KR101940500B1

KR101940500B1 - 보툴리눔 독소 활성을 결정하기 위한 세포주 및 이를 이용한 활성 결정 방법

Info

Publication number: KR101940500B1
Application number: KR1020180150997A
Authority: KR
Inventors: 이치건; 엄지현; 계향애
Original assignee: 주식회사 에이비바이오
Priority date: 2018-11-29
Filing date: 2018-11-29
Publication date: 2019-01-21

Abstract

본 발명은 보툴리눔 독소 활성을 결정하기 위한 세포주 및 그를 이용한 방법에 관한 것으로, 상기 세포주는 종래 보툴리눔 독소 활성 결정에 사용되는 SiMa 세포에 비하여 현저하게 짧은 분열 시간을 가지며, 보툴리눔 독소에 대한 민감도가 부모 세포주에 비하여 현저하게 높아, 세포 기반 보툴리눔 독소의 활성 결정뿐만 아니라, 독소의 검출에 매우 적합하다. 나아가, 본 발명에 따른 상기 세포주는 폴리-d-라이신(poly-d-lysine; PDL)으로 코팅된 배양 접시에 부착되어 안정적으로 배양될 수 있으므로, 세포 기반 보툴리눔 독소 활성을 결정 또는 독소를 검출하기 위한 세포로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

보툴리눔 독소 활성을 결정하기 위한 세포주 및 이를 이용한 활성 결정 방법{A cell line for determining botulinum toxin activity and method for using the same}

본 발명은 보툴리눔 독소 활성을 결정하기 위한 세포주 및 이를 이용한 활성 결정 방법에 관한 것이다.

현재 마우스 LD50 생물검정(mLD50)은 식품, 임상, 또는 환경 시료에 존재하는 보툴리눔 독소(BoNT)의 검출을 위해 일반적으로 인정되는 방법이다. 특히, 제약 분야에서는 미학적 또는 의학적 용도로 사용되는 보툴리눔 독소의 활성을 결정하기 위한 표준 분석법으로 mLD50을 이용한다. 그러나 mLD50을 이용한 보툴리눔 독소의 활성 검증은 시험자, 시험 기관, 및 시설 등에 영향을 많이 받으므로, 보툴리눔 독소의 생물학적 효능을 정확하며 재현될 수 있도록 정량화하기에 어려움이 있는 실정이다. 이에, 실험에 사용되는 동물의 수와 고통을 최소화하고 보툴리눔 독소 활성 결정 즉, 보툴리눔 독소의 역가 측정법을 표준화하고자, mLD50 대안 측정법의 개발을 장려하기 위해 ZEBET 회의가 개최되었다(Adler et al., 2010). 다양한 국가에서 많은 연구소와 산업체가 특이성, 민감성, 및 재현성 측면에서 mLD50을 대체하기에 만족할만한 세포 기반 역가 분석법(CBPAs), 또는 세포 기반 생물 검정법(CBB)을 개발하고자 다양한 연구에 착수하였다. 성공적인 CBPA 또는 CBB의 구현을 위해서는 (1) SNAP25₁₉₇ 에 특이적인 단일 클론, 또는 다클론 항체, 및 (2) 저농도(~pM)의 보툴리눔 독소에 높은 민감성을 나타내는 신경 세포를 획득하는 것이 요구된다. 2004년 초 Chapman 박사와 그의 동료들은 두 개의 형광 단백질과 융합된 보툴리눔 독소를 이용하는 형광 리포터 분석을 발명하였고(Dong et al., 2004), BoCellTM 분석법으로 명명하여 상업화하였다(BioSentinel Inc). 그러나 BoCellTM 분석이 98-웰 배양 접시에서 배양되는 동물 세포로 보툴리눔 독소의 엔도펩티다아제 활성을 검출 할 수 있는 최초의 분석법이라는 의의에도 불구하고, 마우스를 이용한 분석법보다 2-3배 민감도가 떨어지는 문제점이 있었다(Dunning et al., 2012).

상기 기술한 바와 같이 mLD50을 대체하기 위한 CBPA를 개발하고자 전 세계적인 노력이 지속되고 있으므로, 궁극적으로 동물을 이용한 분석법은 제거될 것으로 보인다. 효과적인 CPBA 개발을 위해 해결해야할 과제들이 남아 있으나, 효과적인 CBPA 개발은 다양한 보툴리눔 독소 제품의 활용성 확장을 용이하게 하고, 품질 관리 수준을 향상시키며, 소비자에게 보다 높은 수준의 신뢰를 제공함으로써 보툴리눔 독소 제품의 경쟁력을 고취시킬 것이다. 따라서 본 발명은 종래의 CPBA가 가진 한계점을 극복하고, 보다 효과적인 CBPA 개발을 위한 것이다. 본 발명의 CPBA는 13 개의 상이한 신경 세포주를 비교 분석하고, 신경 세포들을 구성하는 광범위한 클론 중 가장 최적화된 새로운 클론인 N2-42F를 개발하였으며, 이와 같은 클론은 SiMa와 비교하여 24시간 이하의 짧은 분열시간을 가지고, 폴리-d-라이신(poly-d-lysine; PDL)으로 코팅된 배양 접시에 부착되어 안정적으로 배양될 수 있으므로, CBPA용 세포로서 매우 유용할 것으로 기대된다.

본 발명의 일 목적은 보툴리눔 독소의 활성을 결정 또는 보툴리눔 독소를 검출하기 위한 세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 세포를 이용한 세포 기반 보툴리눔 독소의 활성 결정 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포를 이용한 세포 기반 보툴리눔 독소의 검출 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

Botox® 제조업체인 알러간사(Allergan)는 SNAP25₁₉₇에 특이적인 단일 클론 항체와 보툴리눔 독소에 매우 민감한 이상적인 숙주 세포인 인간 신경종 세포 SiMa(human neuroblastoma SiMa)를 성공적으로 구축하였다(Fernandez-Salas et al., 2012). 알러간은 2010년에 상기 항체와 세포로 새로운 CBPA 분석법을 개발하여 대체 가능한 첫번째 CBPA로 mLD50을 FDA로부터 승인 받았다(US8455213B2, 및 US2010/0204559A1). 또 다른 보툴리눔 독소 제조업체인 독일 멀츠(MERZ)는 2014년에 CBA-ELISA를 개발하였고(WO2014/207109A1), 2015년 FDA로부터 승인 받았다. CBA-ELISA는 차별화된 신경 세포 고정법(in-situ)을 사용하고, 세포막을 침투하여 내인성 SNAP₂₅을 면역학적으로 검출한다.

알러간의 CBPA와 멀츠의 CBA-ELISA는 마우스를 이용한 분석 방법과 동등하게 피코몰 이하 농도(i.e. <1.0 U/well)의 EC₅₀에서도 탁월한 감도를 나타낸다. 알러간과 멀츠의 기술 플랫폼은 일반적인 상업용 토끼의 다클론 항체(Sigma S9684)를 사용하여, 최적 조건에서 SNAP₂₅를 검출한다. 세포의 경우, 알러간의 CBPA에서는 분화된 인간 신경종 세포 SiMa가 독점적으로 사용되는 반면, 멀츠의 CBA-ELISA에서는 인간의 분화된 유도다능성 줄기세포(이하 ‘iPS’라 함)가 표준화되고 최적화된 숙주 세포로 사용된다. SiMa는 매우 천천히 증식하여 일반적으로 세포수가 2배가 되는데 필요한 시간(Population doubling time; PDT)이 70시간 이상이고, iPS 생성 또한 매우 시간 소모적이고, 저장은 더욱 어렵다. 따라서, 보툴리눔 독소에 매우 민감하면서도 PDT가 짧고, 보관이 쉬운 CBPA용 신경 세포 개발의 필요성이 제기되었다. 또한, 위스콘신 대학 David Beebe 박사의 연구 그룹은 SiMa가 운동신경과 유사한 특징을 보이지 않기 때문에 CBPA용 세포로서 SiMa의 적합성에 문제가 있다고 지적하였고(Hong et al., 2016), 7.9pM 이하 농도의 EC₅₀에서도 민감성을 나타내는 운동신경 유사 세포 NG108-15으로 대체 CBPA를 개발하였다. 그러나, 상기 개발된 CBPA들은 웨스턴 블랏팅 분석법을 이용하여 SNAP25₁₉₇ 및 SNAP25_FL의 내인성 수준을 결정하므로, 고 처리량 분석(High-throughput assay)에는 적용되기 어려운 실정이다.

본 발명의 일 구체예에서 “보툴리눔 독소(Botulinum Toxin)”란, 클로스트리디움 보툴리눔 세균이 만드는 신경독 단백질이다. 클로스트리디움 속은 127 종 이상이며, 형태 및 기능에 따라 구분된다. 혐기성, 그람 양성 박테리아 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)은 사람 및 동물에서 보툴리즘이라는 신경마비 질환을 일으키는, 강력한 폴리펩티드 신경독인, 보툴리눔 독을 생산한다. 클로스트리디움 보툴리눔의 포자는 토양에서 발견되며, 제대로 살균되지 않고 밀봉된, 집에서 통조림된 식품 용기에서 배양될 수 있어, 이러한 것들이 많은 보툴리즘의 원인이 된다. 보툴리즘 증상은 전형적으로 클로스트리디움 보툴리눔 배양물 또는 포자에 감염된 음식을 먹은 후 18 내지 36시간이 지나서 나타난다. 보툴리눔 독소는 독성이 감소되지 않은 채로 장 내막을 통과할 수 있는 것으로 보이며 콜린성 운동 뉴런에 대해 높은 친화도를 나타낸다. 보툴리눔 독소 중독의 증상은, 보행장애, 연하장애 및 언어장애, 호흡근육의 마비 및 죽음으로 증상이 진행될 수 있다. 보툴리눔 독소는 활동항진성 골격근을 특징으로 하는 신경근육 장애(즉, 운동 장애)의 치료를 위해 임상에서 사용되고 있다. 1989년에, 보툴리눔 독소 타입 A 컴플렉스는 미국 식품의약청에 의해서, 본태성 안검경련, 사시 및 반측안면 경련의 치료에 사용되는 것이 승인되었다. 이어서, 보툴리눔 독소 타입 A는 또한 FDA로부터 경부 디스토니아의 처치 및 미간 주름의 처치에 대해 승인되었고, 보툴리눔 독소 타입 B도 경부 디스토니아의 처치에 대하여 승인되었다. 독소 타입 A 이외의 보툴리눔 세로타입들은 보툴리눔 독소 타입 A와 비교할 때, 활성에 있어서 더 낮은 효력 및/또는 더 짧은 지속시간을 가지는 것으로 보인다. 말초 근육내 주사된 보툴리눔 독소 타입 A의 임상 효과는 보통 주사 후 일주일 이내에 나타난다. 일회 보툴리눔 독소 타입 A의 근육 내 주사에 의한 증상 구제의 전형적인 지속시간은 평균 약 3 개월이나, 상당히 더 긴 기간 동안의 치료 활성이 보고되었다. 모든 보툴리눔 독소 세로타입이 신경근육 접합부에서 신경전달물질 아세틸콜린의 방출을 억제하는 것으로 보인다 하더라도, 이들은 상이한 신경분비성 단백질에서 작용하며, 이 단백질을 상이한 부위에서 절단한다. 예를 들어, 보툴리눔 타입 A 및 E는 모두 25kDa 시냅토솜 관련 단백질(SNAP-25)을 절단하지만, 이 단백질의 상이한 아미노산 서열을 표적으로 한다. 보툴리눔 독소 타입 B, D, F 및 G는 소포 관련 단백질(VAMP, 소위 시냅토브레빈)에 작용하며, 각각의 세로타입은 이 단백질의 상이한 부위를 절단한다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 타입 C1은 신택신 및 SNAP-25를 모두 절단하는 것으로 보인다. 이러한 작용 메카니즘의 상이성은 여러 보툴리눔 독소 세로타입들의 작용에 의한 상대적인 효력 및/또는 지속시간에 영향을 미칠 것이다. 특히, 보툴리눔 독소의 기질을 여러 상이한 세포 타입에서 발견할 수 있다. 또한 in vitro 연구에서, 보툴리눔 독소가 뇌간 조직의 일차 세포 배양물로부터 아세틸콜린 및 노르에피네프린의 칼륨 양이온 유도 방출을 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 보툴리눔 독소는 척수 뉴런의 일차 배양물에서 글리신 및 글루타메이트의 유발 방출을 억제하며, 뇌 시냅토솜 표본에서 신경전달물질 아세틸콜린, 도파민, 노르에피네프린, CGRP, 물질 P(Substance P) 및 글루타메이트 각각의 방출을 억제하는 것으로 보고되었다. 따라서, 적당한 농도로 사용하는 경우, 보툴리눔 독소에 의해서 대부분의 신경전달물질의 자극-유발 방출이 억제된다.

본 발명의 일 구체예에서 "항체(antibody)"란, 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 내인성 신경 분비 단백질, 특히 SNAP25 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 항체는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 보다 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체 항체, 단일 클론 항체, 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 본 발명의 항체는 경쇄(Light chain) 및 중쇄(Heavy chain)를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 일 구체예에서 "독소의 활성"이란, 표준 검정 방식인 마우스 LD50 생물검정(mLD50)으로 측정하였을 때, 1U(1 unit)의 보툴리눔 독소가 20g 중량 쥐의 50% 치사율을 나타내는 것으로, 보툴리눔 독소가 갖는 고유의 역가(potency)를 의미한다. 상기 보툴리눔 독소, 특히 보툴리눔 독소 세로타입 A는 동결 건조된 상태로 제품화되어 유통되고, 임상에 적용되기 직전에 수행되는 희석 과정 또는 상기 희석액의 보관시간 등에 의해 상기 보툴리눔 독소의 역가가 감소될 수 있다. 이와 같이 보툴리눔 독소의 역가가 감소되는 경우에는 보툴리눔 독소에 의한 기대 효과를 나타내기 어려우므로 보툴리눔 독소의 역가를 정확하게 예측하는 것이 반드시 필요하다.

본 발명자들은 13개의 상이한 신경 세포주에서 SiMa 세포주와 유사한 정도의 보툴리눔 독소에 민감도를 가지는 Neuro-2a 세포를 선별하였고, 클론 선택 과정을 통해 상기 Neuro-2a로부터 일관되게 보툴리눔 독소에 민감도가 높은 N2-42F(수탁번호: KCTC 13712BP)를 최종적으로 선별하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 일 구현 예는 부모 신경 세포주인 Neuro-2a로부터 클론 선택(clonal selection)된 세포주를 제공한다.

본 발명의 상기 세포주는 보툴리눔 독소의 활성 결정에 사용되거나, 또는 보툴리눔 독소의 검출을 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 세포주는 계대가 지속되어도 보툴리눔 독소에 대한 민감도를 유지하기 때문에, 세포를 기반으로 하는 분석 플랫폼에서 매우 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 보툴리눔 독소 활성을 결정하기 위한 세포주는 다양한 세포 유형의 혼합된 집단에 해당하는 부모 신경 세포주로부터 분리된 균질(Homogeneous)한 단일 세포로서, 공통된 유전적인 특징, 예를 들면 특정 유전자의 발현 수준이 높거나 낮음 등과 같은 특징을 공유하고 있는 세포를 의미한다.

상기 보툴리눔 독소 활성을 결정하기 위한 세포주는 부모 신경 세포주로부터 클론 선택 등의 방법을 통해 분리되거나, 상기 유전자들의 발현 수준을 조절함으로써 제조될 있다. 상기 유전자의 발현 수준을 조절은, 유전자 발현을 조절하는 통상의 방법, 예를 들면 형질전환, 프로모터 조작 등을 통해 달성될 수 있다.

본 발명의 상기 부모 신경 세포주는 신경으로부터 유래된 불멸화 세포주는 모두 포함될 수 있으나, 바람직하게는 Neuro-2a 세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 수탁번호가 KCTC AC28106인 Neuro-2a 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Neuro-2a 세포는 통상적으로 LD50의 측정에 사용될 수 있는 쥐로부터 유래된 신경 세포주로서, 분열시간(Doubling time)이 종래 보툴리눔 독소의 활성 결정에 사용되던 SiMa 세포의 경우 34~100 시간인 반면, 상기 Neuro-2a 세포의 경우 24시간에 불과하여 세포를 기반으로 하는 독성의 활성 결정뿐만 아니라, 검출에 매우 적합할 수 있다. 나아가, 상기 Neuro-2a 세포는 현미경으로 관찰하였을 때, 다양한 세포 유형이 혼합된 집단에 해당하여 보툴리눔 독소에 더욱 민감한 단일 세포만을 선별해 내기에 매우 적합하다는 장점을 갖는다.

본 발명의 상기 부모 신경 세포주인 Neuro-2a로부터 클론 선택된 세포주는 N2-42F(수탁번호: KCTC 13712BP)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 보툴리눔 독소 활성을 결정하기 위한 세포주는 보툴리눔 독소의 검출 또는 활성 결정의 용도로 사용될 수 있다. 상기 세포주는 보툴리눔 독소에 민감하여 목적하는 시료에 보툴리눔 독소가 존재하는지 여부를 확인해낼 수 있을 뿐만 아니라, 보툴리눔 독소의 농도에 따른 독성 유발 정도를 측정해낼 수 있다.

본 발명의 상기 보툴리눔 독소는 클로트리디움 보툴리움(Clostridium botulinum)에 의해 생성되는 신경 독성 단백질로서, A, B, C(C1, C2), D, E, F 및 G의 총 7개 세로타입(serotype)으로 분류될 수 있다. 상기 보툴리눔 독소는 상기 세로타입의 종류에 따라 상이한 신경 분비성 단백질에 작용하여 상이한 부위를 절단한다. 구체적으로, 보툴리눔 독소 세로타입 A 및 세로타입 E는 모두 SNAP25(Synaptosomal nerve-associated protein 25)를 쪼개고, 보툴리눔 독소 세로타입 B, D, F 및 G는 VAMP(Vesicle-associated membrane protein)를 쪼개며, 보툴리눔 독소 세로타입 C1은 신택신(Syntaxin) 및 상기 SNAP25를 절단함으로써 신경 독성이 유발되도록 할 수 있다. 바람직하게는 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 세로타입 A 또는 보툴리눔 독소 세로타입 B일 수 있고, 더욱 바람직하게는 보툴리눔 독소 세로타입 A일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 보툴리눔 독소 세로타입 A 및 B는 정제되어, 근육 긴장 이상의 치료, 미학적 용도 등에 널리 사용되고 있기 때문에, 본 발명의 상기 보툴리눔 독소 활성을 결정하기 위한 세포주를 이용하여 역가를 측정하는 경우에는 부작용이 발생될 수 있는 농도를 도출하여 상기와 같은 용도로 사용할 때 발생될 수 있는 문제점을 해결할 수 있다는 장점이 존재한다.

본 발명의 다른 구현 예는 세포 기반 보툴리눔 독소의 활성 결정 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 방법은 본 발명에 따른 세포주를 배양하는 단계; 상기 배양된 세포주에 보툴리눔 독소를 처리하는 단계; 및 상기 보툴리눔 독소가 처리된 세포주에서 보툴리놈 독소에 의한 민감도를 확인하는 단계;를 포함한다.

본 발명의 상기 세포 기반 보툴리눔 독소의 활성 결정 방법은 상기 보툴리눔 독소 활성을 결정하기 위한 세포주에 보툴리눔 독소를 처리하고, 상기 세포주에서 보툴리눔 독소에 의한 민감도를 확인함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 보툴리눔 독소 활성을 결정하기 위한 세포주, 보툴리눔 독소와 보툴리눔 독소에 의해 절단된 신경 단백질, 부모 신경 세포주 등과 관련된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 상기 세포주를 배양하는 단계에서, 상기 세포주의 배양은 폴리-D-라이신(Poly-D-lysine)이 코팅된 배양 플레이트에서 배양하는 것일 수 있다. 통상적으로 세포주의 배양에 사용되는 플레이트나, 젤라틴 또는 콜라겐이 코팅된 경우에 비하여 폴리-D-라이신이 코팅된 경우 본 발명에 따른 상기 세포주가 고르게 분포되고 단단하게 부착될 뿐만 아니라, 건강한 세포의 상태를 유지할 수 있다.

본 발명의 상기 보툴리눔 독소에 의한 민감도를 확인하는 단계는, 보툴리눔 독소에 의한 내인성(endogeneous) 신경 분비 단백질의 절단을 측정하는 것일 수 있다. 구체적으로, 보툴리눔 독소 세로타입 A 및 세로타입 E의 경우 SNAP25, 보툴리눔 독소 세로타입 B, D, F 및 G의 경우 VAMP, 보툴리눔 독소 세로타입 C1의 경우 신택신 및/또는 SNAP25의 절단 정도를 측정할 수 있다.

본 발명의 상기 절단 정도의 측정은 상기 내인성 신경 분비 단백질의 절단된 펩타이드에 특이적인 항체 등을 이용한 단백질의 검출 방법을 통해 달성될 수 있다.

본 발명의 상기 항체는 신경 분비 단백질의 전체 또는 절단된 일부 펩타이드를 항원으로 인식하여, 이에 특이적으로 결합될 수 있는 단백질 분자를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등을 모두 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 단백질의 검출 방법은 통상적으로 단백질을 검출하는 방법이라면 모두 사용될 수 있고, 예를 들면 웨스턴 블랏팅 분석, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현 예는 세포 기반 보툴리눔 독소의 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 방법은 본 발명에 따른 세포주를 배양하는 단계; 상기 배양된 세포주에 목적하는 시료를 처리하는 단계; 및 상기 목적하는 시료가 처리된 세포주에서 보툴리놈 독소에 의한 민감도를 확인하는 단계;를 포함한다.

본 발명의 상기 세포 기반 보툴리눔 독소의 검출 방법은 상기 세포 기반 보툴리눔 독소의 활성 결정 방법에서 보툴리눔 독소를 대신하여 목적하는 시료를 처리하고, 상기 세포주에서 보툴리눔 독소에 의한 민감도를 확인함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 보툴리눔 독소 활성을 결정하기 위한 세포주, 보툴리눔 독소와 보툴리눔 독소에 의해 절단된 신경 단백질, 부모 신경 세포주, 코팅 플레이트, 단백질 검출 방법, 항체 등과 관련된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 상기 목적하는 시료는 보툴리눔 독소가 포함되어 있을 것으로 예상되는 시료로서, 세포 배양액의 상층액, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액, 분비물, 림프액, 투석액, 체액, 소변 등의 생물학적 시료뿐만 아니라, 화합물을 포함하고 있는 화학적 시료를 모두 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 신규한 세포주는 종래 보툴리눔 독소 활성 결정 또는 독소의 검출에 사용되는 SiMa 세포에 비하여 현저하게 짧은 분열 시간을 가지며, 보툴리눔 독소에 대한 민감도가 부모 세포주에 비하여 현저하게 높아, 세포 기반 보툴리눔 독소 활성 결정 또는 검출에 매우 적합하다. 나아가, 본 발명에 따른 상기 세포주는 폴리-d-라이신(poly-d-lysine; PDL)으로 코팅된 배양 접시에 부착되어 안정적으로 배양될 수 있으므로, 세포 기반 보툴리눔 독소 활성 결정 또는 검출에 사용되는 세포로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 신경 세포에서 보툴리눔 독소 A(BoNT/A)에 대한 민감도를 측정한 웨스턴 블랏팅 분석 결과를 나타낸 것으로, 레인 M은 단백질 사이즈 마커이며, 레인 1은 BoNT/A 중독이 없는 전체 세포 용해물, 레인 2는 BoNT/A 중독이 있는 전체 세포 용해물의 SNAP25 단백질의 발현 정도를 나타낸 것이다. 또한, N2a는 Neuro-2a 세포를 나타낸 것이고, K-BM1은 KP-N-RT-BM-1 세포를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 3 단계의 클론 선택 과정에서 확인된 SNAP25의 절단 정도를 웨스턴 블랏팅 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것으로, 2 단계의 클론 선택 과정(2^nd clonal selection)에서 42번 클론을 포함하는 6개의 클론 중 유의미하게 BoNT/A에 의한 SNAP25의 절단 현상을 나타낸 42번 클론만을 선택하였고, 3 단계의 클론 선택 과정(3^rd clonal selection)에서 24번 클론(42F)은 복수의 동일한 실험에서 일관되게 BoNT/A에 의한 SNAP25의 절단 현상을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 N2-42F와 그의 부모 Neruo-2a 세포간의 분열시간(Doubling time)을 확인한 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포의 형태학적 확인을 위하여, 20배의 배율로 Leica DMi8을 사용하여 부모 세포인 Neruo-2a와, SiMa 세포 및 클론 N2-42F가 60%의 컨플루언스일 때 확인된 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 SiMa 세포 및 N2-42F에 다양한 농도의 BoNT/A를 처리하였을 때 나타나는 SNAP25의 절단 정도를 웨스턴 블랏팅 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 클론 선택 과정을 통해 얻어진 N2-42F의 계통 안정성을 웨스턴 블랏팅 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

제조예 1. 시약 및 물질 정보

본 발명에서 사용된 재료를 하기 표 1에 기재하였다.

재료명	재료정보
0.25% 트립신 EDTA	Gibco^TM 25200056
GlutaMAX^TM	Gibco^TM 35050061
MEM	Gibco^TM 11095080
MEM 1Ⅹ비필수아미노산(1Ⅹnon-essential amino acid; 1ⅩNEAA)	Gibco^TM 11140050
소듐 피루베이트(sodium pyruvate)	Gibco^TM 11360070
TrypLE^TM 발현 효소(Express Enzyme) (1Ⅹ)	Gibco^TM 12604021
항생제 항균제(antibiotic antimycotic solution; AA) (100Ⅹ)	Sigma A5955
붕산(boric acid)	Sigma B6768
인간 태반 유래 콜라겐(collagen from human placenta)	Sigma C5533
DTT(Dithiothreitol)	Sigma D0632
DMSO	Sigma D2650
젤라틴 용액(gelatin solution)	Sigma G1393
폴리-D-라이신 하이드로브로마이드(poly-D-lysine hydrobromide)	Sigma P6407
폴리소베이트(Polysorbate)	Sigma P7949
붕사(sodium tetraborate)	Sigma 221732
DPBS	Welgene LB001-02
우태아혈청(fetal bovine serum; FBS)	YI Frontier US-FBS-500
글리세롤(glycerol)	Affymatrix USB 16374
PCR 마이크로플라즈마 검출 세트(Mycoplasma Detection Set)	Takara Bio 6601
리파 완충액(RIPA buffer) (10Ⅹ)	abcam ab156034
6-웰 플레이트	Falcon 353046
12-웰 플레이트	Corning CLS3513
24-웰 플레이트	Falcon 353047
T75 플라스크	Falcon BD353136
TaKaRa EX Taq ^TM	Takara Bio RR001

제조예 2. 보툴리눔 독소 A(Botulinum toxin serotype A; BoNT/A) 원액, 희석액 및 BoNT/A 독성 배지의 제조

보툴리눔 독소 A(Botulinum toxin serotype A; BoNT/A, 이하, BoNT/A라 함)는 휴젤(EXBII1501)으로부터 제공받은 것을 사용하였다.

제조예 2-1. BoNT/A 스탁 용액 및 독성 배지 제조

독소 희석 완충액(pH 7.0, 50mM의 인산 나트륨(sodium phosphate), 1mM의 DTT(Dithiothreitol), 0.05% 폴리소르베이트, 20% 글리세롤 및 0.2mg/ml의 아세틸화-BSA)을 이용하여 상기 BoNT/A를 10nM의 농도가 되도록 희석함으로써 원액을 제조하였다. 아래의 실시예에 사용하기 전까지 분주하여 -80℃에서 상기 원액을 보관하였다.

동결 건조된 BoNT/A(200U)을 독성 배지 또는 생리 식염수 1 ml에 재현탁 시키고 실온에서 10분 동안 보관하여, 마스터 스탁(Mater stock)을 제조하였다. 스탁 A의 경우, 실온에서 150㎕의 마스터 스탁과 450㎕의 독성 배지를 혼합하여 제조하였다. 스탁 B의 경우, 실온에서 20㎕의 스탁 A와 180㎕의 독성 배지를 혼합하여 제조하였다. 스탁 C의 경우, 실온에서 20㎕의 스탁 B와 180㎕의 독성 배지를 혼합하여 제조하였다.

제조예 2-2. 표준 곡선 도출을 위한 표준 참고 시료 제조

동결 건조된 BoNT/A(100U)을 880㎕의 독성 배지 또는 생리 식염수에 재현탁 시키고 실온에서 10분 동안 보관함으로써 50pM의 표준 스탁 A(113.6U/ml)를 제조하였다. 10pM의 표준 스탁 B(22.7U/ml)의 경우, 50㎕의 표준 스탁 A와 200㎕의 독성 배지를 혼합하여 제조하였다. 2pM의 표준 스탁 C(4.54U/ml)의 경우, 50㎕의 표준 스탁 B와 200㎕의 독성 배지를 혼합하여 제조하였다.

제조예 3. 신경 세포의 배양을 위한 플레이트 코팅

배양 플레이트 또는 플라스크에 젤라틴 용액(1ⅩPBS에 0.1%로 포함)과, 0.1mg/ml의 콜라겐 타입 Ⅵ 또는 50㎍/ml의 폴리-D-라이신을 넣은 뒤 3시간 또는 밤새도록 배양함으로써 플레이트를 코팅하였다. 그런 다음, 상기 플레이트 또는 플라스크를 15ml의 1ⅩDPBS로 2회 헹구고 배양 후드에서 공기를 이용하여 건조시켰다.

상기 플레이트 코팅에 사용된 콜라겐의 경우 동결 건조된 콜라겐을 탈이온수(deionized H₂O)에서 0.1mg/ml의 최종 농도로 재구성하고, 폴리-D-라이신의 경우 pH8.5, 0.1M의 붕산염 완충액에 5mg의 분말을 용해시켜 코팅에 사용될 수 있도록 준비하였다.

제조예 4. 신경 세포 및 배양 배지

BoNT/A에 대한 민감도가 높은 신경 세포를 스크리닝해 내기 위하여, 13개의 신경 세포를 하기 표 2에서 보는 바와 같이 5개의 기관으로부터 얻었고, 기관에서 권장하는 조성을 포함하는 배양 배지에서 하기 13개의 신경 세포를 유지 및 번식시켰다.

Neuro-2a 세포로부터 클론 선택된 N2-42F 세포의 경우 4계대 및 SiMa 세포의 경우 10계대가 될 때마다, PCR 마이코플라즈마(Mycoplasma) 검출 세트(Takara Bio Inc. 6601)를 이용하여 마이코플라즈마 오염 여부를 모니터링 하였다. 여기서, 상기 PCR 검사는 제조사에서 권장하는 절차에 따라 수행되었다. 구체적으로, 상기 세포의 배양 상등액을 수득한 뒤, 3일 또는 4일 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 배양 상등액 3㎕에 1ⅩPCR 완충액, dNTP 혼합물, MCGp F1/R2 프라이머와 TaKaRa EX Taq ^TM(Takara Bio Inc. RR01)가 포함된 50㎕의 혼합액을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이후, 1% 아가로스겔에 10㎕의 PCR 생성물을 넣고 전기영동 하였다. 상기 전기영동이 완료된 1% 아가로스겔은 에티튬 염색을 통해 시각화될 수 있도록 하여 최종적으로 마이크로플라즈마 오염 여부를 확인하였다.

세포	기관	배양 배지
SK-N-SH	KCLB 30011¹	MEM, 300 mg/l glutamine, 25 mM HEPES, 25 mM NaHCO₃, 10% FBS
SH-SY5Y	KCLB 22266¹	MEM, 20 mM HEPES, 25 mM NaHCO₃,10% FBS
IMR-32	KCLB 10127¹	RPMI1640, 300 mg/l glutamine, 25 mM HEPES, 25 mM NaHCO₃, 10% FBS
Neuro-2a	KCTC AC28106²	MEM, 10% FBS
SK-N-MC	KCTCHC18501²	DMEM, 10% FBS
N1E-115	ATCCCRL2263³	DMEM, 10% FBS
NG108-15	ATCC HB12317³	DMEM, 0.1 mM hypoxanthin, 0.4 mM aminopterin, 16 mM thymidine, 10% FBS, 1.5 g/l NaHCO₃
BE(2)-M17	ATCC CRL2267³	EMEM+F12, 10% FBS
SiMa	DSMZ ACC164⁴	RPMI1640, 2 mM glutamine, 10% FBS
KP-N-RT-BM-1	JCRB IFO50432⁵	RPMI1640, 10% FBS
KP-N-YN	JCRBIFO50431⁵	RPMI1640, 10% FBS
NH-6	JCRB 0832⁵	Alpha-MEM, 10% FCS
NH-12	JCRB 0833⁵	Alpha-MEM, 10% FCS
TGW	JCRB 0618⁵	EMEM, 10% FBS
1: KCLB; Korean Cell Line Bank 2: KCTC; Korean Collection for Type Culture 3: ATCC; American Tissue Culture Collection 4: DSMZ; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen 5: JCRB; Japanese Collection of Research Bioresources FBS; 우태혈청(fetal bovine serum), FCS; 우아혈청(fetal calf serum)

실시예 1. BoNT/A에 민감한 신경 세포 스크리닝

1-1. BoNT/A에 의해 SNAP25 단백질의 절단(cleavage) 현상에 따른 BoNT/A에 민감한 신경 세포 스크리닝

24웰 플레이트에 한 웰당 2 x 10⁵의 세포수로 상기 제조예 3의 신경 세포들을 각각 분주하였다. 상기 세포들을 24시간 동안 배양한 뒤에, 상기 세포들의 배양 배지에 2nM의 BoNT/A를 처리하고 3일 동안 추가로 배양하였다. 여기서, 상기 표 1에 기재에 따른 각 세포에 적합한 배양 배지를 사용하였다.

1Ⅹ리파버퍼(abcam, ab156034)를 사용하여 상기 세포들을 용해시킴으로써 전체 세포 용해물을 얻었다. 그런 다음, 3.5μg의 단백질을 12% SDS-PAGE에 넣고 전기영동 하였다. 전기영동이 완료된 SDS-PAGE를 48mM의 트리스, 38.9mM의 글리신, 20% 메탄올 및 0.05% SDS로 구성된 전달 완충액에 5분 동안 담근 뒤, Trans-Blot® Semi-Dry (Bio-Rad 170-3940)를 이용하여 상기 SDS-PAGE에 존재하는 단백질을 PVDF 막으로 이동시켰다. 상기 PVDF 막을 1XTBST(1ⅩTBS/0.05%의 트윈20)로 헹군 뒤에, 블로킹 완충액(5%의 무지방 건조 우유 in 1XTBST)에 넣고 상온에서 15분 동안 배양하였다.

그런 다음, 블로킹 완충액으로 1:8,000 희석된 SNAP25_FL(Polyclonal anti-SNAP25 IgG (Sigma, S9684))와, 1:100 희석한 SNAP25₁₉₇(anti-SNAP25₁₉₇ IgG (R&D, MC6050))에 특이적인 항체와 상기 PVDF 막을 실온에서 45분동안 배양하였다. 이후, PVDF 막을 1XTBST로 15분 동안 3회 세척하고, HRP가 결합된 IgG가 포함된 희석액과 함께 상온에서 45분 동안 배양하였다. 1ⅩTBST을 이용하여 상기 PVDF 막을 3회 세척하고, ECL 용액과 ChemiDoc^TM MP 이미징 시스템(Bio-Rad)을 이용하여 시각화 및 정량화 하였다. 상기 ECL 용액은 AbBio에 의해 공식화 및 최적화된 것으로, 사용 전에 1:1의 비율로 SolA와 SolB를 혼합하여 사용하였다. 여기서, 상기 ECL 용액을 구성하는 SolA 및 SolB 용액의 구체적인 구성은 하기 표 3과 같으며, SNAP25의 절단 정도에 따른 BoNT/A에 대한 민감도 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

구분	구성
SolA	pH 8.8, 0.1M Tris-HCl, 2.5mM 루미놀(DMSO에 포함), 4 mM 4-요오드페닐 보론산(iodophenylboronic acid), 0.2mM 테트라부틸암모늄 보로하이드라이드(tetrabutylammonium borohydride), 2% 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 및 0.02% 트리톤 X-100
SolB	pH 8.8, 0.1 M Tris-HCl, 10.6 mM 과산화 수소 및 0.012% 소듐 스타네이트(sodium stannate)

세포	2nM의 BoNT/A 민감도
SK-N-SH	없음
SH-SY5Y	없음
IMR-32	없음
Neuro-2a	있음
SK-N-MC	없음
N1E-115	없음
NG108-15	없음
BE(2)-M17	없음
SiMa	있음
KP-N-RT-BM-1	있음
KP-N-YN	없음
NH-6	없음
NH-12	없음
TGW	없음

표 4에서 보는 바와 같이, 13종의 신경 세포 중에서 BoNT/A에 민감한 세포로 알려져 있는 SiMa 세포를 제외하고, Neuro-2a(N2a), 및 KP-N-RT-BM-1(K-BM1) 세포 만이 SNAP25 단백질의 절단된 형태가 검출 가능한 수준에 해당하는 것을 확인하였다.

1-2. BoNT/A에 민감한 세포 스크리닝

상기 1-1.과 동일한 조건으로 Neuro-2a, SiMa 및 KP-N-RT-BM-1 세포들을 각각 24웰 플레이트에 분주하였다. 그런 다음, 상기 1-1.과 동일한 과정으로 SNAP25 단백질의 절단 현상을 웨스턴 블랏팅 분석을 통해 확인하여, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이, Neuro-2a(N2a), SiMa 및 K-BM1(KP-N-RT-BM-1) 세포는 BoNT/A에 의해 SNAP25가 각각 33%, 66% 및 29% 절단되는 것을 확인하였다.

상기 결과를 기반으로 Neuro-2a는 클론 선택(clonal selection)을 위해 다음과 같은 이유로 계속하여 사용되었다. 첫째, 통상적으로 쥐의 치사율(즉, 쥐 LD50)에 의해 측정되는 BoNT/A의 생체 내 효능은 쥐의 세포에서 더욱 잘 나타낼 수 있다. 둘째, Neuro-2a는 쥐의 세포 이지만, KP-N-RT-BM-1은 인간 세포이며, Neuro-2a와 비교하여 KP-N-RT-BM-1은 현저하게 느린 속도로 자란다. 인간 신경 모세포종 세포인 SiMa 세포는 34 ~ 100 시간의 분열시간(doubling time)을 갖는다. 셋째, 현미경으로 관찰된 Neuro-2a 세포의 경우, 다양한 세포 유형의 혼합된 집단으로 확인된다. 따라서, BoNT/A에 민감성이 높은 세포가 이종의 Neruo-2a 세포 집단 내에 존재할 가능성이 있을 것으로 판단하였다.

실시예 2. BoNT/A에 민감한 클론 선택

상기 실시예 1에서 선별된 Neuro-2a 세포 집단 중에서 BoNT/A에 민감도가 높은 클론을 선별하는 과정을 수행하였다.

2-1. Neuro-2a 세포의 클론 배양(Clonal culture)

Neuro-2a 세포는 10%의 우태아혈청, 1Ⅹ비필수아미노산(1Ⅹnon-essential amino acid; 1ⅩNEAA), 1Ⅹ피루브산나트륨(sodium pyruvate), 1Ⅹ GlutaMAX^TM 및 1Ⅹ항생제 항균제(1Ⅹantibiotic antimycotic; 1ⅩAA)가 포함된 조건의 MEM 배양 배지에서 배양될 수 있도록 하였다.

세포의 컨플루언스(confluence)가 80 내지 90%가 되었을 때, 1ⅩTrypLE(Gibco^TM, 12604021, 미국)을 처리하여, 상기 세포가 단일 세포 현탁액이 되도록 하였다. 그런 다음, 트리판 블루(trypan blue) 및 헤모사이토미터(hemocytometer)를 사용하여 단일 세포의 생존 수를 측하고, 이를 기초로 단일 세포 현탁액을 1ml 당 10 세포수의 밀도로 희석하였다. 그런 다음, 96웰 플레이트에 희석된 단일 세포 현탁액을 100μl씩 넣었다. 현미경 검사를 통해 콜로니의 성장을 주기적으로 관찰하였다. 상기 단일 세포가 60%의 컨플루언스가 되었을 때, 상기와 동일한 방법으로 24웰 플레이트에 옮겼다. 24웰 플레이트에 옮겨진 세포 클론은 1/2로 균등하게 나누어 절반은 BoNT/A 중독에 대한 민감성 검사를 수행하였고, 나머지 절반은 액체질소동결기에 보관하였다.

상기 세포 클론의 BoNT/A 중독 검사를 위하여 총 672개의 세포 클론을 24웰 플레이트에서 7Ⅹ96웰 마이크로플레이트로 서브컬쳐(sub-cultured)하였다. 이튿날 상기 세포 클론의 배양 배지를 2mM L-알라닐-L-글루타민, 1ⅩB27, 1ⅩN2 및 1ⅩNEAA(분화 배지)가 포함된 RPMI 1640으로 교체하여 신경 분화를 유도하였다. 신경 분화를 유도한지 4일재 되는 때에, 최종 농도가 25μg/ml가 되도록 GT1b(1Ⅹ비중독 배지에 희석됨)를 상기 분화 배지에 첨가하고, 24시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 배지를 0.1nM의 BoNT/A가 포함되어 있는 중독 배지로 교체하고, 2일동안 추가로 배양하였다. 그런 다음, 상기 실시예 1에 기재되어 있는 방식과 동일하게 웨스턴 블랏팅 분석을 수행하여 SNAP25의 절단 정도를 확인하여 1차 클론 선택 과정을 수행하였다. 이와 같은 클론 선택 과정을 3번 반복하였으며, 각 클론 선택 과정에서 확인된 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 142개의 클론에 대하여 사소하게 수정되어 있는 알러간사의 SiMa 세포에 최적화된 상기 클론 선택 과정에 따라 BoNT/A에 대한 민감도를 테스트 하였다. 그 결과, 3번의 클론 선택 과정을 통해 부모 세포인 Neuro-2a에 비하여 19개의 양성 클론에서 BoNT/A에 대한 민감도가 현저하게 높은 것으로 확인되었다. 특히, 다수의 클론 선택 과정에서 선택된 양성 클론 중에서 42번 양성 클론만이, 부모 세포인 Neuro-2a에 비하여 BoNT/A에 대한 민감도가 현저하게 높은 현상을 지속적으로 보였다. 이러한 과정을 통해 최종적으로 선택된 42번 양성 클론을 Rust and Pollok, 2011 및 Sarntivijai et al., 2008에서 권장된 명명법에 따라 N2-42F로 명명하였다.

2-2. 동결건조된 세포의 회복(Recovery), 증식(Propagation) 및 저장

동결건조된 세포의 회복은 다음과 같은 과정을 통해 수행하였다.

저장되어 있는 극저온 저장 바이알을 액체질소동결기로부터 회수하고, 37℃의 항온 수조에서 부드럽게 교반하면서 2분 이내에 빠르게 녹였다. 70%의 에탄올을 이용하여 상기 바이알의 오염을 제거하고, 층류 조직 배양 후드에서 바이알의 상단 스크류를 열었다. 그런 다음, 사전에 데워 놓은 9ml의 완전한 배양 배지가 포함된 멸균된 15ml 튜브에, 상기 바이알의 내용물을 모두 옮겼다. 10분 동안 125Ⅹg의 조건에서 상기 15ml 튜브를 원심분리한 뒤, 흡입을 통해 상등액을 모두 제거하고, 2ml의 완전한 배양 배지를 넣고, 파이페팅을 부드럽게 하여 펠렛을 풀어줌으로써 세포를 재현탁하였다. 그런 다음, 25ml의 완전한 배양 배지가 포함되어 있는 상기 제조예 3의 방법에 의해 코팅된 T75 플라스크에 상기 세포의 재현탁액을 옮겨 넣고, 이를 CO₂ 배양기에서 37℃의 조건으로 배양하였다.

세포의 배양은 다음과 같이 수행하였다.

플라스크에 배양되어 있는 세포의 컨플루언스가 약 90%가 될 때, 흡입을 통해 배양 배지를 모두 제거하고, 1ⅩDPBS로 플라스크 내부를 한번 헹궜다. 그런 다음, 1ml의 0.25% 트립신-EDTA를 넣고, 37℃에서 5분간 배양한 뒤, 9ml의 완전한 배양 배지를 넣고 파이펫팅을 통하여 세포 덩어리를 분해하여 단일 세포 가 될 수 있도록 하였다. 상기 단일 세포 현탁액을 15ml 원추형의 튜브에 옮기고, 800Ⅹg의 조건으로 5분 동안 원심분리한 뒤, 흡입을 통해 상등액을 모두 제거하였다. 그런 다음, 상기 튜브에 10ml의 완전한 배양 배지를 넣고, 세포 펠렛을 재현탁 하였다. 헤파토사이토미터를 통해 세포의 생존 밀도를 확인한 뒤, 3ml의 세포 펠렛의 재현탁액을 새로운 T75 플라스크에 옮겼다. 이후 세포의 컨플루언스가 약 90%가 될 수 있도록 3일 동안 배양하였다.

세포 은행 구축을 위한 세포 동결은 다음과 같이 수행하였다.

2개 내지 8개의 T75 플라스크에 세포의 컨플루언스가 약 90%가 될 때까지 배양하였다. 세포가 후기 성장 단계(~2.0Ⅹ10⁷세포수/플라스크)에 도달하였을 때, 배양 배지를 흡입을 통해 제거하고, 상기 세포의 배양에서와 마찬가지로 트립신을 처리하여 단일 세포를 형성하고, 원심분리 한 뒤에 세포 펠렛이 동결 배지(완전한 배양 배지에 00%의 DMSO가 포함되어 있음)를 이용하여 5Ⅹ10⁶세포수/ml의 밀도로 재현탁될 수 있도록 하였다. 1ml의 상기 세포 재현탁액을 극저온 저장 바이알에 옮기고, 이를 이소프로판올이 채워진 냉동 용기에 옮겼다. 상기 냉동 용기는 -80℃에서 밤새도록 보관하고, 이튿날 극저온 저장 바이알만 꺼내 액체질소동결기에 보관하였다.

실시예 3. N2-42F 특성 및 배양 환경 확인

3-1. 분열시간(doubling time) 확인

상기 1-1.에서 SNAP25 단백질의 절단된 형태가 검출 가능한 것으로 확인된 Neuro-2a 세포 및 N2-42F의 분열시간을 확인하였다.

상기 세포 및 클론을 각각 6웰 플레이트에 한 웰당 1.5 Ⅹ10⁵세포수만큼 분주하고, 6일동안 매일 헤파토사이토미터 및 트리판 블루 염색을 통하여 총 생존 세포의 수를 계수하였다. 분열시간은 지수 성장 단계 동안 얻어진 살아있는 세포 수를 이용하여 아래의 식을 통해 계산하여, 그 결과를 아래 표 5 및 도 3에 나타내었다. 아래의 식 1에서 T는 배양 시간이고, Xe 및 Xb는 각각 배양 시간의 시작 및 마지막에서 계측된 세포의 수이다.

[식 1]

분열시간= T Ⅹ ln2/ln(Xe/Xb)

세포	분열시간 (시간)
Neuro-2a	24 ± 4.7
N2-42F	24 ± 2.9

상기 표 5 및 도 2에서 보는 바와 같이, 분열시간은 Neuro-2a의 경우 24 ± 4.7시간이었고, N2-42F의 경우 24 ± 2.9시간으로 유의미한 차이가 없는 것을 확인하였다.

3-2. 형태학(morphology)적 확인

알러간에 의해 SiMa를 부모 세포로 하여 BoNT/A에 민감한 클론인 H1의 분리가 보고되었다(Fernandez-Salas et al., 2012). 이와 같은 보고를 바탕으로 고찰해 보았을 때, Neruo-2a 세포와 마찬가지로 SiMa 세포 역시 혼합 세포의 유형의 이종 세포 집단인 반면, 상기 H1과 N2-42F와 같은 서브 클론의 경우에는 동종의 세포 타입으로 예상된다. 이에, N2-42F가 동종의 세포 타입인 것을 확인하기 위하여 부모 세포인 Neuro-2a와 N2-42F 및 SiMa 세포의 형태를 현미경으로 확인하여, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, 현미경 상에서 혼합 세포의 유형으로 예상되었던 Neuro-2a와 SiMa 세포는 모두 이질적인 형태를 나타내는 반면, N2-42F는 매우 균일한 형태를 나타내는 것을 확인하였다.

상기와 같은 결과를 통해, N2-42F는 Neuro-2a를 구성하고 있는 다양한 클론 중에서 동종의 세포 타입에 해당하는 단일 클론에 해당하는 것임을 알 수 있다.

3-3. 배양 환경 확인

BoNT/A 중독 실험에 최적화된 N2-42F의 배양 환경을 확인하기 위하여, 상기 제조예 3에의 방법으로 콜라겐 타입 IV, 젤라틴 및 폴리-D-라이신으로 코팅된 플레이트에서, N2-42F를 상기 [2-2]에 기재되어 있는 방법대로 배양하고, 배양된 형태를 현미경을 통해 측정하여, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 보는 바와 같이, 부모 Neuro-2a 세포의 경우 일반적으로 아무것도 코팅되어 있지 않은 플레이트에서 증식이 원활하게 일어나는 반면, N2-42F의 경우 원활한 증식을 위해 폴리-D-라이신으로 코팅되어 있는 플레이트를 선호하는 것을 확인하였다. 나아가, 코팅되어 있지 않는 플레이트(None), 콜라겐 타입 IV(Collagen IV) 및 젤라틴(Gelatin)의 경우에서는 N2-42F의 효율적인 성장에 적합하지 않았다. 특히, 폴리-D-라이신을 제외한 플레이트들에서는 N2-42F의 상태가 좋지 않았을 뿐만 아니라 플레이트에 느슨하게 부착되었다. 반면, 폴리-L-라이신이 코팅된 플레이트에서는 N2-42F가 고르게 분포되고 단단히 부착된 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 N2-42F는 폴리-D-라이신이 코팅된 플레이트 상에서 최적화된 배양 환경을 가지는 것을 알 수 있다. 따라서, N2-42F를 이용한 BoNT/A 중독 측정을 위해서는 폴리-D-라이신이 코팅된 플레이트를 본 발명에서 사용하였다.

실시예 4. N2-42F에서 BoNT/A에 의한 SNAP25의 절단 현상 확인

SiMa 세포를 대조군으로 사용하여, 폴리-D-라이신이 코팅된 96웰 플레이트에 배양된 N2-42F에 다양한 농도의 BoNT/A가 포함된 1Ⅹ 중독 배지를 넣고, N2-42F의 BoNT/A 민감도를 측정하였다.

구체적으로, 상기 조건으로 N2-42F를 4일 동안 배양한 뒤, 수득한 N2-42F에 50㎕의 1ⅩSDS 샘플 완충액을 처리하였다. 그런 다음, 상기 1-1.에 기재된 방법과 마찬가지로 웨스턴 블랏팅 분석을 수행하여, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이와 같은 실험 수행은 모두 3번씩 반복되었다.

도 6에서 보는 바와 같이, 0.93pM 또는 그 이하의 BoNT/A에 의한 내인성(Endogenous) SNAP25의 절단은 SiMa 세포 및 N2-42F 모두에서 미비한 수준으로 확인되었다. 2.78 ~ 25 pM의 BoNT/A가 처리되었을 때 SNAP25의 절단 정도가 N2-42F에서는 25 ~ 75%로 확인되었고, SiMa 세포에서는 33 ~ 75%로 확인되었다.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 N2-42F는 SiMa 세포만큼 BoNT/A에 민감하다는 것을 알 수 있다.

실시예 5. N2-42F의 계통 안정성 확인

세포를 기반으로 하는 분석 플랫폼으로서 사용되기 위해서 신경 세포의 계통 안정성은 매우 중요한 요소일 수 있다. 이에, N2-42F의 계통 안정성을 확인하였다.

N2-42F는 계속해서 다수의 계대로 배양되었다. 마스터 세포 은행을 준비하기 위해서는 초기 계대의 N2-42F를 사용하였으며, 상기 클론의 안정성이 유지될 수 있도록 5 계대 마다 액체질소동결기에 상기 2-2.에 기재된 바와 동일한 방법으로 보관하였다. 여기서, 5계대 및 15 계대에 보관된 N2-42F를 상기 2-2. 에 기재되어 있는 바 대로 회복한 뒤, 상기 N2-42F의 컨플루언스가 약 90%가 되는 때에 상기 실시예 4에 기재되어 있는 방식으로 BoNT/A에 대한 민감도를 검사하여, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이와 같은 실험 수행은 모두 3번씩 반복되었으며, 대조군으로 SiMa 세포를 사용하였다.

도 6에서 보는 바와 같이, BoNT/A에 의해 나타나는 SNAP25의 분열은 5 계대의 N2-42F(N2-42F(P5))에서 63%(6번 레인), 66%(7번 레인) 및 68%(8번 레인)이고, 15 계대의 N2-42F(N2-42F(P15))에서 63(6번 레인), 73%(7번 레인) 및 71%(8번 레인)인 것을 확인하였다.

상기와 같은 결과를 통해, 알러간에 의해 구축된 SiMa 세포의 H1 클론과 유사하게 부모 Neuro-2a로부터 얻어진 N2-42F에서 5계대 뿐만 아니라, 15계대에서도 BoNT/A에 민감도가 유지되는 것을 확인하였다. 따라서, N2-42F는 SiMa 세포의 H1 클론 다음으로 세포 기반 분석 플랫폼에 사용될 수 있는 매우 적절한 클론임을 알 수 있다.

실시예 6. N2-42F을 기반으로 하는 활성 결정을 위한 실험 과정

6-1. 실험 방법

96웰 플레이트를 상기 제조예 3에 기재된 방식으로 코팅하였다. 공기를 이용하여 코팅된 96웰 플레이트를 말리는 동안, 90%의 컨플루언스로 배양된 T75 플라스크로부터 얻은 N2-42F 세포를 이용하여, 5.5Ⅹ10⁵ 세포수/ml의 밀도로 총 7 ml의 현탁액을 제조하였다. 멸균된 버퍼 저장 용기에 상기 현탁액을 옮겨 담은 뒤, 멀티 채널 파이펫을 이용하여 100㎕씩 96웰 플레이트의 각 웰이 분주하고, CO₂배양기에서 잘 배양하였다. 이때, 가장자리 효과로부터 방해 받지 않기 위하여, 1ⅩAA 용액(1Ⅹ항생제 항균 용액 in 멸균된 ddH₂O)을 96웰 플레이트의 가장 가장자리 부분에 넣어주었다.

세포를 분주한 다음날, 멀티 채널 파이펫을 이용하여 96웰 플레이트에서 세포 배양 배지를 모두 제거하고, 100㎕의 RPMI 1640을 넣어 헹궈주었다. 그런 다음, 상기 제조예 2에서 제조된 BoNT/A 중독 배지를 각각의 96웰 플레이트에 처리한 뒤, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 4일 동안 배양하였다. 또한, 캡쳐 항체인 B4 IgG를 7ml의 양으로 준비한 뒤, 이를 50㎕씩 ELISA 플레이트에 나눠 담고 4℃에서 밤새도록 보관하였다.

측정을 위하여, 상기 96웰 플레이트에서 BoNT/A 중독 배지를 멀티 채널 파이펫을 이용하여 제거하고, 각각의 웰에 60㎕의 용해 완충액(pH 7.5, 20 mM HEPES, 1% Triton-100, 200mM NaCl, 1mEGTA 및 5mM EDTA가 포함되어 있으며, 사용하기 직전에 단백질 분해 억제제를 추가로 넣었음)을 처리한 뒤 500rpm의 속도로 4℃에서 20분 동안 흔들어 주었다. 이후, 각 웰에 포함되어 있는 용해 버퍼를 수득한 뒤, 4,000 rpm의 조건으로 4℃에서 20분 동안 원심분리하였다.

상기 ELISA 플레이트를 세척 완충액을 이용하여 3회 세척한 뒤, 300㎕의 블로킹 완충액을 각 웰에 넣고 상온에서 15분 동안 보관하였다. 상기 블로킹 완충액을 제거하고, 세척 완충액을 이용하여 2회 세척하였다. 그런 다음, 상기 96웰 플레이트에 존재하는 원심분리된 세포 상층액을 50㎕ 채취하여, ELISA 플레이트에 옮긴 뒤에 200rpm의 속도로 4℃에서 4시간 동안 배양하고, 세척 완충액을 이용하여 3회 세척하였다.

상기 ELISA 플레이트의 각 웰에 SNAP25₁₉₇을 검출하기 위에 이에 특이적인 항체를 50㎕씩 분주하고, 써모 쉐이커 인큐베이터(Thermo shaker incubator)를 이용하여 200rpm의 속도로 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 세척 버퍼를 이용하여 ELISA 플레이트를 3번 세척한 뒤에, ELISA 플레이트의 각 웰에 50㎕의 1-StepTMUltra TMB-ELISA를 넣고, 5분 뒤 50㎕ 2M 황산을 추가로 첨가하여 HRP 반응을 종결시켰다. HRP 반응 정도의 측정을 위해, 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 여기서, 상기 A₄₅₀에서의 값은 SNAP25₁₉₇의 상대적인 양을 나타낼 수 있다.

6-2. 표준 곡선의 작성 및 BoNT/A의 활성 결정 방법

0pM, 즉 BoN/A가 존재하지 않는 샌드위치 ELISA 플레이트에서 A₄₅₀ 값을 측정하여, 대조군의 평균 값을 도출하였다. 이렇게 측정된 대조군의 평균 값은 위의 6-1.에서 측정된 A₄₅₀에서의 값에서 빼주었으며, 정규화된 평균 시험 A₄₅₀ 값을 계산하였다. 그런 다음, Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA)을 사용하여 Y 축에 대한 정규화된 평균 A₄₅₀ 값을 X 축상의 BoNT/A의 역가에 대해 점으로 나타내었다. EC₅₀ 값을 산출할 때, 사용될 분석 방법(예를 들면, "분석", "비선형 회귀 (곡선 적합)"및 "S 자형 용량-반응")을 선택하였다. 이후, 상기 2-2.에서 제조된 BoNT/A 표준 참고 시료(스탁 C)를 기초로 0.1 ~ 0.93pM의 농도로 희석된 시료를 샌드위치 ELISA 플레이트에 넣고, 정규화된 평균 시험 A₄₅₀ 값을 측정하고 이를 통해 표준 곡선을 도출하였다. 이렇게 도출된 R2 값이 0.95 이상인 표준 곡선을 이용하여 측정하고자 하는 시료의 BoNT/A의 활성을 결정하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC13712BP

20181113

Claims

부모 신경 세포주인 Neuro-2a로부터 클론 선택(clonal selection)된 N2-42F(수탁번호: KCTC 13712BP) 세포주.
제 1항에 있어서,
상기 세포주는 보툴리눔 독소의 활성 결정 또는 보툴리눔 독소의 검출을 위한 것인, 세포주.
제 1항에 있어서,
상기 Neuro-2a 세포주는 수탁번호 KCTC AC28106인 것인, 세포주.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 세포주를 배양하는 단계;
상기 배양된 세포주에 보툴리눔 독소를 처리하는 단계; 및
상기 보툴리눔 독소가 처리된 세포주에서 보툴리놈 독소에 의한 민감도를 확인하는 단계;를 포함하는, 세포 기반 보툴리눔 독소의 활성 결정 방법.
제 4항에 있어서,
상기 세포주를 배양하는 단계에서, 상기 세포주의 배양은 폴리-D-라이신(Poly-D-lysine)이 코팅된 배양 플레이트에서 배양하는 것인, 세포 기반 보툴리눔 독소의 활성 결정 방법.
제 4항에 있어서,
상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 세로타입 A인 것인, 세포 기반 보툴리눔 독소의 활성 결정 방법.
제 4항에 있어서,
상기 보툴리눔 독소에 의한 민감도를 확인하는 단계는,
내인성(endogeneous) 신경 분비 단백질의 절단(Cleavage)을 측정하는 것인, 세포 기반 보툴리눔 독소의 활성 결정 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 세포주를 배양하는 단계;
상기 배양된 세포주에 목적하는 시료를 처리하는 단계; 및
상기 목적하는 시료가 처리된 세포주에서 보툴리놈 독소에 의한 민감도를 확인하는 단계;를 포함하는, 세포 기반 보툴리눔 독소의 검출 방법.
제 8항에 있어서,
상기 세포주를 배양하는 단계에서, 상기 세포주의 배양은 폴리-D-라이신이 코팅된 배양 플레이트에서 배양하는 것인, 세포 기반 보툴리눔 독소의 검출 방법.
제 8항에 있어서,
상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 세로타입 A인 것인, 세포 기반 보툴리눔 독소의 검출 방법.
제 8항에 있어서,
상기 보툴리눔 독소에 의한 민감도를 확인하는 단계는,
내인성 신경 분비 단백질의 절단을 측정하는 것인, 세포 기반 보툴리눔 독소의 검출 방법.