KR101919298B1 - 보툴리눔 독소 및 안정화제를 포함하는 액상 제형 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 보툴리눔 독소 및 안정화제를 포함하는 액상 제형 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 보툴리눔 독소 및 안정화제를 포함하는 제형화 기술은 액상 제형으로서 보관 및 유통이 용이하고, 인체의 온도 및 pH 에 적합한 조건에서 보툴리눔 독소 안정화의 현저한 효과를 입증하였으므로, 보툴리눔 독소의 안전하고 편리한 의학적 이용에 크게 활용될 것으로 기대된다.

Description

보툴리눔 독소 및 안정화제를 포함하는 액상 제형 및 이의 제조방법{The stabilized liquid formulations comprising a botulinum toxin and a stabilizer and a method of producing thereof}
본 발명은 보툴리눔 독소 및 안정화제를 포함하는 액상 제형 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
신경독성 효과를 지닌 독소를 분비하는 다양한 클로스트리디움 속 균주들이 1890년대부터 지금까지 발견되었으며, 지난 70년간 이들 균주들이 분비하는 독소에 대한 특성 규명이 이루어져 왔다(Schant, E. J. et al., Microbiol. Rev., 56:80, 1992). 그 중에서도 보툴리눔 독소(botulinum toxin)는 신경 기능을 가지는 동물에 있어서 신경근육종말(neuromuscular junction)의 콜린성 전시냅스(cholinergic presynapse)에서 아세틸콜린의 엑소시토시스(exocytosis)를 저해하여 전신 무력증을 일으키므로, 이러한 보툴리눔 독소의 특성을 이용하여 미용 또는 치료 용도로 이용하고자 하는 노력이 있어 왔다. 안과질환(미국 특허 6,265,379호), 통증(미국 특허 6,113,915호), 다한증을 포함하는 다양한 자율신경계 신경 기능장애(미국 특허 5,766,605호), 편두통 통증(미국 특허 5,714,468호), 수술-후 통증 및 내장 통증(미국 특허 6,464,986호), 건선 및 피부염(미국 특허 5,670,484호), 다양한 암(미국 특허 6,139,845호 및 6,063,768), 및 신경성 염증(미국 특허 6,063,768호) 등의 치료에 보툴리눔 독소를 이용하기 위한 기술이 제안되었거나 시도되었다.
그러나 보툴리눔 독소는 단백질 제제로써 약제화 과정을 포함하는 보관, 유통, 관리가 용이하지 않은 문제점이 있었다. 이는 단백질의 불안정성에 기인하며, 보툴리눔 독소와 같이 극히 낮은 농도로 약제화가 이루어지는 단백질 제제의 경우 그 문제가 심각하다. 보툴리눔 독소 단백질은 고체 표면에 접착하는 특성을 가지므로 용기에 주입되는 경우 단백질의 일부가 용기 내벽에 접착하여 활성성분의 손실을 야기하며, 단백질이 쉽게 산화되거나 작은 단편으로 분해될 수 있다. 따라서 보툴리눔 독소의 변성을 최대한 방지하기 위하여, 제조 공정상에서 정제된 보툴리눔 독소를 동결건조 분말 형태로 유통하고 이를 임상에서 사용 직전에 용매에 희석하여 액상 형태로 환자에게 투여하고 있는 실정이다. 그러나 이 또한 사용자의 희석 배율 착오 또는 희석 용매의 오염 등 인적 오류로 인한 의료 사고의 위험성이 높은 문제점이 있다. 따라서 보툴리눔 독소 액상 제형의 제조 및 유통 시에도 단백질 변성을 방지할 수 있는 안정화제의 개발이 시급한 실정이다. 종래에는 보툴리눔 독소의 활성 유지를 위한 안정화제로 알부민을 활발히 이용하였으나, 동물 유래의 성분으로 인한 교차감염 및 부작용의 위험성으로 최근에는 비-동물성 제제의 개발이 요구되고 있다. 이에 따라 미국공개특허공보 제2007-0134199호에는 아미노산으로서 글루타민과 글루탐산 또는 아스파라긴과 아스파르트산을 포함하는 보툴리눔 독소 조성물에 대하여 개시하고 있고, 한국 등록특허공보 제1087017호에서는 메티오닌을 안정화제로 이용하는 보툴리눔 독소 조성물에 대하여 개시하고 있으나, 인체의 온도 및 pH 에 적합한 조건에서의 현저한 효과를 제시하지 못하는 한계가 있었다.
따라서 본 발명은 보툴리눔 독소 및 안정화제를 포함하는 액상 제형 및 이의 제조방법에 대한 것으로, 본 발명의 보툴리눔 독소를 포함하는 약제학적 제형은 유효성분으로서의 보툴리눔 독소에 대한 안정화제로 아르기닌, 글루타민산, 또는 아스파르트산을 이용하여 액상 제형으로서 보관 및 유통이 용이하고, 인체의 온도 및 pH 에 적합한 조건에서 보툴리눔 독소 안정화의 현저한 효과를 입증하였으므로, 보툴리눔 독소의 안전하고 편리한 의학적 이용에 크게 활용될 것으로 기대된다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 보툴리눔 독소 및 안정화제를 포함하는 액상 제형 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구체예에서 “보툴리눔 독소(Botulinum Toxin)”란, 클로스트리디움 보툴리눔 세균이 만드는 신경독 단백질이다. 클로스트리디움 속은 127 종 이상이며, 형태 및 기능에 따라 구분된다. 혐기성, 그람 양성 박테리아 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)은 사람 및 동물에서 보툴리즘이라는 신경마비 질환을 일으키는, 강력한 폴리펩티드 신경독인, 보툴리눔 독을 생산한다. 클로스트리디움 보툴리눔의 포자는 토양에서 발견되며, 제대로 살균되지 않고 밀봉된, 집에서 통조림된 식품 용기에서 배양될 수 있어, 이러한 것들이 많은 보툴리즘의 원인이 된다. 보툴리즘 증상은 전형적으로 클로스트리디움 보툴리눔 배양물 또는 포자에 감염된 음식을 먹은 후 18 내지 36시간이 지나서 나타난다. 보툴리눔 독소는 독성이 감소되지 않은 채로 장 내막을 통과할 수 있는 것으로 보이며 콜린성 운동 뉴런에 대해 높은 친화도를 나타낸다. 보툴리눔 독소 중독의 증상은, 보행장애, 연하장애 및 언어장애, 호흡근육의 마비 및 죽음으로 증상이 진행될 수 있다.
보툴리눔 독소 타입 A는 사람에게 알려진 가장 치명적인 천연 생물학제이다. 상업적으로 입수 가능한 보툴리눔 독소 타입 A(정제된 신경독 복합체)의 LD50은 약 50 피코그램이다(즉, 1 유닛). 몰(M)을 기준으로 할 때, 보툴리눔 독소 타입 A는 디프테리아보다 18억배, 시안화 나트륨보다 6억배, 코브라 독(cobra toxin)보다 3천만배, 그리고, 콜레라보다 1천2백만배 더 치명적이다. 보툴리눔 독소 1 유닛(U)은, 체중이 각각 18-20g인 암컷 스위스 웹스터 마우스(Swiss Webster mice)에 복강내 주사를 통한 LD50로서 정의할 수 있다.
일반적으로 면역학적으로 구별되는 7개의 보툴리눔 신경독은, 타입-특이적인 항체로 중화하여 구별되는 각각 신경독 세로타입(serotype) A, B, C1, D, E, F 및 G로 특징 지워진다. 상이한 세로타입의 보툴리눔 독소는 작용하는 동물 종 및 야기하는 마비의 정도 및 지속시간에 따라 차이가 있다. 예를 들어, 랫드에서 발생하는 마비율로 측정할 때, 보툴리눔 독소 타입 A는 보툴리눔 독소 타입 B에 비하여 500배 더 강력한 것으로 측정되었다. 또한, 보툴리눔 독소 타입 B는, 보툴리눔 독소 타입 A 영장류 LD50의 약 12배인 480U/kg을 영장류에 투여할 때도 독성이 없는 것으로 측정되었다. 보툴리눔 독소는 콜린성 운동 뉴런에 강한 친화도를 가지고 결합하고, 뉴런으로 들어가 아세틸콜린의 방출을 억제하는 것으로 여겨진다. 식세포작용 및 음세포작용에 의해서 뿐 아니라, 낮은 친화도 수용체를 통하여 추가로 흡수될 수 있다.
세로타입에 관계없이, 독소 중독의 분자적 메카니즘은 유사하며, 적어도 3 단계로 구성되는 것으로 보인다. 이 과정의 첫 번째 단계에서는, 독소의 중쇄(H 사슬 또는 HC)와 세포 표면 수용체의 특이적인 상호작용에 의해서, 독소가 표적 뉴런의 시냅스 전 막에 결합하는 것이며, 이 수용체는 보툴리눔 독소 타입 및 파상풍 독소 타입 각각에 따라 다른 것으로 여겨진다. 세포 표면에 대한 독소의 표적화에는 중쇄의 카르복실 말단 단편, Hc이 중요한 것으로 여겨진다.
두번째 단계에서는, 독소가 중독된 세포의 원형질막을 가로질러 통과한다. 일차로 보툴리눔 독소는 수용체-매개 엔도시토시스를 통하여 세포에 의해서 감싸져서, 독소를 포함하는 엔도좀이 형성된다. 그리고 나서, 독소는 엔도좀을 빠져나와 세포의 세포질로 들어간다. 이 단계는 약 pH 5.5 이하에서 독소의 구조 변경을 유발하는 중쇄의 아미노 말단 단편, HN에 의해서 매개되는 것으로 여겨진다. 엔도좀은 엔도좀 내부 pH를 감소시키는 양성자 펌프를 가지는 것으로 알려져 있다. 구조적 위치이동으로 인해 독소의 소수성 잔기가 노출되어, 독소가 엔도솜 막으로 둘러싸일 수 있게 된다. 그리고 나서, 독소(또는 최소한 경쇄)는 엔도솜 막을 통하여 시토졸로 전위된다.
보툴리눔 독소 활성화 메카니즘의 마지막 단계는 중쇄와 경쇄를 연결하는 디설파이드 결합의 환원을 포함하는 것으로 여겨진다. 보툴리눔 및 파상풍 독소의 전체 독성 활성은 완전독(holotoxin)의 경쇄에 포함되며; 경쇄는 인식, 및 신경전달물질-함유 소포(vesicle)와 원형질 막의 세포질 표면과의 도킹, 및 원형질 막과 소포와의 융합에 꼭 필요한 단백질을 선택적으로 절단하는 아연(Zn++) 엔도펩티다아제이다. 파상풍 신경독, 보툴리눔 독소 타입 B, D, F 및 G는 시냅토브레빈(또는 소포-관련 막 단백질(VAMP)라 칭함), 시냅토솜 막 단백질의 분해를 야기한다. 시냅스 소포의 세포질 표면에 존재하는 VAMP은 대부분 이러한 분해작용 중 하나의 결과로 제거된다. 세로타입 A 및 E는 SNAP-25를 절단한다. 세로타입 C1은 원래 신택신을 절단하는 것으로 여겨졌으나, 신택신 및 SNAP-25를 절단하는 것으로 밝혀졌다. 동일한 결합을 절단하는 타입 B(및 파상풍 독소)를 제외하고는, 각각의 독소는 상이한 결합을 특이적으로 절단한다. 각각의 이러한 절단은 소포-막 도킹의 과정을 방해하여 소포 내용물의 엑소시토시스를 막는다.
보툴리눔 독소는 활동항진성 골격근을 특징으로 하는 신경근육 장애(즉, 운동 장애)의 치료를 위해 임상에서 사용되고 있다. 1989년에, 보툴리눔 독소 타입 A 컴플렉스는 미국 식품의약청에 의해서, 본태성 안검경련, 사시 및 반측안면 경련의 치료에 사용되는 것이 승인되었다. 이어서, 보툴리눔 독소 타입 A는 또한 FDA로부터 경부 디스토니아의 처치 및 미간 주름의 처치에 대해 승인되었고, 보툴리눔 독소 타입 B도 경부 디스토니아의 처치에 대하여 승인되었다. 독소 타입 A 이외의 보툴리눔 세로타입들은 보툴리눔 독소 타입 A와 비교할 때, 활성에 있어서 더 낮은 효력 및/또는 더 짧은 지속시간을 가지는 것으로 보인다. 말초 근육내 주사된 보툴리눔 독소 타입 A의 임상 효과는 보통 주사 후 일주일 이내에 나타난다. 일회 보툴리눔 독소 타입 A의 근육 내 주사에 의한 증상 구제의 전형적인 지속시간은 평균 약 3 개월이나, 상당히 더 긴 기간 동안의 치료 활성이 보고되었다.
모든 보툴리눔 독소 세로타입이 신경근육 접합부에서 신경전달물질 아세틸콜린의 방출을 억제하는 것으로 보인다 하더라도, 이들은 상이한 신경분비성 단백질에서 작용하며, 이 단백질을 상이한 부위에서 절단한다. 예를 들어, 보툴리눔 타입 A 및 E는 모두 25kDa 시냅토솜 관련 단백질(SNAP-25)을 절단하지만, 이 단백질의 상이한 아미노산 서열을 표적으로 한다. 보툴리눔 독소 타입 B, D, F 및 G는 소포 관련 단백질(VAMP, 소위 시냅토브레빈)에 작용하며, 각각의 세로타입은 이 단백질의 상이한 부위를 절단한다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 타입 C1은 신택신 및 SNAP-25를 모두 절단하는 것으로 보인다. 이러한 작용 메카니즘의 상이성은 여러 보툴리눔 독소 세로타입들의 작용에 의한 상대적인 효력 및/또는 지속시간에 영향을 미칠 것이다. 특히, 보툴리눔 독소의 기질을 여러 상이한 세포 타입에서 발견할 수 있다.
보툴리눔 독소 단백질 분자의 분자량은, 알려진 보툴리눔 독소 세로타입 7가지 모두에서, 약 150kDa이다. 보툴리눔 독소는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서 관련된 비독성 단백질과 함께 150kDa 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 복합체로서 방출된다. 그러므로, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 900kDa, 500kDa 및 300kDa 형으로 생성될 수 있다. 보툴리눔 독소 타입 B 및 C1은 700kDa 또는 500kDa 복합체로서만 생성되는 것으로 보인다. 보툴리눔 독소 타입 D는 300kDa 및 500kDa 복합체로서 생성된다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 타입 E 및 F는 약 300kDa 복합체로서만 생성된다. 이 복합체들(즉, 분자량이 약 150kDa 보다 큰 것)은 비독성 적혈구응집소 단백질 및 비독소 및 비독성 비적혈구응집소 단백질을 포함하는 것으로 여겨진다. 이러한 두가지 비독소 단백질(보툴리눔 독소 분자와 함께 관련 신경독 복합체를 포함하는)은 보툴리눔 독소 분자 변성에 대한 안정성 및 독소가 섭취될 때 소화성 산에 대한 보호를 제공하는 데에 작용할 것이다. 또한, 보툴리눔 독소 복합체가 더 클수록(분자량이 약 150kDa 이상), 보툴리눔 독소 복합체가 근육 주사된 부위로부터 보툴리눔 독소가 더 천천히 확산될 것이다. 따라서 본 발명에 있어서, 보툴리눔 독소는 복합체화 단백질을 함유하지 않는 형태 또는 복합체화 단백질을 함유하는 복합체 형태를 모두 포함할 수 있다. 자연적으로 형성하는 복합체화 단백질을 함유하지 않으며 A, B, C, D, E, F 또는 G형 클로스트리디움 보툴리눔으로부터 유래되는 보툴리눔 독소 단백질의 분자량은 대략 150kDa이다. 하지만 클로스토리디움 보툴리눔 박테리아에 의해서 독소 단백질이 생산될 때 보툴리눔 독소 단백질은 보툴리눔 독소 단백질의 작용을 보조 및 보호하는 여러가지 헤마글루티닌(Hemagglutinin) 단백질 및 비헤마글루티닌 단백질과 다양한 복합체를 형성하여 생산된다. 자연적으로 형성하는 복합체화 단백질을 함유하는 보툴리눔 독소 세로타입 A는 대략 900kDa, 500kDa, 또는 300kDa의 분자량을 가진 복합체 형태이고, 세로타입 B와 C는 대략 500kDa의 분자량을 가진 복합체 형태이고, 세로타입 D는 대략 300kDa, 또는 500kDa의 분자량을 가진 복합체 형태이며, 세로타입 E와 F는 대략 300kDa의 분자량을 가진 복합체 형태이다.
또한 in vitro 연구에서, 보툴리눔 독소가 뇌간 조직의 일차 세포 배양물로부터 아세틸콜린 및 노르에피네프린의 칼륨 양이온 유도 방출을 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 보툴리눔 독소는 척수 뉴런의 일차 배양물에서 글리신 및 글루타메이트의 유발 방출을 억제하며, 뇌 시냅토솜 표본에서 신경전달물질 아세틸콜린, 도파민, 노르에피네프린, CGRP, 물질 P(Substance P) 및 글루타메이트 각각의 방출을 억제하는 것으로 보고되었다. 따라서, 적당한 농도로 사용하는 경우, 보툴리눔 독소에 의해서 대부분의 신경전달물질의 자극-유발 방출이 억제된다.
보툴리눔 독소 타입 A는 발효조에서 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물을 만들어 배양한 다음, 발효 혼합물을 공지의 방법으로 수확 및 정제하여 얻을 수 있다. 처음에는 모든 보툴리눔 독소 세로타입이, 프로테아제에 의해 절단 또는 닉킹되어(nicked) 신경활성화되어야만 하는, 비활성 단일 사슬 단백질로서 합성된다. 보툴리눔 독소 세로타입 A 및 G를 생성하는 박테리아 균주는 내재성 프로테아제를 지니며, 따라서 세로타입 A 및 G는 박테리아 배양물로부터 주로 활성형으로서 회수될 수 있다. 이와 대조적으로, 보툴리눔 독소 세로타입 C1, D 및 E는 비단백분해성 균주에 의해 합성되므로, 배양물에서 회수될 때 전형적으로 비활성화된 상태이다. 세로타입 B 및 F는 단백분해성 및 비단백분해성 균주 모두에 의해서 생성되므로, 활성 또는 비활성 형으로 회수될 수 있다. 그러나, 예를 들어, 보툴리눔 독소 타입 B 세로타입을 생성하는 단백분해성 균주는 생성된 독소의 일부만을 절단한다. 닉킹되지 않은 분자에 대한 닉킹된 분자의 정확한 비율은 배양시간 및 배양물의 온도에 따라 다르다. 그러므로, 이미 알려진 바와 같이, 보툴리눔 독소 타입 A에 비해 보툴리눔 독소 타입 B는 효력이 상당히 낮기 때문에, 예를 들어, 소정 백분율의 어떤 표본의 보툴리눔 독소 타입 B 독소도 비활성일 것이다. 임상 표본에서 비활성 보툴리눔 독소 분자의 존재는 표본의 총체적인 단백질 부하에 기여할 것이며, 이는 임상적인 효과에는 기여하지 않으면서 항원성의 증가와 연관된다. 또한, 동일한 투여량 레벨에서 보툴리눔 독소 타입 B는 보툴리눔 독소 타입 A에 비하여, 근육 주사시, 활성의 지속시간이 더 짧고 또한 효력이 떨어지는 것으로 알려져 있다.
클로스트리디움 보툴리눔의 홀 A 종(Hall A strain)으로부터 ≥3 X 107U/mg이고, A260/A278이 0.60 이하이고, 겔 전기영동에서 독특한 밴드 패턴을 보이는 특징을 가지는, 질 높은 결정형 보툴리눔 독소 타입 A를 얻을 수 있다. 공지의 산츠 프로세스(Shantz process)를 결정형 보툴리눔 독소 타입 A를 얻는데 사용할 수 있다. 일반적으로, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 적절한 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A를 배양한 혐기성 발효물로부터 분리 및 정제될 수 있다. 이러한 공지의 프로세스는 또한, 예를 들어: 분자량이 약 150kDa이고, 특이적인 효력이 1-2 X 108 LD50 U/mg 이상인 보툴리눔 독소 타입 A를 정제하거나; 분자량이 약 156kDa이고, 특이적인 효력이 1-2 X 108 LD50 U/mg 이상인 보툴리눔 독소 타입 B를 정제하거나; 분자량이 약 155kDa이고, 특이적인 효력이 1-2 X 107 LD50 U/mg 이상인 보툴리눔 독소 타입 F를 정제하는 등의, 비독소 단백질들로부터 순수한 보툴리눔 독소들을 분리하여 얻는데 사용할 수 있다.
보툴리눔 독소 및/또는 보툴리눔 독소 복합체를 당업계에 공지된 화합물 제조업체로부터 상업적으로도 입수할 수 있으며, 순수한 보툴리눔 독소를 또한 약제학적 조성물을 제조하는 데 사용할 수 있다.
일반적으로 효소에서 그렇듯이, 보툴리눔 독소들(이들은 세포내 펩티다아제임)의 생물학적 활성은, 적어도 일부분, 그들의 3차원적 구조에 따라 달라진다. 그러므로, 보툴리눔 독소 타입 A는 열, 다양한 화학물질, 표면 긁힘 및 표면 건조에 의해서 독성이 제거될 수 있다. 또한, 공지의 배양, 발효 및 정제에 의해 얻어진 독소 복합체를 아주 낮은 독소 농도로 희석하여 약제학적 조성물 제제에 사용하는 경우, 적합한 안정화제가 없으면, 독소의 독성이 빠르게 제거된다는 것이 공지되어 있다. 대량으로 희석하면 특이적 독성이 빠르게 손실되기 때문에, 수 밀리그램 양의 독소를 밀리리터당 수 나노그램을 함유하는 용액으로 희석하는 것은 상당히 어렵다. 독소를 함유하는 약제학적 조성물을 제조한 후, 수개월 또는 수년동안 사용할 수 있기 때문에, 독소는 적합한 안정화제 또는 안정화 버퍼를 사용하여 안정화하여야만 한다.
하기와 같이, 임상 세팅에서 보툴리눔 독소 타입 A를 사용하는 것이 보고되었다:
생체 내에서 일회성으로 투여된 보툴리눔 독소에서 근육내 주사의 일반적인 지속시간은 전형적으로 약 3 내지 4개월이다. 그러나 경우에 따라 A 아형은 12 개월 이상 효능을 지속할 수 있으며(European J. Neurology 6 (Supp 4): S111-S1150 : 1999), 다한증과 같은 선(gland)의 치료에 사용되는 경우, 어떤 상황에서는 27 개월 동안 지속될 수 있다.
보툴리눔 독소는 말초 부위에서 약리학적 작용을 나타낼 뿐 아니라, 중추 신경계에서도 억제 효과를 나타낼 수 있다. Weigand 등의 연구, Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1976; 292,161-165, 및 Habermann, Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1974; 281,47-56는 보툴리눔 독소가 역행 수송에 의해서 척수 영역으로 거슬러 올라갈 수 있다는 것을 보여준다. 이와 같이, 말초 부위에 예를 들어, 근육내로 투여된 보툴리눔 독소는, 척수로 역행 수송될 수 있다.
보툴리눔 독소는 또한 피부, 뼈 및 건의 상처(미국 특허 6,447,787호 참조), 동통(미국 특허 6,113,915 참조), 다한증을 포함하는 다양한 자율신경계 신경 기능장애(미국 특허 5,766,605호 및 Goldman(2000), Aesthetic Plastic Surgery Jul-Aug 24(4):280-282 참조), 긴장성 두통(미국 특허 6,458,365호 참조), 편두통 통증(미국 특허 5,714,468호 참조), 수술-후 통증 및 내장 통증(미국 특허 6,464,986호 참조), 모발 성장 및 모발 유지(미국 특허 6,299.893호 참조), 건선 및 피부염(미국 특허 5,670,484호 참조), 손상된 근육(미국 특허 6,423,319호 참조), 다양한 암(미국 특허 6,139,845호 및 6,063,768 참조), 평활근 장애(미국 특허 5,437,291호 참조), 신경 포착 증후군(미국 특허출원 2003 0224019 참조), 좌창(WO 03/011333 참조), 신경성 염증(미국 특허 6,063,768호 참조), 안과질환(미국 특허 6,265,379 참조), 췌장질환(미국특허 6,143,306 및 6,261,572 참조); 전립선 비대증, 전립선 암 및 요실금을 포함하는 전립선 질환(미국 특허 6,365,164 및 6,667,041 및 Doggweiler R., et al Botulinum toxin type A causes diffuse and highly selective atrophy of rat prostate, Neurourol Urodyn 1998;17(4):363 참조); 섬유조직염(미국 특허 6,623,742호), 이상근 증후군(Childers et al. (2002), American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation, 81:751-759 참조)을 치료하기 위하여 제안되었거나 시도되었다.
미국 특허 제 5,989,545호에는 특정 표적 잔기에 화학적으로 컨쥬게이트되거나, 재조합적으로 융합된 변형 클로스트리디움 신경독 또는 이의 단편, 바람직하게는 보툴리눔 독소를, 척수에 투여하여, 통증을 처치하는 데 사용될 수 있음이 개시되어 있다. 또한, 다양한 질환을 처치하는 데 있어서 표적화된 보툴리눔 독소(즉, 비-천연 결합 잔기를 가짐)가 사용될 수 있다는 것이 개시되어 있다(WO 96/33273; WO 99/17806; WO 98/07864; WO 00/57897; WO 01/21213; WO 00/10598 참조).
또한 보툴리눔 독소를 흉근에 주사하여 흉근경련을 조절하는 기술도 공지되었고(Senior M., Botox and the management of pectoral spasm after subpectoral implant insertion, Plastic and Recon Surg, July 2000, 224-225 참조), 경피 보툴리눔 독소 투여(미국 특허출원 제 10/194,805호 참조)의 경우와 같이, 제어 방출 독소 임플란트(미국특허 6,306,423 및 6,312,708 참조 참조)가 공지되어 있다. 보툴리눔 독소를, 입의 씹거나 무는(biting) 근육을 약화시켜 자신이 입히는 상처 및 얻어지는 궤양을 치료하고(Payne M., et al, Botulinum toxin as a novel treatment for self mutilation in Lesch-Nyhan syndrome, Ann Neurol 2002 Sep; 52(3 Supp 1):S157 참조), 양성 담낭 손상 또는 종양을 치료하고(Blugerman G., et al., Multiple eccrine hidrocystomas: A new therapeutic option with botulinum toxin, Dermatol Surg 2003 May; 29(5):557-9 참조),치열을 치료하고(Jost W., Ten years' experience with botulinum toxin in anal fissure, Int J Colorectal Dis 2002 Sep; 17(5):298-302 참조), 및 특정 형태의 아토피성 피부염을 치료하기 위하여(Heckmann M., et al. Botulinum toxin type A injection in the treatment of Lichen simplex: An open pilot study, J Am Acad Dermatol 2002 Apr; 46(4):617-9 참조) 사용할 수 있다는 것이 알려져 있다.
추가적으로, 보툴리눔 독소는 랫드 포르말린 모델에서 유도된 염증 통증을 감소시키는 효과를 가질 수 있다(Aoki K., et al, Mechanism of the antinociceptive effect of subcutaneous Botox: Inhibition of peripheral and central nociceptive processing, Cephalalgia 2003 Sep; 23(7):649. 참조). 또한, 보툴리눔 독소 신경 저해가 상피 두께의 감소를 가져올 수 있다고 보고되어 있다(Li Y, et al., Sensory and motor denervation influences epidermal thickness in rat foot glabrous skin, Exp Neurol 1997; 147:452-462 참조). 마지막으로, 과도한 발의 발한(Katsambas A., et al., Cutaneous diseases of the foot: Unapproved treatments, Clin Dermatol 2002 Nov-Dec; 20(6):689-699; Sevim, S., et al, Botulinum toxin-A therapy for palmar and plantar hyperhidrosis, Acta Neurol Belg 2002 Dec; 102(4): 167-70 참조), 경직성 발가락(Suputtitada, A., A., Local Botulinum toxin type A injections in the treatment of spastic toes, Am J Phys Med Rehabil 2002 Oct;81(10):770-5 참조), 특발성 발가락 보행(Tacks, L., et al., Idiopathic toe walking: Treatment with botulinum toxin A injection, Dev Med Child Neurol 2002;44(Suppl 91):6 참조), 및 발 근긴장이상(Rogers J., et al., Injections of botulinum toxin A in foot dystonia, Neurology 1993 Apr;43(4 Suppl 2) 참조)을 치료하기 위하여 발에 보툴리눔 독소를 투여하는 것이 알려져 있다.
파상풍 독소(tetanus toxin)와, 이의 유도체(즉, 비-천연 표적 잔기를 가진), 단편, 하이브리드 및 키메라를 또한 치료에 사용할 수 있다. 파상풍 독소는 보툴리눔 독소와 많이 유사하다. 따라서, 파상풍 독소 및 보툴리눔 독소는 모두 가깝게 연관 된 종의 클로스트리디움(각각, 클로스트리디움 테타니 및 클로스트리디움 보툴리눔)에 의해 생성되는 폴리펩티드이다. 또한, 파상풍 독소와 보툴리눔 독소는 모두, 단일 디설파이드 결합에 의해서 중쇄(분자량 약 100kDa)에 공유 결합된 경쇄(분자량 약 50kDa)로 구성된 2중 사슬 단백질이다. 그리고, 파상풍 독소 및 각각 7가지 보툴리눔 독소(비-복합체)의 분자량은 약 150kDa이다. 또한, 파상풍 독소와 보툴리눔 독소 모두에서, 경쇄는 세포내 생물학적(프로테아제) 활성을 가지는 도메인을 포함하는 반면에, 중쇄는 수용체 결합(면역원성) 및 세포 막 전위 도메인을 포함한다.
또한, 파상풍 독소와 보툴리눔 독소는 모두, 시냅스전 콜린성 뉴런 표면의 갱글리오사이드 수용체에 대하여 크고, 특이적인 친화도를 나타낸다. 말초 콜린성 뉴런에 의한, 파상풍 독소의, 수용체 매개 엔도시토시스로 인하여, 축색돌기 역행수송, 중앙 시냅스로부터의 억제성 신경전달물질 방출 차단 및 경련성 마비가 나타난다. 이에 반하여, 말초 콜린성 뉴런에 의한, 보툴리눔 독소의 수용체 매개 엔도시토시스는 역행 수송, 중독된 말초 운동 뉴런으로부터의 아세틸콜린 엑소시토시스의 억제 및 이완성 마비를 거의 일으키지 않는다.
끝으로, 파상풍 독소 및 보툴리눔 독소는 생합성 및 분자 구성 모두에 있어 서로 닮아있다. 따라서, 파상풍 독소와 보툴리눔 독소 타입 A는 단백질 서열이 전체에 걸쳐 34% 동일하며, 몇몇 기능성 도메인에서는 서열이 62%나 동일하다(Binz T. et al., The Complete Sequence of Botulinum Neurotoxin Type A and Comparison with Other Clostridial Neurotoxins, J Biological Chemistry 265 (16); 9153-9158: 1990 참조).
본 발명의 일 구체예에서 “아세틸콜린”이란, 콜린과 아세트산의 에스테르로 처음으로 발견된 신경전달물질로, 뉴런 전체에 분포하며 화학식은 C7H16NO2, 분자량은 146.21 이다.
몇몇 신경조절물질이 동일한 뉴런에 의해 방출될 수 있는 것을 제시하는 증거가 있지만, 전형적으로 포유류 신경계에서는, 각각의 형태의 뉴런에 의해서 단일 형태의 작은 분자 신경전달물질만이 방출된다. 이 신경전달물질 아세틸콜린은 뇌의 여러 부위의 뉴런, 특히, 운동피질의 큰 피라미드 세포, 대뇌핵의 몇 가지 상이한 뉴런, 골격근에 분포하는 운동 뉴런, 자율신경계(교감신경계 및 부교감신경계 모두)의 신경절이전 뉴런, 근방추 섬유의 bag 1 섬유, 부교감신경계의 신경절이후 뉴런 및 교감신경계의 신경절이후 뉴런 몇가지에 의해서 분비된다. 본래, 대부분의 교감신경계의 신경절이후 뉴런은 신경전달물질인 노르에피네프린을 분비하는데 비하여, 땀샘, 기모근 및 몇몇 혈관으로의 신경절이후 교감신경 섬유만이 콜린성이다. 대부분의 경우, 아세틸콜린은 흥분효과를 나타낸다. 그러나, 아세틸콜린이 몇몇 말초 부교감신경 말단에서는 억제효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(예를 들어, 미주신경에 의한 심장박동의 억제).
자율신경계의 원심성 신호는 교감신경계 또는 부교감신경계를 통하여 몸에 전달된다. 교감신경계의 신경절이전 뉴런은 척수의 중간외측각에 위치하는 신경절이전 교감 뉴런 세포체로부터 뻗어 나온다. 세포체로부터 뻗어 나온 신경절이전 교감신경 섬유는, 척추주위 교감 신경절 또는 척추전 신경절에 위치하는 신경절이후 뉴런과 시냅스를 이룬다. 교감신경계 및 부교감신경계의 신경절이전 뉴런은 모두 콜린성이므로, 신경절에 아세틸콜린을 적용하면 교감 및 부교감 신경절이후 뉴런을 흥분시킬 것이다.
아세틸콜린은 두가지 형태의 수용체, 무스카린성 수용체 및 니코틴성 수용체를 활성화시킨다. 무스카린성 수용체는 부교감신경계의 신경절이후 뉴런 및 교감신경계의 신경절이후 콜린성 뉴런에 의해서 자극된 모든 효과기(effector) 세포에서 발견된다. 니코틴성 수용체는 부신 수질뿐 아니라, 교감신경계 및 부교감신경계 모두의 신경절이전과 신경절이후 뉴런 사이의 시냅스에서 신경절이후 뉴런의 세포 표면에 있는 자율신경절 내에서 발견된다. 니코틴성 수용체는 또한 많은 비자율 신경말단, 예를 들어, 신경근육 접합부의 골격근 섬유의 막에서 발견된다.
아세틸콜린은, 작고 투명한, 세포내 소포가 시냅스전 뉴런성 세포막과 융합될 때, 콜린성 뉴런으로부터 방출된다. 부신수질(또한, PC12 세포라인) 및 췌장의 섬세포과 같은, 광범위한 비-뉴런성 분비 세포는 큰 고밀도 중심 소포(large densecore vesicle)로부터 각각 카테콜아민 및 부갑상선 호르몬을 방출한다. PC12 세포라인은 교감신경부신 발달(sympathoadrenal develpoment) 연구를 위한 조직 배양 모델로서 광범위하게 사용되는 랫드 크롬친화성세포종 세포의 클론이다. 탈신경된 세포에 독소를 투과 가능하게 하거나(전기충격법 등에 의해서), 직접 주사하면, 보툴리눔 독소는 in vitro에서 두 가지 세포종류 모두에서 두 가지 화합물 종류의 방출을 모두 억제한다. 보툴리눔 독소는 또한 피질의 시냅토솜 세포 배양물로부터 신경전달물질인 글루타메이트가 방출되는 것을 억제하는 것으로 알려져 있다.
신경근육 접합부는 근육세포의 주변 축색돌기에 의해서 골격근에서 형성된다. 신경계를 통하여 전달된 신호는 말단 축색돌기에서 작용 전위가 되고, 이온 채널을 활성화하며, 그 결과로 예를 들어, 신경근육 접합부의 운동 종판에서, 뉴런내 시냅스성 소포로부터 신경전달물질인 아세틸콜린이 방출된다. 아세틸콜린은 세포외 공간을 가로질러 근육 종판 표면의 아세틸콜린 수용체 단백질과 결합한다. 일단 충분하게 결합되면, 근육 세포의 작용 전위가 특이적인 막 이온 채널 변화를 일으키고, 그 결과로 근육세포가 수축한다. 그리고 나서, 아세틸콜린은 근육세포로부터 방출되어, 세포외 공간에서 콜린에스테라아제에 의해서 대사된다. 대사생성물은 다시 아세틸콜린으로 재생하기 위해서 말단 축색돌기로 다시 회수된다.
본 발명의 일 구체예에서 “안정화제(stabilizer)”란, 활성성분의 안정성을 증가시키고, 활성성분이 임의로 변화되어 산화되거나, 결정화되거나, 유연물질로 변성되는 것을 방지하기 위하여 첨가되는 임의의 첨가제를 의미하며, 약학적으로 허용 가능한 것이라면 크게 제한되지 않는다. 안정화제의 안정화 효능에 대한 평가는 온도를 한정하지 않고 수행될 수 있으나, 통상적으로 고온에서보다 저온에서 안정화 효과가 장기적으로 유지되는 것으로 이해된다. 따라서, 저온에서 장기간 안정화 효능을 평가하는 것을 고온에서 단시간 수행하는 “가속화 실험”으로 대체할 수 있다. 예를 들어, 특정 안정화제의 안정화 효과를 37℃에서 9일간 평가한 결과는 4℃에서 3개월간 평가한 결과가 같고, 37℃에서 74일간 평가한 결과는 4℃에서 24개월간 평가한 결과가 같은 것으로 이해될 수 있다(http://iso-inc.com/medical-package-testing/accelerated-aging.html).
본 발명에 있어서 안정화제는 보툴리눔 독소를 포함하는 클로스트리디움계 신경독 단백질의 생물학적 활성을 보존 또는 유지하기 위해 첨가되는 것이고, 바람직하게는 아르기닌, 메티오닌, 아스파르트산, 글루타민산, 글루코노락톤, 주석산, 및/또는 차아황산나트륨이고, 더욱 바람직하게는 아르기닌, 아스파르트산, 및/또는 글루타민산이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서 “안정화 완충액” 또는 “안정화 완충화제”란, 안정화제로서의 효과와 완충액으로서의 효과를 동시에 가지는 것으로서, 일반적인 완충액에 안정화 효과를 갖는 물질을 추가하여 제조 가능하고, 안정화 완충액에 추가적인 안정화제를 포함하여 안정화 시너지 효과(synergic effect)를 기대할 수 있다. 본 발명에 있어서 안정화 완충액은 글루코노락톤 완충액, 및/또는 주석산 완충액이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서 “아르기닌(arginine)”이란, 염기성 아미노산의 일종으로 분자식은 C6H14N4O2으로 표시되고, 분자량 174.21이며, 수용성이며, 잔기의 약어는 ‘Arg’이며, 더욱 간략화할 때는 ‘R’로 표현한다. 특히 어류에서 백자의 단백질 크루페인 등에 다량으로 함유되어 있다. M.J.S. 슐체와 E. 스타이거에 의해서 백화시킨 루피누스(콩의 하나)의 싹튼 것으로부터 단리되었다. 그 질산염이 은(argent)처럼 흰색을 띠어 아르기닌이라고 이름을 붙였다. L-아르기닌은 단백질을 구성하는 아미노산의 하나로 존재하는데, 어류의 정자에 존재하는 단백질 프로타민에 속한다. 청어·연어 등에서는 구성 아미노산의 약 70%가 아르기닌이다. 식물 종자 속에는 유리상태로도 존재한다. 아르기닌 잔기(殘基)는 그 구아니디노기(基)로 인해 강염기성을 나타낸다. 알칼리성으로 α-나프톨과 하이포아염소산을 작용시키면 특유한 빨간색을 나타내므로 정량할 수 있다. 생체 내의 대사 경로로서는 H. A. 크렙스 등이 발견한 오르니틴 회로(尿素回路)의 구성 성분이며, 아르기나아제의 작용에 의하여 요소와 오르니틴으로 분해된다. 시트룰린과 이스파라긴산으로부터 생성된다. 성인에게는 비필수 아미노산이지만 유아에게는 필수 아미노산이다. 암모니아나 대량의 아미노산의 독작용(毒作用)에 대하여 보호하는 작용이 있다. 뇌에는 아르기나아제가 존재하며, γ-구아니디노부티르산의 전구체인 아르기닌의 양을 조절하고 있다. 무척추 동물에서는 아르기닌인산의 형태로 포스파겐으로서 근육의 수축에 중요한 역할을 하는 것 외에 특이한 구아니딘염기(마그마틴·옥토핀)의 전구체로서 널리 존재한다.
본 발명의 일 구체예에서 “글루타민산(Glutamic acid)”이란, 아미노산의 일종으로 “글루탐산”이라고도 명명되고, 잔기 약호 “Glu”, 또는 “E”로 표시되며, 분자식은 C5H9NO4이다. 밀의 글루텐의 가수 분해물에서 처음 발견되었는데 단백질 구성 아미노산으로서는 가장 널리 다량으로 존재하는 것의 하나로, 특히 밀의 글리아진에서는 43.7%의 함량으로 함유되어 있고, 밀, 대두 등의 단백질의 가수 분해물에 염화수소를 포화해서 염산염으로 분리 가능하다.
본 발명의 일 구체예에서 “아스파르트산(Aspartic acid)”이란, 아미노산의 일종으로 “아스팜산”이라고도 명명되고, 잔기 약호 “Asp”, 또는 “D”로로 표시되며, 분자식은 C4H7NO4이다. 단백질을 구성하는 아미노산의 하나로, 분자 내에 2개의 카르복시기(-COOH)를 갖는 산성 아미노산이고, 영양적으로는 비필수아미노산으로 분류된다. 글루타민과 같이 생체내 아미노기 전이반응에서 중심적 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “글루코노락톤(Gluconolactone)”이란, 백색의 결정 또는 결정성 분말로서 냄새가 없거나 약간의 냄새를 가지고 있으며, 처음에는 단맛을 나타내나 나중에 약간 신맛을 나타낸다. 화학식은 C6H10O6이다. 합성팽창제로서 물에 잘 녹고 에탄올에 약간 녹으나, 에테르에는 녹지 않는다. 수용액은 서서히 가수분해되어 글루콘산(Gluconic acid)과 δ-락톤 및 γ-락톤의 평형상태가 되며, 온도나 pH가 높을수록 가수분해가 빨리 일어난다. 25℃의 실온에서 약 2시간이 지나면 완전히 가수분해되어 글루콘산 55-60%, 락톤 40-50%의 용액으로 변한다. 비록 글루코노-δ-락톤이 산은 아니지만 물에 용해되면 가수분해되어 산성을 나타내므로 팽창제용 산도조절제로 사용하는 것이 좋으며, 탄산수소나트륨(중조)과 배합하여도 서로 반응이 일어나지 않는다. 또한 서서히 가수분해가 일어나므로 팽창제용 산도조절제로 사용하면 탄산수소나트륨과도 서서히 반응하여 아주 미세한 조직감을 가진 제품을 만들 수 있다. 또한 금속과 착염을 형성하기 때문에 항산화능이 있으며, 비록 산은 아니지만 가열에 의해 수용액이 산성을 나타내므로 연제품의 pH를 낮추는데 사용된다.
본 발명의 일 구체예에서 “주석산(Tartaric Acid)”란, 주석에 탄산칼슘을 넣어 생성되는 침전물에 황산을 처리하여 얻는 유기화합물로, 포도주를 만들 때 침전하는 주석에 함유되어 있어 주석산이라고도 하며, 다이옥시석신산이라고도 한다. 화학식 C4H6O6으로 표시된다. 우회전성인 L-타타르산, 좌회전성인 D-타타르산 및 이들의 등량혼합물인 라세미체의 타타르산(포도산이라고도 한다) 외에, 광학활성을 갖지 않는 m-타타르산의 여러 이성질체가 있다. 천연으로 존재할 때는 L－타타르산이 주가 되며, 유리상태의 산·칼슘염 및 칼륨염으로서 식물계에 널리 분포한다.
본 발명의 일 구체예에서 “약학조성물”이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학조성물은 안정화제로써 아르기닌, 글루타민산, 또는 아스파르트산을 포함하는 보툴리눔 독소 조성물이며, 이에 관여하는 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기의 "약학적 허용될 가능한" 담체 또는 부형제는 정부의 규제부에 의해 승인된 것이나, 또는 척추 동물, 그리고 보다 특별하게는 인간에게 사용을 위한 정부 또는 기타 일반적으로 승인된 약전에서 리스트된 것을 의미한다.
비경구적인 투여를 위해 본 발명의 약학조성물은 유성 또는 수성 담체에 있는 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태로 될 수 있고, 고체 또는 반고체의 형태로 제조될 수 있으나, 가장 바람직하게는 액상 형태일 수 있다. 상기 약학조성물은 제조 및 저장의 조건 하에서 안정할 수 있고, 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 약학조성물은 사용 전에 적절한 담체와 재구성을 위해 멸균 분말 형태일 수 있다. 약학조성물은 단위-복용량 형태로, 마이크로니들 패치에, 앰플에, 또는 기타 단위-복용량 용기에, 또는 다-복용량 용기에 존재할 수 있다. 대안적으로, 약학적 조성물은 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 사용 바로 전에 주사용 물의 부가함을 요하는 동결-건조된(냉동건조) 상태로 보관될 수 있다. 즉시 주사용액 및 현탁액은 멸균 분말, 그래뉼 또는 타블렛으로 제조될 수 있다.
몇몇 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 액체로 제형화되어 질 수 있고, 또는 액체 속에 미립구의 형태로 포함될 수 있다. 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물, 또는 이들의 약학적으로 허용될 수 있는 화합물 및/또는 혼합물을 0.001 내지 100,000 U/kg 사이의 농도로 포함할 수 있다. 또한 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 현탁제, 보존제, 용해제 및/또는 분산제와 같은 제형화제, 염료, 완충제, 항균제, 항진균제, 등장화제(예를 들어, 설탕 또는 염화나트륨), 추가적인 안정화제를 포함할 수 있고, 여기서의 “추가적인 안정화제”란 본 발명의 안정화제(아르기닌, 글루타민산, 또는 아스파르트산) 이외에 추가적으로 포함되는 안정화제로서, 당 업계에서 일반적으로 공지된 것이라면 제한 없이 이용 가능하다.
또한 본 발명의 약학조성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 약학적으로 허용될 수 있는 담체의 비-제한적인 예는 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 오일, 및 이들의 적절한 혼합물을 포함한다. 본 발명의 약학조성물은 멸균 가능하고, 본 발명의 약학조성물에 적용되는 멸균 기술의 비-제한적인 예는 세균-억제 필터를 통한 여과, 터미날 멸균화, 멸균 제제의 합체, 방사선 조사, 멸균 가스 조사, 가열, 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서 “투여”란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 본 발명의 약학조성물의 경우, 액상 제형의 형태로 근육 내 주사 투여가 가장 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 치료 방법은 상기 약학조성물을 약제학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 신경독소 및 안정화제를 포함하는 약학제형을 제공하고, 상기 신경독소는 보툴리눔 독소, 파상풍 독소, 콜레라 독소, 및 백일해 독소로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 약학제형을 제공하며, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A인 것을 특징으로 하는 약학제형을 제공하며, 상기 보툴리눔 독소는 복합체화 단백질을 함유하지 않는 형태 또는 복합체화 단백질을 함유하는 복합체 형태인 것을 특징으로 하는 약학제형을 제공하며, 상기 안정화제는 아르기닌, 글루타민산, 및 아스파르트산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 약학제형을 제공하며, 상기 안정화제는 보툴리눔 독소 100 유닛당 0.01 내지 1,000 mM로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학제형을 제공하며, 상기 약학제형의 pH는 5.5 내지 7.0인 것을 특징으로 하는 약학제형을 제공하며, 상기 약학제형은 안정화 완충액을 추가로 포함하는 약학제형을 제공하며, 상기 안정화 완충액은 글루코노락톤 완충액, 또는 주석산 완충액인 약학제형을 제공하며, 상기 약학제형은 국소마취제를 추가로 포함하는 약학제형을 제공하며, 상기 국소마취제는 리도카인인 약학제형을 제공하며, 상기 국소마취제는 전체 조성물에 대하여 0.1 내지 1 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학제형을 제공하며, 상기 약학제형은 폴리솔베이트를 추가로 포함하는 약학제형을 제공하며, 상기 약학제형은 액상인 약학제형을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서, (a) 신경독소를 정제하는 단계; 및 (b) 상기 신경독소에 안정화제를 첨가하는 단계;를 포함하는 약학제형의 제조방법을 제공하고, 상기 신경독소는 보툴리눔 독소 타입 A인 약학제형의 제조방법을 제공하며, 상기 안정화제는 아르기닌, 글루타민산, 및 아스파르트산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 약학제형의 제조방법을 제공하며, 상기 약학제형은 액상인 약학제형의 제조방법을 제공한다.
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
보툴리눔 독소는 신경 기능을 가지는 동물에 있어서 신경근육종말의 콜린성 전시냅스에서 아세틸콜린의 엑소시토시스를 저해하여 전신 무력증을 일으킨다. 보툴리눔 독소는 신경 독성 기능은 다양한 질병에서의 치료 효과가 크지만 독성이 강하여 극소량으로도 치명적이므로, 생체를 대상으로 한 이용 시 농도의 미세한 조절이 필수적이다. 그러나 현재의 보툴리눔 독소 약학조성물은 단백질 변성의 문제로 동결건조제제로 제조 및 유통하여 임상에서 사용 직전에 사용자가 액상 용매에 희석하므로, 희석 배율 착오 또는 희석 용매의 오염 등 인적 오류로 인한 의료 사고의 위험성이 높은 문제점이 있었다. 본 발명은 안정화제로서 아르기닌, 글루타민산, 또는 아스파르트산을 포함하는 보툴리눔 독소 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 액상 제형으로 유통시에도 보툴리눔 독소 안정화의 현저한 효과를 입증하였으므로, 보툴리눔 독소의 안전하고 편리한 의학적 이용에 크게 활용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 보툴리눔 독소에 아르기닌 또는 메티오닌을 첨가 하고 28일 내지 56일간 배양한 후의 잔존 역가를 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 아르기닌 또는 메티오닌을 첨가한 보툴리눔 독소조성물을 pH6.0 내지 pH7.0 조건에서 56일간 배양한 후의 잔존 역가를 측정한 결과이다. 상세하게, 도 2a는 pH 6.0, 도 2b는 pH 6.5, 도 2c는 pH 7.0의 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 다양한 항산화제를 포함한 보툴리눔 독소 조성물을 28일간 배양한 후의 잔존 역가를 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 다양한 완충용액제를 포함한 보툴리눔 독소 조성물을 28일간 배양한 후의 잔존 역가를 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 보툴리눔 독소 역가 측정용 DESCR assay의 단계별 모식도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 액상 보툴리눔 제형을 안정화 시키는 아르기닌과 메티오닌의 효능을 비교한 결과이다. 상세하게, 도 6a는 국소마취제가 포함되지 않은 경우에, 도 6b는 국소마취제(리도카인 0.3%)가 포함된 경우의 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 액상 제형 용기 재질이 BoNT/A 효능 안정화에 미치는 영향을 평가한 결과이다. 상세하게, 도 7a는 국소마취제가 포함되지 않은 경우에, 도 7b는 국소마취제(리도카인 0.3%)가 포함된 경우의 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 완충화제로서 주석산, 또는 글루코노락톤이 함유된 제형에서 아르기닌의 안정화 효능을 유리 용기를 사용해 비교한 결과이다. 상세하게, 도 8a는 국소마취제가 포함되지 않은 경우에, 도 8b는 국소마취제(리도카인 0.3%)가 포함된 경우의 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, 주석산 또는 글루코노락톤 완충화제에 글루타민산이 추가로 포함된 경우에 안정화제로서 아르기닌의 효능에 미치는 영향을 평가한 결과이다. 상세하게, 도 9a는 국소마취제가 포함되지 않은 경우에, 도 9b는 국소마취제(리도카인 0.3%)가 포함된 경우의 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, 글루코노락톤이 완충화제로 조성된 제형에서 아르기닌의 안정화 효능에 기여하는 글루타민산의 최적 농도를 평가한 결과이다. 상세하게, 도 10a는 국소마취제가 포함되지 않은 경우에, 도 10b는 국소마취제(리도카인 0.3%)가 포함된 경우의 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, 아스파르트산이 아르기닌의 BoNT/A 안정화 효능에 미치는 영향을 평가한 결과이다. 상세하게, 도 11a는 국소마취제가 포함되지 않은 경우에, 도 11b는 국소마취제(리도카인 0.3%)가 포함된 경우의 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, 신규 조성의 액상 제형으로 제조된 BoNT/A 제품에 아르기닌, 또는 메티오닌 첨가 시 안정성을 비교한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
본 발명의 실시예에서 사용된 안정화 효능의 후보 첨가물질 및 기본 완충 용액과 기타 첨가제의 시약 출처는 하기(*)에 표기하였다.
* 글루코노 델타락톤(Gluconolactone, Sigma G2164); 주석산(L(+)-tartaric acid, Merck 100804); 리도카인(lidocaine hydrochloride monohydrate, Sigma L5647); 옥탄산(octanoic acid, Sigma C2875); 메티오닌(L-methionine, Merck K45023607 414); 아르기닌(L-arginine, Merck K45895542 534); 글라이신(glycine, Bioshop GLN001-1); 글루타민산(L-Glutamic acid, Merck 100291); 아스파르트산(aspartic acid, Merck K45895542 534); 말레산(maleic acid, Merck S6858580 534); 부틸 히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, Sigma SLBM1210V); 갈산프로필(propyl gallate, Sigma P3130); 아황산수소나트륨(sodium bisulfite, Sigma MKBR6468V); 티오글리콜레이트(thioglycolic acid, Sigma T3758); 시스테인(L-cystein hydrochloride, K46446495 513); 호박산(succinic acid, Merck K46618782 533); 인산수소나트륨(sodium phosphate monobasic, Sigma S5011); 인산 나트륨(sodium phosphate dibasic, Sigma S7907); 염화나트륨(sodium chloride, Merck K47013904 548); 폴리솔베이트(polysorbate, Sigma P7949); 디티오트레이톨(DL-dithiothreitol, Sigma D0632).
본 발명의 실시예에서 사용된 약어, 및 버퍼의 조성은 하기(**)에 표기하였다.
** 메티오닌(Met, 또는 M), 아르기닌(Arg, 또는 R), 글루타민산(Glu, 또는 E), 아스파르트산(Asp, 또는 D), Buffer P(10 mM NaPO4, pH 6.0, 45 mM NaCl, 0.05% polysorbate), Buffer G(10 mM gluconolactone, pH 6.0, 45 mM NaCl, and 0.05% polysorbate), Buffer R(buffer G supplemented with 50 mM arginine).
실시예 1. BoTest를 이용한 보툴리눔 독소의 안정화제 개발
실시예 1-1. 실험의 준비
본 발명에서의 보툴리눔 독소는 ㈜휴젤(대한민국)에서 생산한 것으로, 농도 0.1mg/ml, 역가 1,529units/㎕(BoTest 기준)으로 맞추어 사용하였다. 안정화효능을 갖는 첨가제 검출을 위한 모든 실험에는 보툴리눔 독소를 ㈜휴젤에서 추천하는 조성(50mM NaPO4, pH7.0, 1mM DTT, 0.05 중량% 폴리솔베이트, 및 20 중량% 글리세롤)의 “단백질 희석 완충액”으로 50units/㎕로 희석하여 사용하였다.
안정화 효능 첨가제 후보물질 검출을 위한 각 실험군(100ul)은 200units 보툴리눔 독소와 안정화제 후보 첨가제를 “안정화 조성액(10mM NaPO4(pH5.5-7.0), 0.01 중량% 폴리솔베이트, 130mM NaCl)”에 희석하여 제조하였다. 이후, 각 실험군을 37℃에서 1주 내지 11주 배양하고, 그 일부(25%)를 잔존역가 측정에 사용하였다. 보툴리눔 독소의 역가는 BoTest(BoTest® Botulinum Neurotoxin Detection Kits, BioSentinel, 미국)을 이용하여 측정하였다. 이를 위해, 5mM HEPES-NaOH(pH 7.1), 0.1 중량% 폴리솔베이트, 10uM ZnCl2(Sigma 229997), 0.2uM BoTest A/E reporter, 및 안정화 실험군 25㎕를 혼합하여 최종 반응액(100㎕)을 제조하고, 상기 반응액을 37℃에서 21시간 배양하여 Synergy Neo2(Synergy Neo2 Multi-Mode Reader, BioTek, 미국) 장비로 CFP/FRET 비율값을 측정하고, 이를 표준 곡선에 대입하여 보툴리눔 독소의 잔존 역가를 추정하였다.
또한 본 발명의 보툴리눔 독소의 안정화 연구에 사용된 모든 시료들은 3차 증류수에 용해하고, 염산(hydrochloric acid)과 수산화나트륨(sodium hydroxide)으로 pH를 pH5.5 내지 pH7.0 범위로 조절하여 사용하였다.
실시예 1-2. pH 변화에 따른 아르기닌과 메티오닌의 안정화 효능 비교
pH 5.5 내지 7.0의 범위에서 아르기닌과 메티오닌을 안정화제로 사용시에 보툴리눔 독소의안정화 효능을 비교 검증하였다.
이를 위하여 실시예 1에 기재된 안정화 조성액에 보툴리눔 독소를 첨가하고 50mM의 아르기닌 또는 메티오닌을 추가로 첨가하였다. 이를 37℃에서 28일 내지 56일간 배양한 후 잔존 역가를 측정하였다. 그 결과를 표 1 및 도 1에 나타내었다.
　 　 0일 28일 56일
pH5.5 아르기닌 50mM 100 34.2 27.5
메티오닌 50mM 100 1.22 9.01
음성 대조군 100 0.97 -0.34
pH6.0 아르기닌 50mM 100 28.2 32.6
메티오닌 50mM 100 7.5 -0.66
음성 대조군 100 8.38 -0.63
pH6.5 아르기닌 50mM 100 23.6 16.2
메티오닌 50mM 100 13.6 8.78
음성 대조군 100 -1.06 -0.8
pH7.0 아르기닌 50mM 100 19.6 1.72
메티오닌 50mM 100 1.63 -0.94
음성 대조군 100 -0.83 0.11
실험 결과, 안정화 후보 물질이 첨가되지 않은 음성대조군은 여러 pH의 조건에서 모두 보툴리눔 독소가 불안정한 경향을 보여 28일 이후에는 잔존 역가가 거의 검출되지 않았다. 안정화제로 메티오닌이 첨가된 실험군에서는 pH 5.5 내지 7.0의 범위에서 보툴리눔 독소가 최대 약 10%의 잔존 역가를 나타내었고, 이에 반해 아르기닌이 첨가된 실험군에서는 최대 약 30%의 잔존 역가가 측정되었다. 또한, pH 6.5 내지 7.0 보다 pH가 5.5 내지 6.0 범위에서 아르기닌이 보툴리눔 독소의 안정화에 높은 효능을 보이는 것으로 측정되었다.
실시예 1-3. 아르기닌과 메티오닌의 안정화 효능 비교 검증
보툴리눔 독소의 안정화제로서 아르기닌과 메티오닌의 효능을 재검증하기 위해 아르기닌(50mM) 또는 메티오닌(50mM)이 안정화 첨가제로 함유된 보툴리눔 독소 조성물을 56일간 배양하고, 잔존 역가를 측정한 3번의 독립적 실험결과들을 통계 처리하여 각각의 효능을 비교 검증하였다. 대조군으로는 어느 첨가제도 포함하지 않는 시료를 사용하였다. 상기 세 실험군간의 유의성을 확인하는 방법으로는 One-way ANOVA 방법을 이용하였다. 유의 확률이 0.05 이하이면 세 실험군간 유의적인 차이가 있다고 판단하여 LSD (Least Significant Difference) 방법으로 사후 검정을 진행하였다. 상기 결과를 표 2 및 도 2에 나타내었다.
　 　 37℃ 안정화
　 pH 0일 14일 28일 56일
아르기닌 50mM 6.0 100 90.1±5.5 71.6±7.5** 69.1±14**
6.5 100 71.9±2.1* 70.6±9.6** 38.4±8.2**
7.0 100 70.1±9** 55.8±8.2*** 16.9±6.8*
메티오닌 50mM 6.0 100 57.6±12 27.2±8.3 22.6±8.5
6.5 100 55±4.4 36.7±3.3 11.1±3.8
7.0 100 40.2±2.7 17.1±4.3 0.35±1.4
음성대조군 6.0 100 47±14 21.7±5.6 -1.22±0.2
6.5 100 29.1±7.5 17.3±6.9 -1.27±0.3
7.0 100 5.16±4.8 3.37±2.7 1.37±0.6
상기의 결과는 아르기닌과 메티오닌 모두 pH6.0에서 가장 높은 안정화 효능을 보이는 것으로, 앞선 실험의 결과와 일치한다. 그러나 동일한 pH 조건에서는 모든 실험군에서 아르기닌이 메티오닌보다 높은 안정화 효능을 보이는 것으로 나타났다. 예를 들면, 안정화제가 첨가되지 않은 대조군은 56일 배양 후 모든 조건에서 보툴리눔 독소의 역가가 측정되지 않았지만, 메티오닌이 첨가된 실험군은 pH6.0에서 22.6%의 잔존 역가가 측정되었고, 아르기닌이 첨가된 실험군은 같은 조건에서 69.1%의 잔존 역가가 측정되었다.
아르기닌과 메티오닌의 상대적 안정화 효능을 One-way ANOVA 방법을 이용하여 유의성을 확인한 결과, pH6.0 조건에서는 14일 배양한 실험군을 제외한 모든 실험군에서 안정화 효능 수치가 유의성이 있는 것으로 나타났다. 이를 LSD (Least Significant Difference) 방법으로 사후 검정을 진행한 결과 p<0.05 내지 p<0.001의 수준에서 아르기닌의 안정화 효능이 메티오닌보다 현저하게 우수함을 확인하였다. 예를 들면 pH7.0 조건에서 28일 배양 후 비교한 측정값은 메티오닌 첨가 실험군이 17.1%, 아르기닌 첨가 실험군이 55.8%로 p<0.001의 유의 수준에서 안정화 효능에 차이가 있었고, pH6.0 조건에서 56일 배양 후 비교한 측정값은 메티오닌 첨가 실험군이 22.6%, 아르기닌 첨가 실험군이 69.1%로 p<0.01의 유의 수준에서 안정화 효능에 차이가 있었다.
보툴리눔 독소에 메티오닌 또는 아르기닌이 첨가되는 경우에, 폴리솔베이트의 계면활성화 성질이 아르기닌 또는 메티오닌의 안정화 효능에 미치는 영향도 조사하였다. 이를 위하여 0 내지 0.05 중량%의 폴리솔베이트가가 함유된 안정화 조성액에 보툴리눔 독소 및 50Mm의 아르기닌 또는 메티오닌을 첨가하고, 37℃에서 28일 내지 56일간 배양한 후 잔존 역가를 측정하였다. 실험 결과, 메티오닌이 첨가된 경우, pH가 5.5 내지 6.0인 범위에서는 폴리솔베이트 농도에 비례하게 안정화 효능이 증가되는 양상이 보였고, pH 6.5 내지 7.0 범위에서는 전반적으로 폴리솔베이트의 영향이 나타나지 않았다. 아르기닌이 첨가된 실험군에서는 pH 5.5 내지 6.5 범위에서 폴리솔베이트 첨가에 따라 미미하게 안정화 효능에 기여하는 경향을 보였지만, 그 영향은 그리 큰 수준이 아니었다. 이 결과는 아르기닌이 안정화제로 첨가된 보툴리눔 독소의 액상제형에서는 폴리솔베이트의 첨가가 필수적이지 않음을 시사한다.
실시예 1-4. 보툴리눔 독소 액상 제형을 위한 새로운 안정화제 개발
상기 실시예 1-2와 1-3의 결과는 보툴리눔 독소의 액상 제형에 있어서 아르기닌이 메티오닌보다 뛰어난 안정화 효능을 가지고 있음을 보여준다. 그러나 아르기닌과 유사한 효능을 보이는 새로운 첨가제의 검출은 다양한 제품 개발을 가능하게 하므로, 이를 위해서 본 발명자들은 하기 표 3에 기재한 안정화 후보제의 보툴리눔 독소 안정화 효능을 비교 조사하였다. 그 결과를 도 3과 도 4에 나타내었다.
보툴리눔 독소의 안정화 후보제　 안정화 효능
아르기닌(Arginine) +++
글루코노락톤(Glucono-delta-lactone) ++
글라이신(Glycine) -
주석산(tartaric acid) ++
아황산수소나트륨(Sodium bisulfite) -
시스테인(Cysteine) -
갈산프로필(Propyl gallate) -
차아황산나트륨(Sodium hydrosulfite) +
티오글리콜레이트(Thioglycolate) -
도 3은 상기 표 3의 아황산수소나트륨(Sodium bisulfite), 갈산프로필(Propyl gallate), 티오글리콜레이트(Thioglycolate), 항산화제들이 포함된 보툴리눔 독소 조성물을 28일 배양 후 보툴리눔 독소의 잔존 역가를 측정한 결과이다. 실험 결과, 검증에 사용한 모든 항산화 첨가제들이 대조군인 메티오닌에 비하여 낮은 안정화 효능을 보이는 것으로 나타났다. 반면, 도 4는 완충용액제의 경우, 글루코노락톤은 pH6.5에서 유의한 수준의 안정화 효과를 나타내었고, 주석산은 pH5.5 내지 6.5의 범위에서 안정화 효과를 나타내었다. 상기 결과는 현저한 효과를 갖는 새로운 첨가제의 개발 가능성을 시사한다.
실시예 2. DESCR을 이용한 보툴리눔 독소의 안정화제 개발
실시예 2-1. 실험의 준비
실시예 1은 비교적 높은 역가의 보툴리눔 독소(200 units/0.1 ㎖)을 섞어서 조성한 액상 제형의 시료를 폴리프로필렌 튜브에서 제조하여 BoTest Assay를 이용해 잔존 역가를 측정한 것이다. 그러나 상기 농도는 실제 임상 목적으로 시판되는 보툴리눔 독소의 농도와 현저하게 상이하므로, 본 발명에서는 현재 시판되고 있는 고형이나 액상 보툴리눔 제품의 조성과 유사한 제형; 즉, 보툴리눔 독소의 시초 역가가 40 내지 80 units/㎖ 인 제형을 이용해 보툴리눔 독소의 안정화 제형 연구를 수행하였다. BoTest Assay 의 경우 최소 50 units 의 역가를 필요로 하기 때문에, 위와 같은 조건으로 조성된 액상 제형의 잔존 역가는 측정할 수 없다. 따라서 본 발명자들은 미량 존재하는 BoNT/A 의 역가를 정량적으로 측정 가능한 DESCR(Direct ELISA coupled with in vitro SNAP25 cleavage reaction) 방법을 개발하였다. 상기 DESCR 방법을 하기 실시예 2-2에 구체적으로 기술하였다.
간단하게, 상기 실시예 1의 BoTest Assay로 잔존 역가를 측정하는 모든 제형의 시료에는 200 units 의 BoNT/A 가 100 ㎕의 액상제형에 첨가되었으나, 본 발명자들이 새로이 개발한 DESCR 방법으로 잔존 역가를 측정하는 모든 제형의 시료에는 40-80 units/㎖ 의 BoNT/A 가 0.1 내지 1 ㎖ 의 액상제형에 첨가되었다.
안정화 효능 첨가제 후보물질 검출을 위한 각 실험군의 시료는 완충용액으로 10 mM NaPO4 (pH 6.0), 10 mM 주석산(tartaric acid, pH 6.0) 혹은 10 mM 글루코노락톤(gluconolactone, pH 6.0)이 음성대조군으로 사용되었고, 공통적으로 0.05% 폴리솔베이트, 45 내지 130 mM NaCl, 및 보툴리눔 독소와 안정화제 후보 첨가제로 조성되었다. 이들은 37도에서 2 내지 8주 배양한 후, 10 ㎕(0.4 units)를 DESCR로 잔존 역가 측정하였다. 이하 구체적 기술이 생략된 실험방법은 실시예 1과 동일하다.
실시예 2-2. DESCR 측정 방법의 개발
DESCR(Direct ELISA coupled with in vitro SNAP25 cleavage reaction)은 두 가지 부분으로 구성된다.
(1) in vitro에서 순도 높은 재조합 단백질 (GST-SNAP25) 을 기질로 BoNT/A 와 효소 반응을 하는 단계(In vitro SNAP25 cleavage reaction); 및
(2) 효소 반응의 정도를 효소면역정량법 (ELISA)을 이용해 정량적으로 측정하는 단계.
반응의 정도는 발색 반응을 통해 검출하는데, 이 과정은 BoNT/A에 의해 잘린 형태 (SNAP25197)에 특이적으로 반응하는 1차 항체(primary antibody)와 HRP(Horseradish peroxidase)-결합된 이차 항체(HRP conjugated secondary antibody)를 이용한 발색 반응을 바탕으로 검출 가능하다. 각 단계의 과정은 다음과 같이 수행한다.
(1) In Vitro SNAP25 Cleavage Reaction
실험에 사용한 보툴리눔 톡신은 다양한 농도(0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.2, 1.6 units)로 희석하였고, 20 μl의 완충용액(20 mM HEPES-NaOH (pH 7.1), 0.1 % Tween 20, 10 μM ZnCl2, 및 1 μg GST-SNAP25)에서 37℃ 조건으로 21시간 효소 반응을 수행하였다.
(2) ELISA
BoNT/A 반응을 정지하기 위해 80 μl의 RSB(Reaction Stop Buffer; 125 mM carbonate (pH9.6, Sigma S6014), 및 6.25 mM EDTA)를 첨가하고, Maxisorp Immuno-plate (NUNC, Cat No. 170-6531)에 옮긴 후 37도에서 두시간 코팅하였다. WB(Washing Buffer; 0.05 % Tween-20이 첨가된 1X PBS, 및 0.2 M NaCl)로 3 회 닦아준 후, BS(Blocking Solution; 5 % skim milk in 1X PBS)로 37도에서 15분간 블럭하였다. 이후 WB로 1 회 닦아주고, BS 에 희석한 SNAP25197-특이적 항체(1:250 희석, R&D)를 각 웰에 100 μl로 분주하여 37도에서 한시간 반응하였다. WB로 3 회 닦아준 다음, BS 에 희석한 HRP-결합된 이차 항체(1:1000 희석, AbFrontier, LF-SA8001)를 각 웰에 100 μl로 분주하여 37도에서 한시간 반응하였다. WB로 3 회 닦아준 후, TMB substrate(Thermo-fisher, Cat No. 34028)를 각 웰에 100 μl 분주하여 발색 반응을 유도하였다. 동량의 2M 황산(Sigma, Cat No. 258105)을 첨가해 반응을 중지시킨 후, 흡광도 분석기(Multi-Mode Reader Synergy Neo2, BioTek) 장비를 이용해 450 nm 에서 흡광도를 측정하고, AU 값을 산출하였다. 상기 단계의 모식도를 도 5에 나타내었다.
실시예 2-3. 액상 보툴리눔 제형을 안정화 시키는 아르기닌과 메티오닌의 효능 비교
상기 실시예 1에서 보툴리눔 독소에 대한 아르기닌과 메티오닌의 안정화 효능은 산도(pH)에 의존적인 결과를 보였다. 즉, 안정화제로 메티오닌이 첨가된 실험군에서는 pH 5.5 내지 7.0의 범위에서 보툴리눔 독소가 최대 약 10%의 잔존 역가를 나타내었고, 이에 반해 아르기닌이 첨가된 실험군에서는 최대 약 30%의 잔존 역가가 측정되었다. 또한, 산도 6.5~7.0 보다 산도가 5.5~6.0 에서 아르기닌이 BoNT/A의 안정화에 높은 효능을 보였다. 안정화 후보 첨가물이 없는 음성대조군은 여러 산도의 조건에서 모두 BoNT/A 가 불안정한 경향을 보여 28일 이후 잔존 역가가 거의 검출되지 않았다.
상기 결과를 바탕으로, 액상 BoNT/A 제형의 산도는 6.0으로 고정하고 아르기닌의 농도를 변화시킨 조성액에서 BoNT/A 를 80 units/ml 의 초기 역가로 첨가한 후, 37도에서 8 주까지 배양하고, DESCR Assay로 역가를 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
실험 결과, 안정화제가 첨가되어 있지 않은 대조군은 2주 경과 후부터 BoNT/A 의 잔존 역가가 10%로 나타났고, 50 mM 메티오닌이 첨가된 실험군은 2주, 4주, 8주 경과에 따라 각각 67%, 47%, 27% 의 잔존 역가를 보여, 메티오닌이 유의할 만한 수준의 안정화 효능이 있음을 검증하였다. 아르기닌의 경우, 50 내지 100 mM 의 농도에서 메티오닌 이상의 안정화 효능을 보이며, 8주 경과 이후에도 31 내지 65% 의 잔존 역가가 측정되었다.
메티오닌과 아르기닌의 상대적 안정화 효능 차이는 리도카인이 0.3% 함유된 제형에서도 관찰되었다. 즉, 8주 경과 후 메티오닌이 함유된 실험군은 27%, 아르기닌이 함유된 실험군은 44 내지 62%의 잔존 역가가 유지되는 것으로 나타났다.
상기의 결과는 첫째, 아르기닌의 안정화 효능이 BoTest Assay와 DESCR Assay 등의 다양한 측정 방법과 관계없이 검증되며, 둘째, 실제로 임상용으로 제조/유통되고 있는 제품과 유사한 역가의 보툴리눔을 함유하는 제형의 조건에서도 아르기닌이 안정화 효능을 나타내며, 셋째, 아르기닌의 안정화 효능은 리도카인이 첨가된 제형에서도 유지된다는 것을 보여준다.
실시예 2-4. 액상 제형 용기 재질이 BoNT/A 효능 안정화에 미치는 영향 확인
상기 실시예 2-3은 보툴리눔 독소를 포함하는 제형을 폴리프로필렌 튜브에서 제조하여 얻어진 결과이다. 그러나 실제 임상용으로 유통되는 보툴리눔 독소 액상 제형은 유리 용기로 제조되므로, 메티오닌과 아르기닌의 안정화 효능을 유리 용기를 사용하여 잔존 역가를 재검증하였다. 구체적으로, BoNT/A 를 40 units/ml 의 초기 역가로 20 mM 메티오닌이나 100 mM 아르기닌이 함유된 액상 제형으로 제조하고, 37도 에서 8주 동안 배양하면서 DESCR Assay로 잔존 역가를 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
실험 결과, 메티오닌이 함유된 제형의 BoNT/A 잔존 역가는 2주, 4주, 8주 경과 후 각각41%, 15%, 및 8% 로 측정되었다. 한편 아르기닌이 함유된 제형의 BoNT/A 잔존 역가는 같은 기간 경과 후 84%, 64%, 및 43%로 측정되어, 메니오닌이 함유된 제형의 BoNT/A 잔존 역가와 큰 차이를 보였다.
액상 제형에 리도카인이 첨가되어도 메티오닌과 아르기닌은 모두 안정화 효능을 나타내는데, 메티오닌이 함유된 제형의 BoNT/A 잔존 역가는 2주, 4주, 8주 경과 후에 각각 47%, 21%, 16% 였고, 아르기닌이 함유된 제형의 BoNT/A 잔존 역가는 79%, 71%, 55% 로 측정되어, 안정화 효능의 정도가 크게 차이나는 것으로 나타났다.
상기의 결과는 첫째, 같은 조성의 제형이라고 해도 유리용기보다 폴리프로필렌 튜브에서 조성된 시료에 함유된 BoNT/A 의 역가가 더 안정적으로 유지되고, 둘째, 유리 용기로 조성된 BoNT/A 액상 제형에서 아르기니의 안정화 효능이 메티오닌에 비해 상대적으로 뛰어나다는 것을 보여준다.
실시예 2-5. 완충화제와 글루타민산이 안정화제로서 아르기닌의 효능에 미치는 영향 평가
상기 실시예 1-4는 주석산과 글루코노락톤이 완충화제로서 안정화 효능이 있음을 확인하였는데 이들은 모두 산도 6.0 주변에서 최적의 효능을 나타낸다. 따라서 BoNT/A 제조에 완충화제로서 주석산, 또는 글루코노락톤이 함유된 제형에서 아르기닌의 안정화 효능을 유리 용기를 사용해 비교하였다. 음성 대조군으로서의 완충화제는 가장 일반적으로 사용되는 pH 6.0 의 인산나트륨(NaPO4)을 사용하였다. 상기 결과를 도 8에 나타내었다.
실험 결과, 아르기닌의 안정화 효능은 모든 액상 제형에서 유사한 양상을 보이며, 8 주 경과 후에도 BoNT/A 의 잔존 역가는 57~70% 로 측정되었다. 실험된 모든 완충화제 중에서 글루코노락톤이 함유된 제형에서 아르기닌의 안정화 효능이 유의적으로 높게 나타났고, 8 주 경과 후에 BoNT/A 의 잔존 역가가 다른 시료에 비해 10% 정도 더 높게 측정되는 것을 확인하였다. 이런 경향은 리도카인이 함유된 제형에서도 동일하게 나타났다.
또한, 주석산 또는 글루코노락톤 완충화제에 글루타민산이 추가로 포함된 경우에 안정화제로서 아르기닌의 효능에 미치는 영향을 평가하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 상기 실시예 2-3에서, 인산나트륨 완충화제와 50 mM 아르기닌으로 조성된 BoNT/A 액상 제형에 50 mM 글루타민산을 첨가한 경우에, 8 주 경과 후 BoNT/A 잔존 역가는 65%인 것으로 나타났다. 글루타민산이 포함되지 않은 경우에는 32% 였다. 리도카인이 함유된 제형에서도 유사한 결과를 얻었는데, 8 주 경과 후 71%의 BoNT/A 잔존 역가가 측정되었다. 이 경우, 글루타민산이 포함되지 않았을 때는 45%의 잔존 역가가 측정되었다(도 6 참조).
실험 결과, 아르기닌과 글루타민산이 모두 포함된 경우에 BoNT/A 액상 제형의 안정화에 최적인 완충화제를 선별하기 위해서, 인산나트륨, 주석산, 또는 글루코노락톤이 함유된 제형에서의 BoNT/A 효능을 유리 용기를 사용해 비교하였다. 실험 결과, 2주, 4주, 8주 경과 후 DESCR 를 이용해 측정한 BoNT/A 의 잔존 역가는 글루코노락톤이 완충화제로 함유된 제형에서 유의적으로 높게 나타났는데 리도카인이 없는 경우에는 각각 2주, 4주, 8주 경과 후 잔존 역가가 96%, 87%, 71% 에 이르렀고, 리도카인이 포함된 경우에는 96%, 86%, 68%인 것으로 측정되었다.
마지막으로, 아르기닌의 안정화 효능에 기여하는 글루타민산의 최적 농도를 평가하기 위해 글루코노락톤이 완충화제로 조성된 제형에 50 mM 아르기닌과 10 내지 50 mM 글루타민산을 첨가해 BoNT/A 의 효능을 폴리프로필렌 튜브에서 측정하였다. 상기 결과를 도 10에 나타내었다. 실험 결과, 아르기닌 없이 글루타민산만 첨가된 제형에서도 유의적인 수준의 BoNT/A 효능이 검출되었는데 그 효과는 특히 리도카인이 함유된 제형에서 더 명확하여 37도에서 8주 경과 후 잔존 역가는 음성대조군의 경우 15%, 글루타민산만 첨가된 제형에서는 41% 의 잔존 역가가 측정되었다. 그러나 글루타민산을 단독으로 사용했을 때 BoNT/A 의 안정화 효능은 아르기닌에 비해서는 낮은 편으로, 아르기닌만 첨가된 제형 실험군은 37도에서 8주 경과 후 잔족 역가가 61% 인 것으로 나타났다. 10 내지 50 mM 의 글루타민산과 50 mM 아르기닌이 함께 첨가된 제형에서 BoNT/A 의 안정화 효능을 측정하면, 2-8주 경과 후 측정된 잔존 역가는 거의 모든 실험군에서 아르기닌이 단독으로 첨가된 제형의 역가와 매우 유사하게 측정된다. 이런 경향은 리도카인이 함유된 제형에서도 나타나는데 8주 경과 후 측정된 잔존 역가는 아르기닌이 단독으로 첨가된 제형에서는 61%, 아르기닌과 글루타민산이 모두 첨가된 제형에서는 농도에 유의적인 관련성을 보이지 않고 57 내지 65% 수준인 것으로 나타났다.
상기의 결과는 하기 중요한 사실을 시사한다. 글루타민산은 액상 제형의 BoNT/A 를 안정화 시키는 효능을 갖고 있지만, 글루타민산 단독의 효과는 아르기닌 단독의 효과보다 미비하다. 글루타민산과 아르기닌이 모두 첨가한 제형은 8주간의 비교적 오랜 보존 기간을 거친 후에는 상승 효과를 나타내지 않고, 일정 수준(60 내지 80%)으로 유지된다.
실시예 2-6. 아스파르트산이 안정화제로서 아르기닌의 안정화 효능에 미치는 영향 평가
글루타민산과 같은 산성 아미노산으로서 아스파르트산이 아르기닌의 BoNT/A 안정화 효능에 미치는 영향을 조사하였고, 그 결과를 도 11에 기재하였다. 아스파르트산 단독으로 첨가된 액상 제형에서 2-8 주 경과 후, BoNT/A 는 비교적 높은 잔존 역가를 나타내는데 이런 아스파르트산의 안정화 효능은 리도카인이 함유된 제형에서 현저하게 드러난다. 음성대조군은 2주, 4주, 8주 경과 후 73%, 30%, 15% 의 잔존 역가가 측정되지만, 이와 대조적으로 아스파르트산이 첨가된 실험군으로는 88%, 73%, 52% 의 잔존 역가가 측정되었다. 10 내지 50 mM 의 아스파르트산과 50 mM 아르기닌이 함께 첨가된 제형에서 8주 경과 후의 BoNT/A 잔존 역가를 측정하면, 아르기닌이 단독으로 첨가된 제형에서는 61%, 아스파르트산이 부가적으로 첨가된 제형에서는 농도에 유의적인 관련성을 보이지 않고 58 내지 73% 수준으로 측정되었다. 8주 경과 후 측정한 잔존 역가의 결과와는 달리, 2 내지 4주 경과 후에 측정된 BoNT/A 의 잔존 역가는 통계적으로 유의할 수준의 차이를 나타낸다. 아르기닌만 함유된 제형은 2주, 4주 경과에 따라 82%, 76% 의 잔존 역가가 측정되지만 아스파르트산이 첨가되면 92 내지 100%, 및 85 내지 94% 의 잔존 역가가 측정되었다. 글루타민산이 함유된 제형에서도 같은 기간 유사한 안정화 효능이 보이기는 하지만 상대적으로 그 정도가 낮아 잔존 역가는 83 내지 98%, 및 76 내지 88% 로 측정되었다. 상기 아스파르트산이 첨가된 경우의 결과를 표 4에, 글루타민산이 첨가된 경우의 결과를 표 5에 나타내었다.
37℃ 안정화
0주 2주 4주 8주
Buffer G 아스파르트산 무첨가 100 62.84±10.78
(73.07±7.70)		 29.66±2.01
(48.66±4.67)		 15.19±2.37
(36.59±10.22)
+ 50mM 아스파르트산 100 87.91±4.25
(85.29±4.16)		 72.66±5.69
(75.08±3.24)		 51.92±5.47
(51.72±6.04)
Buffer R 아스파르트산 무첨가 100 82.01±6.89
(91.40±6.30)		 75.96±4.65
(80.36±6.53)		 61.19±4.20
(61.54±3.88)
+ 10mM 아스파르트산 100 92.19±3.98
(86.83±3.10)		 85.28±5.79
(85.49±2.33)		 73.05±79.67
(79.01±6.61)
+ 25mM 아스파르트산 100 93.37±4.53
(94.76±3.94)		 86.92±7.08
(84.87±4.48)		 58.05±3.37
(65.49±11.48)
+ 50mM 아스파르트산 100 100±0.24
(94.79±4.49)		 94.90±3.72
(89.70±4.21)		 61.07±1.63
(73.85±4.43)
37℃ 안정화
0주 2주 4주 8주
Buffer G 글루타민산 무첨가 100 62.84±10.78
(73.07±7.70)		 29.66±2.01
(48.66±4.67)		 15.19±2.37
(36.59±10.22)
+ 50mM 글루타민산 100 87.41±5.42
(90.29±4.95)		 78.30±6.22
(71.09±3.35)		 40.87±6.04
(37.42±4.78)
Buffer R 글루타민산 무첨가 100 82.01±6.89
(91.46±6.30)		 75.96±4.65
(80.36±6.53)		 61.19±4.20
(61.54±3.88)
+ 10mM 글루타민산 100 93.34±4.55
(100±2.63)		 88.21±5.69
(92.39±7.38)		 65.76±4.53
(72.11±3.92)
+ 25mM 글루타민산 100 87.69±3.21
(92.53±12.79)		 76.38±3.73
(87.68±6.37)		 64.85±5.93
(67.83±15.29)
+ 50mM 글루타민산 100 83.68±5.85
(89.18±5.39)		 81.34±6.50
(86.83±6.60)		 55.98±3.93
(50.36±3.40)
실시예 2-7. 신규 액상 제형으로 제조된 BoNT /A 제품의 안정성 확인
본 발명자들에 의해 안전성이 확인된 다양한 액상 주사제 첨가제들을 체계적으로 비교 분석한 상기의 결과들을 통해 수립된 BoNT/A 의 신규 액상 조성은 10 mM 글루코노락톤(pH 6.0), 100 mM 염화나트륨, 50 mM 아르기닌, 50 mM 아스파르트산, 0.05% 폴리솔베이트 이다. mouse LD50 assay 를 이용해 액상 제형의 안정성을 검증하기 위해, 상기 조성의 BoNT/A 제형을 40 units/ml 의 초기 역가로 유리 용기를 이용해 제조하였다. 아르기닌 대신 메티오닌이 포함된 액상 제형 제품을 대조군으로 사용하여 제품의 안정성을 비교/조사하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다. 실험 결과, 신규 액상 조성에서 제조된 BoNT/A 제품의 안정성은 in vitro 연구에서 얻은 결과와 매우 유사하여, 2주, 4주, 8주 경과 후 측정된 잔존 역가는 96%, 84%, 66% 로 나타났고, 대조군의 잔존 역가는 41%, 15%, 8% 인 것으로 나타났다.

Claims (18)

  1. 신경독소, 제 1 안정화제, 및 제 2 안정화제를 포함하는 약학제형으로서,
    상기 제 1 안정화제는 아르기닌이고,
    상기 제 2 안정화제는 글루타민산, 또는 아스파르트산인, 약학제형.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 신경독소는 보툴리눔 독소, 파상풍 독소, 콜레라 독소, 및 백일해 독소로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 약학제형.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A인 것을 특징으로 하는, 약학제형.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 보툴리눔 독소는 복합체화 단백질을 함유하지 않는 형태 또는 복합체화 단백질을 함유하는 복합체 형태인 것을 특징으로 하는, 약학제형.
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 안정화제, 또는 제 2 안정화제는 신경독소 100 유닛당 0.01 내지 1,000 mM로 포함되는 것을 특징으로 하는, 약학제형.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 약학제형의 pH는 5.5 내지 7.0인 것을 특징으로 하는, 약학제형.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 약학제형은 안정화 완충액을 추가로 포함하는, 약학제형.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 안정화 완충액은 글루코노락톤 완충액, 또는 주석산 완충액인, 약학제형.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 약학제형은 국소마취제를 추가로 포함하는, 약학제형.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 국소마취제는 리도카인인, 약학제형.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 국소마취제는 전체 조성물에 대하여 0.1 내지 1 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는, 약학제형.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 약학제형은 폴리솔베이트를 추가로 포함하는, 약학제형.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 약학제형은 액상인, 약학제형.
  15. (a) 신경독소를 정제하는 단계; 및
    (b) 상기 신경독소에 제 1 안정화제, 및 제 2 안정화제를 첨가하는 단계;를 포함하는 약학제형의 제조방법으로서,
    상기 제 1 안정화제는 아르기닌이고,
    상기 제 2 안정화제는 글루타민산, 또는 아스파르트산인, 약학제형의 제조방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 신경독소는 보툴리눔 독소 타입 A인, 약학제형의 제조방법.
  17. 삭제
  18. 제 15항에 있어서,
    상기 약학제형은 액상인, 약학제형의 제조방법.
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