MX2013013616A - Vectores de expresion para una secrecion de proteina mejorada. - Google Patents
Vectores de expresion para una secrecion de proteina mejorada.Info
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Abstract
La finalidad de la invención es mejorar la secreción de una proteína a partir de una célula hospedera a fin de incrementar el rendimiento de producto de proteína en un proceso de fermentación. Esto se logra mediante un vector de expresión que comprende a) una secuencia de promotor y b) una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína. La proteína comprende un péptido de señal y una secuencia de aminoácidos adicional, y el péptido de señal comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO: 2, por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO: 4, por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO: 6, o el péptido de señal comprende una secuencia de aminoácidos que es estructuralmente homóloga a por lo menos una de dichas secuencias.
Description
VECTORES DE EXPRESIÓN PAPA UNA SECRECIÓN DE PROTEÍNA MEJORADA
La invención está en el campo de biotecnología, muy particularmente síntesis de proteína microbiana. La invención se refiere en particular a vectores de expresión para preparar proteínas y propone, además, células hospederas que comprenden dichos vectores de expresión. La invención además se refiere a métodos y usos de dichos vectores de expresión y células hospederas para preparación de proteína.
Para la preparación de proteínas, se pueden usar células hospederas, muy particularmente microorganismos, que expresan los genes de las proteínas de interés. El gen de una proteína de interés' (transgén) es generalmente introducido en las células hospederas de tal manera que es expresado por las mismas. Frecuentemente, está presente en un denominado vector de expresión junto con una o más secuencias promotoras (promotores), que permiten la expresión de gen.
Para producción biotecnológica a escala industrial, las células hospederas en cuestión son cultivadas en termentadores que están adaptados de acuerdo con las propiedades metabólicas de las células. Durante el cultivo, las células hospederas metabolizan el sustrato suministrado y forman el producto deseado, que después de que termina la fermentación, es usualmente separado de los organismos de producción y es purificado y/o concentrado de la suspensión
del fermentador y/o medio de fermentación.
Es inherentemente deseable obtener un rendimiento de producto muy alto en la fermentación. El rendimiento de producto depende de múltiples factores, por ejemplo las células hospederas usualmente forman, además del producto realmente deseado, una multiplicidad de sustancias adicionales que generalmente no son de interés. Además, la expresión del transgén y por lo tanto el rendimiento del producto depende sustancialmente del sistema de expresión usado. Por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 91/02792 describe la producción fermentativa mejorada de una proteasa alcalina de Bacillus lentus en una cepa optimizada de Bacillus licheniformis bajo el control de las secuencias reguladoras de gen de Bacillus licheniformis, muy particularmente el promotor de Bacillus licheniformis .
Para la producción industrial de proteínas, por ejemplo enzimas hidrolíticas , se da preferencia al uso de células hospederas capaces de secretar grandes cantidades de la proteína en el sobrenadante de cultivo, haciendo redundante la alteración de células elaborada, que es necesaria en la producción intracelular . Para este propósito, se da preferencia al uso de células hospederas, por ejemplo especies de Bacillus, que se pueden cultivar usando medios de cultivo .efectivos en costos en procedimientos de fermentación de densidad de células alta eficientes y son capaces de
secretar múltiples gramos por litro de la proteina objetivo en el sobrenadante de cultivo. Habitualmente , la proteina que ha de ser secretada es expresada por vectores de expresión que han sido introducidos en la célula hospedera y codifican la proteina que ha de ser secretada. La proteina expresada' usualmente comprende un péptido de señal (secuencia de señal) que lleva a cabo la exportación del mismo de las células hospederas. El péptido de señal es generalmente parte de la cadena de polipéptido traducida en la célula hospedera, pero además puede ser escindida post-traduccionalmente de la proteina dentro o fuera de la célula hospedera.
Especialmente para esta producción extracelular de proteínas heterólogas, sin embargo, existen numerosos cuellos de botella y una alta demanda correspondiente para la optimización de los procesos de secreción. Uno de estos cuellos de botella es la selección de un péptido de señal que permite la exportación eficiente de la proteína objetivo de la célula hospedera. Los péptidos de señal, en principio, pueden' ser recién combinados con proteínas, muy particularmente enzimas. Por ejemplo, la publicación de Brockmeier et al. (J. Mol. Biol . 362, páginas 393-402 (2006)) describe la estrategia de determinación selectiva de una biblioteca de péptido de señal usando el ejemplo de una cutinasa. Sin embargo, no todo péptido de señal también lleva a cabo la exportación adecuada de la proteína bajo
condiciones de fermentación, muy particularmente condiciones de fermentación industriales o a escala industrial.
Por lo tanto, un objeto de la invención es mejorar la secreción de una proteína a partir de una célula hospedera y, como resultado, incrementar el rendimiento del producto de proteína en un procedimiento de fermentación.
La invención provee un vector de expresión que comprende
'a) una secuencia de promotor y
b) una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína, la proteína comprendiendo un péptido de señal y una secuencia de aminoácidos adicional y el péptido de señal comprendiendo una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO. 2 o es por ló menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en la SEQ ID NO. 4 o es por lo menos 80% idéntica a la secuencia de áminoácidos especificada en SEQ ID NO. 6, o el péptido de señal que comprende una secuencia de aminoácidos que es estructuralmente homologa a por lo menos una de estas secuencias.
Se encontró sorprendentemente que un vector dé expresión que codifica una proteína que tiene dicho péptido de señal logra secreción mejorada de la proteína a partir de una célula hospedera que contiene el vector de expresión y que expresa la secuencia de ácido nucleico b) . Como
resultado, es posible en modalidades preferidas de la invención incrementar el rendimiento del producto de proteina en un procedimiento de fermentación.
Un vector de expresión es una secuencia de ácido nucleico que permite que la proteina sea expresada en una célula hospedera, muy particularmente un microorganismo. Comprende la información genética, es decir, la secuencia de ácido nucleico (gen) b) que codifica la proteina.
La expresión de una secuencia de ácido nucleico se convierte en producto (s) de gen codificado por dicha secuencia, es decir, en un polipéptido (proteina) o en múltiples polipéptidos (proteínas) . El término polipéptido y proteína se usan como sinónimos en la presente solicitud. Para el propósito de la presente invención, la expresión consecuentemente significa la biosíntesis de ácido ribonucleico (ARN) y proteínas a partir de la información genética. Generalmente, la expresión comprende la transcripción, es decir, la síntesis de un ácido ribonucleico mensajero (ARNm) sobre la base de la secuencia de ADN (ácido desoxirribonucleico ) del gen, y la traducción del ARNm en la cadena de polipéptido correspondiente, que además puede ser modificada post-traduccionalmente . La expresión de una proteína consecuentemente describe la biosíntesis de la misma a partir de la información genética que se provee de conformidad con la invención en el vector de expresión.
Los vectores son elementos genéticos que consisten de ácidos nucleicos, preferiblemente ácido desoxirribonucleico (ADN) , y son conocidos por un experto en la técnica en el campo de biotecnología. Particularmente cuando se usan en bacterias, son plásmidos específicos, es decir, elementos genéticos circulares. Los vectores, por ejemplo, pueden incluir aquellos que se derivan de plásmidos bacterianos, de virus o de bacteriófagos, o predominantemente vectores o plásmidos sintéticos que contienen elementos de muy diverso origen. Con los elementos genéticos adicionales presentes en cada caso, los vectores son capaces de establecerse en las células hospederas, en la cuales se han introducido preferiblemente por transformación, durante múltiples generaciones como unidades estables. A este respecto, es insignificante para el propósito de la invención si se establecen extracromosómicamente como unidades separadas o son integradas en el cromosoma o ADN cromosómico. Cuál de los numerosos sistemas se escoge depende del caso individual. Factores críticos, por ejemplo pueden ser el número de copias obtenible, los sistemas de selección disponibles, incluyendo especialmente las resistencias a antibióticos, o la capacidad de cultivo de las células hospederas capaces de captar vectores.
Los vectores de expresión, además, pueden ser regulados a través de cambios en las condiciones de cultivo,
por ejemplo, la densidad de células o la adición de compuestos particulares. Un ejemplo de dicho compuesto es el derivado de galactosa isopropil- -D-tiogalactopiranósido (IPTG), que se usa como un, activador de operón de lactosa bacteriana (operón lac) .
Un vector de expresión además comprende por lo menos una secuencia de ácido nucleico,* preferiblemente ADN, que tiene una función de control para la expresión de la secuencia de ácido nucleico b) que codifica la proteina (una denominada - secuencia reguladora de gen) . Una secuencia reguladora de gen, en este caso, es cualquier secuencia de ácido nucleico que, a través; de la presencia en la célula hospedera particular, afecta,' preferiblemente incrementa, la velocidad de. transcripción de la secuencia de ácido nucleico b) que codifica la proteina. Preferiblemente, es una secuencia de promotor, ya que dicha secuencia es esencial para expresión de la secuencia de ácido nucleico b) . Sin embargo, un vector de expresión de conformidad con la invención también comprende secuencias reguladoras de gen adicionales, por ejemplo, una o más secuencias incrementadoras . Un vector de expresión para los propósitos de la invención consecuentemente comprende por lo menos una unidad funcional compuesta de la secuencia de ácido nucleico b) y un promotor (cásete de expresión) . Puede, pero no necesariamente, estar presente como una entidad física. El
promotor realiza la expresión de la secuencia de ácido nucleico b) en la célula hospedera. Para el propósito de la presente invención, un vector de expresión también puede ser restringido al cásete de expresión compuesto de un promotor y secuencia de ácido nucleico b) que ha de ser expresada, siendo posible que el cásete de expresión sea integrado extracromosómicamente o bien cromosómicamente. Dichas modalidades de vectores de expresión de conformidad con la invención constituyen cada uno de ellas una modalidad separada de la invención.
La presencia de por lo menos un promotor es consecuentemente esencial para un vector de expresión de conformidad con la invención. Un promotor por lo tanto se entiende que significa una secuencia de ADN que permite la expresión regulada de un gen. Una secuencia de promotor es naturalmente un componente de un gen y a menudo está situada en el extremo 5' del mismo y por lo tanto antes de la región codificante de ARN. Preferiblemente, la secuencia de promotor en un vector de expresión de conformidad con la invención está situada hacia el extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico b) que codifica la proteina. La propiedad más importante de un promotor es la interacción especifica con por lo menos una proteina o polipéptido de unión a ADN que es mediador del inicio de la transcripción del gen por medio de una ARN polimerása y se refiere como un factor de
transcripción. Múltiples factores de transcripción y/o proteínas adicionales frecuentemente están implicados en el inicio de la transcripción por medio de una ARN polimerasa, Un promotor por lo tanto es preferiblemente una secuencia de ADN que tiene actividad de promotor, es decir, una secuencia de ADN a la cual por lo menos un factor de transcripción se une por lo menos transitoriamente a fin de iniciar la transcripción de un gen. La resistencia de un promotor es medible por la velocidad de transcripción del gen expresado, es decir, a través del número de moléculas de ARN, muy particularmente moléculas de ARNm, generadas por tiempo unitario .
Preferiblemente, la secuencia de promotor (a) y la secuencia de ácido nucleico (b) están atrás una de la otra en el vector de expresión. Muy preferiblemente, la secuencia de promotor (a) está situada adelante de la secuencia de ácido nucleico (b) en la molécula de ácido nucleico (en la orientación 5' —> 3' ) . También se prefiere que, entre las dos secuencias de ácido nucleico (a) y (b) , no haya secuencias de ácido nucleico que reduzcan la velocidad de transcripción de la secuencia de ácido nucleico (b) que codifica la proteína. Todos los enunciados anteriores se refieren a la hebra de ADN que contiene la secuencia de ácido nucleico (b) que codifica la proteína (la hebra codificante) y no la hebra de ADN complementaria asociada. Empezando a partir de la secuencia
de ácido nucleico (b) que codifica la proteina, la secuencia de promotor (a) está situada como consecuencia preferiblemente hacia el extremo 5' , es decir, en la dirección 5', en esta hebra de ADN.
La secuencia de ácido nucleico b) codifica la proteina que ha de ser secretada. En este caso, es aquella proteina que ha de ser preparada usando un vector de expresión de conformidad con la invención (proteina obj etivo) .
La proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico b) comprende un péptido de señal que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO. 2 o es por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO. 4 o es por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en la SEQ ID NO. 6. Se encontró que dichos péptidos de señal llevan a cabo secreción eficiente -de la proteína que - los comprende, muy particularmente proteina recombinante . Con preferencia cada vez mayor, el péptido de señal comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y muy particularmente preferiblemente 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO. 2, o es por lo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%,
90%, 91%, 92%, 93%, .94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y muy particularmente preferiblemente 100% idéntica a la secuencia ¦ de aminoácidos especificada en SEQ ID NO. 4, o es por lo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y muy particularmente preferiblemente 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO. 6. Con preferencia particular, el péptido de señal tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y muy particularmente preferiblemente 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO. 2, o es por lo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y muy particularmente preferiblemente 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO. 4, o es por lo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y muy particularmente preferiblemente 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO. 6.
Se da preferencia muy particular a las secuencias 100% idénticas en cada caso, y de esta manera el vector de expresión correspondientemente preferido es caracterizado porque el péptido de señal codificado por la secuencia de ácido nucleico b) tiene una secuencia de aminoácidos de
conformidad con SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4 o SEQ ID NO. 6. Secuencias de ácido nucleico particularmente preferidas que codifican dichos péptidos de señal son especificadas en SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 5.
En lugar de los péptidos de señal antes mencionados que permiten la secreción de la proteína, es además posible usar secuencias que son estructuralmente homologas a estas secuencias. Una secuencia estructuralmente homologa significa una secuencia de aminoácidos que tiene una sucesión de aminoácidos que presentas doblez espacial comparable con el de un péptido de señal que tiene la secuencia de aminoácidos de conformidad con SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4 o la SEQ ID NO. 6. Este doblez espacial permite ser reconocido por la célula hospedera como una secuencia de señal secretora y, consecuentemente, la proteína que comprende la secuencia de señal estructuralmente homologa que ha de ser transferida hacia el exterior de la célula hospedera. Preferiblemente, una interacción tiene lugar con el sistema de translocación usado por. la célula hospedera. Por lo tanto, la secuencia de aminoácidos estructuralmente homologa se une preferentemente en forma directa o indirectamente a por lo menos un componente del sistema de translocación de la célula hospedera. La unión directa se entiende como una interacción directa, y la unión indirecta se entiende como la interacción que puede tener lugar a través de uno o más componentes
adicionales, muy particularmente proteínas u otras moléculas, que actúan como adaptadores, por consiguiente, funcionan como un puente entre la secuencia de aminoácidos estructuralmente homologa y un componente del sistema de translocación de la célula hospedera.
La identidad de secuencias de ácido nucleico o aminoácidos se determina por una comparación de secuencias. Dicha comparación se logra asignando sucesiones similares en secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos unas a otras. Dicha comparación de secuencias preferiblemente se lleva a cabo sobre la base del algoritmo BLAST, que es establecido en la técnica . anterior y comúnmente usado (compárese por ejemplo, Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. y Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool . " J. Mol. Biol . 215: 403-410, y Altschul, Stephan ¦ F . , Thomas L . Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, y David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a' new generation of protein datábase search programs"; Nucleic Acids Res., 25, páginas 3389-3402), y ocurre principalmente al asignar sucesiones similares de nucleótidos o aminoácidos en las secuencias de ácido nucleico o aminoácidos unas a otras. Una asignación tabular de las posiciones en cuestión se refiere como una alineación. Un algoritmo adicional disponible en la técnica anterior es el algoritmo FASTA. Comparaciones de secuencias (alineaciones),
muy particularmente comparaciones de secuencias múltiples, usualmente son creadas usando programas de computadora. Frecuentemente usadas son, por ejemplo, las series Clustal (compárese por ejemplo Chenna et al (2003): Múltiple sequence alignment with the Clustal series of programs . Nucleic Acid Research 31, 3497-3500), T-Coffee (compárese por ejemplo Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for múltiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217) o programas que se basan en estos programas o algoritmos. Para propósitos de la presente invención, las comparaciones y alineaciones de secuencias se crean preferiblemente usando el programa de computadora Vector NTI® Suite de 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California, E.U.A.) usando los parámetros estándares (por defecto) predefinidos.
Dicha comparación hace posible revelar la similitud de las- secuencias comparadas unas a otras. Usualmente se reporta en por ciento de identidad, es decir, la proporción de nucleótidos o residuos de aminoácidos idénticos en las mismas posiciones o posiciones correspondientes unas a otras en una alineación. El término amplio de homología toma en consideración sustituciones de aminoácidos conservadas en el caso de secuencias de aminoácidos, es decir, aminoácidos que tienen propiedades similares, porque usualmente ejercen actividades o funciones similares dentro de la proteína. Por
lo tanto, la · similitud de las secuencias comparadas también se puede reportar como por ciento de homología o por ciento de similitud. Los valores de identidad y/u . homología se-pueden reportar a través de polipéptidos o genes enteros o sólo a través de regiones particulares. Las regiones homologas o idénticas de diferentes secuencias de ácido nucleico o aminoácidos por lo tanto son definidas por concordancias en las secuencias. A menudo tienen las mismas o similares¦ funciones . Pueden ser pequeñas y comprender sólo algunos nucleótidos o aminoácidos. Dichas regiones pequeñas a menudo ejercen funciones esenciales para la actividad entera de la proteína. Por lo tanto, puede ser aconsejable basar las concordancias de. secuencia sólo en regiones particulares, particularmente pequeñas. A menos que se indique lo contrario, valores de identidad u homología en la presente solicitud se refieren, sin embargo, a la longitud total de las diversas secuencias de ácido nucleico o aminoácidos indicados .
La proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico b) comprende además una secuencia de aminoácidos adicional. Dicha secuencia de aminoácidos es consecuentemente la secuencia de aminoácidos real de la proteína sin péptido de señal. Preferiblemente, la secuencia de aminpácidos es una proteína madura. Una proteína madura significa la forma de la misma procesada hasta completarse, ya que es posible que un
gen asociado codifique una forma inmadura que, después de la traducción, sea procesada adicionalmente para dar la forma madura. Por ejemplo, formas inmaduras de la proteina pueden comprender péptidos de señal y/o propéptidos o elongaciones en el N-terminal y/o C-terminal que ya no están presentes en la forma madura. Por ejemplo, las formas inmaduras de proteasas, muy particularmente subtilasas y entre éstas especialmente subtilisinas , comprenden un péptido de señal y ¦también un propéptido, que ya no están presentes en la forma madura de la proteasa. Alternativamente, la secuencia de aminoácidos adicional es la secuencia de aminoácidos de una proteina inmadura que comprende un propéptido. Dicha modalidad se considera especialmente también para proteasas, muy particularmente subtilasas y entre éstas especialmente subtilisinas. En modalidades particularmente preferidas, la secuencia de aminoácidos adicional no comprende un péptido de señal adicional. En dichas modalidades de conformidad con la invención, sólo el péptido de señal de conformidad con la invención consecuentemente lleva a cabo la secreción de la proteina a partir de una célula hospedera.
En particular preferiblemente, la secuencia de aminoácidos adicional de la proteina comprende la secuencia de aminoácidos de una enzima, muy particularmente una proteasa, amilasa, celulasa, hemicelulasa, mananasa, tanasa, xilanasa, xantanasa, xiloglucanasa , ß-glucosidasa , una enzima
de escisión de pectina, carragenasa, perhidrolasa, oxidasa, oxidorreductasa o una lipasa, muy particularmente una enzima como. se . indica más adelante. Muy en particular preferiblemente, la secuencia de aminoácidos adicional de la prot'eína comprende la secuencia de aminoácidos de una proteasa y esta incluye una subtilisina.
Por ejemplo, una de las enzimas mencionadas más adelante puede ser ventajosamente preparada .usando un vector de expresión de conformidad con la invención.
Entre las proteasas, las subtilisinas son preferidas. Ejemplos de las mismas son las subtilisinas BPN' y Carlsberg, la proteasa PB'92, las subtilisinas 147 y 309, la proteasa alcalina de Bacillus lentus, subtilisina DY y las enzimas que deben ser asignadas a las subtilasas, pero ya no las subtilisinas en el sentido más estrecho, siendo éstas la termitasa, proteinasa K y las proteasas T 3 y T 7. La subtilisina Carlsberg está disponible en una forma adicionalmente desarrollada bajo el nombre comercial Alcalase® de Novozymes A/S, Bagsvasrd, Dinamarca. Las subtilisinas 147 y 309 son vendidas por Novozymes bajo los nombres comerciales Esperase®, _ o Savinase®. Derivadas de la proteasa DSM 5483 de Bacillus lentus son las variantes de proteasa conocidos por el nombre BLAP®. Proteasas preferidas adicionales, son además las enzimas conocidas, por ejemplo, por el nombre PUR. Proteasas adicionales son, además, las
enzimas disponibles bajo los nombres comerciales Durazym®, Reíase®, Everlase®, Nafizym®, Natalase®, Kannase® y Ovozyme® de Novozymes, las enzimas disponibles bajo los nombres comerciales Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime, Excellase® y Properase® de Genencor, la enzima disponible bajo el nombre comercial Protosol® de Advanced Biochemicals Ltd., Thane, India, la enzima disponible bajo el nombre comercial Wuxi® de Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, las enzimas disponibles bajo los nombres comerciales Proleather® y Protease P® de Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japón, y la enzima disponible bajo el nombre Proteinase K-16 de Kao Corp., Tokio, Japón. También se prefieren, además, las proteasas de Bacillus gibsoníi y Bacillus pumilus, que se describen en las solicitudes de patente internacionales W02008/086916 y W02007/131656.
Ejemplos de amilasas son las a-amilasas de Bacillus licheniformis, de Bacillus amyloliquefaciens o de Bacillus stearothermophilus y, en particular, también desarrollos adicionales de las mismas mejoradas para usarse en productos de lavado o agentes de limpieza. La enzima de Bacillus licheniformis está disponible de Novozymes bajo el nombre Termamyl® y de Danisco/Genencor bajo el nombre Purastar®ST. Los productos de desarrollo adicional de esta a-amilasa están disponibles de Novozymes bajo los nombres comerciales de Duramyl® y Termamyl@Ultra , de Danisco/Genencor bajo el nombre
Purastar®OxAm, y de Daiwa Seiko Inc., Tokio, Japón, como Keistase®. La a-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens es vendida por Novozymes bajo el nombre BAN®, y variantes derivadas de la a-amilasa de Bacillus stearothermophilus son igualmente vendidas por Novozymes bajo los nombres BSG® y Novamyl®. Además, la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) y la ciclodextrina glucanotransferasa (CGTasa) de Bacillus agaradherens (DSM 9948) deben ser mencionadas. De manera ' similar, los productos de fusión de todas las moléculas antes mencionadas son utilizables. Además, los desarrollos adicionales de la a-amilasa de Aspergillus niger y A. oryzae son adecuados, dichos desarrollos adicionales estando disponibles bajo los nombres comerciales de Fungamyl® de Novozymes. Productos comerciales ventajosos adicionales son, por ejemplo, la amilasa Powerase® de Danisco/Genencor las amilasas Amylase-LT®, Stainzyme® y Stainzyme plus®, esta última de Novozymes. Variantes de estas enzimas obtenibles por. mutaciones puntuales también se pueden preparar de conformidad con la invención. Amilasas preferidas adicionales se describen en las . especificaciones internacionales publicadas WO 00/60060, O 03/002711, O 03/054177 y WO 07/079938,' la descripción de las cuales es por lo tanto expresamente incorporadas aquí por referencia y el contenido de la descripción relevante de las cuales es ,por lo tanto expresamente incorporado en a presente solicitud de patente.
Las amilasas que se pueden preparar de conformidad con la invención son, además, preferiblemente -amilasas.
Ejemplos de lipasas o cutinasas son las lipasas . originalmente disponibles, o desarrolladas adicionalmente, de Humicola lanuginosa {Ther omyces lanuginosus) , muy particularmente aquellas con la sustitución de aminoácidos D96L. Son vendidas, por ejemplo, por Novozymes bajo los nombres comerciales Lipolase®, Lipol.ase® Ultra, LipoPrime®, Lipozyme® y Lipex®. Además, es posible preparar, por ejemplo, las cutinasas que han sido aisladas originalmente de Fusarium solani pisi y Humicola insolens . De Danisco/Genencor, es posible preparar, por ejemplo, las lipasas o cutinasas cuyas enzimas de partida han sido aisladas originalmente de Pseudo onas mendocina y Fusarium solanii. Productos comerciales importantes adicionales que deben ser mencionados son las preparaciones MI Lipase® y Lipomax® originalmente vendidas por Gist-Brocades (ahora Danisco/Genencor) y las enzimas vendidas por Meito Sangyo KK, Japón, bajo los nombres Lipase MY-30®, Lipase OF® y Lipase PL®, y además el producto Lumafast® de Danisco/Genencor.
Ejemplos de celulasas ( endoglucanasas , EG) comprenden secuencias de preparación de celulasa rica en endoglucanasa (EG) de hongos, o los desarrollos adicionales de la misma, que son suministrados por Novozymes bajo el nombre comercial Celluzyme®. Los productos Endolase® y Carezyme®,
igualmente disponibles de Novozymes, se basan en 501 kD EG y 43 kD EG, respectivamente, de Humicola insolens DSM 1800. Otros productos comerciales de dicha compañía que se pueden preparar son Cellusoft®, Renozyme® y Cellucle-an®. Es posible además preparar, por ejemplo, celulasas que están disponibles de AB Enzymes, Finlandia, bajo los nombres comerciales Ecostone® y Biotouch® y que son por lo menos parcialmente basadas en 20.kD EG de Melanocarpus. Celulasas adicionales de AB Enzymes son Econase® y Ecopulp®. Otras celulasas adicionales son de Bacillus sp. CBS 670.93 y CBS 669.93, aquella del Bacillus sp. CBS 670.93 estando disponible en Danisco/Genencor bajo el nombre comercial de Puradax®. Otros productos comerciales de Danisco/Genencor que se pueden preparar son "celulasa L de detergente de. Genencor" e IndiAge® Neutra.
Variantes de estas enzimas obtenibles por mutaciones puntuales también se pueden preparar de conformidad con la invención. Las celulasas particularmente preferidas son variantes de celulasa de Thielavia terrestris que se describen en la especificación internacional publicada WO 98/12307, celulasas de Melanocarpus, muy particularmente Melanocarpus albomyces, que se describen en la especificación internacional publicada WO 97/14804, celulasas EGIII de Trichoderma reesei que se describen en la solicitud de patente europea EP 1 305 432 o variantes obtenibles de las
mismas, muy particularmente aquellas que se describen en las solicitudes de patente europea EP 1240525 y EP 1305432, y también celulasas que se describen en las especificaciones internacionales publicadas WO 1992006165, WO 96/29397 y O 02/099091. Las descripciones respectivas de las mismas por lo tanto se incorporan expresamente aquí por referencia y el contenido relevante de la descripción de las mismas es por lo tanto incorporado expresamente en la presente solicitud de patente .
Además, es posible preparar enzimas adicionales qué son cubiertas por el término hemicelulasas . Estas incluyen, por ejemplo, mananasas, xantano liasas, xantanasas, xiloglucanasas , xilanasas, pululanasas, enzimas de escisión de pectina y ß-glucanasas . La ß-glucanasa obtenida de Bacillus subtilis está disponible bajo el nombre de Cereflo® de Novozymes. Las hemicelulasas particularmente preferidas de conformidad con la invención son mananasas, que son vendidas, por ejemplo, bajo los nombres comerciales Mannaway® de Novozymes o Purabrite® de Genencor. Para los propósitos de la presente invención, las enzimas de escisión de pectina asimismo incluyen enzimas que tienen los nombres de pectinasa, pectato liasa, pectinesterasa, pectina desmetoxilasa , pectina metoxilasa, pectina metilesterasa , pectasa, pectina metilesterasa, pectinoesterasa, pectina pectilhidrolasa , pectina ' despolimerasa ,
endopoligalacturonasa, pectolasa, pectina hidrolasa, pectina poligalacturonasa , endopoligalacturonasa, poli-a-1, - galacturónido glicanohidrolasa , endogalacturonasa , endo-D- galacturonasa , galacturano 1, 4- -galacturonidasa, exopoligalacturonasa, poligalacturonato hidrolasa, exo-D- galacturonasa, exo-D-galacturonanasa^ exopoli-D- galacturonasa, exo-poli-a-galacturonosidasa, exopoligalacturonosidasa o exopoligalacturanosidasa. Ejemplos de enzimas adecuadas a este respecto están disponibles, por ejemplo, bajo los nombres Gamanase®, Pektinex AR®, X-Pect® o Pectaway® de Novozymes, bajo el nombre Rohapect UF®, Rohapect TPL®, Rohapect PTE100®, Rohapect PE®, Rohapect MA plus HC, ' Rohapect DA12L®, Rohapect 10L®, Rohapect BIL® de AB Enzymes y bajo el nombre Pyrolase® de Diversa Corp., San Diego, CA, E.U.A.
Además, también es posible preparar oxidorreductasas , por ejemplo oxidasas, oxigenasas, catalasas, peroxidasas, tales como haloperoxidasas , chloroperoxidasas , bromoperoxidasAs , lignina peroxidasas, glucosa peroxidasas o manganeso peroxidasas, dioxigenasas o lacasas (fenol ¦ oxidasas, polifenol oxidasas). Productos comerciales adecuados que se deben mencionar son Denilite® 1 y 2 de Novozymes. Enzimas adicionales se describen en las solicitudes de patente internacional O 98/45398, O 2005/056782, WO 2004/058961 y WO 2005/124012.
En una modalidad · adicional de la invención, la secuencia de aminoácidos adicional no está presente naturalmente junto con el péptido de señal en una cadena de polipéptido en un microorganismo. Consecuentemente, la proteina codificada por la secuencia de ácido nucleico b) es una proteina recombinante . No naturalmente presente significa, por lo tanto, que las dos secuencias de aminoácidos no son constituyentes de una proteina endógena del microorganismo. Una proteina que comprende el péptido de señal y la secuencia de aminoácidos adicional consecuentemente no puede ser expresada en el microorganismo por una secuencia de ácido nucleico que es . parte del ADN cromosómico del microorganismo en su forma de tipo silvestre. Dicha proteina y/o la secuencia de ácido nucleico que la codifica en cada caso no está consecuentemente presente en forma de tipo silvestre del microorganismo y/o no puede ser aislada de la forma de tipo silvestre del microorganismo. Ambas secuencias -péptido de señal y secuencia de aminoácidos adicional- por lo tanto deben ser asignadas a dos diferentes cadenas de polipéptido en una forma de tipo silvestre de un microorganismo, si ambas están, o pueden estar, presentes en su totalidad en forma de tipo silvestre de un microorganismo. En el contexto de esta modalidad de la invención, el péptido de señal y secuencia de aminoácido adicional, o los ácidos nucleicos que los codifican, por lo tanto recientemente
fueron combinados usando métodos de tecnología de gen, y esta combinación- de péptido de señal y secuencia de aminoácidos adicional no existe en la naturaleza. En la forma de tipo silvestre de un microorganismo, tal como un enlace del péptido de señal con la secuencia de aminoácidos adicional no está consecuentemente presente, específicamente ni al nivel de ADN ni al nivel de proteína. Sin embargo, el péptido de señal y la s.ecuencia de aminoácidos adicional, o las secuencias de ácido nucleico que los codifican, pueden ambas ser de origen natural, pero la combinación de las mismas no existen en la naturaleza. El péptido de señal y la secuencia de aminoácidos adicional por sí mismos pueden, sin embargo, originarse del mismo microorganismo o bien de diferentes microorganismos .
En una modalidad preferida, un ácido nucleico de conformidad con la invención se caracteriza porque es un ácido nucleico no natural. No natural significa que un ácido nucleico de conformidad con la invención no puede ser aislado de un organismo en su forma de tipo silvestre que ocurre en la naturaleza. Muy particularmente y con respecto a las bacterias de tipo silvestre, un ácido nucleico de conformidad con la invención por lo tanto no es un ácido nucleico endógeno a bacterias.
Preferiblemente, las secuencias de (a) y (b) no se originan del mismo organismo (s) ,' muy particularmente
bacterias, sino que se originan de diferentes organismos, muy particularmente bacterias. Diferentes bacterias son, por ejemplo, bacterias que pertenecen a diferentes cepas o especies o géneros.
En una modalidad adicional de la invención, el vector de expresión se caracteriza porque el péptido de señal está dispuesto N-terminal a la secuencia de aminoácidos adicional en la proteina codificada por la secuencia de ácido nucleico b) . La proteina codificada por la secuencia de ácido nucleico b) por lo tanto tiene la estructura siguiente: N-terminal - péptido de señal - (secuencia de aminoácidos adicional opcional) - secuencia de aminoácido adicional - C-terminal. Dicha estructura de la proteina que ha de ser expresada se ha encontrado que es particularmente ventajosa.
En una modalidad adicional de la invención, el vector de expresión se caracteriza porque la proteina codificada por la secuencia de ácido nucleico b) comprende además una secuencia de conexión dispuesta entre el péptido de señal y la secuencia de aminoácidos adicional de la proteina. La proteina codificada por la secuencia de ácido nucleico b) por lo tanto tiene la siguiente estructura: N-terminal - péptido de señal - secuencia de conexión (también "acoplador" o "espaciador") - secuencia de aminoácidos adicional - C-terminal. Dicha estructura de la proteina que ha de ser expresada igualmente se ha encontrado que es
particularmente ventajosa. Preferiblemente, la longitud de la secuencia de conexión es entre 1 y 50 aminoácidos, entre 2 y 25 aminoácidos, entre 2 y 15 aminoácidos, entre 3 y 10 aminoácidos, y en particular preferiblemente entre 3 y 5 aminoácidos. Un ejemplo de una secuencia de conexión particularmente preferida es la . sucesión de aminoácidos de alanina, ácido glutámico y fenilalanina (desde la N-terminal a la C-terminal) .
En una modalidad adicional de la invención, el vector de expresión se caracteriza porque la secuencia de aminoácidos adicional de la proteina comprende la secuencia de aminoácidos de una proteasa, dicha secuencia de aminoácidos de la proteasa siendo por lo menos 80% idéntica a SEQ ID NO. 7. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de la proteasa es por lo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,, 96%, 97%, 98%, 99% y muy particularmente preferiblemente 100% idéntica a la SEQ ID NO. 7.
Alternativamente, la secuencia de aminoácidos adicional de la proteina comprende la secuencia de aminoácidos de una proteasa que es por lo menos 80% idéntica a la SEQ ID NO. 8. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de la proteasa es por lo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, '91%, 92%, 93%, 94%, 95%, '9.6%,, 97%, 98%, 99% y muy particularmente preferiblemente 100%
idéntica a la SEQ ID NO. 8.
Alternativamente, la secuencia de aminoácidos adicional de la proteina comprende la secuencia de aminoácidos de una proteasa que es por lo menos 80% idéntica a SEQ ID NO. 9. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de la proteasa es por lo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y muy particularmente preferiblemente 100% idéntica a la SEQ ID NO. 9.
Alternativamente, la secuencia de aminoácidos adicional de la proteina comprende la secuencia de aminoácidos de una proteasa que es por lo menos 80% idéntica a SEQ ID NO. 10 y tiene el aminoácido ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) en la posición 99 en la numeración de acuerdo con SEQ ID NO. 10. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de la proteasa es por lo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,. 97%, 98%, 99% idéntica y muy particularmente preferiblemente idéntica a SEQ ID NO. 10 en las posiciones 1 a 98 y 100 a 269 en la numeración de acuerdo con SEQ ID NO. 10.
Alternativamente, la secuencia de aminoácidos adicional de la ' proteina comprende la secuencia de aminoácidos de una proteasa que es por lo menos 80%. idéntica a SEQ ID NO. 10 y tiene el aminoácido ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) en la posición 99 en la numeración de
acuerdo con . SEQ ID NO. 10 y tiene, además, por lo menos' uno de los siguientes aminoácidos en la numeración de acuerdo con SEQ ID NO. 10:
(a) treonina en la posición 3 (3T),
(b) isoleucina en la posición 4 (41),
(c) alanina, treonina o arginina en la posición 61 (61A, 61T o 61R) ,
(d) ácido aspártico o ácido glutámico en la posición 154 (154D o 154E) ,
(e) prolina en la posición 188 (188P),
(f) metionina en la posición 193 (193M),
(g) isoleucina en la posición 199 (1991),
(h) ácido aspártico, ácido glutámico o glicina en la posición 211 (211D, 211E o 211G) ,
(i) combinaciones de los aminoácidos (a) a (h) .
Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de esta proteasa es por lo menos 81%, 82%; 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idéntica y muy particularmente preferiblemente idéntica a SEQ ID NO. 10 en todas las posiciones que no están modificadas o no se pretende que sean modificadas. Muy en particular preferiblemente, la secuencia de aminoácidos adicional . de la proteina por lo tanto comprende la secuencia de aminoácidos de una proteasa que tiene una secuencia de aminoácidos modificada en por lo menos dos posiciones con
respecto a SEQ ID NO. 10, con la primera modificación siendo ácido glutámico en la posición 99 en la numeración de acuerdo con SEQ ID NO. 10 y la segunda modificación, en la numeración de acuerdo con SEQ ID NO. 10, siendo seleccionada del grupo que consiste de:
(a) treonina en la posición 3 (3T) ,
(b) isoleuciná en la posición 4 (41),
(c) alanina, treonina o arginina en la posición 61 (61A, 61T o 61R) ,
(d) ácido aspártico o ácido glutámico en la posición 154 (154D o 154E) ,
(e) prolina en la posición 188 (188P),
(f) metionina en la posición 193 (193M),
(g) isoleuciná en la posición 199 (1991),
(h) ácido aspártico, ácido glutámico o glicina en la posición 211 (211D, 211E o 211G) ,
(i) combinaciones de los aminoácidos (a) a (h) .
Asimismo, muy en particular preferiblemente, la secuencia de aminoácidos adicional de la proteina comprende la secuencia de aminoácidos de una proteasa que tiene una secuencia de aminoácidos modificada en por lo menos dos posiciones con respecto a la SEQ ID NO. 10, con la primera modificación siendo el ácido aspártico en la posición 99 en la numeración de acuerdo con SEQ ID NO. 10 y la segunda modificación, en la numeración de acuerdo con SEQ ID NO. 10,
siendo seleccionada del grupo que consiste de:
(a) treonina en la posición 3 (3T) ,
(b) isoleucina en la posición 4 (41),
(c) alanina, .treonina o arginina en la posición 61 (61A, 61T o .61R) ,
(d) ácido aspártico o ácido glutámico en la posición 154 (15 D o 154E) ,
(e) prolina en la posición 188 (188P),
(f ) · ' metionina en la posición 193 (193 ) ,
(g) isoleucina en la posición 199 (1991),
(h) ácido aspártico, ácido glutámico o glicina en la posición 211 (211D, 211E o 211G) ,
(i) combinaciones de los aminoácidos (a) a (h) .
Se encontró que las proteasas antes mencionadas también se pueden preparar ventajosamente en particular usando vectores de expresión de conformidad con la invención. Para dichas modalidades de la invención, se encontró que dichas combinaciones de péptidos de señal y subtilisinas hacen posible lograr rendimientos de producto particularmente buenos en un procedimiento de fermentación. Especificadas a este respecto son las secuencias de aminoácidos de las proteasas maduras, es decir, los productos procesados hasta su terminación. En un vector de expresión de conformidad con la invención, también es posible a este respecto incluir secuencias adicionales de la proteasa no madura, muy
particularmente por ejemplo propéptidos. En tal caso, la secuencia de aminoácidos adicional de' la proteina comprende la secuencia de aminoácidos de la proteasa y del propéptido. Una modalidad adicional de' la invención se caracteriza consecuentemente porque la secuencia de aminoácidos adicional de la proteina comprende la secuencia de aminoácidos de una proteasa, muy particularmente una proteasa como se describió anteriormente, junto con un propéptido o su propéptido.
En general, la secuencia de aminoácidos adicional de la proteína no sólo necesita comprende'r la secuencia de aminoácidos de una proteína madura; por el contrario, es posible incluir secuencias de aminoácidos adicionales tales como, por ejemplo, propéptidos de dicha secuencia de aminoácidos. Esto se aplica no sólo a proteasas, sino también a todas las proteínas, muy particularmente todos los otros tipos de enzimas.
Los ácidos nucleicos y los vectores de expresión de conformidad con la invención pueden ser generados a través de métodos conocidos como tales para modificar ácidos nucleicos. Dichos métodos son presentados, por ejemplo, en los manuales pertinentes tales como el de Fritsch, Sambrook y Maniatis, "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1989, y conocido con un experto en la técnica en el campo de la biotecnología. Ejemplos de dichos métodos son la síntesis química o la reacción en
cadena de .polimerasa (PCR), opcionalmente en combinación con métodos estándares adicionales en biología molecular y/o química o bioquímica.
Células hospederas no humanas que contienen vectores de conformidad con la invención, métodos de preparación en los cuales se usan células hospederas correspondientes, y los usos de vectores correspondientes o células hospederas están asociados con todos los temas de la invención antes mencionados y modalidades como temas adicionales de la invención. Por lo tanto, las declaraciones anteriores se refieren correspondientemente a dichos temas de la invención.
La invención además provee una célula hospedera no humana que contiene un vector de expresión de conformidad con la invención. Un vector de expresión de conformidad con la invención se introduce preferiblemente en la célula hospedera para la transformación de la misma. De conformidad con la invención, esto se lleva a cabo preferiblemente transformando un vector de conformidad con la invención en un microorganismo, que después constituye una célula hospedera .de conformidad con la invención. Alternativamente, también es posible para componentes, individuales, es decir, porciones o fragmentos de ácido nucleico, por ejemplo los componentes (a) y/o (b) , de un vector de conformidad con la invención que ha de ser introducido en una célula hospedera de tal manera que
la célula hospedera que resulta de esta manera comprenda un vector de conformidad con la invención. Este enfoque es especialmente adecuado si la célula hospedera ya comprende uno o más componentes de un vector de conformidad con la invención y los constituyentes adicionales son después complementados en consecuencia. Los métodos para transformación de células son establecidos en la técnica anterior y son bien conocidos por un experto en la técnica. En principio, todas las células, es decir, células procarióticas o eucarióticas , son adecuadas como células hospederas. Las células hospederas que pueden ser ventajosamente manipuladas genéticamente por ejemplo con respecto a transformación con el vector y el establecimiento •estable de las mismas, son preferidas, por ejemplo hongos o bacterias unicelulares. Además, células hospederas preferidas son fácilmente manipulables desde una perspectiva microbiológica y biofecnológica . Esto se refiere, por ejemplo, a la facilidad de cultivo, tasas de crecimiento altas, demanda baja sobre medios de fermentación, y tasas de producción y secreción buenas para proteínas extrañas. En muchos casos, es necesario determinar experimentalmente los sistemas de expresión óptimos para cada caso individual a partir de la abundancia de diferentes sistemas disponibles en la técnica anterior.
Modalidades preferidas adicionales son células
hospederas que son regulables en cuanto a su actividad debido a elementos reguladores genéticos que, por ejemplo, se hacen disponibles en el vector, pero también pueden estar presentes en dichas células desde el principio. Por ejemplo, pueden ser estimuladas para expresar mediante adición controlada de compuestos químicos que sirven como activadores, cambiando las condiciones de cultivo, o al alcanzar una densidad de células particular. Esto permite la producción económica de las proteínas.
Las células hospederas preferidas son células procarióticas- o bacterianas. Las bacterias tienen tiempos de generación cortos y demandas bajas en términos de condiciones de cultivo. Como resultado, es posible establecer métodos efectivos en cuanto a costos. Además, una gran cantidad de experiencia está disponible para un experto en .la técnica en el caso de bacterias en tecnología de fermentación. Para un proceso de producción específico, bacterias Gram-positivas o Gram-negativas pueden ser adecuadas por una muy amplia variedad de razones diferentes que han de ser determinadas experimentalmente sobre una base individual, tal como fuentes de nutrientes, velocidad de formación de producto, requerimiento de tiempo, etc.
En el caso de bacterias Gram-negativas, por ejemplo Escherichia coli, una multiplicidad de polipéptidos son secretados en el espacio periplásmico, es decir, en el
compartimiento entre las dos membranas que encierran las células. Esto puede ser ventajoso para aplicaciones especificas. Además, es también posible configurar las bacterias Gram-negativas de tal manera que expulsen los polipéptidos expresados no sólo en el espacio periplásmico, sino también en el medio que rodea a la bacteria. Por el contrario, las bacterias Gram-positivas , por ejemplo bacilos o Actinomycetaceae u otros representativos de Actinomycetales , no tienen una membrana externa y de esta manera las proteínas secretadas son inmediatamente liberadas al medio que rodea la bacteria, generalmente el medio de cultivo, a partir el cual se pueden purificar los polipéptidos expresados. Se pueden aislar directamente del medio o adicionalmente ser procesados. Además, las bacterias Gram-positivas están relacionadas o son idénticas a la mayoría de los organismos de origen para enzimas técnicamente importantes y usualmente forman enzimas comparables, y de esta manera tienen uso de codón similar y su aparato de síntesis de proteínas es organizado naturalmente en consecuencia.
Se entiende que el uso de codón significa la representación del código genético en aminoácidos, es decir, qué orden de nucleótidos (triplete o triplete base) codifica qué aminoácido o qué función, por ejemplo, el inicio y el fin de la región que ha de ser traducida, sitios de unión para
varias proteínas, etc. Por lo tanto, cada organismo, muy particularmente cada cepa de producción, tiene un uso de codón particular. Los cuellos de botella pueden ocurrir en la biosíntesis de proteínas si los codones en el ácido nucleico · transgénico en la célula hospedera se enfrentan con un número comparativamente bajo de ARNt cargados. Por el contrario, los codones sinónimos codifican los mismos aminoácidos y pueden ser traducidos de manera más eficiente dependiendo del hospedero. Esta transcripción opcionalmente necesaria depende de esta manera de la elección del sistema de expresión. Especialmente en el caso de muestras compuestas de organismos desconocidos, posiblemente no cultivables, puede ser necesaria una adaptación correspondiente.
La presente invención es, en principio, aplicable a todos los microorganismos, muy particularmente todos los microorganismos fermentables, en particular preferiblemente aquellos del género Bacillus, y da por resultado que sea posible llevar a cabo, a través del uso de dichos microorganismos como organismos de producción, un rendimiento de producto incrementado en un procedimiento de fermentación. Dichos microorganismos son células hospederas preferidas para los propósitos de la invención.
En una modalidad adicional de la invención, la célula hospedera se caracteriza por lo tanto porque es una bacteria, preferiblemente una seleccionada del grupo del
género de Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus , Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces , Stenotrophomonas y Pseudomonas, muy preferiblemente una seleccionada del. grupo de Escherichia coli , Klebsiella planticola , Bacillus licheniformis , Bacillus lentus, Bacillus a yloliquefaciens, Bacillus subtilis , Bacillus alcalophilus , Bacillus globigii , Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans , Bacillus pumilus , Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans ,· Streptomyces coelicolor y Stenotrophomonas altophilia. Se da particular preferencia a Bacillus licheniformis .
Sin embargo, la célula hospedera también puede ser una célula eucariótica, caracterizada porque tiene un núcleo. La invención por lo tanto provee además una célula hospedera, caracterizada porque tiene un núcleo.
A diferencia de las células procarióticas , las células eucarióticas son capaces de modificar post-traduccionalmente la proteina formada. Ejemplos de las mismas son los hongos tales como- ñctinomycetaceae o levaduras tales como Saccharomyces o Kluyveromyces . Esto puede ser particularmente ventajoso cuando, por ejemplo, las proteínas, junto con su síntesis, han de pasar por modificaciones específicas, que es permitido- por dichos sistemas.- Las modificaciones que los sistemas eucarióticos llevan a cabo especialmente en combinación con. síntesis de proteínas
incluyen, por ejemplo, la unión de compuestos de peso molecular bajo tales como anclajes de membrana u oligosacáridos . Dichas modificaciones de oligosacáridos, por ejemplo, pueden ser deseables para reducir' la alergenicidad , de una proteina expresada. La coexpresión con las enzimas formadas naturalmente, por dichas células, por ejemplo, celulasas, también puede ser ventajosa. Además, los sistemas de expresión de hongos termofilicos pueden ser, por ejemplo, especialmente adecuados para la expresión de variantes resistentes a temperatura.
Para los propósitos de la invención, las proteínas codificadas por la secuencia de ácido nucleico (b) , muy particularmente aquellas descritas ¦ anteriormente, se considera que son los productos formados durante la fermentación. Por lo tanto, son preferiblemente enzimas, en particular preferiblemente proteasas, y muy en particular preferiblemente subtilisinas .
Además, las células hospederas pueden ser modificadas con respecto a sus requerimientos en términos de condiciones de cultivo, puede tener otros o marcadores de selección adicionales, o pueden expresar otras o adicionales proteínas. Muy particularmente, las células hospederas pueden ser aquellas que expresan proteínas múltiples o enzimas. Preferiblemente, las, secretan en el medio que rodea las células hospederas.
Las células hospederas de conformidad con la invención son cultivadas y fermentadas de una manera conocida como tal, por ejemplo en sistemas intermitentes o sistemas continuos. En el primer caso, un medio de cultivo apropiado es inoculado con las células hospederas y el producto cosechado del medio después de un periodo ha de ser determinado experimentalmente . Los procedimientos de fermentación continuos implican la consecución de un estado estacionario en el cual, durante un periodo comparativamente largo, las células mueren parcialmente pero también crecen nuevamente y el producto puede ser removido al mismo tiempo¦ del medio.
Las células hospederas de conformidad con la invención se usan preferiblemente para preparar proteínas codificadas por la secuencia de ácido nucleico de (b) . La invención por lo tanto provee además un método para preparar una prcteína, que comprende
a) cultivar una célula hospedera de conformidad con la invención
b) aislar la proteína del medio de cultivo o de la célula hospedera.
Este tema de la invención preferiblemente comprende métodos de fermentación. Los métodos de fermentación son conocidos como tales de la técnica anterior y constituyen el paso de producción a escala industrial real, generalmente
seguido por un método de purificación apropiado para el producto preparado, por ejemplo la proteina. Todos los métodos de fermentación que implican un método correspondiente para preparar una proteina constituyen modalidades de este tema de la invención.
En conexión a esto, las diversas condiciones óptimas para los métodos de preparación, muy particularmente las condiciones de cultivo óptimas para- las células hospederas usadas, se deben determinar experimentalmente de conformidad con el conocimiento de una experto en la técnica, por ejemplo, con respecto al volumen de fermentación y/o composición del medio y/o suministro de oxigeno y/o velocidad de agitación.
Los métodos de fermentación caracterizados porque la fermentación se lleva a cabo mediante una estrategia de .suministro continua son una posibilidad particular. En este caso, los constituyentes del medio que son consumidos por el cultivo en curso son continuamente alimentados; esto se conoce como una estrategia de alimentación continua. Como. resultado, incrementos considerables tanto en la densidad de células como en la masa celular o masa seca y/o especialmente la actividad de la proteina de interés, preferiblemente una enzima, se pueden lograr.
Además, la fermentación también se puede configurar de tal manera que los productos metabólicos no deseados son
filtrados o neutralizados por la adición de regulador de pH o los contraiones apropiados en cada caso.
La proteina preparada puede ser cosechada del medio de fermentación. Dicho método de fermentación es ventajoso sobre el aislamiento del polipéptido de la célula hospedera, es decir, procesamiento de producto de la masa celular (masa seca) . De conformidad con la invención, los marcadores de , secreción adecuados a este respecto se proveen con los péptidos de señal.
Todos los hechos explicados anteriormente pueden combinarse para formar métodos para preparar proteínas. A este respecto, una multiplicidad de posibles combinaciones de pasos de método es concebible. El método óptimo se debe determinar para cada caso individual específico.
La invención además provee el uso de un vector de expresión de conformidad con la invención o de una célula hospedera de conformidad con la invención para preparar una proteína.
Todos los hechos, temas y modalidades que ya se describieron anteriormente también son aplicables a este tema de la invención. Por lo tanto, se hace referencia expresamente en este punto a la descripción del punto correspondiente con la indicación de que dicha descripción también se aplica a los usos de conformidad con la invención (uso del vector o de la célula hospedera) .
Ejemplos :
Todos los pasos de trabajo de biología molecular siguen métodos estándares, como se especifica, por ejemplo, en el manual de Fritsch, Sambrook y Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1989, o trabajos pertinentes comparables. Se usaron enzimas y kits de conformidad con las instrucciones de los fabricantes respectivos.
Ejemplo 1: Preparación de vectores de expresión de conformidad con la invención
El plásmido pBSMuL3 (Brockmeier et al., 2006) fue acortado por digestión de restricción de SacI y religación subsiguiente alrededor de la porción de E. coli. El plásmido resultante, pBSMuL5 (compárese figura 1), se usó como un vector para clonar las proteasas incluyendo propéptido en los sitios de restricción EcoRI y BamHI . Para este fin, se llevó a cabo amplificación de los genes de la proteasa de conformidad con SEQ ID NO. 8 con los cebadores de conformidad con SEQ ID NO. 11 y SEQ ID NO. 12, y de la proteasa alcalina de conformidad con SEQ ID NO. 9 con los cebadores de conformidad con SEQ ID NO. 13 y SEQ ID NO. 14. Los plásmidos resultantes se usaron como vectores para clonar los péptidos de señal en los sitios de restricción HindIII y EcoRI . El fragmento de ADN del péptido de señal de control SubC (23.
licheniformis, NCBI (National Center for Biotechnology Information) número de acceso: X91260.1), como sello distintivo, fue amplificado usando los cebadores de conformidad con SEQ ID NO. 15 y SEQ ID NO. 16 y clonado en cada caso en los sitios de restricción HindIII y EcoRI de los plásmidos, produciendo plásmidos que tenían una secuencia de ácido nucleico b) que codifica una proteína que tiene el péptido de señal SubC junto con una proteasa de conformidad con SEQ ID NO. 8 (plásmido 1) o SEQ ID NO. 9 (plásmido 2) . Estos plásmidos se usaron subsiguientemente como control o sello, distintivo . El fragmento de ADN del péptido de señal de conformidad con SEQ ID NO. 2 fue amplificado usando los cebadores de conformidad con SEQ ID NO. ,19 y SEQ ID NO. 20, el fragmento de ADN del péptido de señal de conformidad con SEQ ID NO. 4 fue amplificado con los cebadores de conformidad con SEQ ID. 17 y SEQ ID NO. 18, y el fragmento de ADN del péptido de señal de conformidad con SEQ ID NO. 6 fue amplificado con los cebadores de conformidad con SEQ ID. 21 y SEQ ID NO. 22. Mientras tanto los fragmentos de ADN de los péptidos de señal de conformidad con SEQ ID NO. 2 y 4 fueron clonados cada uno en el vector que codifica una proteasa de conformidad con SEQ ID NO. 8 (plásmidos 3 y 4), el .fragmento de ADN del péptido de señal de conformidad con SEQ ID NO. 6 fue insertado en el vector que codifica una proteasa de conformidad con SEQ ID NO. 9 (plásmido 5) . Asociada con la
clonación, una secuencia de 9 nucleótidos que codifican la sucesión de los aminoácidos AEF (compárese figura 1) fue introducida entre la secuencia de ADN del péptido de señal particular y la secuencia de ADN del propéptido de la proteasa particular. Esta denominada secuencia- de conexión contiene la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción EcoRI .
Todos los oligonucleótidos usados como cebadores se listan en la tabla 1 a continuación:
Tabla 1:
Ejemplo 2: Expresión de las proteínas
Una cepa de Bacillus licheniformis fue transformada
con los plásmidos 1 a 5 para obtener las diversas cepas de producción de proteasa. Para la inoculación de cultivos, se hizo uso de colonias individuales de placas de agar que fueron incubadas durante toda la noche (ACTIVADAS) . Para la ' determinación cuantitativa de la eficacia de secreción, las colonias individuales fueron transferidas directamente de las placas de agar a MTPs de pozos - profundos (placas de microtitulación; 96 pozos que contenían cada uno 1 mi de medio LB selectivo) . En dicha determinación, cada colonia individual fue transferida a por lo menos dos pozos en paralelo a fin de obtener determinación por duplicado o triplicado como resultado del cultivo múltiple del clon particular. Para la inoculación de las MTPs de pozo profundo, sólo se usaron clones que fueron incubaron durante la noche a 37°C. Después del cultivo durante 20 hr a 37°C en el agitador de placa de microtitulación (Timix 5 . de Edmund-Bühler , Hechingen) , todos los clones fueron replicados en placas de agar LB y subsiguientemente las células fueron sedimentadas por centrifugación (4000 rpm, 20 min, 4°C). Todos los pasos de aplicación con pipeta que siguieron se llevaron a cabo usando pipetas de multicanalés (Eppendorf , Hamburgo) , con el uso del modo de pipeteo inverso y ningún volumen menor de 15 µ? fue pipeteado. En cada caso, el volumen más pequeño fue inicialmente cargado en la MTP y los volúmenes más grandes se añadieron a la misma y la MTP se mezcló en cada paso de
dilución durante 10 segundos en el espectrofotómetro "Spectramax 250" (Molecular Devices, Sunnyvale, E.U.A.). Para ¦la generación de las diluciones correspondientes, el sobrenadante de cultivo se removió usando la pipeta de multicanales y. se transfirió a placas de microtitulación (96 pozos, fondo en F, transparente, de Greiner Bio-One, Frickenhausen) .
Subsiguientemente, la actividad proteolitica en los sobrenadantes de cultivo o diluciones se determinó mediante la liberación del cromóforo para-nitroánilina (pNA) del sustrato suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilida (suc- AAPF-pNA) . La proteasa digiere el sustrato y libera pNA. La liberación de pNA produce un incremento en la absorbancia a 410 nm, su cambio en tiempo siendo una medida de la actividad enzimática (compárese Del Mar et al, Anal Biochem, 99: 316- 320, 1979) .
Para la determinación de la. eficiencia de secreción de las diversas cepas, un constructo de control interno (plásmido 1 o plásmido 2) se cultivó concomitantemente en cada cultivo de MTP. La actividad proteolitica de la cepa que tenia el constructo de control, como se determinó en el sobrenadante del cultivo, se definió como 100%.
En comparación con el ' control que comprendía el plásmido 1, las cepas que contenían los plásmidos 3 y 4 de conformidad con la invención lograron una actividad de
proteasa que fue incrementada por 194% +/- 48 y 230% +/- 38, respectivamente (compárese figura 2).
En comparación con el control que comprendía el plásmido 2, la cepa que contenía el plásmido 5 de conformidad con la invención logró una actividad de proteasa que se incrementó por 44% +/- 10 (compárese figura 3) .
Descripción de las figuras
Figura 1: Diagrama de la estrategia de clonación en el vector de expresión de Bacillus pBSMul5 (modificado de Brockmeier et al., 2006). (A) Los fragmentos de ADN de los péptidos de señal fueron amplificados en el N-terminal con un sitio de restricción HindIII, un sitio de unión a ribosoma estandarizado (RBS), seguido por una región separadora y el codón de inicio estandarizado para metionina. Un acoplador que tenía una alanina en la posición y el sitio de restricción EcoRI se fijó entre el péptido de señal y N-terminal de la proteasa que ha de ser secretada. (B) El vector de Bacillus pBSMul5 que tenía el promotor Hpall, el objetivo de secreción particular (clonado por EcoRI y BamHI), y el cásete de resistencia a la kanamicina y la proteína de replicación repB para Bacillus .
Figura 2: Actividad de proteasa relativa en el sobrenadante de cultivo de Bacillus licheniformis que contenía la proteasa de conformidad con SEQ ID NO. 8 y tres
péptidos de señal diferentes en pBS ul5. La actividad proteolitica del plásmido de construcción 1 se definió como 100% (control). Los valores se determinaron en por lo . menos dos cultivos independientes. Las barras de error indican la desviación estándar.
Figura 3: Actividad de proteasa relativa en el sobrenadante de cultivo de Bacillus licheniformis que contenia la proteasa de conformidad con SEQ ID NO. 9 y dos péptidos de señal- diferentes en pBSMul5. La actividad proteolitica del plásmido de cultivo 2 se definió como 100% (control) . Los valores se determinaron en por lo menos dos cultivos independientes. Las barras de error indican la desviación estándar.
Claims (10)
1. Un vector de expresión que comprende a) una secuencia de promotor y b) una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteina, la proteina comprendiendo un péptido de señal y una secuencia de aminoácidos adicional y el péptido de señal comprendiendo una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada ' en SEQ ID NO. 2 o es por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en la SEQ ID NO. 4 o ; es por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO. 6, ,o el péptido de señal que comprende una secuencia de aminoácidos que es estructuralmente homologa a por lo menos una de estas secuencias.
2. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación V, en donde el péptido de señal codificado por la secuencia de ácido nucleico b) tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4 o SEQ ID NO. 6.
3. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde la secuencia de aminoácidos adicional de la proteina comprende la secuencia de aminoácidos de una enzima, muy particularmente una proteasa, amilasa, celulasa, hemicelulas.a, mananasa, tanasa, xilanasa, xantanasa, xiloglucanasa, ß-glucosidasa, una enzima de escisión de pectina, carragenasa, perhidrolasa, oxidasa, oxidorreductasa o una lipasa.
4. El vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el péptido de señal está dispuesto N-terminal a la secuencia de aminoácidos adicional en la proteina codificada por la secuencia de ácido nucleico b) .
5. El vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la proteina codificada por la secuencia de ácido nucleico b) comprende -además una secuencia de conexión dispuesta entre el péptido 'de señal y la secuencia de aminoácidos adicional de la proteina, la longitud de la secuencia de conexión siendo en particular entre 1 y 50 aminoácidos.
6. El vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la secuencia de aminoácidos adicional de la proteina comprende la secuencia de aminoácidos de una proteasa, la secuencia de aminoácidos de la proteasa siendo por lo menos 80% idéntica a la SEQ ID NO. 7, o siendo por lo menos 80% idéntica a la SEQ ID NO. 8, o siendo por lo menos 80% idéntica a- la SEQ ID NO. 9, o siendo por lo menos 80% idéntica a la SEQ ID NO. 10 y que tiene el aminoácido ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) en la posición 99 en la numeración de conformidad con SEQ ID NO. 10, o siendo por lo menos 80% idéntica a SEQ ID NO. 10 que tiene el aminoácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) en la posición 99 en la numeración de conformidad con SEQ ID NO. 10 y que tiene, además, por lo menos uno de los siguientes aminoácidos en la numeración de conformidad con SEQ ID NO. 10: (a) treonina en la posición 3 (3T) , (b) isoleucina en la posición 4 (41), (c) alanina, treonina o arginina en la posición.61 (61A, 61T o 61R) , (d) ácido aspártico o ácido glutámico en la posición 154 (154D o 154E) , (e) prolina en la posición 188 (188P), (f) metionina en la posición 193 (193?), · (g) isoleucina en la posición 199 (1991), (h) ácido aspártico, ácido glutámico o glicina en la posición 211 (211D, 211E o 211G) , (i) combinaciones de los aminoácidos (a) a (h) .
7. Una célula hospedera no humana que comprende un vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 7, en donde es una bacteria, preferiblemente una seleccionada del grupo del género de Escherichia, Klebsiella , Bacillus , Staphylococcus , Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces , Stenotrophomonas y Pseudomonas, muy preferiblemente una seleccionada del grupo de Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus lícheniformís, Bacillus lentus, , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis , Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii , Bacillus gibsonii , Bacillus clausii , Bacillus halodurans , Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus , Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans , Streptomyces coelicolor y Stenotrophomonas maltophilia muy particularmente Bacillus lícheniformís .
9. Un método para preparar una proteina, que comprende los pasos de método de (a) cultivar una célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8 (b) aislar la proteina del medio de cultivo o de la célula hospedera.
10. El uso de un vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o de una célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8 para preparar una proteina. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La finalidad de la invención es mejorar la secreción de una proteína a partir de' una célula hospedera a fin de incrementar el rendimiento de producto de proteína en un proceso de fermentación. Esto se logra mediante un vector de expresión que comprende a) una secuencia de promotor y b) una secuencia de ácido nucleico, que codifica para una proteína. La¦ proteína comprende un péptido de señal y una secuencia de aminoácidos, adicional, y el péptido de señal comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO: 2, por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO: 4, por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO: 6, o el péptido de señal comprende una secuencia de aminoácidos que es estructuralmente homologa a por lo menos una de dichas secuencias.
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