KR101896924B1

KR101896924B1 - 신규한 항암제

Info

Publication number: KR101896924B1
Application number: KR1020137013509A
Authority: KR
Inventors: 안토니 윌크 버지스; 프란체스카 워커; 케이스 제프리 왓슨; 헬렌 윗차드; 기욤 레슨
Original assignee: 더 월터 앤드 엘리자 홀 인스티튜트 오브 메디컬 리서치
Priority date: 2010-10-27
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2018-09-10
Also published as: CA2814120A1; US20160145243A1; KR20130141554A; JP6184866B2; PL2632916T3; EP2632916A1; ES2621932T3; AU2011320024A1; JP2017137323A; US20150045365A1; US20130261119A1; EP2632916B1; AU2011320024B2; EP2632916A4; JP2013540778A; CN103476769B; NZ609186A; CN103476769A; US9221799B2; HUE032522T2

Abstract

본 발명은 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체, 염 또는 프로드러그를 제공한다. 나아가, 화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체, 염 또는 프로드러그를 유효량으로 대상에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 나아가, 화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체, 염 또는 프로드러그 를 암 치료를 위한 약물 제조에 사용하는 용도를 제공한다. 또한, 추가적으로 본 발명은 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체, 염 또는 프로드러그를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

화학식 Ⅰ

Description

신규한 항암제{Novel anti-cancer agents}

본 발명은 대장암(colon cancer), 폐암(lung cancer), 뇌암(brain cancer) 및 유방암(breast cancer)과 같은 암의 치료에 유용한 화합물에 관한 것이다.

암은 전 세계적으로 죽음을 야기하는 주요 질병이다. 암의 치료의 주요한 방법은 항암제를 사용한 화학적 요법이다. 그러나, 화학적 요법을 사용한 암의 치료는 좀처럼 간단하지 않으며, 종래와는 다른 메카니즘 및 경로로 작용하는 새롭고, 개선된 항암제의 개발이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체, 염 또는 프로드러그를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체, 염 또는 프로드러그를 유효량으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 첨가제를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는데 있다.

첫 번째 관점에서, 본 발명은 화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체, 염 또는 프로드러그를 제공한다, 여기서:

[화학식 Ⅰ]

E 및 G는 서로 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬-, -NH-, -N(C₁ _- ₄알킬)-, -O- 및, 어느 방향으로든(in either orientation), -NH-C₁ _- ₄알킬-, -N(C₁ _- ₄알킬)-C₁ _- ₄알킬-, 및 -O-C₁ _-4알킬-로 이루어진 군으로 선택되고; 및

은 단일 또는 이중 결합이고;

이 단일 결합인 경우, K는 독립적으로 CH 및 N으로부터 선택되고, 및 J는 독립적으로 NH 및 CH₂로부터 선택되고; 또는

이 이중 결합인 경우, K는 C이고, 및 J은 독립적으로 N 및 CH로부터 선택되며;

R¹은 0-2개의 치환기이고, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬, -C₃ _- ₆사이클로알킬, -OH, -O-C₁ _- ₄알킬, -N(R⁴)₂, -C₁ _- ₄알킬N(R⁴)₂, -O-C₁ _- ₄알킬-N(R⁴)₂, -C₃ _-6사이클로알킬-N(R⁴)₂, -O-페닐, -O-벤질, -NO₂, 할로겐, 및 CF₃로 이루어진 군으로부터 선택되고;

각각의 R⁴는 독립적으로 -H, -OH, -C₁ _- ₄알킬, -C(O)OC_1- ₄알킬, -C₁ _- ₄알킬-OR⁷, 및 -C(O)R⁵로 이루어진 군으로부터 선택되며, 하나의 R⁴가 -OH인 경우, 나머지 R⁴는 -OH는 될 수 없으며; 또는

-N(R⁴)₂는 임의적으로 -C₁ _- ₄알킬로 치환된 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 몰폴리노기를 형성할 수 있으며;

R²는 0-2개의 치환기이고, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬, -C₃ _- ₆사이클로알킬, -OH, -O-C₁ _- ₄알킬, -N(R⁶)₂, -C₁ _- ₄알킬N(R⁶)₂, -O-C₁ _- ₄알킬-N(R⁶)₂, -C₃ _-6사이클로알킬-N(R⁶)₂, -O-페닐, -O-벤질, -NO₂, 할로겐, 및 -CF₃로 이루어진 군으로부터 선택되며;

각각의 R⁶는 독립적으로 -H, -OH, -C₁ _- ₄알킬, -C(O)OC_1- ₄알킬, -C₁ _- ₄알킬-OR⁷, 및 -C(O)R⁸로 이루어진 군으로부터 선택되고, 하나의 R⁶이 -OH인 경우, 나머지 R⁶은 -OH이 될 수 없으며; 또는

-N(R⁶)₂는 임의적으로 -C₁ _- ₄알킬로 치환된 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 또는 몰폴리노기를 형성할 수 있고;

여기서 각각의 R⁵ 및 R⁸은 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬 및 -페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R³은 H, -C₁ _- ₄알킬, 아릴, 및 알킬아릴로 이루어진 군으로부터 선택되며; 및

여기서 R⁷은 -H 및 -C₁ _- ₄알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.

두 번째 관점에서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체, 염 또는 프로드러그를 유효량으로 대상에게 투여함으로써 이루어지는 암의 치료방법을 제공한다.

세 번째 관점에서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체, 염 또는 프로드러그를 이용한 암 치료용 약물을 제공한다.

네 번째 관점에서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체, 염 또는 프로드러그 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 화학식 1의 화합물은 암 세포의 증식을 억제하는 효과가 우수하므로 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1: G2/M 억제제로 처리된 세포에 대한 안정화된 튜불린(tubulin) 대 용해된 튜불린(tubulin)의 결과. 담체, 탁솔 또는 화합물 3 (198-02)로 처리된 LIM1215 세포는 NP-40에 용해시켰다. 동일한 부피의 상등액 및 재부유된 불용성 물질은 SDS/PAGE에 의해 분석되었으며, β-튜불린(β-tubulin)에 대한 항체로 면역학적 도식화하였다.
도 2: "생체 외" 튜불린 ( tubulin ) 중합에 대한 본 발명의 화합물 효과.
완충용액 (A), 탁솔(Taxol)(B), 0.5mM 트리아진 (C) 또는 2mM 트리아진 (D), 을 첨가하기 전에 튜불린(tubulin) (IPES/MgCl₂/GTP 완충용액에 용해된 1mg/ml)은 캐리 50 분광기(Cary 50 spectrophotometer)의 시료 접시에서(cuvette) 평형을 유지시켰다 (행 방향). OD[340]는 30분 동안 5회 측정되었다.
도 3: 추출된 마우스 혈장의 대표적인 크로마토그램. A: HC 처리된 일반 마우스의 혈장. B: 표준 곡선용 화합물 2 (156-01) 및 HC가 처리된 일반 마우스의 플루즈마 표준 곡선. C: 화합물 2 (156-01) 주사 투여 2시간 후에 얻어진 혈장은 얻어진 화합물 2 (156-01) 피크 뿐만 아니라 다른 3종의 추정된 대사산물 피크를 나타낸다.
도 4: 추정된 대사산물 피크의 분광분석. A: 혈장 내 표준 화합물 2 (156-01) (점선) 및 투여된 마우스의 혈장 (실선)의 전반적인 크로마토그램 (overlaid chromatogram). B: 정제된 피크의 UV 스펙트럼
도 5: 화합물 2 주사 투여 후 마우스 혈장으로부터 얻은 대사산물의 항-유사분열 효과. BAF/3 세포는 각각의 재구성 피크의 양 증가와 함께 24시간 동안 배양되었다. 세포주기 분포는 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)를 사용한 FACS 분석을 통하여 평가되었다. 세포주기의 G2/M 단계에 있는 세포의 비율은 ModFi를 사용하여 측정되었다.
도 6: 50 mg / kg 의 단일 피하 투여된 마우스의 혈장 화합물 2 농도가 도시된 도표. 각 점은 개별의 마우스에 대응한다. A: 피크 1 수치의 계산된 농도에 대한 세미-로그 도표. B: 모든 대사산물 피크를 포함하는 수치에 대한 세미-로그 도표. C: 모든 피크와 피크 1만의 비교값 및 평균.
도 7: 누드 마우스에 대한 LIM2537 종양 성장. 종양 지름은 실험 시작 후 매 3일마다 외측용 캘리퍼스를 이용하여 측정하였으며, 종양 부피는 수학식: π/6 ×(L × W²)를 이용하여 계산되었다. 실험 시작 3일 후 일주일에 3회 15mg/kg로 담체 대조군으로 처리된 동물 (검정 곡선)과 화합물 2로 처리된 동물 (적색 곡선) 사이의 명확한 차이.
도 8: 누드 마우스에 대한 U87MG (Δ2-7) 종양 성장. 종양 지름은 실험 시작 후 매 3일마다 외측용 캘리퍼스를 이용하여 측정하였으며, 종양 부피는 수학식: π/6 ×(L × W²)를 이용하여 계산되었다. 실험 시작 5일 후 일주일에 3회 20mg/kg로 담체 대조군으로 처리된 동물 (검정 곡선)과 화합물 2로 처리된 동물 (적색 곡선) 사이의 명확한 차이.
도 9: 화합물 2("156-01" 표시)로 처리된 동물 (녹색 기둥)은 담체 대조군으로 처리된 동물 (적색 기둥)과 간 및 비장 무게에서 상당한 차이가 발견되지 않은 반면, 종양 무게는 현저히 줄어들었다.
도 10: 누드 마우스에 대한 H1437 종양 성장. 종양 지름은 실험 시작 후 매 3일마다 외측용 캘리퍼스를 이용하여 측정하였으며, 종양 부피는 수학식: π/6 ×(L × W²)를 이용하여 계산되었다. 실험 시작 5일 후 일주일에 3회 20mg/kg로 담체 대조군으로 처리된 동물 (검정 곡선)과 화합물 2로 처리된 동물 (적색 곡선) 사이의 명확한 차이.
도 11: 담체 대조군이 처리된 동물로부터 제거된 이종이식 종양 (상위 3행) 및 화합물 2가 처리된 (20mg/kg, 일주일에 3회) 동물로부터 제거된 아래쪽 행의 이종이식 종양의 사진. 크기면에서 분명한 차이를 볼 수 있다.

루세타 해면(Leucetta sponges)으로부터 추출된 이미다졸 알칼로이드인 나아미딘 A(Naamidine A)는 상피 세포 성장 인자(epidermal growth factor, EGF)의 신호경로를 선택적으로 억제하고, EGF 수용체를 과발현시킨 인간 암 세포주를 이종이식된 마우스의 종양 성장을 억제하는 것으로 보고된 바 있다(Copp et al., J.Med.Chem. 1998, 41:3909).

나아미딘 A

EGF-수용체-특정 저분자 억제제에 대한 연구에 있어서, 본 발명자들은 나아미딘 A 유사체를 합성하였으며, 이들의 생물학적 활성을 평가하였다.

놀랍게도, 본 발명자들은 세포증식억제 및/또는 세포독성 활성을 보이고, EGF 신호 경로를 통한 활성을 억제하는 나아이딘 A와 관련된 분자 종류를 확인하였다. 상기 종류의 트라이아진 화합물은 나노몰 농도 범위에서 항암활성을 갖는 항암제로서 가능성을 나타내었다.

따라서, 첫 번째 관점에서 본 발명은 화학식 Ⅰ의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 유도체, 염 또는 프로드러그를 제공한다, 여기서:

화학식 Ⅰ

E 및 G는 서로 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬-, -NH-, -N(C₁ _- ₄알킬)-, -O- 및, 어느 방향으로든(in either orientation), -NH-C₁ _- ₄알킬-, -N(C₁ _- ₄알킬)-C₁ _- ₄알킬-, 및 -O-C₁ _- ₄알킬-로 이루어진 군으로 선택되고; 및

은 단일 또는 이중 결합이고;

R¹은 0-2개의 치환기이고(0, 1, 또는 2의 치환기 또는 그 정수의 2가지 중 하나를 포함하는 범위를 의미), 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬, -C₃ _- ₆사이클로알킬, -OH, -O-C₁ _- ₄알킬, -N(R⁴)₂, -C₁ _- ₄알킬N(R⁴)₂, -O-C₁ _- ₄알킬-N(R⁴)₂, -C₃ _- ₆사이클로알킬-N(R⁴)₂, -O-페닐, -O-벤질, -NO₂, 할로겐, 및 -CF₃로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R²는 0-2개의 치환기이(0, 1, 또는 2의 치환기 또는 그 정수의 2가지 중 하나를 포함하는 범위를 의미)고, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬, -C₃ _- ₆사이클로알킬, -OH, -O-C₁ _- ₄알킬, -N(R⁶)₂, -C₁ _- ₄알킬N(R⁶)₂, -O-C₁ _- ₄알킬-N(R⁶)₂, -C₃ _- ₆사이클로알킬-N(R⁶)₂, -O-페닐, -O-벤질, -NO₂, 할로겐, 및 -CF₃로 이루어진 군으로부터 선택되며;

각각의 R⁶는 독립적으로 -H, -OH, -C₁ _- ₄알킬, -C(O)OC_1- ₄알킬, -C₁ _- ₄알킬-OR⁷, 및 -C(O)R⁸,로 이루어진 군으로부터 선택되고, 하나의 R⁶이 -OH인 경우, 나머지 R⁶은 -OH이 될 수 없으며; 또는

일실시예에 있어서,

은 단일 결합이고, (i) K은 CH이며, J은 NH이고, 또는 (ii) K은 N이고 및 J은 CH₂이다.

다른 실시예에 있어서,

은 이중 결합이고, K는 CH이며, J는 NH이다.

바람직하게는, R³은 수소, 메틸, 프로필, 부틸, 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일실시예에 있어서, E는 -NH-C₁ _- ₄알킬-, -N(C₁ _- ₄알킬)-C₁ _- ₄알킬-, 및 -O-C₁ _- ₄알킬-으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서, E의 헤테로 원자는 트리아진 고리와 결합된다.

일실시예에 있어서, G는 -NH-C₁ _- ₄알킬-, -N(C₁ _- ₄알킬)-C₁ _- ₄알킬-, 및 -O-C₁ _- ₄알킬-으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 G의 헤테로 원자는 트리아진 고리와 결합된다.

바람직하게는, E는 -NHC₁ _- ₄알킬이고, 더욱 바람직하게는 E는 -NH-CH₂-이다.

바람직하게는, G는 -NHC₁ _- ₄알킬이고, 더욱 바람직하게는 G는 -NH-CH₂-이다.

일실시예에 있어서, R¹은 하기 화학식의 -C₁ _- ₄알킬로 치환된 피페라지닐기를 형성하는 -N(R⁴)₂이고:

바람직하게는, R¹ 및 R²는 서로 독립적으로 1-2개의 치환기, 더욱 바람직하게는 R¹ 및 R²는 1개의 치환기이다.

일실시예에 있어서, 각각의 R¹ 및 R²는 적어도 하나의 파라-치환기이다.

바람직하게는, 각각의 R¹ 치환기는 독립적으로 -OH, -O-C₁ _- ₄알킬, 및 -C₁ _- ₄알킬으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는, 각각의 R¹ 치환기는 독립적으로 -OH, -OMe, 및 -CH₃으로 이루어진 군으로부터 선택되고,

바람직하게는, 각각의 R² 치환기는 독립적으로 -OH, O-C₁ _- ₄알킬, 및 -C₁ _- ₄알킬N(R⁶)₂.으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

더욱 바람직하게는, 각각의 R² 치환기는 독립적으로 -OH, -OMe, -CH₂NH₂, 및 -CH₂NH-C(O)O(t-Bu)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직한 실시예에 있어서, 본 발명은 화학식 Ⅱ의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체, 염 또는 프로드러그를 제공한다, 여기서:

화학식 Ⅱ

E 및 G는 서로 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬-, -NH-, -O- 및, 어느 방향으로든(in either orientation), -NH-C₁ _- ₄알킬-, 및 -O-C₁ _- ₄알킬-로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및

R¹은 0-2개의 치환기이며, 이때 각각의 치환기는 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬, -C₃ _- ₆사이클로알킬, -OH, -O-C₁ _- ₄알킬, -N(R⁴)₂, -C₁ _- ₄알킬N(R⁴)₂, -O-C₁ _- ₄알킬-N(R⁴)₂, -C₃ _- ₆사이클로알킬-N(R⁴)₂, -O-페닐, -O-벤질, -NO₂, 할로겐, 및 -CF₃으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

-N(R⁴)₂는 임의적으로 -C₁ _- ₄알킬로 치환된 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 몰폴리노기를 형성할 수 있고;

R²는 0-2개의 치환기이고, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬, -C₃ _- ₆사이클로알킬, -OH, -O-C₁ _- ₄알킬, -N(R⁶)₂, -C₁ _- ₄알킬N(R⁶)₂, -O-C₁ _- ₄알킬-N(R⁶)₂, -C₃ _- ₆사이클로알킬-N(R⁶)₂, -O-페닐, -O-벤질, -NO₂, 할로겐, 및 -CF₃로 이루어진 군으로부터 선택되며;

각각의 R⁶은 독립적으로 -H, -OH, -C₁ _- ₄알킬, -C(O)OC_1- ₄알킬, -C₁ _- ₄알킬-OR⁷, 및 -C(O)R⁸로 이루어진 군으로부터 선택되고, 하나의 R⁶가 -OH인 경우, 나머지 R⁶은 -OH이 될 수 없으며; 또는

-N(R⁶)₂는 임의적으로 -C₁ _- ₄알킬로 치환된 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 몰폴리노기를 형성할 수 있고;

여기서 R⁵ 및 R⁸은 서로 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬 및 -페닐로 이루어진 군으로부터 선택되며;

R³은 -H, -C₁ _- ₄알킬, 및 -아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;

여기서, R⁷은 -H 및 -C₁ _- ₄알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일실시예에 있어서, E는 -NH-C₁ _- ₄알킬-, -N(C₁ _- ₄알킬)-C₁ _- ₄알킬-, 및 -O-C₁ _- ₄알킬-로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 E의 헤테로 원자는 트리아진 고리에 결합된다.

일실시예에 있어서, G는 -NH-C_1-4알킬-, -N(C_1-4알킬)-C_1-4알킬-, 및 -O-C_1-4알킬-로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 G의 헤테로 원자는 트리아진 고리에 결합된다.

바람직하게는, E는 -NHC₁ _- ₄알킬이고, 더욱 바람직하게는, E는 -NH-CH₂-이다.

바람직하게는 G는 -NHC₁ _- ₄알킬이고, 더욱 바람직하게는, G는 -NH-CH₂-이다.

일실시예에 있어서, 본 발명은 화학식 Ⅱ의 화합물을 제공한다. 이때, R¹은 1-2 치환기이고, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬, -OH, -O-C₁ _- ₄알킬, 및 -C₁ _- ₄알킬NHR⁴로 이루어진 군으로부터 선택되며; 및 R²는 1-2 치환기이고, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬, -OH, -O-C₁ _- ₄알킬, 및 -C₁ _- ₄알킬NHR⁶로 이루어진 군으로부터 선택되며;

여기서 R⁴는 -H, -C₁ _- ₄알킬, -C(O)OC_1- ₄알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;

여기서 R⁶은 -H, -C₁ _- ₄알킬, -C(O)OC_1- ₄알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;

바람직하게는, 각각의 R¹ 치환기는 독립적으로 -OH, -OMe, -CH₃ 으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 및 각각의 R² 치환기는 독립적으로 -OH, -O-C₁ _- ₄알킬, -C₁ _- ₄알킬NHR⁶으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

여기서 R⁶은 -H, -C₁ _- ₄알킬, 및 -C(O)OC_1- ₄알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.

더욱 바람직하게는, R²는 -OH, -OMe, -CH₂NH₂, 및 -CHNH-C(O)O(t-Bu)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 일실시예에 있어서, 본 발명은 화학식 II의 화합물을 제공한다. 여기서 R³은 -H, 메틸, 프로필, 부틸 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일실시예에 있어서, R³은 직쇄 알킬이다.

일실시예에 있어서, 본 발명은 화학식 Ⅲ의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체, 염 또는 프로드러그를 제공한다, 여기서:

화학식 Ⅲ

E 및 G는 서로 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬-, -NH-, -O- 및, 어느 방향으로든(in either orientation), -NH-C₁ _- ₄알킬-, 및 -O-C₁ _- ₄알킬-로 이루어진 군으로 선택되고;

R¹은 0-2개의 치환기이고, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬, -C₃ _- ₆사이클로알킬, -OH, -O-C₁ _- ₄알킬, -N(R⁴)₂, -C₁ _- ₄알킬NHR⁴, , -O-C₁ _- ₄알킬-N(R⁴)₂, -C₃ _-6사이클로알킬-N(R⁴)₂, -O-페닐, -O-벤질, -NO₂, 할로겐, 및 -CF₃으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

여기서, 각각의 R⁴는 독립적으로 -H, -OH, C₁ _- ₄알킬, -C(O)OC_1- ₄알킬, -C₁ _- ₄알킬-OR⁷, 및 -C(O)R⁵로 이루어진 군으로부터 선택되고, 하나의 R⁴가 -OH인 경우 나머지 R⁴는 -OH는 될 수 없으며; 또는

R²는 0-2개의 치환기이고, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬, -C₃ _- ₆사이클로알킬, -OH, -O-C₁ _- ₄알킬, -N(R⁶)₂, -C₁ _- ₄알킬N(R⁶)₂, -O-C₁ _- ₄알킬-N(R⁶)₂, -C₃ _- ₆사이클로알킬-N(R⁶)₂, -O-페닐, -O-벤질, -NO₂, 할로겐, 및 -CF₃으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

각각의 R⁶은 독립적으로 -H, -OH, -C₁ _- ₄알킬, -C(O)OC_1- ₄알킬, -C₁ _- ₄알킬-OR⁷, 및 -C(O)R⁸로 이루어진 군으로부터 선택되고, 하나의 R⁶은 -OH인 경우 나머지 R⁶은 -OH이 될 수 없으며; 또는

-N(R⁶)₂는 임의적으로 -C₁ _- ₄알킬로 치환된 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 몰폴리노기를 형성할 수 있으며;

R³은 -H, -C₁ _- ₄알킬, 및 -아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및

일실시예에 있어서, E는 -NH-C₁ _- ₄알킬-, -N(C₁ _- ₄알킬)-C₁ _- ₄알킬-, 및 -O-C₁ _- ₄알킬-로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서, E의 헤테로 원자는 트리아진 고리와 결합된다.

일실시예에 있어서, G는 -NH-C₁ _- ₄알킬-, -N(C₁ _- ₄알킬)-C₁ _- ₄알킬-, 및 -O-C₁ _- ₄알킬-로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서, G의 헤테로 원자는 트리아진 고리와 결합된다.

바람직하게는 E는 -NHC₁ _- ₄알킬이고, 더욱 바람직하게는 E는 -NH-CH₂-이다.

바람직하게는 G는 -NHC₁ _- ₄알킬이고, 더욱 바람직하게는 G는 -NH-CH₂-이다.

일실시예에 있어서 본 발명은 화학식 Ⅲ의 화합물을 제공한다. 여기서, R¹는 1-2개의 치환기이고, 각각의 치환기는 독립적으로 -O-C₁ _- ₄알킬, 및 -C₁ _- ₄알킬N(R⁴)₂로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및 R²는 1-2개의 치환기이고, 각각의 치환기는 독립적으로 -O-C_1-4알킬, 및 -C₁ _- ₄알킬N(R⁶)₂으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

여기서, 각각의 R⁴는 독립적으로 -H, -C₁ _- ₄알킬, -C(O)OC_1- ₄알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;

여기서, 각각의 R⁶은 독립적으로 -H, -C₁ _- ₄알킬, -C(O)OC_1- ₄알킬으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

바람직하게는, R¹은 -OMe이고 R²는 -O-C₁ _- ₄알킬, 및 -C₁ _- ₄알킬N(R⁶)₂로 이루어진 군으로부터 선택되고;

여기서, 각각의 R⁶은 독립적으로 -H, -C₁ _- ₄알킬, 및 -C(O)OC_1- ₄알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.

더욱 바람직하게는, R²는 -OMe, -CH₂NH₂, 및 -CHNH-C(O)O(t-Bu)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직하게는, R³은 수소이다.

일실시예에 있어서, 본 발명은 화학식 Ⅳ의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체, 염 또는 프로드러그를 제공한다, 여기서:

화학식 Ⅳ

R¹은 0-2개의 치환기이고, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬, -C₃ _- ₆사이클로알킬, -OH, -O-C₁ _- ₄알킬, N(R⁴)₂, -C₁ _- ₄알킬NHR⁴, -O-C₁ _- ₄알킬-N(R⁴)₂, -O-C₁ _- ₄알킬-N(R⁴)₂, -C₃ _- ₆사이클로알킬-N(R⁴)₂, -O-페닐, -O-벤질, -NO₂, 할로겐, 및 -CF₃으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

여기서, 각각의 R⁴는 독립적으로 -H, -OH, C₁ _- ₄알킬, -C(O)OC_1- ₄알킬, -C₁ _- ₄알킬-OR⁷, 및 -C(O)R⁵로 이루어진 군으로부터 선택되고; 또는

R²는 0-2개의 치환기이고, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬, -C₃ _- ₆사이클로알킬, -OH, -O-C₁ _-4알킬, N(R⁶)₂, -C₁ _- ₄알킬N(R⁶)₂, -O-C₁ _- ₄알킬-N(R⁶)₂, -C₃ _- ₆사이클로알킬-N(R⁶)₂, -O-페닐, -O-벤질, -NO₂, 할로겐, 및 -CF₃으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

각각의 R⁶은 독립적으로 -H, -OH, -C₁ _- ₄알킬, -C(O)OC_1- ₄알킬, -C₁ _- ₄알킬-OR⁷, 및 -C(O)R⁸로 이루어진 군으로부터 선택되며, 하나의 R⁶이 -OH인 경우, 나머지 R⁶은 -OH이 될 수 없으며; 또는

여기서, 각각의 R⁵ 및 R⁸은 독립적으로 -C₁ _- ₄알킬 및 -페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고;

여기서, R⁷은 -H 및 -C₁ _- ₄알킬으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일실시예에 있어서, G는 -NH-C₁ _- ₄알킬-, -N(C₁ _- ₄알킬)-C₁ _- ₄알킬-, 및 -O-C₁ _- ₄알킬-로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 상기 G의 헤테로 원자는 트리아진 고리에 결합된다.

일실시예에 있어서, 본 발명은 화학식 Ⅳ의 화합물을 제공하며, 이때 R¹은 1-2 치환기이고, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -O-C₁ _- ₄알킬, 및 -C₁ _- ₄알킬N(R⁴)₂로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및 R²는 1-2개의 치환기이고, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -O-C_1-4알킬, 및 -C₁ _- ₄알킬N(R⁶)₂로 이루어진 군으로부터 선택되며;

여기서, 각각의 R⁶은 독립적으로 -H, -C₁ _- ₄알킬, -C(O)OC_1- ₄알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되며;

바람직하게는, R¹은 -OMe이고, R²는 -O-C₁ _- ₄알킬, 및 -C₁ _- ₄알킬N(R⁶)₂로 이루어진 군으로부터 선택되고;

또 다른 일실시예에 있어서, 본 발명은 화학식 Ⅳ의 화합물을 제공하며, 여기서 R³는 -H, 메틸, 프로필, 부틸 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, R³은 수소이다.

일실시예에 있어서, 본 발명은 다음의 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물을 제공한다:

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바람직하게는, 상기 화합물은 다음의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다:

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장(Chang) 등은 미오세버린(myoseverin)과 유사한 항증식 효과를 갖는 트리아진 화합물을 합성하였다 (US 2004/0122009). 장(Chang)의 화합물은 본 발명의 화합물과 구조적으로 분명한 차이가 있으며, 규모 순에 따른 암 세포주에 대한 낮은 항암 활성을 갖는다. 또한, 장(Chang) 등에 의해 기재된 화합물들은 본 발명의 화합물과 확연한 생물학적 활성 차이를 갖는다. 그들의 연구에 있어서, 장(Chang) 등이 개발한 그들의 화합물은 튜불린(tubulin) 중합 및 U937 인간 백혈병 세포 성장 억제에 대한 IC₅₀값과의 밀접한 연관관계를 나타냈다 (표 1, 25페이지 참고). 이와 대조적으로, 본 발명자들은 본 발명의 화합물들이 세포 증식 분석에서의 IC₅₀보다 1000배 우수한 튜불린(tubulin) 중합 활성 농도를 나타내는 것을 발견했다.

본 발명에 사용되는, "할로" 또는 "할로겐"이라는 용어는 플루오린(플루오로), 클로린(클로로), 브로민(브로모), 또는 아이오딘(아이오도)를 나타낸다.

본 발명에 사용되는, 단독 또는 NH(알킬) 또는 N(알킬)₂와 같은 화합물 내에서의 "알킬"이라는 용어는 1가의 직쇄 또는 측쇄 탄화수소기를 나타낸다. 예를 들면, 바람직한 알킬기는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 및 test-부틸이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

당업자에게 이해되는, "C₁ _- ₄알킬"은 1, 2, 3 또는 4 개의 탄소 원자 또는 그 정수의 두 가지 중 하나를 포함하는 범위의 직쇄 또는 측쇄 사슬을 나타낸다.

본 발명에 사용되는, "아릴"이라는 용어는 C₆-C₁₀의 방향족 탄화수소기를 나타내며, 예를 들면, 페닐 또는 나프탈렌이 있다.

본 발명에서 사용되는, "사이클로알킬"이라는 용어는 고리형 탄화수소기이다. 바람직한 사이클로알킬기로는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 및 사이클로헥실이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

당업자들에게 이해되는, "C₃ _- ₆사이클로알킬"이라는 용어는 3,4,5 또는 6 개의 탄소 원자 또는 그 정수의 두 가지 중 하나를 포함하는 범위의 사이클로알킬기를 나타낸다.

"알킬아릴"이라는 용어는 예를 들면, 벤질이 포함된다.

아민 질소는 바람직한 질소 보호기로 보호될 수 있다 (see "Protective Groups in Organic Synthesis" Theodora Greene 및 Peter Wuts, third edition, Wiley Interscience, 1999 참조).

화학식 I의 화합물의 염은 바람직하게는 약학적으로 허용 가능하나, 약학적으로 허용 가능한 염의 제조를 위한 전구체로서 유용할 수 있으므로 본 발명의 범위 내에서 비약학적으로 허용가능한 염 또한 인식될 수 있다.

"약학적으로 허용 가능한 유도체"라는 용어는 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물 또는 프로드러그, 또는 대상에 투여 시 다른 화합물이 포함될 수 있으며, 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 이의 항균 활성 대사물 또는 잔류물을 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공할 수 있다.

바람직한 약학적으로 허용 가능한 염은 염산, 황산, 인산, 질산, 탄산, 보론산, 설파믹산, 및 브롬산과 같은 약학적으로 허용 가능한 무기산, 또는 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 타르타르산, 말레익산, 하이드록시말레익산, 퓨마릭산, 말릭산, 시트르산, 락틱산, 젖산, 글루콘산, 벤조산, 숙신산, 옥살산, 페닐아세트산, 메탄설포닐산, 톨루엔설포닐산, 벤조설포닐산, 살리실산, 설파닐산, 아스파틱산, 글루타믹산, 에데트산, 스테아르산, 팔미트산, 올레산, 라우르산, 판토텐산, 탄닌산, 아스코르브산 및 발레르산과 같은 약학적으로 허용 가능한 유기산이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

염기 염은 소듐, 포타슘, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 아연, 암모니움; 알킬암모니움 (예를 들면, 트리에틸아민으로부터 형성되는 염) 및 알콕시암모니움 (예를 들면, 에탄올아민으로 형성되는 것)과 같은 약학적으로 허용 가능한 양이온이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 염기 염은 에틸렌다이아민, 클로린; 및 아미노산 (예를 들면, 아르기닌, 라이신 ㄸ또는 히스티딘)으로부터 형성되는 염을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 염 종류에 대한 일반적인 정보 및 이들의 제조방법은 당업자에게 알려져 있으며, "Hanbook of Pharmaceutical Salts" P.H.Stahl, C.G.Wermuth, 1^st edition, 2002, Wiley-VCH와 같은 일반적인 문헌에 기재되어 있다.

질소를 포함하는 염기기는 메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드와 같은 저가 알킬할라이드; 다이메틸 및 다이에틸 설페이트과 같은 다이알킬 설페이트; 및 다른 시약으로 4급화 될 수 있다

하이드록시기는 아세트산 및 2,2-다이메틸프로피온산과 같은 저가 알킬 카복실산을 포함하는 에스테르화, 메틸 설폰산과 같은 알킬 설폰산을 포함하는 설폰화 또는 글루쿠로니드 유도체(glucuronide derivatives)를 형성하기 위한 글루글리코실화 될 수 있다.

또한, 본 발명은 화학식 Ⅰ의 화합물 프로드러그를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 나아가, 본 발명은 화학식 Ⅰ의 화합물 프로드러그를 대상에게 투여하는 암의 예방 또는 치료방법을 포함한다. 유리 아미노, 아미도, 하이드록시 또는 카복실기를 포함하는 화학식 Ⅰ의 화합물은 프로드러그로 전환될 수 있다.

프로드러그는 화학식 Ⅰ 화합물의 유리 아미노, 하이드록시 및 카복실산과 공유결합 가능한 아미노산 잔기, 또는 2 이상의 폴리펩타이드 사슬 (예를 들면, 2, 3 또는 4)의 아미노산 잔기가 있는 화합물이 포함된다. 상기 아미노산 잔기는 일반적으로 3자 기호로 지정된 천연에 존재하는 20개의 아미노산이 포함되고, 또한 4-하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 데모신, 이소데모신, 3-메틸히스티딘, 노르브린, 베타-알라닌, 감마-아미노부티르산, 시트룰린, 호모시스테인, 호모세린, 오르니틴 및 메티오닌 설폰을 포함한다. 또한, 프로드러그는 프로드러그 곁사슬인 카보닐 탄소를 통하여 화학식 Ⅰ의 상기 치환기와 공유결합 가능한 카보네이트, 카바메이트, 아마이드 및 알킬 에스테르가 있는 화합물이 포함된다. 나아가, 프로드러그는 화학식 Ⅰ 화합물의 유리 하이드록시와 결합된 포스포러스-산소를 통한 일련의 화학식 Ⅰ 화합물의 포스페이트 유도체(예를 들면, 산, 산 염, 또는 에스테르) 를 포함한다.

또한, 화학식 Ⅰ 화합물은 비대칭 중심을 가질 수 있으며, 그로 인하여 1 이상의 입체이성질체 형태가 존재할 수 있는 것으로 인식될 수 있다. 나아가, 본 발명은 예를 들면, 약 90% ee 보다 큰, 약 95% 또는 97% ee과 같은, 또는 99% ee 보다 큰 혼합물, 이의 라세믹 혼합물과 같은 1 이상의 비대칭 중심에 대하여 대체로 순수한 이성질체 구조의 화합물에 관한 것이다.

이러한 이성질체는 예를 들면, 키랄 중간체, 또는 키랄 분리에 의한 비대칭 합성에 의해 제조될 수 있다.

일실시예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체, 염 또는 프로드러그를 유효량으로 대상에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.

다른 일실시예에 있어서, 본 발명은 암 치료를 위한 약물의 제조에 대한 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.

또 다른 일실시예에 있어서, 본 발명은 암 치료용 화합물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 암은 대장암(coln cancer), 비소 폐암(non-small lung cancer), 뇌암(brain cancer) 또는 유방암(breast cancer)이다.

본 발명자들은 본 발명의 트리아진이 최적의 농도에서 G2/M 억제를 적어도 탁솔(Taxol)보다 효과적으로 유도하는 것을 발견하였다. 그러나, 탁솔(Taxol)은 튜불린(tubulin) 중합을 안정화하는 역할을 수행하는 반면, 추가실험은 트리아진이 튜불린(tubulin)의 중합을 유도를 최소화하고, 유사분열 억제제로서 그들의 약효를 현저히 초과하여 발휘되었다.

그러므로, 일실시예에 있어서 상기 암은 예를 들면, 파클리탁셀(paclitaxel), 도시탁셀(docetaxel) 및 카바지탁셀(carbazitaxel)과 같은 탁산(taxane)에 대하여 내성이 있다.

일실시예에 있어서. 상기 암은 세포 분열 억제제에 대하여 내성이 있으며, 여기서 세포 분열 억제제는 직접적으로 튜불린의 조립 및 분해를 방해한다.

일실시예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 첨가제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 조성물은 하기에 기재된 것과 같이 다른 약학적 시약을 포함할 수 있으며, 당분야에서 잘 알려진 제형과 같은 기술에 따라 원하는 투여방식에 적절한 형태의 예를 들면 통상적인 고체 또는 액체 전달체 또는 희석제와 같은 약학적 첨가제를 사용하여 정제될 수 있다.

본 발명의 화합물은 예를 들면, 비경구적으로 피하(subcutaneous), 정맥(intravenous), 근육 내(intramuscular), 또는 낭내(intracisternal) 투여 또는 주입법 (예를 들면, 멸균된 주사용 수용액 또는 비-수용액 또는 현탁액)과 같은 적절한 방법에 의하여 투여될 수 있다.

약학적 제형은 구강(oral) (볼 밑 및 혀 밑 포함), 직장(rectal), 비강(nasal), 국부(topical), 질 내(vaginal), 또는 비경구 투여 (근육 내, 피하 및 정맥 내 포함) 또는 흡입법(inhalation) 또는 흡입(insufflation)에 의한 투여를 위한 적절한 형태를 포함한다.

본 발명의 화합물은 통상적인 보조제(adjuvant), 담체 또는 희석제와 함께, 약학적 조성물의 형태를 이룰 수 있으며, 이의 유닛(unit)은 복용되고, 이들의 형태는 경구투여 가능한 고체상으로서의 정제 또는 캡슐제, 또는 용액으로서의 액상, 현탁액, 에멀젼, 엘릭시르제(elixirs) 또는 동일하게 채워진 캡슐제, 직장 투여를 위한 좌약; 또는 비경구 투여를 위한 멸균 주사용 액제 (피하 투여 포함)를 사용하여 형성될 수 있다.

아울러, 인간과 같은 영장류뿐만 아니라, 다양한 다른 포유류도 본 발명의 방법으로 치료될 수 있다. 예를 들어, 소(cows), 양(sheep), 염소(goats), 말(horses), 개(dogs), 고양이(cats), 기니피그(guinea pigs), 쥐(rats) 또는 다른 소 과(bovine), 양 과(ovine), 말 과(equine), 개 과(canine), 고양이 과(feline), 설치류(rodent) 또는 쥐과(murine) 종을 포함하는 포유류에 치료 가능하나 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나, 본 방법은 또한 조류 (예를 들면, 닭)와 같은 다른 종에 대해서도 실시될 수 있다.

상기 방법의 치료 대상은 소(cows), 양(sheep), 염소(goats), 말(horses), 개(dogs), 고양이(cats), 기니피그(guinea pigs), 쥐(rats) 또는 다른 소 과(bovine), 양 과(ovine), 말 과(equine), 개 과(canine), 고양이 과(feline), 설치류(rodent) 또는 쥐과(murine) 종을 포함하는 포유류이나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 남성 또는 여성의 인간이다.

"유효량"이라는 용어는 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해서 수행되고 있는 조직, 기관, 동물 또는 사람의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도할 대상 성분의 양을 의미한다.

당업자에 의해 이해되는 암 치료에 있어서, "치료"라는 용어는 반드시 암이 완치되는 것을 의미하는 것은 아니다. "치료"라는 용어는 암 세포의 복제 억제 및/또는 치료받고 있는 대상의 종양 크기의 감소를 포함한다.

본 발명에서 사용되는 "조성물"이라는 용어는 직접 또는 간접적으로 특정 양의 특정 성분의 조합으로부터 초래된 생성물뿐만 아니라, 특정 양의 특정 성분을 포함하는 생성물을 포괄하는 것이다. "약학적으로 허용 가능한" 것으로 의미되는 담체, 희석제 또는 첨가제는 다른 성분과 호환 가능하고, 이로 인하여 투여 대상에게 유해하지는 않다.

"투여의" 및/또는 "투여"라는 용어는 치료를 필요로 하는 개인에게 본 바렴의 화합물을 제공하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 화합물 투여를 위한 약학적 조성물은 편리하게 복용 단위(unit) 형태로 제시될 수 있으며, 약학분야에서 잘 알려진 방법 중 하나에 의해서 제조될 수 있다. 모든 방법은 1 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 활성성분을 혼합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 약학적 조성물은 균일하고 직접적으로 활성성분과 액상담체 또는 입자가 고운 고형 담체 또는 상기 둘과 함께 혼합하여 제조되며, 다음으로 필요한 경우 원하는 제형의 생성물을 형성하여 제조된다. 약학적 조성물에 있어서, 활성 목적 화합물은 질환의 과정 또는 상태에 대하여 원하는 효과를 유발하기에 충분한 양이 포함된다. 본 발명에서 사용되는 "조성물"이라는 용어는 직접 또는 간접적으로 특정 양의 특정 성분의 조합으로부터 초래된 생성물뿐만 아니라, 특정 양의 특정 성분을 포함하는 생성물을 포괄하는 것이다.

상기 약학적 조성물은 멸균 주사용 액제 또는 유질의 현탁액(oleagenous suspension)의 형태가 될 수 있다. 상기 현탁액은 적절한 분산제 또는 습윤제 및 상술된 현탁제를 사용하여 당분야에서 알려진 기술에 따라 제조될 수 있다. 또한, 상기 멸균 주사제의 제조는 1,3-부탄 다이올에 용해된 용액과 같은 무독성의 비경구-허용 가능한 희석제 또는 용제에 용해된 멸균된 주사용 용액 또는 현탁액을 사용할 수 있다. 사용 가능한 담체 및 용제로는 물, 링거 용액(Ringer's solution) 및 제일생리식염수(isotonic sodium chloride solution) 등이 사용될 수 있다. 아울러, 멸균, 비휘발성 오일(fixed oil)은 통상적으로 용제 또는 현탁 매체로 사용될 수 있다. 상기 목적을 위하여 사용되는 비휘발성 오일은 합성 모노- 또는 다이글리세라이드를 포함하여 사용될 수 있다. 더욱이, 올레인산과 같은 지방산은 주사제의 제조에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물 및 방법은 상술된 병리학적 조건의 치료에 적용되는 다른 약학적으로 활성을 갖는 화합물을 포함할 수 있다. 조합 치료에 사용하기 위한 적절한 치료제의 선택은 통상적인 약학적 이론에 따른 당분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 수행될 수 있다. 치료제의 조합은 상술된 다양한 질환의 예방 또는 치료 효과와 상승작용할 수 있다. 상기 방법의 사용에 따라 각각의 치료제의 적은 복용량으로 치료 효과를 얻을 수 있으며, 부장용의 가능성을 감소시킬 수 있다.

다른 치료제를 본 발명의 화합물과 조합하여 사용할 경우, 상기 화합물은 예를 들면, 의사에 의한 처방전(Physician Desk Reference, PDR) 또는 당업자에 의해 결정된 양으로 사용될 수 있다.

암 세포의 복제 억제 및/또는 종양 크기 감소에 요구되는 치료 또는 예방 조건에 있어서, 적절한 복용수준은 일반적으로 1회 또는 중복 투여될 수 있는 환자의 체중 당 0.01 내지 500 mg/kg이다. 바람직하게는, 복용량은 1일 당 약 0.1 내지 250 mg/kg이고; 더욱 바람직하게는, 1일 당 약 0.5 내지 100 mg/kg이다. 바람직한 복용수준은 1일당 약 0.01 내지 250 mg/kg, 1일당 약 0.05 내지 100 mg/kg, 또는 1일당 약 0.1 내지 50 mg/kg일 수 있다. 상기 범위 내에서 복용량은 1일당 0.05 내지 0.5, 0.5 내지 5 또는 5 내지 50 mg/kg일 수 있다. 경구 투여의 경우, 바람직하게는 약학적 조성물은 1.0 내지 1000 mg의 활성성분을 포함하는 정제 형태로 제공되며, 특히 증상 조절을 위한 1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0, 400.0, 500.0, 600.0, 750.0, 800.0, 900.0, 및 1000.0 mg의 활성성분 복용량을 환자에서 처방할 수 있다. 본 화합물은 1일 당 1 내지 4회 처방될 수 있으며, 바람직하게는 1일당 1회 또는 2회 처방될 수 있다.

그러나, 특정 용량 수준 및 특정 환자에 대한 복용 횟수는 변경될 수 있으며, 사용되는 특정 화합물의 활성도, 대사 안정성 및 화합물의 활성기간, 환자의 나이 체중, 일반적인 건강, 성별, 다이어트, 투여 형태 및 시간, 배설 속도, 약물 조합, 치료받고 있는 특정 대상 및 특정 조건의 심각도를 포함하는 다양한 요인에 따라 달라진다.

본 명세서의 "포함되다", 또는 "포함되다" 또는 "포함되는"과 같은 변형된 용어는, 명시된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹(group)을 포함하나, 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹(group)의 배제를 의미하는 것은 아닌 것으로 이해될 수 있다.

문서, 수단, 물질, 장치, 물품 또는 본 명세서에 포함되는 것 등의 논의는 본 발명의 각 청구항의 우선일 이전에 존재하는 선행자료의 일부 또는 본 발명의 관련분야에서 보통 일반적으로 알려진 지식을 형성하는 일부 또는 전부의 문제를 해결할 수는 없다.

본 발명의 유형은 이에 따른 바람직한 형태로서 보다 분명하게 이해되기 위하여 실시예로 참고로서 다음에 설명하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 합성화학

빠르고, 수율이 높은 합성 프로토콜은 트라진으로 치환된 유도체를 생성하기 위하여 1,3,5-트리아진 골격을 개량하여 개발되었다.

실시예 1.1 - 1-[4,6- 비스 -(4- 메톡시벤질아미노 )-{1,3,5}- 트리아진 -2-일-아미노]- 이미다졸리딘 -2,4- 다이온의 제조를 위한 합성방법 ( 화합물 1 )

단계 A 1-(4,6-다이클로로-[1,3,5]-트리아진-2-일-아미노)-이미다졸리딘-2,4-다이온의 제조

아세토니트릴 (5mL)에 용해되고, 얼음물로 냉각된 1-아미노히단토인 염산염 (457mg, 3.0mmol), 시아누르산 염화물(시아누르산 염화물, 500mg, 2.73mmol) 및 소듐 바이카보네이트 (505mg, 6mmol)를 질소 존재하에서 2시간 동안 교반하고, 상온에서 20시간 동안 추가 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 감압건조시키고, 잔류물을 에틸아세테이트로 추출한 후, 추출된 에틸아세테이트를 분리하고 건조시켰다(MgSO₄). 상기 혼합 생성물 (770mg)을 얇은 막 크로마토그래피에서 단일 스팟으로 확인되었으며[실리카; CH₂Cl₂/MeOH (10:1)], 별도의 정제없이 다음 단계에 사용하였다.

¹H NMR (CD₃CN): δ= 4.11 (s, 2H); 8.71 (s, 1H); 8.85 (s, 1H).

단계 B 1-[4,6-비스-(4-메톡시벤질아미노)-{1,3,5}-트리아진-2-일-아미노]-이미다졸리딘-2,4-다이온 (화합물 1)

아세토니트릴 (20mL)에 용해된 1-(4,6-다이클로로-[1,3,5]-트리아진-2-일-아미노)-이미다졸리딘-2,4-다이온 (770mg, 2.93mmol) 및 포타슘 카보네이트 (2.42g, 17.6mmol) 현탁액을 상온에서 교반하면서 4-메톡시벤질아민 (0.96mL, 7.32mmol)을 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 질소 존재 하에서 상온에서 24시간 동안 교반한 후, 감압하여 용매를 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 에틸 아세테이트를 건조한 후(MgSO₄), 용매를 증발시켰다. 얻어진 상기 혼합 생성물을 용리액으로서 CH₂Cl₂/MeOH (50:1 → 10:1)을 사용하여 실리카 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 생성물은 무색의 고체로 분리되었다 (587mg, 43%).

¹H NMR (d₆ DMSO): δ = 3.67 (s, 6H); 3.96 및 4.05 (2s, 총 2H); 4.20 및 4.32 (2s, total 4H); 6.80 (bs, 4H); 7.13-7.39 (m, 6H); 8.67, 8.85 및 8.99 (2s, total 1H); 11.0 (bs, 1H). 분자량 (ES+) 465 (M+H).

실시예 1.2 - 1-[4-(4- 아미노메틸 - 벤질아미노 )-6-(4- 메톡시벤질아미노 )-{1,3,5}-트리아진-2-일-아미노]- 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 염산염의 제조를 위한 합성방법 ( 화합물 2 )

단계 A 1-[4-클로로-6-(4-N-Boc-아미노메틸)-벤질아미노-{1,3,5}-트리아진-2-일-아미노]-이미다졸리딘-2,4-다이온의 제조

무수 다이메틸포름아미드 (다이메틸포름아마이드, 10 mL)에 용해된 1-(4,6-다이클로로-[1,3,5]-트리아진-2-일-아미노)-이미다졸리딘-2,4-다이온 (실시예 1.1, 단계 A)(590mg, 2.24mmol) 및 포타슘 카보네이트 (681mg, 4.94mmol) 현탁액을 교반하면서 4-(N-Boc-아미노메틸)-벤질아민 (582mg, 2.47mmol)을 적가하였다. 상기 혼합물을 상온에서 20시간 동안 교반한 후, 혼합물에 물 및 에틸 아세테이트를 부었다. 생성된 에멀젼을 여과하고, 유기층을 층분리하였다. 층분리된 유기층을 건조시키고 용매를 증발시켜 황색 고체의 상기 혼합 생성물을 얻었다 (576mg, 55%).

분자량 (ESI+): 946 (2M+Na), 924 (2M+H).

단계 B 1-[4-(4-아미노메틸-벤질아미노)-6-(4-메톡시벤질아미노)-{1,3,5}-트리아진-2-일-아미노]-이미다졸리딘-2,4-다이온 염산염의 제조 (화합물 2)

다이메틸포름아미드 (다이메틸포름아마이드, 5mL)에 용해된 1-[4-클로로-6-(4-N-Boc-아미노메틸)-벤질아미노-{1,3,5}-트리아진-2-일-아미노]-이미다졸리딘-2,4-다이온 (실시예 1.2, 단계 A) (200mg, 0.43mmol) 및 포타슘 카보네이트 (131mg, 0.95mmol) 현탁액을 교반하면서 4-메톡시벤질아민 (0.06mL, 0.48mmol)을 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 35℃에서 18시간 동안 교반하고, 물을 붓은 후 에틸 아세테이트로 추출하였다. 생성된 에멀젼을 여과하고, 에틸 아세테이트 층을 층분리하였다. 층분리된 유기층의 용매를 증발시켜 오일 형태 잔류물로서 N-Boc 생성물을 얻었다 (90mg, 37%). 분자량 (ESI+): 1127 (2M+H), 564 (M+H). 상기 N-Boc 화합물 (90mg)을 다이클로로메탄.트리플루오로아세트산 (1:1, 3mL)에 용해시키고, 질소 존재하에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 용매 및 과량의 트리플루오로아세트산(TFA)을 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 메탄올 (5mL)에 용해시킨 다음, 다이에틸 에테르에 용해된 염산 용액(0.08mL, 2M 용액)으로 처리하였다. 상기 메탄올을 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 메탄올/아세토니트릴로 재결정하여 어두운 백색 고체 (off-white solid)의 혼합된 염산염을 얻었다 (49mg, 62%).

¹H NMR (d₆ DMSO): δ = 3.72 (s, 3H); 3.96-4.12 (m, 6H); 4.32-4.52 (m, 4H); 6.84 (brs, 2H); 7.16-7.51 (m, 6H); 8.4 및 8.5 (brd, 6H); 11.3 (s, 1H). 분자량 (ES+): 464 (M+H).

실시예 1.3 - 트리아진 - 이미다졸리딘 - 다이온의 제조를 위한 합성방법

5-[4,6-비스-(4-메톡시-벤질아미노)-[1,3,5]-트리아진-2-일아미노]-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온의 제조 (화합물 3)

단계 A 1-메틸-이미다졸리딘-2,4,5-트리온의 제조

무수 테트라하이드로퓨란 (6mL)에 용해되고, 얼음물로 냉각된 1-메틸우레아 (200 mg, 2.70 mmol) 용액에 질소 존재 하에서 옥살일 클로라이드 (0.26 mL, 2.97 mmol)를 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 0-5℃에서 2시간 동안 교반한 후, 물에 희석시키기 전에 1시간 동안 상온으로 승온하였다. 상기 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 추출물을 물로 세척한 후, 건조시키고 용매를 증발시켜 어두운 백색 고체 (off-white solid)의 생성물을 얻었다 (326 mg, 94%).

mp 146-149℃ (lit.145-148℃).

단계 B 5-벤질아미노-3-메틸-이미다졸-2,4-다이온의 제조

클로로포름 (13 mL)에 용해된 1-메틸-이미다졸리딘-2,4,5-트리온 (실시예 1.3, 단계 A) (800 mg, 6.25 mmol), 이미다졸 (467 mg, 6.87 mmol), N,N-다이메틸아미노피리딘 (촉매) 및 트리에틸아민 (1.82 mL, 13.1 mmol) 용액에 상온, 질소 분위기 하에서 클로로트리메틸실란 (1.67 mL, 13.1 mmol)을 적가한 후, 2시간 동안 교반하였다. 벤질아민 (0.75 mL, 6.87 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 22.5시간 동안 추가 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 클로로포름으로 묽히고, 추출한 후, 건조시키고 용매를 증발시켰다. 상기 혼합 생성물을 컬럼 크로마토그래피 (PS, 용리액은 DCM:EtOAc 3:1)로 정제하여 무색 고체의 생성물을 얻었다 (838 mg, 62%).

mp 152-154℃. δ_H (300 MHz, CD₃CN) 7.95 (v br s, 1H, NH), 7.41-7.27 (m, 5H, PhH), 4.64 (s, 2H, CH₂), 2.95 (s, 3H, CH₃). 분자량 (ESI) m/z 218 (M+H).

단계 C 5-아미노-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온의 제조

에탄올/에틸 아세테이트 (50 mL, 1:1)에 용해된 5-벤질아미노-3-메틸-이미다졸-2,4-다이온 (실시예 1.3, 단계 B) (400 mg, 1.84 mmol) 용액에 10% Pd/C 촉매 (195 mg, 0.18 mmol)를 첨가하였다. 상기 플라스크를 진공처리 시키고, 수소 가스를 채우는 것을 3회 수행한 후 상온에서 23시간 동안 교반하였다. 이 시간이 지난 후 상기 반응 혼합물을 셀라이트 여과하고, 여과물의 용매를 증발시켜 무색 고체의 생성물을 얻었다 (214 mg, 90%).

mp 122-125℃. δ_H (300 MHz, CD₃CN) 6.31 (br s, 1H, NH), 4.68 (d, J 1.5 Hz, 1H, CH), 2.87 (s, 3H, CH₃). d_H (300 MHz, D₂O) 4.95 (s, 1H, CH), 2.96 (s, 3H, CH₃). δ_C (75 MHz, D₂O) 175.6, 158.5, 64.0 (CH), 24.3 (CH₃).

단계 D 5-(4,6-다이클로로-[1,3,5]트리아진-2-일아미노)-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온의 제조

아세토니트릴 (15 mL)에 용해되고 얼음물에 냉각된 5-아미노-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온 (실시예 1.3, 단계 C) (266 mg, 2.06 mmol), 시아누르산 염화물 (415 mg, 2.27 mmol) 및 소듐 바이카보네이트 (191 mg, 2.27 mmol) 현탁액에 얼음탕, 질소 분위기 하에서 1시간 동안 교반하고, 상온으로 승온하여 22시간 동안 추가 교반하였다. 상기 반응 용매를 증발시키고, 혼합 생성물을 컬럼 크로마토그래피 (PS, 용리액은 DCM:EtOAc 1:1)은 크림색 고체의 생성물을 얻었다 (448 mg, 78%).

δ_H (300 MHz, CD₃CN) 7.50 (br s, 1H, NH), 6.56 (br s, 1H, NH), 5.60 (dd, J 7.8, 1.8 Hz, 1H, CH), 2.97 (s, 3H, CH₃). 분자량 (ESI) m/z 259 [M+H (OH의 Cl로의 교환이온)].

단계 E 5-[4,6-비스-(4-메톡시-벤질아미노)-[1,3,5]-트리아진-2-일아미노]-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온 (화합물 3)의 제조

아세토니트릴 (15 mL)에 용해된 5-(4,6-다이클로로-[1,3,5]트리아진-2-일아미노)-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온 (실시예 1.3, 단계 D) (193 mg, 0.70 mmol) 및 포타슘 카보네이트 (212 mg, 1.53 mmol) 현탁액에 5℃에서 4-메톡시벤질아민 (0.10 mL, 0.77 mmol)을 적가하였다. 상기 현탁엑을 얼음 온도(ice temperature)에서 1시간 동안 교반하고, 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 상기 혼합 생성물은 다이클로로메탄:에틸 아세테이트 (10:1)으로 시작하여 5:1 그리고 마지막에는 다이클로로메탄:메탄올 (20:1) 용리액을 적용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 상기 초기 분획으로부터 단일 치환된 5-[4-클로로-6-(4-메톡시-벤질아미노)-[1,3,5]-트리아진-2-일아미노]-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온 (133 mg, 51%) 중간체를 생성하였고, 이후 분획으로부터 다이-벤질아미노 생성물을 얻었다 (112 mg, 34%). (Found: C, 55.46; H, 4.66; N, 18.39%. C₂₁H₂₀N₆O₆ requires C, 55.75; H, 4.46; N, 18.58). δ_H (300 MHz, CD₃CN): 7.19 (br d, 4H, Ar), 6.84 (br d, 4H, Ar), 6.35 (br s, 1H, NH), 5.9-5.8 (br, 3H, NH), 5.46 (br d, 1H, CH), 4.36 (s, 4H, CH₂), 3.74 (s, 6H, OMe), 2.9-2.8 (br, 3H, NMe). 분자량 (ESI) m/z 479 [M+H].

실시예 1.4 - 5-[4-(4- 아미노메틸 - 벤질아미노 )-6-(4- 메톡시벤질아미노 )-[1,3,5]-트리아진-2- 일아미노 ]-3- 메틸 - 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 4 )의 제조

단계 A 5-[4-클로로-6-(N-Boc-{4-아미노메틸}-벤질아미노)-[1,3,5]-트리아진-2-일 아미노]-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온

다이메틸포름아마이드 (5 mL)에 용해된 5-(4,6-다이클로로-[1,3,5]트리아진-2-일아미노)-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온 (실시예 1.3, 단계 D) (300 mg, 1.08 mmol) 및 포타슘 카보네이트 (329 mg, 2.38 mmol) 현탁액에 상온에서 N-Boc-(4-아미노메틸)-벤질아민 (281 mg, 1.19 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 상온에서 4시간 동안 교반하고, 물 및 에틸 아세테이트에 묽혔다. 상기 에틸 아세테이트를 층분리하고, 건조한 후 용매를 증발시켜 얻은 혼합 생성물을 다음 단계에 사용하였다.

단계 B 5-[4-{(N-Boc-4-아미노메틸)-벤질아미노}-6-(4-메톡시 벤질아미노)-[1,3,5]-트리아진-2-일아미노]-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온 (화합물 4(B))의 제조

다이메틸포름아마이드 (5 mL)에 용해된 5-[4-클로로-6-(N-Boc-{4-아미노메틸}-벤질아미노)-[1,3,5]-트리아진-2-일 아미노]-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온 (실시예 1.4, 단계 A) (377 mg, 0.79 mmol) 및 포타슘 카보네이트 (240 mg, 1.74 mmol) 현탁액에 30℃에서 4-메톡시벤질아민 (0.12 mL, 0.95 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 30℃에서 18시간 동안 교반하고, 물 및 에틸 아세테이트에 묽혔다. 에틸 아세테이트 층을 묽은 염산으로 세척하고, 층분리한 후 건조시키고, 농축하여 얻은 혼합 생성물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하였다. 이때, 용리액은 다이클로로메탄으로 시작하여 다이클로로메탄:메탄올 (20:1)로 극성을 증가시켰다. 백색 고체의 생성물을 얻었다 (71 mg, 16%). NMR spectrum δ_H (300 MHz, CD₃CN): 7.16 (br s, 6H, Ar), 6.82 (br d, 2H, Ar), 6.5 (br s, 1H, NH), 6.1-5.7 (br m, 4H, NH), 5.47 (br d, 1H, CH), 4.5-4.3 (br, 4H, CH₂), 4.15 (d, 2H, CH₂) 3.73 (s, 3H, OMe), 2.9-2.7 (br, 3H, NMe), 1.39 (s, 9H, Boc).

단계 C 5-[4-(4-아미노메틸-벤질아미노)-6-(4-메톡시벤질아미노)-[1,3,5]-트리아진-2-일아미노]-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온 (화합물 4)의 제조

트리플루오로아세트산 (2 mL)을 다이클로로메탄 (2 mL)에 용해된 5-[4-{(N-Boc-4-아미노메틸)-벤질아미노}-6-(4-메톡시벤질아미노)-[1,3,5]-트리아진-2-일아미노]-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온 (실시예 1.4, 단계 B) (63 mg, 0.11 mol)에 상온에서 첨가하였다. 트리플루오로아세트산을 첨가하고 3시간 후, 용매를 감압증류하여 제거하고, 과량의 다이클로로메탄을 첨가하고 다시 제거하여 과량의 잔류 트리플루오로아세트산을 완전히 제거하였다. 혼합 생성물을 무수 메탄올에 용해시키고, 염산-에테르 용액 (2M, 0.05 mL)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 상온에서 15분 동안 교반하고, 농축한 후 잔류물을 얼음물로 냉각하고 메탄올/아세토니트릴로 분쇄하면서(triturating) 재결정하였다. 결과물인 엷은 분홍색 고체을 여과하여 수집하여 염산염의 생성물을 얻었다 (48 mg, 86%). NMR spectrum δ_H (300 MHz, d₆-DMSO): 8.9-8.2 (br m, 6H, NH), 7.4-7.1 (br m, 6H, Ar), 6.85 (d, 2H, Ar), 5.6 (br, 1H, CH), 4.5-4.2 (br, 4H, CH₂), 3.95 (br s, 2H, CH₂) 3.70 (s, 3H, OMe), 2.8-2.6 (br, 3H, NMe); 분자량 (ESI) m/z 478 [M+H].

실시예 1.5 - 5-[4-(4- 메틸 - 벤질아미노 )-6-(4- 메톡시벤질아미노 )-[1,3,5]- 트 리아진-2- 일아미노 ]-3- 메틸 - 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 5 )

단계 A 5-[4-클로로-6-(4-메틸-벤질아미노)-[1,3,5]-트리아진-2-일아미노]-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온의 제조

상온에서 다이메틸포릎아마이드 (5mL)에 용해된 5-(4,6-다이클로로-[1,3,5]트리아진-2-일아미노)-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온 (실시예 1.3, 단계 D) (200 mg, 0.72 mmol) 및 포타슘 카보네이트 (219 mg, 1.59 mmol) 현탁액에 4-메틸-벤질아민 (0.1 mL, 0.79 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 35℃에서 24시간 동안 교반하고, 물 및 에틸 아세테이트에 묽혔다. 상기 에틸 아세테이트를 층분리하고, 건조한 후 용매를 증발시켜 얻은 혼합 생성물을 다음 단계에 사용하였다.

단계 B 5-[4-(4-메틸-벤질아미노)-6-(4-메톡시벤질아미노)-[1,3,5]-트리아진-2-일아미노]-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온 (화합물 5)의 제조

35℃에서 다이메틸포름아마이드 (5 mL) 에 용해된 5-[4-클로로-6-(4-메틸-벤질아미노)-[1,3,5]-트리아진-2-일아미노]-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온 (실시예 1.5, 단계 A) (80 mg, 0.22 mmol) 및 포타슘 카보네이트 (67 mg, 0.49 mmol) 현탁액에 4-메톡시벤질아민 (0.03 mL, 0.24 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 35℃에서 20시간 동안 교반하고, 물 및 에틸 아세테이트에 묽혔다. 상기 에틸 아세테이트를 층분리하고, 건조한 후 농축시켜 혼합 생성물을 폼 형태(form)로 얻었다 (79 mg, 77%).

NMR spectrum δ_H (300 MHz, CD₃CN): 7.2-7.0 (br m, 7H, Ar + NH), 6.8 (br d, 2H, Ar), 6.5 (br, 1H, NH), 6.1-5.8 (br m, 2H, NH), 5.45 (br d, 1H, CH), 4.5-4.3 (br, 4H, CH₂), 4.15 (d, 2H, CH₂) 3.74 (s, 3H, OMe), 2.9-2.7 (br, 3H, NMe), 2.3 (s, 3H, Me). 분자량 (ESI) m/z 463 [M+H].

실시예 1.6 - 5-[4,6- 비스 -(4- 메톡시 - 벤질아미노 )-[1,3,5]-트리아진 -2- 일아미노 ]-3-n-부틸- 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 6 )의 제조

표제 화합물은 실시예 1.3의 단계 B 내지 E에서 1-메틸-이미다졸리딘-2,4,5-트리온을 사용하는 대신에 1-(n-부틸)-이미다졸리딘-2,4,5-트리온을 사용하는 것을 제외하고, 동일한 조건 및 순서로 수행하여 제조하였다. 마지막 단계에서 제조된 상기 생성물은 크로마토그래피로 정제하였으며, NMR 및 분자량을 확인하였다.

NMR spectrum δ_H (300 MHz, CD₃CN): 7.19 (br d, 4H, Ar), 6.84 (br d, 4H, Ar), 6.38 (br s, 1H, NH), 6.0-5.7 (br, 3H, NH), 5.5 (br d, 1H, CH), 4.36 (s, 4H, CH₂), 3.74 (s, 6H, OMe), 3.38 (t, 2H, NCH₂); 1.52 (m, 2H, CH₂); 1.28 (m, 2H, CH₂); 0.89 (d, 3H, Me). 분자량 (ESI) m/z 521 [M+H].

실시예 1.7 - 5-[4,6- 비스 -(4- 메톡시 - 벤질아미노 )-[1,3,5]- 트리아진 -2- 일아미 노]-3-n-프로필- 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 7 )의 제조

표제 화합물은 실시예 1.3의 단계 B 내지 E에서 1-메틸-이미다졸리딘-2,4,5-트리온을 사용하는 대신에 1-(n-프로필)-이미다졸리딘-2,4,5-트리온을 사용하는 것을 제외하고, 동일한 조건 및 순서로 수행하여 제조하였다. 마지막 단계에서 제조된 상기 생성물은 크로마토그래피로 정제하였으며, NMR 및 분자량을 확인하였다.

NMR spectrum δ_H (300 MHz, d₆DMSO): 8.31 (s, 1H, NH); 7.5 (br, 1H, NH); 7.1-7.3 (br, 6H, Ar+NH), 6.83 (br d, 4H, Ar), 5.5 (br d, 1H, CH), 4.32 (s, 4H, CH₂), 3.78 (s, 6H, OMe), 3.34 (br, 2H, NCH₂); 1.46 (m, 2H, CH₂); 0.79 (br, 3H, Me). 분자량 (ESI) m/z 507 [M+H].

실시예 1.8 - 5-[4,6- 비스 -(4- 메톡시 - 벤질아미노 )-[1,3,5]- 트리아진 -2- 일아미 노]-3- 페닐 - 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 8 )의 제조

표제 화합물은 실시예 1.3의 단계 B 내지 E에서 1-메틸-이미다졸리딘-2,4,5-트리온을 사용하는 대신에 1-페닐-이미다졸리딘-2,4,5-트리온을 사용하는 것을 제외하고, 동일한 조건 및 순서로 수행하여 제조하였다. 마지막 단계에서 제조된 상기 생성물은 크로마토그래피로 정제하였으며, NMR 및 분자량을 확인하였다.

NMR spectrum δ_H (300 MHz, CD₃CN): 8.07 (s, 1H, NH); 7.4-7.0 (br, 9H, Ar+NH); 6.9-6.6 (br, 5H, Ar+NH), 6.2-5.5 (br, 3H, NH+CH), 5.5 (br d, 1H, CH), 4.38 (s, 4H, CH₂), 3.73 (s, 6H, OMe). 분자량 (ESI) m/z 541 [M+H].

실시예 1.9 - 5-[4,6- 비스 -(4- 메톡시 - 페녹시 )-[1,3,5] 트리아진 -2- 일아미노 ]-3-메틸- 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 9 )의 제조

상온, 질소 분위기 하에서 아세토니트릴 (5 mL)에 용해된 5-아미노-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온 (실시예 1.3, 단계 C) (80mg, 0.29mmol), p-메톡시페놀 (39mg, 0.32mmol) 및 포타슘 카보네이트 (88mg, 0.64mmol) 현탁액을 18시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 및 물에 묽히고, 상기 혼합 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 상기 유기층을 건조시키고, 용매를 증발시킨 후, 혼합 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하고 (실리카겔; 다이클로로메탄:에틸 아세테이트, 용리액의 농도구배를 10:1에서 1:2로 극성을 증가시켰다), 아세토니트릴로 재결정하여 무색 고체의 표제 화합물을 얻었다 (17 mg, 13%).

(Found: C, 55.5; H, 4.7; N, 18.4%. C₂₁H₂₀N₆O₆ requires C, 55.8; H, 4.5; N, 18.6%). δ_H (300 MHz, (CD₃)₂CO) 7.81 (d, J 8.1 Hz, 1H, NH), 7.40 (s, 1H, NH), 7.08 (d, J 9.0 Hz, 2H, ArH (ortho to OPh attach)), 7.07 (d, J 9.0 Hz, 2H, ArH (ortho to OPh attach)), 6.92 (d, J 9.0 Hz, 4H, ArH (ortho to OCH₃ attach)), 5.73 (d, J 8.4 Hz, 1H, CH), 3.81 (s, 6H, OCH₃), 2.77 (s, 3H, NCH₃). 분자량 (ESI) m/z 453 (72%, MH⁺).

실시예 1.10 - 5-[4,6- 비스 -(4- 메톡시 -페닐 아미노 )-[1,3,5] 트리아진 -2- 일아 미노]-3- 메틸 - 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 10 )의 제조

단계 A 5-[4-클로로-6-(4-메톡시-페닐아미노)-[1,3,5]트리아진-2-일아미노]-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온의 제조

상온, 질소 분위기 하에서 아세토나이트릴 (7 mL)에 용해된 5-아미노-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온 (실시예 1.3, 단계 C) (228mg, 0.82mmol), p-메톡시아닐린 (111mg, 0.90mmol) 및 소듐 바이카보네이트 (76mg, 0.90mmol) 현탁액을 25시간 동안 교반하였다. 상기 용매를 증발시키고, 혼합 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 상기 유기층을 건조치시코, 감압 농축시킨 후, 혼합 생성물을 컬럼 크로마토그래피 정제하여 (실리카겔; 용리액을 다이클로로메탄:에틸 아세테이트, 10:1로 시작하여 다이클로로메탄:메탄올, 10:1까지 극성을 증가시켰다), 크림색의 표제 화합물을 얻었다 (288mg, 96%).

δ_H (300 MHz, (CD₃)₂CO) 8.88 (br s, 0.5H, NH), 8.84 (br s, 0.5H, NH), 7.87 and 7.70 (2 br s, 1H, NH), 7.61 (br s, 1H, NH), 7.51 (d, J 9.0 Hz, 2H, ArH (O를 기준으로 올쏘 위치)), 6.91 and 6.89 (2 d, J 8.7, 6.6 Hz, 2H ArH (O를 기준으로 올쏘 위치)), 5.82 (br d, J 7.8 Hz, 1H, CH), 3.79 (s, 3H, OCH₃), 2.95 (s, 1.4H, NCH₃), 2.73 (s, 1.6H, NCH₃). 분자량 (ESI) m/z 364 (100%, MH⁺).

단계 B 5-[4,6-비스-(4-메톡시-페닐아미노)-[1,3,5]트리아진-2-일아미노]-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온의 제조 (화합물 10)

질소 분위기 하에서 무수 다이메틸포름아마이드 (5mL)에 용해된 5-[4-클로로-6-(4-메톡시-페닐아미노)-[1,3,5]트리아진-2-일아미노]-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온 (실시예 1.10, 단계 A) (50mg, 0.14mmol), p-메톡시아닐린 (25mg, 0.21mmol) 및 포타슘 카보네이트 (48mg, 0.34mmol) 현탁액을 18.5시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 물에 묽히고, 상기 혼합 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 상기 유기층을 건조시키고, 용매를 증발시킨 후, 혼합 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (실리카겔; 용리액을 다이클로로메탄:에틸 아세테이트, 10:1로 시작하여 다이클로로메탄:메탄올, 10:1까지 극성을 증가시켰다), 엷은 황색 고체의 표제 화합물을 얻었다 (36 mg, 58%).

δ_H (300 MHz, (CD₃)₂CO) 8.14 (br s, 2H, NH), 7.60 (br s, 4H, ArH (NH를 기준으로 올쏘 위치)), 7.43 (br s, 1H, NH), 6.91 (d, J 8.7 Hz, 1H, NH), 6.85 (d, J 9.0 Hz, 4H, ArH (O를 기준으로 올쏘 위치)), 5.91 (d, J 7.8 Hz, 1H, CH), 3.77 (s, 6H, OCH₃), 2.86 (br s, 2.0H, NCH₃), 2.73 (br s, 1.0H, NCH₃). 분자량 (ESI) m/z 451 (37%, MH⁺).

실시예 1.11 - 5-[4-(4- 하이드록시 - 페닐아미노 )-6-(4- 메톡시 - 페닐아미노 )-[1,3,5]트리아진-2- 일아미노 ]-3- 메틸 - 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 11 )의 제조

35℃ 이상의 오일탕(oil bath), 질소 분위기 하에서 무수 다이메틸포름아마이드 (3 mL)에 용해된 5-[4-클로로-6-(4-메톡시-페닐아미노)-[1,3,5]트리아진-2-일아미노]-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온 (실시예 1.10, 단계 A) (76mg, 0.05mmol), p-아미노페놀 (50mg, 0.46mol) 및 포타슘 아세테이트 (25mg, 0.25mmol) 현탁액을 22시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 물에 묽히고, 상기 혼합 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 상기 유기층을 건조시키고, 용매를 증발시킨 후, 혼합 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (실리카겔; 용리액을 다이클로로메탄:에틸 아세테이트, 10:1로 시작하여 다이클로로메탄:메탄올, 10:1까지 극성을 증가시켰다), 엷은 황갈색 고체의 표제 화합물을 얻었다 (24mg, 33%).

Found: C, 54.1; H, 4.9; N, 24.3%. C₂₀H₂₀N₈O₄.MeOH requires C, 53.8; H, 5.2; N, 23.9%). δ_H (300 MHz, CD₃CN) 7.49 (br d, J 8.7 Hz, 2H, ArH (NH을 기준으로 올쏘 위치), 7.37 (br s, 4H, NH and ArH (NH을 기준으로 올쏘 위치)), 6.87 (d, J 9.0 Hz, 2H, ArH (O를 기준으로 올쏘 위치)), 6.75 (d, J 9.0 Hz, 2H, ArH (O를 기준으로 올쏘 위치)), 6.70 (br s, 1H, OH), 6.48 (s, 1H, NH), 6.10 (br d, J 7.8 Hz, 1H, NH), 5.67 (d, J 7.8 Hz, 1H, CH), 3.78 (s, 3H, OCH₃), 2.88 (br s, 3H, NCH₃). 분자량 (ESI) m/z 437 (36%, MH⁺).

실시예 1.12 - 5-[4-(4- 벤질옥시 - 페닐아미노 )-6-(4- 메톡시 - 페닐아미노 )-[1,3,5]트리아진-2- 일아미노 ]-3- 메틸 - 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 12 )의 제조

30℃ 이상의 오일탕(oil bath), 질소 분위기 하에서 무수 다이메틸포름아마이드 (5 mL)에 용해된 5-[4-클로로-6-(4-메톡시-페닐아미노)-[1,3,5]트리아진-2-일아미노]-3-메틸-이미다졸리딘-2,4-다이온 (실시예 1.10, 단계 A) (93mg, 0.26mmol), p-벤질옥시아닐린 염산염 (132mg, 0.56mmol) 및 세슘 카보네이트 (184mg, 0.56mmol) 현탁액을 19시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 상기 반응 혼합물을 물에 묽히고, 상기 혼합 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 상기 유기층을 건조시키고, 용매를 증발시킨 후, 혼합 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (실리카겔; 용리액을 다이클로로메탄:에틸 아세테이트, 10:1로 시작하여 다이클로로메탄:메탄올, 20:1까지 극성을 증가시켰다). 그 후, PS/다이클로로메탄/에틸 아세테이트로 재결정하여 크림색 고체의 생성물을 얻었다 (90mg, 62%).

(Found: C, 61.5; H, 5.1; N, 21.2%. C₂₇H₂₆N₈O₄ requires C, 61.6; H, 5.0; N, 21.3%). δ_H (300 MHz, CD₃CN) 7.58-7.30 (m, 11H, ArH (NH를 기준으로 올쏘 위치), PhH and 2 NH), 6.94 (d, J 8.7 Hz, 2H, ArH (O를 기준으로 올쏘 위치)), 6.87 (d, J 8.7 Hz, 2H, ArH (O를 기준으로 올쏘 위치)), 6.49 (br s, 1H, NH), 6.14 (m, 1H, NH), 5.67 (d, J 7.2 Hz, 1H, CH), 5.09 (s, 2H, CH₂), 3.78 (s, 3H, OCH₃), 2.88 (br s, 3H, NCH₃). 분자량 (ESI) m/z 527 (100%, MH⁺).

실시예 1.13 - 1-((4-((4-메톡시벤질)아미노)-6-((4-(피페리딘-1- 일메틸 )벤질) 아미노)-1,3,5- 트리아진 -2-일)아미노) 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 13 )의 제조

단계 A 1-[4-클로로-6-(4-메톡시벤질)아미노-{1,3,5}-트리아진-2-일-아미노]-이미다졸리딘-2,4-다이온의 제조

0 ℃에서 아세토니트릴 (50 mL)에 용해된 1-(4,6-다이클로로-[1,3,5]-트리아진-2-일-아미노)-이미다졸리딘-2,4-다이온 (실시예 1.1, 단계 A) (3.84 g, 14.6 mmol) 및 K₂CO₃ (4.4 g, 31.8 mmol) 혼합액에 (4-메톡시페닐)-메탄아민 (2.0 g, 14.6 mmol)을 적가하였다. 상기 혼합물을 상온에서 밤샘 교반하였다. 얇은 막 크로마토그래피(TLC)로 반응완료를 확인하였다. 상기 혼합물을 여과하고, 여과물을 물 및 에틸아세테이트에 용해시켰다. 상기 유기층을 층분리하고, 물층은 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 합한 다음, 소금물로 세척하고, 소듐설페이트(Na₂SO₄)로 건조시키고, 감압농축하여 백색 고체의 목적화합물을 얻었다 (3.50 g, 수득률: 66%). 얻어진 화합물은 별도의 정제없이 다음 단계에서 사용하였다.

δ_H (400 MHz, DMSO-d₆): 11.30-11.23 (m, 1H), 10,06-9.83 (m, 1H), 8.67-8.60 (m, 1H), 7.24-7.13 (m, 2H), 6.90-6.83 (m, 2H), 4.40-4.35 (m, 2H), 4.26-4.05 (m, 2H), 3.73 (s, 3H). 분자량 (ESI) m/z 364 (100%, MH⁺).

단계 B 1-((4-((4-메톡시벤질)아미노)-6-((4-(피페리딘-1-일메틸) 벤질)아미노)-1,3,5-트리아진-2-일)아미노)이미다졸리딘-2,4-다이온 (화합물 13)의 제조

테트라하이드로퓨란 (8.0 mL)에 용해된 1-[4-클로로-6-(4-메톡시벤질)아미노-{1,3,5}-트리아진-2-일-아미노]-이미다졸리딘-2,4-다이온 (실시예 1.13, 단계 A) (150 mg, 0.41 mmol), 4-피페리디닐메틸렌-벤질아민 (101 mg, 0.49 mmol) 및 K₂CO₃ (171 mg, 1.24 mmol) 혼합액을 밤샘 환류교반하였다. 얇은 막 크로마토그래피(TLC)로 반응완료를 확인하였다. 상기 혼합물을 상온으로 냉각시키고, 물을 부은 후, 에틸 아세테이트로 반복하여 추출하였다. 추출된 유기층을 합한 다음, 소금물로 세척하고, 소듐설페이트(Na₂SO₄)로 건조시키고, 감압농축하였다. 상기 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 (실리카 겔, CH₂Cl₂ : MeOH= 20 :1, v/v) 어두운 백색 고체(off-white solid)의 화합물 13을 얻었다 (65 mg, 수득률: 30%).

δ_H (400 MHz, DMSO-d ₆): 11.13 (br, 1H), 9.03-8.74 (m, 1H), 7.66-6.77 (m, 10H), 3.91 (s, 1H), 3.72-3.45 (m, 4H), 2.38 (s,2H), 1.53-1.24 (m, 6H). 분자량 (ESI) m/z 532.3 (100%, MH⁺).

실시예 1.14 - 1-((4-((4-메톡시벤질)아미노)-6-((4-( 몰폴리노 메틸 )벤질)아미노)-1,3,5- 트리아진 -2-일)아미노) 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 14 )의 제조

화합물 14은 실시예 1.13의 단계 A 및 B의 합성 과정을 수행하여 제조하였다.

δ_H (400 MHz, DMSO-d ₆): 11,14-11,04 (m, 1H), 7.50-5.50 (m, 10H), 4.41-3.80 (m, 6H), 3.72 (s, 3H), 3.56 (s, 2H), 3.41 (s, 4H), 2.33 (s, 4H). 분자량 (ESI) m/z 534.2 (100%, MH⁺).

실시예 1.15 - 1-((4-((4-(( 다이에틸아미노 ) 메틸 )벤질)아미노)-6-((4-메톡시벤질)아미노)-1,3,5- 트리아진 -2-일)아미노) 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 15 )의 제조

화합물 15는 실시예 1.13의 단계 A 및 B의 합성 과정을 수행하여 제조하였다.

δ_H (400 MHz, DMSO-d ₆): 11.12-11.04 (m, 1H), 9.02-8.92 (m, 1H), 7.62-6.77 (m, 10H), 4.42-4.23 (m, 4H), 4.09, 3.92 (m, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.53 (s, 2H), 3.55-3.52 (m, 4H), 0.99 (br s., 6H). 분자량 (ESI) m/z 520.3 (100%, MH⁺).

실시예 1.16 - 1-((4-((4-메톡시벤질)아미노)-6-((4-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)벤질)아미노)-1,3,5- 트리아진 -2-일)아미노) 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 16 )의 제조

화합물 16은 실시예 1.13의 단계 A 및 B의 합성 과정을 수행하여 제조하였다.

δ_H(400 MHz, DMSO-d ₆): 11.07 (br s, 1H), 9.04-8.89 (m, 1H), 7.49-6.72 (m, 10H), 4.42-4.21 (m, 4H), 4.09-3.94 (m, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.40 (s, 2H), 2.34 (br s, 8H), 1.92 (s, 3H). 분자량 (ESI) m/z 547.3 (100%, MH⁺).

실시예 1.17 - 1-((4-((4-메톡시벤질)아미노)-6-((4-(피페리딘-1-일)벤질)아미노)-1,3,5- 트리아진 -2-일)아미노) 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 17 )의 제조

화합물 17은 실시예 1.13의 단계 A 및 B의 합성 과정을 수행하여 제조하였다.

δ_H(400 MHz, DMSO-d ₆): 11.14-11.03 (m, 1H), 8.90- 8.70 (m, 1H), 7.56-6.84 (m, 10H), 4.35-4.02 (m, 6H), 3.72 (s, 3H), 3.07 (s, 4H), 1.60-1.51 (m, 6H). 분자량 (ESI) m/z 518.3 (100%, MH⁺).

실시예 1.18 - 1-((4-((4-메톡시벤질)아미노)-6-((4- 몰폴리노 벤질)아미노)-1,3,5-트리아진-2-일)아미노) 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 18 )의 제조

화합물 18은 실시예 1.13의 단계 A 및 B의 합성 과정을 수행하여 제조하였다.

δ_H(400 MHz, DMSO-d ₆): 10.94 (br s, 1H), 8.89-8.70 (m, 1H), 7.75-6.77 (m, 10H), 4.34-4.06 (m, 6H), 3.74-3.72 (m, 7H), 3.04 (s, 4H). 분자량 (ESI) m/z 520.2 (100%, MH⁺).

실시예 1.19 - 1-((4-((4-메톡시벤질)아미노)-6-((4-(4- 메틸피페라진 -1-일)벤질)아미노)-1,3,5- 트리아진 -2-일)아미노) 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 19 )의 제조

화합물 19는 실시예 1.13의 단계 A 및 B의 합성 과정을 수행하여 제조하였다.

δ_H(400 MHz, DMSO-d ₆): 8.89-8.70 (m, 1H), 7.40-6.81 (m, 10H), 4.35-4.01 (m, 6H), 3.72 (s, 3H), 3.39 (br s, 4H), 3.10 (s, 4H), 2.27 (s, 3H). 분자량 (ESI) m/z 533.3 (100%, MH⁺).

실시예 1.20 - 1-((4-((4-메톡시벤질)아미노)-6-((3-(피페리딘-1-일)벤질)아미노)-1,3,5- 트리아진 -2-일)아미노) 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 20 )의 제조

화합물 20은 실시예 1.13의 단계 A 및 B의 합성 과정을 수행하여 제조하였다.

δ_H (400 MHz, DMSO-d ₆): 11.12-11.04 (m, 1H), 9.03-8.71 (m, 1H), 7.59-6.60 (m, 10H), 4.37-3.98 (m, 6H), 3.71 (s, 3H), 3.09 (s, 4H), 1.59-1.51 (m, 6H). 분자량 (ESI) m/z 518.3 (100%, MH⁺).

실시예 1.21 - 1-((4-((4-메톡시벤질)아미노)-6-((3- 몰폴리노벤질 )아미노)-1,3,5-트리아진-2-일)아미노) 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 21 )의 제조

화합물 21은 실시예 1.13의 단계 A 및 B의 합성 과정을 수행하여 제조하였다.

δ_H (400 MHz, DMSO-d ₆): 11.13-11.03 (m, 1H), 9.04-8.72 (m, 1H), 7.58-6.66 (m, 10H), 4.37-3.98 (m, 6H), 3.72 (s, 7H), 3.07 (s, 4H). 분자량 (ESI) m/z 520.2 (100%, MH⁺).

실시예 1.22 - 1-((4-((4-메톡시벤질)아미노)-6-((3-(4- 메틸피페라진 -1-일)벤질)아미노)-1,3,5- 트리아진 -2-일)아미노) 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 22 )의 제조

화합물 22는 실시예 1.13의 단계 A 및 B의 합성 과정을 수행하여 제조하였다.

δ_H (400 MHz, DMSO-d ₆): 11.07 (br s, 1H), 9.03-8.71 (m, 1H), 7.56-6.61 (m, 10H), 4.36-3.98 (m, 6H), 3.72 (br s, 7H), 3.12 (s, 4H), 2.27 (s, 3H). 분자량 (ESI) m/z 533.3 (100%, MH⁺).

실시예 1.23 - 1-((4-((4-(2-( 다이에틸아미노 ) 에톡시 )벤질)아미노)-6-((4-메톡시벤질)아미노)-1,3,5- 트리아진 -2-일)아미노) 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 23 )의 제조

화합물 23은 실시예 1.13의 단계 A 및 B의 합성 과정을 수행하여 제조하였다.

δ_H (400 MHz, DMSO-d ₆): 11.07 (br s, 1H), 9.03-8.71 (m, 1H), 7.57-6.77 (m, 10H), 4.35-3.98 (m, 8H), 3.72 (s, 3H), 2.81 (s, 2H), 2.60-2.51 (m, 4H), 0.99 (t, J = 7.2 Hz, 6H). 분자량 (ESI) m/z 550.3 (100%, MH⁺).

실시예 1.24 - 1-((4-((4-메톡시벤질)아미노)-6-((4-(2- 몰폴리노에톡시 )벤질)아미노)-1,3,5- 트리아진 -2-일)아미노) 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 24 )의 제조

화합물 24는 실시예 1.13의 단계 A 및 B의 합성 과정을 수행하여 제조하였다.

δ_H (400 MHz, DMSO-d ₆): 11.16-11.06 (m, 1H), 9.03-8.72 (m, 1H), 7.57-6.81 (m, 10H), 4.35-3.99 (m, 8H), 3.72 (s, 3H), 3.58 (s, 4H), 2.67 (s, 2H), 2.52-2.46 (m, 4H). 분자량 (ESI) m/z 564.3 (100%, MH⁺).

실시예 1.25 - 1-((4-((4-메톡시벤질)아미노)-6-((4-(2-( 피롤리딘 -1-일) 에톡 시)벤질)아미노)-1,3,5- 트리아진 -2-일)아미노) 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 25 )의 제조

화합물 25는 실시예 1.13의 단계 A 및 B의 합성 과정을 수행하여 제조하였다.

δ_H (400 MHz, DMSO-d ₆): 10.78 (br s, 1H), 9.03-8.73 (m, 1H), 7.65-6.77 (m, 10H), 4.41-3.95 (m, 6H), 3.72 (s, 3H), 3.60 (s, 2H), 2.55 (br s, 4H), 1.71 (s, 4H). 분자량 (ESI) m/z 518.3 (100%, MH⁺).

실시예 1.26 - 1-((4-((4-메톡시벤질)아미노)-6-((4-(((2- 메톡시에틸 )아미노)메틸)벤질)아미노)-1,3,5- 트리아진 -2-일)아미노) 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 26 )의 제조

화합물 26은 실시예 1.13의 단계 A 및 B의 합성 과정을 수행하여 제조하였다.

δ_H (400 MHz, DMSO-d ₆): 9.03-8.73 (m, 1H), 7.52-6.77 (m, 10H), 4.40-4.09 (m, 6H), 3.72 (s, 3H), 3.67 (s, 2H), 3.39 (m, 2H), 3.23 (s, 3H), 2.63 (s, 2H). 분자량 (ESI) m/z 522.2 (100%, MH⁺).

실시예 1.27 - 1-((4-((4-(( 다이메틸아미노 ) 메틸 )벤질)아미노)-6-((4-메톡시벤질)아미노)-1,3,5- 트리아진 -2-일)아미노) 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 27 )의 제조

화합물 27은 실시예 1.13의 단계 A 및 B의 합성 과정을 수행하여 제조하였다.

δ_H (400 MHz, DMSO-d ₆): 11.07 (br s, 1H), 9.04-8.75 (m, 1H), 7.66-6.74 (m, 10H), 4.44-3.91 (m, 6H), 3.72 (s, 5H), 2.34 (s, 6H). 분자량 (ESI) m/z 492.2 (100%, MH⁺).

실시예 1.28 - 1-((4-((4-메톡시벤질)아미노)-6-((4-(피페라진-1- 일메틸 )벤질)아미노)-1,3,5- 트리아진 -2-일)아미노) 이미다졸리딘 -2,4- 다이온 2,2,2- 트리플루오 로아세테이트 ( 화합물 28 )의 제조

화합물 28은 실시예 1.13의 단계 A 및 B의 합성 과정을 수행하여 제조되는 Boc-보호화된 4-(피페라진-1-일메틸)벤질)아미노 유도체를 탈보호화하여 얻었다.

δ_H (400 MHz, CD₃OD): 7.42-6.83 (m, 8H), 4.64-4.47 (m, 4H), 4.20-3.93 (m, 4H), 3.79 (s, 3H), 3.34-3.32 (m, 4H), 3.12-3.01 (m, 4H). 분자량 (ESI) m/z 533.3 (100%, MH⁺).

실시예 1.29 - tert -부틸 4-(((4-((2,4- 다이옥소이미다졸리딘 -1-일)아미노)-6-((4-메톡시벤질)아미노)-1,3,5- 트리아진 -2-일)아미노) 메틸 ) 벤질카바메이트 ( 화합물 29 )의 제조

화합물 29는 출발물질로 1-(4,6-다이클로로-[1,3,5]-트리아진-2-일-아미노)-이미다졸리딘-2,4-다이온 (실시예 1.1, 단계 A) 을 사용하여 상기 실시예 1.4의 단계 A 및 B의 합성 과정을 수행하여 제조하였다.

실시예 1.30 - 5-((4,6- 비스 ((4- 하이드록시벤질 )아미노)-1,3,5- 트리아진 -2-일)아미노)-3- 메틸이미다졸리딘 -2,4- 다이온 ( 화합물 30 )의 제조

화합물 30은 상기에 기재된 합성 과정을 적용하여 제조하였다.

실시예 2 - 생물학적 시험

실시예 2.1 - 암세포주의 증식 및 지속 억제

본 발명의 트리아진 화합물에 대하여 G2/M 세포주기 억제를 평가하였다. 트리아진는 생체 외(in vitro)에서의 종양 세포주 성장 억제 활성을 시험하였다. 초기 시험에서 2종의 대장암 세포주 (LIM1215 and SW480) 및 2종의 유방암 세포주 (MDA-MB-231 and MCF-7)를 사용하였다. 탁솔(Taxol)은 이 실험에서 대조군으로 사용되었다 (표 1).

시험된 전체 트리아진은 이들의 최적 농도에서 최소한 G2/M 억제 유도에서 탁솔 만큼 효과적이었다(표 1).

표 1: 암세포주에 대한 트리아진의 항유사분열 효과. 억제제는 24시간 동안 로그 성장된 세포에 주입되었다. 세포주기 단계 분포는 DNA 염색 및 ModFit. 분석을 통하여 관찰되었다. (a) 세포주기를 통한 증식에 대한 IC₅₀ 및 (b) 1μM의 탁솔(Taxol)에 노출된 이후 G2/M 세포의 비율을 기준으로서 사용하였으며; 트리아진의 활성은 G2M 세포의 비율 (시험군)/ G2M 세포의 비율 (탁솔)로 표현되었다. 본 실험에서의 G2/M 세포의 최대값은 다음과 같다: LIM1215= 78.5%; SW480 = 72%; MDA-MB-231=55%; MCF-7= 62%. NT= 실험하지 않음.

실시예 2.2 - "생체 외에서" 암 세포 성장에 대한 트리아진 효과

또한, 증식억제는 MTT 분석에 의한 종양 세포 패널을 통하여 측정되었다 (일반적인 프로토콜은 실시예 2.6에 나타냄).

세포 증식을 측정한 본 분석에 의해 결정된 IC₅₀은 G2/M 억제가 실제로 세포 증식을 억제함을 나타내는 G2/M 억제에 대한 FACS 분석으로부터 계산된 값에 근접하게 일치한다. 시료와 함께 세포를 배양한 후 수행된 워시아웃 실험(wash-out experiment)에서 유방암 세포주에 대한 증식은 재개되었고, 대장암 세포주에 대한 증식은 완전히 억제되었으며, 이로부터 처리된 시료가 적어도 특정 세포형에 대한 세포 독성이 있는 것을 알 수 있다.

실시예 2.3.1 - 종양 세포 성장에 대한 트리아진의 생물학적 효과

화합물 2은 화합물의 반응성 및 선택성을 확인하기 위하여 세포주 시리즈에 시험되었다 (표 2). 세포 증식은 억제제와 함께 3일 동안 세포와 증식시킨 다음, MTT 분석을 사용하여 측정되었다 (일반적인 프로토콜은 실시예 2.6에 나타냄).

표 2: 화합물 2에 의한 종양 세포주의 증식 억제: : (a) 쥐 B-전구 세포주; (B) 인간의 대장암; 및 (c) 인간의 유방암 종.

상기 서로 다른 세포주에 대한 IC₅₀은 매우 유사하고, 이로부터 화합물 2는 G2/M의 종결에 요구되는 일반적인 경로를 표적으로 하는 것을 알 수 있다.

실시예 2.3.2 - "생체 외에서" 및 "생체 내에서"의 튜불린 ( tubulin ) 중합에 대한 트리아진의 효과

'생체 외에서' 및 '생체 내에서'의 튜불린 중합에 대한 트리아진의 효과를 시험하였다. 트리아진에 의해 유도된 튜불린 중합을 확인하는 본 실험은 최소값을 나타냈으며, 유사분열 억제제로서의 현저히 우수한 약물 효과를 나타났다.

튜불린에 대한 트리아진 효과를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 약물 노출에 따른 손상이 없는 세포 내의 튜불린 중합을 시험하였다.

탁솔 또는 화합물 3으로 처리된 세포는 0.5% NP-40을 포함하는 저장성 완충용액에 분해시키고, 세포 추출물을 고속으로 원심분리하였다. 중합된 튜불린은 세척액에 불용성이다: 따라서, 시료 처리로 인하여 용해성이 있는 튜불린은 상등액으로 존재하고 (S), 중합된 튜불린은 세포 펠렛 (P)에 존재한다. 상기 두 형태의 상대적인 비율은 SDS/PAGE 및 특정 튜불린 항체를 포함하는 면역학적 도식화(immunoblotting)에 의해 관찰되었다.

본 실험에서, 탁솔은 용량 의존적으로 튜불린을 매우 안정화시키는 반면, 처리된 트리아진은 심지어 고농도에서 유의한 효과를 나타내지 않았다 (도 1).

튜불린과 트리아진의 직접 반응을 평가하기 위한 시도에서, '생체 외에서' 튜불린 중합 분석이 사용되었다 (도 2). 본 분석에서 트리아진은 튜불린 중합에서 작지만 상당한 증가를 초래하였다. 그러나, 튜불린 중합에 요구되는 트리아진의 농도는 세포 증식 분석에서의 IC₅₀보다 1000배 이상 컸다.

실시예 2.3.4 - 마우스에 대한 종양선량 증가

화합물 1은 처음에 마우스에서의 지속성 및 세포독성을 시험하였다. C57Bl/6 마우스 (8-12 주령)에 일정 부피의 다이메틸설폭사이드에 용해된 화합물 1을 피하 주사투여하였다. 마우스는 투여 24시간 후에 희생되었다. 이 시간 동안 80 mg/kg의 투여량까지 복용의 부장용은 없었다. 따라서, 본 화합물은 "생체 외에서" 측정된 IC₅₀값을 훨씬 초과하는 양을 투여 가능하다.

화합물 2는 최대 4일 동안 64.5 mg/kg까지 복용하였을 경우 외부적인 건강 또는 행동에 있어서 부작용을 나타내지 않았다. 투여량 범위 21.5 mg/kg 및 64.5mg/kg에서 어떤 마우스에서는 주사 부위의 피부가 얇게 되는 징후가 관찰되었다. BALB/c 누드 마우스에 있어서, 화합물 2는 20 mg/kg 투여된 경우 약간의 피부 병변을 야기시켰다. 이러한 부수적인 피부 병변은 2-3주 내에 쉽게 치유되었다.

실시예 2.4 - 약물동태학

화합물 2의 약물 동태학적 파라미터는 마우스에 주사투여에 따라 결정되었다.

수용액에서 50mg/kg의 복용량으로 전달될 경우, 약물은 혈류 내에서 약 60μM의 최고 농도에 도달하고, 6-10시간 동안 6μM까지의 농도 수준을 유지한다. 약물 제거 반감기는 약 1.5시간이다. 또한, 체외에서 G2/M 세포주기 억제를 유도하는 적어도 2개의 활성 대사 산물은 혈장에서 발견되었으며, 이들의 구조는 질량 분석을 통하여 확인되었다. 활성 대사 산물이 약물동력학 계산에 포함되는 경우, 활성 약물의 총 농도는 약물이 혈장으로부터 제거되기 시작하기 전까지 최대 6시간 동안 평균 30μM이 된다.

실시예 2.4.1 - 마우스 혈액으로부터의 트리아진 추출 및 양 측정

마우스 혈장으로부터의 추출 및 추출된 약물의 RP-HPLC 정량뿐만 아니라 대사산물 및 화합물의 약동학적 특성 확인을 위해 개발 된 프로토콜은 하기에 설명되어 있습니다.

실시예 2.4.1.1 - 마우스 혈장으로부터의 트리아진 추출

마우스 혈액은 CO₂ 가스에 의한 마취 후 심장 천자에 의해 수집되었다. 마우스는 이후 안락사되었다. 상기 혈액은 원심분리를 통하여 분리한 후 수집된 혈장의 응고를 방지하기 위하여 EDTA 튜브에 옮겨졌다. 각 25μl의 혈장 시료에 대하여 내부 표준물질로서 5μM의 하이드로코르티손 (HC)을 포함하는 차가운 75μl의 0.1% TFA (v/v)를 첨가하였다. 얻어진 시료는 요구될 때까지 -20℃에 저장되었다. 해동에 있어서, 이들은 원심분리에 의해 명확히 분리되었으며, 추출물은 RP-HPLC로 분석되었다.

실시예 2.4.1.2 - 마우스 혈장 내의 트리아진 양 측정

각 100μl 혈장 추출물은 분당 0.1ml의 흐름 속도와 45℃의 열 온도에서 용출 용매로서 0.1 %의 TFA (v / v)를 포함하는 아세토 니트릴을 50분 동안 선형 농도구배하여 ZORBAX SB-C18, 2.1X150mm, 5 ㎛ 컬럼 분리되었다. 검출은 250nm에서 수행되었다. 대표적인 크로마토그램은 도 3에 나타내었다.

실시예 2.4.1.3 - 화합물 2 대사물의 분석

대조군으로부터 얻은 것이 아닌 화합물 2를 투여한 마우스로부터 얻은 혈장 크로마토그램은 약간의 피크가 포함되어 있다. 이들 피크는 화합물 2의 주사 투여 후 나중에 나타나며, 아마도 대사되었다. 이들 피크의 출처 확인을 위하여 그들의 흡수 스펙트럼을 화합물 2의 기준 스펙트럼과 비교하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 모든 피크는 250nm 흡광도를 가지며, 관련 화합물임을 나타낸다. 상기 마우스 혈장은 RP-HPLC에서 분획되었으며, 각 피크는 분획된 상기 혈장을 나타낸다. 풀링 피크 시료(pooled peak sample)은 동결건조에 의해서 농축되었다. 각 피크 시료의 일부는 생물 분석을 위한 배양액으로 재구성되었다 (도 5). 나머지는 분자량 확인 및 구조 식별을 위한 LC-MS 분석에 사용되었다.

얻어진 화합물 2 (피크 1), 피크 2 및 피크 3의 IC₅₀값은 각각 0.1μM, 0.2μM 및 >1μM이다. 비록 양이 매우 작아 얻어진 피크의 정확한 농도를 정량화하기 어려웠지만, 본 분석은 모든 얻어진 피크가 어떠한 생물학적 활성을 갖는지를 알 수 있다.

복구된 화합물의 LC-MS 분석 결과를 표 3에 나타내었다.

표 3. 화합물 2 주사투여 후 마우스 혈장으로부터 얻어진 대사물의 LC-MS 분석 결과

화합물 2 출발물질의 분석은 464 Da의 유리 염기 화합물의 분자량을 확인하였다. 피크 1은 혈장으로부터 얻어진 화합물과 동일하다는 것을 나타내는 동일한 질량을 가지고 있었다. 피크 3은 하이드록시기를 치환기로 갖는 479 Da의 질량을 갖는다. 피크 2는 655 Da의 훨씬 더 큰 화합물이다. 추가된 질량은 하이드록시기의 글루쿠로니드기를 나타낸다.

이러한 결과는 얻어진 화합물이 화합물 2의 활성 대사산물 임을 나타내고, 혈장 및 상기 화합물의 제거 반감기에 대한 약물의 활성 수준 계산에 포함되어야 함을 나타낸다.

실시예 2.4.1.4 - 화합물 2의 약물동력학적 분석

혈장 내의 약물 농도는 알려진 표준법과 관련하여 약물과 HC 피크 면적 비율 비교에 의한 교정의 내부 표준 방법에 의해 결정되었다. 하나의 약물동력학 실험으로부터의 마우스 내 화합물 2의 혈장 농도는 도 6에 나타내었다.

이러한 결과는 화합물 2의 치료적으로 상당한 농도가 혈청에서 도달하고, 최대 10시간 동안 유지된다는 것을 나타낸다.

실시예 2.5 - 이종이식 시험에서의 항암제로서의 효과

이종이식 실험은 종양 성장 감소에 대한 화합물 2의 효과를 확인하기 위하여 사용되었다. 대장암 세포주 LIM2537에 설립된 종양 모델을 사용한 초기 실험에서, 화합물 2는 종양 성장의 속도를 상당히 감소시켰다.

실시예 2.5.1 - LIM 2537 세포를 사용한 종양 이종이식 연구 (대장암 세포주)

방법:

LIM 2537 대장암 세포주는 화합물 2 ("종양 세포 성장에 대한 트리아진의 생물학적 효과" 참고)에 의해서 이들의 성장이 억제되는 것을 확인하기 위하여 BALB/c 누드 마우스에 대한 종양 이종이식 연구에 사용되었다.

상기 마우스는 종양 당 3x10⁶ 세포가 있는 100μL의 PBS로 피하 각 측면 (SC)에 접종되었다. 치료는 15mg/kg의 용량을 제공하는 3 mg/kg의 수용액에 담체 대조군 (VC) 또는 100μL의 약물 중 하나와 함께 종양 접종 후 세 번째 날부터 투여하기 시작하였다. 마우스는 실험 기간 동안, 복부에 일주일에 3회 투여하였다. 마우스는 체중, 종양의 부피 및 모양, 그리고 약물에 대한 부반응에 대하여 관찰되었다. 실험은 총 33일 후에 종료되었으며, 대조군은 대조군의 종양 크기(burden)가 허용되는 최대값에 도달했으므로 안락사되었다. 그 후, 나머지 마우스는 9일 동안 추가적인 치료없이 종양 성장의 재개를 관찰하기 위하여 남겨 놓았다.

결과:

마우스 체중은 약물 치료에 의해 영향을 받지 않았다. 대조군과 약물 처리군 사이의 종양 크기의 차이는 12일 후에 분명히 나타났고, 33일 경과 후 대조군이 안락사 될 때까지 이 둘의 차이는 구별되었다. 상기 군 내에서, 하나의 천천히 성장하는 종양 있었고, 또 하나의 빠르게 성장하는 종양이 있었다. 이러한 비정상적인 종양은 큰 표준 편차로서 나타내었다 (도. 7).

본 실험으로부터 LIM 2537의 성장 둔화를 성공시킨 약물 처리 일정 (화합물 2를 15mg/kg의 용량으로 일주일에 3회 주사 투여)이 계산될 수 있다. 이러한 약물의 복용량 및 제형은 장기적인 부작용은 없었다.

실시예 2.5.2 - U87MG 를 사용한 종양 이종이식 연구(Δ2-7) (뇌암 세포주)

방법:

마우스: Balb/c nu/nu 수컷; 8 대조군 및 8 약물 처리군.

세포 접종: 2.13x10⁶ 세포/종양의 U87MG(Δ2-7); 마우스 당 2종 종양.

복용량: 20mg/kg의 화합물 2 = 20g 마우스 당 4mg/ml의 식염수 100μl 주사투여. 대조군 마우스는 식염수 100μl 주사투여.

치료 및 관찰: 치료는 접종 후 5일 후부터 시작되었다. 마우스는 일주일에 3회 (월요일, 수요일, 금요일) 복부에 피하 주사 투여되었다. 마우스는 체중 및 이차원으로 종양의 지름이 측정되었으며, 마우스의 건강상태가 관찰되었다.

실험 후 마우스는 안락사시켰으며: 종양은 해부되어 무게가 측정되었고; 비장 및 간의 무게 또한 측정되었다.

결과:

종양은 동물들 사이에서 빠르게, 지속적으로 성장하였다. 본 실험은 접종 후 14일이 경과되었 때, 대부분의 대조군 마우스들이 최대 종양 크기(burden)에 도달하였으므로 14일 후에 종료되었으며, 일부 종양은 궤양이 시작되었다. 본 실험의 끝에서 대조군과 약물 처리군의 종양 사이의 부피에 있어서 상당한 차이가 있었다 (도 8).

또한, 간 및 비장은 사후 무게가 측정되었다. 도 9에서 이러한 장기의 평균 무게는 종양의 무게와 함께 비교되었다.

일주일에 3회, 20mg/kg의 화합물 2를 처리하는 U87MG(Δ2-7) 종양의 치료는 담체 대조군을 투여한 마우스의 종양과 대조하여 종양의 성장을 감소시켰다.

실시예 2.5.3 - H1437 를 이용한 종양 이종이식 연구 (비-소 세포성 폐암주 )

방법:

마우스: Balb/c nu/nu 수컷; 8 대조군 및 8 약물 처리군; 5 주령.

세포 접종: 2x10⁶ 세포/종양의 H1437 (비-소 세포 폐암 세포주); 마우스 당 2종 종양.

치료 및 관찰: 치료는 접종 후 5일 수부터 시작되었다. 마우스는 일주일에 3회 복부에 피하 주사 투여되었다. 마우스는 체중 및 이차원으로 종양의 지름이 측정되었으며, 마우스의 건강상태가 관찰되었다. 주사 투여는 도표의 각 점에 대응하게 표시되고, 추가적으로 처리된 14일은 측정하지 않았다.

결과:

대조군의 종양은 빠르게 성장하였으나, 동물들 사이에서 약간의 다양성(variation)이 있었다. 21일 후에 측정된 종양의 부피는 안정되었고, 이전 실험에서의 세포주보다 성장 속도가 증가되지 않았다. 이러한 종양은 일반적으로 동물의 옆구리를 따르는 확산보다 높은 둥근 공으로 성장했다. 본 실험은 접종 후 대부분의 대조군 마우스가 최대 종양 크기(burden)에 도달하였으므로 26일 후에 종료되었다. 피부 아래 남아 있는 종양의 궤양은 발견되지 않았으며, 특히 혈관 (vascularise)에는 나타나지 않았다. 이와 대조적으로, 약물 처리군의 종양은 26일에 걸쳐 현저히 작고 단단하게 남아있었다. 실험의 끝에서 대조군과 약물 처리군 사이의 종양 부피는 상당한 차이가 있었다 (도 10).

마우스가 죽은 후, 종양 해부 및 무게를 측정하였다. 두 시험군으로부터 얻어진 종양을 절개하여 비교하였다. 두 시험군 사이에서 관찰된 종양의 크기는 현저한 차이가 있었다 (도 11).

광범위한 범위에서 본 발명의 범위를 벗어남 없이 특정 실시예에 나타낸 본 발명에 많은 변화 및/또는 개량을 수행할 수 있는 것은 당업자로부터 인식될 수 있다.

따라서, 본 실시예는 설명되고 제한되지 않는 모든 측면에서 고려되어야 한다.

실시예 2.6

모든 세포 및 억제제에 대한 MTT 및 MTS 분석을 위한 프로토콜

실시예 2.6.1 - 일반적인 요약

ㆍ 100μl 배지 + 5% FCS (+첨가제¹)에 용해된 세포를 플레이트에 웰당 10⁴씩 분주한다.

ㆍ 세포를 밤색 배양한다.

ㆍ 플래쉬 플레이트에 150μl 배지에 용해된 억제제를 적정한다.

ㆍ 세포 플레이트의 대응하는 웰에 적정된 화합물 100μl를 이동시킨다.

ㆍ 4일 동안 추가 배양한다.

ㆍ 10μl의 MTS² 또는 MTT³을 1.5시간 내지 2시간 동안 첨가하고, 멀티스태너 (파장 492/690)로 측정한다.

¹ LIM 세포주 배양용 첨가제: 10μM 티오글리세롤, 0.025U/ml 인슐린, 1μg/ml 하이드로코르티손. ²3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸리움. ³ 3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸리움 브로마이드.

실시예 2.6.2- MTS 분석에 사용된 세포주

ㆍ RPMI + 첨가제¹ + 5% FCS에서 성장된 LIMIM2537 인간 직장암 세포주.

실시예 2.6.3 - 세포 분주: 플레이트 당 1 세포주

세포는 트립신화되고, 배지 + 5% FCS로 2회 세척한 다음, 웰 당 10⁴ 세포씩 100μl에 석출시킨다.

플레이트를 37℃, 5%-10% CO₂ 배양기에서 밤샘 배양한다.

실시예 2.6.4 - 억제제

억제제를 다이메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 10mM 기준용액을 제조하고, 90웰 플레이트에 시험 플레이트의 기준으로서 사용될 복제물을 적정하였다. 40μM 이하에서 0.01μM의 1/2 희석액의 농도 범위로 적정하고, 100μl의 각 희석액을 세포를 포함하고 있는 시험 플레이트(또한, 10μl)의 적정 웰에 주입하여 결과물 내 억제제의 최종 농도가 20μM 이하 내지 0.01μM가 되도록 하였다. 플레이트 당 3 종의 억제제를 시험하였다 (A-F 행).

각 플레이트는 다음과 같다:

A,B행: 억제제 1 희석액, 웰 당 200μl

C,D행: 억제제 1 희석액, 웰 당 200μl

E,F행: 억제제 1 희석액, 웰 당 200μl

G1-6 행 조절: 배지 + 5% FCS (최대 성장)

G7-12 행 조절: 탁솔 (최대 억제, 250nM)

H 행 조절: 세포로부터 배지를 제거하고, 무혈청 성장 속도 측정을 위한 무혈청 배지 200μl를 첨가한다.

실시예 2.6.5 - 배양

배양기에서 4일 동안 플레이트를 배양시킨다. MTS 또는 MTT 과정은 하기와 같이 수행하였다.

실시예 2.6.6 - MTS 분석

각 웰에 10μl MTS (Sigma)용액을 첨가한다. MTS는 1.5 내지 2시간 동안, MTT는 4시간 동안 배양하였다. 각 웰에 10% SDS 10μl를 첨가하여 반응을 종결시킨다. 멀티 스탠(492/690) 플레이트 리더를 이용하여 측정하고, 색상 변화에 대한 억제제의 농도를 도시하여 IC₅₀값을 도출한다.

실시예 2.6.7 - MTT 분석

MTT 용액

MTT (Sigma M-2128) - PBS에 5g을 용해시켜 5mg/ml로 농도를 조절하고, 여과한 다음, -20℃에서 저장한다. 필요시에는 해동한다.

MTT 용제 (산성화된 이소프로판올)

a. 1M 염산:

500ml 2차 증류수에 44.6ml conc. 염산 (11.2 M)를 혼합한다.

b. 산성화된 이소프로판올 (0.04 N 염산이 혼합된 이소프로판올):

480ml 이소프로판올(프로판-2-올, 이소-프로필 알코올)에 1M 염산 20ml를 혼합한다.

MTT 첨가

각 웰에 10μM의 MTT 용액을 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 배양한다.

5분 동안 1500 rpm에서 스핀 플레이트(Spin plates)를 이용하여 플레이트를 회전시키고, 조심스럽게 생성된 결정의 손실없이 배지를 제거한다. 200μl의 산성화된 이소프로판올 (MTT 용제)을 각 웰에 첨가한다.

상온, 6.5의 속도로 10분 내지 30분 동안 플레이트 혼합기(plate shaker)에서 혼합한다.

Thermo Multiskan Ex를 사용하여 560/690nm에서 OD를 측정한다.

실시예 2.6.8 - LIM2537 인간 결장암 세포주를 이용한 본 발명에 따른 선택된 화합물에 대한 MTS 분석 결과

표 4 LIM2537 인간 결장암 세포주를 이용한 본 발명에 따른 선택된 화합물에 대한 MTS 분석 결과

Claims

화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:

화학식 Ⅰ
여기서, E 및 G는 서로 독립적으로 -NH-, -N(C_1-4알킬)-, -O- 및 -NH-C_1-4알킬렌- 으로 이루어진 군으로 선택되고;

은 단일 결합이고;
K는 독립적으로 CH 및 N으로부터 선택되고, 및 J는 독립적으로 NH 및 CH₂로부터 선택되고;
R¹은 0-2개의 치환기이고, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -C_1-4알킬, -OH, -O-C_1-4알킬, -N(R⁴)₂, -C_1-4알킬N(R⁴)₂, -O-C_1-4알킬-N(R⁴)₂, -O-벤질, -NO₂ 및 -CF₃로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R⁴는 독립적으로 -H, -C_1-4알킬, -C(O)OC_1-4알킬 및 -C_1-4알킬-OR⁷로 이루어진 군으로부터 선택되며; 또는
-N(R⁴)₂는 비치환 또는 C_1-4알킬로 치환된 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 몰폴리노기를 형성할 수 있으며;
R²는 0-2개의 치환기이고, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -C_1-4알킬, -OH, -O-C_1-4알킬, -N(R⁶)₂, -C_1-4알킬N(R⁶)₂, -O-C_1-4알킬-N(R⁶)₂, -O-벤질, -NO₂ 및 -CF₃로 이루어진 군으로부터 선택되며;
각각의 R⁶는 독립적으로 -H, -C_1-4알킬, -C(O)OC_1-4알킬 및 -C_1-4알킬-OR⁷로 이루어진 군으로부터 선택되며; 또는
-N(R⁶)₂는 비치환 또는 -C_1-4알킬로 치환된 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 또는 몰폴리노기를 형성할 수 있고;
R³은 -H, -C_1-4알킬 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되며; 및
여기서 R⁷은 -H 및 -C_1-4알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 화학식 Ⅱ의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 화합물:

화학식 Ⅱ
여기서, E 및 G는 서로 독립적으로 -NH-, -O- 및 -NH-C_1-4알킬렌- 으로 이루어진 군으로 선택되고; 및
R¹은 0-2개의 치환기이고, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -C_1-4알킬, -OH, -O-C_1-4알킬, -N(R⁴)₂, -C_1-4알킬N(R⁴)₂, -O-C_1-4알킬-N(R⁴)₂, -O-벤질, -NO₂ 및 -CF₃로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R⁴는 독립적으로 -H, -C_1-4알킬, -C(O)OC_1-4알킬 및 -C_1-4알킬-OR⁷로 이루어진 군으로부터 선택되며; 또는
-N(R⁴)₂는 비치환 또는 C_1-4알킬로 치환된 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 몰폴리노기를 형성할 수 있으며;
R²는 0-2개의 치환기이고, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -C_1-4알킬, -OH, -O-C_1-4알킬, -N(R⁶)₂, -C_1-4알킬N(R⁶)₂, -O-C_1-4알킬-N(R⁶)₂, -O-벤질, -NO₂ 및 -CF₃로 이루어진 군으로부터 선택되며;
각각의 R⁶는 독립적으로 -H, -C_1-4알킬, -C(O)OC_1-4알킬 및 -C_1-4알킬-OR⁷로 이루어진 군으로부터 선택되며; 또는
-N(R⁶)₂는 비치환 또는 C_1-4알킬로 치환된 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 또는 몰폴리노기를 형성할 수 있고;
R³은 -H, C_1-4알킬 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되며; 및
여기서 R⁷은 -H 및 -C_1-4알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 화학식 Ⅲ의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 화합물:

화학식 Ⅲ
여기서, E 및 G는 서로 독립적으로 -NH-, -O- 및 -NH-C_1-4알킬렌- 으로 이루어진 군으로 선택되고; 및
R¹은 0-2개의 치환기이고, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -C_1-4알킬, -OH, -O-C_1-4알킬, -N(R⁴)₂, -C_1-4알킬N(R⁴)₂, -O-C_1-4알킬-N(R⁴)₂, -O-벤질, -NO₂ 및 -CF₃로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R⁴는 독립적으로 -H, C_1-4알킬, -C(O)OC_1-4알킬 및 -C_1-4알킬-OR⁷로 이루어진 군으로부터 선택되며; 또는
-N(R⁴)₂는 비치환 또는 C_1-4알킬로 치환된 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 몰폴리노기를 형성할 수 있으며;
R²는 0-2개의 치환기이고, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 -C_1-4알킬, -OH, -O-C_1-4알킬, -N(R⁶)₂, -C_1-4알킬N(R⁶)₂, -O-C_1-4알킬-N(R⁶)₂, -O-벤질, -NO₂ 및 -CF₃로 이루어진 군으로부터 선택되며;
각각의 R⁶는 독립적으로 -H, -C_1-4알킬, -C(O)OC_1-4알킬 및 -C_1-4알킬-OR⁷로 이루어진 군으로부터 선택되며; 또는
-N(R⁶)₂는 비치환 또는 C_1-4알킬로 치환된 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 또는 몰폴리노기를 형성할 수 있고;
R³은 -H, C_1-4알킬 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되며; 및
여기서 R⁷은 -H 및 -C_1-4알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제1항에 있어서,
상기 각각의 E 및 G는 모두 독립적으로 -NH-C_1-4알킬렌- 으로부터 선택되는 화합물.
제4항에 있어서,
상기 E 및 G의 헤테로 원자는 모두 트리아진 고리와 결합하는 화합물.
제1항에 있어서,
상기 R¹ 및 R²는 서로 독립적으로 1-2개의 치환기인 화합물.
제1항에 있어서,
각각의 R¹ 및 R²는 적어도 하나의 파라 치환기인 것을 특징으로 하는 화합물.
제1항에 있어서,
상기 R¹ 치환기는 독립적으로 -OH, -O-C_1-4알킬, 및 -C_1-4알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제1항에 있어서,
상기 각각의 R²는 서로 독립적으로 -OH, O-C_1-4알킬, 및 -C_1-4알킬N(R⁶)₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제1항에 있어서,
상기 R³은 H, 메틸, 프로필, 부틸 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제1항에 있어서,
상기 R³은 수소인 것을 특징으로 하는 화합물.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물:

;
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; 및

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제12항에 있어서,
상기 화합물은 하기의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물:

; 및
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제1항의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
제14항에 있어서,
상기 암은 대장암(colon cancer), 비소 폐암(non-small lung cancer), 뇌암(brain cancer) 또는 유방암(breast cancer)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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