질을 코딩하고 있는 발현 벡터가 발현 벡터를 함유하며 상기 핵산 서열 b)를 발현하는 숙주 세포로부터의 향상된 단백질 분비를 달성한다는 것이 발견되었다. 그 결과, 본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 발효 절차에서 단백질 생산 수율을 증가시키는 것이 가능하다.
발현 벡터는 숙주 세포, 더 구체적으로는 미생물에서 단백질이 발현되는 것을 가능케 하는 핵산 서열이다. 그것은 유전적 정보, 즉 단백질을 코딩하고 있는 해당 핵산 서열 (유전자) b)를 포함한다.
핵산 서열의 발현은 해당 서열에 의해 코딩되는 유전자 생성물(들), 즉 폴리펩티드 (단백질) 또는 다수의 폴리펩티드들 (단백질들)로의 그의 번역이다. 본 출원에서 폴리펩티드 및 단백질이라는 용어는 동의어로 사용된다. 따라서 본 발명의 목적상, 발현은 유전 정보로부터의 리보핵산 (RNA) 및 단백질의 생합성을 의미한다. 일반적으로, 발현은 전사, 즉 유전자의 DNA (데옥시리보핵산) 서열을 기반으로 한 메신저(messenger) 리보핵산 (mRNA)의 합성, 그리고 번역후에 추가적으로 변형될 수도 있는 상응 폴리펩티드 사슬로의 상기 mRNA의 번역을 포함한다. 따라서, 단백질의 발현은 본 발명에 따라 발현 벡터상에 제공되는 유전적 정보로부터의 그의 생합성을 말한다.
벡터는 핵산, 바람직하게는 데옥시리보핵산 (DNA)으로 구성되는 유전 요소로써, 생물공학 분야의 업계 숙련자에게 알려져 있다. 특히 박테리아에서 사용되는 경우, 그것은 특정 플라스미드, 즉 원형의 유전 요소이다. 예를 들어, 벡터에는 박테리아 플라스미드, 바이러스 또는 박테리오파지로부터 유래하는 것들, 또는 매우 다양한 기원의 요소들을 함유하는 주로 합성인 벡터 또는 플라스미드가 포함될 수 있다. 각 경우에 존재하는 추가적인 유전 요소들에 의해, 바람직하게는 형질전환에 의해 그것이 도입된 숙주 세포에서, 벡터는 다수 세대에 걸쳐 안정한 단위로서 자신을 확립시킬 수 있다. 이와 관련하여, 그것이 염색체외에 별도의 단위로 확립되는지, 또는 염색체 또는 염색체 DNA에 통합되는지는 본 발명의 목적상 중요하지 않다. 수많은 시스템들 중 어느 것이 선택되는지는 개별 경우에 따라 달라진다. 중요한 인자는 예를 들어 달성가능한 카피 수, 특히 항생제 내성을 포함한 가용한 선택 시스템, 또는 벡터 흡수를 할 수 있는 숙주 세포의 배양성일 수 있다.
발현 벡터는 또한 배양 조건, 예를 들어 세포 밀도 또는 특정 화합물 첨가의 변화를 통하여 조절가능할 수 있다. 그와 같은 화합물의 예는 갈락토스 유도체인 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)로써, 박테리아 락토스 오페론 (lac 오페론)의 활성화제로 사용된다.
발현 벡터는 또한 단백질을 코딩하고 있는 핵산 서열 b)의 발현에 대하여 조절 기능을 갖는 1종 이상의 핵산 서열, 바람직하게는 DNA (소위 유전자 조절 서열)를 포함한다. 이 경우, 유전자 조절 서열은 특정 숙주 세포에서의 그의 존재를 통해 단백질을 코딩하고 있는 핵산 서열 b)의 전사율(transcription rate)에 영향을 주어, 바람직하게는 증가시키는 소정의 핵산 서열이다. 바람직하게는, 그것은 프로모터 서열인데, 핵산 서열 b)의 발현에는 그와 같은 서열이 필수적이기 때문이다. 그러나, 본 발명에 따른 발현 벡터는 또 다른 추가적인 유전자 조절 서열, 예를 들어 1종 이상의 인핸서(enhancer) 서열을 포함할 수도 있다. 결론적으로, 본 발명의 목적상, 발현 벡터는 핵산 서열 b) 및 프로모터로 구성되는 1종 이상의 기능적 단위 (발현 카세트(cassette))를 포함한다. 반드시 그러한 것은 아니지만, 그것은 물리적 실재물로서 존재할 수 있다. 프로모터는 숙주 세포에서 핵산 서열 b)의 발현을 야기한다. 본 발명의 목적상, 발현 벡터는 프로모터 및 발현될 핵산 서열 b)로 구성되는 순수 발현 카세트로 제한될 수도 있으며, 상기 발현 카세트는 염색체외로, 아니면 염색체로 통합되는 것이 가능하다. 본 발명에 따른 발현 벡터의 그와 같은 실시양태들은 각각 별도의 본 발명 실시양태를 구성한다.
결론적으로, 1종 이상 프로모터의 존재는 본 발명에 따른 발현 벡터에 필수적이다. 따라서, 프로모터는 유전자의 조절 발현을 가능케 하는 DNA 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 프로모터 서열은 원래 유전자의 구성요소로써, 종종 그의 5' 말단에, 그리고 그에 따라 RNA-코딩 영역 전에 위치한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 발현 벡터의 프로모터 서열은 단백질을 코딩하고 있는 핵산 서열 b)의 5' 상류에 위치한다. 프로모터의 가장 중요한 특성은 RNA 폴리머라제에 의한 유전자 전사의 개시를 매개하며 전사 인자로 지칭되는 1종 이상 DNA-결합 단백질 또는 폴리펩티드와의 특이적인 상호작용이다. 다수의 전사 인자 및/또는 추가적인 단백질들이 종종 RNA 폴리머라제에 의한 전사의 개시에 연루된다. 따라서, 프로모터는 바람직하게는 프로모터 활성을 갖는 DNA 서열, 즉 유전자의 전사를 개시하기 위하여 적어도 일시적으로 1종 이상의 전사 인자가 거기에 결합되는 DNA 서열이다. 프로모터의 강도는 발현 유전자의 전사율을 통하여, 즉 단위 시간 당 생성되는 RNA 분자, 더 구체적으로는 mRNA 분자의 수를 통하여 측정가능하다.
바람직하게는, 프로모터 서열 (a)와 핵산 서열 (b)는 발현 벡터상에서 줄지어 존재한다. 더욱 바람직하게는, 프로모터 서열 (a)는 핵산 분자상에서 (5'→3' 방향으로) 핵산 서열 (b)의 앞에 위치한다. 2개의 핵산 서열 (a)와 (b) 사이에 단백질을 코딩하고 있는 핵산 서열 (b)의 전사율을 감소시키는 핵산 서열이 존재하지 않는 것 역시 바람직하다. 상기의 모든 설명은 연관되어 있는 상보적 DNA 가닥이 아닌, 단백질을 코딩하고 있는 핵산 서열 (b)를 함유하는 DNA 가닥 (코딩 가닥)을 말하는 것이다. 결론적으로 바람직하게는, 단백질을 코딩하고 있는 핵산 서열 (b)로부터 시작하여, 프로모터 서열 (a)는 더 상류에, 즉 상기 DNA 가닥상의 5' 방향에 위치한다.
핵산 서열 b)는 분비될 단백질을 코딩하고 있다. 이 경우에서, 그것은 본 발명에 따른 발현 벡터를 사용하여 제조되어야 하는 해당 단백질 (표적 단백질)이다.
핵산 서열 b)에 의해 코딩되는 단백질은 서열 2에 명시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열, 또는 서열 4에 명시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열, 또는 서열 6에 명시된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 신호 펩티드를 포함한다. 그와 같은 신호 펩티드는 그를 포함하는 단백질, 더 구체적으로는 재조합 단백질의 충분한 분비를 야기하는 것으로 밝혀졌다. 더욱 바람직하게는, 신호 펩티드는 서열 2에 명시된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 아미노산 서열, 또는 서열 4에 명시된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 아미노산 서열, 또는 서열 6에 명시된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특히 바람직하게는, 신호 펩티드는 서열 2에 명시된 아미노산 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 아미노산 서열, 또는 서열 4에 명시된 아미노산 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 아미노산 서열, 또는 서열 6에 명시된 아미노산 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진다.
각 경우에서 매우 특히 바람직한 것은 100% 동일한 서열이며, 따라서 상응하는 바람직한 발현 벡터는 핵산 서열 b)에 의해 코딩되는 신호 펩티드가 서열 2, 서열 4 또는 서열 6에 따른 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다. 그와 같은 신호 펩티드를 코딩하는 특히 바람직한 핵산 서열은 서열 1, 서열 3 및 서열 5에 열거되어 있다.
단백질의 분비를 가능케 하는 상기 언급된 신호 펩티드들 대신, 이들 서열과 구조적으로 상동인 서열을 사용하는 것 또한 가능하다. 구조적으로 상동인 서열은 서열 2, 서열 4 또는 서열 6에 따른 아미노산 서열을 갖는 신호 펩티드의 것과 유사한 공간적 접힘을 나타내는 일련의 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 이와 같은 공간적 접힘은 그것이 숙주 세포에 의해 분비 신호 서열로 인식되고, 그에 따라 구조적으로 상동인 신호 서열을 포함하는 단백질이 숙주 세포 외부로 전달되는 것을 가능케 한다. 바람직하게는, 숙주 세포에 의해 사용되는 전위 시스템과 상호작용이 이루어진다. 따라서, 구조적으로 상동인 아미노산 서열은 바람직하게는 숙주 세포 전위 시스템의 1종 이상 구성요소에 직접적으로 또는 간접적으로 결합한다. 직접적인 결합은 직접적인 상호작용을 의미하는 것으로 이해되며, 간접적인 결합은 어댑터(adapter)로 작용하며, 그에 따라 구조적으로 상동인 아미노산 서열과 숙주 세포 전위 시스템 구성요소 사이의 가교로서 기능하는 1종 이상의 추가적인 구성요소, 더 구체적으로는 단백질 또는 다른 분자를 통하여 상호작용이 이루어질 수 있다는 것을 의미하는 것으로 이해된다.
핵산 또는 아미노산 서열의 동일성(identity)은 서열 비교에 의해 결정된다. 그와 같은 비교는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열 중 유사한 연속물을 서로 대입하는 것에 의해 달성된다. 상기 서열 비교는 바람직하게는 선행 기술에서 확립되어 보편적으로 사용되고 있는 블라스트(BLAST) 알고리즘을 바탕으로 수행되며 (cf. 예를 들어 문헌 [Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215: 403-410], 및 [Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, pages 3389-3402)]), 원칙적으로 핵산 또는 아미노산 서열 중 뉴클레오티드 또는 아미노산들의 유사한 연속물을 서로 대입하는 것에 의해 이루어진다. 문제 위치의 표에 의한 대입은 정렬(alignment)로 지칭된다. 선행 기술에서 가용한 다른 알고리즘은 파스타(FASTA) 알고리즘이다. 서열 비교 (정렬), 더 구체적으로는 다중 서열 비교는 보통 컴퓨터 프로그램을 사용하여 이루어진다. 빈번하게 사용되는 것은 예를 들어 클러스탈 시리즈(Clustal series) (cf. 예를 들어 문헌 [Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31, 3497-3500]), T-커피(Coffee) (cf. 예를 들어 문헌 [Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217]), 또는 이들 프로그램 또는 알고리즘을 바탕으로 하는 프로그램들이다. 본 발명의 목적상, 서열 비교 및 정렬은 바람직하게는 컴퓨터 프로그램 벡터(Vector) NTI® 스위트(Suite) 10.3 (인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation) 사, 미국 캘리포니아 칼스배드, 1600 패러데이 애비뉴 소재)을 사용하고 사전정의된 표준 (디폴트(default)) 파라미터를 사용하여 이루어진다.
그와 같은 비교는 비교되는 서열들의 서로에 대한 유사성을 밝히는 것을 가능케 한다. 그것은 보통 % 동일성, 즉 정렬시 동일한 위치 또는 서로 상응하는 위치에서의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 비율로 기록된다. 확장된 용어 상동성(homology)은 아미노산 서열의 경우에서 보존된 아미노산 치환체, 즉 유사한 특성을 갖는 아미노산을 고려하는데, 그들이 보통 단백질 내에서 유사한 활성 또는 기능을 발휘하기 때문이다. 따라서, 비교되는 서열들의 유사성은 % 상동성 또는 % 유사성으로 기록될 수도 있다. 동일성 및/또는 상동성 값은 전체 폴리펩티드 또는 유전자에 걸쳐, 또는 특정 영역에만 걸쳐 기록될 수 있다. 이에 따라, 상이한 핵산 또는 아미노산 서열들의 상동성이거나 동일한 영역은 서열의 합동성(congruity)으로 정의된다. 그들은 종종 동일하거나 유사한 기능을 가진다. 그들은 소형이어서 수 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산만을 포함할 수 있다. 그와 같은 소형 영역은 종종 단백질의 전체 활성에 대하여 필수적인 기능을 발휘한다. 따라서, 특정의 소형일 수 있는 영역만을 서열 합동성의 기준으로 하는 것이 타당할 수도 있다. 그러나, 다르게 표시되지 않는 한, 본 출원에서의 동일성 또는 상동성 값은 표시된 다양한 핵산 또는 아미노산 서열의 전체 길이에 대한 것이다.
핵산 서열 b)에 의해 코딩되는 단백질은 또한 추가적인 아미노산 서열을 포함한다. 결론적으로, 상기 아미노산 서열은 신호 펩티드가 없는 단백질의 실제 아미노산 서열이다. 바람직하게는, 상기 아미노산 서열은 성숙 단백질이다. 성숙 단백질은 그의 프로세싱 완료된 형태를 의미하는 것으로 이해되는데, 관련 유전자가 변역 후 추가적으로 프로세싱되어 성숙 형태를 산출하는 미성숙 형태를 코딩하는 것이 가능하기 때문이다. 예를 들어, 단백질의 미성숙 형태는 성숙 형태에 더 이상 존재하지 않는 신호 펩티드, 및/또는 N-말단 및/또는 C-말단의 프로펩티드(propeptide) 또는 연장체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 프로테아제, 더 구체적으로는 서브틸라제, 그중에서도 특히 서브틸리신의 미성숙 형태는 프로테아제의 성숙 형태에 더 이상 존재하지 않는 신호 펩티드 및 또한 프로펩티드를 포함하고 있다. 다르게는, 추가적인 아미노산 서열은 프로펩티드를 포함하는 미성숙 단백질의 아미노산 서열이다. 그와 같은 실시양태는 특별히 프로테아제, 더 구체적으로는 서브틸라제, 그중에서도 특히 서브틸리신(subtilisin)에 대해서도 고려한 것이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 추가적인 아미노산 서열은 추가적인 신호 펩티드를 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 그와 같은 실시양태에서는, 본 발명에 따른 신호 펩티드만이 숙주 세포로부터의 단백질의 분비를 야기한다.
특히 바람직하게는, 단백질의 추가적인 아미노산 서열은 효소, 더 구체적으로는 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 만난아제, 탄나제, 크실라나제, 크산타나제, 크실로글루카나제, β-글루코시다제, 펙틴-절단 효소, 카라기나제, 퍼히드롤라제, 옥시다제, 옥시도리덕타제 또는 리파제, 더 구체적으로는 하기에서 나타내는 바와 같은 효소의 아미노산 서열을 포함한다. 매우 특히 바람직하게는, 단백질의 추가적인 아미노산 서열은 프로테아제의 아미노산 서열을 포함하며, 여기에는 서브틸리신이 포함된다.
예를 들어, 하기에서 언급되는 효소들 중 1종이 본 발명에 따른 발현 벡터를 사용하여 유리하게 제조될 수 있다.
프로테아제 중에서는, 서브틸리신이 바람직하다. 그의 예로는 서브틸리신 BPN' 및 칼스버그(Carlsberg), 프로테아제 PB92, 서브틸리신 147 및 309, 바실루스 렌투스 유래의 알칼리 프로테아제, 서브틸리신 DY, 및 서브틸라제로 할당되어야 하나 더 좁은 의미에서는 더 이상 서브틸리신에는 속하지 않는 효소들 (이들은 서미타제, 프로테이나제 K 및 프로테아제 TW3 및 TW7임)이 있다. 서브틸리신 칼스버그는 덴마크 바그스배르드 소재 노보자임스(Novozymes) A/S 사로부터 알칼라제(Alcalase)®라는 상표명하에 추가 개발된 형태로 구입가능하다. 서브틸리신 147 및 309는 에스페라제(Esperase)® 또는 사비나제(Savinase)®라는 상표명으로 노보자임스 사에 의해 시판되고 있다. 바실루스 렌투스 유래의 프로테아제인 DSM 5483로부터 유래하는 것은 BLAP®라는 명칭으로 알려져 있는 프로테아제 변종이다. 또한, 다른 바람직한 프로테아제로는 예를 들어 PUR라는 명칭으로 알려져 있는 효소가 있다. 또한, 다른 프로테아제로써, 노보자임스 사로부터 듀라자임(Durazym)®, 렐라제(Relase)®, 에버라제(Everlase)®, 나피자임(Nafizym)®, 나탈라제(Natalase)®, 칸나제(Kannase)®, 및 오보자임(Ovozyme)®이라는 상표명으로 구입가능한 효소들, 제넨코르(Genencor) 사로부터 퓨라펙트(Purafect)®, 퓨라펙트® OxP, 퓨라펙트® 프라임(Prime), 엑셀라제(Excellase)® 및 프로페라제(Properase)®라는 상표명으로 구입가능한 효소들, 인도 탄네 소재 어드밴스드 바이오케미칼즈(Advanced Biochemicals) Ltd. 사로부터 프로토졸(Protosol)®이라는 상표명으로 구입가능한 효소들, 중국 소재 욱시 스나이더 바이오프라덕츠(Wuxi Snyder Bioproducts) Ltd. 사로부터 욱시®라는 상표명으로 구입가능한 효소들, 일본 나고야 소재 아마노 파마슈티칼즈(Amano Pharmaceuticals) Ltd. 사로부터 프로리더(Proleather)® 및 프로테아제(Protease) P®라는 상표명으로 구입가능한 효소들, 그리고 일본 도쿄 소재 카오(Kao) Corp. 사로부터 프로테이나제(Proteinase) K-16이라는 명칭으로 구입가능한 효소가 있다. 역시 바람직한 것은 또한 국제 특허 출원 WO2008/086916호 및 WO2007/131656호에 개시되어 있는 바실루스 기브소니이(Bacillus gibsonii) 및 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus) 유래의 프로테아제들이다.
아밀라제의 예는 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 또는 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 그리고 특히 또한 세척제 또는 세정제에서의 용도를 위하여 개선된 이들의 추가 개발체로부터 유래하는 α-아밀라제이다. 바실루스 리케니포르미스 유래의 효소는 노보자임스 사로부터 테르마밀(Termamyl)®이라는 명칭으로, 그리고 다니스코/제넨코르(Danisco/Genencor) 사로부터 퓨라스타(Purastar)®ST라는 명칭으로 구입가능하다. 이와 같은 α-아밀라제의 추가 개발체로부터의 생성물은 노보자임스 사로부터 듀라밀® 및 테르마밀®울트라라는 상표명으로, 다니스코/제넨코르 사로부터 퓨라스타®OxAm이라는 명칭으로, 그리고 일본 도쿄 소재 다이와 세이코 인크.(Daiwa Seiko Inc.) 사로부터 케이스타제(Keistase)®로 구입가능하다. 바실루스 아밀로리퀘파시엔스의 α-아밀라제는 노보자임스 사에 의해 BAN®이라는 명칭으로 시판되고 있으며, 바실루스 스테아로써모필루스 유래 α-아밀라제의 유도 변종 역시 노보자임스 사에 의해 BSG® 및 노바밀(Novamyl)®이라는 명칭으로 시판되고 있다. 또한, 바실루스 종 A7-7 (DSM 12368) 유래의 α-아밀라제 및 바실루스 아가라데렌스(Bacillus agaradherens) (DSM 9948) 유래의 시클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제 (CGTase)가 언급되어야 한다. 마찬가지로, 상기 언급된 모든 분자들의 융합 생성물들이 사용가능하다. 또한, 아스페르길루스 니제르(Aspergillus niger) 및 A. 오리자에(oryzae) 유래 α-아밀라제의 추가 개발체들이 적합한데, 상기 추가 개발체들은 노보자임스 사로부터 풍가밀(Fungamyl)®이라는 상표명으로 구입가능하다. 추가적인 유리한 시중의 생성물로는 예를 들어 다니스코/제넨코르 사로부터의 아밀라제인 파워라제(Powerase)®, 그리고 아밀라제인 아밀라제-LT®, 스테인자임(Stainzyme)® 및 스테인자임 플러스® (후자는 노보자임스 사의 것임)가 있다. 점 돌연변이에 의해 수득가능한 이들 효소의 변종들 역시 본 발명에 따라 제조될 수 있다. 추가적인 바람직한 아밀라제들이 국제 공개 명세서 WO 00/60060호, WO 03/002711호, WO 03/054177호 및 WO 07/079938호에 개시되어 있는 바, 그 개시는 의거 명시적으로 본원에 참조로써 개재되며, 그의 관련 개시 내용은 의거 명시적으로 본 특허 출원에 개재된다. 또한, 본 발명에 따라 제조될 아밀라제는 바람직하게는 α-아밀라제이다.
리파제 또는 큐티나제의 예는 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) (써모미세스 라누기노수스(Thermomyces lanuginosus)), 더 구체적으로는 아미노산 치환 D96L을 갖는 것들에서 원래 가용하거나 그로부터 추가 개발된 리파제들이다. 이들은 예를 들어 노보자임스 사에 의해 리폴라제(Lipolase)®, 리폴라제®울트라, 리포프라임(LipoPrime)®, 리포자임(Lipozyme)® 및 리펙스(Lipex)®이라는 상표명으로 시판되고 있다. 또한, 예를 들어 원래 푸사리움 솔라니 피지(Fusarium solani pisi) 및 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens)에서 단리되어 왔던 큐티나제를 제조하는 것이 가능하다. 다니스코/제넨코르 사에서는, 예를 들어 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina) 및 푸사리움 솔라니이(Fusarium solanii)로부터 원래 개시 효소가 단리되었던 리파제 또는 큐티나제를 제조하는 것이 가능하다. 언급되어야 하는 추가적인 중요한 시중의 생성물로는 기스트-브로케이드스(Gist-Brocades) 사 (현 다니스코/제넨코르 사)에 의해 원래 시판되던 제제 M1 리파제® 및 리포맥스(Lipomax)®, 및 일본 소재 메이토 산교(Meito Sangyo) KK 사에 의해 리파제 MY-30®, 리파제 OF® 및 리파제 PL®이라는 명칭으로 시판되고 있는 효소들, 그리고 또한 다니스코/제넨코르 사로부터의 생성물 루마패스트(Lumafast)®이 있다.
셀룰라제 (엔도글루카나제, EG)의 예에는 진균의 서열인 엔도글루카나제(EG)-풍부 셀룰라제 제제, 또는 노보자임스 사에 의해 셀루자임(Celluzyme)®이라는 상표명으로 공급되는 그의 추가 개발체가 포함된다. 역시 노보자임스 사로부터 구입가능한 생성물 엔돌라제(Endolase)® 및 케어자임(Carezyme)®은 각각 휴미콜라 인솔렌스 DSM 1800 유래의 50 kD EG 및 43 kD EG를 바탕으로 한다. 제조될 수 있는 상기 회사의 추가적인 시중 생성물은 셀루소프트(Cellusoft)®, 레노자임(Renozyme)® 및 셀루클린(Celluclean)®이다. 예를 들어 핀란드 소재 AB 엔자임스 사로부터 에코스톤(Ecostone)® 및 바이오터치(Biotouch)®라는 상표명으로 구입가능하며 적어도 부분적으로 멜라노카르푸스(Melanocarpus) 유래의 20 kD EG를 바탕으로 하는 셀룰라제를 제조하는 것 또한 가능하다. AB 엔자임스 사로부터의 추가적인 셀룰라제로는 에코나제® 및 에코펄프(Ecopulp)®이 있다. 추가적인 적합한 셀루라제로는 바실루스 종 CBS 670.93 및 CBS 669.93으로부터의 것이 있는데, 바실루스 종 CBS 670.93 유래의 것은 다니스코/제넨코르 사로부터 퓨라닥스(Puradax)®라는 상표명으로 구입가능하다. 제조될 수 있는 다니스코/제넨코르 사의 추가적인 시중의 생성물은 "제넨코르 세정제 셀룰라제 L" 및 인디에이지(IndiAge)®뉴트라이다.
점 돌연변이에 의해 수득가능한 이들 효소의 변종 역시 본 발명에 따라 제조될 수 있다. 특히 바람직한 셀룰라제는 국제 공개 명세서 WO 98/12307호에 개시되어 있는 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris) 셀룰라제 변종, 국제 공개 명세서 WO 97/14804호에 개시되어 있는 멜라노카르푸스(Melanocarpus), 더 구체적으로는 멜라노카르푸스 알보미세스(Melanocarpus albomyces) 유래의 셀룰라제, 유럽 특허 출원 EP 1 305 432호에 개시되어 있는 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei) 유래의 EGIII 셀룰라제 또는 그로부터 수득가능한 변종들, 더 구체적으로는 유럽 특허 출원 EP 1240525호 및 EP 1305432호에 개시되어 있는 것들, 그리고 또한 국제 공개 명세서 WO 1992006165호, WO 96/29397호 및 WO 02/099091호에 개시되어 있는 셀룰라제들이다. 이들의 각 개시는 의거 명시적으로 본원에 참조로써 개재되며, 그의 관련 개시 내용은 의거 명시적으로 본 특허 출원에 개재된다.
또한, 헤미셀룰라제라는 용어에 의해 포괄되는 추가적인 효소들을 제조하는 것이 가능하다. 여기에는 예를 들어 만난아제, 크산탄 리아제, 크산타나제, 크실로글루카나제, 크실라나제, 풀루라나제, 펙틴-절단 효소 및 β-글루카나제가 포함된다. 바실루스 서브틸리스로부터 수득되는 β-글루카나제는 노보자임스 사로부터 세레플로(Cereflo)®라는 명칭으로 구입가능하다. 본 발명에 있어서 특히 바람직한 헤미셀룰라제는 예를 들어 노보자임스 사로부터 만나웨이(Mannaway)®라는 상표명으로, 또는 제넨코르 사로부터 퓨라브라이트(Purabrite)®라는 상표명으로 시판되고 있는 만난아제이다. 본 발명의 목적상, 펙틴-절단 효소에도 역시 펙티나제, 펙테이트 리아제, 펙틴에스테라제, 펙틴 데메톡실라제, 펙틴 메톡실라제, 펙틴 메틸에스테라제, 펙타제, 펙틴 메틸에스테라제, 펙티노에스테라제, 펙틴 펙틸히드롤라제, 펙틴 데폴리머라제, 엔도폴리갈락투로나제, 펙톨라제, 펙틴 히드롤라제, 펙틴 폴리갈락투로나제, 엔도폴리갈락투로나제, 폴리-α-1,4-갈락투로니드 글리카노히드롤라제, 엔도갈락투로나제, 엔도-D-갈락투로나제, 갈락투란 1,4-α-갈락투로니다제, 엑소폴리갈락투로나제, 폴리갈락투로네이트 히드롤라제, 엑소-D-갈락투로나제, 엑소-D-갈락투로나나제, 엑소폴리-D-갈락투로나제, 엑소-폴리-α-갈락투로노시다제, 엑소폴리갈락투로노시다제 또는 엑소폴리갈락투라노시다제라는 명칭을 갖는 효소들이 포함된다. 이와 관련하여 적합한 효소의 예는 예를 들어 노보자임스 사로부터 감마나제(Gamanase)®, 펙티넥스(Pektinex) AR®, X-펙트(Pect)® 또는 펙타웨이(Pectaway)®이라는 명칭으로, AB 엔자임스 사로부터 로하펙트(Rohapect) UF®, 로하펙트 TPL®, 로하펙트 PTE100®, 로하펙트 MPE®, 로하펙트 MA 플러스 HC, 로하펙트 DA12L®, 로하펙트 10L®, 로하펙트 B1L®이라는 명칭으로, 그리고 미국 캘리포니아 샌디에고 소재 디베르사(Diversa) Corp. 사로부터 피롤라제(Pyrolase)®라는 명칭으로 구입가능하다.
또한, 옥시도리덕타제, 예를 들어 옥시다제, 옥시제나제, 카탈라제, 퍼옥시다제, 예컨대 할로퍼옥시다제, 클로로퍼옥시다제, 브로모퍼옥시다제, 리그닌 퍼옥시다제, 글루코스 퍼옥시다제 또는 망간 퍼옥시다제, 디옥시제나제 또는 락카제 (페놀 옥시다제, 폴리페놀 옥시다제)를 제조하는 것 역시 가능하다. 언급되어야 하는 적합한 시중의 생성물로 노보자임스 사의 데닐라이트(Denilite)® 1 및 2가 있다. 추가적인 효소들이 국제 특허 출원 WO 98/45398호, WO 2005/056782호, WO 2004/058961호 및 WO 2005/124012호에 개시되어 있다.
본 발명의 추가적인 실시양태에서, 추가적인 아미노산 서열은 자연에서는 미생물의 폴리펩티드 사슬에 신호 펩티드와 함께 존재하지 않는다. 결론적으로, 핵산 서열 b)에 의해 코딩되는 단백질은 재조합 단백질이다. 따라서, 자연에서 존재하지 않는다는 것은 2종의 아미노산 서열이 미생물 내생 단백질의 구성요소가 아니라는 것을 의미한다. 따라서, 신호 펩티드 및 추가적인 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 해당 야생형 형태에서 미생물 염색체 DNA의 일부인 핵산 서열에 의해서는 미생물 내에서 발현될 수 없다. 결론적으로, 그와 같은 단백질 및/또는 그를 코딩하는 핵산 서열은 매 경우 미생물의 야생형 형태에는 존재하지 않거나, 및/또는 미생물의 야생형 형태로부터는 단리될 수 없다. 따라서, 양자가 미생물의 야생형 형태에는 전혀 존재하지 않거나 존재할 수 없는 경우, 양 서열 - 신호 펩티드 및 추가적인 아미노산 서열 -은 반드시 미생물의 야생형 형태에서 2종의 상이한 폴리펩티드 사슬에 할당되어 있다. 따라서, 본 발명의 이와 같은 실시양태의 맥락에서, 신호 펩티드 및 추가적인 아미노산 서열, 또는 이들을 코딩하는 핵산은 유전자-기술 방법을 사용하여 새로 조합되었는데, 신호 펩티드와 추가적인 아미노산 서열의 이와 같은 조합은 자연에는 존재하지 않는다. 결론적으로, 미생물의 야생형 형태에는 신호 펩티드의 추가적인 아미노산 서열과의 그와 같은 결합은 존재하지 않는데, 구체적으로 DNA 수준은 물론 단백질 수준에서도 그렇지 않다. 그러나, 신호 펩티드와 추가적인 아미노산 서열, 또는 그들 양자를 코딩하는 핵산 서열은 모두 자연 기원의 것일 수 있으나, 이들의 조합은 자연에는 존재하지 않는다. 그러나, 신호 펩티드 및 추가적인 아미노산 서열 자체는 동일한 미생물 아니면 상이한 미생물로부터 기원할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 핵산은 그것이 비자연 핵산임을 특징으로 한다. 비자연은 본 발명에 따른 핵산이 자연에서 출현하는 해당 야생형 형태의 생물체에서는 단리될 수 없다는 것을 의미한다. 따라서 더 구체적으로, 야생형 박테리아과 관련하여, 본 발명에 따른 핵산은 박테리아에 있어서 내생적인 핵산은 아니다. 바람직하게는, 서열 (a) 및 (b)는 동일한 생물체(들), 더 구체적으로는 박테리아로부터 기원하지 않으며, 대신 상이한 생물체, 더 구체적으로는 박테리아로부터 기원한다. 상이한 박테리아는 예를 들어 상이한 균주 또는 종 또는 속에 속하는 박테리아이다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 핵산 서열 b)에 의해 코딩되는 단백질에서 신호 펩티드가 추가적인 아미노산 서열에 대하여 N-말단에 배열되는 것을 특징으로 한다. 따라서, 핵산 서열 b)에 의해 코딩되는 단백질은 하기의 구조를 가진다: N-말단-신호 펩티드-(임의의 추가적인 아미노산 서열)-추가적인 아미노산 서열-C-말단. 발현될 단백질의 이와 같은 구조는 특히 유리한 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 추가적인 실시양태에서, 발현 벡터는 핵산 서열 b)에 의해 코딩되는 단백질이 단백질의 신호 펩티드와 추가적인 아미노산 서열 사이에 배열되는 연결 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 핵산 서열 b)에 의해 코딩되는 단백질은 하기의 구조를 가진다: N-말단-신호 펩티드-연결 서열 (또한 "커플러(coupler)" 또는 "스페이서(spacer)")-추가적인 아미노산 서열-C-말단. 발현될 단백질의 그와 같은 구조 역시 특히 유리한 것으로 밝혀졌다. 바람직하게는, 상기 연결 서열의 길이는 1 내지 50개 아미노산, 2 내지 25개 아미노산 사이, 2 내지 15개 아미노산 사이, 3 내지 10개 아미노산 사이, 특히 바람직하게는 3 내지 5개 아미노산 사이이다. 특히 바람직한 연결 서열의 예는 알라닌, 글루탐산 및 페닐알라닌 (N-말단에서 C-말단으로)의 아미노산 연속체이다.
본 발명의 추가적인 실시양태에서, 발현 벡터는 단백질의 추가적인 아미노산 서열이 프로테아제의 아미노산 서열을 포함하며, 프로테아제의 상기 아미노산 서열은 서열 7과 80% 이상 동일한 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 프로테아제의 아미노산 서열은 서열 7과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일하다.
다르게는, 단백질의 추가적인 아미노산 서열은 서열 8과 80% 이상 동일한 프로테아제의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 프로테아제의 아미노산 서열은 서열 8과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일하다.
다르게는, 단백질의 추가적인 아미노산 서열은 서열 9와 80% 이상 동일한 프로테아제의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 프로테아제의 아미노산 서열은 서열 9와 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일하다.
다르게는, 단백질의 추가적인 아미노산 서열은 서열 10과 80% 이상 동일한 프로테아제의 아미노산 서열을 포함하며, 서열 10에 따른 넘버링으로 위치 99에 아미노산 글루탐산 (E) 또는 아스파르트산 (D)을 가진다. 바람직하게는, 프로테아제의 아미노산 서열은 서열 10에 따른 넘버링으로 위치 1 내지 98 및 100 내지 269에서 서열 10과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하며, 매우 특히 바람직하게는 동일하다.
다르게는, 단백질의 추가적인 아미노산 서열은 서열 10과 80% 이상 동일한 프로테아제의 아미노산 서열을 포함하며, 서열 10에 따른 넘버링으로 위치 99에 아미노산 글루탐산 (E) 또는 아스파르트산 (D)을 가지고, 또한 서열 10에 따른 넘버링으로 하기 위치의 아미노산들 중 하나 이상을 가진다:
(a) 위치 3의 트레오닌 (3T),
(b) 위치 4의 이소류신 (4I),
(c) 위치 61의 알라닌, 트레오닌 또는 아르기닌 (61A, 61T 또는 61R),
(d) 위치 154의 아스파르트산 또는 글루탐산 (154D 또는 154E),
(e) 위치 188의 프롤린 (188P),
(f) 위치 193의 메티오닌 (193M),
(g) 위치 199의 이소류신 (199I),
(h) 위치 211의 아스파르트산, 글루탐산 또는 글리신 (211D, 211E 또는 211G),
(i) (a) 내지 (h) 아미노산들의 조합.
바람직하게는, 이와 같은 프로테아제의 아미노산 서열은 변형되지 않거나 변형이 예정되지 않는 모든 위치에서 서열 10과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하며, 매우 특히 바람직하게는 동일하다. 따라서, 매우 특히 바람직하게는, 단백질의 추가적인 아미노산 서열은 서열 10과 관련하여 2개 이상의 위치에서 변형된 아미노산 서열을 갖는 프로테아제의 아미노산 서열을 포함하는데, 첫 번째 변형은 서열 10에 따른 넘버링으로 위치 99에서의 글루탐산이며, 두 번째 변형은 서열 10에 따른 넘버링으로 하기 위치의 아미노산들로 구성되는 군에서 선택된다:
(a) 위치 3의 트레오닌 (3T),
(b) 위치 4의 이소류신 (4I),
(c) 위치 61의 알라닌, 트레오닌 또는 아르기닌 (61A, 61T 또는 61R),
(d) 위치 154의 아스파르트산 또는 글루탐산 (154D 또는 154E),
(e) 위치 188의 프롤린 (188P),
(f) 위치 193의 메티오닌 (193M),
(g) 위치 199의 이소류신 (199I),
(h) 위치 211의 아스파르트산, 글루탐산 또는 글리신 (211D, 211E 또는 211G),
(i) (a) 내지 (h) 아미노산들의 조합.
역시 매우 특히 바람직하게는, 단백질의 추가적인 아미노산 서열은 서열 10과 관련하여 2개 이상의 위치에서 변형된 아미노산 서열을 갖는 프로테아제의 아미노산 서열을 포함하며, 첫 번째 변형은 서열 10에 따른 넘버링으로 위치 99에서의 아스파르트산이고, 두 번째 변형은 서열 10에 따른 넘버링으로 하기 위치의 아미노산들로 구성되는 군에서 선택된다:
(a) 위치 3의 트레오닌 (3T),
(b) 위치 4의 이소류신 (4I),
(c) 위치 61의 알라닌, 트레오닌 또는 아르기닌 (61A, 61T 또는 61R),
(d) 위치 154의 아스파르트산 또는 글루탐산 (154D 또는 154E),
(e) 위치 188의 프롤린 (188P),
(f) 위치 193의 메티오닌 (193M),
(g) 위치 199의 이소류신 (199I),
(h) 위치 211의 아스파르트산, 글루탐산 또는 글리신 (211D, 211E 또는 211G),
(i) (a) 내지 (h) 아미노산들의 조합.
상기 언급된 프로테아제 역시 본 발명에 따른 발현 벡터를 사용하여 특히 유리하게 제조될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 이와 같은 실시양태의 경우, 신호 펩티드와 서브틸리신의 해당 조합은 발효 절차에서 특히 우수한 생성물 수율을 달성하는 것이 가능하도록 한다는 것이 밝혀졌다. 이와 관련하여서는, 성숙 프로테아제, 즉 프로세싱 완료된 생성물의 아미노산 서열이 상술되어 있다. 본 발명에 따른 발현 벡터에서는, 이와 관련하여 미성숙 프로테아제, 더 구체적으로는 예컨대 프로펩티드의 추가적인 서열을 포함시키는 것 역시 가능하다. 그와 같은 경우, 단백질의 추가적인 아미노산 서열은 프로테아제의 아미노산 서열 및 프로펩티드의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명의 추가적인 실시양태는 단백질의 추가적인 아미노산 서열이 프로펩티드 또는 그의 프로펩티드와 함께 프로테아제, 더 구체적으로는 상기한 바와 같은 프로테아제의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
일반적으로, 단백질의 추가적인 아미노산 서열이 단순히 성숙 단백질의 아미노산 서열을 포함할 필요는 없으며; 반대로 예를 들어 해당 아미노산 서열의 프로펩티드와 같은 추가적인 아미노산 서열을 포함하는 것이 가능하다. 이것은 프로테아제에 뿐만 아니라, 모든 단백질, 더 구체적으로는 모든 다른 유형의 효소들에도 적용된다.
본 발명에 따른 핵산 및 발현 벡터는 핵산의 변형을 위하여 원래 알려져 있는 방법들을 통하여 생성될 수 있다. 그와 같은 방법에 대해서는 예를 들어 문헌 [Fritsch, Sambrook and Maniatis, "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989]의 것과 같이 관련 매뉴얼에 나와 있으며, 생물공학 분야의 업계 숙련자에게 친숙하다. 그와 같은 방법의 예로는, 임의로 분자 생물학 및/또는 화학 또는 생화학의 다른 표준 방법들과 조합된 화학적 합성 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)이 있다.
본 발명에 따른 벡터를 함유하는 비인간 숙주 세포, 해당 숙주 세포가 사용되는 제조 방법, 및 해당 벡터 또는 숙주 세포의 용도가 모든 상기 언급된 본 발명의 주제 및 실시양태들과 추가적인 본 발명의 주제로서 연관된다. 따라서, 상기 설명들은 상응하여 상기 본 발명의 주제와 관련된다.
본 발명은 추가적으로 본 발명에 따른 발현 벡터를 함유하는 비인간 숙주 세포를 제공한다. 본 발명에 따른 발현 벡터는 바람직하게는 그의 형질전환에 의해 숙주 세포에 도입된다. 본 발명에 있어서, 이는 바람직하게는 본 발명에 따른 벡터를 미생물에 형질전환시킨 다음, 본 발명에 따른 숙주 세포를 구성하는 것에 의해 수행된다. 다르게는, 개별 구성요소, 즉 본 발명에 따른 벡터의 핵산 일부 또는 단편, 예를 들어 구성요소 (a) 및/또는 (b)가 그렇게 생성되는 숙주 세포가 본 발명에 따른 벡터를 포함하게 하는 방식으로 숙주 세포에 도입되는 것 역시 가능하다. 이와 같은 접근법은 숙주 세포가 이미 본 발명에 따른 벡터의 1종 이상 구성요소를 포함하고, 이후 적절하게 추가적인 구성요소가 보충되는 경우에 특히 적합하다. 세포를 형질전환시키는 방법은 선행 기술에 확립되어 있으며, 업계 숙련자에게 잘 알려져 있다. 원칙적으로는, 모든 세포, 즉 원핵 또는 진핵 세포가 숙주 세포로서 적합하다. 예를 들어 벡터를 사용한 형질전환 및 그의 안정한 확립과 관련하여 유리하게 유전적으로 조작될 수 있는 숙주 세포, 예컨대 단세포인 진균 또는 박테리아가 바람직하다. 또한, 바람직한 숙주 세포는 미생물 및 생물공학적 견지에서 용이하게 조작가능하다. 이는 예를 들어 배양의 용이성, 높은 성장 속도, 낮은 발효 배지 요구도, 및 외래 단백질에 대한 우수한 생산 및 분비 속도와 관련된다. 많은 경우에, 선행 기술에서 가용한 풍부한 상이한 시스템들 중에서 각 개별 경우에 따라 최적의 발현 시스템을 실험적으로 결정할 필요가 있다.
추가적인 바람직한 실시양태는 예를 들어 벡터상에서 가용하게 될 수 있지만 개시시부터 해당 세포에 존재할 수도 있는 유전적 조절 요소로 인하여, 그의 활성 측면에서 조절가능한 숙주 세포이다. 예를 들어, 그것은 활성화제로서 작용하는 화합물의 조절되는 첨가에 의해, 배양 조건을 변화시키는 것에 의해, 또는 특정 세포 밀도의 달성에 의해 발현되도록 자극될 수 있다. 이는 경제적인 단백질 생산을 가능케 한다.
바람직한 숙주 세포는 원핵 또는 박테리아 세포이다. 박테리아는 짧은 세대 시간 및 배양 조건 면에서 낮은 요구도를 가지고 있다. 결과적으로, 비용-효과적인 방법을 확립하는 것이 가능하다. 또한, 박테리아의 경우에는 발효 기술에 있어서 업계 숙련자에게 풍부한 경험이 가용하다. 구체적인 생산 공정을 위해서는, 영양소 공급원, 생성물 형성 속도, 요구 시간 등과 같이 개별 기준으로 실험적으로 결정되어야 하는 매우 다양한 여러 이유로 그람-음성 또는 그람-양성의 박테리아가 적합할 수 있다.
그람-음성 박테리아, 예를 들어 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 경우, 주변세포질 공간(periplasmic space), 즉 세포를 둘러싸고 있는 2개 막 사이의 구획으로 다수의 폴리펩티들이 분비된다. 이는 특정 적용분야에 유리할 수 있다. 또한, 주변세포질 공간으로 뿐만 아니라, 박테리아를 둘러싸고 있는 배지로도 발현된 폴리펩티드를 그것이 방출하도록 하는 방식으로 그람-음성 박테리아를 구성하는 것 역시 가능하다. 반면, 그람-양성 박테리아, 예를 들어 바실루스(Bacilli) 또는 악티노미세타세아에(Actinomycetaceae) 또는 다른 대표적인 악티노미세츠는 외부 막을 가지고 있지 않으며, 그에 따라 분비되는 단백질을 박테리아를 둘러싸고 있는 배지, 일반적으로는 배양 배지로 바로 방출함으로써, 그로부터 발현 폴리펩티드가 정제될 수 있다. 그것은 배지로부터 직접 단리되거나 추가적으로 처리될 수 있다. 또한, 그람-양성 박테리아는 기술적으로 중요한 효소들의 기원이 되는 대부분의 생물체와 관련이 있거나 그와 동일하며, 보통 그 자체가 유사한 효소를 형성하기 때문에, 유사한 코돈 용법을 가지고 있어서, 해당 단백질-합성 장치가 자연스럽게 적절하게 구성된다.
코돈 용법은 유전자 코드의 아미노산으로의 번역, 즉 어떤 뉴클레오티드 순서 (삼중자(triplet) 또는 염기 삼중자)가 어떤 아미노산, 또는 어떤 기능 예를 들어 번역될 영역의 개시 및 종료, 다양한 단백질들에 대한 결합 부위 등을 코딩하는지를 의미하는 것으로 이해된다. 예컨대, 각 생물체, 더 구체적으로 각 생산 균주는 특정 코돈 용법을 가지고 있다. 숙주 세포 내 트랜스제닉 핵산상의 코돈이 상대적으로 적은 수의 적재 tRNA와 조우하게 되는 경우, 단백질 생합성에 있어서 애로사항이 발생할 수 있다. 반면, 숙주에 따라서는 동일 의미의 코돈이 동일한 아미노산을 코딩함으로써, 더 효율적으로 번역될 수 있다. 따라서, 이와 같이 임의로 요구되는 전사는 발현 시스템의 선택에 따라 달라진다. 특히 미지의 배양불가능할 수 있는 생물체로 구성되는 샘플의 경우에는, 상응하는 적합화가 필요할 수 있다.
원칙적으로, 본 발명은 모든 미생물, 더 구체적으로는 모든 발효가능 미생물, 특히 바람직하게는 바실루스 속의 것들에 적용가능하며, 결과적으로 생산 생물체로서의 그와 같은 미생물의 사용을 통하여 발효 절차에서의 증가된 생성물 수율을 구현하는 것이 가능하다. 그와 같은 미생물이 본 발명의 목적상 바람직한 숙주 세포이다.
따라서, 본 발명의 추가적인 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아, 바람직하게는 에스케리키아(Escherichia), 클레브시엘라(Klebsiella), 바실루스(Bacillus), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 아르트로박터(Arthrobacter), 스트렙토미세스(Streptomyces), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속의 군에서 선택되는 것, 더욱 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 클레브시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 렌투스(Bacillus lentus), 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alcalophilus), 바실루스 글로비기이(Bacillus globigii), 바실루스 기브소니이(Bacillus gibsonii), 바실루스 클라우시이(Bacillus clausii), 바실루스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus), 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylococcus carnosus), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 아르트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxidans), 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토미세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor) 및 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)의 군에서 선택되는 것임을 특징으로 한다. 매우 특히 바람직한 것은 바실루스 리케니포르미스이다.
그러나, 숙주 세포는 핵을 갖는 것을 특징으로 하는 진핵 세포일 수도 있다. 따라서, 본 발명은 추가적으로 핵을 갖는 것을 특징으로 하는 숙주 세포를 제공한다.
원핵 세포와 달리, 진핵 세포는 형성된 단백질을 번역 후에 변형시킬 수 있다. 그의 예로는 악티노미세타세아에와 같은 진균, 또는 사카로미세스(Saccharomyces) 또는 클루이베로미세스(Kluyveromyces)와 같은 효모가 있다. 이들은 예를 들어 단백질이 그의 합성과 관련하여 해당 시스템에 의해 허용되는 특정 변형을 받아야 하는 경우에 특히 유리할 수 있다. 특히 단백질 합성과 관련하여 진핵 시스템이 수행하는 변형에는 예를 들어 막 앵커(anchor) 또는 올리고당과 같은 저분자량 화합물의 결합이 포함된다. 그와 같은 올리고당 변형은 예를 들어 발현 단백질의 알레르기원성을 낮추는 데에 바람직할 수 있다. 그와 같은 세포에 의해 자연에서 형성되는 효소, 예를 들어 셀룰라제와의 공동발현이 유리할 수도 있다. 또한, 온도-내성 변종의 발현에는 예를 들어 호열성 진균 발현 시스템이 특히 적합할 수 있다.
본 발명의 목적상, 핵산 서열 (b)에 의해 코딩되는 단백질, 더 구체적으로 상기한 바와 같은 것들은 발효시에 형성되는 생성물인 것으로 간주된다. 따라서, 그들은 바람직하게는 효소, 특히 바람직하게는 프로테아제, 매우 특히 바람직하게는 서브틸리신이다.
또한, 숙주 세포는 배양 조건 면에서의 그의 요건과 관련하여 변형될 수 있거나, 다르거나 추가적인 선택 마커를 가질 수 있거나, 또는 다르거나 추가적인 단백질을 발현할 수 있다. 더 구체적으로, 숙주 세포는 다수의 단백질 또는 효소를 발현하는 것들일 수 있다. 바람직하게는, 그들은 숙주 세포를 둘러싸고 있는 배지로 그것을 분비한다.
본 발명에 따른 숙주 세포는 원래 알려져 있는 방식으로, 예를 들어 배치 시스템 또는 연속식 시스템에서 배양 및 발효된다. 첫 번째 경우에서는, 적절한 배양 배지에 숙주 세포가 접종되고, 실험적으로 결정된 기간 후 배지로부터 생성물이 수확된다. 연속식 발효 절차는 비교적 장기간에 걸쳐 세포가 부분적으로는 사멸하지만 또한 다시 성장하며 동시에 배지로부터 생성물이 제거될 수 있는 정상 상태(steady state)를 달성하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 숙주 세포는 바람직하게는 핵산 서열 (b)에 의해 코딩되는 단백질을 제조하는 데에 사용된다. 따라서, 본 발명은 추가적으로 하기를 포함하는 단백질의 제조 방법을 제공한다:
a) 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
b) 배양 배지 또는 숙주 세포로부터 단백질을 단리하는 단계.
본 발명의 주제는 바람직하게는 발효법을 포함한다. 발효법은 선행 기술에 원래 알려져 있으며, 일반적으로 제조되는 생성물, 예를 들어 단백질에 대한 적절한 정제법이 이어지는 실제 산업-규모의 생산 단계를 구성하고 있다. 상응하는 단백질 제조 방법을 포함하는 모든 발효법들이 본 발명 주제의 실시양태를 구성한다.
이와 관련하여, 제조 방법을 위한 다양한 최적의 조건들, 더 구체적으로는 사용되는 숙주 세포를 위한 최적의 배양 조건들은 예를 들어 발효 부피 및/또는 배지 조성 및/또는 산소 공급 및/또는 교반 속도와 관련한 업계 숙련자의 지식에 따라 실험적으로 결정되어야 한다.
연속식 공급 전략을 통하여 발효가 수행되는 것을 특징으로 하는 발효법이 한 가지 구체적인 가능성이다. 이 경우, 배양을 진행하면서 소비되는 배지 성분이 연속적으로 공급되는데; 이는 연속식 공급 전략으로도 알려져 있다. 결과적으로, 세포 밀도 및 세포괴(cell mass) 또는 건조괴(dry mass) 양자, 및/또는 특히 관심 단백질, 바람직하게는 효소의 활성에 있어서의 상당한 증가가 달성될 수 있다.
또한, 발효는 원치 않는 대사 생성물이 여과 제거되거나, 또는 각 경우에 적절한 완충제 또는 상대이온의 첨가에 의해 중화되는 방식으로 구성될 수도 있다.
제조되는 단백질은 발효 배지로부터 수확될 수 있다. 그와 같은 발효법은 숙주 세포로부터의 폴리펩티드의 단리, 즉 세포괴 (건조괴)로부터의 생성물 처리에 비해 유리하다. 본 발명에 있어서, 이와 관련하여 적합한 분비 마커에는 신호 펩티드가 제공된다.
상기에서 설명한 모든 사실들은 조합되어 단백질의 제조 방법을 형성할 수 있다. 이와 관련하여, 다수의 가능한 방법 단계 조합들을 생각할 수 있다. 최적의 방법은 각 특정 개별 경우별로 결정되어야 한다.
본 발명은 추가적으로 단백질을 제조하기 위한, 본 발명에 따른 발현 벡터 또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도를 제공한다.
상기에서 이미 기술된 모든 사실, 주제 및 실시양태들이 본 발명의 이와 같은 주제에도 적용가능하다. 따라서, 이 부분에서는 해당 개시가 본 발명에 따른 용도 (벡터 또는 숙주 세포의 용도)에도 적용된다는 말로써, 상응하는 부분의 개시를 명시적으로 참조한다.
실시예
모든 분자 생물학 작업 단계는 예를 들어 문헌 [Fritsch, Sambrook and Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989] 또는 유사 관련 문헌의 매뉴얼에 기재되어 있는 바와 같은 표준 방법에 따른다. 효소 및 키트는 각 제조자의 지침에 따라 사용하였다.
실시예 1: 본 발명에 따른 발현 벡터의 제조
SacI 제한 분해 및 이어지는 E. 콜라이 부분 부근에서의 재결찰에 의해 플라스미드 pBSMuL3 (문헌 [Brockmeier et al ., 2006])를 단축시켰다. 생성 플라스미드 pBSMuL5 (cf. 도 1)를 EcoRI 및 BamHI 제한 부위에 프로펩티드를 포함하는 프로테아제를 클로닝하기 위한 벡터로 사용하였다. 이를 위하여, 서열 11 및 서열 12에 따른 프라이머를 사용한 서열 8에 따른 프로테아제 유전자의 증폭, 그리고 서열 13 및 서열 14에 따른 프라이머를 사용한 서열 9에 따른 알칼리 프로테아제 유전자의 증폭을 수행하였다. 생성되는 플라스미드를 HindIII 및 EcoRI 제한 부위에 신호 펩티드를 클로닝하기 위한 벡터로 사용하였다. 서열 15 및 서열 16에 따른 프라이머를 사용하여, 벤치마크(benchmark)로서의 조절 신호 펩티드 SubC의 DNA 단편 (B. 리케니포르미스, NCBI (국가 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) 접근 번호: X91260.1)을 증폭한 후, 각 경우 플라스미드의 HindIII 및 EcoRI 제한 부위에 클로닝함으로써, 서열 8 (플라스미드 1) 또는 서열 9 (플라스미드 2)에 따른 프로테아제와 함께 신호 펩티드 SubC를 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 서열 b)를 갖는 플라스미드를 생성시켰다. 이후, 이들 플라스미드를 대조군 또는 벤치마크로서 사용하였다. 서열 19 및 서열 20에 따른 프라이머를 사용하여 서열 2에 따른 신호 펩티드의 DNA 단편을 증폭하고, 서열 17 및 서열 18에 따른 프라이머를 사용하여 서열 4에 따른 신호 펩티드의 DNA 단편을 증폭하고, 서열 21 및 서열 22에 따른 프라이머를 사용하여 서열 6에 따른 신호 펩티드의 DNA 단편을 증폭하였다. 서열 2 및 4에 따른 신호 펩티드의 DNA 단편들은 각각 서열 8에 따른 프로테아제를 코딩하는 벡터에 클로닝한 반면 (플라스미드 3 및 4), 서열 6에 따른 신호 펩티드의 DNA 단편은 서열 9에 따른 프로테아제를 코딩하는 벡터에 삽입하였다 (플라스미드 5). 클로닝과 관련하여, 아미노산 AEF의 연속체를 코딩하는 9개 뉴클레오티드 서열 (cf. 도 1)을 특정 신호 펩티드 DNA 서열과 특정 프로테아제의 프로펩티드 DNA 서열 사이에 도입하였다. 이와 같은 소위 연결 서열은 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI의 인식 서열을 함유한다. 프라이머로 사용된 모든 올리고뉴클레오티드를 하기 표 1에 목록화하였다:
실시예 2: 단백질의 발현
플라스미드 1 내지 5를 사용하여 바실루스 리케니포르미스 균주를 형질전환시킴으로써, 다양한 프로테아제 생성 균주를 수득하였다. 배양물의 접종에는, 밤새 (ON) 인큐베이팅된 아가 플레이트로부터의 단일 콜로니를 사용하였다. 분비 효율의 정량 측정을 위하여, 단일 콜로니를 바로 아가 플레이트로부터 딥-웰(deep-well) MTP (마이크로타이터 플레이트; 각각 1 mL의 선택적 LB 배지를 함유하는 96 웰)로 전달하였다. 해당 측정에서는, 특정 클론의 다수 배양의 결과로서 2반복 또는 3반복 측정치를 수득하기 위하여, 각 단일 콜로니를 동시에 2개 이상 웰에 전달하였다. 딥-웰 MTP의 접종에는, 37℃에서 밤새 인큐베이팅된 클론만을 사용하였다. 마이크로타이터 플레이트 진탕기 (헤칭겐 소재 에드문드-뷜러(Edmund-Buehler) 사의 티믹스(Timix) 5)에서의 37℃로 20시간 동안의 배양 후, LB 아가 플레이트상에서 모든 클론을 복제하고, 이어서 원심분리 (4000 rpm, 20분, 4℃)에 의해 세포를 침강시켰다. 이어지는 모든 피펫팅 단계는 다채널 피펫 (함부르크 소재 에펜도르프(Eppendorf) 사)을 사용하고 역상-피펫팅 모드를 사용하여 수행하였는데, 15 μl 미만의 부피는 피펫팅되지 않았다. 각 경우, 최저 부피를 처음에 MTP에 충전하고, 거기에 더 큰 부피를 첨가하였으며, 각 희석 단계에서는 분광광도측정기 "스펙트라맥스(Spectramax) 250" (미국 서니데일 소재 몰큘라 디바이시즈(MOlecular Devices) 사)에서 10초 동안 MTP를 혼합하였다. 상응하는 희석물의 생성을 위하여, 다채널 피펫을 사용하여 배양 상청액을 제거한 후, 마이크로타이터 플레이트 (96 웰, F-저부(bottom), 투명, 프리켄하우젠 소재 그레이너 바이오-원(Greiner Bio-One) 사)로 전달하였다.
이어서, 기질인 suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-니트로아닐리드 (suc-AAPF-pNA)로부터의 발색단인 파라-니트로아닐린 (pNA)의 방출을 통하여, 배양 상청액 또는 희석물에서의 단백질분해 활성을 측정하였다. 프로테아제는 기질을 절단하여 pNA를 방출한다. pNA의 방출은 410 nm에서의 흡광도의 증가를 야기하는데, 시간에 따른 그의 변화는 효소 활성의 척도이다 (cf. 문헌 [Del Mar et al., Anal. Biochem., 99: 316-320, 1979]).
여러 균주의 분비 효율 측정을 위하여, 각 MTP 배양에서 내부 대조군 구축물 (플라스미드 1 또는 플라스미드 2)을 동시에 배양하였다. 배양 상청액에서 측정하였을 때의 대조군 구축물을 갖는 균주의 단백질분해 활성을 100%로 정의하였다.
플라스미드 1을 포함하는 대조군에 비해, 본 발명에 따른 플라스미드 3 및 4를 함유하는 균주는 각각 194% +/- 48 및 230% +/- 38 증가된 프로테아제 활성을 달성하였다 (cf. 도 2).
플라스미드 2를 포함하는 대조군에 비해, 본 발명에 따른 플라스미드 5를 함유하는 균주는 44% +/- 10 증가된 프로테아제 활성을 달성하였다 (cf. 도 3).
도면의 설명
도 1: 바실루스 발현 벡터 pBSMul5 (문헌 [Brockmeier et al., 2006]로부터 변형)에서의 클로닝 전략의 도표. (A) 스페이서 영역 및 표준화된 메티오닌 개시 코돈이 후속하는 표준화된 리보좀 결합 부위 (RBS)인 HindIII 제한 부위를 사용하여 N-말단에서 신호 펩티드의 DNA 단편을 증폭하였음. "+1" 위치의 알라닌 및 EcoRI 제한 부위를 갖는 커플러를 신호 펩티드와 분비될 프로테아제의 N-말단 사이에 결합시켰음. (B) 바실루스 벡터 pBSMul5는 HpaII 프로모터, 특정 분비 표적 (EcoRI 및 BamHI을 통하여 클로닝됨), 및 카나마이신-내성 카세트, 그리고 바실루스용의 복제 단백질 repB를 가짐.
도 2: pBSMul5에 서열 8에 따른 프로테아제 및 3종의 상이한 신호 펩티드들을 함유하는 바실루스 리케니포르미스 배양 상청액에서의 상대적인 프로테아제 활성. 구축물 플라스미드 1의 단백질분해 활성을 100% (대조군)로 정의하였음. 2개 이상의 독립적인 배양에서 값들을 측정하였음. 오차 막대(error bar)는 표준 편차를 나타냄.
도 3: pBSMul5에 서열 9에 따른 프로테아제 및 2종의 상이한 신호 펩티드들을 함유하는 바실루스 리케니포르미스 배양 상청액에서의 상대적인 프로테아제 활성. 구축물 플라스미드 2의 단백질분해 활성을 100% (대조)로 정의하였음. 2개 이상의 독립적인 배양에서 값들을 측정하였음. 오차 막대는 표준 편차를 나타냄.
SEQUENCE LISTING
<110> Henkel AG & Co. KGaA
<120> Expressionsvektoren zur verbesserten Proteinsekretion
<130> H 09309 PCT
<150> DE 102011118032.3
<151> 2011-05-31
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 126
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(126)
<400> 1
atg gcg aaa cca cta tca aaa ggg gga att ttg gtg aaa aaa gta ttg 48
Met Ala Lys Pro Leu Ser Lys Gly Gly Ile Leu Val Lys Lys Val Leu
1 5 10 15
att gca ggt gca gta gga aca gca gtt ctt ttc gga acc ctt tca tca 96
Ile Ala Gly Ala Val Gly Thr Ala Val Leu Phe Gly Thr Leu Ser Ser
20 25 30
ggt ata cca ggt tta ccc gcg gca gac gct 126
Gly Ile Pro Gly Leu Pro Ala Ala Asp Ala
35 40
<210> 2
<211> 42
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 2
Met Ala Lys Pro Leu Ser Lys Gly Gly Ile Leu Val Lys Lys Val Leu
1 5 10 15
Ile Ala Gly Ala Val Gly Thr Ala Val Leu Phe Gly Thr Leu Ser Ser
20 25 30
Gly Ile Pro Gly Leu Pro Ala Ala Asp Ala
35 40
<210> 3
<211> 81
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(81)
<400> 3
atg aaa aaa cta ttc aaa acc att gtt aca ctg tca ctc ttg att tct 48
Met Lys Lys Leu Phe Lys Thr Ile Val Thr Leu Ser Leu Leu Ile Ser
1 5 10 15
gga acg ctt tta ttc tca caa tct gcg gcg gct 81
Gly Thr Leu Leu Phe Ser Gln Ser Ala Ala Ala
20 25
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> Bacillus licheniformis
<400> 4
Met Lys Lys Leu Phe Lys Thr Ile Val Thr Leu Ser Leu Leu Ile Ser
1 5 10 15
Gly Thr Leu Leu Phe Ser Gln Ser Ala Ala Ala
20 25
<210> 5
<211> 84
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(84)
<400> 5
atg aca ttg act aaa ctg aaa atg ctg agt atg tta acc gtg atg att 48
Met Thr Leu Thr Lys Leu Lys Met Leu Ser Met Leu Thr Val Met Ile
1 5 10 15
gca tct tta ttc att ttt tcc agt cag gca ctt gcc 84
Ala Ser Leu Phe Ile Phe Ser Ser Gln Ala Leu Ala
20 25
<210> 6
<211> 28
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 6
Met Thr Leu Thr Lys Leu Lys Met Leu Ser Met Leu Thr Val Met Ile
1 5 10 15
Ala Ser Leu Phe Ile Phe Ser Ser Gln Ala Leu Ala
20 25
<210> 7
<211> 269
<212> PRT
<213> Bacillus lentus
<400> 7
Ala Gln Thr Ile Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Asp Gly Arg Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210> 8
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Claims (10)
- a) 프로모터 서열, 및
b) 신호 펩티드 및 추가적인 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로서,
상기 신호 펩티드는 서열 2, 서열 4, 또는 서열 6에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 상기 단백질의 추가적인 아미노산 서열은 프로테아제의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 프로테아제의 아미노산 서열은
서열 7과 95% 이상 동일하거나,
서열 8과 95% 이상 동일하거나,
서열 9와 95% 이상 동일하거나,
서열 10과 95% 이상 동일하고 서열 10에 따른 넘버링으로 위치 99에 아미노산 글루탐산 (E) 또는 아스파르트산 (D)을 가지거나, 또는 서열 10과 95% 이상 동일하고 서열 10에 따른 넘버링으로 위치 99에 아미노산 글루탐산 (E) 또는 아스파르트산 (D)을 가지며 서열 10에 따른 넘버링으로 하기 위치의 아미노산들 중 하나 이상을 갖는 것인 발현 벡터:
(a) 위치 3의 트레오닌 (3T),
(b) 위치 4의 이소류신 (4I),
(c) 위치 61의 알라닌, 트레오닌 또는 아르기닌 (61A, 61T 또는 61R),
(d) 위치 154의 아스파르트산 또는 글루탐산 (154D 또는 154E),
(e) 위치 188의 프롤린 (188P),
(f) 위치 193의 메티오닌 (193M),
(g) 위치 199의 이소류신 (199I),
(h) 위치 211의 아스파르트산, 글루탐산 또는 글리신 (211D, 211E 또는 211G),
(i) (a) 내지 (h) 아미노산들의 조합. - 제1항에 있어서, 신호 펩티드가 핵산 서열 b)에 의해 코딩되는 단백질에서 추가적인 아미노산 서열의 N-말단에 배열되는 것인 발현 벡터.
- 제1항에 있어서, 핵산 서열 b)에 의해 코딩되는 단백질이 단백질의 신호 펩티드와 추가적인 아미노산 서열 사이에 배열되는 연결 서열을 추가로 포함하며, 상기 연결 서열의 길이는 1 내지 50개의 아미노산인 발현 벡터.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 비인간 숙주 세포.
- 제4항에 있어서, 박테리아, 또는 에스케리키아(Escherichia), 클레브시엘라(Klebsiella), 바실루스(Bacillus), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 아르트로박터(Arthrobacter), 스트렙토미세스(Streptomyces), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속의 군에서 선택되는 것, 또는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 클레브시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 렌투스(Bacillus lentus), 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alcalophilus), 바실루스 글로비기이(Bacillus globigii), 바실루스 기브소니이(Bacillus gibsonii), 바실루스 클라우시이(Bacillus clausii), 바실루스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus), 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylococcus carnosus), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 아르트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxidans), 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토미세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor) 및 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)의 군에서 선택되는 것, 또는 바실루스 리케니포르미스인 숙주 세포.
- (a) 제4항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
(b) 배양 배지 또는 숙주 세포로부터 단백질을 단리하는 단계
를 포함하는, 단백질의 제조 방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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