KR101887586B1

KR101887586B1 - 통증과 부종 그리고 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101887586B1
Application number: KR1020180046228A
Authority: KR
Inventors: 이기택
Original assignee: 이기택
Priority date: 2017-04-21
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2018-08-10
Also published as: WO2018194427A1; ES2949946T3; AU2018256263A1; CN109862897B; JP7034497B2; MX2019002289A; CO2019004317A2; IL266873B2; EP3479827A4; WO2018194427A8; US20190201328A1; RU2736974C1; AU2018256263B2; CA3031678A1; JP2020517581A; CN109862897A; IL266873B1; EP3479827B1; US11298314B2; EP3479827A1

Abstract

본 발명은, 통증, 부종 및 부작용이 없는 국소지방 분해용 주사제 조성물과 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 글리코콜린산(또는 이의 염) 또는 타우로콜린산(또는 이의 염)과 포스파티딜콜린(PPC)을 특정 배합비로 포함하여 통증과 부종 그리고 지방세포 외 근육세포, 섬유아세포 및 혈관내피세포 괴사, 투여부위의 무감각증, 광범위한 종창, 홍반, 경화, 감각이상, 결절, 가려움증, 작열감, 신경손상 및 연하곤란 등의 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물과 상기 조성물의 제조방법에 대한 것이다. 기존의 국소 지방 감소용 주사제로서 알려진 DCA 단독주사제 또는 가용화제로 DCA가 배합된 PPC 주사제 조성은 지방세포 뿐만 아니라 섬유아세포, 혈관내피세포 및 골격근 세포도 용해 시켜 필연적으로 야기되는 세포 괴사(necrosis)로 인해 통증 및 무감각증, 광범위한 종창, 국소적 부종, 홍반, 경화, 감각이상, 결절, 가려움증, 작열감, 연하곤란 등 부작용이 동반되어 환자들이 통증과 불편함 그리고 불안감을 호소하며 복약 순응도가 낮은데 반해, 본 발명의 국소지방 감소용 주사제는 제제가 안전하고 안정적이며 지방세포만 선택적으로 지방분해(lipolysis)와 지방세포 사멸(apoptosis) 유도 효과가 우수하여 상기 언급된 부작용이 없이 환자들의 삶의 질을 높이고 복약 순응도를 높인 우수한 조성이다.

Description

통증과 부종 그리고 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물 및 이의 제조방법{Injectable composition for localized fat reduction without pain, edema and side effect}

본 발명은 약제학적으로 활성인 포스파티딜콜린을 사용하여 국소적으로 침착된 지방(localized fat deposit)을 가진 대상자에게 통증, 부종 그리고 부작용 없이 비수술적으로 지방을 감소시키는데 유용한 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (i) 포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine); 및 (ii) 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA), 타우로콜린산(Taurocholic acid, TCA) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하고, 상기 (i) 및 (ii)는 (ii)/(i)의 몰비(mol/mol)가 0.7 내지 3.0인 것을 특징으로 하는, 통증(pain) 및 부작용[특히 지방세포 외 근육세포, 섬유아세포 및 혈관내피세포 괴사(necrosis); 부종(edema); 투여 부위의 무감각증(anesthesia); 광범위한 종창(swelling); 홍반(erythema); 경화(induration); 감각이상(paresthesia); 결절(nodule); 가려움증(pruritus); 작열감(warmth); 신경손상(nerve injury); 또는 연하곤란(dysphagia)]이 경감된 국소지방 감소용 조성물 및 제제, 이를 포함하는 키트, 이들의 제조방법에 대한 것이다.

국소적으로 침착된 지방은 많은 사람에게 특별한 관심사이다. 얼굴 또는 신체 일부분에 원치 않게 볼록하거나 통통하게 침착된 지방이 있는 사람은 외모적으로 매력이 떨어지고 늙어 보일 수 있다. 이와 같은 원인은 노화, 생활습관 또는 유전적 소인으로 인해 발생할 수 있으며 이를 극복하기 위해 운동요법과 식이요법으로 개선하고자 하지만 지방감소 효과는 제한적이다.

국소적으로 침착된 지방(localized fat deposits)을 감소하기 위한 대표적인 수술적 미용성형방법(cosmetic surgical procedures)은 지방흡입술(liposuction), 지방성형술(lipoplasty), 지방조각 흡입 절개술(liposculpture suction)로 많은 양의 지방을 제거하는 미용 외과수술이다. 비수술적 미용성형방법(cosmetic minimally-invasive procedures)은 의료기기, 메조테라피(mesotheraphy), 오프라벨(off-label) 주사를 이용한 시술이다. 하지만 수술적 방법은 치유에 몇 주 혹은 몇 달이 소요되며, 흡연자 및 당뇨병 환자와 같은 특정인은 치유가 상당히 지연될 수 있으며, 십만 명 당 20명이 사망하는 치명적인 부작용, 전신마취의 위험성, 과도한 출혈, 내부 장기 손상, 세균 감염, 흉터, 멍, 종창, 통증과 같은 잠재적 합병증과 위험성을 내포하고 있다. 이에 대한 대안인 비수술적 방법의 경우, 보건당국의 관리 감독하에 승인받아 실시한 대규모 임상시험의 부재로 인하여 안전성과 유효성이 확보되지 않아 잠재적 위해성을 내포하고 있다. 국소 지방감소에 대한 수술적 방법의 위험성과 비술적 방법의 위해성이 없으며 임상적으로 유익성 있는 새로운 의약품 개발이 필요한 실정이다.

국소 지방감소용 주사제(injectable drugs for localized fat reduction)는 약물을 피하지방층에 주사하여 지방세포 감소를 유도하는 시술이다. 대표적인 사례가 PPC 주사이다. PPC 주사는 Polyene Phosphatidylcholine의 약자로, 1950년대에 독일에 위치한 사유기업인 A. Nattermann GmbH사에서 간 질환 치료용으로 개발한 Essentiale ^® N i.v.와 지방색전증의 예방과 치료로 개발한 Lipostabil^® N i.v. 그리고 대한민국의 간경변에 의한 간성혼수 보조치료제로 승인받은 리포빈^®주가 있다.

PPC 주사제를 간 질환 또는 지방색전증 예방과 치료 목적으로 처방하던 중 1988년 프랑스 파리 메조테라피학회에서 이탈리아 의사 Dr.Sergio Maggiori가 PPC 주사로 눈꺼풀에 노랗게 지방이 침착되는 질환인 안검황색종(Xantelasma)을 치료한 연구결과를 최초로 발표한 이후 1999년 브라질 피부과학회에서 브라질 의사 Dr. Patricia G. Rittes가 PPC 주사로 눈 밑 지방패드(lower eyelid fat pads) 감소에 대한 연구결과를 발표하면서 PPC 주사의 지방감소 가능성이 확인되었다. 그 이후 PPC주사를 지방이 침착된 복부, 옆구리, 허벅지, 턱밑, 등, 팔, 다리, 지방종(lipoma) 투여에 대한 소규모 안전성과 유효성에 관한 연구결과들이 발표되었다.

PPC 주사제는 주성분 폴리엔 포스파티딜콜린(polyene phosphatidylcholine)과 가용화제 데옥시콜린산(deoxycholic acid)이 배합된 조성물이다. PPC는 필수인지질로 생물학적 막의 주요 성분으로서 Glycerol 탄소 Backbone에 인과 콜린의 친수성 머리에 5가지 지방산이 결합된 소수성 꼬리 구조로 구성되어 있다. 이는 인체의 세포막과 미토콘드리아 망상 구조의 55%를 차지하고 있으며 인체에서 거의 합성되지 않기 때문에 체외로부터 공급받아야 하는 필수성분으로 대두(soybean), 난황(egg) 등에 많이 함유되어 있으며 핵산을 이용하여 물리적 또는 화학적 방법으로 추출할 수 있으며 고순도로 추출 정제한다.

데옥시콜린산(DCA)은 장 박테리아의 대사 부산물인 2차 담즙염(bile salts) 중 하나로, 난용성 PPC를 안정하게 주사가 가능한 조성물로 제조하기 위해 가용화제로 배합되어 있다. DCA로 가용화한 PPC는 10nm 이하 혼합 미셀(mixed micelles) 시스템으로 안정하게 분산되어 있으며 PPC를 가용화하지 않은 채로 주사하게 되면, 단일분자로 잘 용해되지 않게 되어 원하는 혈중농도를 얻을 수 없게 된다. 또한, 혈관이 막혀 혈전이 생길 수 있으므로 가용화되지 않은 PPC는 주사제로 사용하지 않는다. 정맥 주사 시에 약물이 가용화되지 않고 현탁한 침전을 형성하게 된다면, 큰 입자들이 혈관을 막게 되고, 막힌 혈관 주변의 조직에 혈류에 영향을 미치거나 조직에 손상이나 자극을 주게 되어 가려움, 통증, 발작 등이 발생하게 된다. 심한 경우에 색전이 생기게 될 수도 있다.

주성분 PPC와 가용화제 DCA 조성물인 Lipostabil® N i.v.가 지방조직이 정맥에 흘러 들어가 색전증을 야기하는 지방색전증(Fat embolism)치료에 처방된다는 것에 근거하여 PPC가 지방감소의 활성 성분으로 간주되어 왔으나, 2004년 PPC 주사제에 가용화제로 배합된 DCA가 계면활성제 효력(detergent effect)으로 세포 괴사(necrosis)를 야기시켜 지방세포가 감소하는 것으로 확인되어, PPC 주사제의 지방감소 약리활성성분(active ingredient)은 DCA인 것으로 밝혀졌다(비특허문헌 1). 이를 바탕으로 2015년 FDA는 미국에 위치한 사유 기업인 Kythera biopharmaceuticals INC가 개발한 PPC를 포함하지 않는 DCA 단독 주사제를 턱밑 지방감소를 위한 외모 개선용 세포용해제로 승인하였다.

하지만 DCA 단독 또는 DCA로 가용화한 PPC 주사제는 비선택적으로 지방세포(3T3L1 adipocytes)뿐만 아니라 섬유아세포(normal fibroblasts), 혈관내피세포(Endothelial cells), 골근격세포(Skeletal muscle cells)까지 용해하기 때문에 지방분해주사가 아닌 세포용해주사이다(비특허문헌 2).

임상적으로 PPC와 DCA가 배합된 조성은 DCA의 강력한 염증과 세포용해 작용으로 피하지방층에 투여 시 통증(78.4%), 혈종(83.8%), 홍반(100%), 작열감(100%), 부종(100%), 경화(66.7%) 그리고 DCA 단독조성은 통증(100%), 멍(91.9%), 홍반(100%), 작열감(100%), 종창(100%), 경화(89.2%)를 야기하는 것으로 보고되었을 뿐만 아니라(비특허문헌 3), DCA 단독조성에 대한 대규모 임상시험 결과, 통증(73.6%), 혈종(72.9%), 부종(67.8%), 무감각증(65.5%), 홍반(35.3%), 종창(29.1%), 경화(28.3%), 소양감(16.3%), 결절(14.3%)을 야기하는 이상반응이 보고되었다(비특허문헌 4). 이와 같은 유해사례들은 DCA를 피하주사하면 세포에 산소공급을 차단하여 즉각적인 세포팽창과 세포막에 수포 및 손상을 야기시켜 급격한 염증반응으로 세포가 괴사(necrosis)되는 작용기전에 기인한다(비특허문헌 5).

생체 내에서 세포가 죽을(death) 때, 괴사(necrosis)되는 것과 사멸(자멸사, apoptosis)되는 것에는 현격한 차이가 있다. 아포토시스(apoptosis)는 세포 내부에서 프로그램화된 신호를 따라 여러 유전자 및 단백질들의 발현과 활성이 조절되어 일어나는 능동적인 죽음을 말하며, 그 과정을 통해 생성된 아폽토좀(apoptosome)들은 주변의 세포들이나 대식세포(macrophage) 등의 식세포 작용에 의해 제거됨으로서, 염증을 유발하지 않는다. 반면, 세포 괴사(necrosis)는 외부적 환경의 변화에 의해 급격히 일어나는 수동적 죽음으로 염색사의 다형태적 덩어리(irregular clumping) 및 세포질의 팽창(swelling of cytoplasm) 과정을 거치게 되고, 최종적으로 세포들의 분해를 통해 세포파편(cell debris)이 생성되며 이들은 염증을 유발하는 것으로 알려져 있다 (Earnshaw, W.C., Curr. Opin. Cell Biol., 7, pp. 337-343, 1995).

따라서 국소 지방감소 주사제가 세포 괴사 효력으로 작용하면, 해당 약물을 투여한 목적 부위 이외의 주변 영역에도 염증작용이 영향을 미치기 때문에 정상적으로 기능하여야 할 세포들에도 영향을 주어 죽게 된다. 이러한 사실을 종합하건데, 기 승인 받은 외모개선용 세포 용해 주사제에서 나타나는 통증, 부종, 무감각증, 광범위한 종창, 홍반, 경화, 감각이상, 결절, 가려움증, 작열감, 그리고 지방세포 외 섬유아세포, 근육세포, 혈관내피 세포 괴사 없이 투여 약물이 작용하는 부위에서 선택적으로 지방세포들에만 지방분해(lipolysis)와 세포자멸사(apoptosis)를 고효율로 유발시키는 것이 중요하다고 할 것이나, 현재까지 이러한 관점에서 수행된 연구 및 제제 개발은 없는 실정이다(비특허문헌 6).

현재 PPC와 DCA가 배합된 조성의 주사제인 Lipostabil^® N i.v., Essentiale^® N i.v. , Lipobean^® i.v.를 국소 지방감소 용도로 투여한 오프라벨 시술과 Kybella(DCA 단독 조성)는 지방감소에 대한 많은 연구가 수행되었을 뿐만 아니라 Kybella가 글로벌 최초로 외모개선용 세포용해제(cytolytic drug)로 FDA 승인을 획득한 성공적인 측면도 있지만, 종래 기술들 및 조성물들은 소정의 한계가 있다. PPC+DCA 조성물 또는 DCA 단독 조성물은 통증, 부종, 무감각증, 광범위한 종창, 홍반, 경화, 감각이상, 결절, 가려움증, 작열감 뿐만 아니라 지방세포 외 섬유아세포, 근육세포, 혈관내피 세포 괴사로 인하여 비수술적 시술로 지방감소를 희망하는 대상자들은 불편함과 불안감을 호소하고 있다. 이러한 사유로, 현재 임상적 유효성이 검증되었음에도 복약 순응도가 낮은 실정이다. 이에 현재 이용 가능한 세포용해 주사제에 비해서 염증에 의한 통증과 부종이 없으며 선택적으로 지방세포만 사멸과 분해를 야기시켜 부작용 없이 지방이 감소되는 주사제 개발이 요구된다. 본 발명은 이러한 요구사항을 충족시킨다.

위와 같은 사실에 기초하여 본 발명 연구진은 PPC의 지방감소 효력을 연구하던 중 DCA가 첨가되지 않은 PPC 단독 조성물은 지방세포에서 괴사(necrosis)가 아닌 사멸(apoptosis)로 지방세포만 감소시키고 섬유아세포 감소에 영향을 주지 않는 연구결과를 발표하였다(비특허문헌 7). 그 이후 지속적으로 통증과 부종 그리고 부작용이 없는 PPC 주성분 기반의 선택적 지방세포 감소용 조성물 연구하던 중 본 발명을 완성하게 되었다.

Rotunda AM, Suzuki H, Moy RL, Kolodney M., Detergent effects of sodium deoxycholate are a major feature of an injectable phosphatidylcholine formulation used for localized fat dissolution. Dermatol Surg 30(7):1001-8(2004) A.Gupta, Action and comparative efficacy of phosphatidylcholine formulation and isolated sodium deoxycholate for different cell type, Aest Plast Sur, 33:346-352, 2009 Giovanni Salti, Phosphatidylcholine and sodum deoxycholate in the treatment of localized fat: A doube-blind, randomized study, Dermatol Surg 34:60-66, 2007 Humphrey et al, ATX-101 for reduction of submental fat: A Phase Ⅲ randomized controlled trial, J AM ACAD DERMATOL Vol75, No.4, 788-797, 2016 Duncan, Injectable therapies for localized fat loss: state of the art, Clin Plastic Surg, 1-13, 2011 Duncan, Refinement of Technique in injection lipolysis based on scientific studies and clinical evaluation, Clin Plastic Surg 36 195-209 (2009) Dong-Seok Kim, Phosphatidylcholine induces apoptosis of 3T3-L1 adipocytes, Journal of biomedical science,18:91,1-7, 2011

본 발명자는 기존 DCA 단독 조성 주사제 또는 DCA로 가용화한 PPC 조성 주사제들은 염증에 의한 통증과 부종 그리고 비선택적 세포용해로 기인한 다양한 부작용, 특히 지방세포뿐만 아니라 섬유아세포, 혈관내피세포 및 골격근 세포까지 괴사(necrosis)시키는 작용으로 야기되는 임상적으로 심각한 부작용들을 해결하기 위하여, 지방세포에서 세포사멸(apoptosis)과 지방분해(lipolysis) 기전으로 통증과 부종 없이 지방이 감소되며 섬유아세포, 혈관내피세포 및 골격근 세포 손상 없이 선택적으로 지방세포만 감소시켜 부작용이 없는 안전하고 안정한 국소 지방감소용 주사제 조성물을 제조하기 위한 연구를 수행하였다. 그 결과 타우로콜린산(TCA), 특히 글리코콜린산(GCA)을 특정 배합비로 포스파티딜콜린(PPC)에 첨가하여 제조한 본원 발명의 조성물은 안전(safety)하고 제형 안정성(stability)이 우수할 뿐만 아니라, 세포 괴사(necrosis)를 유발하는 것이 아니라, 선택적으로 지방세포만 사멸과 분해를 유도하여 임상적으로 통증과 부종 그리고 부작용 없이 지방감소를 야기하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은, (i) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline); 및 (ii) 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA), 타우로콜린산(Taurocholic acid, TCA) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하고, 상기 (i) 및 (ii)는 (ii)/(i)의 몰비가 0.7 내지 3.0인 것을 특징으로 하는, 통증 및 부작용(부종; 투여부위의 무감각증; 광범위한 종창; 홍반; 경화; 감각이상; 결절; 가려움증; 작열감; 신경손상; 연하곤란; 및 지방세포 외의 다른 섬유아세포, 근육세포 및 혈관내피 세포 괴사 등)이 경감된 국소지방 감소용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 대상에서 통증 및 부작용이 경감되고 국소화된 지방 침적(localized fat deposit)을 제거하기 위한 제제로서, 상기 제제는 (i) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline); 및 (ii) 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA), 타우로콜린산(Taurocholic acid, TCA) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하고, 상기 (i) 및 (ii)는 (ii)/(i)의 몰비가 0.7 내지 3.0인 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은,

(Ⅰ) (i) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline); 및

(ii) 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA), 타우로콜린산(Taurocholic acid, TCA) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하며 상기 (i) 및 (ii)는 (ii)/(i)의 몰비가 0.7 내지 3.0인, 대상에서 통증 및 부작용이 경감되고 국소화된 지방 침적을 제거하기 위한 조성물 또는 제제를 포함하는 제1 콘테이너; 및

(II) 상기 조성물을 지방 축적 부위에 전달할 수 있는 전달 장치를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은,

(Ⅰ) (i) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline); 및

(ii) 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA), 타우로콜린산(Taurocholic acid, TCA) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하며, 상기 글리코콜린산, 타우로콜린산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것은 포스파티딜콜린의 질량 이하로 포함되는, 대상에서 통증 및 부작용이 경감되고 국소화된 지방 침적을 제거하기 위한 조성물 또는 제제를 포함하는 제1 콘테이너; 및

본 발명의 또 다른 목적은, (a) 주사용수에 글리코콜린산(Glycocholic acid), 타우로콜린산(Taurocholic acid) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 넣고 투명하게 용해될 때까지 교반하는 단계; (b) 보존제를 넣고 교반하는 단계; (c) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline)을 투입하고 상온에서 교반하는 단계; 및 (d) 물로 총 부피를 맞추고 교반하는 단계를 포함하며, 상기 글리코콜린산, 타우로콜린산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것/포스파티딜콜린의 몰비가 0.7 내지 3.0으로 투입되는 것을 특징으로 하는, 통증 및 부작용(부종; 투여부위의 무감각증; 광범위한 종창; 홍반; 경화; 감각이상; 결절; 가려움증; 작열감; 신경손상; 연하곤란; 및 지방세포 외의 다른 섬유아세포, 근육세포 및 혈관내피 세포 괴사 등)이 경감된 국소지방 감소용 주사제 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 통증 및 부작용이 경감되고 국소적 지방 축적을 비수술적으로 제거하기 위한 의약 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 조성물은

포스파티딜콜린과

글리코콜린산, 타우로콜린산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하되,

상기 글리코콜린산, 타우로콜린산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것은 포스파티딜콜린의 질량 이하로 투입되는 것을 특징으로 하는 제조방법을 제공하는 것이다.

일 구현예에서, 상기 제제는 지방-용해 농도의 포스파티딜콜린을 1.0% 내지 약 15.0% 농도를 포함한다.

일 구현예에서, 상기 제제는 주사 가능한 제제이다. 다른 구현예에서, 상기 제제는 지방세포 감소용 주사 제제이다.

본 발명은 또한 국소적으로 지방이 침착된 부위를 갖는 대상자에게 비수술적 감소를 위한 방법을 제공한다.

일 구현예에서, 상기 방법은 pH6.0 내지 pH9.0의 pH를 갖는 약제학적으로 허용가능한 제제 중 글리코콜린산 또는 타우로콜린산으로 가용화한 포스파타딜콜린 조성 중 하나 이상을 포함하는 제제를 투여하는 단계를 포함한다.

일 구현예에서, 상기 투여 단계는 피하 주사를 포함한다.

일 구현예에서, 상기 국소화 된 지방 축적은 하안검 지방 헤르니아 (lower eyelid fat herniation), 지방종 (lipomas), 지방이상증 (lipodystrophy), 및 셀룰라이트 관련성 지방 축적 (fat deposits associated with cellulite)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 구현예에서, 상기 지방 침적은 상기 대상의 눈 밑, 턱 밑, 팔 밑, 엉덩이, 종아리(장딴지), 등, 넓적다리, 발목, 또는 위에 국소화되어 있다.

본 발명은 또한, 글리코콜린산 또는 타우로콜린산으로 가용화한 포스파타딜콜린 조성 중 하나 이상을 포함하는 제제를 하나 이상 포함하는, 대상에서 국소화된 지방 침적을 비수술적으로 제거하기 위한 제제를 사용하기 위한 설명서 (written instruction)를 포함하는 키트를 제공한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline); 및 (ii) 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA), 타우로콜린산(Taurocholic acid, TCA) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하고, 상기 (i) 및 (ii)는 (ii)/(i)의 몰비가 0.7 내지 3.0인 것을 특징으로 하는, 통증 및 부작용(부종; 투여부위의 무감각증; 광범위한 종창; 홍반; 경화; 감각이상; 결절; 가려움증; 작열감; 신경손상; 연하곤란; 및 지방세포 외의 다른 섬유아세포, 근육세포 및 혈관내피 세포 괴사 등)이 경감된 국소지방 감소용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대상에서 통증 및 부작용이 경감되고 국소화된 지방 침적(localized fat deposit)을 제거하기 위한 제제로서, 상기 제제는 (i) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline); 및 (ii) 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA), 타우로콜린산(Taurocholic acid, TCA) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하고, 상기 (i) 및 (ii)는 (ii)/(i)의 몰비가 0.7 내지 3.0인 제제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(Ⅰ) (i) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline); 및

(II) 상기 조성물을 지방 축적 부위에 전달할 수 있는 전달 장치를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(Ⅰ) (i) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline); 및

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 주사용수에 글리코콜린산(Glycocholic acid), 타우로콜린산(Taurocholic acid) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 넣고 투명하게 용해될 때까지 교반하는 단계; (b) 보존제를 넣고 교반하는 단계; (c) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline)을 투입하고 상온에서 교반하는 단계; 및 (d) 물로 총 부피를 맞추고 교반하는 단계를 포함하며, 상기 글리코콜린산, 타우로콜린산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것/포스파티딜콜린의 몰비가 0.7 내지 3.0으로 투입되는 것을 특징으로 하는, 통증 및 부작용(부종; 투여부위의 무감각증; 광범위한 종창; 홍반; 경화; 감각이상; 결절; 가려움증; 작열감; 신경손상; 연하곤란; 및 지방세포 외의 다른 섬유아세포, 근육세포 및 혈관내피 세포 괴사 등)이 경감된 국소지방 감소용 주사제 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

통증 및 부작용이 경감되고 국소적 지방 축적을 비수술적으로 제거하기 위한 의약 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 조성물은

포스파티딜콜린과

용어

본 발명에서 용어‘포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine)’은 인지질로 IUPAC Name 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine으로 표시되는 화합물을 의미하며 본 명세서에서 PPC로 기재되다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해서 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 비록 본 명세서에 서술된 것과 유사하거나 또는 균등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 서술되어 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은, 하기 용어들 각각은 본 섹션에서 그와 관련된 의미를 갖는다.

관사 "a" 및 "an"은 상기 관사의 문법적 대상 중 하나 이상 (즉, 적어도 하나)을 나타내기 위해서 본 명세서에서 사용된다. 예를 들어, "요소 (an element)"는 하나의 요소 또는 그 이상의 요소를 의미한다.

양, 시간적 길이 등과 같은 측정 가능한 수치를 지칭하는 경우 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "약 (about)"은, 하기 변이가 개시된 방법을 수행하기에 적절하기 때문에, 명시된 수치로부터 ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, 또는 ± 0.1%의 변이를 포함하는 것을 의미한다.

질병 또는 장애의 증상의 심각도, 환자가 경험하는 그러한 증상의 빈도, 또는 양자 모두가 감소되는 경우, 질병 또는 장애는 "경감되어 (alleviated)" 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "담즙산 (bile acid)"은 스테로이드산 (및/또는 그 카르복실산 음이온), 및 그 염을 포함하며, 동물 (예를 들어, 인간)의 담즙에서 발견되는 것으로서, ‘데옥시콜린산(Deoxycholic acid)’은 담즙염의 일종으로서, IUPAC Name (4R)-4-[(3R,5R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12- dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoic acid로 표시되는 화합물을 의미한다. 본 발명의 명세서에서 DCA로 기재된다.

‘글리코콜린산(Glycocholic acid)’는 담즙염의 일종으로서, IUPAC Name 2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]acetic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 GCA로 기재된다.

‘타우로콜린산(Taurocholic acid)’는 담즙염의 일종으로서, IUPAC Name 2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]ethanesulfonic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 TCA로 기재된다.

‘콜린산(Cholic acid)’는 담즙염의 일종으로서, IUPAC Name (4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 CA로 기재된다.

‘케노데옥시콜린산(Chenodeoxycholic acid)’는 담즙염의 일종으로서, IUPAC Name((4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 CDCA로 기재된다.

‘우루소데옥시콜린산(Ursodeoxycholic acid)’는 담즙염의 일종으로서, IUPAC Name (4R)-4-[(3R,5S,7S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 UDCA로 기재된다.

‘글리코데옥시콜린산(Glycodeoxycholic acid)’는 담즙염의 일종으로서, IUPAC Name 2-[[(4R)-4-[(3R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]acetic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 GDCA로 기재된다.

‘타우로데옥시콜린산(Taurodeoxycholic acid)’는 담즙염의 일종으로서, IUPAC Name 2-[[(4R)-4-[(3R,5R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]ethanesulfonic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 TDCA로 기재된다.

‘히오데옥시콜린산(Hyodeoxycholic acid)’는 담즙염의 일종으로서, IUPAC Name (4R)-4-[(3R,5R,6S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-3,6-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 HDCA로 기재된다.

‘리토콜린산(Lithocholic acid)’는 담즙염의 일종으로서, IUPAC Name (4R)-4-[(3R,5R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3-hydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 LCA로 기재된다.

‘타우로우루소데옥시콜린산(Tauroursodeoxycholic acid)’는 담즙염의 일종으로서, IUPAC Name 2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]ethanesulfonic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 TUDCA로 기재된다.

‘디히드로콜린산(Dehydrocholic acid)’는 담즙염의 일종으로서, IUPAC Name (4R)-4-[(5S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-3,7,12-trioxo-1,2,4,5,6,8,9,11,14,15,16,17-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 DHCA로 기재된다.

용어 "환자 (patient)", "대상 (subject)", "개체 (individual)" 등은 본 명세서에서 서로 교환 가능하게 사용되며, 본 명세서에 기술된 방법에 순응할 수 있는 (인 비트로 또는 인 시투 등에서) 임의의 동물, 또는 그 세포를 지칭한다. 특정 비제한적인 구현예들에서, 상기 환자, 대상 또는 개체는 인간이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "조성물 (composition)" 또는 "약제학적 조성물 (pharmaceutical composition)"은, 본 발명에서 사용되는 하나 이상의 화합물 또는 조성물과 임의의 추가적 담체(carriers), 안정화제, 희석제, 분산제, 현탁제, 농후제 (thickening agents), 및/또는 부형제 (excipients)와 같은 다른 화학 성분의 혼합물을 모두 포함하는 의미일 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 상기 화합물의 유기체로의 투여를 촉진한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "유효량 (effective amount)", "약제학적으로 유효한 양 (pharmaceutically effective amount)" 및 "치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"은 비독성이지만 원하는 생물학적 결과를 제공하기에 충분한 양을 나타낸다. 상기 결과는 징후, 증상, 또는 질병의 원인 감소 및/또는 경감, 또는 생물학적 시스템의 임의의 다른 원하는 변화(alteration)일 수 있다. 임의의 개별적 사안에서 적당한 치료학적 양은 통상의 실험을 사용하여 통상의 기술자에 의해서 결정될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "효능 (efficacy)"은 분석방법 내에서 달성되는 최대 효과(Emax)를 의미하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은, "지시적 물질 (instructional material)"은 본 명세서에 언급된 다양한 질병 또는 장애의 경감을 발휘하기 위한 키트 중에서 본 발명의 화합물, 조성물, 벡터, 또는 전달 시스템의 유용성을 전달하는데 사용될 수 있는 간행물, 기록 (recording), 다이어그램, 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 선택적으로, 또는 대안으로서, 상기 지시적 물질은 포유류의 세포 또는 조직 내에서 질병 또는 장애의 경감에 대한 하나 이상의 방법을 서술할 수 있다. 본 발명의 상기 키트의 상기 지시적 물질은, 예를 들어, 본 발명의 상기 확인된 화합물, 조성물, 벡터, 또는 전달 시스템을 포함하는 용기에 부착될 수 있거나, 또는 상기 확인된 화합물, 조성물, 벡터, 또는 전달 시스템을 포함하는 용기와 함께 출하 (ship)될 수 있다.

대안적으로, 상기 지시적 물질은, 상기 지시적 물질 및 상기 화합물(조성물)이 수용자에 의해서 협동적으로 사용되는 것을 의도로 상기 용기와는 별도로 출하될 수도 있다.

"국소적 투여 (local administration)"는 약제학적 성분을 비전신적 경로에 의해서 환자의 근육 또는 피하 위치(subdermal location)에, 또는 그 주변에 투여하는 것을 의미한다. 따라서, 국소적 투여는 정맥 또는 구강 투여와 같은 전신적 경로를 통한 투여는 배제한다.

"약제학적으로 허용 가능한 (pharmaceutically acceptable)"은, 조성, 제제, 안정성, 환자 수용성 및 생물이용 가능성에 관하여 약리학적/독성학적 관점에서 및 물리적/화학적 관점에서 제조하는 약제학적 화학자에게 수용 가능한 특성 및/또는 물질을 나타낸다. "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 활성 성분(들)의 생물학적 활성의 유효성 (effectiveness)을 방해하지 않고 투여되는 호스트에 독성을 나타내지 않는 매체를 나타낸다.

"치료학적 (therapeutic)" 치료 (treatment)는 징후 또는 증상을 감소 또는 제거하기 위한 목적으로, 병리 징후 또는 증상을 나타내는 대상에게 투여되는 치료이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "치료 (treatment)" 또는 "치료하는 (treating)"은 본 명세서에서 고려된 상태, 본 명세서에서 고려된 상태의 증상 또는 본 명세서에서 고려된 상태로 진전될 잠재성을 치료 (cure), 치유(heal), 경감 (alleviate), 완화(relieve), 변화(alter), 구제(remedy), 개선(ameliorate), 향상 (improve) 또는 영향을 주기 위하여, 치료학적 작용제, 즉 본 발명의 조성물(단독 또는 다른 약제학적 작용제와 조합으로)을 환자에게 적용 또는 투여하는 것으로 정의되거나(예를 들어, 진단 또는 인 비보 적용을 위해서), 환자로부터 분리된 조직 또는 세포주에 치료학적 작용제를 적용 또는 투여하는 것(예를 들어, 진단 또는 인 비트로 적용을 위해서)으로 정의되고, 상기 본 명세서에서 고려된 상태는, 본 명세서에서 고려된 상태의 증상(symptoms) 또는 본 명세서에서 고려된 상태로 진전될 잠재성을 갖고 있다. 상기 치료는 약리학 분야로부터 얻어진 지식에 기초하여 구체적으로 맞추어지거나 변형될 수 있다.

"치료학적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)"은 환자에게 투여되는 경우, 질병의 증상을 개선하는 본 발명의 조성물(또는 조성물을 이루는 개별화합물)의 양이다. "치료학적으로 유효한 양"을 구성하는 본 발명 조성물의 양은, 상기 조성물을 구성하는 화합물, 질병 상태 및 그 심각성, 치료되는 환자의 연령 등에 따라서 변화될 수 있다. 치료학적으로 유효한 양은 자신의 지식 및 본 개시를 고려하여 당 분야에서 통상의 기술을 지닌 자에 의하여 통상적으로 결정될 수 있다.

범위: 본 개시 전반에 걸쳐서, 본 발명의 다양한 양상들이 범위 형식으로 제안될 수 있다. 본 명세서에서 범위값의 기재는, 별다른 언급이 없는 한 해당 경계값을 포함하는 것으로서 즉, 하한값 이상 내지 상한값 이하의 값을들 모두 포함하는 의미이다. 범위 형식의 서술은 단순히 편의성 및 간략성을 위한 것이며, 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한 (inflexible limitation)으로서 해석되지 않아야 하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 서술은 상기 범위 내의 개별적인 수치값들뿐만 아니라 모든 가능한 하부범위(subrange)를 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 서술은 상기 범위 내의 개별적 수치들, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6뿐만 아니라, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하부범위들을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭과 무관하게 적용된다.

본 발명에서 조성물 함량 표기 시에 사용되는‘%’는 특별한 언급이 없는 한 w/v%의 함량을 의미하며, 별도의 언급이 없는 한 전체 조성물을 기준으로하는 w/v% 값을 의미한다.

본 발명에서 ‘글리코콜린산 또는 타우로콜린산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는지 하나 이상의 것/포스파티딜콜린’ 기재중 ‘/’표시는, 통상적으로 사용되는 양식의 분수(fraction) 표시이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

FDA 승인받은 외모개선용 세포용해제인 키벨라(DCA 1.0%)와 오프라벨 시술된 DCA로 가용화한 PPC 주사제 조성물(예를 들어, 리포스타빌, 엣센샬주, 리포빈주)은 국소 지방감소 목적으로 피하주사 시 염증 반응에 의해 통증과 부종을 동반한다. 또한 지방세포 뿐만 아니라 섬유아세포, 골격근세포, 혈관내피세포까지 괴사를 야기하는 비선택적 세포용해제로 투여 부위의 괴사, 궤양 및 하악신경마비, 신경손상과 같은 치명적인 부작용이 보고되고 있다. 이러한 연유로, 잠재적인 지방 외 조직 손상을 방지하기 위해 침샘, 림프절, 근육 내에 또는 이와 매우 근접한 부위에 약을 주사하지 말 것을 경고하고 있다. 또한 현재 키벨라를 투여받은 대상자들은 통증, 부종, 안면마비 및 피부층 괴사와 같은 부작용이 지속적으로 보고되고 있다.

이에 대하여 본 발명의 발명자는 가용화제가 첨가되지 않은 PPC(5.0%) 단독조성물이 키벨라(DCA 1.0%)의 in vitro 지방세포 감소 효력은 동등하지만 PPC는 선택적으로 지방세포만 사멸과 분해 기전으로 감소를 유도하여 통증과 부종 그리고 부작용이 없는 지방감소용 조성물 개발의 가능성을 확인하였다. 하지만 PPC는 난용성으로 물리적 또는 화학적으로 안정하고 안전하게 주사가 가능한 조성물 제조에 한계가 있었다. 이와 같은 배경으로 2010년부터 PPC를 주성분으로 하는 지방세포 감소제 조성물을 연구하였다. 그 결과 고압호모게나이저로 분산한 PPC는 시간과 농도 의존적으로 지방세포 감소 효력이 있지만 낮은 안정성(stability)으로 인하여 산업적 이용에 한계가 있었다.

이러한 연유로, 본 발명자는 난용성 PPC를 안전하고 안정하게 피하주사가 가능한 조성물들을 제조하기 위해 물리적 및 화학적 방법으로 제제실험들을 수행하였다(도 1 내지 도 3). 본 연구는 담즙산(염)의 계면활성력에 따라 독성은 특이적으로 나타낼 수 있다는 가정에서 출발한다. 계면활성 기능은 PPC 고유의 지방세포 사멸과 분해 효력을 억제하고, 괴사 기능으로 세포용해를 유도해 고통과 부종 그리고 부작용을 동반한 국소 지방감소를 야기하므로, 구체적인 계면활성제의 종류와 이의 사용 용량(비율)을 결정하는 것은 당업자에게 있어 상당한 기술적 곤란성을 야기한다.

이하에서 여러 가지 비교예, 실시예 및 실험예들에서 제공된 결과는, 본 발명 조성물의 예기치 못한 특이적 효과를 입증한다. 간략하게, 본 발명자들은 제제 실험결과 산업적으로 이용 가능한 안정한 조성물임이 확인되어 선택된 조성물 중, in vivo 부종과 병변 그리고 염증 평가에서 국소 이상반응이 없거나 경증으로 확인된 담즙산(염) 조합을 선발하였다. 그리고, 선발된 담즙산(염) 중 in vitro 지방세포, 섬유아세포, 내피세포 및 골격근 세포의 생존력 평가에서 지방세포 선택성이 검증되어 선택된 본 발명의 GCA 또는 TCA로 가용화한 PPC 조성물에 대한 지방세포 사멸과 분해 효력을 검증하였다. 또한 본 발명의 GCA로 가용화한 PPC 복합 조성물은 국소 뿐만 아니라 전신 독성이 월등히 없음을 확인하였다. 그리고 본 발명품으로 실시한 연구자 임상시험결과, 지방감소에 대한 유효성은 키벨라와 비열등적(non inferiority)이며 통증과 부종 그리고 부작용은 없거나 80% 이상 경감된 지방감소용 주사제 조성물이라는 예기치 않은 발견을 입증한다. 이하에서 이를 더욱 구체적으로 기술한다.

PPC의 가용화제로 선택된 답즙염(bile salts)은 콜린산(cholic acid, CA), 데옥시콜린산(deoxycholic acid, DCA), 글리코콜린산(glycocholic acid, GCA), 타우로콜린산(taurocholic acid, TCA), 케노데옥시콜린산(chenodeoxycholic acid, CDCA), 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid, UDCA), 글리코데옥시콜린산(glycodeoxycholic acid, GDCA), 타우로데옥시콜린산(taurodeoxycholic acid, TDCA), 히오데옥시콜린산(hyodeoxycholic acid, HDCA), 타우로우루소데옥시콜린산(tauroursodeoxycholic acid, TUDCA), 리토콜린산(lithocholic acid, LCA), 디히드로콜린산(dehydrocholic acid, DHCA)으로 제제 실험한 결과, LCA와 DHCA는 PPC 가용이 불가능했으며(도 3a, 도 3b) CA, DCA, GCA, TCA, CDCA, UDCA, GDCA, TDCA, HDCA, TUDCA는 특정 몰비 이상에서 안정하게 가용화되는 것을 확인하였다(도 2a 내지 도 2j).

제제 실험결과로 선택된 담즙산 CA, DCA, GCA, TCA, CDCA, UDCA, GDCA, TDCA, HDCA, TUDCA에 대한 염증과 부종 그리고 병변에 대한 in vivo 실험을 시행하였다. 담즙산 중 DCA는 가장 강력한 계면활성제로 피하주사 시 염증과 부종을 야기하며 비선택적 세포용해에 기인한 임상적 부작용이 보고된바, 담즙산 중 DCA와 같은 유해 효력이 있는 첨가제는 PPC 고유의 선택적인 지방세포의 사멸과 분해 작용을 방해하기 때문에 적합한 가용화제가 아님을 인지하고, 우선 in vivo 에서 농도별 담즙산들을 주사 후 대표적인 유해사례인 부종과 피부병변 그리고 염증을 관찰하였다.

in vivo 담즙산들에 대한 부종 시험결과(도 4a 내지 도 4q), 대표적으로 투여 2시간 경과 시점, 없음”은 GCA(1.25~2.5%) 또는 TCA(1.25~2.5%)로 가용화한 PPC(2.50~5.0%) 복합 조성물이며, “경증”은 단독 조성물로 PPC(1.25~10.0%), GCA(1.0%), TCA(1.0%) 및 TUCA(1.0%,2.5%)와 복합 조성물로 PPC(7.5%,10.0%)+GCA (3.75%, 5.0%), PPC(7.5%, 10.0%)+TCA(3.75%, 5.0%)이며, “중등증”은 단독 조성물로 PPC(12.5%, 15.0%), UDCA(1.0%), GDCA(1.0%), CDCA(1.0%), CA(1.0%), GCA(2.5%, 5.0%), TCA(2.5%, 5.0%), TUDCA(5.0%, 7.5%) 복합 조성물로 PPC(5.0%)+CA(2.5%), PPC(15.0%)+GCA(7.5%) 및 PPC(15.0%)+TCA(7.5%)으로 확인되었으며 그 외 단독 조성물과 복합 조성물은 “중증” 및 “극심”으로 확인되었다. DCA(2.2%)로 가용화한 PPC(5.0%)의 부종 극심과 비교하여 본 발명의 도 4n의 PPC(2.5~15.0%)+GCA(1.25~7.50%)와 도 4p의 PPC(5.0%)+GCA(2.5~7.5%) 복합 조성물은 부종이 없는 놀라운 발명이다. 놀라운 발견은 GCA 또는 TCA 단독 투여 시 관찰된 부종의 정도는 PPC+GCA와 PPC+TCA 복합 조성물에서 드라마틱하게 감소한다. 하지만 DCA 단독 또는 DCA 2.2%로 가용화한 PPC 5.0% 조성물은 투여 후 부종은 극심으로 관찰되어 DCA는 세포 괴사 작용으로 PPC 고유의 선택적 지방세포 사멸과 분해에 방해를 유도하는 효력이 있음을 시사하는 것을 발견하였다(도 4m).

in vivo 담즙산들의 피부병변 시험결과(도 5a 내지 도 5f), 대표적으로 투여 2시간 경과 시점, “없음”은 단독 조성물로 PPC(1.25~15.0%), GCA(1.0%), TCA(1.0%) 및 TUDCA(1.0~7.5%)와 복합 조성물로 PPC(2.5~10.0%)+GCA(1.25~5.0%), PPC(5.0%)+GCA(2.5~5.0%), “경증”은 단독 조성물로 HDCA(1.0%), CA(1.0%), GCA(2.5%, 5.0%) 및 TCA(2.5%, 5.0%)와 복합 조성물로 PPC(15.0%)+GCA (7.5%), “중등증”은 단독 조성물로 DCA(1.0%), UDCA(1.0%), TDCA(1.0%), GDCA(1.0%), CDCA(1.0%), CA(2.5%), GCA(7.5%) 및 TCA(7.5%)으로 확인되었으며 그 외 단독 조성물과 복합 조성물은 “중증” 및 “극심”으로 확인되었다. 이와 같은 결과는 부종 시험 결과와 일치된 양상으로 GCA 또는 TCA 단독 조성물과 비교하여 PPC+GCA와 PPC+TCA 복합 조성물의 피하주사 시 병변 증상이 경감되는 것을 확인하였다.

in vivo 담즙산들의 H&E 염증시험 결과, 도 6a 내지 도 6f와 같이, 염증반응 정도는 “없음”은 단독 조성물로 PPC(2.5~7.5%), TUDCA(1.0~5.0%)와 복합 조성물로 PPC(2.5~7.5%)+GCA(1.25~3.75%), PPC(5.0%)+GCA(2.5~7.5%), PPC(5.0%)+TCA(2.5%) 및 PPC(5.0%)+TUDCA(4.0%)이며, “경증”은 단독 조성물로 PPC(10.0%, 12.5%), GCA(1.0%), TCA(1.0%) 및 TUDCA(7.5%)와 복합 조성물로 PPC(10.0%)+GCA(5.0%), PPC(5.0%)+GCA(10.0%)이며, “중등증”은 단독 조성물로 PPC(15.0%), TDCA(1.0%), GDCA(1.0%), CDCA(1.0%), CA(1.0%) 및 GCA(2.5% 이상), TCA(2.5% 이상)과 복합 조성물로 PPC(15.0%)+GCA(7.5%) 및 PPC(5.0%)+CA(2.5%)으로 확인되었으며 그 외 단독 조성물과 복합 조성물은 “중증” 및 “극심”으로 확인되었다. 이와 같은 결과는 부종과 병변 실험결과와 일치하게 GCA 또는 TCA 단독 투여 시 독성은 PPC와 함께 배합되면 독성이 없거나 경감되지만 DCA 또는 이와 동등한 답즙산은 강한 세포독성으로 인하여 PPC 고유의 사멸과 분해를 방해하는 괴사로 인한 통증과 부종 그리고 부작용이 야기됨을 증명한 것이다.

위 제제실험과 in vivo 담즙산들의 부종과 염증 그리고 피부병변 실험결과를 바탕으로 선택된 가용화제 TUDCA, TCA, GCA로 가용화한 PPC 조성물에 대한 in vitro 지방세포 생존도 효력시험 결과, 지방세포 생존도는 TUDCA로 가용화한 PPC군을 제외한 PPC 단독군과 GCA로 가용화한 PPC군 및 TCA로 가용화한 PPC군에서 시간과 농도 의존적으로 지방세포 감소가 관찰되었다(도 7a 내지 도 7d). 특이한 발견은 TUDCA는 지방세포 사멸과 분해를 억제하는 것으로 관찰되었다. 이와 관련하여 TUDCA 세포사멸 억제에 대한 연구결과는 발표되어 있는 바(Andrew L.Rivard, Administration of Tauroursodeoxycholic acid reduces apoptosis following myocardial infarction in rat, The American Journal of Chinese Medicine, Vol. 35, No. 2, 279-295, 2007), PPC는 세포의 괴사와 사멸에 서로 다르게 작용하는 효과임을 시사한다.

PPC 5.0% 단독, PPC 5.0%+GCA 2.5% 및 PPC 15.0%+TCA 7.5%는 DCA 1.0%와 96시간 경과 시점 유사한 지방세포 감소 효력 활성을 나타내었다. 즉, 외모 개선용 세포용해제로 FDA 승인받은 Kybella(DCA 1.0%)와 지방세포 생존도가 동등한 농도는 PPC 단독은 5.0%와 PPC 5.0%+GCA 2.5%로, 이들 실험군에서 지방세포 감소 효력 차이는 통계적 유의성이 없었다(도 7e). 종합하면, PPC를 국소 지방감소 목적의 주사제 조성물로 제조하기 위해 선택되는 가용화제는 조성물의 안전성과 제형 안정성 뿐만 아니라, PPC 고유의 선택적 지방세포 사멸과 분해 효과에 대하여 괴사를 통한 방해작용이 없는 등 독성이 낮거나 이러한 독성이 PPC에 의해 상쇄될 수 있는 담즙산의 선택이 중요하다. 즉, PPC 자체의 지방감소 효력에 괴사와 같은 부정적 변형(PPC+DCA) 또는 억제(PPC+TUDCA) 약리활성이 없는 가용화제가 선택되어야 하는 놀라운 발견을 하였다.

PPC 가용을 위해 배합되는 몰비에 따른 GCA 단독 조성물에 대한 in vitro 지방세포 생존력 관찰결과, 농도와 시간 의존적으로 지방세포 감소가 관찰되었으며, PPC 단독 조성물과 GCA로 가용화한 PPC 조성물의 지방세포 생존력의 차이는 통계적 유의성이 없었다(도 7f 내지 도 7h). 즉, PPC 단독 조성물과 GCA로 가용화한 PPC 조성물의 지방세포 사멸 효과는 동등한 수준이었다. 본 발명의 조성물에서 GCA의 지방세포 감소에 대한 영향을 검증하기 위해, GCA의 투입량 증가에 따른 PPC의 지방세포 감소 효력을 관찰하였다. GCA(2.5~8.75%)로 가용화한 PPC(5.0%) 복합조성물과 PPC(5.0%) 단독 조성물에 대한 96시간 경과 시점의 지방세포 생존력 실험결과, GCA(2.5~7.5%)로 가용화한 PPC(5.0%) 복합 조성물은 PPC(5.0%) 단독 조성물과 비교하여 그 효과상의 차이가 통계적 유의성은 없었다. 즉, 상기 군들은 지방세포 사멸 효과가 동등한 수준이었다. 하지만 GCA(8.75%)으로 가용화한 PPC(5.0%) 처리군에서는 지방세포 사멸 효과 차이가 통계적 유의성이 관찰되었다(도 7i). 이는 즉, GCA/PPC 몰비가 3.04 mol/mol(PPC 5.0%+GCA 8.75%) 이상일 때 부터는 본래 PPC의 고유의 긍정적 성능에 부작용을 부가할 가능성을 시사한다.

기(旣) 보고에 따르면 DCA 또는 DCA로 가용화한 PPC 조성물은 지방세포뿐만 아니라 섬유아세포, 골격근세포, 혈관내피세포까지 용해시켜 임상적으로 심각한 부작용이 보고된 바, PPC 단독 조성물과 GCA로 가용화한 PPC 복합 조성물에 대한 세포 생존도를 관찰한 결과, PPC+GCA는 PPC+DCA와 다르게 지방세포만 선택적으로 감소시키는 놀라운 발견을 하였다[도 8a 내지 도 8d]. 이는 본 발명 조성물은 선택적 지방세포 감소 조성물로 시판제품 리포스타빌주(PPC+DCA), 키벨라주(DCA)가 갖는 세포용해제에서 야기되는 피부층 괴사, 하악신경마비, 연하곤란과 같은 치명적인 부작용 없이 안전하게 지방 감소를 야기하는 획기적인 발명이다.

상기 지방세포 감소가 괴사에 의한 것인지 사멸과 분해에 의한 것인지 평가하기 위해 Caspase 3 activity를 통한 지방세포 사멸(apoptosis)과 Glycerol release를 통해 지방세포 분해(lipolysis) 효력을 관찰하였다.

PPC 단독 조성물과 PPC+GCA 복합 조성물은 시간 의존적으로 caspase-3 활성을 상당한 수준으로 유발하는 효과를 나타내었다. 그러나 PPC+DCA 복합 조성물은 PPC 또는 PPC+GCA와 비교하여 caspase-3 활성을 억제하는 효과를 나타내었다. 흥미로운 발견은 DCA 1.0%는 24시간까지는 caspase-3 활성이 일부 나타났으나 48시간 이후로는 caspase-3 활성이 처치 전 수준으로 돌아오는 양상을 보였다. 이러한 현상은 DCA 단독 조성물 처치 직후 24시간 까지는 세포 사멸에 대한 작용이 일부 나타나나 이후에 나타나는 염증반응에 의해 세포가 괴사 되는 반응으로 전환되기 때문으로 판단된다(도 10a 및 도 10b).

24시간 경과시점에서, DCA 1.0%와 PPC 5.0%+GCA 5.0%를 제외한 실험물질들은 유사하게 glycerol 분비를 유도하였다. 48시간 경과시점, PPC 단독, PPC+DCA, DCA 단독 및 GCA 단독군들은 24시간에 비해서 약간 더 높은 세포 분해 효과를 나타내었다. 특히 PPC+GCA군은 PPC 단독 조성물보다 훨씬 더 높은 세포 사멸 효과가 확인되었다(도 10c 및 도 10d).

위 결과 PPC 단독 조성물과 PPC+GCA 복합 조성물은 PPC+DCA의 괴사(necrosis) 기전과 차별되게 세포사멸(apoptosis)과 지방분해(lipolysis) 기전으로 지방세포가 감소하는 특이적 효과에 기여하는 것을 신규하게 규명하였다. 이와 같은 기전은 본 발명 조성물을 피하지방층에 투여 시 통증과 부종 그리고 부작용 없이 지방이 감소하는 것을 발견한 것이다.

in vitro 지방세포 감소 효력을 바탕으로, PPC 단독 조성물(2.5%, 5.0%, 10.0%, 15.0%), PBS(음성대조군) 및 Isuprel(양성대조군), DCA 1.0%, GCA 2.5% 그리고 복합 조성물로 PPC 5.0%+DCA 2.2%, PPC 5.0%+HDCA 2.5%, PPC 5.0%+UDCA 3.0%, PPC 5.0%+TDCA 2.5%, PPC 5.0%+GDCA 2.5%, PPC 5.0%+CDCA 2.5%, PPC 5.0%+CA 2.5%, PPC 5.0%+TUDCA 4.0%, PPC 5.0%+TCA 2.5%, PPC (2.5~10.0%)+GCA (1.25~5.0%)에 대한 in vivo H&E 조직병리 실험을 수행하였다. 실험결과, DCA 단독 또는 PPC+DCA 복합 조성물이 주사된 지방조직은 투여 영역에 심한 염증을 유발되었으며 세포가 괴사(necrosis)에 의해 용해된 모습을 보이면서 현저한 파괴가 유도되었다. DCA 단독 조성물은 DCA가 1%로 낮은 농도로서 포함됨에도 불구하고 심한 염증 정도를 보여, GCA 단독 조성물에 비해 염증 유발 작용이 컸다. PPC+GCA 복합 조성물은 지방세포의 크기가 작아지고 세포가 죽은 부분이 명확하며 붕괴된 지방세포의 융합으로 이루는 지방세포로 변화 되었으며 농도 의존적으로 염증 유발 정도가 미약하게 나타날 뿐이었고, 특징적으로 지방세포 막에만 손상을 주는 형태학적 특징이 나타났다(도 11a 내지 도 11d).

상기 제제 실험결과, in vivo 부종과 염증 그리고 피부병변 실험결과, in vitro 지방세포, 근육세포, 섬유아세포, 내피세포 생존력 실험결과, in vivo 지방 패드의 H&E 조직병리 실험결과를 종합적으로 볼 때, 본 발명의 GCA로 가용화한 PPC 복합 조성물은 기 시판제품 DCA로 가용화한 PPC 복합 조성물 및 GCA 단독 조성물과 비교하여 국소 독성이 현저히 낮다. 이를 GLP(good laboratory practice)에 따라 재확인하고자, 임상적용량을 산출하여 비글견에 대한 단회 투여 독성시험을 실시하였다. 그 결과 본원 발명의 복합조성물은 독성이 없음을 확인하였다(도 12a 내지 도 12c).

in vivo상 통증의 정도를 평가하기 위해, 각각의 실험약물 투여 후 마우스의 이동거리와 이동속도를 측정하였다. PPC 단독제제, GCA+PPC 제제를 제외하고는, 모든 실험물질 투여군에서 이동거리 및 이동속도가 투여 전과 비교하여 현저히 감소되었다. 실험결과 PPC 5.0% 단독 조성물, PPC 5.0%+TUDCA 4.0%, PPC 5.0%+GCA 2.5%, PPC 5.0%+TCA 2.5% 이동거리와 이동속도는 변화가 없거나 약간 증가한 반면 상대적으로 PPC 5.0%+DCA 2.2%, PPC 5.0%+HDCA 2.5%, PPC 5.0%+UDCA 3.0%, PPC 5.0%+TDCA 2.5%, PPC 5.0%+GDCA 2.5%, PPC 5.0%+CDCA 2.5%, PPC 5.0%+CA 2.5%를 투여 받은 마우스의 이동거리와 이동속도는 20% 정도 감소하였으며 이는 통증에 의한 활동성 감소로 판단된다(도 13a 및 도 13b).

상기 제제 실험결과, in vivo 부종과 염증 그리고 피부병변 실험결과, in vitro 지방세포, 근육세포, 섬유아세포, 내피세포 생존력 실험결과, in vivo 지방 패드의 H&E 조직병리 실험결과, 단회 투여 독성시험 결과 및 통증 실험결과를 바탕으로, 임상적 검증을 위해 인간 대상자를 상대로 투여 전후의 안전성과 유효성을 평가하였다. 연구자 임상시험 연구결과, 턱밑 피하지방층에 0.2cc, 1cm간격, 6내지 8mm 깊이, 총 50포인트, 투여량 10mL을 4주 간격으로 6회 투여 12주 후 시험결과, 육안으로도 턱밑 지방감소가 확인되었다(도 14a). 본 대상자가 보고한 만족도는 5점 중 4점이며 투여전 사진과 비교한 후 평가한 개선도는 1.5등급으로 보고하였다(도 14a). 또한 CT 상 턱밑 지방두께 감소치는 투여전 5.6mm에서 최종 투여 12주 후 3.9mm로 30.36% 감소했다(도 14b).

DCA로 가용화한 PPC 주사 조성물(기존 시판 제품)을 투여 받은 경험이 있는 남·녀 6명을 대상으로, 본원 발명의 GCA로 가용화한 PPC 주사제 조성물 투여 후 고통과 부종 그리고 부작용에 대한 임상적 평가를 수행하였다. 투여부위에 9.6% 리도카인 크림으로 30분 이상 국소 마취 후, DCNa 2.4%로 가용화한 PPC 5.0% 주사제인 리포빈주를 생리식염주사액과 1:1 희석한 조성물(PPC 2.5%+DCNa 1.2%)을 30G 13mm 주사바늘을 장착한 주사기로 복부와 옆구리(1.5cm간격, 10~12mm 깊이, 포인트당 0.5cc를 1회 당 50ml 내지 100ml)에 투여 받거나 턱밑 피하지방층(1.0cm간격, 6~8mm 깊이, 포인트당 0.2cc를 1회 당 10ml)에 투여 받은 경험이 있는 환자들을 대상으로, 본 발명의 조성물인 GCA 2.8%로 가용화한 PPC 5.0% 주사제 또는 GCA 4.0%로 가용화한 PPC 5.0% 주사제를 동일한 투여방법으로 주사하였다. 시험결과, DCNa로 가용화한 PPC 조성 주사액을 투여받은 경험이 있는 대상자들은 투여 시와 투여 10일이 경과된 시점까지 특히 통증과 부종을 호소했으며, 홍반, 혈종, 멍과 같은 피부병변 그리고 국소 유해사례로 경화, 결절, 가려움증, 작열감을 보고했다. 하지만 놀랍게도, 본 발명 GCA로 가용화한 PPC 주사제를 투여받은 대상자들은 특히 통증(도 15a)과 부종(도 15b)이 실질적으로 없다고 할 경증 수준으로 경감되었다. 즉, 안전성은 DCA로 가용화한 PPC 주사제 시험군과 비교하여 통증과 부종은 없거나 80% 이상 개선되었을 뿐만 아니라 대상자 중 심각한 이상반응은 보고되지 않았다(도 15a 내지 도 15c). 구체적으로 종창, 혈종, 멍, 홍반, 무감각증, 경화, 결절, 소양감 등의 부작용이 없거나 현저히 낮은 수준으로서 관찰되었다.

그뿐만 아니라, 복부와 옆구리에 0.5cc, 1.5cm 간격 12mm 깊이, 총 200포인트, 투여량 100mL을 DCA로 가용화한 PPC와 GCA로 가용화한 PPC 투여에 대한 피부병변은 PPC+GCA군이 육안관찰에서 확연히 없는 것을 확인하였다(도 16). 즉, 도 16에서 보는 바와 같이, 주사바늘 자체에 의한 멍 또는 주사 시 혈관손상에 의한 혈종을 제외하고 홍반은 없음 내지 경증으로 경감되었으며, 무감각증, 광범위한 종창, 경화, 감각이상, 결절, 가려움증, 작열감, 연하곤란 등 부작용이 없었다(도 15c).

종합하면, 본 발명의 조성은 기존 DCA 또는 DCA로 가용화한 PPC 조성 주사제 투여 후 염증으로 인한 통증과 부종 그리고 비선택적 세포 용해력에 의한 광범위한 종창, 홍반, 멍과 같은 불편함 및 무감각증, 경화, 감각이상, 결절, 가려움증, 작열감, 연하곤란, 신경손상 없이 선택적으로 지방세포 사멸과 분해 기전으로 지방이 감소되어 환자들의 불안감과 불편함 그리고 복약 순응도를 향상시킬 뿐만 아니라 제형 안정성이 우수한 획기적인 발명이다.

이에 본 발명은

(i) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline); 및

(ii) 글리코콜린산 ( Glycocholic acid, GCA ), 타우로콜린산 (Taurocholic acid, TCA ) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하고,

상기 (i) 및 (ii)는 (ii)/(i)의 몰비가 0.7 내지 3.0인 것을 특징으로 하는, 통증 및 부작용이 경감된 국소지방 감소용 조성물을 제공한다.

구체적으로 본 발명은,

(i) 포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine);

(ii) 타우로콜린산(Taurocholic acid, TCA) 또는 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것; 및

(iii) 물(또는 주사용수)을 포함하고,

상기 (i) 및 (ii)는 (ii)/(i)의 몰비가 0.7 내지 3.0인 것을 특징으로 하는, 통증 및 부작용이 경감된 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 지방 감소용 주사제 조성물은 국소적 부위에 적용할 수 있고, 그 부위가 이에 한정되지는 않지만, 바람직하게는 복부, 턱밑, 팔뚝, 허벅지, 허리, 엉덩이, 눈 밑, 브라라인(brassiere line) 등에 침착된 지방, 지방종 부위 등과 목주름 개선에 적용할 수 있다.

상기 본원 발명의 상기 조성물은 바람직하게 대상에서 국소화된 지방 침적을 비수술적으로 제거하기 위한 목적으로 사용된다. 용어 "비수술적"이란 절개를 요구하지 않는 의료 과정을 일컫는다.

본 발명의 상기 조성물은 지방감소(특히 국소지방 감소)목적으로 사용되는 한 그 제형이 특별히 제한되지 않으나, 일례로 패치, 피하데포(Depot) 등의 주사제등을 포함하며, 바람직하게 주사 가능한 제제(주사제)의 조성물일 수 있다. 즉, 본 발명은 수술이 개재되지 않고 지방 제거를 필요로 하는 환자의 치료 부위에 직접적으로 주입이 가능한 조성물 또는 제제에 관한 것이다.

본 발명의 국소지방 감소용 주사제 조성물은 지방조직 과증식 또는 과축적 장애(질환)의 치료용 약학적 조성물로서, 상기 장애는 당 업계에 병리적으로 지방조직이 과증식 또는 과축적되는 것으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 비만(복부 비만 등), 하부 눈꺼풀 탈출, 지방종, 더컴병( Dercum's disease), 마델룽 목(Madelung's neck), 지방부종, 피에조젠 결절(piezogenic nodules), 안검황색증(xanthelasma),지방이영양증, 또는 셀룰라이트와 관련된 지방 축적증 등을 포함한다.

본 발명의 주사제 조성물의 투여 방법은 제한되지는 않지만, 질환의 심각도, 환자의 연령, 성별 및 기타 조건 등의 관점에서 환자에게 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 이러한 경로로는 그 방법에 있어 특별히 제한되지는 않지만 피하지방층(조직)에 직접 투여되거나, 예를 들어 격자간격으로 0.5 내지 2.0 cm 간격으로 다 회, 피하주사 또는 피내주사 등이 바람직하다.

본 발명에서 상기 용어 부작용은 기존에 공지 또는 시판되어오고 있는 특정 담즙염을 포함하는 PPC 제제들, 특히 기존에 국소 지방 감소용 주사제로서 알려진 DCA로 가용화한 PPC 주사제(예를 들어 리포스타빌주, 엣센샬주, 리포빈주) 또는 DCA 단일제제(예를 들어 키벨라(Kybella))가 가지고 있는 부작용을 의미하는 것으로서, 약물이 치료효과를 기대하는 주작용(본 발명에서는 목적하는 지방감소효과) 이외의 인체에 유해한 작용을 의미한다. 이에 제한되지 않으나 구체적으로, 주사바늘에 의한 혈종과 멍을 제외하고, 부종, 무감각증(특히 투여부위의 무감각증), 광범위한 종창, 홍반, 혈종, 멍, 경화, 감각이상, 결절, 가려움증, 작열감, 연하곤란, 지방세포 이외의 다른 세포(근육세포, 섬유아세포, 혈관내피 세포 등)의 괴사 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 의미한다. 본 발명의 국소지방 감소용 주사제 조성물은 국소 이상반응이 경감된 것으로서 상기 부작용이 실질적으로 없다고 할 수 있을 정도로 경감된 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서 용어“통증 및 부작용이 경감”이라는 것은 통증 및 부작용이 감소, 제거, 약하게 있거나(일부 제거), 실질적으로 없는 것(실질적 제거), 완전히 없는 것(완전한 제거) 등을 모두 포함하는 의미이다.

본 발명에서 상기 통증과 부종은 주사제 투여 시의 통증과 투여 후의 통증 및 부종을 모두 포함한다. 본 발명은 기존에 시판되고 있는 DCA 단독조성 또는 DCA로 가용화한 PPC 조성 주사제가 통증과 부종을 수반하는 것과는 달리, 상당히 통증과 부종이 경감된 것(실질적 무통이며 무부종)을 특징으로 한다. 이러한 무통증과 무부종 PPC 주사제는 본원 발명에서 최초로 공개하는 것으로서, 특히 주사제 투여 시와 투여 직후 나타나는 1차적인 통증뿐만 아니라 염증 작용에 기인한 10일 이상 지속되는 2차적인 통증과 부종이 없는 것이 특징이다. 본원 발명에서 상기 통증의 의미는 주사바늘의 침습에 의해 발생되는 증상(ex. 따끔함, 바늘에 의한 멍, 바늘에 의한 혈종, 바늘에 의한 부어오름)과는 구별되는 것으로서, 기존의 DCA 단독 주사제나 DCA+PPC 주사제 조성물 자체 특성에 의해 발생되었던 통증 또는 부종(염증)을 의미하는 것이다. 본원 발명의 일실시예에서는, 기존 시판되는 지방분해 주사제로서 대조군으로 사용된‘DCA로 가용화한 PPC 조성 주사제’대비 본원 발명의 PPC+GCA 복합제제가 특이하게도 주사(injecting)시점에서도 통증(고통)이 거의 없다는 것을 확인한 바 있다(도 15a). 이러한 점은 본원 발명의 복합 제제가 기존 시판 제제(대표적 예로 DCNa로 가용화한 PPC 조성 주사액 등)와 입자 특성(미셀, 입자 크기 등)이 유사할 뿐만아니라 상기 주사제들이 모두 인체와 유사한 pH로 투여됨을 종합적으로 고려하였을 때, 기존에 공지된 기술들로부터 예측하기 어려운 특이한 효과이다.

또한 본원 발명의 상기 조성물은 지방세포에 특이적으로 사멸(apoptosis)과 분해(lipolysis)를 일으키는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일실시예에서는 본원 발명의 PPC+GCA 복합제제가 섬유아세포, 골격근세포 및 혈관내피세포 등 지방세포 이외의 다른 세포에 대해서는 실질적으로 영향을 미치지 않고, 오직 지방세포에만 특이적으로 유효하게 세포사멸(apoptosis)과 분해(lipolysis)를 유도하는 것을 확인하였다(도 8a 내지 도 8d 참조). 이러한 효과는 다른 담즙산을 사용하여 가용화된 PPC 제제(대표적으로 기존 시판제품인 PPC+DCA 제제)들이 지방세포 이외의 다른 세포에도 세포 괴사(necrosis)를 일으키는 것과 대비되는 것으로서, GCA를 특정 비율로 PPC와 복합하였을 때 지방세포 특이적(선택적) 효과를 보유한다는 것은 본원 발명에서 최초로 공개되는 것이다.

주사제는 주약(본 발명에서는 GCA로 가용화한 PPC)과 필요한 경우 기타 첨가제를 주사용수에 용해하고 이 용액을 세균여과기로 여과하여 무균처리한 후 무균상태에서 바이알, 앰플, 또는 프리필드시린지에 충전한 후 밀봉하는 것으로, 주사제를 제조할 때에는 잔량을 채우기 위해, 물 이외에 주사용수를 사용할 수 있다. 주사용수는 고형주사제의 용해나 수용성 주사제를 희석하기 위하여 만들어진 주사용 증류수 또는 주사용 완충용액이라면 특별히 그 종류가 제한되지 않으나, 예를 들어 pH 3.5 내지 7.5 범위의 인산염 완충용액 또는 인산이수소나트륨(NaH₂PO₄)-구연산 완충용액 등을 사용할 수 있다. 이때 사용되는 인산염은 나트륨염 또는 칼륨염 형태이거나 무수물 또는 수화물 형태이어도 무방하고, 구연산 또는 무수물 또는 수화물 형태이어도 무방하다. 또한 주사용수의 일례로서, 글루코오스 주사액, 자일리톨 주사액, D-만니톨 주사액, 프룩토스 주사액, 생리식염수, 덱스트란 40 주사액, 덱스트란 70 주사액, 아미노산 주사액, 링거액, 락트산-링거액 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PPC)은 동물, 식물, 효모, 곰팡이류에 널리 존재하는 인지질(燐脂質)로 레시틴, 폴리엔포스파티딜콜린, 3-sn-포스파티딜콜린 이라고도 하며 하기 <화학식 1>과 같은 기본구조를 지닌다. 포유동물의 막구성 인지질로서 주로 뇌수, 신경, 혈구, 난황 등에 들어 있다. 식물에서는 대두, 해바라기씨, 밀배아 등에 함유되어 있으며 박테리아에서는 거의 찾아볼 수 없다. 일반적으로 글리세롤의 1번 위치에는 포화지방산, 2번 위치에는 불포화지방산이 결합되어 있는 것이 많고 아실기는 C12 내지 C22(탄소수 12개 내지 22개)가 대부분이다.

<화학식 1>

본 발명의 포스파티딜콜린은 상기 <화학식 1>과 같은 구조를 가지며, R1은 탄소수 12 내지 22개의 포화 또는 불포화 지방산이며, R2는 탄소수 12 내지 22개의 포화 또는 불포화 지방산일 수 있다. 상기 포화 또는 불포화 지방산은 직쇄 또는 분지쇄 형태를 이룰 수 있으며, 상기 불포화 지방산은 단일 불포화 또는 다중(예를 들어, 이중, 삼중 또는 사중 등) 불포화를 포함할 수 있다. 본 발명의 포스파티딜콜린은 단일 화합물일 수 있으며, 또는 상기 R1 및 R2 아실기의 탄소수가 다양한 여러 화합물의 혼합물일 수 있다. 바람직하게 본 발명의 포스파티딜콜린은 분자량이 700g/mol 내지 1000g/mol의 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 분자량이 750g/mol 내지 800g/mol인 것일 수 있다.

본 발명의 포스파티딜콜린은 각종 동물 또는 식물, 예를 들어 대두, 해바라기씨, 밀배아 및 난황으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 추출하여 사용할 수 있다. 또는 본 발명의 포스파티딜콜린은 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용할 수 있으며, 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조한 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 포스파티딜콜린은 바람직하게는 대두(soybean) 또는 난황(egg yolk)에서 분리된 것일 수 있다. 일반적으로 대두에서 분리되는 포스파티딜콜린의 전형적인 구조는 하기 <화학식 2>와 같다. 또한 일반적으로 난황에서 유래되는 포스파티딜콜린의 전형적인 구조는 하기 <화학식 3>과 같다. 본 발명에서 이용되는 포스파티딜콜린은 하기 화학식 2 또는 화학식 3의 화합물로만 이루어진 단일 화합물일 수 있으며, 또는 상기 화학식 1을 기본 구조로 하여 상기 R1 및 R2 아실기의 탄소수가 다양한 여러 화합물들이 추가로 혼입된 혼합물일 수 있다. 상기 혼합물에 있어서는 실질적으로 하기 화학식 2 또는 화학식 3의 화합물이 혼합물 내에 실질적으로 50 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 70 중량% 이상, 가장 바람직하게는 90 중량% 이상 포함되는 것일 수 있다.

<화학식 2>

<화학식 3>

가장 바람직하게 본 발명의 포스파티딜콜린은 대두에서 추출되는 것일 수 있으며, 상기 <화학식 2>와 같은 구조를 가지는 화합물이 93.0중량% 이상의 비율로 포함되어 있는 혼합물일 수 있다.

본 발명의 국소지방 감소용 주사제 조성물에 있어서 상기 포스파티딜콜린은 전체 조성물을 기준으로 0.625 내지 15.0%(w/v) 포함되는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 1.25 내지 12.5%(w/v) 포함되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 전체 조성물 내에 2.5 내지 10.0(w/v)%로 포함되는 것일 수 있다. 가장 바람직하게 상기 포스파티딜콜린은 전체 조성물을 기준으로 2.5 내지 7.5% (w/v) 포함되는 것일 수 있다. 포스파티딜콜린의 농도가 0.625%(w/v) 미만이면 지방 분해 효과가 없고(도 7a 내지 도 7d 참조), 15%(w/v)를 초과할 때는 높은 점도로 인하여 피하지방층에 다회 투여가 불편하며 가용화제의 과량투입이 요구되므로 이로 인하여 염증반응의 중등도 이상이 발현되어 통증과 부종, 염증 등의 부작용이 심하게 발생할 수 있다.

본 발명의 국소지방 감소용 조성물은 글리코콜린산(Glycocholic acid), 타우로콜린산(Taurocholic acid) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것(이하, (ii)로 간략 표기)/ 포스파티딜콜린(PPC, 이하, (i)로 간략 표기)의 몰비가 0.7 내지 3.0으로 포함되는 것을 특징으로 한다. 다시 말해서 (ii)/(i)의 몰비가 0.7 내지 3.0로 이루어지는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게(ii)/(i)의 몰비는 0.7 내지 2.60인 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 0.7 내지 1.73의 몰비로 이루어지는 것일 수 있다. 0.7 미만의 몰비(mol/mol)로 포함되는 경우에는, 안정한 미셀(micelle)의 형성이 어려워 제형 안전성이 떨어지므로 몰비 하한 값은 0.70 이상인 것이 바람직하며, 더욱 바람직한 하한 값은 0.76일 수 있다. 상한 값으로서 3.04 이상의 몰비로 포함되는 경우에는 각각 염증은 경증 이상, 부종은 중등증 이상, 피부 병변은 중증 이상의 정도로 통증, 부종 및 부작용이 현저하게 나타나며, PPC 고유의 지방세포 사멸(apotosis)과 분해(lipolysis) 작용에 대한 긍정적 효과를 부여하기 보다는 세포 괴사를 동반하게 되어 PPC 고유의 기능을 제한하게 된다. 3.0 이하의 몰비에서는 이러한 부작용 및 통증이 현저히 감소되었으며, 특히 2.60 이하 몰비로 포함되는 경우에는 부종과 병변 그리고 염증은 없거나 경증으로 확인되는데 임상적으로 미약하게 부종이 보일 수 있으나 이는 실질적으로 통증과 부작용이 거의 없는 수준에 해당하므로, 본원 발명에서 더욱 바람직한 범위로 채택된다. 가장 바람직하게 1.73 이하 몰비로 포함되는 경우에는, 부종과 병변 그리고 염증으로 인한 임상적 통증과 부종이 발생하지 않는다.

본 발명에서 상기 (ii)/(i)의 몰비 범위에는 구체적으로, 0.70, 0.71, 0.72, 0.73, 0.74, 0.75, 0.76, 0.77, 0.78, 0.79, 0.80, 0.81, 0.82, 0.83, 0.84, 0.85, 0.86, 0.87, 0.88, 0.89, 0.90, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99, 1.00, 1.01, 1.02, 1.03, 1.04, 1.05, 1.06, 1.07, 1.08, 1.09, 1.10, 1.11, 1.12, 1.13, 1.14, 1.15, 1.16, 1.17, 1.18, 1.19, 1.20, 1.21, 1.22, 1.23, 1.24, 1.25, 1.26, 1.27, 1.28, 1.29, 1.30, 1.31, 1.32, 1.33, 1.34, 1.35, 1.36, 1.37, 1.38, 1.39, 1.40, 1.41, 1.42, 1.43, 1.44, 1.45, 1.46, 1.47, 1.48, 1.49, 1.50, 1.51, 1.52, 1.53, 1.54, 1.55, 1.56, 1.57, 1.58, 1.59, 1.60, 1.61, 1.62, 1.63, 1.64, 1.65, 1.66, 1.67, 1.68, 1.69, 1.70, 1.71, 1.72, 1.73, 1.74, 1.75, 1.76, 1.77, 1.78, 1.79, 1.80, 1.81, 1.82, 1.83, 1.84, 1.85, 1.86, 1.87, 1.88, 1.89, 1.90, 1.91, 1.92, 1.93, 1.94, 1.95, 1.96, 1.97, 1.98, 1.99, 2.00, 2.01, 2.02, 2.03, 2.04, 2.05, 2.06, 2.07, 2.08, 2.09, 2.10, 2.11, 2.12, 2.13, 2.14, 2.15, 2.16, 2.17, 2.18, 2.19, 2.20, 2.21, 2.22, 2.23, 2.24, 2.25, 2.26, 2.27, 2.28, 2.29, 2.30, 2.31, 2.32, 2.33, 2.34, 2.35, 2.36, 2.37, 2.38, 2.39, 2.40, 2.41, 2.42, 2.43, 2.44, 2.45, 2.46, 2.47, 2.48, 2.49, 2.50, 2.51, 2.52, 2.53, 2.54, 2.55, 2.56, 2.57, 2.58, 2.59, 2.60, 2.61, 2.62, 2.63, 2.64, 2.65, 2.66, 2.67, 2.68, 2.69, 2.70, 2.71, 2.72, 2.73, 2.74, 2.75, 2.76, 2.77, 2.78, 2.79, 2.80, 2.81, 2.82, 2.83, 2.84, 2.85, 2.86, 2.87, 2.88, 2.89, 2.90, 2.91, 2.92, 2.93, 2.94, 2.95, 2.96, 2.97, 2.98, 2.99 및 3.00로 이루어지는 군에서 선택되는 두 개 숫자를 경계값으로 하는 범위의 값을 모두 포함한다. 본원 발명에서 가장 바람직한 최선의 일례로서, 상기에서 설명한 본원 발명의 몰비 범위 중 구체적으로 0.76 및 1.39의 경계값이 선택될 수 있고, 이에 따라 0.76 내지 1.39의 몰비 범위 즉, 0.76 이상 내지 1.39 이하의 범위에 있는 모든 값들이 본원 발명에 적용될 수 있음은, 당업자에 있어 자명하다.

구체적으로 본 발명의 국소지방 감소용 조성물은‘글리코콜린산(Glycocholic acid) 또는 이의 염’을 조성물 내에 특정 배합비로 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 글리코콜린산은 담즙염으로서, 분자량 약 465.63g/mol이며 본 명세서에서 GCA 또는 GC로 기재될 수 있다. 상기 글리코콜린산은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서‘약학적으로 허용 가능한'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 이에 한정되지 않으나 예를 들어 나트륨염, 칼륨염 또는 암모늄염일 수 있다. 바람직하게 본 발명의 글리코콜린산염은 글리코콜린산 나트륨(Sodium Glycocholate, GCNa)일 수 있다.

상기 글리코콜린산(Glycocholic acid) 또는 이의 염은 당업계에 공지된 방법에 따라 동물의 장에서 추출하여 사용할 수 있으며, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조한 것을 사용할 수 있다.

더욱 구체적으로, 안정하고 안전하게 피하주사가 가능한 10nm 이하의 미셀(mixed micelle) 제제로 마이크로필터링이 가능한 맑은 용액을 제조하기 위한 최소 배합조성으로서 GCA/PPC 최소 몰비는 0.76(PPC 5.0%+ GCA 2.2%)이다. 상기 최소 몰비 미만의 몰비에서는 침전현상으로 인하여 제제의 안정성이 낮다. 따라서 상기 글리코콜린산 또는 그 염은 바람직하게 GCA/PPC 몰비가 0.76 내지 3.0(PPC 5% 기준 GCA 2.2 내지 8.65%(w/v))가 되도록 포함될 수 있으며, 구체적인 범위는 전술한 몰비 내용을 참조로 한다. 글리코콜린산을 이의 염 형태로 사용하는 경우에, 상기 몰비는 바람직하게 상기 글리코콜린산염 중에서 글리코콜린산 부분만을 기준으로 산출되는 것일 수 있다.

본 발명의 국소지방 감소용 조성물은‘타우로콜린산(Taurocholic acid) 또는 이의 염’을 조성물 내에 특정 배합비로 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 타우로콜린산은 담즙염으로서, 분자량 약 515.71g/mol이며 본 명세서에서 TCA로 기재될 수 있다. 상기 타우로콜린산은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서‘약학적으로 허용가능한'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 이에 한정되지 않으나 예를 들어 나트륨염, 칼륨염 또는 암모늄염일 수 있다. 바람직하게 본 발명의 타우로콜린산염은 타우로콜린산 나트륨(Sodium Taurocholate, TCNa)일 수 있다.

상기 타우로콜린산(Taurocholic acid) 또는 이의 염은 당업계에 공지된 방법에 따라 동물의 장에서 추출하여 사용할 수 있으며, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조한 것을 사용할 수 있다.

더욱 구체적으로 안정하고 안전하게 피하주사가 가능한 10nm 이하의 미셀(mixed micelle) 제제로 마이크로필터링이 가능한 맑은 용액을 제조하기 위한 최소 배합조성으로서 TCA/PPC 최소 몰비는 0.78(PPC 5% + TCA 2.5%)이다. 상기 최소 몰비 미만의 몰비에서는 침전현상으로 인하여 제제의 안정성이 낮다. 따라서 상기 글리코콜린산 또는 그 염은 바람직하게 TCA/PPC 몰비가 0.78 내지 3.0(PPC 5% 기준 TCA 2.5 내지 9.57%(w/v))이 되도록 포함될 수 있으며, 구체적인 범위 및 바람직한 일례등에 대해서는 전술한 몰비 내용을 참조로 한다. 타우로콜린산을 이의 염 형태로 사용하는 경우에, 상기 몰비는 바람직하게 상기 타우로콜린산염 중에서 타우로콜린산 부분만을 기준으로 산출되는 것일 수 있다.

이때, 상기 글리코콜린산(Glycocholic acid), 타우로콜린산(Taurocholic acid) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것(물질)은 포스파티딜콜린(PPC)의 질량(또는 질량/용적 백분율(즉, % w/v)) 이하로 포함되는 것이 바람직할 수 있으며, 예를 들어 PPC를 기준으로 질량비가 1 : 0.1 내지 1로 포함될 수 있다. 구체적으로 PPC를 기준으로 질량비가 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9 또는 1:1 가 되도록 포함될 수 있다. 이러한 질량기준을 몰비(GCA/PPC 몰비 또는 TCA/PPC 몰비) 기준으로 적용하면, 몰비가 0.7 내지 1.73 범위에 해당하는 것이 바람직할 수 있다, 더욱 바람직하게 0.76 내지 1.73에 해당하는 것일 수 있다.

바람직하게 상기 글리코콜린산(Glycocholic acid), 타우로콜린산(Taurocholic acid) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것(물질)은 포스파티딜콜린(PPC)의 질량(또는 질량/용적 백분율(즉, % w/v)) 보다 적게 포함되는 것이 바람직할 수 있으며, 예를 들어 PPC를 기준으로 질량비가 1 : 0.1 내지 0.999로 포함될 수 있다. 구체적으로 PPC를 기준으로 질량비가 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 또는 1:0.9 가 되도록 포함될 수 있다. 이러한 질량기준을 몰비(GCA/PPC 몰비 또는 TCA/PPC 몰비) 기준으로 적용하면, 몰비가 0.7 이상 1.73 미만에 해당하는 것이 바람직할 수 있다. 더욱 바람직하게 0.76 이상 1.73 미만에 해당하는 것일 수 있다.

상기 글리코콜린산 또는 타우로콜린산을 이들의 염 형태로 사용하는 경우에는, 상기 질량비는 바람직하게 상기 글리코콜린산염 중에서 글리코콜린산 부분만의 비율 또는 타우로콜린산염 중에서 타우로콜린산 부분만의 비율에 따라 산출하는 것을 기준으로 하는 것일 수 있다.

상기 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA), 타우로콜린산(Taurocholic acid, TCA) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것은,

(가) 개별물질이 단독(글리코콜린산, 글리코콜린산의 염 종류 중의 하나, 타우로콜린산, 타우로콜린산의 염종류 중의 하나)으로 PPC와 복합되는 것일 수 있고,

(나) GCA 또는 이의 염; 및 TCA 또는 이의 염으로 이루어지는 혼합물(이하, GCA-TCA 혼합물)로서 PPC와 복합되어 사용될 수 있다.

상기한 바와 같이 GCA, TCA 또는 이들의 염이 포스파티딜콜린(PPC)과 특정 배합비로 포함되는 본원 발명의 조성물은, 비리포좀성(non-liposome) 미셀(micelle) 제제인 것을 특징으로 한다. 즉, 본원 발명의 조성물은 조성물 내에 포스파티딜콜린이 미셀형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 것으로서, 이는 기존의 PPC 제제들이 리포좀 시스템을 이용하는 것과 큰 차이가 있다.

상기 GCA, TCA 또는 이들의 염은 본 발명의 지방감소 주사제 조성물에 있어서 전술한 바와 같이 특정 용량(또는 배합비, 몰비)로 포함됨으로서 제형안정성이 뛰어날 뿐만 아니라, 기존에 PPC 주사제 조성물에 포함되는 가용화제(특히, 데옥시콜레이트 및 이의 염 종류)가 세포의 괴사(necrosis)를 일으켜 체내 통증과 부종을 수반하고 혈종, 무감각증, 홍반, 종창, 경화, 소양감, 결절 등 부작용을 일으키는 것과는 달리, PPC와 함께 고효율의 지방분해(lipolysis)와 지방세포 사멸(apoptosis, 아포토시스) 작용을 유도하여 통증 및 상기 부작용이 실질적으로 없다고 할 정도로 경감시키고 지방감소에 있어서는 뛰어난 효과를 보이는 것이 특징이며(통증과 부종은 80% 이상 경감 되었으며 주사바늘에 의한 멍을 제외한 홍반, 혈종, 경화, 소양감, 결절 역시 80% 이상 경감됨), 이에 따라 별도의 통증 관리를 위한 항-염증제 또는/및 진통제 성분이 조성물 내에 필수적으로 포함되거나 병용될 필요성이 없는 것 또한 특장점이다.

한편, 상기 본 발명의 조성물은, 보존제; 등장화제; 및 pH 조절제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로, 본원 발명의 국소지방 감소용 조성물은, 바람직하게 전체 조성물을 기준으로 0.1 내지 5%(w/v)의 보존제, 0.1 내지 10%(w/v)의 등장화제 및 0.01 내지 2%(w/v)의 pH조절제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 추가로 포함할 수 있다.

상기 보존제는 이에 한정하지는 않지만, 벤질알코올(benzyl alcohol), 리도카인(lidocaine), 프로카인(procaine) 및 클로로부탄올(chlorobutanol)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는 벤질알코올 일 수 있다. 상기 벤질알코올은 방향족 알코올류 중의 하나로 무색투명한 액체이다. 본 발명의 주사제 조성물에 포함되는 벤질알코올의 농도는 바람직하게는 0.1%(w/v) 내지 2%(w/v)일 수 있다.

상기 등장화제는 포스파티딜콜린을 포함하는 본 발명의 조성물을 체내에 투여할 때에 삼투압을 적절하게 유지(조절)하는 역할을 하며, 포스파티딜콜린을 용액상에서 더욱 안정화시키는 부수적인 효과도 나타낸다. 등장화제는 약학적으로 허용되는 당, 염 또는 이의 임의의 조합 또는 혼합물 일 수 있으며, 그 예로는 당으로 글루코오스, 또는 수용성 무기염으로 염화나트륨, 염화칼슘, 황산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 분자량 1000 이하의 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 등 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 염화나트륨일 수 있다. 이들은 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용될 수 있다. 상기 등장화제의 농도는 바람직하게는 0.1%(w/v) 내지 5%(w/v)이며, 본 발명의 조성물에 포함된 성분들의 종류, 량 등에 따라 각각의 혼합물이 모두 포함된 용액 제형이 등장액이 되도록 적절한 함량으로 조절될 수 있다.

본 발명의 pH 조절제는 주사제의 pH를 조절하는 역할을 하며, 산성 물질, 염기성 물질을 모두 포함한다. 상기 산성 물질에는 염산, 초산, 아디프산, 아스코르빈산, 아스코르빈산 나트륨, 에테르산 나트륨, 사과산, 숙신산, 주석산, 푸마르산, 구연산(시트르산) 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 상기 염기성 물질에는 무기 염기(예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 탄산수소나트륨, 탄산마그네슘, 탄산칼슘, 산화마그네슘, 암모니아, 합성 히드로탈사이트), 유기 염기 (예를 들어, 염기성 아미노산, 예컨대, 리신, 아르기닌 등, 메글루민 등) 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 본원 발명에서 상기 pH 조절제는 산성 물질과 염기성 물질이 조성물 내에 각각 단독으로 포함될 수 있고, 또는 각각의 물질이 2개 이상 조합되어 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 pH 조절제는 수산화나트륨 또는/및 염산일 수 있다. 첨가되는 pH 조절제의 양은 본 발명 조성물을 구성하는 성분들의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있으며, 바람직하게는 0.01%(w/v) 내지 1.32%(w/v), 더욱 바람직하게는 0.01%(w/v) 내지 1%(w/v)일 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게 pH 7.0 내지 pH 7.8의 범위로 제공되는 것일 수 있으며, 이에 따른 pH 조절제의 종류 및 첨가량은 용액의 구체적 조성에 따라 당업자가 조건을 변경할 수 있다.

가장 바람직한 형태로서 본 발명은,

(i) 포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine);

(ii) 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA) 또는 타우로콜린산(Taurocholic aic, TCA) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것;

(iii)보존제;

(ⅳ) 등장화제;

(ⅴ) pH 조절제; 및

(ⅵ) 잔량의 물로 이루어지고(구성되고)

상기 (i) 및 (ii)는 (ii)/(i)의 몰비가 0.7 내지 3.0인 것을 특징으로 하는, 통증 및 부작용이 경감된 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제공한다. 상기 조성의 개별 성분 특성, 함량, 조합 등은 전술한 바를 참조로 하여 이해될 수 있다.

또한 본 발명은, 대상에서 통증 및 부작용이 경감되고 국소화된 지방 침적(localized fat deposit)을 제거하기 위한 제제로서, 상기 제제는

(i) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline); 및

(ii) 글리코콜린산 ( Glycocholic acid, GCA ), 타우로콜린산 (Taurocholic acid, TCA ) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하고, 상기 (i) 및 (ii)는 (ii)/(i)의 몰비가 0.7 내지 3.0인 제제를 제공한다.

상기 제제에 대한 가장 바람직한 형태로서 본 발명은,

(i) 포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine);

(iii)보존제;

(ⅳ) 등장화제;

(ⅴ) pH 조절제; 및

(ⅵ) 잔량의 물로 이루어지고(구성되고)

상기 (i) 및 (ii)는 (ii)/(i)의 몰비가 0.7 내지 3.0인 것을 특징으로 하는, 대상에서 통증 및 부작용이 경감되고 국소화된 지방 침적(localized fat deposit)을 제거하기 위한 제제를 제공한다. 상기 제제를 구성하는 구체적 물질들의 조성, 함량 및 특성 등에 대해서는 전술한 국소지방 감소용 조성물과 동일하게 이해된다.

본원 발명의 상기 국소지방 감소용 조성물 및 상기 제제는 pH 6.8 내지 pH7.8로 조성되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기, 본 발명 조성물 또는 제제의 단위 용량(단위 복용량)은, 포유동물에의 환부에 대하여 예를 들면 500 mL, 400 mL, 300 mL, 200 mL, 100 mL, 90 mL, 80 mL, 70 mL, 60 mL, 50 mL, 40 mL, 30 mL, 20 mL, 10 mL, 9 mL, 8 mL, 7 mL, 6, mL, 5 mL, 4 mL, 3 mL, 2 mL, 1 mL, 0.9 mL, 0.8 mL, 0.7 mL, 0.6 mL, 0.5 mL, 0.4 mL, 0.3 mL, 0.2 mL, 0.1 mL, 0.09 mL, 0.08 mL, 0.07 mL, 0.06 mL, 0.05 mL, 0.04 mL, 0.03 mL, 0.02 mL, 0.01 mL, 0.009 mL, 0.008 mL, 0.007 mL, 0.006 mL, 0.005 mL, 0.004 mL, 0.003 mL, 0.002 mL, 0.001 mL, 0.0009 mL, 0.0008 mL, 0.0007 mL, 0.0006 mL, 0.0005 mL, 0.0004 mL, 0.0003 mL, 0.0002 mL 또는 0.0001 mL 이하의 총량을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 단위 용량은 부분적으로 표적 영역, 지방의 양 및 목적하는(수득하고자 하는) 결과에 좌우된다.

구체적으로, 본 발명 조성물 또는 제제의 단위 용량(단위 복용량)은 환부에 대하여 총량 0.1mL 내지 500mL일 수 있으며, 바람직하게는 1mL 내지 200mL, 더욱 바람직하게는 1mL 내지 100mL 범위로 투여되는 것일 수 있다.

본원 발명의 조성물 또는 제제는 1회 투여시에, 환부에 대하여 일정 간격으로 여러 표적 부위(site, point)를 설정하여 투여되는 것을 포함하며, 상기 총량은 1회에 이러한 여러 표적부위를 통해 투여되는 투여량의 총량을 의미하는 것일 수 있다. 상기 표적 부위는 1개의 환부에 대하여 1 내지 50개, 바람직하게 2 내지 30개, 더욱 바람직하게 3 내지 10개의 범위 등으로 설정될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물 또는 제제는 1회 투여시에 하나의 환부에 하나의 표적부위에 대하여 투여되는 것을 모두 포함하며, 이때 총량은 상기 하나의 표적부위에 대한 양을 기준으로 산정됨은 당업자에게 자명히 이해 가능하다.

또한 본 발명은 조성물 또는 제제는 표적 부위(site, point) 당 0.01-20mL의 투여 용량 범위로 투여되는 것일 수 있으며, 바람직하게 0.01-10mL, 더욱 바람직하게 0.02-5 mL, 가장 바람직하게 0.1-1mL 의 범위 용량으로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물 또는 제제는 표적부위에 한번 또는 다회 투여될 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 조성물은 표적 부위에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10번 투여된다. 한번 이상의 투여가 단일 시간, 일, 주, 월 또는 년에 발생할 수 있다. 바람직하게는, 단일 표적 부위에 다수의 투여가 일년에 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2회 이하, 한 달에 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2회 이하, 일 주에 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2회 이하, 하루에 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2회 이하 또는 한시간에 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2회 이하로 발생한다. 어떤 구체예에서, 환자는 표적 부위에 1-100회, 2-50회, 3-30회, 4-20회 또는 5-10회 주입이 제공된다. 이러한 주입 수는 1년, 6개월, 5개월, 4개월, 3개월, 2개월, 1개월, 3주, 2주 또는 1주 또는 그 이하의 기간에 걸쳐 발생할 수 있다.

본 발명의 조성물 또는 제제는, 이에 제한되지 않으나, 예를 들면, 피부 아래 0.1-4 인치, 0.5-3 인치, 1-2 인치를 포함하여, 피부 아래에 다양한 수준(깊이)으로 투여될 수 있다.

또한 본원 발명은

(Ⅰ) ( i) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline); 및

(ii) 글리코콜린산 ( Glycocholic acid, GCA ), 타우로콜린산 (Taurocholic acid, TCA ) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하며 상기 (i) 및 (ii)는 (ii)/(i)의 몰비가 0.7 내지 3.0인, 대상에서 통증 및 부작용이 경감되고 국소화된 지방 침적을 제거하기 위한 조성물 또는 제제를 포함하는 제1 콘테이너 ; 및

(II) 상기 조성물을 지방 축적 부위에 전달할 수 있는 전달 장치를 포함하는 키트를 제공한다.

더욱 바람직한 일례로서, 본 발명은

(Ⅰ) ( i) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline); 및

(ii) 글리코콜린산 ( Glycocholic acid, GCA ), 타우로콜린산 (Taurocholic acid, TCA ) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하며, 상기 글리코콜린산 , 타우로콜린산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것은 포스파티딜콜린의 질량 이하로 포함되는, 대상에서 통증 및 부작용이 경감되고 국소화된 지방 침적을 제거하기 위한 조성물 또는 제제를 포함하는 제1 콘테이너 ; 및

상기 본원 발명의 키트에서 (I) 제1 콘테이너(용기)에 포함되는 조성물 또는 제제의 구성은 전술한 본원 발명의 국소지방 감소용 조성물 및 제제에 대한 설명을 참조로 하여 이해된다. 상기 제1 콘테이너는 본원 발명의 조성물 또는 제제의 단위 용량(투여 용량)을 수용하기에 충분한 체적(부피)를 갖는다. 예를 들면, 제1 콘테이너는 500mL, 100 mL 용액, 20 mL 용액, 10 mL, 5mL, 4mL, 3mL, 2mL, 또는 1mL 용액을 수용하는데 적합할 수 있다. 어떤 구체예에서, 제1 콘테이너는 0.01 ml - 약 100 ml, 약 0.1 ml - 약 90 ml, 약 0.5 ml - 약 80 ml, 약 1 ml - 약 70 ml, 약 2 ml - 약 60 ml, 약 3 ml - 약 50 ml, 약 4 ml - 약 40 ml, 약 5 ml - 약 30 ml, 약 6 ml - 약 20 ml 및 약 7ml - 약 10 ml의 체적을 가질 수 있다. 보다 바람직한 구체예에서, 제1 콘테이너는 약 1-10ml의 체적 용량을 갖는 바이알 또는 앰플이다.

상기 본원 발명의 키트는 지방 축적 부위에 제1 콘테이너에 있는 조성물을 전달하기 위해 (II) 전달장치를 포함한다. 상기 전달장치는 그 구체적 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 주사기일 수 있고, 또는/및 다른 적절한 전달장치(예를 들면, 패치)를 더 포함할 수 있다.

상기 전달장치는 전술한 본원 발명의 조성물 또는 제제의 단위 용량을 미리 적재하고 있을 수 있다.

본원 발명의 상기 키트는 임의로 다수의 컨테이너를 추가로 포함하고 있을 수 있다. 일례로 상기 키트는 제1 콘테이너에 포함된 조성물 또는 제제의 희석을 위한 적절한 용량의 희석제, 또는/ 및 제2의 다른 임의의 제제를 포함하는 제2 콘테이너를 추가로 포함할 수 있다. 상기 임의의 제제는 당업자가 키트의 제공 목적에 따라 적의 선택하여 구성품으로 할 수 있는 것으로서,그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 예를들어 항균제, 혈관수축제, 항-혈전제, 항-응고제, 거품-억제제, 분산제, 항-분산제, 침투 강화제, 스테로이드, 신경안정제, 근육이완제 및 지사제 등을 포함할 수 있다.

상기 키트는 대상에서 통증 및 부작용이 경감되고 국소화된 지방 침적을 제거하기 위한 상기 조성물 또는 제제를 사용하기 위한 설명서(written description)를 포함할 수 있다. 이에 따라 상기 (I) 제1 콘테이너 내에 포함된 조성물 또는 제제는 설명서에 따라 투여될 수 있다. 사용 설명서는 예를 들면, 표적 부위, 치료될 포유동물, 원하는 결과, 표적 부위의 위치, 용액의 농도, 지방 축적의 크기에 좌우될 수 있는 복용 설명서를 제공할 수 있다. 바람직하게는, 사용설명서는 인간, 개, 고양이 또는 말과 같은 포유동물의 치료를 위한 것이다. 사용 설명서는 또한 다른 길들여진 동물 및/또는 농장 동물의 치료를 위한 정보를 포함할 수 있다.

사용 설명서는 예를 들면 포유 동물의 눈 아래, 턱 밑, 팔 밑, 엉덩이, 종아리, 등, 넓적다리, 발목 또는 복부와 같은 특정 표적 부위를 치료하기 위해 본 발명의 조성물의 사용에 대한 정보를 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 사용 설명서는 눈꺼풀 지방 탈출, 지방종, 지방이영양증, 버팔로 험프 지방이영양증 또는 셀룰라이트와 연관된 지방 축적인 지방 축적을 치료하기 위한 본 발명 조성물의 사용을 위한 설명을 구체화한 것이다.

상기 사용설명서는, 필요한 경우에 제1 콘테이너의 구성품 및/또는 제2 콘테이너의 희석제를 섞어 희석이 필요한 경우에 그 양에 관한 정보를 포함할 수 있다. 사용 설명서는 투여의 빈도 또는 용량과 같은, 본 발명의 조성물 또는 제제의 적절한 투여에 관한 정보를 제공할 수 있다.

또한 본 발명은

(a) 주사용수에 글리코콜린산 ( Glycocholic acid), 타우로콜린산 (Taurocholic acid) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 넣고 투명하게 용해될 때까지 교반하는 단계;

(b) 보존제를 넣고 교반하는 단계;

(c) 포스파티딜콜린( Phosphatidyl choline )을 투입하고 상온에서 교반하는 단계; 및

(d) 물로 총 부피를 맞추고 교반하는 단계를 포함하며,

상기 글리코콜린산 , 타우로콜린산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것/포스파티딜콜린의 몰비가 0.7 내지 3.0으로 투입되는 것을 특징으로 하는,

통증 및 부작용이 경감된 국소지방 감소용 주사제 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 국소지방 감소용 주사제 조성물의 제조방법을 이하에서 단계별로 설명한다.

(a) 단계에서는 주사용수에 글리코콜린산(Glycocholic acid), 타우로콜린산(Taurocholic acid) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 투입하여 용액이 실질적으로 투명한 상태가 될 때까지 교반한다.

이때, 상기 글리코콜린산, 타우로콜린산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것(물질)과, 이들의 조합 및 배합비는 상기 조성물에서 전술한 바와 같다. 상기 (a) 단계에서는 임의로 pH 조절제가 선(先)투입될 수 있다.

(b) 단계에서는 보존제를 투여하는 단계이다. 상기 (b) 단계에서는 등장화제 또는 pH 조절제 중 어느 하나, 또는 이들을 모두 추가로 넣고 교반할 수 있다. 상기 보존제, 등장화제 및 pH 조절제의 성분 및 농도는 상기 조성물에 관한 설명에서 전술한 바와 같다.

본 발명에서 교반 또는 혼합은 공지의 교반 수단(교반기)에 의한 것일 수 있으며, 투입되는 물질의 종류 또는 특성에 따라 당업자가 작업 효율을 높이기 위해 온도, 압력, 시간 또는 회전 속도 등의 조건을 달리할 수 있다.

(c) 단계에서는 상기 (b) 단계에서 교반한 혼합물에 포스파티딜콜린을 투입하고 차광, 밀폐 상태에서 가용화 될 때까지 교반한다. 상기 교반은 당업계에 알려진 교반 수단(교반기)에 의한 것일 수 있고, 바람직하게 2 내지 24 시간 동안 수행되는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 5 내지 15 시간 동안 수행되는 것일 수 있다. 회전속도는 이에 제한되지 않으나 100 내지 1000rpm에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 과정을 통하여 포스파티딜콜린이 조성물 내에 작은 입도(입자경이 2 내지 10nm, 바람직하게 입자경이 2 내지 6nm)를 가지며 균질한 입자로 제조될 수 있다. 상기 교반과정이 2시간 미만으로 진행되면 원하는 입도와 균질도를 얻을 수 없고, 24시간을 초과하면 생산공정에 있어서 비경제적이다. 또한 당업자는 성분 물질의 용해도를 높이기 위하여 다양한 공정 조건을 설정할 수 있으며, 일례로 질소압 등의 조건에서 성분물질을 교반할 수 있다.

(d) 단계에서는 물로 총 부피를 맞추고 균질하게 혼합한다. 상기 물은 주사용수로 대체될 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 (d) 단계에서는 추가의 pH 조절제 투입이 수행될 수 있다. 또한 본 단계에서 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여 주사제로 사용가능한 산수용액 또는 인산염 등의 완충용액(pH 조절제)을 사용하여 pH를 조절함으로써 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 pH 조절제의 종류 및 이들의 포함량 등에 대해서는 전술한 바와 같다.

또한 상기 제조방법은

(e) 상기 (d) 단계에서 교반한 용액을 여과하여 포스파티딜콜린 입자경이 2 내지 10nm인 여과물을 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 (e) 단계는 여과 공정을 통해 특별히 포스파티딜콜린 입자경이 2 내지 10 nm로 생성된 분자들을 고농도로 분리수득하는 단계이다. 상기 여과는 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상의 여과수단이 이용될 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 예를 들어 시린지 필터(syringe filter)에 의해 여과될 수 있다. 상기 입자경은 바람직하게는 2 내지 5 nm일 수 있다.

바람직한 구체예로서 본원 발명은, 통증 및 부작용이 경감되고 국소적 지방 축적을 비수술적으로 제거하기 위한 의약 조성물을 제조하는 방법에 있어서 ,

상기 조성물은

포스파티딜콜린과

글리코콜린산 , 타우로콜린산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하되,

상기 글리코콜린산 , 타우로콜린산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것은 포스파티딜콜린의 질량 이하로 투입되는 것을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.

이러한 구체예에 대하여 구체적 물질 조성, 배합비 등에 대해서는 전술한 본원 발명의 조성물 및 제제에 대한 내용을 참조로 하여 이해된다.

타우로콜린산 또는 글리코콜린산(또는 이의 염)과 포스파티딜콜린(PPC)을 특정 배합비로 포함하는 본원 발명의 국소지방 감소용 주사제 조성물은 제제가 안전하고 안정적이며, DCA를 단독으로 포함하는 키벨라와 같은 제제와 리포스타빌과 같이 기존에 DCA를 포함하고 있는 PPC 제제들에서 야기되는 지방세포 괴사(necrosis) 없이 지방세포의 지방분해(lipolysis)와 지방세포 사멸(apoptosis) 특이적 효과가 우수하여, 이에 따라 통증, 부종, 무감각증, 광범위한 종창, 홍반, 경화, 감각이상, 결절, 가려움증, 작열감, 그리고 지방세포 외 섬유아세포, 근육세포, 혈관내피 세포 괴사작용 등의 부작용이 없이 지방세포가 감소되는 효과가 우수하다.

도 1a 및 도 1b를 포함하는 도 1은 가용화제를 첨가하지 않은 PPC를 교반기와 고압호모게나이저로 분산한 일련의 이미지들이다. 도 1a는 주사용수에 PPC 5%(w/v)만을 투입하고 교반기로 최대 72시간 교반 직후의 이미지와 최종 교반 1일 경과 시점에서 얻어진 조성물의 이미지이다. 도 1b는 주사용수에 다양한 농도의 PPC투입(왼쪽부터 0.625%(w/v), 1.25%(w/v), 2.5%(w/v), 5.0%(w/v), 7.5%(w/v), 10.0%(w/v)) 및 1시간 교반 후 고압호모게나이저로 분산한 조성물의 제조 직후, 7일 및 30일 경과 시점에 촬영된 조성물들의 이미지들이다.
도 2a 내지 도 2j를 포함하는 도 2는 다양한 농도별 DCA, GCA, TCA, CA, CDCA, UDCA, GDCA, TDCA, HDCA, TUDCA로 가용화한 PPC 5.0% 조성물에 대한 제조 직후와 제조 30일 경과시점 제제 안정성에 대한 성상을 도시한 일련의 이미지들이다.
도 2a는 PPC 5%(w/v)를 기준농도로 하였을 때 이에 대한 데옥시콜린산(DCA) 함량%(w/v)별 제제 성상을 나타낸다.
도 2b는 PPC 5%(w/v)를 기준농도로 하였을 때 이에 대한 글리코콜린산(GCA) 함량%(w/v)별 제제 성상을 나타낸다.
도 2c는 PPC 5%(w/v)를 기준농도로 하였을 때 이에 대한 타우로콜린산(TCA) 함량%(w/v)별 제제 성상을 나타낸다.
도 2d는 PPC 5%(w/v)를 기준농도로 하였을 때 이에 대한 콜린산(CA) 함량%(w/v)별 제제 성상을 나타낸다.
도 2e는 PPC 5%(w/v)를 기준농도로 하였을 때 이에 대한 케노데옥시콜린산(CDCA) 함량 %(w/v)별 제제 성상을 나타낸다.
도 2f는 PPC 5%(w/v)를 기준농도로 하였을 때 이에 대한 우루소데옥시콜린산(UDCA) 함량 %(w/v)별 제제 성상을 나타낸다.
도 2g는 PPC 5%(w/v)를 기준농도로 하였을 때 이에 대한 글리코데옥시콜린산(GDCA) 함량 %(w/v)별 제제 성상을 나타낸다.
도 2h는 PPC 5%(w/v)를 기준농도로 하였을 때 이에 대한 타우로데옥시콜린산(TDCA) 함량%(w/v)별 제제 성상을 나타낸다.
도 2i는 PPC 5%(w/v)를 기준농도로 하였을 때 이에 대한 히오데옥시콜린산(HDCA) 함량 %(w/v)별 제제 성상을 나타낸다.
도 2j는 PPC 5%(w/v)를 기준농도로 하였을 때 이에 대한 타우로우루소데옥시콜린산(TUDCA) 함량 %(w/v)별 제제 성상을 나타낸다.
도 3a 및 도 3b를 포함하는 도 3은 PPC를 가용화할 수 없는 담즙산들의 일례와 대표적으로 다양한 농도의 GCA로 가용화한 PPC 복합 조성물의 제제별 성상을 나타낸다. 도 3a는 리토콜린산(LCA)으로 가용화한 PPC 복합 조성물로 혼합 미셀로 제조가 불가능 하였다. 도 3b는 데히드로콜린산(DHCA)으로 가용화한 PPC 복합 조성물로 안정적인 혼합 미셀 제조가 불가능 하였다.
도 4a 내지 도 4q를 포함하는 도 4는 PPC 단독 조성물, 다양한 담즙염(DCA, HDCA, UDCA, TDCA, GDCA, CDCA, CA, GCA, TCA, TUDCA) 단독 조성물, 담즙산(DCA, GCA, TCA 등등)으로 가용화한 다양한 농도의 PPC 복합 조성물 및 PBS를 랫트 족부에 0.1ml 주사하고 투여 직후(0.1hrs), 1, 2시간 경과에 따른 부종[랫트 족부 두께(mm)]을 나타낸 그래프들이다. 실험은 각 처리 당 4회 반복하였으며 캘리퍼에 의해서 수행되었다. 이하에서 %는 %(w/v)를 의미한다.
도 4a는 다양한 농도의 PPC 단독 조성물(1.25~15.0%)들과 DCA 1% 단독 조성물 주사 후 부종을 비교한 결과이다.
도 4b는 다양한 농도의 DCA 단독 조성물(1.0~7.5%)들의 주사 후 부종을 비교한 결과이다.
도 4c는 다양한 농도의 HDCA 단독 조성 주사제(1.0~7.5%)들과 DCA 1% 단독 조성물 주사 후 부종을 비교한 결과이다.
도 4d는 다양한 농도의 UDCA 단독 조성 주사제제(1.0~7.5%)들과 DCA 1% 단독 조성물 주사 후 부종을 비교한 결과이다.
도 4e는 다양한 농도의 TDCA 단독 조성 주사제제(1.0~7.5%)들과 DCA 1% 단독 조성물 주사 후 부종을 비교한 결과이다.
도 4f는 다양한 농도의 GDCA 단독 조성 주사제제(1.0~7.5%)들과 DCA 1% 단독 조성물 주사 후 부종을 비교한 결과이다.
도 4g는 다양한 농도의 CDCA 단독 조성 주사제제(1.0~7.5%)들과 DCA 1% 단독 조성물 주사 후 부종을 비교한 결과이다.
도 4h는 다양한 농도의 CA 단독 조성 주사제(1.0~7.5%)들과 DCA 1% 단독 조성물 주사 후 부종을 비교한 결과이다.
도 4i는 다양한 농도의 GCA 단독 조성 주사제(1.0~7.5%)들들과 DCA 1% 단독 조성물 주사 후 부종을 비교한 결과이다.
도 4j는 다양한 농도의 TCA 단독 조성 주사제(1.0~7.5%)들과 DCA 1% 단독 조성물 주사 후 부종을 비교한 결과이다.
도 4k는 다양한 농도의 TUDCA 단독 조성 주사제(1.0~7.5%)들과 DCA 1% 단독 조성물 주사 후 부종을 비교한 결과이다.
도 4l은 PPC 5.0% 단독 조성물, 담즙산 별로 PPC 5.0% 가용에 필요한 각각의 농도의 단독제제(통상 약 2.5% 농도를 사용하지만, UDCA의 경우 3%, TUDCA 4% 정도가 적합), 또는 PBS 주사 후 2시간 경과 시점 부종을 비교한 결과이다.
도 4m은 담즙산 별로 PPC 5.0% 가용에 필요한 각각의 농도의 담즙산 단독제제와, 상기 각각의 담즙산들로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물을 주사한 후, 2시간 경과 시점에서 부종을 비교한 결과이다.
도 4n은 다양한 농도별 GCA(1.25~7.5%)로 가용화한 PPC(2.5%~15.0%) 복합 조성물들과 DCA 1% 단독 조성물 주사 후 부종을 비교한 결과이다.
도 4o는 다양한 농도별 TCA(1.25~7.5%)로 가용화한 PPC(2.5%~15.0%) 복합 조성물들과 DCA 1% 단독 조성물 주사 후 부종을 비교한 결과이다.
도 4p는 다양한 농도의 GCA(2.5~25.0%)로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물 주사 후 부종을 비교한 결과이다.
도 4q는 다양한 농도의 TCA(2.5~25.0%)로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물 주사 후 부종을 비교한 결과이다.
도 5a 내지 도 5f를 포함하는 도 5는 PPC(1.25~15.0%) 단독 조성물 및 PBS(도 5a), 다양한 담즙염(DCA, HDCA, UDCA, TDCA, GDCA, CDCA, CA, GCA, TCA, TUDCA)의 1.0~7.5% 농도 단독 조성물(도 5b 및 도 5c), 다양한 담즙산들로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물(도 5d), GCA(1.25~7.5%)으로 가용화한 다양한 농도의 PPC(2.5~15.0%) 복합 조성물(도 5e), GCA(2.5~20.0%)로 가용화한 PPC(5.0%) 복합 조성물(도 5f)를 랫트 족부에 0.1ml 주사하고 투여 전, 투여 후 1, 2시간 경과 시점 중 대표적으로 2시간 경과 시점의 투여 부위를 촬영한 일련의 이미지들이다. 족부 사진은 4×4 cm 축척자를 이용하여 촬영하였다.
도 6a 내지 도 6f를 포함하는 도 6은 PPC(2.5~15.0%) 단독 조성물(도 6a), 다양한 담즙염(DCA, HDCA, UDCA, TDCA, GDCA, CDCA, CA, GCA, TCA, TUDCA)의 1.0~7.5% 농도 단독 조성물(도 6b 및 도 6c), 다양한 담즙산들로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물(도 6d), GCA(1.25~7.5%)으로 가용화한 다양한 농도의 PPC(2.5~15.0%) 복합 조성물(도 6e), GCA(2.5~25.0%)로 가용화한 PPC(5.0%) 복합 조성물(도 6f) 주사 후 3시간 경과 시점에 랫트를 희생시켰다. 주사된 영역의 조직을 절개하고, 10% 포르말린으로 고정한 후 검체를 제작하여 광학현미경을 이용하여 조직학적 검사를 나타낸 일련의 이미지들이다. H&E 염색은 처리된 족부의 염증반응을 보여준다(200배).
도 7a 내지 도 7i를 포함하는 도 7은 3T3-L1 지방세포에서 실험약물의 생존도 감소를 도시한 일련의 이미지들이다. 지방세포 생존도를 3-(4,5-디메틸타아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석법으로 측정하였다. 실험은 각 처리 당 3회 반복하였으며 결과는 미처리된 대조군 대비 생존 세포의 총 백분율로서 표현하였다. 분화된 3T3-L1 지방세포에 PPC 단독 조성물(0.3125~ 15.0%), TUDCA(0.25~12.0%)로 가용화한 PPC (0.3125~ 15.0%) 복합 조성물, TCA(0.1563~7.5%)으로 가용화한 PPC (0.3125~ 15.0%) 복합 조성물, GCA(0.1563~7.5%)으로 가용화한 PPC (0.3125~ 15.0%) 복합 조성물에 대한 24시간 경과 시점(도 7a), 48시간 경과 시점(도 7b), 72시간 경과시점(도 7c), 96시간 경과 시점(도 7d)의 지방세포 생존도를 나타낸 일련의 그래프들이다.
도 7e는 단독 조성물로 DCA(1.0%) 및 PPC(5.0%)와 복합 조성물 PPC(5.0%)+GCA(2.5%), PPC(5.0~15.0%)+TCA(2.5~7.5%), PPC(5.0~15.0%)+TUDCA(4.0~12.0%)에 대한 96시간 경과 시점의 지방세포 생존도를 나타낸 일련의 그래프이다.
도 7f 내지 도 7h는 단독 조성물로서 PPC(2.5~10.0%), DCA(1.1~4.4%), GCA(1.25~5.0%), 복합 조성물로서 PPC(2.5~10.0%)+GCA(1.25~5.0%), PPC(2.5~10.0%)+DCA(1.1~4.4%)에 대한 96시간 경과 시점의 지방세포 생존도를 나타낸다.
도 7i는 PPC(5.0%) 단독 조성물과 다양한 농도의 GCA(2.5~8.75%)로 가용화한 PPC(5.0%) 복합 조성물의 생존도를 나타낸 일련의 그래프들이다.
도 8a 내지 도 8d를 포함하는 도 8은 지방세포(3T3-L1 adipocytes, 도 8d)뿐만 아니라 근육세포(Skeletal muscle cells, 도 8a), 섬유아세포(Normal fibroblasts, 도 8b) 및 혈관내피세포(Endothelial cells, 도 8c)에서 단독 조성물로 PPC 5.0% 단독 조성물과 담즙산으로 가용화한 PPC 복합 조성물(PPC 5.0%+GCA 2.5%, PPC 5.0%+TCA 2.5%, PPC 5.0%+TUDCA 4.0%, PPC 5.0%+DCA 2.2%, PPC 5.0%+HDCA 2.5%, PPC 5.0%+UDCA 3.0%, PPC 5.0%+TDCA 2.5%, PPC 5.0%+GDCA 2.5%, PPC 5.0%+CDCA 2.5%, PPC 5.0%+CA 2.5%)의 처리에 따른 세포 생존도 감소를 도시한 일련의 이미지들이다. 각각의 생존도를 3-(4,5-디메틸타아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석법으로 측정하였다. 실험은 각 처리 당 3회 반복하였으며 결과는 미처리된 대조군 대비 생존 세포의 총 백분율로서 표현하였다.
도 9a 및 도 9b를 포함하는 도 9는 3T3-L1 지방세포의 분화 전(도 9a), 후(도 9b)의 모습을 나타낸다. 3T3-L1 전구 지방세포(왼쪽 이미지)를 분화 배지를 이용하여 분화를 유도하였으며, 분화된 지방세포(오른쪽 이미지)를 대상으로 Oil Red 염색방법으로 중성지방이 함유된 지방세포를 염색하고 200X 배율로 촬영한 결과이다.

도 10a 내지 도 10d를 포함하는 도 10은 지방세포가 괴사(necrosis)되는 것과 구별하여, 본 발명의 주사제 조성물이 특이적으로 아포토시스(apoptosis) 세포사멸 효과를 가지는지를 Caspase 3 activity assay를 통하여 확인한 결과와 지방분해(lipolysis) 효과를 가지는지를 Glycerol release 측정을 통하여 확인한 결과를 도시한 일련의 이미지들이다.
도 10a 및 도 10b는 Caspase 3 activity를 측정한 것으로 각 well에 3T3-L1 지방세포를 1X10⁵개씩 분주하고 실험물질 PPC 5.0%, PPC 5.0%+DCA 2.2%, PPC 5.0%+GCA 2.5%, PPC 5.0%+GCA 5.0%, DCA 1.0%, GCA(1.0~5.0%)을 함유하는 제제 및 PBS 대조군을, 섭씨 37도씨에서 0~48시간 동안 배양하였다(3회 반복 실험). 그 후 분광광도계로 405nm 파장에서 측정한 결과를 나타낸 일련의 그래프로 10a는 24시간 경과 시점, 10b는 48시간 경과 시점이다.
도 10c 및 도 10d는 Glycerol release를 측정한 것으로 각 실험약물의 처리는 도 10a 및 도 10b와 동일한 방법으로 수행되었으며, 약물처리된 지방세포를 섭씨 37도에서 0~48시간동안 배양하여 지방분해(lipolysis)를 유도하였다. 상온에서 30분간 방치 후 OD570는 분광광도계로 측정하였다(3회 반복 실험).
도 11a 내지 도 11d를 포함하는 도 11은 실험약물이 투여된 마우스로부터 지방 패드에서 관찰되는 조직학적 변화를 도시한 이미지들이다. 도 11a는 PPC(2.5~15.0%) 단독 조성물을 주사한 결과이다.
도 11b는 단독 조성물로 PBS, Isuprel, DCA 1.0%, 복합 조성물로 PPC 5.0%+DCA 2.2%, PPC 5.0%+CDCA 2.5%, PPC 5.0%+HDCA 2.5%, PPC 5.0%+UDCA 3.0%를 주사한 결과이다.
도 11c는 복합 조성물로 PPC 5.0%+GDCA 2.5%, PPC 5.0%+TDCA 2.5%, PPC 5.0%+CA 2.5%, PPC 5.0%+GCA 2.5%, PPC 5.0%+TCA 2.5%, PPC 5.0%+TUDCA 4.0%를 주사한 결과이다.
도 11d는 단독 조성물로 PBS, PPC 5.0%, GCA 2.5%, 복합 조성물로 PPC(2.5~10.0%)+GCA(1.25~5.0%)을 주사한 결과이다.
상기 주사 후에 각각 주사된 영역의 지방조직을 절개하였다. 절개된 조직을 포름알데히드로 고정하고 파라핀 블록 중에 함침시킨 다음, 슬라이드 글라스에 단편화하였다. 조직 괴사, 사멸, 분해는 H&E 염색에 의해 관찰하였다.
도 12a 내지 도 12c를 포함하는 도 12는 PPC+GCA 복합 조성물을 비글견(Dog, beagle)에 단회 피하투여시 나타나는 독성반응을 평가하기 위하여 실시한 실험결과 중 투여 14일 후 부검 후 조직병리학적 검사를 실시한 것으로 조직을 H&E 염색하여 투여부위를 조직학적으로 비교한 일련의 이미지들을 촬영한 이미지들이다.
도 12a는 비글견 암컷 및 수컷에 대한 저용량 투여군[PPC(90mg/kg)+GCA(50.4mg/kg) 복합 조성물],
도 12b는 비글견 암컷 및 수컷에 대한 중용량 투여군[PPC(180 mg/kg)+GCA(100.8mg/kg) 복합 조성물],
도 12c는 비글견 암컷 및 수컷에 대한 고용량 투여군[(360 mg/kg)+GCA(201.6mg/kg) 복합 조성물]에 대한 결과를 나타낸다.
도 13a 및 도 13b를 포함 하는 도 13는 in vivo 통증 유발 정도를, 실험동물의 이동거리(cm)와 이동속도(cm/s)로 측정하여 평가한 결과를 나타낸다. 구체적으로 랫드 족부 바닥에 각 실험약물을 100μl 주사 후 부종을 관찰한 결과 부종이 최고로 발생되는 시간이 2시간째임을 확인하였고, 이를 통증 최고 시간으로 정하여 투약 전 후의 이동능을 거리와 시간으로 비교 평가하였다. 실험 약물 투약 전후의 이동능은 Noldus Video Tracking 시스템을 사용하였고 5분간의 이동거리(도 13a)와 이동속도(도 13b)를 비교하였다.
도 14a 및 도 14b를 포함하는 도 14는 본 발명의 GCA로 가용화한 PPC 복합 조성물을 투여 받은 대상자의 턱밑 지방 감소에 대한 유효성 결과이다. 투여부위(턱 밑)에 9.6% 리도카인 연고로 국소마취 후, 본 발명 제제인 PPC 5.0%+GCA 2.8% 복합 조성 주사제 10ml(PPC 500mg+GCA 280mg)을 턱밑 피하지방층(총 50군데, 포인트당 0.2cc, 1.0cm간격, 6~8mm 깊이, 30G 13mm 주사바늘을 장착)에 4주 간격으로 6회 투여 수행 후 12주 차의 결과를 나타낸 일련의 이미지들이다. 도 14a는 표준임상사진 촬영방법으로 촬영한 이미지이며, 도 14b는 CT상 턱밑 지방두께 감소치를 나타낸 일련의 이미지들이다.
도 15a 내지 도 15c를 포함하는 도 15는 인간 피험자 6명에 대하여, DCA로 가용화한 PPC 주사제를 투여받은 경험이 있는 대상자을 대상으로 GCA로 가용화한 PPC 복합 조성물 후 통증과 부종 그리고 유해사례를 비교한 일련의 그래프들이다. 실험약물은 리포빈주(1ml 중 PPC 50.0mg+DCNa 24.0mg)을 0.9% 생리식염주사액으로 1:1로 희석한 용액(즉, PPC 25.0mg+DCNa 12.0mg에 해당) 10ml, GCA 2.8%로 가용화한 PPC 5.0%(1ml 중 PPC 50.0mg+GCA 28.0mg) 10ml 및 GCA 4.0%로 가용화한 PPC 5.0%(1ml 중 PPC 50.0mg+GCA 40.0mg) 10ml을 턱 밑 피하지방층 부위(총 50군데, 포인트당 0.2cc, 1.0cm간격, 6~8mm 깊이, 30G 13mm 주사바늘을 장착하고 투여하였다. 상기 각 물질의 투여 후 1,3,7,10일 경과 시점에서 설문조사를 실시하였다.
도 15a는 통증(pain) 정도를 100mm pain VAS 평가한 결과, 도 15b는 부종 정도를 부종평가척도[(Edema grade scale,(0:없음-0mm, 1:경증-2mm, 2:중등증-4mm, 3:중증-6mm, 4: 극심-8mm))로 평가한 결과 및 도 15c는 국소적 유해사례들인 투여부위의 광범위한 종창(swelling), 혈종(hematoma), 멍(bruising), 홍반(erythema), 결절(nodule), 가려움증(pruritus)] 5등급(0:없음, 1:경증, 2:중등증, 3:중증, 4: 극심)으로 분류하여 평가한 결과를 나타낸 그래프들이다.
도 16은 인간 피험자에게 리포빈주(1ml 중 PPC 50.0mg+DCNa 24.0mg)을 0.9% 생리식염주사액을 1:1로 희석한 용액(1ml 중 PPC 25.0mg+DCNa 12.0mg) 또는 GCA로 가용화한 PPC 복합 조성 주사제(1ml 중 PPC 50mg+GCA 40mg) 투여 후 피부병변인 홍반, 멍, 혈종에 대한 비교 이미지이다. 투여부위에 9.6% 리도카인 연고로 30분 국소마취 후, 실험약물 각각 50ml을 옆구리 피하지방층 부위(총 100군데, 포인트당 0.5cc, 1.5cm간격, 10~12mm 깊이, 30G 13mm 주사바늘을 장착)에 투여 되었다. 투여 2일 후 이미지를 수득하였다. DCA로 가용화한 PPC 주사제의 투여부위에서는 약물이 퍼지는 부위를 따라 홍반, 멍, 혈종과 같은 피부병변이 관찰되었으나, 본 발명의 GCA로 가용화한 PPC 복합 조성 주사제는 주사기 바늘의 침습에 의한 혈종과 멍만 관찰되었다.

하기 실시예, 비교예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 원료 ]

본원 발명의 주사제 조성물들 및 비교 조성물들의 제조에 투입된 물질은 하기와 같다:

필수인지질성물질(PPC, S-100, LIPOID GmbH, 784g/mol based on Oleoyl-linoleoyl-glycero-phosphocholine), 콜린산(Glycocholic acid, CA, New zealand pharm), 데옥시콜린산(Deoxycholic acid, DCA, Sigma-Aldrich), 소디움 데옥시콜린산(Sodium Deoxycholate, DCNa, New zealand phram), 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA, New zealand phram), 소디움 글리코콜린산 (Sodium Glycocholate, GCNa, New zealand phram), 타우로콜린산(Taurocholic acid, TCA, Sigma-Aldrich), 소디움 타우로콜린산(Sodium Taurocholate, TCNa, New zealand phram), 케노데옥시콜린산(Chenodeoxycholic acid, CDCA, Sigma-Aldrich), 우르소데옥시콜린산(Ursodeoxycholic acid, UDCA, Sigma-Aldrich), 글리코데옥시콜린산(Glycodeoxycholic acid, GDCA, Sigma-Aldrich), 타우로데옥시콜린산(Taurodeoxycholic acid, TDCA, Sigma-Aldrich), 히오데옥시콜린산(Hyodeoxycholic acid, HDCA, Sigma-Aldrich), 리토콜린산(Lithocholic acid, LCA, Sigma-Aldrich), 디하이드로콜린산(Dehydrocholic acid, DHCA, Sigma-Aldrich), 타우로우루소데옥시콜린산(Tauroursodeoxycholic acid, TUDCA, Tokyo Chemical Industry), 벤질알코올(Sigma-Aldrich, 0.9% w/v), 염화나트륨(Sigma-Aldrich, 0.44% w/v), 수산화나트륨(Sigma-Aldrich, 0.04~0.76% w/v), 염산(Sigma-Aldrich, 0.001~0.6% w/v), 주사용수(물). 투입된 물질들 중 등장화제(염화나트륨)는 실시예 및 비교예 등에서 벤질알코올 투입 시에 함께 투입되는 방식으로 사용되었다.

[분석 기기]

본원 발명의 주사제 조성물들 및 비교 조성물들의 분석에 사용된 기기는 다음과 같다. 입도측정은 나노입도분석기(Microtrac Wave, MICROTRACT, USA)를 이용하여 측정했으며 제조 후 침전현상으로 인한 층 분리 관찰은 사진기(Nikkon, D5200, AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR 렌즈)로 촬영했으며, 투명도는 분광광도계 (CM-3600d, KONICA MINOLTA,JAPAN)를 이용하여 측정했으며, pH는 pH측정기(ST3100, OHAUS, GERMANY), 등장도는 삼투압측정기 (Vapro 5600, Elitech Group, USA), 점도는 점도계(Digital Viscometer CL-2, CAS, 대한민국)를 이용하여 분석하였다.

하기와 같이 가용화제 종류에 따른 PPC 기반 국소지방감소용 제제로서 본원 발명의 조성물(실시예)과 비교 조성물들(비교예)들을 제조하였다. 이하에서 조성물의 %는 %(w/v)를 의미한다.

< 비교예 1>

PPC 단독조성 주사제

가용화제가 첨가되지 않은 포스파티딜콜린(PPC) 단독조성을 기반으로 하는 국소 지방감소 주사용 조성물(PPC 농도 0.313~15.0%)을 제조하였다. 고압호모게나이저를 이용하여, 1mL 중 각각 PPC 3.125mg(0.3125%), 6.25mg(0.625%), 12.5mg(1.25%), 25.0mg(2.5%), 50.0mg(5.0%), 75.0mg(7.5%), 100.0mg(10.0%), 125.0mg(12.5%) 및 150.0mg(15.0%)과 벤질알코올 9mg(0.9%) 조성을 기반으로 하는 주사용 조성물을 제조하였으며, 이들의 대표적인 결과를 하기 표 1에 나타낸다. 이하, 본 명세서에서 조성물의 %w/v은 %로 표기한다.

구체적인 제조방법은 다음과 같다. 세척, 멸균된 조제탱크에 주사용수를 투입하고(상온), 여기에 포스파티딜콜린(PPC), 벤질알코올을 투입하여 질소압, 차광, 상온조건에서 2시간 200RPM 교반하였다. 교반 종료 후 질소압으로 초고압 균질기(Nano Disperser NLM100, 일신오토클레이브, 대한민국)로 이송하였다. 12,000psi에서 7 cycle로 초고압 균질(분산)을 시행하여 입자를 미세화하였고, 그 후 pH조절하였으며, 0.2 μm필터 여과 후 바이알에 충진 및 밀봉하였다.

고압호모게나이저로 분산한 PPC 단독조성 주사제

성분명	비교예 1-1	비교예 1-2	비교예 1-3	비교예 1-4	비교예 1-5	비교예 1-6
PPC %(w/v)	0.625	1.25	2.5	5.0	7.5	10.0
성상 (제조 후)	약간혼탁	약간혼탁	약간혼탁	혼탁	혼탁	혼탁
성상 (제조 30일 후)	약간혼탁	약간혼탁	침전	침전	침전	침전
투명도 (660nm)	97.87	86.72	84.03	77.24	77.11	67.47
입자도 (nm)	17.16± 5.88	17.88± 5.74	18.43± 6.16	17.07± 5.19	15.27± 4.73	16.69± 4.51

도 1a에서 보는 바와 같이 가용화제가 첨가되지 않은 PPC 5.0% 조성물은 24 내지 72시간 교반 직후 성상이 혼탁했으며, 최종 교반 1일 경과시점에서 조성물은 PPC가 주사용수에 분산되지 못하고 침전되어 제형 안정성이 낮아 산업적 이용에 한계가 있었다. 또한 도 1b 및 표 1에서 보는 바와 같이, 가용화제가 첨가되지 않고 PPC 0.625 내지 10.0%를 고압호모게나이저로 분산시킨 조성물의 성상은 농도별로 약간 혼탁 내지 혼탁한 상태를 나타내었으며, 입자도는 17.16±5.88 내지 16.69±4.51nm의 리포좀 시스템으로 불안정하게 분산되었다. 30일 경과 시점의 성상을 관찰한 결과, PPC 2.5% 이상의 농도부터는 주사용수에 분산되지 못하고 침전되는 낮은 제형 안정성으로 인하여 산업적 주사용 제제로 적합하지 않음을 확인하였다(도 1b).

이러한 연유로 PPC가 10nm 이하의 입도로 안정하게 분산된 마이셀 구조의 맑은 용액의 주사제 조성물을 수득하고 이들의 성상을 비교하기 위하여, 다양한 담즙산(BA)인 (데옥시콜린산(DCA), 콜린산(CA), 글리코콜린산(GCA), 타우로콜린산(TCA), 케노데옥시콜린산(CDCA), 우루소데옥시콜린산(UDCA), 글리코데옥시콜린산(GDCA), 타우로데옥시콜린산(TDCA), 히오데옥시콜린산(HDCA), 리토콜린산(LCA), 디하이드로콜린산(DHCA), 타우로우루소데옥시콜린산(TUDCA))을 여러가지 농도로 가용화한 PPC 복합 조성물을 제조하였으며, 이하의 비교예 및 실시예에서 이들의 조성을 자세히 도시한다.

< 비교예 2>

DCA로 가용화한 PPC 주사제

기존에 공지된 리포스타빌 제제 등의 조성과 같이, 데옥시콜린산(DCA)으로 가용화한 포스파티딜콜린(PPC 5.0%)을 기반으로 하는 조성물은 하기 표 2에서 보는 바와 같이 1ml 중 PPC 50.0mg(5.0%)에 DCA를 각각 10.0mg(1.0%), 15.0mg(1.5%), 20.0mg(2.0%), 21.0mg(2.1%), 22.0mg(2.2%), 23.0mg(2.3%), 24.0mg(2.4%), 25.0mg(2.5%), 30.0mg(3.0%)을 투입하고 벤질알코올 9mg(0.9%)을 첨가하여 다양하게 제작되었다. 구체적으로 세척, 멸균된 조제탱크에 주사용수를 투입하고(상온), 상기 주사용수에 수산화나트륨을 투입하였다. 그 후 데옥시콜린산과 벤질알코올 투입, 교반 및 용해하였다. 그 후 포스파티딜콜린을 투입하여, 차광, 밀폐, 상온(25℃), 질소압 조건에서 200RPM으로 약 24시간 교반하였다. 교반 종료 후 pH 조절(필요한 경우에, 추가의 수산화나트륨 또는 염산으로)하고, 0.2 μm필터로 여과 후 바이알에 충진 및 밀봉하였다. 표 2 는 다양한 농도의 DCA로 가용화한 PPC 주사제들의 특성을 나타낸다.

DCA로 가용화한 PPC 주사제

성분명	비교예 2-1	비교예 2-2	비교예 2-3	비교예 2-4	비교예 2-5	비교예 2-6	비교예 2-7	비교예 2-8	비교예 2-9
PPC %(w/v)	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
DCA %(w/v)	1.0	1.5	2.0	2.1	2.2	2.3	2.4	2.5	3.0
DCA/PPC 몰비	0.41	0.62	0.83	0.87	0.91	0.95	0.99	1.03	1.24
성상 (제조 후)	매우 혼탁	매우 혼탁	약간 혼탁	투명	투명	투명	투명	투명	투명
성상 (제조 30일 후)	침전	침전	투명	투명	투명	투명	투명	투명	투명
투명도 (660nm)	23.7	26.92	91.7	99.41	99.52	99.26	99.71	99.57	99.89
입자도 (nm)	50.80± 330.0	72.70± 492.0	39.60± 26.14	8.57± 0.660	3.21± 0.920	3.23± 0.780	3.20± 0.690	3.19± 0.820	2.68± 0.850

데옥시콜린산(DCA)으로 가용화한 PPC 주사제들 대하여 제조 직후와 제조 30일 후(상온에서 방치한 후) 제형 안정성을 평가하였으며, 이러한 평가결과는 도 2a에 나타낸다. PPC 5%에 대하여 DCA가 2.1% 이상으로 첨가될 때 안정적인 제제학적 배합이 일어난 것이 확인되었으며 조성물은 투명한 맑은 용액의 성상을 나타내었다(비교예 2-4 내지 비교예 2-9). 비교예 2-1 내지 2-3은 침전현상으로 제제가 불안정한 성상으로 관찰되었다. 상기 비교를 통하여 PPC 5% 기준 DCA 2.1% 이상에서 안정한 주사제 제형이 가능하다는 결론에 도달하였다. 특히 비교예 2-1 내지 비교예 2-3에서는 포스파티딜콜린 입자도가 50.80±330.0nm 내지 39.60±26.14nm로 마이셀 구조가 아닌 불안정한 에멀전 또는 리포좀 구조로 조성되었으나, 비교예 2-4 내지 비교예 2-9는 10nm 이하 마이셀 구조로 조성되었다. 상기한 바와 같이 DCA/PPC 몰비 0.87 미만의 조성은 실질적으로 안정적인 제제학적 배합이 일어나지 않은 것으로 판단되어 주사제에 사용하기에는 부적합할 것으로 사료되었다.

< 실시예 1>

GCA로 가용화한 PPC 주사제의 제조

글리코콜린산(GCA)으로 가용화한 포스파티딜콜린(PPC)을 기반으로 하는 국소 지방감소용 조성물을 하기 표 3 및 표 4에서 보는 바와 같이 1ml 중 PPC 50.0mg(5.0%w/v)에 GCA를 각각 10.0mg(1.0%), 15.0mg(1.5%), 20.0mg(2.0%), 21.0mg(2.1%), 22.0mg(2.2%), 23.0mg(2.3%), 24.0mg(2.4%), 25.0mg(2.5%), 26.0mg(2.6%), 27.0mg(2.7%), 28.0mg(2.8%), 29.0mg(2.9%), 30.0mg(3.0%), 35.0mg(3.5%), 40.0mg(4.0%), 45.0mg(4.5%)을 투입하고 벤질알코올 9mg(0.9%)을 첨가하여 다양하게 제조하였다. 구체적인 제조공정은 다음과 같다. 세척, 멸균된 조제탱크에 주사용수를 투입하고(상온), 상기 주사용수에 수산화나트륨(0.04~0.72%)을 투입하였다. 그 후 글리코콜린산과 벤질알코올을 투입, 교반 및 용해하였다. 그 후 포스파티딜콜린을 투입하여, 차광, 밀폐, 상온(25℃), 질소압 조건에서 200RPM으로 약 24시간 교반하였다. 교반 종료 후 pH 조절(필요한 경우에, 추가의 0.001~0.04% 수산화나트륨 또는 0.001~0.6% 염산으로)하고, 0.2 μm필터로 여과 후 바이알에 충진 및 밀봉하였다. 표 3 및 표 4는 다양한 농도의 GCA로 가용화한 PPC 주사제들의 특성을 나타낸다.

성분명	비교 실시예 1-1	비교 실시예 1-2	비교 실시예 1-3	비교 실시예 1-4	실시예 1-1	실시예 1-2	실시예 1-3	실시예 1-4
PPC %(w/v)	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
GCA %(w/v)	1.0	1.5	2.0	2.1	2.2	2.3	2.4	2.5
GCA/PPC 몰비	0.35	0.52	0.69	0.73	0.76	0.80	0.83	0.87
성상 (제조 후)	매우 혼탁	매우 혼탁	매우 혼탁	약간 혼탁	약간 혼탁	약간 혼탁	약간 혼탁	투명
성상 (제조30일 후)	침전	침전	침전	약간 투명	투명	투명	투명	투명
투명도 (660nm)	21.03	24.18	30.05	35.24	88.0	88.05	87.78	99.79
입자도 (nm)	198.2± 721.0	117.5±2533	194.9± 2752	28.2± 11.35	9.84± 1.780	8.41± 1.210	7.01± 1.200	7.13± 0.880
pH	7.18	7.24	7.27	7.18	7.22	7.20	7.24	7.23

성분명	실시예 1-5	실시예 1-6	실시예 1-7	실시예 1-8	실시예 1-9	실시예 1-10	실시예 1-11	실시예 1-12
PPC %(w/v)	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
GCA %(w/v)	2.6	2.7	2.8	2.9	3.0	3.5	4.0	4.5
GCA/PPC 몰비	0.90	0.94	0.97	1.01	1.04	1.21	1.39	1.56
성상 (제조 후)	투명	투명	투명	투명	투명	투명	투명	투명
성상 (제조30일 후)	투명	투명	투명	투명	투명	투명	투명	투명
투명도 (660nm)	99.82	99.8	99.71	99.83	99.9	99.73	99.74	99.87
입자도 (nm)	7.43± 1.190	6.07± 0.870	3.93± 0.750	4.00± 0.760	3.64± 0.730	2.89± 0.830	2.38± 0.760	2.28± 0.670
pH	7.20	7.22	7.28	7.22	7.26	7.24	7.19	7.26

상기 표 3 및 표 4의 글리코콜린산(GCA)으로 가용화한 PPC 주사제 조성물들의 제조 직후와 제조 30일 후(냉장보관) 제형안정성을 평가하였으며, 이러한 평가결과는 도 2b에 나타낸다. PPC 5.0%에 대하여 GCA 2.2% 이상으로 첨가될 때 안정적으로 제제학적 배합이 일어난 것이 확인되었으며 조성물이 투명한 맑은 용액의 성상을 나타내었다(실시예 1-1 내지 1-12). 비교실시예 1-1 내지 1-4은 침전현상으로 제제가 안정하지 못한 것으로 확인되었다. 실시예 1-1 내지 1-3은 제조 직후 약간 혼탁했으나 0.2 μm필터로 여과 후에는 투명한 성상을 나타내어 주사용 제제로 사용가능함을 확인하였다. 이로써, PPC 5.0% 기준으로 GCA 2.2% 이상에서 안정한 주사제 제형이 가능하다는 결론에 도달하였다. 비교실시예 1-1 내지 1-4 조성물의 입자도는 198.2±721.0nm 내지 28.2±11.35nm로 불안정한 에멀전 또는 리포좀 구조로 분산되어 실질적으로 안정적인 제제학적 배합이 일어나지 않은 것으로 판단되어 주사제에 사용하기에는 부적합할 것으로 사료되었다. 그 외에 GCA 2.2% 이상(GCA/PPC 몰비 0.76 이상) 첨가 PPC 복합 조성물들(실시예 1-1 내지 1-12)은 10nm 이하 마이셀구조로 조성되며 GCA 2.8%이상(GCA/PPC 몰비 0.97 이상) 첨가 PPC 복합 조성물들(실시예 1-7 내지 1-12)은 5nm 이하 마이셀 구조로 조성되어, 주사제로 사용에 적합한 것으로 확인되었다.

GCA로 가용화한 PPC 복합 조성물은, PPC 농도에 비례하여 점도가 증가하기 때문에 다양한 조성물에 대한 점도 실험을 실시하였다. 구체적으로 PPC 5.0%가 5nm 이하 입자도로 분산되는 GCA 배합 농도인 2.8%를 기준으로, GCA(1.4~11.2%)로 가용화한 PPC(2.5~20.0%)와 GCA(4.2~12.6%)로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물의 특성을 조사하였다. 상기 조성물 각각 500ml을 상온(25℃)에서 스핀니들 1번을 장착 후 60 RPM으로 3분간 측정하였다. 실험결과 입자도는 4.23±1.69 내지 1.37±0.530 nm인 것을 확인하였고, 투명도(660nm)는 99.11±0.77 %로 측정되었다. 표 5는 다양한 농도의 GCA로 가용화한 PPC 주사제들의 점도특성을 나타낸다. 하기 표 5에 근거하여, PPC가 15%(w/v)를 초과할 때는 높은 점도로 인하여 투여에 부적절한 것으로 확인되었다.

PPC %(w/v)	GCA %(w/v)	점도 (cP)	PPC %(w/v)	GCA %(w/v)	점도(cP)
2.5	1.4	0.02	5.0	2.8	0.25
5.0	2.8	0.25		4.2	0.09
6.0	3.4	1.90		5.6	0.43
7.0	3.9	5.71		7.0	0.44
8.0	4.5	7.22		8.4	0.44
9.0	5.0	7.87		9.8	0.49
10.0	5.6	8.70		12.6	0.96
11.0	6.2	12.87
12.0	6.7	14.76
13.0	7.3	17.86
14.0	7.8	22.16
15.0	8.4	24.16
16.0	9.0	25.96
17.0	9.5	27.95
18.0	10.1	50.49
19.0	10.6	74.20
20.0	11.2	176.00

< 실시예 2>

TCA로 가용화한 PPC 주사제 제조

타우로콜린산(TCA)으로 가용화한 포스파티딜콜린(PPC)을 기반으로 하는 조성물을 하기 표 6 및 표 7에서 보는 바와 같이 1ml 중 PPC 50.0mg(5.0%)에 TCA를 각각 10.0mg(1.0%), 15.0mg(1.5%), 20.0mg(2.0%), 21.0mg(2.1%), 22.0mg(2.2%), 23.0mg(2.3%), 24.0mg(2.4%), 25.0mg(2.5%), 26.0mg(2.6%), 27.0mg(2.7%), 28.0mg(2.8%), 29.0mg(2.9%), 30.0mg(3.0%), 35.0mg(3.5%), 40.0mg(4.0%), 45.0mg(4.5%)을 투입하고 벤질알코올 9mg(0.9%)을 첨가하여 다양하게 제조하였다. 구체적인 제조공정은 상기 실시예 1과 동일하다. 표 6 및 표 7은 다양한 농도의 TCA로 가용화한 PPC 주사제들의 특성을 나타낸다.

성분명	비교 실시예 2-1	비교 실시예 2-2	비교 실시예 2-3	비교 실시예 2-4	비교 실시예 2-5	비교 실시예 2-6	비교 실시예 2-7	실시예 2-1
PPC %(w/v)	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
TCA %(w/v)	1.0	1.5	2.0	2.1	2.2	2.3	2.4	2.5
TCA/PPC 몰비	0.31	0.47	0.63	0.66	0.69	0.72	0.75	0.78
성상 (제조 후)	매우 혼탁	매우 혼탁	매우 혼탁	매우 혼탁	매우 혼탁	매우 혼탁	혼탁	약간 혼탁
성상 (제조30일 후)	침전	침전	침전	침전	침전	침전	침전	투명
투명도 (660nm)	28.26	28.58	30.97	34.54	36.24	36.74	43.88	94.2
입자도 (nm)	139.6± 126.14	160.0± 158.80	170.8± 121.60	153.2± 2474	120.3± 1.60	149.5± 798.0	146.1± 2908	9.88± 1.420
pH	7.22	7.26	7.22	7.25	7.22	7.24	7.25	7.15

성분명	실시예 2-2	실시예 2-3	실시예 2-4	실시예 2-5	실시예 2-6	실시예 2-7	실시예 2-8	실시예 2-9
PPC %(w/v)	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
TCA %(w/v)	2.6	2.7	2.8	2.9	3.0	3.5	4.0	4.5
TCA/PPC 몰비	0.81	0.85	0.88	0.91	0.94	1.10	1.25	1.41
성상 (제조 후)	투명	투명	투명	투명	투명	투명	투명	투명
성상 (제조30일 후)	투명	투명	투명	투명	투명	투명	투명	투명
투명도 (660nm)	97.39	95.29	99.6	99.54	99.83	99.82	99.81	99.76
입자도 (nm)	7.01± 1.030	6.63± 0.960	3.74± 0.820	2.710± 1.030	3.56± 0.750	2.88±0.600	2.39±0.510	2.78±0.690
pH	7.19	7.17	7.15	7.26	7.20	7.21	7.25	7.20

상기 표 6 및 표 7의 타우로콜린산(TCA)으로 가용화한 PPC 주사제 조성물들 대하여, 제조 직후와 제조 30일 후(냉장보관) 제형안정성을 평가하였으며, 이러한 평가결과는 도 2c에 나타낸다. PPC 5.0%에 대하여 TCA 2.5% 이상으로 첨가될 때 안정적인 제제학적 배합이 일어난 것이 확인되었으며 조성물은 투명한 맑은 용액의 성상을 나타내었다(실시예 2-1 내지 2-9). 비교실시예 2-1 내지 2-7은 침전현상으로 제제가 안정하지 못한 것으로 확인되었다. 실시예 2-1은 제조직후 약간 혼탁했으나 0.2 μm필터로 여과 후에는 거의 투명한 성상을 나타내어 주사용 제제로 사용가능함을 확인하였다. 이로써, PPC 5% 기준으로 TCA 2.5% 이상에서 안정한 주사제 제형이 가능하다는 결론에 도달하였다. 비교실시예 2-1 내지 2-7 조성물의 입자도는 139.6±126.14nm 내지 146.1±2908nm로 불안정한 에멀전 또는 리포좀 구조로 분산되어 실질적으로 안정적인 제제학적 배합이 일어나지 않은 것으로 판단되어 주사제에 사용하기에는 부적합할 것으로 사료되었다. 그 외에 TCA 2.5% 이상(TCA/PPC 몰비 0.78 이상) 첨가 PPC 복합 조성물들(실시예 2-1 내지 2-9)은 10nm 이하 마이셀 구조로 조성되며, TCA 2.8% 이상(GCA/PPC 몰비 0.88 이상) 첨가 PPC 복합 조성물들(실시예 2-4 내지 2-9)은 5nm 이하 마이셀 구조로 조성되어, 주사제로 사용에 적합한 것으로 확인되었다.

< 비교예 3>

CA로 가용화한 PPC 주사제

콜린산(CA)으로 가용화한 포스파티딜콜린(PPC)을 기반으로 하는 조성물을 하기 표 8에서 보는 바와 같이 1ml 중 PPC 50.0mg(5.0%)에 CA를 각각 10.0mg(1.0%), 15.0mg(1.5%), 20.0mg(2.0%), 21.0mg(2.1%), 22.0mg(2.2%), 23.0mg(2.3%), 24.0mg(2.4%), 25.0mg(2.5%), 30.0mg(3.0%)을 투입하고 벤질알코올 9mg(0.9%)을 첨가하여 다양하게 제작되었다. 구체적인 제조공정은 상기 실시예 1과 동일하다.

성분명	비교예 3-1	비교예 3-2	비교예 3-3	비교예 3-4	비교예 3-5	비교예 3-6	비교예 3-7	비교예 3-8	비교예 3-9
PPC %(w/v)	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
CA %(w/v)	1.00	1.50	2.00	2.10	2.20	2.30	2.40	2.50	3.00
CA/PPC 몰비	0.40	0.60	0.80	0.84	0.88	0.91	0.95	0.99	1.19
성상 (제조 후)	매우 혼탁	매우 혼탁	혼탁	혼탁	거의 투명	투명	투명	투명	투명
성상 (제조30일후)	침전	침전	침전	침전	투명	투명	투명	투명	투명
투명도 (660nm)	24.2	27.41	44.46	63.64	95.56	99.66	99.62	99.71	99.73
입자도 (nm)	50.80± 330.0	72.70± 492.0	2105± 956	583.0± 293	6.22± 0.880	3.20± 0.760	3.20± 0.690	3.21± 0.660	2.63± 0.580

상기 표 8의 콜린산(CA)으로 가용화한 PPC 주사제 조성물들 대하여, 제조 직후와 제조 30일 후(냉장보관) 제형안정성을 평가하였으며, 이러한 평가결과는 도 2d에 나타낸다. PPC 5.0%에 대하여 CA가 2.2% 이상으로 첨가될 때 안정적으로 제제학적 배합이 일어난 것이 확인되었으며 조성물이 투명한 맑은 용액의 성상을 나타내었다(비교예 3-5 내지 3-9). 비교예 3-1 내지 3-4는 침전현상으로 제제가 안정하지 못한 것으로 확인되었다. 비교예 3-5는 제조 직후 거의 투명 했고, 0.2μm필터로 여과 후 완전히 투명한 성상을 나타내었다. 이로써, PPC 5% 기준으로 CA 2.2% 이상에서 안정한 주사제 제형이 가능하다는 결론에 도달하였다. 비교예 3-1 내지 3-4에서는 포스파티딜콜린 입자도가 50.80±330nm 내지 583.00±293nm로 마이셀 구조가 아닌 불안정한 에멀전 또는 리포좀 구조로 조성되었으나, 비교예 3-5 내지 3-9는 10nm 이하 마이셀구조로 조성되었다. 상기한 바와 같이 CA/PPC 몰비 0.88 미만의 조성은 실질적으로 안정적인 제제학적 배합이 일어나지 않은 것으로 판단되어 주사제에 사용하기에는 부적합할 것으로 사료되었다.

< 비교예 4>

CDCA로 가용화한 PPC 주사제

케노데옥시콜린산(CDCA)으로 가용화한 포스파티딜콜린(PPC)을 기반으로 하는 조성물을 하기 표 9에서 보는 바와 같이 1ml 중 PPC 50.0mg(5.0%)에 CDCA를 각각 10.0mg(1.0%), 15.0mg(1.5%), 20.0mg(2.0%), 21.0mg(2.1%), 22.0mg(2.2%), 23.0mg(2.3%), 24.0mg(2.4%), 25.0mg(2.5%), 30.0mg(3.0%)을 투입하고 벤질알코올 9mg(0.9%)을 첨가하여 다양하게 제작되었다. 구체적인 제조공정은 상기 실시예 1과 동일하다.

성분명	비교예 4-1	비교예 4-2	비교예 4-3	비교예 4-4	비교예 4-5	비교예 4-6	비교예 4-7	비교예 4-8	비교예 4-9
PPC %(w/v)	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
CDCA %(w/v)	1.0	1.5	2.0	2.1	2.2	2.3	2.4	2.5	3.0
CDCA/PPC 몰비	0.40	0.61	0.81	0.85	0.89	0.93	0.97	1.01	1.21
성상 (제조 후)	매우 혼탁	매우 혼탁	혼탁	혼탁	투명	투명	투명	투명	투명
성상 (제조 30일 후)	침전	침전	침전	침전	투명	투명	투명	투명	투명
투명도 (660nm)	21.4	21.47	37.46	48.38	98.79	99.05	98.78	99.45	99.28
입자도 (nm)	80.05± 280.0	1250± 478.0	93.76± 6.100	35.73± 0.830	3.47± 0.960	3.98± 0.910	3.64± 0.941	3.08± 0.920	3.89± 0.890

상기 표 9의 케노데옥시콜린산(CDCA)으로 가용화한 PPC 주사제 조성물들에 대하여 제조 직후와 제조 30일 후(냉장보관) 제형안정성을 평가하였으며, 이러한 평가결과는 도 2e에 나타낸다. PPC 5.0%에 대하여 CDCA가 2.2% 이상으로 첨가될 때 안정적으로 제제학적 배합이 일어난 것이 확인되었으며 조성물이 투명한 맑은 용액의 성상을 나타내었다(비교예 4-5 내지 4-9). 비교예 4-1 내지 4-4은 침전현상으로 제제가 안정하지 못한 성상을 나타내었다. 이로써, PPC 5% 기준 CDCA 2.2% 이상에서 안정한 주사제 제형이 가능하다는 결론에 도달하였다. 비교예 4-1 내지 4-4에서는 포스파티딜콜린 입자도가 80.05± 280.0nm 내지 35.73± 0.830nm로 마이셀 구조가 아닌 불안정한 에멀전 또는 리포좀 구조로 조성되었으나, 비교예 4-5 내지 4-9는 10nm 이하 마이셀 구조로 조성되었다. 상기한 바와 같이 CDCA/PPC 몰비 0.89 미만의 조성은 실질적으로 안정적인 제제학적 배합이 일어나지 않은 것으로 판단되어 주사제에 사용하기에는 부적합할 것으로 사료되었다.

< 비교예 5>

UDCA로 가용화한 PPC 주사제

우루소데옥시콜린산(UDCA)으로 가용화한 포스파티딜콜린(PPC)을 기반으로 하는 조성물을 하기 표 10에서 보는 바와 같이 1ml 중 PPC 50.0mg(5.0%)에 UDCA를 각각 10.0mg(1.0%), 15.0mg(1.5%), 25.0mg(2.5%), 26.0mg(2.6%), 27.0mg(2.7%), 28.0mg(2.8%), 29.0mg(2.9%), 30.0mg(3.0%)을 투입하고 벤질알코올 9mg(0.9%)을 첨가하여 다양하게 제작되었다. 구체적인 제조공정은 상기 실시예 1과 동일하다.

성분명	비교예 5-1	비교예 5-2	비교예 5-3	비교예 5-4	비교예 5-5	비교예 5-6	비교예 5-7	비교예 5-8	비교예 5-9
PPC %(w/v)	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
UDCA %(w/v)	1.0	1.5	2.0	2.5	2.6	2.7	2.8	2.9	3.0
UDCA/PPC 몰비	0.42	0.62	0.83	1.04	1.08	1.12	1.16	1.20	1.25
성상 (제조 후)	매우 혼탁	매우 혼탁	매우 혼탁	매우 혼탁	혼탁	거의 투명	투명	투명	투명
성상 (제조 30일 후)	침전	침전	침전	침전	침전	투명	투명	투명	투명
투명도 (660nm)	30.79	37.9	38.48	52.4	66.43	92.59	99.45	99.65	99.82
입자도 (nm)	289.0± 265.0	2698± 2475	83.20± 773.1	69.43± 315.0	42.42± 250	6.24± 0.430	2.31± 0.380	2.09± 0.450	2.22± 0.410

상기 표 10의 우루소데옥시콜린산(UDCA)으로 가용화한 PPC 주사제 조성물들에 대하여 제조 직후와 제조 30일 후(냉장보관) 제형안정성을 평가하였으며, 이러한 평가결과는 도 2f에 나타낸다. PPC 5.0%에 대하여 UDCA가 2.7% 이상으로 첨가될 때 안정적으로 제제학적 배합이 일어난 것이 확인되었으며 조성물이 투명한 맑은 용액의 성상을 나타내었다(비교예 5-6 내지 5-9). 비교예 5-1 내지 5-5는 침전현상으로 제제가 안정하지 못한 것으로 확인되었다. 비교예 5-6은 제조 직후 거의 투명 했고 0.2μm필터로 여과 후 투명한 성상을 나타내었다. 이로써 PPC 5.0% 기준 UDCA 2.7% 이상에서 안정한 주사제 제형이 가능하다는 결론에 도달하였다. 비교예 5-1 내지 비교예 5-5에서는 포스파티딜콜린 입자도가 289.0± 265.0nm 내지 42.42± 250nm로 마이셀 구조가 아닌 불안정한 에멀젼 또는 리포좀 구조로 조성되었으나 비교예 5-6 내지 5-9는 10nm 이하 마이셀 구조로 조성되었다. 상기한 바와 같이 UDCA/PPC 몰비 1.12 미만의 조성은 실질적으로 안정적인 제제학적 배합이 일어나지 않은 것으로 판단되어 주사제에 사용하기에는 부적합할 것으로 사료되었다.

< 비교예 6>

GDCA로 가용화한 PPC 주사제

글리코데옥시콜린산(GDCA)로 가용화한 포스파티딜콜린(PPC)을 기반으로 하는 조성물을 하기 표 11에서 보는 바와 같이 1ml 중 PPC 50.0mg에 GDCA를 각각 10.0mg(1.0%), 15.0mg(1.5%), 20.0mg(2.0%), 21.0mg(2.1%), 22.0mg(2.2%), 23.0mg(2.3%), 24.0mg(2.4%), 25.0mg(2.5%), 30.0mg(3.0%)을 투입하고 벤질알코올 9mg(0.9%)을 첨가하여 다양하게 제작되었다. 구체적인 제조공정은 상기 실시예 1과 동일하다.

성분명	비교예 6-1	비교예 6-2	비교예 6-3	비교예 6-4	비교예 6-5	비교예 6-6	비교예 6-7	비교예 6-8	비교예 6-9
PPC %(w/v)	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
GDCA %(w/v)	1.0	1.5	2.0	2.1	2.2	2.3	2.4	2.5	3.0
GDCA/PPC 몰비	0.36	0.54	0.73	0.76	0.80	0.84	0.87	0.91	1.09
성상 (제조 후)	매우 혼탁	매우 혼탁	매우 혼탁	혼탁	혼탁	혼탁	거의 투명	투명	투명
성상 (제조 30일 후)	침전	침전	침전	침전	침전	침전	투명	투명	투명
투명도 (660nm)	21.68	34.67	30.94	46.88	48.39	58.6	92.43	99.76	99.83
입자도 (nm)	204.4± 1880	344.0± 3215	95.22± 246.0	231.3± 348.2	155.4± 270.3	134.8± 680.1	3.91± 0.420	4.87± 0.300	2.78± 0.260

상기 표 11의 글리코데옥시콜린산(GDCA)으로 가용화한 PPC 주사제 조성물들에 대하여 제조 직후와 제조 30일 후(냉장보관) 제형안정성을 평가하였으며, 이러한 평가결과는 도 2g에 나타낸다. PPC 5.0%에 대하여 GDCA가 2.4% 이상으로 첨가될 때 안정적인 제제학적 배합이 일어난 것이 확인되었으며 조성물은 투명한 맑은 용액의 성상을 나타내었다(비교예 6-7 내지 6-9). 비교예 6-1 내지 6-6는 침전현상으로 제제가 안정하지 못한 것으로 확인되었다. 비교예 6-7은 제조 직후 거의 투명 했고, 0.2μm필터로 여과 후 투명한 성상을 나타내었다. 이로써 PPC 5.0% 기준으로 GDCA 2.4% 이상에서 안정한 주사제 제형이 가능하다는 결론에 도달하였다. 비교예 6-1 내지 비교예 6-6에서는 포스파티딜콜린 입자도가 204.4± 1880nm 내지 134.8± 680.1nm로 마이셀 구조가 아닌 불안정한 에멀전 또는 리포좀 구조로 조성되었으나, 비교예 6-7 내지 6-9는 10nm 이하 마이셀 구조로 조성되었다. 상기한 바와 같이 GDCA/PPC 몰비 0.87 미만의 조성은 실질적으로 안정적인 제제학적 배합이 일어나지 않은 것으로 판단되어 주사제에 사용하기에는 부적합할 것으로 사료되었다.

< 비교예 7>

TDCA로 가용화한 PPC 주사제

타우로데옥시콜린산(TDCA)으로 가용화한 포스파티딜콜린(PPC)을 기반으로 하는 조성물을 하기 표 12에서 보는 바와 같이 1ml 중 PPC 50.0mg(5.0%)에 TDCA를 각각 10.0mg(1.0%), 15.0mg(1.5%), 20.0mg(2.0%), 21.0mg(2.1%), 22.0mg(2.2%), 23.0mg(2.3%), 24.0mg(2.4%), 25.0mg(2.5%), 30.0mg(3.0%)을 투입하고 벤질알코올 9mg(0.9%)을 첨가하여 다양하게 제작되었다. 구체적인 제조공정은 상기 실시예 1과 동일하다.

성분명	비교예 7-1	비교예 7-2	비교예 7-3	비교예 7-4	비교예 7-5	비교예 7-6	비교예 7-7	비교예 7-8	비교예 7-9
PPC %(w/v)	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
TDCA %(w/v)	1.0	1.5	2.0	2.1	2.2	2.3	2.4	2.5	3.0
TDCA/PPC 몰비	0.32	0.48	0.64	0.67	0.71	0.74	0.77	0.80	0.96
성상 (제조 후)	매우 혼탁	매우 혼탁	매우 혼탁	매우 혼탁	혼탁	거의 투명	투명	투명	투명
성상 (제조 30일 후)	침전	침전	침전	침전	침전	투명	투명	투명	투명
투명도 (660nm)	33.24	29.56	25.12	41.58	53.68	87.82	99.45	99.78	99.98
입자도 (nm)	185.1± 1834	307.2± 90.90	199.2± 163.2	229.0± 330.9	123.5± 72.0	1.46± 0.410	1.80± 0.320	1.71± 0.450	1.85± 0.380

표 12의 타우로데옥시콜린산(TDCA)으로 가용화한 PPC 주사제 조성물들에 대하여 제조 직후와 제조 30일 후(냉장보관) 제형안정성을 평가하였으며, 이러한 평가결과는 도 2h에 나타낸다. PPC 5.0%에 대하여 TDCA가 2.3% 이상으로 첨가될 때 안정적으로 제제학적 배합이 일어난 것이 확인되었으며 조성물이 투명한 맑은 용액의 성상을 나타내었다(비교예 7-6 내지 7-9). 비교예 7-1 내지 7-5는 침전현상으로 제제가 안정하지 못한 것으로 확인되었다. 비교예 7-6은 제조 직후 거의 투명했고, 0.2μm필터로 여과 후 완전히 투명한 성상을 나타내었다. 이로써 PPC 5.0% 기준으로 TDCA 2.3% 이상에서 안정한 주사제 제형이 가능하다는 결론에 도달하였다. 비교예 7-1 내지 비교예 7-5에서는 포스파티딜콜린 입자도가 185.1±1834nm 내지 123.5±72.0nm로 마이셀 구조가 아닌 불안정한 에멀젼 또는 리포좀 구조로 조성되었으나 비교예 7-6 내지 7-9는 10nm 이하 마이셀 구조로 조성되었다. 상기한 바와 같이 TDCA/PPC 몰비 0.74 미만의 조성은 실질적으로 안정적인 제제학적 배합이 일어나지 않은 것으로 판단되어 주사제에 사용하기에는 부적합할 것으로 사료되었다.

< 비교예 8>

HDCA로 가용화한 PPC 주사제

히오데옥시콜린산(HDCA)으로 가용화한 포스파티딜콜린(PPC)을 기반으로 하는 조성물을 하기 표 13에서 보는 바와 같이 1ml 중 PPC 50.0mg(5.0%)에 HDCA를 각각 10.0mg(1.0%), 15.0mg(1.5%), 20.0mg(2.0%), 21.0mg(2.1%), 22.0mg(2.2%), 23.0mg(2.3%), 24.0mg(2.4%), 25.0mg(2.5%), 30.0mg(3.0%)을 투입하고 벤질알코올 9mg(0.9%)을 첨가하여 다양하게 제작되었다. 구체적인 제조공정은 상기 실시예 1과 동일하다.

성분명	비교예 8-1	비교예 8-2	비교예 8-3	비교예 8-4	비교예 8-5	비교예8-6	비교예8-7	비교예8-8	비교예8-9
PPC %(w/v)	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
HDCA %(w/v)	1.0	1.5	2.0	2.1	2.2	2.3	2.4	2.5	3.0
HDCA/PPC 몰비	0.41	0.62	0.82	0.86	0.91	0.95	0.99	1.03	1.24
성상 (제조 후)	매우 혼탁	매우 혼탁	매우 혼탁	매우 혼탁	매우 혼탁	거의 투명	투명	투명	투명
성상 (제조 30일 후)	침전	침전	침전	침전	침전	투명	투명	투명	투명
투명도 (660nm)	26.53	26.89	25.97	26.74	35.61	96.38	99.94	99.73	99.91
입자도 (nm)	537.2± 320	469.8± 33.20	168.3± 122	83.05± 650.5	81.65± 24.30	3.30± 0.980	3.21± 0.800	2.92± 1.150	3.47± 0.820

상기 표 13의 히오데옥시콜린산(HDCA)으로 가용화한 PPC 주사제 조성물들에 대하여 제조 직후와 제조 30일 후(냉장보관) 제형안정성을 평가하였으며, 이러한 평가결과는 도 2i에 나타낸다. PPC 5.0%에 대하여 HDCA가 2.3% 이상으로 첨가될 때 안정적으로 제제학적 배합이 일어난 것이 확인되었으며 조성물이 투명한 맑은 용액의 성상을 나타내었다(비교예 8-6 내지 8-9). 비교예 8-1 내지 8-5는 침전현상으로 제제가 안정하지 못한 것으로 확인되었다. 비교예 8-6은 제조 직후 거의 투명했고, 0.2μm필터로 여과 후 투명한 성상을 나타내었다. 이로써 PPC 5.0% 기준으로 HDCA 2.3% 이상에서 안정한 주사제 제형이 가능하다는 결론에 도달하였다. 비교예 8-1 내지 비교예 8-5에서는 포스파티딜콜린 입자도가 537.2±320nm 내지 81.65± 24.30nm로 마이셀 구조가 아닌 불안정한 에멀전 또는 리포좀 구조로 조성되었으나 비교예 8-6 내지 8-9는 10nm 이하 마이셀 구조로 조성되었다. 상기한 바와 같이 HDCA/PPC 몰비 0.95 미만의 조성은 실질적으로 안정적인 제제학적 배합이 일어나지 않은 것으로 판단되어 주사제에 사용하기에는 부적합할 것으로 사료되었다.

특이한 발견은 HDCA로 가용화한 PPC 복합 조성물은 냉장(4~8℃) 보관 시 혼탁했다가 상온에서 맑은 용액으로 성상이 변하는 양상이 관찰되었다. PPC+HDCA 복합 조성물은 냉장 보관 시 제형 안정성이 낮아 장시간 상온에서 보관해야 한다는 결론에 도달하였다. 하지만 상온에서 PPC+HDCA를 장시간 보관을 하면 용혈작용을 야기하는 리소포스파티딜콜린(lyso phosphatidylcholine)의 증가로 인하여 HDCA는 PPC 복합 조성물에 품질관리상 적합한 가용화제가 아닌 것으로 사료되었다.

< 비교예 9>

TUDCA로 가용화한 PPC 주사제

타우로우루소데옥시콜린산(TUDCA)으로 가용화한 포스파티딜콜린(PPC)을 기반으로 하는 조성물을 하기 표 14에서 보는 바와 같이 1ml 중 PPC 50.0mg에 TUDCA를 각각 10.0mg(1.0%), 15.0mg(1.5%), 20.0mg(2.0%), 25.0mg(2.5%), 30.0mg(3.0%), 35.0mg(3.5%), 40.0mg(4.0%), 45.0mg(4.5%), 50.0mg(5.0%)을 투입하고 벤질알코올 9mg(0.9%)을 첨가하여 다양하게 제작되었다. 구체적인 제조공정은 상기 실시예 1과 동일하다.

성분명	비교예 9-1	비교예 9-2	비교예 9-3	비교예 9-4	비교예 9-5	비교예 9-6	비교예9-7	비교예9-8	비교예9-9
PPC %(w/v)	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
TUDCA %(w/v)	1.0	1.5	2.0	2.5	3.0	3.5	4.0	4.5	5.0
TUDCA/PPC 몰비	0.32	0.48	0.64	0.80	0.97	1.13	1.29	1.45	1.61
성상 (제조 후)	매우 혼탁	매우 혼탁	매우 혼탁	혼탁	혼탁	혼탁	투명	투명	투명
성상 (제조 30일 후)	침전	침전	침전	침전	침전	침전	투명	투명	투명
투명도 (660nm)	19.56	21.2	24.8	38.43	42.16	62.49	98.87	99.13	99.56
입자도 (nm)	86.30± 850.3	77.72± 110.3	51.02± 120.0	41.2± 58.2	26.2± 18.6	22.8± 0.980	2.07± 0.450	1.92± 0.650	2.20± 0.420

표 14의 타우로우루소데옥시콜린산(TUDCA)으로 가용화한 PPC 주사제 조성물들에 대하여 제조 직후와 제조 30일 후(냉장보관) 제형안정성을 평가하였으며, 이러한 평가결과는 도 2j에 나타낸다. PPC 5.0%에 대하여 TUDCA가 4.0% 이상으로 첨가될 때 안정적으로 제제학적 배합이 일어난 것이 확인되었으며 조성물이 투명한 맑은 용액의 성상을 나타내었다(비교예 9-7 내지 9-9). 비교예 9-1 내지 9-6은 침전현상으로 제제가 안정하지 못한 성상을 나타내었다. 이로써 PPC 5.0% 기준으로 TUDCA 4.0% 이상에서 안정한 주사제 제형이 가능하다는 결론에 도달하였다. 비교예 9-1 내지 비교예 9-6에서는 포스파티딜콜린 입자도가 86.30±850nm 내지 22.8±0.980nm로 마이셀 구조가 아닌 불안정한 에멀전 또는 리포좀 구조로 조성되었으나, 비교예 9-7 내지 9-9에서는 10nm 이하 마이셀 구조로 조성되었다. 이에 TUDCA/PPC 몰비 1.29 미만의 조성은 실질적으로 안정적인 제제학적 배합이 일어나지 않은 것으로 판단되어 주사제에 사용하기에는 부적합할 것으로 사료되었다.

하기 표 15는, 상기 비교예 1 내지 비교예 9, 실시예 1 및 실시예 2에서 서술된 바와 같이, 여러 가지 담즙산(BA)을 이용한 PPC 주사제 조성물 제작에 요구되는 바람직한 BA/PPC 몰비 중 가장 바람직한 최소 몰비를 종합하여 나타낸다. PPC가 냉장과 상온 조건에서 10nm 이하의 미셀 구조로 분산된 맑은 용액의 안정된 주사제 조성물을 제조하기 위하여 사용 가능한 담즙염(BA)은 데옥시콜린산(DCA), 콜린산(CA), 글리코콜린산(GCA), 타우로콜린산(TCA), 케노데옥시콜린산(CDCA), 우루소데옥시콜린산(UDCA), 글리코데옥시콜린산(GDCA), 타우로데옥시콜린산(TDCA), 타우로우루소데옥시콜린산(TUDCA)이며, 상온 조건에서 히오데옥시콜린산(HDCA)로 확인되었다. 이들은 전술한 최소 몰비 이상에서 PPC를 가용하여 안정한 맑은 용액의 마이셀 구조로 분산된다. 상기 BA들로 PPC를 가용화기 위한 가장 바람직한 BA/PPC 최소 몰비 = 0.92±0.17이다. 즉, 가장 바람직한 BA/PPC 최소 몰비는 0.74 내지 1.29이며, 하기 표 15와 같다. PPC 5%를 가용하기 위해 BA는 최소 2.49±0.56%(w/v)가 배합되어야 한다.

성분명	DCA	CA	GCA	TCA	CDCA	UDCA	GDCA	TDCA	HDCA	TUDCA
PPC %(w/v)	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
BA %(w/v)	2.1	2.2	2.2	2.5	2.2	2.7	2.4	2.3	2.3	4.0
BA/PPC 몰비	0.87	0.88	0.76	0.78	0.89	1.12	0.87	0.74	0.95	1.29
성상 (제조 후)	투명	투명	투명	투명	투명	투명	투명	투명	투명	투명
성상 (제조 30일 후)	투명	투명	투명	투명	투명	투명	투명	투명	투명	투명
투명도 (660nm)	99.41	95.56	88.0	94.2	98.79	92.59	92.43	87.82	96.38	98.87
입자도 (nm)	8.57 ±0.7	3.22 ±0.9	9.84±1.8	9.88 ±1.4	3.47 ±1.0	2.24 ±0.4	3.91 ±0.4	1.46 ±0.4	3.30 ±1.0	2.07 ±0.5

< 비교예 10>

LCA로 가용화한 PPC 주사제

리토콜린산(LCA) 3.0%(w/v)로 가용화한 포스파티딜콜린(PPC 5.0%)을 기반으로 하는 조성물을 상기 실시예 1과 같은 방법으로 제작하고자 하였다.

그러나 도 3a에서 보는 바와 같이 리토콜린산(LCA)은 수산화나트륨 하에서 PPC 가용 시 겔화 현상으로 인하여, 혼탁 및 침전 성상을 보여 주사용 제제 제작이 불가능하였다.

< 비교예 11>

DHCA로 가용한 PPC 주사제

디하이드로콜린산(DHCA) 2.5%, 3.0%, 4.0%, 또는 5.0%로 가용화한 포스파티딜콜린(PPC 5.0%)을 기반으로 하는 조성물을 상기 실시예 1과 같은 방법으로 제작하고자 하였다. 그러나 도 3b에서 보는 바와 같이, 디하이드로콜린산(DHCA)은 수산화나트륨하에서 PPC 가용 후 pH조절 시 혼탁 및 침전현상이 일어나 주사용 조성물로 적합하지 않았다.

< 비교예 12 내지 비교예 30>

PPC 단독, BA 단독 및 PPC + BA 복합 조성물의 제조

단독 조성물로 데옥시콜린산(DCA) 단독(비교예 12), 콜린산(CA) 단독 (비교예 13), 글리코콜린산(GCA) 단독(비교예 14), 타우로콜린산(TCA) 단독(비교예 15), 케노데옥시콜린산(CDCA) 단독(비교예 16), 우루소데옥시콜린산(UDCA) 단독(비교예 17), 글리코데옥시콜린산(GDCA) 단독(비교예 18), 타우로데옥시콜린산(TDCA) 단독(비교예 19), 히오데옥시콜린산(HDCA) 단독(비교예 20), 타우로우루소데옥시콜린산(TUDCA) 단독(비교예 21) 조성의 주사제 조성물을 농도별로(1.0~7.5%(w/v) 등) 제조하였다. 구체적으로, 1mL 중 담즙산이 각각 10.0mg(1.0%), 25.5mg(2.5%), 50.0mg(5.0%) 또는 75.5mg(7.5%)씩 포함되고, 벤질알코올 9mg(0.9%)이 포함되는 조성으로 제조하였다. 제조공정은 먼저 세척, 멸균된 조제탱크에 주사용수를 투입하고(상온), 상기 주사용수에 수산화나트륨을 투입한 후, 상기 담즙산(염)과 벤질알코올을 투입, 교반 및 용해하였다. 전 공정은 차광, 밀폐, 상온, 질소압 조건에서 200RPM으로 2시간 교반하였다. 교반 종료 후에 pH 조절하고, 이를 0.2 μm필터로 여과 후 바이알에 충진 및 밀봉하였다.

또한, 다양한 농도별 PPC 단독 조성물[(PPC 1.25%, 2.50%, 5.0%, 7.5%, 10.0%, 12.5%, 15.0%),(비교예 22)]을 제조하였다. 구체적인 제조공정은 상기 비교예 1과 같다.

복합 조성물로 PPC 5.0%+DCA 2.2%(비교예 23), PPC 5.0%+HDCA2.5%(비교예 24), PPC 5.0%+UDCA 3.0%(비교예 25), PPC 5.0%+TDCA 2.5%(비교예 26), PPC 5.0%+GDCA 2.5%(비교예 27), PPC 5.0%+CDCA 2.5%(비교예 28), PPC 5.0%+CA 2.5%(비교예 29), PPC 5.0%+TUDCA 4.0%(비교예 30)을 제조하였다. 구체적인 제조공정은 비교예 2 내지 비교예 9 등과 같다.

< 실시예 3 및 실시예 4>

GCA 또는 TCA로 가용화한 PPC 복합 조성물의 제조

PPC+GCA[(PPC 2.5%+GCA 1.25%, PPC 5.0%+GCA 2.5%, PPC 7.5%+GCA 3.75%, PPC 10.0%+GCA 5.0%, PPC 15.0%+GCA 7.5%, PPC 5.0%+GCA 5.0%, PPC 5.0%+GCA 7.5%, PPC 5.0%+GCA 10.0%, PPC 5.0%+GCA 15.0%, PPC 5.0%+GCA 20.0%, PPC 5.0%+GCA 25.0%), (실시예 3)], PPC+TCA[(PPC 2.5%+TCA 1.25%, PPC 5.0%+TCA 2.5%, PPC 7.5%+TCA 3.75%, PPC 10.0%+TCA 5.0%, PPC 15.0%+TCA 7.5%, PC 5.0%+TCA 5.0%, PPC 5.0%+TCA 7.5%, PPC 5.0%+TCA 10.0%, PPC 5.0%+TCA 15.0%, PPC 5.0%+TCA 20.0%, PPC 5.0%+TCA 25.0%), (실시예 4)]을 제조하였다. 구체적인 제조공정은 실시예 1 및 실시예 2와 같다.

<실험예 1>

부작용(염증,부종 및 피부병변) 평가 비교

다양한 농도의 포스파티딜콜린(PPC) 단독 조성물(비교예 22), 답즙산(BA) 단독 조성물(비교예 12 내지 비교예 21), 담즙산 중 DCA, HDCA, UDCA, TDCA, GDCA, CDCA, CA로 가용화한 PPC 복합 조성물(비교예 23 내지 비교예 29) 및 GCA,TCA로 가용화한 PPC 복합 조성물(실시예 3 및 실시예 4) 등 다양한 조성물에 대한 부종과 피부병변 그리고 염증 실험들을 수행하였다.

염증(inflammation), 부종(edema) 및 주사 부위의 국소적 또는 광범위한 피부병변은 기존에 널리 알려져 사용되고 있는 DCA 단독 주사제 조성물(예를 들어, 키벨라) 또는 DCA로 가용화한 PPC 주사제 조성물(예를 들어, 리포스타빌, 리포빈주 등)에서 관찰되는 전형적인 국소적 이상반응 사례 중 하나이다. 이하의 결과는 in vivo에서, 담즙산(염) 단독 조성물, PPC 단독 조성물 및 담즙산으로 가용화한 PPC 복합 조성물의 피하주사에 대한 부종과 염증 그리고 피부병변 결과를 나타낸다. 하기 결과로부터 특히 특정 몰비로 GCA, TCA 및 TUDCA로 가용화한 PPC 주사제 조성물에서 염증과 부종이 실질적으로 없거나 80% 이상 경감되었음이 관찰되었는데, 이는 개별 물질들의 효과 평가로부터는 예측 가능하지 않은 발견에 기초한 것이었다. 하기 실험방법과 결과를 이하에 서술한다. 이하에서 조성물의 %는 %(w/v)를 의미한다.

<1-1> 랫드 족부 부종(paw edema)

부종의 정도를 평가하기 위해서 랫트들의 족부에 전술한 각각의 실험약물들을 주사하였다. 구체적으로 수컷 스프라그 돌리 랫트(6주령)을 구입하여 1주일 적응 이후에 사용하였다. 랫트들(체중:170~200g)을 무작위 선택하고 실험약물 투여 전 랫트 족부의 두께를 캘리퍼로 측정하였다. 부종 여부를 관찰하기 위해서, 랫트들의 족부에 PBS 및 다양한 실험약물을 0.1ml씩 투여하였다. 족부 부피의 측정은 주사 직전과 주사 직후, 1, 2시간 경과 시점에 캘리퍼에 의해서 수행하였다. 또한, 두께 측정 시 발바닥을 사진(4×4 cm 축척자 이용)촬영으로 주사 부위의 피부병변을 관찰하였다.

부종의 정도를 0 내지 4 등급으로 평가하였다. 투여 전 대비 직후, 1, 2시간 경과 시점에 부종이 전혀 없음[-, (투여전 대비 붓는 정도 0%)], 경증의 부종 [+, (투여전 대비 붓는 정도 1 내지 20% 이하)], 중등증의 부종[++, (투여전 대비 붓는 정도 20 내지 40% 이하)], 중증의 부종[+++,(투여전 대비 붓는 정도 40 내지 60% 이하)], 극심한 부종[++++, (투여전 대비 붓는 정도 60% 이상)]으로 평가하였다.

먼저, 농도별 PPC 단독 조성물(PPC 1.25%, 2.50%, 5.0%, 7.5%, 10.0%, 12.5%, 15.0%)들에 대하여 부종이 가장 심한 때인 투여 2시간 경과시점의 부종 평가결과, 하기 표 16에서 보는 바와 같이, “경증”은 PPC 1.25% 내지 10.0%, “중등증”은 12.5% 및 15.0%로 증가하였으며 상대적으로 DCA 1.0%의 2시간 경과 시점의 부종은 “중증”으로 증가되었다(도 4a). 종합하여 PPC 단독 조성은 고농도에서 농도 의존적으로 부종이 관찰되었으나 최고 농도인 PPC 15% 단독 조성물의 부종은 DCA 1.0% 보다 현저히 낮은 것으로 관찰되었다.

PPC % (w/v)	투여직후	투여 +1시간	투여 +2시간
1.25	+	+	+
2.50	+	+	+
5.00	+	+	+
7.50	++	+	+
10.0	++	+	+
12.5	++	++	++
15.0	+++	++	++

다음으로 다양한 농도별 답즙염 단독 조성물(BA 1.0%, 2.5%, 5.0%, 7.5%)들에 대하여 부종이 가장 심한 때인 투여 2시간 경과 시점의 부종 평가결과, 하기 표 17에서 보는 바와 같이,“경증”은 TUDCA 1.0% 및 2.5%, GCA 1.0% 및 TCA 1.0%, “중등증”은 UDCA 1.0%, GDCA 1.0%, CA 1.0%, GCA 2.5~5.0%, TCA 2.5~5.0%, TUDCA 5.0~7.5%로 증가하였으며, 나머지 다양한 농도의 담즙산들의 부종은 “중증” 및 “극심”으로 증가하였다(도 4b 내지 도 4k).

BA	% (w/v)	투여직후	투여 +1시간	투여 +2시간
DCA	1.0	++	+++	+++
	2.5	++	++++	++++
	5.0	++	++++	++++
	7.5	++	++++	++++
HDCA	1.0	++	++	+++
	2.5	++	++	+++
	5.0	++	++++	++++
	7.5	++	++++	++++
UDCA	1.0	++	++	++
	2.5	++	+++	++++
	5.0	++	++++	++++
	7.5	++	++++	++++
TDCA	1.0	++	+++	+++
	2.5	++	+++	+++
	5.0	++	++++	++++
	7.5	++	++++	++++
GDCA	1.0	++	+++	++
	2.5	++	+++	+++
	5.0	++	++++	++++
	7.5	++	++++	++++
CDCA	1.0	++	+++	+++
	2.5	++	+++	++++
	5.0	++	++++	++++
	7.5	++	++++	++++
CA	1.0	++	++	++
	2.5	++	++	+++
	5.0	++	+++	++++
	7.5	++	++++	++++
GCA	1.0	+	+	+
	2.5	++	++	++
	5.0	++	++	++
	7.5	++	++++	++++
TCA	1.0	++	+	+
	2.5	++	++	++
	5.0	++	++	++
	7.5	++	+++	++++
TUDCA	1.0	++	+	+
	2.5	++	+	+
	5.0	++	+	++
	7.5	++	++	++

구체적으로, 후술하는 in vitro 지방세포 생존력 실험결과에서 보는 바와 같이 DCA 1.0%와 지방세포 감소력이 동등한 것으로 나타난 PPC 5.0%에 대하여, 이의 가용화에 필요한 담즙산 농도로서 공통적으로 통상 2.5% 농도를 기준으로 비교를 하면, 상기 표 17에서 보는 바와 같이 투여 2시간 째에서 부종 정도가 “경증”은 TUDCA, “중등증”은 GCA 및 TCA, “중증”은 HDCA, TDCA, GDCA, CA 그리고 “극심”은 DCA, UDCA, CDCA로 확인되었다. 도 4l은 PPC 5.0% 단독 조성물, 담즙산 별로 실제 PPC 5.0% 가용에 필요한 각각의 농도의 단독제제(통상 약 2.5% 농도를 사용하지만, UDCA의 경우 3%, TUDCA 4% 정도가 적합), 또는 PBS 주사 후 2시간 경과 시점 부종을 비교한 결과로서, 상기 표 17과 유사하게 결과가 도출되었다.

이와 관련하여 여러 가지 담즙산으로 가용화한 PPC 복합 조성물의 염증 정도를 확인하고자, 각각의 담즙산으로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물에 대한 2시간 경과 시점의 부종 정도를 비교하였다. 그 결과 표 18에서 보는 바와 같이, “없음”은 GCA, TCA 및 TUDCA, “중등증”은 CA, “중증은 DCA, HDCA, UDCA, TDCA, GDCA, CDCA로 확인되었다(도 4m).

PPC % (w/v)	BA % (w/v)	투여직후	투여 +1시간	투여 +2시간
5.0	DCA 2.2	+++	+++	+++
5.0	HDCA 2.5	++	+++	+++
5.0	UDCA 3.0	++	+++	+++
5.0	TDCA 2.5	+++	+++	+++
5.0	GDCA 2.5	+++	+++	+++
5.0	CDCA 2.5	++	+++	+++
5.0	CA 2.5	+++	+++	++
5.0	GCA 2.5	+	-	-
5.0	TCA 2.5	+	+	-
5.0	TUDCA 4.0	+	+	-

놀라운 발견은 상대적으로 GCA(2.5%), TCA(2.5%) 및 TUDCA(5.0%) 단독 조성물의 부종은 중등증으로 확인되었으나(표 17), GCA(2.5%), TCA(2.5%) 및 TUDCA(4.0%)로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물의 부종은 없거나 경증으로 감소되는 예기치 못한 결과이다(도 4m).

농도 변화에 따른 부종을 관찰하기 위하여 GCA 또는 TCA로 가용화한 다양한 농도의 PPC 복합 조성물에 대한 시간별 부종 정도를 비교하였다. 그 결과 표 19 및 표 20에서 보는 바와 같이, 투여 2시간 경과 시점에서 “없음”은 PPC 2.5~5.0% 에 해당하는 복합조성물, “경증”은 PPC 7.5~10.0%에 해당하는 복합조성물, “중등증”은 PPC 15.0%에 해당하는 복합조성물로 확인되었다(도 4n 및 도 4o).

PPC % (w/v)	GCA % (w/v)	투여직후	투여 +1시간	투여 +2시간
2.50	1.25	+	-	-
5.00	2.50	+	-	-
7.50	3.75	+	+	+
10.0	5.00	+	+	+
15.0	7.50	++	++	++

PPC % (w/v)	TCA % (w/v)	투여직후	투여 +1시간	투여 +2시간
2.50	1.25	+	-	-
5.00	2.50	+	+	-
7.50	3.75	++	+	+
10.0	5.00	++	+	+
15.0	7.50	++	++	++

담즙산으로 가용화한 PPC 복합 조성물은, 가용이 가능한 최소몰비 이상으로 배합되는 담즙산의 농도가 증가함에 따라 안정적인 맑은 용액을 획득하기 위한 제조시간이 단축된다. 이러한 연유로, PPC 5.0% 가용이 가능한 GCA 또는 TCA 배합 농도를 증가시킨 조성물로 부종을 평가하였다. 실험물질은 PPC 5.0%에 GCA와 TCA를 각각 2.5%, 5.0%, 7.5%, 10.0%, 5.0%, 20.0% 및 25.0%가 배합된 복합 조성물이다. 그 결과 표 21과 표 22에서 보는 바와 같이, 부종이 없거나 경증인 GCA/PPC 바람직한 몰비는 2.60 mol/mol 이하이며, 상기 값으로부터 3.47 mol/mol 이하 몰비에서 부종은 경증 및 중등증, 그 이상 몰비에서 중증의 부종이 확인되었다. 또한 부종이 없거나 경증인 TCA/PPC 바람직한 몰비는 2.35 mol/mol 이하이며, 상기 값으로부터 3.13 mol/mol 이하 몰비에서 부종은 경증 및 중등증, 그 이상 몰비에서 중증의 부종이 확인되었다(도 4p 및 도 4q).

PPC % (w/v)	GCA % (w/v)	GCA/PPC몰비(mol/mol)	투여직후	투여 +1시간	투여 +2시간
5.00	2.50	0.87	+	-	-
	5.00	1.73	+	+	-
	7.50	2.60	+	+	+
	10.0	3.47	+	++	++
	15.0	5.20	++	+++	++
	20.0	6.94	++	+++	++
	25.0	8.67	++	++	++

PPC % (w/v)	TCA % (w/v)	TCA/PPC몰비(mol/mol)	투여직후	투여 +1시간	투여 +2시간
5.00	2.50	0.78	+	+	-
	5.00	1.57	+	+	+
	7.50	2.35	+	+	+
	10.0	3.13	+	++	++
	15.0	4.70	++	+++	+++
	20.0	6.26	++	+++	++
	25.0	7.83	++	+++	+++

in vivo 부종 실험을 종합하면, 표 16 내지 표 22 및 도 4(도 4a 내지 도 4q)에서 보는 바와 같이, 부종이 가장 심한 2시간 경과 시점에서 PPC 단독 조성물 1.25~10.0% 농도에서“경증”으로 확인되었다. PPC 단독의 낮은 제형 안정성에 기인한 산업적 이용의 한계를 해결하기 위해 선택된 담즙산(BA) 중, DCA 2.5%, UDCA 2.5%, CDCA 2.5%, HDCA 2.5%, TDCA 2.5%, GDCA 2.5% 및 CA 2.5%는 부종이 중증 및 극심으로 증가했으며 GCA 2.5%, TCA 2.5% 및 TUDCA 5.0%는 중등증으로 확인되었다. 하지만, GCA, TCA 또는 TUDCA로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물은 부종이 없음 및 경증으로 확인되었다. 농도와 배합량에 따른 부종 변화를 관찰한 결과, GCA 또는 TCA 1.25~5.0%로 가용화한 복합제제는 PPC 2.5~10.0% 농도에서 부종이 없거나 경증으로 확인되었으며, GCA/PPC는 3.47 mol/mol 몰비 이하에서, 바람직하게 2.60 mol/mol 몰비 이하에서, TCA/PPC는 3.13 mol/mol 몰비 이하에서, 바람직하게 2.35 mol/mol 몰비 이하에서 부종이 없거나 경증임을 확인하였다. TUDCA는 기 발표된 연구결과와 인비트로 지방세포 생존도 효력시험 결과(후술하는 실험예 2 참조), PPC의 지방세포 용해 기전인 사멸(apoptosis)을 오히려 억제하는 효력으로 인하여 적합한 가용화제가 아닌 것으로 밝혀졌다.

<1-2> 피부병변 측정(홍반)

실험약물 주사 후 피부에 관한 유해사례를 관찰하기 위해서 <1-1> 실험에서 랫트 족부 두께 측정 시 발바닥 사진(4cmX4cm 축적자를 이용)을 촬영하여 피부병변을 관찰하였다. 피부병변의 등급은 투여 전 대비 직후, 1, 2시간 경과 시점의 병변의 특성은 0 내지 4로 점수 매겼으며 그 기준은 육안 관찰로 홍반이 전혀 없음(-), 아주 가벼운 홍반[(육안으로 겨우 식별한 정도) 경증(+)], 분명한 홍반(중등증, ++), 약간 심한 홍반(중증, +++), 심한 홍반(극심, ++++)으로 정의하였다.

먼저, 모든 농도별 PPC(1.25~15.0%) 단독 조성물 투여군에서 표 23에서 보는 바와 같이, 홍반은 전혀 없었다(도 5a).

PPC % (w/v)	투여직후	투여 +1시간	투여 +2시간
1.25	-	-	-
2.50	-	-	-
5.00	-	-	-
7.50	-	-	-
10.0	-	-	-
12.5	-	-	-
15.0	-	-	-

다음으로 다양한 농도별 답즙염 단독 조성물(BA 1.0%, 2.5%, 5.0%, 7.5%)들에 대한 병변은 하기 표 24에서 보는 바와 같이, 투여 2시간 경과 시점에 DCA, HDCA, UDCA, GDCA, TDCA, CDCA는 2.5% 이상의 농도에서, CA는 5.0% 이상 농도에서 중증 및 극심으로 확인되었으며 상대적으로 GCA와 TCA는 5.0% 이하 농도에서 없음 및 경증 그리고 TUDCA는 없는 것으로 확인되었다(도 5b 및 도 5c).

BA	% (w/v)	투여직후	투여 +1시간	투여 +2시간
DCA	1.0	++	++	++
	2.5	++	++++	+++
	5.0	++	++++	++++
	7.5	++	++++	++++
HDCA	1.0	+	+	+
	2.5	+	+++	+++
	5.0	+	++++	++++
	7.5	++	++++	++++
UDCA	1.0	+	++	++
	2.5	++	++	+++
	5.0	++	++++	++++
	7.5	++	++++	++++
TDCA	1.0	+	+++	++
	2.5	++	+++	+++
	5.0	++	++++	++++
	7.5	++	++++	++++
GDCA	1.0	++	++	++
	2.5	++	++++	++++
	5.0	++	++++	++++
	7.5	++	++++	++++
CDCA	1.0	+	++	++
	2.5	++	++++	++++
	5.0	++	++++	++++
	7.5	++	++++	++++
CA	1.0	-	+	+
	2.5	-	++	++
	5.0	++	+++	+++
	7.5	++	++++	++++
GCA	1.0	-	-	-
	2.5	+	+	+
	5.0	+	+	+
	7.5	+	++	++
TCA	1.0	-	-	-
	2.5	+	+	+
	5.0	+	+	+
	7.5	+	++	++
TUDCA	1.0	-	-	-
	2.5	-	-	-
	5.0	-	-	-
	7.5	-	-	-

담즙산으로 가용화한 PPC 복합 조성물의 염증 정도를 확인하고자, 다양한 담즙산으로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물들에 대한 병변은 하기 표 25에서 보는 바와 같이, 투여 2시간 경과 시점에 DCA, HDCA, UDCA, CDCA로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물의 병변은 중증, TDCA, GDCA 및 CA로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물은 중등증으로 확인되었으나, GCA, TCA 및 TUDCA로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물의 병변은 없음으로 확인되었다(도 5d).

PPC % (w/v)	BA % (w/v)	투여직후	투여 +1시간	투여 +2시간
5.0	DCA 2.2	+	+++	+++
5.0	HDCA 2.5	+	+++	+++
5.0	UDCA 3.0	+	+++	+++
5.0	TDCA 2.5	+	++	++
5.0	GDCA 2.5	+	++	++
5.0	CDCA 2.5	+	+++	+++
5.0	CA 2.5	-	++	++
5.0	GCA 2.5	-	-	-
5.0	TCA 2.5	-	-	-
5.0	TUDCA 4.0	-	-	-

농도 변화에 따른 병변을 관찰하기 위하여 대표적으로 GCA로 가용화한 다양한 농도의 PPC 복합 조성물에 대한 병변 정도를 비교하였다. 그 결과 표 26에서 보는 바와 같이, 병변은 PPC 10.0%+GCA 5.0% 이하에서 없음으로 나타났고, PPC 15.0%+GCA 7.5%에 경증으로 확인되었다(도 5e).

PPC % (w/v)	GCA % (w/v)	투여직후	투여 +1시간	투여 +2시간
2.50	1.25	-	-	-
5.00	2.50	-	-	-
7.50	3.75	-	-	-
10.0	5.00	-	-	-
15.0	7.50	+	+	+

PPC 5.0% 가용이 가능한 GCA 배합 농도를 증가시킨 조성물에 대한 병변을 평가하였다. 표 27에서 보는 바와 같이, 병변이 없거나 경증인 GCA/PPC의 바람직한 몰비는 2.60 mol/mol 이하이며, 3.47 mol/mol 이상 몰비에서 병변은 중증 및 극심으로 확인되었다(도 5f).

PPC % (w/v)	GCA % (w/v)	GCA/PPC몰비(mol/mol)	투여직후	투여 +1시간	투여 +2시간
5.00	2.50	0.87	-	-	-
	5.00	1.73	-	-	-
	7.50	2.60	-	+	+
	10.0	3.47	+	+++	+++
	15.0	5.20	+++	++++	++++
	20.0	6.94	+++	++++	++++
	25.0	8.67	++++	++++	++++

in vivo 병변 관찰 결과를 종합하면, 표 23 내지 표 27 및 도 5에서 보는 바와 같이, PPC 단독 조성물 1.25~15.0% 농도에서“없음”으로 확인되었다. PPC 단독의 낮은 제형 안정성에 기인한 산업적 이용의 한계를 해결하기 위해 선택된 담즙산(BA) 중, DCA 2.5%, UDCA 2.5%, CDCA 2.5%, HDCA 2.5%, TDCA 2.5%, GDCA 2.5% 및 CA 5.0% 이상은 병변이 중증 및 극심으로 확인되었으며, GCA와 TCA는 5.0% 이하에서 병변이 없거나 경증, TUDCA는 병변이 없는 것으로 확인되었다. 이에 추가로 실시한 담즙산들로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물은, DCA, HDCA, UDCA, CDCA로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물의 병변은 중증, TDCA, GDCA 및 CA로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물은 중등증으로 확인되었으나, GCA, TCA 및 TUDCA로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물의 병변은 없음으로 확인되었다. 농도와 배합량에 따른 부종 변화를 관찰한 결과, GCA 1.25~5.0%로 가용화한 복합제제는 PPC 2.5~10.0% 농도에서 병변은 없으며, GCA 7.5%로 가용화한 PPC 15.0%는 병변이 경증으로 확인되었다. 또한 GCA/PPC 2.60 mol/mol 몰비 이하에서 병변이 없거나 경증임을 확인하였다.

<1- 3> H &E staining 조직학적 검사(염증)

실험약물 주사 후 염증의 정도를 평가하기 위해 <1-1>과 <1-2> 시험을 마친 후 3시간 경과 시점에 랫트를 희생시켰다. 주사된 영역의 조직을 절개하고, 10% 포르말린으로 고정한 후 검체를 제작하여 광학현미경을 이용하여 이미지를 캡쳐하였다. 염증의 정도는 다음과 같이 평가하였다.

염증 증상의 없음(-)은 땀샘, 혈관, 지방조직 등 기능조직의 형태가 온전하게 잘 유지되고 있으며 염증세포가 보이지 않음. 경증(+)은 기능조직 (땀샘, 혈관, 지방조직 등)의 형태가 온전하게 유지되고 있으며 드물게 염증 세포가 나타남. 중등증(++)은 기능조직 (땀샘, 혈관, 지방조직 등)의 형태 손상이 보이며 조직 내에서 염증 세포가 나타남. 중증(+++)은 기능조직의 형태가 손상되었으며 염증 세포가 많이 증가한 것을 확인할 수 있으며 혈관 주변으로 호중구, 단핵구 등의 염증 세포가 조직으로 이동하는 것이 나타남. 극심(++++)은 기능조직의 형태가 부종 및 염증에 의해 손상되었고 호중구, 단핵구 등의 염증 세포가 심하게 증가했을 뿐만 아니라 유두진피(papillary dermis) 부분으로 확산되어 조직의 파괴가 명확히 나타남으로 평가하였다.

먼저 모든 농도별 PPC(1.25~15.0%) 단독 조성물 투여군에 대한 염증 평가결과, 하기 표 28에서 보는 바와 같이, 염증 평가 “없음”은 PPC 2.50~7.50%, “경증”은 PPC 10.0%~12.5% 그리고 “중등증”은 PPC 15.0% 농도에서 확인되었다(도 6a).

PPC % (w/v)	GCA % (w/v)	GCA/PPC몰비(mol/mol)	염증 반응	PPC (w/v) %	BA (w/v)%	염증 반응
2.50	0.0		-	5.0	DCA 2.2	++++
5.00	0.0		-		HDCA 2.5	++++
7.50	0.0		-		UDCA 3.0	++++
10.0	0.0		+		TDCA 2.5	+++
12.5	0.0		+		GDCA 2.5	+++
15.0	0.0		++		CDCA 2.5	++++
2.50	1.25	0.87	-		CA 2.5	++
5.00	2.50		-		GCA 2.5	-
7.50	3.75		-		TCA 2.5	-
10.0	5.00		+		TUDCA 4.0	-
15.0	7.50		++
5.0	2.5	0.87	-
	5.0	1.73	-
	7.5	2.60	-
	10.0	3.47	+
	15.0	5.20	++++
	20.0	6.94	++++
	25.0	8.67	++++

다음으로 다양한 농도별 답즙염 단독 조성물들(BA 1.0%, 2.5%, 5.0%, 7.5%)에 대한 염증 평가결과, 하기 표 29에서 보는 바와 같이, DCA, HDCA, UDCA는 1.0% 농도 이상에서 중증 및 극심으로 확인되었으며, TDCA, GDCA, CDCA, CA는 2.5% 농도 이상에서 중증 및 극심으로 확인되었다. 상대적으로 GCA와 TCA는 2.5% 농도 이상에서 중등증 수준을 나타내었으며, 그리고 TUDCA는 고농도에만 경증으로 확인되었다(도 6b 및 도 6c).

BA %(w/v)	1.0	2.5	5.0	7.5
DCA	+++	++++	++++	++++
HDCA	+++	++++	++++	++++
UDCA	+++	++++	++++	++++
TDCA	++	++++	++++	++++
GDCA	++	+++	++++	++++
CDCA	++	+++	+++	++++
CA	++	+++	++++	++++
GCA	+	++	++	++
TCA	+	++	++	++
TUDCA	-	-	-	+

담즙산으로 가용화한 PPC 복합 조성물의 염증 정도를 확인하고자, 다양한 담즙산으로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물을 제조하고 염증을 평가하였다. 상기 표 28에서 보는 바와 같이, DCA, HDCA, UDCA, CDCA로 가용화한 PPC 복합 조성물은 “극심”, TDCA 및 GDCA로 가용화한 PPC 복합 조성물은 “중증”, CA로 가용화한 PPC 복합 조성물은 “중증등”을 나타내었다. 반면 특이하게 GCA,TCA, TUDCA로 가용화한 PPC 복합 조성물은 “없음”으로 확인되었다. 상기 표 29에서 보는 바와 같이, GCA 2.5%와 TCA 2.5% 단독조성물의 염증은 중등증으로 평가되었으나, GCA 2.5% 또는 TCA 2.5%로 가용화한 PPC 5.0% 복합 조성물의 염증은 “없음”으로 확인되는 놀라운 발견을 하였다(도 6d).

이와 관련하여 농도 변화에 따른 염증 정도를 관찰하기 위하여 대표적으로 GCA로 가용화한 다양한 PPC 복합 조성물에 대한 염증 정도를 비교하였다. 그 결과 상기 표 28에서 보는 바와 같이, PPC 7.5%+GCA 3.75% 이하는 “ 없음”, PPC 10.0%+GCA 5.0%는 경증 그리고 PPC 15.0%+GCA 7.50%는 중등증으로 확인되었다(도 6e).

가용화제 배합량 증가에 따른 염증 정도를 확인하고자, PPC 5.0% 가용이 가능한 GCA 배합 농도를 증가시킨 조성물들을 제조하고 염증을 평가하였다. 상기 표 28에서 보는 바와 같이, 염증이 없거나 경증인 GCA/PPC 바람직한 몰비는 3.47 mol/mol 이하이며, 3.47 mol/mol 이상의 몰비에서 염증은 극심으로 확인되었다(도 6f).

국소 지방감소를 위한 피하주사 시 야기되는 부종과 병변 그리고 염증에 대한 in vivo 실험결과를 종합하면 다음과 같다. DCA 1.0%와 지방세포 감소력이 동등한 PPC 5.0%를 안정한 조성물로 제조하기 위해 담즙산들은 통상 평균 2.5% 농도로 배합되어야 하는데, 담즙산 2.5% 농도에서 DCA, HDCA, UDCA, TDCA, GDCA, CDCA 및 CA는 염증에 의한 부종과 병변이 중증 및 극심 수준으로 확인되었고, 또한 이들 담즙산들로 제제화한 PPC 5.0% 복합 조성물은 현저하게 통증과 부종이 나타나, 본원 발명에서 목적하는 PPC 기반 국소 지방감소용 주사제 조성물에 배합되는 가용화제로 적합하지 않았다. 반면에 GCA+PPC 제제 및 TCA+PPC 제제는 통증, 부종 및 병변이 실질적으로 없는데, 이러한 발견은 PPC 단독과, GCA 또는 TCA가 단독으로 사용될 때와 비교하여도 예측이 불가한 놀라운 발견이었다.

종합적으로, 본원 발명의 GCA+PPC 복합제제 및 TCA+PPC 복합제제는 담즙산/PPC 몰비(즉,GCA/PPC 몰비 또는 TCA/PPC 몰비)는 0.7 내지 3.0인 수준으로 구성되는 것이 바람직한 것으로 확인되었다. 0.7 미만의 몰비(mol/mol)로 포함되는 경우에는, 안정한 미셀(micelle)의 형성이 어려워 제형안전성이 떨어지므로, 적어도 0.7 이상의 몰비로 구성되는 것이 바람직한 것으로 확인되었으며, 더욱 바람직하게는 0.76 이상일 때 가장 안정성 담보 및 공정 시간적 측면에서 이점을 지닌다. 3.04 초과의 몰비로 포함되는 경우에는 각각 염증 부종, 피부 병변 등의 부작용이 상당한 수준으로 나타나며, 지방세포 사멸(apotosis)과 분해(lipolysis) 작용에 대한 긍정적 효과를 부여하기 보다는 세포 괴사(necrosis)를 동반할 가능성이 높아진다. 3.0 이하의 몰비에서는 이러한 부작용 및 통증이 현저히 감소되었으며, 특히 상기 범위 내에서 2.60 이하의 몰비로 포함되는 경우에는 더욱더 실질적으로 상기 부작용 및 통증이 없는 수준으로 경감되었다. 또한 가장 바람직하게 상기 몰비로서 1.73 이하의 범위가 구성되는 경우에는 염증, 부종 및 병변 모두 완전히 없는 매우 우수한 지방감소 조성물이 제조됨을 확인하였다. 여기서 통증에 대한 확인 결과는, 이하의 실험예에서 더욱 후술된다.

또한 PPC의 절대 함량으로는, 바람직하게 12.5%(w/v)이하로 포함되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 전체 조성물 내에 10.0(w/v)%이하로 포함되는 것이 통증, 부종 및 부작용 측면에서 더욱 유리할 수 있음을 확인하였다.

< 실험예 2>

세포 감소 효과 비교

<2-1> 지방세포(3T3-L1) 감소 효과 비교

PPC 단독 조성물과 담즙산으로 가용화한 PPC 조성물에 대한 지방세포 감소 활성을 비교하기 위하여 실험을 수행하였다. 지방세포 감소 활성을 관찰하기 위해서 분화된 3T3L-1 지방세포주를 사용하였으며, 세포 생존도는 MTT 분석으로 관찰하였다. 이하의 결과는 각 실험물질에 대한 지방세포 생존도를 비교한 것으로, 특히 in vivo 연구결과로부터 선택되어진 가용화제 TUDCA, GCA, TCA와 PPC 배합 조성물은 하기 in vitro 결과에서 예상치 못한 배합비율로 지방세포 생존도 효력에 영향을 미치는 것을 확인하였고, 하기의 데이터는 이러한 예기치 않은 발견을 입증한다. 하기 실험에서 채용된 물질 및 방법을 이하에 서술한다. 이하에서 조성물의 %는 %(w/v)를 의미한다.

구체적인 실험방법은 다음과 같다. 분화된 3T3-L1 지방세포를 세포 충만도(confluence) 85~92%로 배양하였다. 상기 세포에 1ml 중 단독 조성물로, PPC 단독 조성물(PPC 0.3125%, 0.625%, 1.25%, 2.5%, 5.0%, 7.5%, 10.0%, 15.0%), DCA 단독 조성물(DCA 1.0%, 1.1%, 2.2%), GCA 단독 조성물(GCA 1.25%, 2.5%, 5.0%), 복합 조성물로 GCA로 가용화한 PPC 복합 조성물(PPC 0.3125%+GCA 0.1563%, PPC 0.625%+GCA 0.3125%, PPC 1.25% +GCA 0.625%, PPC 2.5%+GCA 1.25%, PPC 5.0%+GCA 2.5%, PPC 7.5%+GCA3.75%, PPC 10.0%+GCA 5.0%, PPC 15.0%+GCA 7.5%, PPC 5.0%+GCA, 3.75%, PPC 5.0%+GCA 5.0%, PPC 5.0%+GCA 6.25%, PPC 5.0%+GCA 7.5%, PPC 5.0%+GCA 8.75%), TCA로 가용화한 PPC 복합 조성물(PPC 0.3125%+TCA 0.1563%, PPC 0.625%+TCA 0.3125%, PPC 1.25% +TCA 0.625%, PPC 2.5%+TCA 1.25%, PPC 5.0%+TCA 2.5%, PPC 7.5%+TCA3.75%, PPC 10.0%+TCA 5.0%, PPC 15.0%+TCA 7.5%), TUDCA로 가용화한 PPC 복합 조성물(PPC 0.3125%+TUDCA 0.25%, PPC 0.625%+TUDCA 0.5%, PPC 1.25% +TUDCA 1.0%, PPC 2.5%+TUDCA 2.0%, PPC 5.0%+TUDCA 4.0%, PPC 7.5%+TUDCA 6.0%, PPC 10.0%+TUDCA 8.0%, PPC 15.0%+TUDCA 12.0%), DCA로 가용화한 PPC 복합 조성물(PPC 2.5%+DCA 1.1%, PPC 5.0%+DCA 2.2%, PPC 10.0%+DCA 4.4%), 기타 다른 담즙산으로 가용화한 PPC 복합 조성물(PPC 5.0%+HDCA 2.5%, PPC 5.0%+UDCA 3.0%, PPC 5.0%+TDCA 2.5%, PPC 5.0%+GDCA 2.5%, PPC 5.0%+CDCA 2.5%, PPC 5.0%+CA 2.5%)을 처리하여, 섭씨 37도에서 0~96시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 PBS로 2회 세척하고 MTT reagent(50 ul) 처리 후, 37℃에서 2시간 동안 방치하였다. 상층액을 제거한 후, DMSO를 처리하여 MTT formazan crystal들을 녹인 후, microplate reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측청하였다.

그 결과 도 7a 내지 도 7d에서 보는 바와 같이, PPC 단독 조성물과 PPC+GCA 복합 조성물은 시간과 농도 의존적으로 유사한 지방세포 감소 활성을 나타내었다. 그리고 PPC+TCA 조성물은 같은 농도에서 PPC 단독과 PPC+GCA 조성물보다 낮은 지방세포 감소 효과를 나타내었다. 그러나 PPC+TUDCA 조성물 처리는 지방세포 생존도를 감소시키지 않았다(도7a 내지 7d).

또한 도 7e에서 보는 바와 같이, PPC 5.0% 단독 조성물, PPC 5.0%+GCA 2.5% 및 PPC 15.0%+TCA 7.5%는 96시간 경과 시점에서 DCA 1.0% 단독 제제와 유사한 지방세포 감소 효력 활성을 나타내었다. 즉, 외모 개선용 세포용해제로 FDA 승인받은 Kybella(DCA 1.0%)와 지방세포 감소능력이 동등한 제제는 PPC 5.0% 단독제제와 PPC 5.0%+GCA 2.5%이상의 제제로, 이들 실험군에서 지방세포 감소 효력 차이는 통계적 유의성이 없었다(도 7e).

PPC 단독 제제는 시간과 농도 의존적으로 지방세포 감소가 되며 PPC+GCA는 같은 농도(PPC농도가 같은 실험군을 의미)에서 유사한 효력이 있었다. 이와 비교하여 PPC+TCA는 같은 농도에서 보다 낮은 세포 감소 효과를 나타내었으며, 이는 TCA가 오히려 PPC의 지방세포 감소 효력을 억제하는 것을 시사하는 것이다. 이러한 연유로, 기존 시판제품과 유사한 정도의 지방세포 감소 효과를 거두기 위해서는 ‘PPC+TCA’제제의 경우 매우 고용량으로 처리되어야함을 의미한다. 즉 도 7e에서 보는 바와 같이, Kybella(DCA 1.0%)와 같은 기존 제제와 유사한 지방감소 효과를 얻기 위해서는 PPC+TCA 제제는 PPC 15.0%+TCA 7.5% 수준으로 투입되는 것이 필요한데, TCA 7.5%로 가용화한 PPC 15.0% 조성물은 20cP 이상의 높은 점도로 인하여 30G 주사바늘로 다회 투여가 곤란하다는 문제점이 있다. 종합하여, 부작용면에서‘PPC+TCA’제제가 일부 이점이 있을 것으로 사료되지만, 실질적으로 산업적인 경제성 측면에서나 고용량이 투여에 따른 다른 부수적 우려들을 고려했을 때, ‘PPC+TCA’제제보다 ‘PPC+GCA’제제가 더욱 우수한 것임을 시사한다.

또한 TUDCA로 가용화한 PPC는 고농도에서도 지방세포 감소 효력이 없는 것으로 관찰되었으며, 이는 매우 고용량(PPC 15%+TUDCA 12%) 처리군에서도 마찬가지였다. 이로써 TUDCA는 오히려 지방세포 사멸과 분해를 억제하는 것으로 관찰되었다. 이와 관련하여 TUDCA의 세포사멸 억제에 대한 연구결과는 기존에 발표되어 있는 바(Andrew L.Rivard, Administration of Tauroursodeoxycholic acid reduces apoptosis following myocardial infarction in rat, The American Journal of Chinese Medicine, Vol. 35, No. 2, 279-295, 2007), 이와 같은 결과는 PPC는 가용화제 선택에 따라 지방세포 감소 효력이 다르며 세포의 괴사와 사멸에 서로 다르게 작용함을 시사한다.

상기 연구결과로부터 바람직하게 선택된 GCA로 가용화한 PPC 복합 조성물(PPC+GCA)과 기존 시판제품인 DCA로 가용화한 PPC 복합 조성물(PPC+DCA)에 대하여, PPC 단독 조성 자체의 지방세포 감소력 외 가용화제로 선택된 GCA와 DCA의 지방세포 감소 활성에 미치는 영향을 관찰하였다. 실험결과를 도 7f 내지 도 7h에 도시하였다. 96시간 경과 시점에서, PPC 단독 제제와 PPC+GCA는 같은 농도(PPC농도가 같은 실험군을 의미)에서 지방세포 감소 효력은 동등한 수준이었으나, GCA 단독은 PPC+GCA 보다 더 낮은 세포 감소 효과를 나타내었다.

PPC+DCA는 PPC 단독과 비교하여 같은 농도에서 지방세포 감소 효력이 더 높았고, DCA 단독보다도 높은 지방세포 감소 효과를 나타내었지만(도 7f 내지 도 7h), 후술하는 실험예 <2-3>에서 보는 바와 같이 이러한 효과는 세포 괴사에 의해 기인하는 것을 확인하였다(도 10a 및 도 10b 참조). 또한 상기 실험예들에서(즉, in vivo 피하주사 후 부종과 병변 그리고 염증 실험에서), DCA와 유사한 독성이 있는 것으로 확인된 다른 담즙산인 HDCA, UDCA, CDCA, TDCA, GDCA 및 CA도 마찬가지로, PPC 고유의 작용 기전인 지방세포 사멸과 분해가 아니라, 세포 괴사를 유도하는 방식으로 지방세포 감소효과가 다소 높게 나타난다(도 8d). 따라서 이들 담즙산 종류들은 지방감소 효과가 다소 높은 것처럼 보일지라도, 통증과 부종 그리고 부작용을 야기하기 때문에 적합한 가용화제가 아니다.

PPC를 안정하게 주가가 가능한 맑은 혼합 미셀(mixed micelles)로 제조하기 위한 GCA 최소 투입 몰비는 GCA/PPC=0.76 mol/mol로 12시간 이상 교반이 요구되며 생산을 위한 작업시간은 2일이 소요된다. 이러한 연유로, GCA 투입량을 증가하면 제조시간을 단축할 수 있다. 하지만 첨가제 과량투입은 안전성과 더불어 PPC 고유의 지방세포 사멸과 분해 약리활성에 부정적 변형을 야기할 수 있기에 PPC 농도(5.0%)를 고정하고 GCA 농도(2.5%~8.75%)를 증가시켜 지방세포 감소에 미치는 영향을 관찰하였다.

그 결과 도 7i에서 보는 바와 같이, PPC 5.0% 단독 조성물과 PPC+GCA 복합 조성물의 지방세포 감소능을 비교하였을때 GCA/PPC 몰비가 2.60 mol/mol(PPC 5.0%+GCA 7.50%) 이하의 범위에서는 각 실험군간에 지방세포 생존도의 차이가 통계적 유의성이 없었으며, GCA/PPC 몰비가 3.04 mol/mol(PPC 5.0%+GCA 8.75%)일 때 부터는 실험군 간에 지방세포 생존도 차이에 통계적 유의성이 있는 것으로 확인되었다. 즉, GCA/PPC 몰비가 3.04 mol/mol(PPC 5.0%+GCA 8.75%) 이상일 때부터는 본래 PPC의 고유의 긍정적 성능에 부작용을 부가할 가능성이 높아진다.

<2-2> 담즙산으로 가용화한 PPC 복합 조성물에 대한 지방세포, 섬유아세포, 골격근세포 , 혈관내피세포 생존도 비교_ 본원 발명의 지방세포 선택 특이성 확인

기존 보고에 따르면 DCA 또는 DCA로 가용화한 PPC 조성물은 지방세포뿐만 아니라 섬유아세포, 골격근세포, 혈관내피세포까지 용해시켜 임상적 심각한 부작용이 보고된 바, 이러한 측면에서 본원 발명 PPC+GCA 복합 조성물의 영향을 비교 평가하였다.

구체적인 실험방법은 실험물질, 단독 조성물로 PPC 5.0% 단독 조성물과 담즙산으로 가용화한 PPC 복합 조성물(PPC 5.0%+GCA 2.5%, PPC 5.0%+TCA 2.5%, PPC 5.0%+TUDCA 4.0%, PPC 5.0%+DCA 2.2%, PPC 5.0%+HDCA 2.5%, PPC 5.0%+UDCA 3.0%, PPC 5.0%+TDCA 2.5%, PPC 5.0%+GDCA 2.5%, PPC 5.0%+CDCA 2.5%, PPC 5.0%+CA 2.5%)을 각각의 3T3L1 adipocytes, Normal fibroblasts, Skeletal muscle cells, Endothelial cells 처리 72시간 후 생존도를 MTT 분석법에 측정하여, 그 결과를 미처리된 대조군 대비 생존 세포의 총 백분율로 계산하였다.

3T3-L1 지방세포주 (ATCC)는 10% fetal bovine serum, 100 units/mL penicillin, 그리고 100μg/mL streptomycin이 포함된 Dulbecco`s modified eagle medium (DMEM) (Invitrogen) 배지에 5% CO₂, 37℃ 조건으로 배양되었다. 지방세포 분화는 2일 또는 4일간 세포 충만도가 100%가 될 때까지 키우고, 1μg/mL 인슐린(insulin), 500 μM 메틸-이소부틸-잔틴(methyl-isobutyl-xanthine), 및 250 nM 덱사메타손(dexamethasone)이 들어있는 DMEM배지로 분화를 3일간 유도하였다(지방세포 분화 전 및 분화 후의 세포는 도 9a 및 도 9b 참조). 그 후 1μg/mL insulin (Sigma)이 들어있는 DMEM배지로 바꾼 후 분화도가 최대치일 때까지 2~3일에 한 번씩 배양배지를 갈아주며 유지하였다. 만약 7일 이상 소요 시, 일반 DMEM배양 배지로 본 실험에 들어갈 때까지 유지하였다. 실험물질을 처리하고 72시간 인큐베이션 후에, PBS에 1mg/mL로 MTT 용액을 희석한 후, 각 배양배지를 제거한 well에 50 μL의 MTT (Sigma)용액을 처리하고 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 3시간 후, MTT 용액을 제거하였다. 200 μL DMSO (Sigma)를 처리하여 녹여낸 후 MTT assay(570 nm에서 측정)을 시행했다.

섬유아세포 (CCD-986sk; human fibroblast, Passage No. 2 기준)는 세포충만도 85%까지 배양 후 배양배지 (IMDM, 10%FBS, 1% antibiotics mix)를 제거하였다. 그리고 실험물질을 새로운 배양배지에 혼합 및 처리 후, 정해진 처리시간에 맞추어 배양배지를 제거하고 MTT assay (570 nm에서 측정)를 시행했다.

근육세포 (C2C12; mouse myocyte, Passage No. 2 기준)는 세포 충만도 80%까지 배양 후 배양배지 (DMEM, 10% FBS, 1% antibiotics mix)를 제거하였다. 그리고 2%의 말 혈청(horse serum)이 포함된 DMEM으로 4일간 배양하였다. 그리고 80% 이상의 세포의 길쭉한 모양을 확인하고, 실험물질을 새로운 배양배지에 혼합 및 처리 후, 정해진 처리시간에 맞추어 배양배지를 제거하고 MTT assay (570 nm에서 측정)를 시행했다.

혈관내피세포 (HUVEC; human endothelium, Passage No. 3 기준)는 1% gelatin을 배양접시에 도포한 후 상온에서 1일 방치한다. 그리고 도포된 배양접시에 세포충만도 80%까지 배양 후 배양배지 (EGM-Plus, 10% FBS, 1% antibiotics mix)를 제거한다. 그리고 실험물질을 새로운 배양배지에 혼합 및 처리 후, 정해진 처리시간에 맞추어 배양배지를 제거하고 MTT assay (570 nm에서 측정)를 시행했다(주의: 세포가 Passage No. 6 이상 되면 폐기하였다.).

여러 가지 세포에 대한 생존도를 관찰한 결과 도 8a 내지 도 8d에서 보는 바와 같이, GCA 또는 TCA로 가용화한 PPC 복합 조성물은 DCA, UDCA, HDCA, CDCA, TDCA, GDCA 및 CA로 가용화한 PPC 복합 조성물과 다르게 지방세포만 선택적으로 감소시키는 놀라운 발견을 하였다. 이는 본원 발명의 조성물인 PPC+GCA가 실제 사람에게 적용되었을 때, 지방세포 주변의 인체 조직에 해로운 영향 없이 지방세포만을 특이적으로 감소시킬 수 있음을 시사하는 것이다.

<2-3> Caspase 3 activity assay

상기 MTT assay에서 나타난 세포의 죽음이 세포괴사(necrosis)에 의한 것인지 사멸(apoptosis)에 의한 것인지 확인하기 위하여, 실험물질에 대한 Caspase 3 activity assay를 수행하였다. Caspase 3은 세포사멸(Apoptosis)이 발생되었을 때 특이적으로 증가하여, 세포사멸의 표지자이다. Abcam의 Caspase 3 Assay Kit (Colorimetric) Kit를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실험하였으며, 간략하게 실험방법은 다음과 같다: 각 well에 3T3-L1 지방세포를 1X10⁵개씩 분주하고, 주사용수 1ml 중 각각 PPC 5.0%, PPC 5.0%+DCA 2.2%, PPC 5.0%+GCA 2.5%, PPC 5.0%+GCA 5.0%, DCA 1.0%, GCA 1.0%, GCA 5.0%을 함유하는 제제 및 PBS 대조군을 처리하여, 섭씨 37℃에서 0~48시간 동안 배양하였다. 그 후 50ul의 cell lysis buffer (10mm Tris-HCl, 10 mm NaH₂PO₄/NaHPO₄, pH 7.5, 130 mm NaCl, 1% Triton X-100, 및 10mm sodium pyrophosphate)를 처리하여 4℃에서 10분간 방치하였다. 1분간 1000 X rpm으로 원심분리하여 상층액을 모은 후, BCA방법으로 단백질 정량을 실시하였다. 각 샘플에 50ul의 reaction buffer(4 mM HEPES, pH 7.5, 10% glycerol, 2 mm dithiothreitol) 및 0.5 ul의 4 mM DEVD-p-NA를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 Spectrofluorometry으로 405nm 파장에서 측정하였다.

실험결과 도 10a와 10b에서 보는 바와 같이, PBS의 경우 지방세포에서 caspase-3 활성을 유발하지 못하였다. PPC 단독, PPC+GCA 복합 조성물은 시간 의존적으로 caspase-3 활성을 상당한 수준으로 유발하는 효과를 나타내었다. 그러나 PPC+DCA 복합 조성물은 PPC 또는 PPC+GCA와 비교하여 caspase-3 활성을 억제하는 효과를 나타내었다. 흥미로운 발견은 DCA 1.0%는 24시간까지는 caspase-3 활성이 일부 나타났으나 48시간 이후로는 caspase-3 활성이 처치 전 수준으로 돌아오는 양상을 보였다. 이러한 현상은 DCA 단독 조성물 처치 직후 24시간까지는 세포 사멸에 대한 작용이 일부 나타나나 이후에 나타나는 염증반응에 의해 세포가 괴사 되는 반응으로 전환되기 때문으로 판단된다. GCA는 caspase-3 활성이 관찰되었으나 시간과 농도 의존적인 변화는 없었다. 반면 GCA+PPC 혼합제제는 시간 및 농도 의존적으로 caspase-3 활성이 높은 수준으로 나타나는 것을 확인하였다. PPC를 DCA와 혼합 할 경우에는 오히려 PPC 단독 조성이 나타내는 caspase-3의 활성 정도가 현저히 저감되었다. 이러한 결과는, PPC 단독 제제가 나타내는 apoptosis 특이적 효과가 DCA에 의하여 저해되는 것으로서, DCA가 첨가되는 경우의 PPC 제제는 염증 등이 관여하는 지방세포 괴사를 더 많이 진행시킴을 의미한다.

<2-4> Lipolysis assay

상기 MTT assay에서 나타난 세포의 죽음이 세포괴사(necrosis)에 의한 것인지 분해(lipolysis)에 의한 것인지 확인하기 위하여, 시험물질에 대한 Glycerol activity assay를 수행하였다. Glycerol은 지방이 분해될 때 특이적으로 증가하는 표지자이다. Abcam의 Lipolysis Assay Kit (Colorimetric)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실험하였으며, 간략하게 실험방법은 다음과 같다: 각 well에 3T3-L1 지방세포를 1X10⁵개씩 분주하고, 주사용수 1ml 중 각각 PPC 5.0%, PPC 5.0%+DCA 2.2%, PPC 5.0%+GCA 2.5%, PPC 5.0%+GCA 5.0%, DCA 1.0%, GCA 1.0%, GCA 5.0%을 함유하는 제제 및 PBS 대조군을 처리하여, 섭씨 37도에서 0~48시간동안 배양하고 Lipolysis를 유도하였다. 상기 배양액 30ul에 Lipolysis Assay Buffer(137 mM NaCl, 5 mM KCl, 4.2 mM NaHCO3, 1.3mM CaCl2, 0.5 mM KH2PO4, 0.5mM MgCl2, 0.5 mM MgSO4, 5mM Glucose, 20mM Hepes (pH 7.4), 1％ BSA, 1μM Isoproterenol)를 첨가하여 총 50 ul로 맞추어 20분 동안 인큐베이션하였다. 여기에 Glycerol Assay complex (50ul)를 혼합한 후, 상온에서 30분간 방치 후 OD570에서 흡광도를 측정하였다(절대 정량 시 standard curve 활용).

실험결과 도 10c와 도 10d에서 보는 바와 같이, PBS의 경우 지방세포에서 glycerol의 분비를 유도하지 못하였다. 24시간 경과시점, DCA 1.0%와 PPC 5.0%+GCA 5.0%를 제외한 실험물질들은 유사하게 glycerol 분비를 유도하였다. 48시간 경과시점, PPC 단독, PPC+DCA, DCA 단독 및 GCA 단독군들은 24시간에 비해서 약간 더 높은 세포 분해 효과를 나타내었다. 특히 PPC+GCA군은 PPC 단독 조성물보다 훨씬 더 높은 세포 사멸 효과가 확인되었다.

< 실험예 3>

고지방식이로 유도된 마우스 비만 모델에 대한, 주사제 효능 및 부작용 평가

수컷 C57BL/6 마우스(4주령)을 구입하였다. 12주 동안 고지방식이(Research diet, 60 %kcal lipid)를 공급하여 고도 비만 상태로 만들었다. 고지방식이로 유도된 비만 마우스 서혜부 지방 패드(피하지방 조직)에 실험약물 1ml 중 단독 조성물로 PPC 단독 조성물(2.5%, 5.0%, 10.0%, 15.0%), PBS(음성대조군) 및 Isuprel(양성대조군), DCA 1.0%, GCA 2.5% 그리고 복합 조성물로 PPC 5.0%+DCA 2.2%, PPC 5.0%+HDCA 2.5%, PPC 5.0%+UDCA 3.0%, PPC 5.0%+TDCA 2.5, PPC 5.0%+GDCA 2.5%, PPC 5.0%+CDCA 2.5%, PPC 5.0%+CA 2.5%, PPC 5.0%+TUDCA 4.0%, PPC 5.0%+TCA 2.2%, PPC (2.5~10.0%)+GCA(1.25~5.0%) 각각을 시험물질을 지방조직에 직접 주사하고 in vivo 지방감소 정도를 관찰하였다. 각 실험물질을 1회 투여 투여하였다. 각 실험물질은 0.2mL씩 마우스의 서혜부 지방패드 내로 피하주사하는 방식으로 수행되었다. 최종적으로, 주사 후 8일 경과 시점에서 마우스를 희생시켰다. 희생된 마우스의 서혜부 지방 패드를 절개하여 신속하게 피하지방을 적출하여 4% 포름알데히드(formaldehyde) 용액에 담가 고정하였다. 고정한 다음 수세와 탈수과정을 거친 후 파라핀(paraffin) 용액으로 처리하여 파라핀 블락(paraffin block)을 만들고 4μm두께로 박절하여 헤마토시린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색한 뒤 광학현미경으로 관찰하였다.

우선 PPC 단독 조성물이 주사된 조직은 2.5% 내지 10.0% 농도에서 농도 의존적으로 지방세포 사멸과 분해로 야기된 지방조직 내 세포들은 크기가 작아지고 일부 축소된 지방세포들이 서로 붙어 있으며 세포가 죽은 부분이 명확하며 붕괴된 지방세포의 융합으로 이루는 지방세포가 커져 보인다. 15.0% 농도는 축소된 지방세포 뿐만 아니라 지방세포 주위로 대식세포의 발생이 확인된다(도 11a).

다음으로 담즙산으로 가용화한 PPC 복합 조성물은 DCA, CDCA, HDCA, UDCA, GDCA, TDCA 및 CA로 가용화한 PPC 복합 조성물이 주사된 지방조직은 지방세포 사멸이 명확히 나타나 작은 지방세포가 보여지며 지방세포 주위로 대식세포 등의 청소 작용이 확연하다. 음성대조군 Isuprel이 주사된 지방조직은 지방세포의 크기가 작아지고 세포 사멸에 의한 형태가 보이며 사멸 세포 청소를 위한 지방세포 이외의 세포 침입이 관찰된다. DCA 단독 조성물 또는 DCA로 가용화한 PPC 조성물이 주사된 지방 조직은, 상기 조성물의 투여 영역에 심한 염증이 유발되었으며 세포가 괴사(necrosis)에 의해 용해된 모습을 보이면서 현저한 파괴가 유도되었다. DCA 단독 조성물은 DCA가 1%로 낮은 농도로서 포함됨에도 불구하고 심한 염증 정도를 보여, PPC 단독 조성물 PPC+GCA 복합 조성물에 비해 염증 유발 작용이 컸다. 상대적으로 PBS(음성대조군)과 5.0%+TUDCA 4.0%이 주사된 지방조직은 지방세포의 세포막의 경계가 분명하고 세포의 모양이 잘 갖추고 있으며 조직 내에서 지방세포로만 구성되어 있다. PPC 5.0%+TCA 2.5%는 전체적으로 지방세포의 크기가 감소했으며 적은 영역에서 사멸 세포 청소를 위한 지방세포 이외의 세포 침입이 관찰되었다. 본 발명의 PPC 5.0%+GCA 2.5%는 염증이 나타나지 않으며, 지방조직은 지방세포의 크기가 작아지고 세포가 죽은(사멸된) 부분이 명확하며 붕괴된 지방세포의 융합으로 이루는 지방세포가 커져 보인다(도 11b 및 도 11c).

실험결과 도 11d에서 보는 바와 같이, 본 발명의 PPC+GCA 복합 조성물을 랫x트 지방패드에 주사 후 지방조직(adipocytes) 뿐만 아니라 진피(dermi)와 표피(epidermis)에 미치는 영향을 관찰한 결과, PBS 주사 후 진피와 표피의 조직은 잘 보전되어 있으며 호중구 등 염증 세포가 없다. 그리고 지방조직은 지방세포의 세포막 경계가 분명하고 세포의 모양을 잘 갖추고 있으며 조직 내에서 지방세포만으로 구성되어 있다. PPC 5.0% 단독 조성물 주사 후 진피와 표피의 조직은 잘 보전되어 있으며 호중구 등의 염증 세포가 없다. 그리고 지방조직은 지방세포의 크기가 작아지고 세포막 중 일부가 붕괴 되는 과정이 보이며 붕괴된 지방세포의 융합으로 일부는 지방세포가 커져 보인다. PPC 2.5%+GCA 1.25% 복합 조성물 주사 후 표피와 진피의 조직이 잘 보전되어 있으며 호중구 등 염증 세포가 없다. 그리고 지방조직은 지방세포의 크기가 작아지고 세포막 중 일부가 붕괴 되어 가는 과정이 보이며 붕괴된 지방세포의 융합으로 일부는 지방세포가 커져 보인다. PPC 5.0%+GCA 2.5% 복합 조성물 주사 후 진피와 표피의 조직이 잘 보전되어 있으며 호중구 등 염증세포가 없다. 그리고 지방조직은 지방세포의 크기가 작아지고 세포가 죽은 부분이 명확하며 붕괴된 지방세포의 융합으로 이루는 지방세포가 커져 보인다. PPC 10.0%+GCA 5.0% 복합 조성물 주사 후 진피와 표피의 조직 손상이 약하게 보이며 염증세포가 일부 보이고 약간 부종도 관찰된다. 그리고 지방조직은 지방세포의 크기가 작아지고 세포가 죽은 부분에 대식세포의 탐식작용이 보이며 세포사멸에 따른 핵산재물이 뚜렷하고 붕괴된 지방세포의 융합으로 일부는 지방세포가 커져 보인다. GCA 2.5% 단독 주사 후 진피와 표피의 조직 손상이 관찰되며 호중구 등의 염증 세포가 산재하여 염증이 확연하다. 그리고 지방조직의 지방세포의 세포막의 경계가 분명하고 세포의 모양이 잘 갖추고 있으며 조직 내에서 지방세포 만으로 구성되어 있다. 상기 결과로부터 GCA 및 PPC 복합제제 보다, GCA를 단독 처리했을 때 지방세포, 진피, 표피에 염증 작용이 현저하게 나타나는 특이적 양상을 확인하였다.

종합하면 DCA 단독 또는 DCA, HDCA, UDCA, CDCA, TDCA, GDCA 및 CA로 가용화한 PPC 복합 조성물이 주사된 지방조직은 투여 영역에 심한 염증을 유발되었으며 세포가 괴사(necrosis)에 의해 용해된 모습을 보이면서 현저한 파괴가 유도되었다. 하지만 본 발명의 PPC+GCA 복합 조성물은 지방세포의 크기가 작아지고 세포가 죽은(사멸된) 부분이 명확하며 붕괴된 지방세포의 융합으로 일부는 지방세포로 변화되었으며 농도 의존적으로 염증 유발 정도가 미약하게 나타났으나, 지방세포 막에 손상을 주는 형태학적 특징이 나타났다.

< 실험예 4>

GCA로 가용화한 PPC 주사제의 독성 평가

대표적으로, GCA 2.8%로 가용화한 PPC 5.0% 주사제를 비글견(Dog, beagle)에 단회 피하투여시 나타나는 독성반응을 평가하였다. 구체적으로, 입수 시 모든 동물은 문신번호를 확인하고, 일반상태, 체중 및 체온을 측정하였다. 입수 후 12일간의 검역, 순화기간 중 매일 1회 일반증상을 관찰하고, 주 1회 체중을 측정하였으며, 검역, 순화기간 종료 시에 동물의 건강상태를 확인하였다. 검역, 순화기간 종료 후, 체중을 기초로 하여 대조군은 암수 각 1마리, 시험물질 투여군은 군당 암수 각 2마리씩 분리하였다. 암수 각 7마리 총 14마리 비글견(수컷: 5~6개월령, 7.05~8.16kg/ 암컷：5~6개월령, 5.83~7.14kg)으로 개체별 투여 액량은 투여 당일의 체중을 기준으로 산출하였으며 경배부를 투여 전에 제모하였다. 투여방법은 1회용 주사기(10 mL, 23G)를 이용하여 좌우 경배부 피하에 분할하여 단회 투여하였다. 군구성은 저용량(투여용량: PPC 90mg/kg+GCA 50.4mg/kg, 투여액량: 1.8ml/kg, 투여부위당 최대투여액량: 0.8ml/site), 중용량(투여용량: PPC 180mg/kg+GCA 100.8mg/kg, 투여액량: 3.6ml/kg, 투여부위당 최대투여액량: 1.6ml/site), 고용량(투여용량: PPC 360mg/kg+GCA 201.6mg/kg, 투여액량: 7.2ml/kg, 투여부위당 최대투여액량: 3.2ml/site)과 대조군(생리식염수, 투여액량: 7.2ml/kg, 투여부위당 최대투여액량: 3.2ml/site)으로 설정하였다. 자세한 시험결과를 하기에 서술한다.

1) 사망유무; 실험기간 중, 암수 모든 시험군과 대조군에서 사망 동물은 관찰되지 않았다.

2) 일반증상; 실험기간 중, 암수 모든 시험군과 대조군에서 어떠한 증상도 관찰되지 않았다.

3) 체중변화; 실험기간 중, 암수 모든 시험군과 대조군에서 이상변화는 관찰되지 않았다.

4) 부검; 암수 모든 시험군과 대조군에서 이상변화는 관찰되지 않았다.

5) 조직병리학적 검사; 암수 고용량 투여군의 피하조직에서 미미한 정도에서 경도의 육아종성염증 (granulomatous inflammation) 소견이 관찰되었다(도 12a 내지 도 12c 참조).이처럼 본원 발명의 주사제는 오직 고용량으로 처리한 개체에서만 일부 매우 약한 염증소견을 보였으나, 인간을 비롯한 동물에 투여시의 적정 투여 농도의 설정 측면에서 볼 때 이러한 정도는 실질적으로 부작용이 없는 것이라 할 수 있다.

< 실험예 5>

in vivo 통증 비교

이하의 결과는 단독 조성물로 DCA, GCA 및 PPC 그리고 담즙산으로 가용화한 PPC 복합 조성물에 대한 통증 유발 정도를 in vivo 실험동물의 이동거리(distance moved)와 이동속도(velocity)를 측정하여 평가한 것이다. 이하에서 조성물의 %는 %(w/v)를 의미한다.

구체적으로 실험물질은 단독 조성물로 DCA 1.0%, PPC 5.0% 및 GCA 2.5% 그리고 복합 조성물로 PPC 5.0%+DCA 2.2%, PPC 5.0%HDCA 2.5%, PPC 5.0%+UDCA 3.0%, PPC 5.0%+TDCA 2.5%, PPC 5.0%+GDCA 2.5%, PPC 5.0%+CDCA 2.5%, PPC 5.0%+CA 2.5%, PPC 5.0%+GCA 2.5%, PPC 5.0%+TCA 2.5%, PPC 5.0%+TUDCA 4.0%를 마우스 족부에 100μl을 주사 후 부종을 관찰하였다. 부종이 최고로 발현되는 시점은 투여 2시간 경과 시점을 확인하고 투약 전후 이동능은 Noldus Video Traking 시스템으로 5분간 이동 거리(cm)와 이동속도(cm/s)를 비교하였다.

도 13a 및 도 13b에서 보는 바와 같이, PPC 5.0% 단독 조성물, PPC 5.0%+TUDCA 4.0%, PPC 5.0%+GCA 2.5%, PPC 5.0%+TCA 2.5% 이동거리와 이동속도는 변화가 없거나 약간 증가한 반면 상대적으로 PPC 5.0%+DCA 2.2%, PPC 5.0%+HDCA 2.5%, PPC 5.0%+UDCA 3.0%, PPC 5.0%+TDCA 2.5%, PPC 5.0%+GDCA 2.5%, PPC 5.0%+CDCA 2.5%, PPC 5.0%+CA 2.5%를 투여 받은 마우스의 이동거리와 이동속도는 20% 정도 감소하였으며 이는 통증에 의한 활동성 감소로 판단된다. 이는 본원 발명의 주사제가 기존 시판 제제들 보다 고통이 현저히 저감된 결과(고통이 실질적으로 없다할 수준으로)인 것으로 판단된다.

< 실험예 6>

GCA로 가용화한 PPC 조성물의 임상적 평가

<6-1> 지방감소 유효성에 대한 임상적 평가

본 발명의 조성물 중 대표적으로 GCA 2.8%로 가용화한 PPC 5.0% 주사제 조성물을 턱밑에 통통하거나 볼록하게 국소적으로 지방이 침착된 환자를 대상으로 투여하였다. 구체적으로, 투여부위에 9.6% 리도카인 크림으로 30분 이상 국소 마취 후 5cc 주사기에 13mm 30G 주사바늘을 장착하고 1.0cm 간격, 6~8mm 깊이로 포인트당 0.2cc씩 턱밑 지방층 50군데에 총 10mL을 4주 간격으로 6회 투여 12주 후 표준임상사진 촬영, CT촬영, 연구자가 보고한 개선도, 대상자가 보고한 개선도 및 대상자의 만족도를 평가하였다.

임상사진 촬영은 투여 전과 최종 투여 후 12주 후에 대상자의 정면, 좌·우사면, 좌·우 측면 총 5컷을 다음 조건으로 촬영하였다. 정면 촬영은 대상자의 양쪽 귀구슬점(Tragion)과 안와궁의 최하부가 만나는 면인 프랑크로트 수평면이 수평이 되는 자세에서 대상자는 카메라를 응시하게 했다. 사면은 정면의 자세에서 대상자의 몸을 45도 회전 후 코끝과 볼의 가장자리와 일직선상이 되도록 얼굴을 위치 후 프랑크포트 수평면이 수평이 되는 자세에서 정면을 응시하게 했다. 측면은 정면의 자세에서 대상자의 몸을 90도 회전시켜 코끝과 턱이 일직선상이 되도록 위치시킨다. 이 때 반대 측 눈썹이 보이지 않도록 하고, 몸이 측면으로 기울거나 굴곡 또는 신전되지 않도록 자세를 똑바로 한다. 대상자의 어깨의 약간 뒷부분에서 머리 뒷부분이 이어지는 선을 조정하여 수직이 되도록 조절 후 프랑크포트 수평면이 수평이 되는 자세에서 정면을 응시하도록 하게 했다. 촬영에 사용된 카메라는 니콘 DSLR-카메라 D5200에 60mm 단초점렌즈이다.

CT 촬영은 투여 전과 최종 투여 12주 후 턱 밑 투여부위의 지방층 두께 및 면적을 측정하였다. 대상자는 지정된 상의와 머리띠를 착용 후 편안하게 누운 상태에서 안내방송에 따라 침을 삼키는 것을 참는다. 이때 CT 촬영용 배게는 NECK 타입으로 대상자를 이마, 콧등, 턱, 쇄골 정중앙을 지나는 레이저 가이드 선에 머리를 고정한다. CT 촬영의 영상지표는 스캔 범위(귓구멍부터 쇄골 하단), 슬라이스(5.0mm), FOV는 skin 포함, Matrix size는 512x512, Rotation time은 0.5s, Beam colimation은 64 x 0.6mm로 촬영했으며 기기는 GE Medical systems고 영상은 인피니티사의 Xelis 1.0 6.0 BN 6 3D를 이용하여 분석하였다.

본 발명 주사제 조성물의 임상적 유효성은 도 16a 및 도 16b에 잘 나타나 있다. 도 14a는 본원 발명의 GCA로 가용화한 PPC 복합조성 주사 용액을 1회 포인트당 0.2cc, 50군데, 10ml을 4주 간격으로 6회 투여받은 대상자의 투여 전과 최종 투여 12주 후 임상사진을 나타낸 것으로, 육안으로도 턱밑 지방감소가 확인되었다. 본 대상자가 보고한 만족도는 5점 중 4점이며 투여 전 사진과 비교한 후 평가한 개선도는 1.5등급으로 보고하였다. 흥미롭게도 본 대상자는 과거 DCNa로 가용화한 PPC 주사제 조성물(시판제품명 리포빈주)을 투여받은 경험이 있는 환자로 본 발명 조성물 투여 시, 직후 그리고 시간이 지남에 따라 통증이 없어 상당히 놀라움을 설명하였다.

또한 CT를 통하여 국소적으로 침착된 지방 감소량에 대한 정략적 평가 결과 결과를 도 14b에서 보여준다. 투여 부위인 턱밑 정중앙을 지나가는 CT 상 시상면의 하악골 끝점 하방 3cm에 위치한 턱밑 넓은 목근 전 피하지방층(Pre-platysmal submental fat) 두께는 투여전 5.6mm에서 최종 투여 12주 후 3.9mm로 30.36% 감소했다.

<6-2> 고통과 부종 그리고 부작용에 대한 임상적 평가

DCA로 가용화한 PPC 주사 조성물(기존 시판 제품)을 투여 받은 경험이 있는 남·녀 6명을 대상으로, 본원 발명의 GCA로 가용화한 PPC 주사제 조성물 투여 후 고통과 부종 그리고 부작용에 대한 임상적 평가를 수행하였다. 구체적으로, 투여부위에 9.6% 리도카인 크림으로 30분 이상 국소 마취 후, DCNa 2.4%로 가용화한 PPC 5.0% 주사제인 리포빈주(5ml)를 생리식염주사액(5ml)과 1:1 희석 한 조성물(즉, PPC 2.5%+DCNa 1.2%에 해당) 10ml을 30G 13mm 주사바늘을 장착한 주사기로 복부와 옆구리(1.5cm간격, 10~12mm 깊이, 포인트당 0.5cc를 1회 당 50ml 내지 100ml 투여 받거나 턱밑 피하지방층(1.0cm간격, 6~8mm 깊이, 포인트당 0.2cc를 1회 당 10ml)에 투여 받은 경험이 있는 환자들을 대상으로, 본 발명의 조성물인 GCA 2.8%로 가용화한 PPC 5.0% 주사제(GCA/PPC 몰비 0.97) 10ml 또는 GCA 4.0%로 가용화한 PPC 5.0% 주사제(GCA/PPC 몰비 1.39) 10ml을 동일한 투여방법으로 투여하였다. 투여 후 대상자들에게 설문조사지, VAS(Visual Analogue Scale)통증 평가를 위한 10cm자와 파란색 유성펜을 지급하고 투여 시, 투여 1,3,7,10일 후 통증, 부종, 종창, 혈종, 멍, 홍반, 무감각증, 경화, 감각이상, 결절, 가려움증을 평가하였다. 통증평가는 대상자들이 지급받은 10cm자와 유성팬을 이용하여 10cm길이의 선으로 왼쪽 끝에는 통증이 없음을 기록하고 오른쪽 끝에는 상상 가능한 가장 심한 고통을 기록하도록 했다. 부종과 종창은 거울을 보고 지급 받은 10cm 자를 이용하여 거울을 보고 주사 투여부위와 투여 이외의 부위를 자로 누른 후 0.없음, 1.경증(2mm이하), 2.중등증(2-4mm), 3.중증(4-6mm), 4.극심(6-8mm)을 기록하게 했다. 혈종, 멍, 홍반은 첨부된 예시 사진과 비교하여 그 정도를 0.없음, 1.경증, 2.중등증, 3.중증, 4.극심으로 기록하게 했다. 무감각증, 경화, 감각이상, 결절, 가려움증은 자각적인 증상으로 투여 후 투여 부위 전체를 손가락으로 눌러보고 그 정도를 0.없음, 1.경증, 2.중등증, 3.중증, 4.극심으로 기록하게 했다.

도 15(도 15a 내지 도 15c) 및 도 16에서 보는 바와 같이, DCNa로 가용화한 PPC 조성 주사액을 투여 받은 경험이 있는 대상자들은 투여 시와 투여 10일이 경과된 시점까지 특히 통증과 부종을 호소했으며, 홍반, 혈종, 멍과 같은 피부병변 그리고 국소 유해사례로 경화, 결절, 가려움증, 작열감을 보고했다. 하지만 놀랍게도, 본 발명 GCA로 가용화한 PPC 주사제를 투여 받은 대상자들은 특히 통증(도 15a)과 부종(도 15b)이 실질적으로 없다고 할 경증 수준으로 경감되었다. 특히, 도 15a에서 보는 바와 같이 본원 발명의 PPC+GCA 복합제제가 주사(injecting)시점에서도 통증(고통)이 거의 없다는 점은 매우 특이한 것으로서, 이는 비교군으로 사용된 기존 제제인 DCNa(DCA의 나트륨 염)로 가용화한 PPC 조성 주사액과 본원 발명의 조성물이 입자 특성(미셀, 입자 크기 등)이 유사할 뿐만 아니라 상기 주사제들이 모두 인체와 유사한 pH로 투여됨을 종합적으로 고려하였을 때, 기존에 공지된 기술들로부터 예측하기 어려운 특이한 효과이다.

또한 도 16에서 보는 바와 같이, 주사바늘 자체에 의한 멍 또는 주사 시 혈관손상에 의한 혈종을 제외하고 약물에 의한 혈종 및 홍반은 없음 내지 경증으로 경감되었다. 구체적으로 도 15c에서 보는 바와 같이, 무감각증(Anesthesia), 광범위한 종창(swelling), 약물에 의한 혈종(hematoma), 멍(bruising), 홍반(erythema), 경화(induration), 감각이상(paresthesia), 결절(nodule), 가려움증(pruritus), 작열감(warmth), 연하곤란(dysphagia) 등의 신경손상 부작용이 없었다. 이러한 연구 결과는, 전술한 실험예들을 통해 in vivo 과 in vitro 그리고 단회 투여 독성시험결과 상에서 GCA로 가용화한 PPC 조성물들이 보여준 지방세포 사멸(apoptosis) 및 지방분해 효과가, 안전하고 높은 효용성으로 인간에게서 임상적으로 재현 가능함을 시사하는 것이다.

이상 살펴본 바와 같이, 약제학적으로 활성인 포스파타딜콜린을 사용하여 국소적으로 침착된 지방을 가진 대상자에게 통증, 부종 그리고 부작용이 없이 비수술적으로 지방을 감소시키는데 유용한 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, (i) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline); (ii) 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA) 타우로콜린산(Taurocholic acid, TCA) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것; 및 (iii) 잔량의 물을 포함하고, 상기 (i) 및 (ii)는 (ii)/(i)의 몰비(mol/mol)가 0.7 내지 3.0인 것을 특징으로 하는, 통증과 부종 그리고 부작용[특히 지방세포 외 근육세포, 섬유아세포 및 혈관내피세포 괴사, 투여부위의 무감각증, 광범위한 종창, 홍반, 경화, 감각이상, 결절, 가려움증, 작열감, 신경손상, 연하곤란이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물과 이의 제조방법에 대한 것이다.

기존의 국소 지방 감소용 주사제로서 알려진 데옥시콜린산(DCA) 단일제 또는 포스파티딜콜린(PPC)-데옥시콜린산(DCA) 복합제제들에서 나타나는 지방세포 괴사와 섬유아세포, 내피세포 및 골격근 세포 용해로 인한 통증 및 무감각증, 광범위한 종창, 국소적 부종, 홍반, 경화, 감각이상, 결절, 가려움증, 작열감, 연하곤란 등 부작용이 발생한다고 보고되고 있다. 하지만 본원 발명에서 제공하는 국소지방 분해용 주사제 조성물은 지방세포만 선택적으로 분해(lipolysis)와 사멸(apoptosis)을 유도하여 국소 지방을 감소시키는 것으로 지방세포 제거 효과가 현저할 뿐만 아니라, 상기 기존 세포용해 주사제 조성물에서 나타나는 통증 및 부작용이 현저히 경감되어 대상자들의 낮은 복약 순응도를 획기적으로 높였을 뿐만 아니라 궁극적으로 국소 지방감소를 원하는 대상자들의 삶의 질을 향상시켜 산업상 이용가능성이 높다.

Claims

(i) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline); 및
(ii) 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA), 타우로콜린산(Taurocholic acid, TCA) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하고,
상기 (i) 및 (ii)는 (ii)/(i)의 몰비가 0.7 내지 3.0인 것을 특징으로 하는, 통증 및 부작용이 경감된 국소지방 감소용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 부작용은 지방세포 외 근육세포, 섬유아세포 및 혈관내피세포 괴사; 부종; 투여부위의 무감각증; 광범위한 종창; 홍반; 경화; 감각이상; 결절; 가려움증; 작열감; 신경손상; 및 연하곤란으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 (ii)/(i)의 몰비는 0.7 내지 2.6인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린은 전체 조성물 내에 0.625 내지 15%(w/v) 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린은 전체 조성물 내에 1.25 내지 12.5%(w/v) 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 염은 나트륨염, 칼륨염 또는 암모늄염인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은
보존제;
등장화제; 및
pH 조절제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 대상에서 국소화된 지방 침적을 비수술적으로 제거하기 위한 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 주사제 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 지방세포에 특이적으로 사멸(apoptosis)과 분해(lipolysis)을 일으키는 것을 특징으로 하는 국소지방 감소용 주사제 조성물.
대상에서 통증 및 부작용이 경감되고 국소화된 지방 침적(localized fat deposit)을 제거하기 위한 제제로서, 상기 제제는
(i) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline); 및
(ii) 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA), 타우로콜린산(Taurocholic acid, TCA) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하고,
상기 (i) 및 (ii)는 (ii)/(i)의 몰비가 0.7 내지 3.0인 제제.
제11항에 있어서, 상기 제제는 대상에서 국소화된 지방 침적을 비수술적으로 제거하는 것인 제제.
제11항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린은 전체 조성물 내에 0.625 내지 15%(w/v) 농도로 포함되는 제제.
제11항에 있어서, 상기 제제는 pH 6.8 내지 pH 7.8인 것을 특징으로 하는 제제.
제11항에 있어서, 상기 제제는
보존제;
등장화제; 및
pH 조절제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 추가로 포함하는 제제.
제11항에 있어서, 상기 제제는 주사가능한 제제인 것인 제제.
(Ⅰ) (i) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline); 및
(ii) 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA), 타우로콜린산(Taurocholic acid, TCA) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하며 상기 (i) 및 (ii)는 (ii)/(i)의 몰비가 0.7 내지 3.0인, 대상에서 통증 및 부작용이 경감되고 국소화된 지방 침적을 제거하기 위한 조성물 또는 제제를 포함하는 제1 콘테이너; 및
(II) 상기 조성물을 지방 축적 부위에 전달할 수 있는 전달 장치를 포함하는 키트.
제17항에 있어서, 상기 조성물 또는 제제는 대상에서 국소화된 지방 침적을 비수술적으로 제거하기 위한 것인 키트.
제17항에 있어서, 상기 조성물 또는 제제는 주사 가능한 제형으로 제공되는 키트.
제17항에 있어서, 상기 전달 장치에는 주사 가능한 제형의 상기 조성물 또는 제제가 미리 적재되어있는 키트.
제17항에 있어서, 상기 조성물 또는 제제는
전체 조성물 기준으로 포스파티딜콜린을 0.625 내지 15%(w/v) 농도로 포함하는 키트.
제17항에 있어서, 상기 조성물 또는 제제는
보존제;
등장화제; 및
pH 조절제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 추가로 포함하는 키트.
제17항에 있어서, 상기 키트는 대상에서 통증 및 부작용이 경감되고 국소화된 지방 침적을 제거하기 위한 상기 조성물 또는 제제를 사용하기 위한 설명서(written description)를 포함하는 키트.
(Ⅰ) (i) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline); 및
(ii) 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA), 타우로콜린산(Taurocholic acid, TCA) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하며, 상기 글리코콜린산, 타우로콜린산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것은 포스파티딜콜린의 질량 이하로 포함되는, 대상에서 통증 및 부작용이 경감되고 국소화된 지방 침적을 제거하기 위한 조성물 또는 제제를 포함하는 제1 콘테이너; 및
(II) 상기 조성물을 지방 축적 부위에 전달할 수 있는 전달 장치를 포함하는 키트.
(a) 주사용수에 글리코콜린산(Glycocholic acid), 타우로콜린산(Taurocholic acid) 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 넣고 투명하게 용해 될 때까지 교반하는 단계;
(b) 보존제를 넣고 교반하는 단계;
(c) 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline)을 투입하고 상온에서 교반하는 단계; 및
(d) 물로 총 부피를 맞추고 교반하는 단계를 포함하며,
상기 글리코콜린산, 타우로콜린산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것/포스파티딜콜린의 몰비가 0.7 내지 3.0으로 투입되는 것을 특징으로 하는,
통증 및 부작용이 경감된 국소지방 감소용 주사제 조성물의 제조방법.
제25항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린은 전체 조성물을 기준으로 0.625 내지 15%(w/v) 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제25항 있어서, 상기 글리코콜린산, 타우로콜린산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것/포스파티딜콜린의 몰비가 0.7 내지 2.6으로 투입되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제25항에 있어서, 상기 보존제는 벤질알코올인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제25항에 있어서, 상기 (b) 단계는 추가적으로 등장화제를 투입하는 것을 포함하는 제조방법.
제25항에 있어서, 상기 조성물은 지방세포에 특이적으로 사멸(apoptosis)과 분해(lipolysis)을 일으키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
통증 및 부작용이 경감되고 국소적 지방 축적을 비수술적으로 제거하기 위한 의약 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 조성물은
포스파티딜콜린과
글리코콜린산, 타우로콜린산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 포함하되,
상기 글리코콜린산, 타우로콜린산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것은 포스파티딜콜린의 질량 이하로 투입되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제31항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린은 전체 조성물을 기준으로 0.625 내지 15%(w/v) 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제31항에 있어서, 상기 조성물은
보존제;
등장화제; 및
pH 조절제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 추가로 포함하는 제조방법.