CN107574177A - 用于改善的蛋白质分泌的表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是改善宿主细胞的蛋白质分泌以增加发酵过程中的蛋白质产量。这是通过表达载体实现的，所述表达载体包含a)启动子序列和b)编码蛋白质的核酸序列。蛋白质包含信号肽和额外的氨基酸序列，并且信号肽包含与SEQ ID NO.2中说明的氨基酸序列至少80％相同，与SEQ ID NO.4中说明的氨基酸序列至少80％相同，或与SEQ ID NO.6中说明的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或者信号肽包含与所述序列中的至少一个在结构上同源的氨基酸序列。
Description
本申请是申请日为2012年5月25日、发明名称为“用于改善的蛋白质分泌的表达载体”的中国专利申请201280026365.0(国际申请号PCT/EP2012/059901)的分案申请。
本发明属于生物技术的领域，更特别是微生物蛋白质合成的领域。本发明尤其涉及用于制备蛋白质的表达载体，并另外提出了包含此类表达载体的宿主细胞。本发明还涉及此类表达载体和宿主细胞用于蛋白质制备的方法和用途。
为了制备蛋白质，可以利用表达目标蛋白的基因的宿主细胞，更特别是微生物。一般以使其表达的方式将目标蛋白的基因(转基因)导入到宿主细胞中。常见的是其与一个或多个允许基因表达的启动子序列(启动子)共同存在于所谓的表达载体上。
为了工业规模的生物技术生产，在发酵罐中培养所讨论的宿主细胞，根据细胞的代谢特性调整发酵罐。在培养过程中，宿主细胞代谢所供应的底物，并形成理想的产物，所述产物在发酵结束后通常与生产生物分离，并从发酵罐浆和/或发酵基质中纯化和/或浓缩。
固有地在发酵中获得非常高的产量是理想的。产量依赖于多种因素，例如除实际需要的产物外，宿主细胞通常形成多种一般非目的性的其他物质。此外，转基因的表达及产物的产量基本上取决于所使用的表达系统。例如，国际专利申请WO 91/02792公开了在优化的地衣芽孢杆菌中，在来自地衣芽孢杆菌的基团调控序列的控制下，更特别是地衣芽孢杆菌的启动子的控制下，来自迟缓芽孢杆菌的碱性蛋白酶的改善的发酵生产。
为了工业生产蛋白质，例如水解酶，优选使用能够将大量蛋白质分泌到培养上清中的宿主细胞，使得不必进行复杂的细胞破碎，所述复杂的细胞破碎对于胞内生产是必需的。出于该目的，优选使用这样的宿主细胞，例如芽孢杆菌属物种，其可以在有效的高细胞密度发酵方法中使用有成本效益的培养基培养，并能够将大量克/升的靶蛋白质分泌到培养上清中。通常，由表达载体表达待分泌的蛋白质，所述表达载体已经被导入到宿主细胞中并且编码待分泌的蛋白质。经表达的蛋白质通常包含使其从宿主细胞输出的信号肽(信号序列)。信号肽通常是在宿主细胞中翻译的多肽链的一部分，但其还可以在宿主细胞内或外，从蛋白质上翻译后切割掉。
尤其是对于异源蛋白质的胞外生产，然而存在多种瓶颈，并且相应的非常需要优化分泌过程。瓶颈之一是选择允许靶蛋白从宿主细胞有效输出的信号肽。原则上，信号肽可以是与蛋白质，更特别是与酶新组合的。例如Brockmeier等人的出版物(J.Mol.Biol.362，第393–402页(2006))描述了使用角质酶的实例分泌信号肽文库的策略。然而，不是每个信号肽也在发酵条件下，更特别是在工业或工业规模的发酵条件下，带来充足的蛋白质输出。
因此，本发明的目标是改善宿主细胞的蛋白质分泌，以及结果为增加发酵方法中的蛋白质产量。
本发明提供了表达载体，包含
a)启动子序列，和
b)编码蛋白质的核酸序列，蛋白质包含信号肽和另外的氨基酸序列，信号肽包含与SEQ ID NO.2中说明的氨基酸序列至少80％相同，或与SEQ ID NO.4中说明的氨基酸序列至少80％相同，或与SEQ ID NO.6中说明的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或者信号肽包含与这些序列中的至少一个在结构上同源的氨基酸序列。
令人惊讶地发现，编码具有此类信号肽的蛋白质的表达载体实现了含有表达载体并且表达核酸序列b)的宿主细胞的改善的蛋白质分泌。结果是在本发明的优选的实施方案中，能够增加发酵方法中的蛋白质产量。
表达载体是使得蛋白质能够在宿主细胞中，更特别在微生物中表达的核酸序列。其包含遗传信息，即，编码蛋白质的核酸序列(基因)b)。
核酸序列的表达是成为所述序列编码的基因产物，即，成为多肽(蛋白质)或成为多个多肽(蛋白质)。术语多肽和蛋白质在本申请中是同义使用的。出于本发明的目的，表达因此意味着从遗传信息生物合成核糖核酸(RNA)和蛋白质。一般而言，表达包含转录，即，基于基因的DNA(脱氧核糖核酸)序列合成信使核糖核酸(mRNA)，和将mRNA翻译成相应的多肽链，所述多肽链还可以被翻译后修饰。因此，蛋白质的表达描述了从遗传信息生物合成蛋白质，根据本发明在表达载体上提供所述遗传信息。
载体是由核酸，优选脱氧核糖核酸(DNA)组成的遗传元件，是生物技术领域的技术人员已知的。特别地当在细菌中使用时，载体是特定的质粒，即，环状遗传元件。例如，载体可以包括源自细菌质粒、病毒或噬菌体的载体，或者含有非常多样来源的元件、主要是合成的载体或质粒。有了各种情况下存在的其他遗传元件，载体能够使其在优选通过转化导入的宿主细胞中建系作为稳定的单元存在多代。在这一方面，载体是作为独立单元在染色体外建系，还是整合到染色体或染色体DNA中，对于本发明的目的而言都是不重要的。根据个案在多种系统中选择。关键性因素可以是例如可实现的拷贝数、可利用的选择体系，尤其包括抗生素抗性，或能够摄入载体的宿主细胞的可培养性。
表达载体还可以是随培养条件的改变(例如细胞密度或添加特定化合物)而可调控的。此类化合物的实例是半乳糖衍生的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，其用作细菌乳糖操纵子(lac操纵子)的激活剂。
表达载体还包含至少一个核酸序列，优选DNA，所述核酸序列对编码蛋白质的核酸序列b)的表达具有控制功能(所谓的基因调控序列)。在此情况下，基因调控序列是任何这样的核酸序列，所述核酸序列通过其在特别的宿主细胞中的存在，影响，优选增加编码蛋白质的核酸序列b)的转录速率。优选地，其是启动子序列，因为此类序列对于核酸序列b)的表达是必需的。然而，根据本发明的表达载体还可以包含其他基因调控序列，例如一个或多个增强子序列。因此，用于本发明目的的表达载体包含至少一个由核酸序列b)和启动子(表达盒)构成的功能单元。其可以，但不必作为物理实体存在。启动子使核酸序列b)在宿主细胞中表达。出于本发明的目的，表达载体还可以限制为由启动子和待表达的核酸序列b)构成的纯表达盒，所述表达盒可以整合在染色体外或染色体上。根据本发明的此类表达载体的实施方案各自构成了本发明的独立实施方案。
因此，存在至少一个启动子对根据本发明的表达载体是必需的。因此，启动子被理解为意指允许基因的受调控的表达的DNA序列。启动子序列天然地是基因的组分，并且通常位于基因的5’端，并因此位于RNA编码区之前。优选地，根据本发明的表达载体中的启动子序列位于编码蛋白质的核酸序列b)的5'上游。启动子的最重要的特性是通过RNA聚合酶与至少一个DNA结合蛋白或多肽的特异性相互作用，所述DNA结合蛋白或多肽通过NRA聚合酶介导基因转录起始，并被称为转录因子。多个转录因子和/或其他蛋白质通常通过RNA聚合酶参与转录起始。因此，启动子优选是具有启动子活性的DNA序列，即，与至少一个转录因子至少瞬时结合，从而起始基因转录的DNA序列。可以通过被表达的基因的转录速率，即，通过每单位时间生成的RNA分子的数量，更特别是mRNA分子的数量，测量启动子的强度。
优选地，在表达载体上，启动子序列(a)和核酸序列(b)位于彼此后方。更优选地，在核酸分子上，启动子序列(a)位于核酸序列(b)之前(按5'→3'方向)。同样优选的是，在两条核酸序列(a)和(b)之间，没有降低编码蛋白质的核酸序列(b)的转录速率的核酸序列。所有上述内容都涉及含有编码蛋白质的核酸序列(b)的DNA链(编码链)而不涉及相结合的互补DNA链。从编码蛋白质的核酸序列(b)开始，因此启动子序列(a)优选位于该DNA链上进一步的上游，即，5'方向。
核酸序列(b)编码待分泌的蛋白质。在此情况下，所述蛋白质是待使用根据本发明的表达载体制备的蛋白质(靶蛋白)。
核酸序列b)编码的蛋白质包含信号肽，所述信号肽具有与SEQ ID NO.2说明的氨基酸序列至少80％相同，或与SEQ ID NO.4说明的氨基酸序列至少80％相同，或与SEQ IDNO.6说明的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。发现此类信号肽使包含它们的蛋白质，更特别地重组蛋白有效分泌。按递增的优选度，信号肽包含与SEQ ID NO.2说明的氨基酸序列至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，非常特别优选100％相同，或与SEQ ID NO.4说明的氨基酸序列至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，非常特别优选100％相同，或与SEQ ID NO.6说明的氨基酸序列至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，非常特别优选100％相同的氨基酸序列。特别优选的是，信号肽具有与SEQ ID NO.2说明的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，非常特别优选100％相同，或与SEQ ID NO.4说明的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，非常特别优选100％相同，或与SEQ ID NO.6说明的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，非常特别优选100％相同的氨基酸序列。
在每种情况下，非常特别优选的是100％相同的序列，因此，相应优选的表达载体的特征在于由核酸序列b)编码的信号肽具有根据SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.6的氨基酸序列。编码此类信号肽的特别优选的核酸序列由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5说明。
除允许蛋白质分泌的前述信号肽外，还可以使用与这些序列在结构上同源的序列。在结构上同源的序列理解为意指这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有连续的氨基酸，所述连续的氨基酸表现出与具有根据SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6的氨基酸序列的信号肽可比较的空间折叠。该空间折叠使其能够被宿主细胞识别为分泌信号序列，并且因此，使得包含在结构上同源的信号序列的蛋白质被转运出宿主细胞。优选地，与宿主细胞使用的易位系统发生相互作用。因此，在结构上同源的氨基酸序列优选与宿主细胞的易位系统的至少一个组分直接或间接地结合。直接结合理解为意指直接的相互作用，间接结合理解为意指通过一个或多个其他组分，更特别地通过蛋白质或其他分子发生相互作用，所述蛋白质或其他分子作为衔接子发挥作用，并因此，作为在结构上同源的氨基酸序列和宿主细胞的易位系统的组分之间的桥接发挥作用。
通过序列比较确定核酸或氨基酸序列的同一性。此类比较是通过对核苷酸序列或氨基酸序列中彼此相似的连续片段赋值而实现的。所述序列比较优选基于BLAST算法进行，这是现有技术中已建立和普遍使用的(参见例如Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.&Lipman,D.J.(1990)"Basic local alignment search tool."J.Mol.Biol.215:403–410，和Altschul,Stephan F.,Thomas L.Madden,AlejandroA.Schaffer,Jinghui Zhang,Hheng Zhang,Webb Miller和David J.Lipman(1997):"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database searchprograms"；Nucleic Acids Res.,25，第3389–3402页)，并且原则上通过对核酸或氨基酸序列中彼此相似的连续核苷酸或氨基酸赋值而发生。所讨论的位置的表格赋值被称为比对。现有技术中可利用的其他算法是FASTA算法。通常使用计算机程序生成序列比较(比对)，更特别是多序列比较。经常使用的是例如Clustal系列(参见例如Chenna等人(2003):Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs.Nucleic AcidResearch 31,3497–3500)、T-Coffee(参见例如Notredame等人(2000):T-Coffee:A novelmethod for multiple sequence alignments.J.Mol.Biol.302,205–217)或基于这些程序或算法的程序。出于本发明的目的，优选使用计算机程序Vector Suite10.3(Invitrogen Corporation,1600Faraday Avenue,Carlsbad,California,USA)使用预定的标准(默认)参数，生成序列比较和比对。
此类比较使得能够揭示所比较的序列彼此间的相似性。通常报道为百分比同一性，即，在比对中，彼此对应的一个或多个相同位置上的相同核苷酸或氨基酸残基的比例。在氨基酸序列的情况下，同源性的广义术语考虑了保守的氨基酸取代，即，具有相似特性的氨基酸，因为其通常在蛋白质中行使相似的活性或功能。因此，比较的序列的相似性也可以报道为百分比同源性或百分比相似性。可以报道整个多肽或基因或仅特别区域的同一性和/或同源性的值。因此，通过序列中的一致性定义不同核酸或氨基酸序列的同源或相同的区域。其通常具有相同或相似的功能。其可以是小的，仅包含一些核苷酸或氨基酸。此类小的区域通常行使对于蛋白质的整体活性必需的功能。因此，可建议使序列一致性仅基于特别的、可能的小区域。然而，除非另外指出，本申请中的同一性或同源性值指多种所提示的核酸或氨基酸序列的全长。
核酸序列b)编码的蛋白质还包含另外的氨基酸序列。因此，所述氨基酸序列是不含信号肽的蛋白质的实际氨基酸序列。优选地，氨基酸序列是成熟的蛋白质。成熟的蛋白质理解为意指加工至完成的蛋白质形式，因为可能相关基因编码不成熟形式，所述不成熟形式在翻译后被额外加工以产生成熟的形式。例如，蛋白质的不成熟形式可以包含在成熟形式中不再存在的信号肽和/或前肽，或N-末端和/或C-末端延伸。例如，蛋白酶，更特别是枯草杆菌酶(subtilase)，并且尤其是枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)的不成熟形式，包含在成熟形式的蛋白酶中不再存在的信号肽和前肽。备选地，另外的氨基酸序列是包含前肽的不成熟蛋白质的氨基酸序列。此类实施方案也特别考虑蛋白酶，更特别是枯草杆菌酶，并且尤其是枯草杆菌蛋白酶。在特别优选的实施方案中，另外的氨基酸序列不包含另外的信号肽。因此，在本发明的此类实施方案中，仅根据本发明的信号肽使蛋白质从宿主细胞中分泌出。
特别优选地，蛋白质的另外的氨基酸序列包含酶的氨基酸序列，更特别地包含蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、鞣酸酶、木聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶(xyloglucanase)、β-葡糖苷酶、果胶切割酶、卡拉胶酶(carrageenase)、perhydrolase、氧化酶、氧化还原酶或脂肪酶，更特别地包含下列酶的氨基酸序列。非常特别优选地，蛋白质的另外的氨基酸序列包含蛋白酶的氨基酸序列，并且此蛋白酶包括枯草杆菌蛋白酶。
例如，可以使用根据本发明的表达载体有利地制备下述酶之一。
在蛋白酶中，优选枯草杆菌蛋白酶。其实例是枯草杆菌蛋白酶BPN'和Carlsberg、蛋白酶PB92、枯草杆菌蛋白酶147和309、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的碱性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶DY，和应该被归为枯草杆菌酶，但狭义上不再属于枯草杆菌蛋白酶的酶，这些酶是嗜热蛋白酶(thermitase)、蛋白酶K和蛋白酶TW3、TW7。枯草杆菌蛋白酶Carlsberg可以进一步的发展的形式以商标名获得自Novozymes A/S,丹麦。枯草杆菌蛋白酶147和309由Novozymes以商标名或出售。源自迟缓芽孢杆菌的DSM 5483蛋白酶的是名为的蛋白酶变体。另外优选的蛋白酶是例如已知名为PUR的酶。另外的蛋白酶是可以商标名 和自Novozymes获得的酶；可以商标名OxP、Prime、和自Genencor获得的酶；可以商标名自Advanced Biochemicals Ltd.,Thane,印度获得的酶；可以商标名自Wuxi Snyder Bioproducts Ltd.,中国获得的酶；可以商标名和Protease 自Amano Pharmaceuticals Ltd.,Nagoya,日本获得的酶；可以名称蛋白酶K-16自Kao Corp.,Tokyo,日本获得的酶。此外，还优选的是来自吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的蛋白酶，其公开在国际专利申请WO2008/086916和WO2007/131656中。
淀粉酶的实例是来自地衣芽孢杆菌、来自解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)或来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的α-淀粉酶，特别是其经改善用于洗涤剂或清洁剂的进一步的发展物。来自地衣芽孢杆菌的酶可以名称自Novozymes获得，并且以名称ST自Danisco/Genencor获得。来自该α-淀粉酶的进一步发展的产物可以商标名和ultra自Novozymes获得，以名称OxAm自Danisco/Genencor获得，以名称自Daiwa Seiko Inc.,Tokyo,日本获得。解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶是由Novozymes以名称出售的，嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶的衍生变体同样是由Novozymes以名称和出售的。此外，应该提及芽孢杆菌属物种A 7-7(DSM12368)的α-淀粉酶和Bacillus agaradherens(DSM 9948)的环糊精葡聚糖转移酶(CGTase)。类似地，可使用所有上述分子的融合产物。此外，黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(A.oryzae)的α-淀粉酶的进一步的发展物也是合适的，所述进一步的发展物可以商标名自Novozymes获得。另外的有利的商业产品是例如，Danisco/Genencor的淀粉酶和Novozymes的淀粉酶和Stainzyme还可以根据本发明，制备这些酶通过点突变可获得的变体。另外的优选的淀粉酶公开在国际公开的说明书WO 00/60060、WO 03/002711、WO 03/054177和WO 07/079938中，其公开内容因此通过引用明确整合到本文中，其相关的公开内容因此明确并入到本专利申请中。此外，待根据本发明制备的淀粉酶优选是α-淀粉酶。
脂肪酶或角质酶的例子是可自柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)(疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus))初始获得的或进一步发展的脂肪酶，特别是具有氨基酸取代D96L的脂肪酶。其是由例如Novozymes以商标名Ultra、和出售的。此外，可以制备例如初始从豌豆根腐镰孢菌(Fusarium solani pisi)和特异腐质霉(Humicola insolens)分离的角质酶。自Danisco/Genencor，例如可以制备脂肪酶或角质酶，所述脂肪酶或角质酶的起始酶最初是从门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)和Fusarium solanii分离的。应提及的另外的重要商业产品是最初由Gist-Brocades(现在的Danisco/Genencor)销售的制品M1和和由Meito Sangyo KK,日本以名称Lipase Lipase和Lipase 销售的酶，以及还有Danisco/Genencor的产品
纤维素酶(内切葡聚糖酶，EG)的实例包含真菌的序列，富含内切葡聚糖酶(EG)的纤维素酶制品，或其进一步的发展物——由Novozymes以商标名提供。产品和同样可自Novozymes获得，分别基于来自特异腐质霉DSM 1800的50kD EG和43kD EG。所述公司的另外的可制备的商业产品是和还可以制备例如可自AB Enzymes,芬兰获得的纤维素酶，商标名为和其至少部分基于来自Melanocarpus的20kD EG。AB Enzymes的其他纤维素酶是和另外的合适的纤维素酶来自芽孢杆菌属物种CBS 670.93和CBS 669.93，来自芽孢杆菌属物种CBS 670.93的酶可以商标名自Danisco/Genencor获得。可制备的Danisco/Genencor的另外的商业产品是“Genencor去垢剂纤维素酶L”和Neutra。
还可以根据本发明制备可通过点突变获得的这些酶的变体。特别优选的纤维素酶是太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)纤维素酶变体，公开在国际公开的说明书WO98/12307中；Melanocarpus，更特别是Melanocarpus albomyces的纤维素酶，其公开在国际公开的说明书WO 97/14804中；公开在欧洲专利申请EP 1 305 432中的里氏木霉(Trichoderma reesei)的EGIII纤维素酶，或可从其获得的变体，更特别是那些公开在欧洲专利申请EP 1240525和EP 1305432中的变体；以及公开在国际公开的说明书WO1992006165、WO 96/29397和WO 02/099091中的纤维素酶。其各自的公开内容通过引用明确并入到本文中，其相关的公开内容因此明确的并入到本专利申请中。
此外，可以制备被术语半纤维素酶覆盖的另外的酶。这些酶包括例如甘露聚糖酶、黄原胶裂解酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、木聚糖酶、支链淀粉酶、果胶切割酶和β-葡聚糖酶。自枯草芽孢杆菌获得的β-葡聚糖酶可以名称自Novozymes获得。根据本发明特别优选的半纤维素酶是甘露聚糖酶，其以例如商标名自Novozymes获得，或以商标名自Genencor获得。出于本发明的目的，果胶切割酶同样包括具有名称果胶酶(pectinase)、果胶酸酯裂解酶、果胶脂酶、果胶脱甲氧酶、果胶甲氧酶、果胶甲酯酶、果胶酶(pectase)、果胶甲酯酶、pectinoesterase、果胶酯酶(pectinpectylhydrase)、果胶去聚合酶、内切多聚半乳糖醛酸酶、果胶酶(pectolase)、果胶水解酶、果胶多聚半乳糖醛酸酶、内切多聚半乳糖醛酸酶、多聚-α-1,4-半乳糖醛酸聚糖水解酶、内切半乳糖醛酸酶、内切-D-半乳糖醛酸酶、galacturan 1,4-α-galacturonidase、外切多聚半乳糖醛酸酶、多聚半乳糖醛酸酯水解酶、外切-D-半乳糖醛酸酶、外切-D-galacturonanase、外切多聚-D-半乳糖醛酸酶、外切-多聚-α-galacturonosidase、exopolygalacturonosidase或exopolygalacturanosidase的酶。适合该方面的酶的例子是例如可以名称Pektinex 或自Novozymes获得的酶；以名称Rohapect Rohapect Rohapect RohapectRohapect MA plus HC、Rohapect Rohapect Rohapect自AB Enzymes获得的酶；和以名称自Diversa Corp.,San Diego,CA,USA获得的酶。
此外，还可以制备氧化还原酶，例如氧化酶、加氧酶、过氧化氢酶、过氧化物酶，如卤代过氧化物酶、氯代过氧化物酶、溴代过氧化物酶、木质素过氧化物酶、葡萄糖过氧化物酶或锰过氧化物酶、加双氧酶或漆酶(酚氧化酶、多酚氧化酶)。应提及的合适的商业产品是来自Novozymes的1和2。其他酶公开在国际专利申请WO 98/45398、WO 2005/056782、WO 2004/058961和WO 2005/124012中。
在本发明的另外的实施方案中，另外的氨基酸序列不是天然地与多肽链中的信号肽共同存于微生物中。因此，核酸序列b)编码的蛋白质是重组蛋白。因此，非天然存在意味着两条氨基酸序列不是微生物的内源蛋白质的组分。因此，包含信号肽和另外的氨基酸序列的蛋白质不能在微生物中由这样的核酸序列表达，所述核酸序列是野生型形式的微生物的部分染色体DNA。因此，在每种情况下，此类蛋白质和/或其编码核酸序列都不存在于野生型形式的微生物中，和/或不能从野生型形式的微生物中分离。因此，两条序列-信号肽和另外的氨基酸序列-都必须分配给野生型形式的微生物的两条不同的多肽链，如果两条序列都或者可能根本位于野生型形式的微生物中。在本发明的这一实施方案的情况下，因此使用基因技术方法，对信号肽和另外的氨基酸序列，或编码它们的核酸进行新组合，并且信号肽和另外的氨基酸序列的此组合不是天然存在的。因此，在野生型形式的微生物中，信号肽与另外的氨基酸序列的此类连接是不存在的，具体而言不存在于DNA水平，也不存在于蛋白质水平。然而，信号肽和另外的氨基酸序列，或编码它们两者的核酸序列，可以都是天然来源的，但其组合不是天然存在的。然而，信号肽和另外的氨基酸序列本身可以源自相同的微生物或源自不同的微生物。
在优选的实施方案中，根据本发明的核酸的特征在于其是非天然的核酸。非天然意指根据本发明的核酸不能从天然存在的野生型形式的生物中分离。因此，更特别地且对于野生型细菌，根据本发明的核酸不是对于细菌内源性的核酸。
优选地，序列(a)和(b)不源自相同的生物，更特别地不源自相同的细菌，而是源自不同的生物，特别是源自不同的细菌。不同的细菌是例如属于不同菌株或种或属的细菌。
在本发明的另外的实施方案中，表达载体的特征在于信号肽排列在由核酸序列b)编码的蛋白质中的另外的氨基酸序列的N端。因此，由核酸序列b)编码的蛋白质具有下列结构：N端-信号肽-(任选的额外的氨基酸序列)-另外的氨基酸序列-C端。已经发现待表达的蛋白质此类结构是特别有利的。
在本发明的另外的实施方案中，表达载体的特征在于由核酸序列b)编码的蛋白质还包含排列在蛋白质的信号肽和另外的氨基酸序列之间的连接序列。因此，由核酸序列b)编码的蛋白质具有下列结构：N端-信号肽-连接序列(也称为“偶联子”或“间隔子”)-另外的氨基酸序列-C端。同样已经发现待表达的蛋白质的此类结构是特别有利的。优选地，连接序列的长度在1和50个氨基酸之间，在2和25个氨基酸之间，在2和15个氨基酸之间，在3和10个氨基酸之间，并且特别优选地在3和5个氨基酸之间。特别优选的连接序列的实例是连续的氨基酸丙氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸(自N端至C端)。
在本发明的另外的实施方案中，表达载体的特征在于蛋白质的另外的氨基酸序列包含蛋白酶的氨基酸序列，所述蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.7至少80％相同。优选地，蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.7至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，非常特别优选100％相同。
可选地，蛋白质的另外的氨基酸序列包含与SEQ ID NO.8至少80％相同的蛋白酶的氨基酸序列。优选地，蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.8至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，非常特别优选100％相同。
可选地，蛋白质的另外的氨基酸序列包含与SEQ ID NO.9至少80％相同的蛋白酶的氨基酸序列。优选地，蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.9至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，非常特别优选100％相同。
可选地，蛋白质的另外的氨基酸序列包含这样的蛋白酶的氨基酸序列，所述蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.10至少80％相同，且在根据SEQ ID NO.10的编号的第99位具有氨基酸谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)。优选地，蛋白酶的氨基酸序列在根据SEQ ID NO.10的编号的第1至98位和第100至269位与SEQ ID NO.10至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同，并且非常特别优选地与SEQ ID NO.10相同。
可选地，蛋白质的另外的氨基酸序列包含这样的蛋白酶的氨基酸序列，所述蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.10至少80％相同，且在根据SEQ ID NO.10的编号的第99位具有氨基酸谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，并且另外地，在根据SEQ ID NO.10的编号中具有下列氨基酸中的至少一个：
(a)第3位的苏氨酸(3T)，
(b)第4位的异亮氨酸(4I)，
(c)第61位的丙氨酸、苏氨酸或精氨酸(61A、61T或61R)，
(d)第154位的天冬氨酸或谷氨酸(154D或154E)，
(e)第188位的脯氨酸(188P)，
(f)第193位的甲硫氨酸(193M)，
(g)第199位的异亮氨酸(199I)，
(h)第211位的天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸(211D、211E或211G)，
(i)氨基酸(a)至(h)的组合。
优选地，该蛋白酶的氨基酸序列在所有未修饰或不预期修饰的位置处与SEQ IDNO.10至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同，并且非常特别优选地与SEQ ID NO.10相同。因此，非常特别优选地，蛋白质的另外的氨基酸序列包含这样的蛋白酶的氨基酸序列，所述蛋白酶的氨基酸序列在相对于SEQ ID NO.10的至少2个位置处具有修饰的氨基酸序列，第一个修饰是在根据SEQ ID NO.10的编号的第99位的谷氨酸，而第二个修饰，根据SEQ ID NO.10的编号，选自：
(a)第3位的苏氨酸(3T)，
(b)第4位的异亮氨酸(4I)，
(c)第61位的丙氨酸、苏氨酸或精氨酸(61A、61T或61R)，
(d)第154位的天冬氨酸或谷氨酸(154D或154E)，
(e)第188位的脯氨酸(188P)，
(f)第193位的甲硫氨酸(193M)，
(g)第199位的异亮氨酸(199I)，
(h)第211位的天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸(211D、211E或211G)，
(i)氨基酸(a)至(h)的组合。
同样非常特别优选地，蛋白质的另外的氨基酸序列包含这样的蛋白酶的氨基酸序列，所述蛋白酶的氨基酸序列在相对于SEQ ID NO.10的至少2个位置处具有修饰的氨基酸序列，第一个修饰是在根据SEQ ID NO.10的编号的第99位的天冬氨酸，而第二个修饰，根据SEQ ID NO.10的编号，选自：
(a)第3位的苏氨酸(3T)，
(b)第4位的异亮氨酸(4I)，
(c)第61位的丙氨酸、苏氨酸或精氨酸(61A、61T或61R)，
(d)第154位的天冬氨酸或谷氨酸(154D或154E)，
(e)第188位的脯氨酸(188P)，
(f)第193位的甲硫氨酸(193M)，
(g)第199位的异亮氨酸(199I)，
(h)第211位的天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸(211D、211E或211G)，
(i)氨基酸(a)至(h)的组合。
发现可以使用根据本发明的表达载体特别有利地制备上述蛋白酶。对于本发明的这类实施方案，发现信号肽和枯草杆菌蛋白酶的这类组合使得能够在发酵方法中实现特别好的产量。在这方面说明的是成熟的蛋白酶，即，加工至完成的产品的氨基酸序列。在根据本发明的表达载体中，这方面还可以包括未成熟蛋白酶，更特别是例如前肽的另外的序列。在此情况下，蛋白质的另外的氨基酸序列包含蛋白酶的和前肽的氨基酸序列。因此，本发明的另外的实施方案的特征在于蛋白质的另外的氨基酸序列包含蛋白酶，更特别是上述蛋白酶与前肽或其前肽的氨基酸序列。
一般而言，蛋白质的另外的氨基酸序列不需要只包含成熟蛋白质的氨基酸序列；相反，能够包括其他氨基酸序列，例如，所述氨基酸序列的前肽。这不仅适用于蛋白酶，还适用于所有蛋白质，更特别是所有其他类型的酶。
可以通过本身已知的用于修饰核酸的方法生成根据本发明的核酸和表达载体。这类方法出现在例如相关手册中，如Fritsch,Sambrook和Maniatis,"Molecular cloning:alaboratory manual",Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,1989，并且是生物技术领域的技术人员熟悉的。这类方法的实例是化学合成或聚合酶链式反应(PCR)，任选与分子生物学和/或化学或生物化学的其他标准方法结合。
含有根据本发明的载体的非人宿主细胞，其中使用了相应宿主细胞的制备方法，和相应载体或宿主细胞的用途，都与上述本发明的主题和作为另外的发明主题的实施方案相关。因此，上述陈述相应涉及了所述发明主题。
本发明还提供了含有根据本发明的表达载体的非人宿主细胞。优选通过转化将根据本发明的表达载体导入宿主细胞。根据本发明，这是优选通过将根据本发明的载体转化到微生物中进行的，所述微生物然后构成了根据本发明的宿主细胞。可选地，还可以以这样的方式将个体组分，即，核酸部分或片段，例如根据本发明的载体的组分(a)和/或(b)，导入到宿主细胞中，所述方式使得如此获得的宿主细胞包含根据本发明的载体。该方法是尤其适合的，如果宿主细胞已包含根据本发明的载体的一个或多个构份，然后再相应地考虑另外的构份。现有技术中已经建立了用于转化细胞的方法，并且是本领域技术人员普遍已知的。原则上，所有的细胞，即，原核或真核细胞，都适合作为宿主细胞。可以有利地遗传操作的宿主细胞，例如关于用载体转化及其稳定的建系，是优选的，例如单细胞真菌或细菌。此外，从微生物学和生物技术的角度来看，优选的宿主细胞是易于操作的。这涉及例如易于培养、高生长速率、低发酵培养基需求，和外源蛋白的良好生产和分泌速率。在多种情况下，必须从现有技术中丰富的不同体系中，实验地确定用于每种情况的最佳表达体系。
其他优选的实施方案是由于遗传调控元件，因此活性可调控的宿主细胞，所述遗传调控元件可获得自例如载体，但也可以从一开始就位于所述细胞中。例如，可以通过充当激活子的化学化合物的受控的添加，通过改变培养条件，或达到特定的细胞密度，来刺激表达。这允许经济地生产蛋白质。
优选的宿主细胞是原核或细菌细胞。细菌具有短的世代时间，和对培养条件的低需求。其结果是可以建立有成本效益的方法。此外，在细菌的发酵技术的情况下，本领域技术人员可利用丰富的经验。对于具体的生产工艺，革兰氏阴性或革兰氏阳性菌可以适用于非常广泛的多种不同理由，所述理由基于个体基础待实验性地决定，如营养源、产物形成速率、时间要求等。
在革兰氏阴性菌的情况下，例如大肠杆菌，多种多肽被分泌到周质空间中，即，进入包裹细胞的两层膜之间的区室中。这对于具体应用是有利的。此外，还可以以这样的方式构建革兰氏阴性菌，使其不仅将表达的多肽排入周质空间，而且还排入细菌周围的基质中。相反，革兰氏阳性菌(如芽孢杆菌或放线菌科(Actinomycetaceae)，或放线菌目(Actinomycetales)的其他代表菌株)不具有外膜，因此，分泌的蛋白质立即被释放到细菌周围的基质中，一般是培养基中，可从中纯化表达的多肽。多肽可以直接从基质中分离，或进一步加工。此外，革兰氏阳性菌与技术上重要的酶来源的大部分生物相关或相同，通常其本身也形成可比较的酶，因此具有相似的密码子使用，且相应地其蛋白质合成装置是天然地组织的。
密码子用法理解为意指使遗传密码成为氨基酸，即，哪种核苷酸顺序(三联体或碱基三联体)编码哪种氨基酸或哪种功能，例如待翻译区域的起点和终点、多种蛋白质的结合位点等。因此，每种生物，特别是每种生产菌株，都具有特定的密码子使用。如果宿主细胞中的转基因核酸上的密码子面对相对低数量的负载的tRNA，则蛋白质的生物合成中存在瓶颈。相反，同义密码子编码相同的氨基酸，并可以根据宿主更有效地翻译。因此，该任选地必需的转录依赖于所选择的表达系统。尤其是在样品由未知的、可能是不可培养的生物构成的情况下，必需进行相应的调试。
本发明原则上可用于所有的微生物，特别是所有的可发酵微生物，特别优选芽孢杆菌属，通过应用此类微生物作为生产生物，导致能够在发酵方法中实现增加的产率。此类微生物是用于本发明目的的优选的宿主细胞。
在本发明的另外的实施方案中，宿主细胞的特征因此在于其是细菌，优选选自埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、节细菌属(Arthrobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和假单胞菌属(Pseudomonas)，更优选地是选自大肠杆菌(Escherichia coli)、特氏克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、球芽孢杆菌(Bacillus globigii)、吉氏芽孢杆菌(Bacillusgibsonii)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化节杆菌(Arthrobacter oxidans)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。非常特别优选地衣芽孢杆菌。
然而，宿主细胞还可以是真核细胞，特征在于其具有细胞核。因此，本发明还提供了特征在于具有细胞核的宿主细胞。
与原核细胞相反，真核细胞能够对形成的蛋白质进行翻译后修饰。其实例是真菌，如放线菌，或酵母，如酵母属(Saccharomyces)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)。这可以是特别有利的，例如，当蛋白质连同其合成经历这类系统允许的特定修饰时。真核系统进行的修饰，特别是连同蛋白质合成进行的修饰包括例如结合低分子量化合物，如膜锚定蛋白或寡糖。这类寡糖修饰可以对于例如，降低表达的蛋白质的过敏原性是理想的。与这类细胞中天然形成的酶(例如纤维素酶)共表达也可以是有利的。此外，例如嗜热真菌表达系统可尤其适合温度抗性变体的表达。
出于本发明的目的，考虑由核酸序列(b)编码的蛋白质，更特别是上述蛋白质，作为发酵过程中形成的产物。因此优选是酶，特别优选蛋白酶，非常特别优选枯草杆菌蛋白酶。
此外，可以根据培养条件方面的要求，修饰宿主细胞，宿主细胞可以具有其他的或额外的选择标志物，或者可以表达其他的或额外的蛋白质。更特别的是，宿主细胞可以是表达多种蛋白质或酶的宿主细胞。优选地，宿主细胞将蛋白质或酶分泌到宿主细胞周围的基质中。
以本身已知的方式，例如在分批系统或连续系统中，培养和发酵根据本发明的宿主细胞。在第一种情况下，用宿主细胞接种恰当的培养基，并在实验地确定的时间后，从培养基收获产物。连续发酵方法涉及达到稳定状态，在所述稳态中，在相对长的时间后，细胞部分死亡，但也再次生长，并同时从培养基中移出产物。
优选使用根据本发明的宿主细胞制备由核酸序列(b)编码的蛋白质。因此，本发明还提供了制备蛋白质的方法，包括
a)培养根据本发明的宿主细胞
b)从培养基或从宿主细胞中分离蛋白质。
本发明的主题优选包括发酵方法。发酵方法本身是现有技术已知的，构成实际的工业规模生产步骤，一般后续为用于制备的产物(如蛋白质)的恰当的纯化方法。涉及相应的制备蛋白质的方法的所有的发酵方法构成本发明主题的实施方案。
就此而言，必须根据本领域技术人员的知识，实验地确定用于制备方法的多种最佳条件，特别是用于所使用的宿主细胞的最佳培养条件，例如关于发酵体积和/或基质组成和/或氧供应和/或搅拌速度。
特征在于通过连续补料策略进行发酵的发酵方法是一种特别的可能性。在此情况下，连续补料被正在进行的培养所消耗的基质构份；这也被称为连续补料策略。结果是可以获得细胞密度和细胞质量或干燥质量和/或尤其是目标蛋白，优选酶的活性的可观增加。
此外，还可以以这样的方式设计发酵，使得通过在各种情况下添加恰当的缓冲液或平衡离子，过滤或中和不想要的代谢产物。
可以从发酵基质中收获制备的蛋白质。这类发酵方法相对于从宿主细胞中分离多肽，即，从细胞团(干燥质量)中加工产物而言是有利的。根据本发明，信号肽提供了适用于该方面的选择标志物。
所有上述事实都可以组合形成制备蛋白质的方法。就此而言，可以考虑方法步骤的多种可能的组合。必需针对各种具体的个案，确定最佳方法。
本发明还提供了根据本发明的表达载体或根据本发明的宿主细胞用于制备蛋白质的用途。
上述所有事实、主题和实施方案也可用于本发明的主题。因此，此处明确参考相应点的公开内容，并指出所述公开内容还可用于根据本发明的用途(载体或宿主细胞的用途)。
实施例
所有的分子生物学工作步骤都遵循标准的方法，例如手册Fritsch,Sambrook和Maniatis"Molecular cloning:a laboratory manual",Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York,1989或可比较的相关工作所述。根据相应生产商的说明书使用酶和试剂盒。
实施例1：制备根据本发明的表达载体
通过SacI限制性消化，截短质粒pBSMuL3(Brockmeier等人，2006)，之后在大肠杆菌部分附近重新连接。将获得的质粒pBSMuL5(参见图1)用作载体，用于将包括前肽的蛋白酶克隆进入EcoRI和BamHI限制性位点中。为此，用根据SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12的引物，扩增根据SEQ ID NO.8的蛋白酶的基因，并用根据SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的引物，扩增根据SEQ ID NO.9的碱性蛋白酶的基因。将获得的质粒用作载体，用于将信号肽克隆进入HindIII和EcoRI限制性位点中。用根据SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的引物，扩增作为参照的对照信号肽SubC(地衣芽胞杆菌，NCBI(美国国立生物技术信息中心)登录号：X91260.1)的DNA片段，并在每种情况下克隆进入质粒的HindIII和EcoRI限制性位点中，产生具有编码蛋白质的核酸序列b)的质粒，所述蛋白质具有信号肽SubC连同根据SEQ IDNO.8(质粒1)或SEQ ID NO.9(质粒2)的蛋白酶。之后将这些质粒用作对照或参照。用根据SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20的引物，扩增根据SEQ ID NO.2的信号肽的DNA片段，用根据SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18的引物，扩增根据SEQ ID NO.4的信号肽的DNA片段，并用根据SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22的引物，扩增根据SEQ ID NO.6的信号肽的DNA片段。而将根据SEQ ID NO.2和4的信号肽的DNA片段分别克隆到编码根据SEQ ID NO.8的蛋白酶的载体中(质粒3和4)，将根据SEQ ID NO.6的信号肽的DNA片段插入到编码根据SEQ ID NO.9的蛋白酶的载体中(质粒5)。与克隆相关联，在特别信号肽的DNA序列与特别蛋白酶的前肽的DNA序列之间导入编码连续氨基酸AEF(参见图1)的9个核苷酸的序列。这一所谓的连接序列含有限制性内切酶EcoRI的识别序列。
下表1列举了用作引物的所有寡核苷酸：
表1：
实施例2：表达蛋白质
用质粒1-5转化地衣芽胞杆菌菌株，以获得多个蛋白酶生产菌株。为了接种培养物，使用来自孵育过夜(ON)的琼脂平板的单克隆。为了定量确定分泌效率，将单克隆从琼脂平板直接转移至深孔MTP(微滴度板；96孔，每孔含1mL选择性LB培养基)。在所述确定中，每个单克隆至少平行地转移至2个孔，从而获得重复2次或3次的确定，作为特别的克隆的多次培养的结果。为了接种深孔MTP，仅使用在37℃孵育过夜的克隆。在微滴度板振荡器(Timix5来自Edmund-Bühler,Hechingen)上37℃培养20h后，在LB琼脂平板上复制所有克隆，并随后通过离心(4000rpm,20min,4℃)沉淀细胞。之后，使用多通道移液器(Eppendorf,Hamburg)进行所有的移液步骤，使用反向移液模式，并且不移取小于15μl的体积。在各种情况下，最小体积最初添加到MTP中，而之后向MTP中加入较大体积，并在每个稀释步骤在分光光度计“Spectramax 250”(Molecular Devices,Sunnyvale,USA)中将MTP混合10秒。为了生成相应的稀释液，使用多通道移液器移出培养上清，并移至微滴度板中(96孔，F型底，透明，来自Greiner Bio-One,Frickenhausen)。
随后，通过从底物suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)释放的生色团对硝基苯胺(pNA)，确定培养上清或稀释液中的蛋白水解活性。蛋白酶切割底物并释放pNA。pNA的释放导致410nm处的吸光值增加，其随时间的改变是酶促活性的测量(参见Del Mar等人，Anal.Biochem.,99:316–320,1979)。
为了确定多个菌株的分泌效率，在各MTP培养中伴随地培养内部对照构建体(质粒1或质粒2)。将培养上清中确定的具有对照构建体的菌株的蛋白水解活性定义为100％。
与包含质粒1的对照相比，含有根据本发明的质粒3和4的菌株分别达到增加了194％+/-48和230％+/-38的蛋白酶活性(参见图2)。
与包含质粒2的对照相比，含有根据本发明的质粒5的菌株达到增加了44％+/-10的蛋白酶活性(参见图3)
附图描述
图1：芽孢杆菌表达载体pBSMul5的克隆策略示意图(根据Brockmeier等人，2006修改)。(A)在N端扩增信号肽的DNA片段，N端具有HindIII限制性位点、标准化的核糖体结合位点(RBS)，后接间隔子区和甲硫氨酸的标准化起始密码子。在信号肽和待分泌的蛋白酶的N-端之间，连接具有“+1”位的丙氨酸和EcoRI限制性位点的偶联子。(B)芽孢杆菌载体pBSMul5，具有HpaII启动子、特别的分泌靶(通过EcoRI和BamHI克隆)、以及卡那霉素抗性盒和芽孢杆菌的复制蛋白repB。
图2：在含有根据SEQ ID NO.8的蛋白酶和pBSMul5中三种不同信号肽的地衣芽胞杆菌的培养上清中的相对蛋白酶活性。将构建体质粒1的蛋白水解活性定义为100％(对照)。在至少2个独立培养中确定值。误差线表示标准差。
图3：在含有根据SEQ ID NO.9的蛋白酶和pBSMul5中2种不同信号肽的地衣芽胞杆菌的培养上清中的相对蛋白酶活性。将构建体质粒2的蛋白水解活性定义为100％(对照)。在至少2个独立培养中确定值。误差线表示标准差。
序列表
<110> Henkel AG & Co. KGaA
<120> 用于改善的蛋白质分泌的表达载体
<130> H 09309 PCT
<150> DE 102011118032.3
<151> 2011-05-31
<160> 22
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 126
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(126)
<400> 1
atg gcg aaa cca cta tca aaa ggg gga att ttg gtg aaa aaa gta ttg 48
Met Ala Lys Pro Leu Ser Lys Gly Gly Ile Leu Val Lys Lys Val Leu
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att gca ggt gca gta gga aca gca gtt ctt ttc gga acc ctt tca tca 96
Ile Ala Gly Ala Val Gly Thr Ala Val Leu Phe Gly Thr Leu Ser Ser
20 25 30
ggt ata cca ggt tta ccc gcg gca gac gct 126
Gly Ile Pro Gly Leu Pro Ala Ala Asp Ala
35 40
<210> 2
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<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
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1 5 10 15
Ile Ala Gly Ala Val Gly Thr Ala Val Leu Phe Gly Thr Leu Ser Ser
20 25 30
Gly Ile Pro Gly Leu Pro Ala Ala Asp Ala
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<211> 81
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌
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<213> 地衣芽孢杆菌
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<213> 枯草芽孢杆菌
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20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
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210 215 220
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<212> PRT
<213> 迟缓芽孢杆菌
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Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
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<212> PRT
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Claims (10)
1.表达载体，包含
a)启动子序列，和
b)编码蛋白质的核酸序列，所述蛋白质包含信号肽和另外的氨基酸序列，并且信号肽包含与SEQ ID NO.2中说明的氨基酸序列至少80％相同，或与SEQ ID NO.4中说明的氨基酸序列至少80％相同，或与SEQ ID NO.6中说明的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或者信号肽包含与这些序列中的至少一个在结构上同源的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的表达载体，其中由核酸序列b)编码的信号肽具有根据SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2的表达载体，其中蛋白质的另外的氨基酸序列包含酶的氨基酸序列，更特别地包含蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、鞣酸酶、木聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、果胶切割酶、卡拉胶酶、perhydrolase、氧化酶、氧化还原酶或脂肪酶的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项的表达载体，其中信号肽排列在由核酸序列b)编码的蛋白质中的另外的氨基酸序列的N端。
5.根据权利要求1至4中任一项的表达载体，其中由核酸序列b)编码的蛋白质还包含排列在蛋白质的信号肽和另外的氨基酸序列之间的连接序列，连接序列的长度特别地在1和50个氨基酸之间。
6.根据权利要求1至5中任一项的表达载体，其中蛋白质的另外的氨基酸序列包含蛋白酶的氨基酸序列，所述蛋白酶的氨基酸序列
与SEQ ID NO.7至少80％相同，或
与SEQ ID NO.8至少80％相同，或
与SEQ ID NO.9至少80％相同，或
与SEQ ID NO.10至少80％相同，并在根据SEQ ID NO.10的编号的第99位具有氨基酸谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，或与SEQ ID NO.10至少80％相同，并在根据SEQ ID NO.10的编号的第99位具有氨基酸谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，并还在根据SEQ ID NO.10的编号中具有下列氨基酸中的至少一个：
(a)第3位的苏氨酸(3T)，
(b)第4位的异亮氨酸(4I)，
(c)第61位的丙氨酸、苏氨酸或精氨酸(61A、61T或61R)，
(d)第154位的天冬氨酸或谷氨酸(154D或154E)，
(e)第188位的脯氨酸(188P)，
(f)第193位的甲硫氨酸(193M)，
(g)第199位的异亮氨酸(199I)，
(h)第211位的天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸(211D、211E或211G)，(i)氨基酸(a)至(h)的组合。
7.非人宿主细胞，其包含根据权利要求1至6中任一项的表达载体。
8.根据权利要求7的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌，优选地是选自埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、节细菌属(Arthrobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌，更优选地是选自大肠杆菌(Escherichia coli)、特氏克雷伯氏菌(Klebsiellaplanticola)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、球芽孢杆菌(Bacillus globigii)、吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化节杆菌(Arthrobacter oxidans)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)和嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的细菌，更特别是地衣芽孢杆菌。
9.制备蛋白质的方法，所述方法包括步骤
(a)培养根据权利要求7或8的宿主细胞，
(b)从培养基或从宿主细胞中分离蛋白质。
10.根据权利要求1至6中任一项的表达载体或根据权利要求7或8的宿主细胞用于制备蛋白质的用途。
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