KR101885705B1 - 종양 개시 세포를 인지하는 항체와 항원 및 이의 용도 - Google Patents

종양 개시 세포를 인지하는 항체와 항원 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

종양 개시 세포의 마커 CACNA2D1의 스크리닝, 동정 또는 검증 방법이 개시된다. 본 방법은 재발성 종양으로부터 기원하며 기원 세포에 풍부한 HEP-12 세포를 이용하여 동물을 면역화하는 단계를 포함한다. 또한, CACNA2D1을 특이적으로 인지하는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 이들의 CACNA2D1 관련 질환 또는 장애, 또는 종양을 치료 또는 예방하기 위한 용도를 개시한다.

Description

종양 개시 세포를 인지하는 항체와 항원 및 이의 용도 {ANTIBODY AND ANTIGEN RECOGNIZING TUMOR-INITIATING CELLS AND USE THEREOF}
본 발명은 약학 생물공학 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 종양 개시 세포 (tumor initiating cell)의 마커 및/또는 종양 치료용 타겟 분자를 동정하는 방법, 및 상기 종양 개시 세포 및/또는 상기 종양 치료용 타겟 분자를 타겟팅하는 치료 약제의 개발 및 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 또한, 종양 진단, 종양의 예후 예측 및 종양의 치료를 위한 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 단일클론 항체 또는 상기 이의 항원 결합 단편을 포함하는 진단 키트 또는 약학 조성물, 및 종양의 진단, 종양의 예후 예측 또는 종양의 치료 등에 있어서의 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 종양 진단 또는 암의 예후 예측에 있어서 항체에 의해 타겟팅되는 항원 또는 상기 항체에 의해 인지되는 타겟 분자의 용도에 관한 것으로, 상기 항원 또는 상기 타겟 분자는 종양 개시 세포 (또는 종양 줄기 세포로도 언급됨)의 마커로서 사용된다. 아울러, 본 발명은 종양 치료용 시약 및 약제의 개발에 있어 분자 타겟으로서 이용되는, 항체에 의해 타겟팅되는 항원 또는 항체에 의해 인지되는 타겟 분자의, 용도에 관한 것이다.
종양 조직은 서로 다른 기능과 다른 형태를 가진 이질적인 세포 집단들로 이루어진 것으로 오랫동안 알려져 왔다. 종양/암 줄기 세포 (TSC/CSC) 가설은, 종양이 정상적인 조직 및 장기들과 유사한 방식으로, 종양 줄기 세포가 진행성 증식과 분화를 통해 생성되어, 이질성이 형성되는 것으로 가정한다. 종양 줄기 세포는, 정상적인 줄기 세포와 유사한 특성으로 인해 그렇게 불리우고 있는데, 종양 조직의 함유량이 비교적 적고, 무한정의 자가-재생력을 가지고 있으며, 종양 형성과 증식을 개시할 수 있는 능력을 가지고 있는, 세포군을 지칭한다. 그러나, TSC가 명확하게 해당 정상 줄기 세포로부터 유래되거나 또는 반드시 정상 줄기 세포와 조합되어 있다는 것을 의미하는 것은 아니다. 이러한 사항을 고려하여, 이들 세포는 또한 오해를 피하기 위해 종양 개시 세포 (TIC) 또는 종양 증식 세포 (TPC)로도 지칭된다. 종양 줄기 세포는 동물에서 강력한 종양형성능(tumorigenicity)/암 발생력 (이러한 세포는 100개 또는 심지어 몇개만으로도 면역결핍 마우스에서 종양/암 형성을 유도할 수 있음), 강력한 약물 내성 및 침습적인 증식을 나타낸다. 또한, 이들 세포는 종양형성능을 나타내지 않는 세포로도 분화할 수 있는 잠재성을 가지고 있다. 이들 종양 줄기 세포의 존재는 종양 발생, 종양 진행 및 치료 실패의 실질적인 요인으로 간주된다.
종양 줄기 세포가 최초로 혈액에서 분리 및 동정된 이래, 뇌암, 유방암, 전립선암 및 대장암 등의 고형 종양에 종양 줄기 세포가 존재한다는 것이 입증되고 있다. 간암과 관련하여, 몇몇 연구 그룹들에서 여러가지 전략을 통해, 배양 세포주 또는 임상 생검으로부터 간암 줄기 세포를 발굴하였다. 예를 들어, Huh7 세포들로부터 분리된 사이드 개체군 (SP: side population)은 연속 접종을 통한 동물 실험에서 종양을 유도할 수 있었다. 또한, CD133은 Huh7 세포주 및 PLC8024 세포주에서 간암 줄기 세포의 마커로서 사용될 수 있는 것으로 보고되었다. 최근, CD90, EpCAM, OV6, CD133/ALDH도 간암 줄기 세포들을 분리하는데 성공적으로 사용된 바 있다. 줄기 세포 같은 특성을 가진 종양 세포가 여러가지 방식으로 동정되더라도, 오리진이 서로 상이한 종양들에서 분리된, 동일한 마커를 가지는 다양한 타입의 세포들은, 이전에 발굴된 종양 줄기 세포 마커들의 특이성 부족으로 인해, 생물학적 특성에 큰 차이를 보인다. 이런 점에서, 종양 줄기 세포의 존재 여부와 종양 줄기 세포의 특성이 무엇인지에 대한 논의가 이루어지고 있다. 실제, 용어 '종양 줄기 세포' 또는 '종양 개시 세포', 또는 심지어 '종양 증식 세포'는 단순히 기능상의 용어일 뿐이며, 특성에 대한 향후 연구가 필요하다. 그럼에도 불구하고, 공통된 결론은, 방사선요법 및 화학요법에 내성을 나타내며, 면역결핍 동물에서 강력한 종양형성능을 나타내는 세포군이 종양 조직내에 존재한다는 것이다. 이것이 무엇으로 지칭되든, 치료 실패와 종양 재발의 일차적인 요인이다. 이들 세포의 분리와 동정은 종양 진단과 치료에 새로운 아이디어를 제공해준다. 과거의 치료는 종양 빈도 측면에서 다량으로 존재하는 저 악성 세포에 주로 집중되었다. 그러나, 종양 개시 세포는, 낮은 비율에도 불구하고, 기존의 방사선치료와 화학요법에 대한 내성으로 인해, 생존하며, 점차 증식하여 다른 부위로 이동함으로써, 종양의 재발생과 전이를 야기할 것이다. 이런 관점에서, 종양 개시 세포를 소멸시키도록 지시하는 약물은 종양이 재발생 및 전이되지 않도록 근본적으로 차단할 수 있다. 이러한 약물들은, 단독으로 또는 기존의 외과적 시술, 방사선치료 또는 화학요법과 병행하여, 종양을 완전히 치유하기 위한 새로운 시발점의 단초가 될 것이다. 이들 종양 개시 세포들은 종양 진단, 치료 및 예후에 대한 타겟으로서 다루어져야 한다.
최근들어, 종양 줄기 세포를 타겟팅함으로써 종양을 치료하는 실험에 큰 진전이 달성되고 있다. 예를 들어, 결장직장 암의 경우, CD133-양성 종양 줄기 세포는 IL-4를 고수준으로 발현함으로써 세포자살을 저해하는데, 즉, CD133-양성 종양 줄기 세포에 IL-4 저해제를 처리함으로써 약물에 대한 민감성을 높이는 것이다. 또한, 연구들을 통해, 항-CD44 항체의 사용이 급성 백혈병 (leucocythemia)에서 종양 줄기 세포를 소멸시켜, 이러한 증상을 치유할 수 있다는 것이 확인되었다.
종양 줄기 세포에 대한 약물 개발은 자가-재생, 약물 내성 및 종양 줄기 세포의 침습적인 증식에 관여하는 신호전달 경로의 주요 분자들을 타겟으로 한다. 또한, 약물 개발은 세포 표면에 위치한 마커들 뿐만 아니라 세포가 존재하는 적소 및 간에 초점을 맞출 수 있다. 이러한 주요 프로세스에 관여하는 분자들은 종양 줄기 세포의 분리와 동정, 그리고 유해한 생물학적 특성들에 대한 본질과 기저 조절 기전에 대한 깊은 이해를 기반으로 발굴된다. 일반적으로 언급되는 종양 관련 항원들에 비해, 종양 줄기 세포와 관련된 분자들은 통상 상대적으로 낮은 수준으로 발현된다는 점에 주목하여야 한다. 즉, 이들 분자의 발견은, 주로 종양 줄기 세포-유사 개체군에서는 특이적으로 발현되지만 과다-발현되지 않는다는 점을 토대로 한다.
현행 약물 개발 기법의 발전으로 인해, 컴퓨터 시뮬레이션을 이용하여 특정 분자에 대한 특이적인 길항제를 설계할 수 있게 되었으며, 기존 선도 약물들에 대한 라이브러리로부터 후보 약물들을 스크리닝할 수 있다. 또한, 길항작용 하는 항체도 제작 가능하며, 파지 디스플레이 방법 등의 그외 분자 생물기법과 세포 생물기법을 이용함으로써, 타겟 약물을 스크리닝할 수 있다.
단일클론 항체 기법은 특정 항원이나 특정 세포를 타겟팅하는 항체를 제조하기 위한 통상적인 기법으로서 사용되고 있다. 다수의 항체들은 직접 사용되고 있거나, 또는 유전자 조작을 통한 마우스-인간 키메라 항체로 변형되거나 또는 테리오마(therioma) 등의 중증 임상 질환들을 치료하기 위해, 심지어는 완전히 인간화된 항체로 변형되어, 사용되고 있다. 지금까지, 항체-매개의 종양 줄기 세포-표적 치료제와 관련된 실험들에는, CD44, p-당단백질 1, 히알루로난 수용체, EpCAM, CD326, CXCR4, IL-4, DLL4, ALDH 등이 사용되었다.
종양 개시 세포를 특이적으로 동정하는데 사용할 수 있는 마커가 이러한 세포의 스크리닝 및 동정 분야에서 요구되고 있다. 아울러, 상기 마커는 임상적인 진단과 예후 예측에도 사용될 수 있다. 또한, 상기 마커는 이들 세포의 유해한 생물학적 행태와 분자적 조절 기전에 대한 연구에도 사용될 수 있다. 한편, 종양을 치료하고, 종양의 재발과 전이화를 근본적으로 방지하기 위해, 종양 개시 세포를 겨냥하는 약물도 개발할 수 있다.
본 발명의 목적은 종양 개시 세포를 분리, 동정 및 치료하기 위한 분자 타겟을 발굴, 식별 또는 동정하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 종양 또는 CACNA2D1 단백질-관련 질환 또는 장애를 진단, 치료 및 예방하는 방법을 제공하는 것이다.
이에, 본 발명은, 종양 개시 세포가 풍부한 재발성 종양 소스로부터 유래된 세포를 이용하여 동물을 면역화하는 단계를 포함하는, 종양 개시 세포의 마커 및/또는 종양 치료용 타겟/분자 타겟을 발굴, 식별 또는 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명은, 또한, 본 발명의, 상기 종양 개시 세포의 마커 또는 종양 치료용 타겟/분자 타겟을 발굴, 식별 또는 동정하는 방법을 적용하는 단계; 상기 마커 및/또는 타겟/분자 타겟을 토대로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드, 핵산, 짧은 펩타이드 또는 이의 소분자 화합물 제제 (small molecular compound agent)를 개발 및/또는 스크리닝하는 단계; 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 단일가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드, 핵산, 짧은 펩타이드 또는 이의 소분자 화합물 제제 중 하나 이상을 필요로 하는 개체에게 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드, 핵산, 짧은 펩타이드 또는 이의 소분자 화합물 제제는, 상기 마커 또는 타겟/분자 타겟의 유전자 발현 및/또는 단백질 활성을 낮추거나, 또는 상기 마커 또는 타겟/분자 타켓을 타겟팅한 후 세포독성 반응을 유발하는 것인, 종양의 진단, 치료 및 예방 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 종양 또는 CACNA2D1 단백질-관련 질환 또는 장애를 진단 또는 치료하기 위한, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 종양 또는 CACNA2D1 단백질-관련 질환 또는 장애를 진단, 예후 예측 및 치료함에 있어서의, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
본 발명의 발명자들은, 전압-의존형 칼슘-채널 α2δ-1 서브유닛 (CACNA2D1으로 지칭됨, GenBank NO. NM_000722.2)이 종양 개시 세포의 분자 마커이자 종양 치료용 타겟 또는 분자 타겟이라는 것을 발견하였다. CACNA2D1의 핵산 또는 단백질에 대한 진단제 및 치료학적 약물의 개발은 유용한 일이다. 본 발명의 발명자들은, 한명의 HCC (간세포 암) 환자에서 원발성 병소의 생검과 재발성 병소의 생검으로부터 각각 Hep-11 세포주 (원발성 간세포 암종 조직으로부터 유래됨)와 Hep-12 세포주 (재발성 간세포 암종 조직으로부터 유래됨)를 확립하게 되었다. 이들은 또한, 집단 및 클로닝 분석을 토대로, 재발성 HCC 조직-유래의 Hep-12 세포들 대부분 (80% 이상)이 종양 개시 세포로서의 특성을 가지는데 반해, 원발성 HCC 조직-유래의 Hpe-11 세포는 최대 107개의 세포를 주입한 후에도 6개월이내에는 종양을 형성하지 않는다는 것을 확인하였다. Hep-12 세포를 이용하여 balb/c 마우스에 접종하여 하이브리도마를 제조한다면, Hep-12 세포를 특이적으로 인지하는 특이 항체 1B50-1을 수득할 수 있다. 본 발명자들은, 5종의 간암 세포주와 4종의 간암 임상 생검에 대한 유세포 측정을 통해 분류한, 1B50-1 양성 세포 100 - 1000개가 NOD/SCID 마우스에서 피하 종양 형성을 개시하는데 충분하다는 사실을 확인하였다. 유전자 발현 및 세포 분화에서, 이들 항체 양성 세포가 종양 개시 세포로서의 특성을 가지고 있는 것으로 나타났다. 한편, 본 발명의 발명자들은, 이들 항체를 Hep-12 종양과 Huh7 종양을 가지고 있는 NOD/SCID 마우스에 복막내로 주입하는 경우, 용량-의존적인 방식으로 이식된 종양을 저해할 수 있으며, 이때 저해율이 (무게로 측정함, IgG 대조군 대비) 각각 80.4% 및 65.5%라는 것을 확인하였다. 면역침강 및 질량-분광측정 (MS) 분석에서, 1B50-1에 의해 인지되는 항체는 150 kDa의 이온 채널 단백질이라는 것이 밝혀졌다. 이 이온 채널 단백질의 유전자 발현을 RNA 간섭으로 저해하면, 누드 마우스에서 Hep-12 세포의 증식을 저해할 수 있었다. 이러한 결과들은 모두 1B50-1에 의해 인지되는 항원이 간암 종양 개시 세포의 새로운 마커일 뿐만 아니라 종양 치료용 분자 타겟임을 시사해준다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명은 종양 개시 세포의 마커 또는 종양 치료용 타겟/분자 타겟을 발굴, 식별 또는 동정하기 위한 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 종양 개시 세포의 분리, 동정 및 치료에 사용할 수 있는 분자 타겟을 발굴, 식별 또는 동정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 종양 개시 세포가 풍부한 재발성 종양 소스로부터 유래된 세포로 동물을 면역화하는 단계를 포함한다. 본 발명의 종양 개시 세포의 마커 및/또는 치료용 타겟/분자 타겟을 발굴하는 방법에 대한 구체적인 구현예에 있어서, 상기 종양은 간암, 결장암, 직장암, 신장암, 식도암, 위암, 폐암, 유방암, 전립선암 또는 CACNA2D1 유전자를 고수준으로 발현하는 기타 종양일 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 종양은 간암이며, 상기 종양 개시 세포가 풍부한 재발성 종양 소스로부터 유래된 세포는, 종양 개시 세포가 풍부하며 재발성 간암으로부터 유래된 Hep-12 세포이다. 본 발명에서 종양 개시 세포의 마커 및/또는 치료용 타겟을 발굴하는 방법에 있어서, 상기 방법은 스크리닝의 세포 쌍으로서 HCC 환자 한명의 원발성 간암 조직과 재발성 간암 조직으로부터 각각 유래된 Hep-12 세포와 Hep-11 세포를 이용하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는 종양 치료 방법을 제공한다:
1) 동물 (예, balb/c 마우스)을 종양 개시 세포가 풍부한 재발성 종양 소스로부터 유래된 세포 (예, Hep-12 세포)를 이용하여 면역화하고, 종양 개시 세포의 마커 및/또는 종양 치료용 타겟/분자 타겟 (예, CACNA2D1)을 발굴, 식별 또는 동정하는 단계;
2) 단계 1)에서 발굴, 식별 또는 동정한 상기 마커 및/또는 타겟/분자 타겟을 토대로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드, 핵산, 짧은 펩타이드 또는 이의 소분자 화합물 제제 (예, CACNA2D1)를 개발 및/또는 스크리닝하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 개발 또는 스크리닝된, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드, 핵산, 짧은 펩타이드 또는 이의 소분자 화합물 제제 중 하나 이상을 필요로 하는 개체에게 치료학적 유효량으로 투여하는 단계로서,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드, 핵산, 짧은 펩타이드 또는 이의 소분자 화합물 제제는 상기 마커 또는 타겟/분자 타겟의 유전자 발현 및/또는 단백질 활성을 낮추거나, 또는 상기 마커 또는 타겟/분자 타켓을 타겟팅한 후 세포독성 반응을 유발한다.
본 발명의 일 구현예에서, 전술한 단계 1)은, 종양 개시 세포가 풍부한 재발성 종양 소스로부터 유래된 세포 (예, Hep-12 세포)로 동물 (예, balb/c 마우스)을 면역화하여, 하이브리도마를 제조하고 단일클론 항체 (예, 1B50-1)를 수득하는 단계에 의해 수행할 수 있다. 상기 수득되는 항체 (예, 1B50-1)에 의해 특이적으로 인지되는 세포 (예, Hep-12 세포)는 종양 줄기 세포의 식별 및 동정을 위한 후보 세포로서 사용된다. 동물 실험 (예, 세포 100 - 1000개가 NOD/SCID 마우스에서 피하 종양을 유발할 수 있음), 유전자 발현 및 세포 식별 및 그외 실험들을 수행하여, 항체 양성 세포가 종양 줄기 세포의 특성을 가지는 지를 확인한다. 본 발명의 방법에 의해 수득되는 단일클론 항체 (예, 1B50-1)에 의해 특이적으로 인지되는 종양 줄기 세포의 항원이, 본 발명에서 발굴하고자 하는, 종양 개시 세포의 마커 및/또는 치료용 타겟/분자 타겟이다. 본 발명의 구체적인 구현예에서, 본 발명의 발명자들은 CACNA2D1 단백질을 발굴하였고, 이를 종양 개시 세포의 마커 및/또는 종양/암 치료용 타겟/분자 타겟으로서 확인하였다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 마커, 타겟 또는 분자 타겟의 유전자 발현 및/또는 단백질 활성을 낮추거나, 또는 상기 마커 또는 타겟/분자 타켓을 타겟팅한 후 세포독성 반응을 유발하는, 단계 2)에서 개발 또는 스크리닝된 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 종양 개시 세포를 발굴, 식별 또는 동정하기 위해 단계 1)에서 수득한 항원 (마커, 종양/암 치료용 타겟/분자 타겟)의 단일클론 항체 (예, 1B50-1)일 수 있으며, 이는 또한 발굴, 식별 또는 동정한 마커, 타겟/분자 타겟 (예, CACNA2D1 단백질/항원)을 토대로 개발 또는 스크리닝할 수 있다.
항원 CACNA2D1에 대한 신규 항체 및 이의 유도체는, 본 발명에서 제공되는 종양 개시 세포의 항원인 CACNA2D1을 토대로 다양한 항체 제작 기법들로 수득할 수 있다. 이러한 기법들로는, 비제한적인 예로서, 다양한 발현 시스템에 의한 CACNA2D1의 발현 또는 이 항원의 정제, 및 마우스, 토끼 또는 그외 동물 (유전자 조작된 동물 균주들이 포함됨)의 면역화를 통한 항원에 특이적인 항혈청의 수득; 면역화된 마우스 유래의 비장 세포와 SP2/0 골수종 세포의 융합, 및 CACNA2D1의 이용을 통한 CACNA2D1 항원에 특이적인 단일클론 항체의 스크리닝을 포함하며; 추가적으로, 마우스 항-CACNA2D1 단일클론 항체의 가변부를 코딩하는 유전자를 클로닝한 다음, 원핵 생물 및/또는 진핵 생물 발현 시스템에서 직접 또는 해당 인간화된 항체의 불변부의 코딩 유전자에 상기 가변부를 정확하게 연결함으로써 인간화한 후 인간-마우스 키메라 항체 또는 단일클론 항체를 발현시키는 것을 포함한다. 이 유전자에 특이적인 완전한 인간 항체 (fully human antibody)는, CACNA2D1을 이용하여 인간 항체 파지-디스플레이형 라이브러리에서 스크리닝함으로써, 또는 인간 말초혈 단핵구 세포를 마우스 세포와 융합하는 키메라 기법에 의해, 수득할 수 있다.
본 발명의 구현예에서, CACNA2D1 단백질의 양은 본 발명의 항체를 이용함으로써 고민감도로 정량할 수 있다. 생체내 CACNA2D1 단백질의 정량화 방법으로, 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 종양 또는 다양한 CACNA2D1 단백질-관련 질환들을 진단하는데 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 본 발명의 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편들 중 하나 이상을 유효량으로 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양 또는 CACNA2D1 단백질-관련 질환 또는 장애의 진단 방법을 추가로 제공한다. 생체내 진단에 필요한 양은 치료에 필요한 양 보다 적을 수 있으며, 당해 기술 분야의 당업자는 통상적인 절차를 통해 정할 수 있다. 또한, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여, 체액, 조직 등의 테스트 액체에 존재하는 CACNA2D1 단백질을 특이적으로 분석할 수 있다.
본 발명의 구현예에 있어서, 본 발명은, 전압-의존형 칼슘-채널 α2δ-1 서브유닛 (CACNA2D1)을 특이적으로 인지할 수 있는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 상기 CACNA2D1을 특이적으로 인지하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
(i) 중쇄 (이하 H 체인으로 언급됨), 상기 중쇄의 가변부는 상보성 결정부 (CDR) CDRH1 (서열번호 1), CDRH2 (서열번호 2) 및 CDRH3 (서열번호 3)를 포함함; 또는
(ii) 경쇄 (이하, L 체인으로 언급됨), 상기 경쇄의 가변부는 상보성-결정부 CDRL1 (서열번호 4), CDRL2 (서열번호 5) 및 CDRL3 (서열번호 6)를 포함함; 또는
(iii) (a) 및 (b).
본 발명의 구현예에서, 전술한 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기와 같은 한가지 이상의 특징을 가진다: (1) CACNA2D1 단백질에 결합함; (2) 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 인지되는 양성 세포는 종양 개시 세포로서의 특성을 가짐; (3) 동물에서 CACNA2D1-발현성 종양 세포의 증식을 저해함. 종양은 간암, 결장암, 직장암, 신장암, 식도암, 위암, 폐암, 유방암, 전립선암 또는 CACNA2D1 유전자를 고도로 발현하는 기타 종양일 수 있다.
본 발명에 제공되는 구현예에서, 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄를 포함하며, 상기 중쇄의 가변부는 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에 제공되는 구현예에서, 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄를 포함하며, 상기 경쇄의 가변부는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에 제공되는 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전술한 중쇄 및 경쇄를 둘다 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 전술한 CDR들과 이들의 조합 중 임의의 것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 가진, 하나 이상의 CDR들을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 본 발명은, 전술한 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 종양 또는 CACNA2D1 단백질-관련 질환 또는 장애의 진단, 예후 예측 및 치료를 위한, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 상기 종양 또는 질환 또는 장애는 간암, 결장암, 직장암, 신장암, 식도암, 위암, 폐암, 유방암, 전립선암 또는 그외 CACNA2D1 유전자를 고도로 발현하는 종양일 수 있다.
본 발명은 하이브리도마 세포주를 제공하며, 상기 하이브리도마 세포주는 2010년 12월 8일자로 중국 일반 미생물 보존 센터 (China General Microbiological Culture Collection Center)에 기탁된 마우스 하이브리도마이다.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 단일클론 항체는 상기 하이브리도마 세포주 (CGMCC No. 4416)에서 생산되는 단일클론 항체 1B50-1이다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 비제한적인 예로서, 잘 알려진 기법들을 이용하여 전술한 항체를 토대로 항원의 특이적인 에피토프를 인지하는 항체 단편을 제조하는 단계를 더 포함한다. 예를 들어, 면역글로불린 분자를, 파파인 (Fab 단편 제조) 또는 펩신 (F(ab')2 단편 제조) 등의 효소를 이용하여 단백질분해 절단을 수행하여, Fab와 F(ab')2 단편들을 제조할 수 있다. F(ab')2 단편은 L 체인과 H 체인의 전체 가변부, CH1 영역 및 힌지 영역을 포함한다. 유도체 서열 (예, 여러가지 신호 펩타이드를 이용하여, 또는 생물정보 분석을 토대로한 인간화에 의한 변형된)을, 기존에 공지된 공공 정보 (예, 유전자 은행, 문헌 또는 기존의 클로닝 및 서열 분석을 통한 정보)를 이용하여 항체의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 토대로 추가로 수득할 수 있다. 상기 면역글로불린을 코딩하는 핵산은 화학적으로 합성할 수 있다. 다른 예로, 상기 면역글로불린을 코딩하는 핵산은, 3' 말단과 5' 말단의 서열들과 매칭되는 합성 프라이머들을 이용한, PCR 증폭에 의해, 적정 소스 (예, 항체의 cDNA 라이브러리, 또는 항체를 발현하는 스크리닝된 하이브리도마 등의 이들 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포로부터, 바람직하게는 mRNA 라이브러리 또는 이로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 분리한 핵산)으로부터 수득할 수 있다. 또한, 상기 면역글로불린을 코딩하는 핵산은, 예를 들어, cDNA 라이브러리로부터, 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써, 스크리닝할 수 있다. 그런 후, 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법으로, PCR 증폭에 의해 생성되는 핵산을 여러가지 발현 시스템 (원핵 생물 및 진핵 생물 발현 시스템들, 무세포성 번역 시스템 등)에서 발현시킬 수 있는 복제가능한 벡터에 도입하여, 본 발명의 항체와 유사한 생활성을 가진 유전자 조작된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시킬 수 있다.
본 발명에 제공되는 구현예에서, 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 재조합 발현 또는 화학 합성 등의 항체를 합성하기 위한 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기타 방법에 의해 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 구현예에서, 이러한 약학 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 아울러, 본 발명은, 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 종양 또는 CACNA2D1 단백질-관련 질환 또는 장애를 치료하기 위한, 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 구체적인 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 상기 질환 또는 장애를 부가적으로 또는 상승적으로 완화할 수 있는, 다른 활성 화합물들을 추가로 포함한다. 상기 활성 화합물들은, 비제한적인 예로서, 상기 질환 또는 장애를 치료하기 위한 기타 화학요법 화합물 및 독소(toxin)를 포함한다. 상기 활성 화합물은 소분자 화합물과 다른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 추가로 포함한다. 구체적으로, 상기 종양 또는 CACNA2D1 단백질-관련 질환 또는 장애는 간암, 결장암, 직장암, 신장암, 식도암, 위암, 폐암, 유방암, 전립선암 또는 그외 CACNA2D1 유전자를 고도로 발현하는 종양일 수 있다.
유익하게는, 경구 또는 비경구 투여를 위한 상기한 약학 조성물은, 적절한 고정된 함량의 활성 성분에 적합한 단위 투약 형태(unit dosage form)로 제조한다. 이러한 단위 투약 형태는, 예를 들어, 정제, 환제, 캡슐제, 주입제, 좌제 등을 포함한다.
구현예에 따라, 본 발명은 CACNA2D1의 유전자 또는 단백질을 겨냥하는 키트를 제공한다. 여기서, 상기 키트는 종양 또는 CACNA2D1 단백질-관련 질환 또응 장애를 진단, 치료 또는 예방하는데 사용할 수 있으며, 키트는 전술한 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 CACNA2D1을 겨냥하는 DNA 및 mRNA 등의 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 키트는 간암, 결장암, 직장암, 신장암, 식도암, 위암, 폐암, 유방암, 전립선암 또는 그외 CACNA2D1 유전자를 고도로 발현하는 종양 등의 종양의 진단, 치료 또는 예방에 사용할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자의 지식에 따르면, 항원은 mRNA 수준에서 정량적인 RT-PCR 등의 방법으로 테스트할 수 있으며, ELISA (효소-연계된 면역흡착 분석), 유세포 측정, 항원에 특이적으로 결합하는 유전자 또는 소분자를 겨냥하는 항체를 이용한 면역조직화학 (세포화학)으로 항원을 테스트할 수 있다. 사용되는 생검은 환자의 혈액, 조직, 박리된 세포 등으로부터 유래될 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 종양 또는 CACNA2D1 단백질-관련 질환 또는 장애의 진단, 치료 또는 예방용 약제의 제조에 있어서의, 본원에 언급된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 상기 종양, 질환 또는 장애는 간암, 결장암, 직장암, 신장암, 식도암, 위암, 폐암, 유방암, 전립선암 또는 그외 CACNA2D1 유전자를 고도로 발현하는 종양일 수 있다. 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 암 (예컨대, 종양 개시 세포가 환자의 조직이나 혈청에 함유되어 있는지의 여부 뿐만 아니라 예후 예측 및 치료 감수성 예측) 및 그외 CACNA2D1 단백질-관련 질환 또는 장애를 진단하기 위한 진단제로서 사용할 수 있다. 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CACNA2D1 항원을 특이적으로 인지할 수 있으며, 따라서, 예를 들어, 더불 항체 샌드위치 분석, 경쟁적인 측정 및 면역분석 등의 당해 기술 분야의 통상적인 방법에 의해, 테스트 액체에서 CACNA2D1 단백질을 정량하는데 사용할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 하나 이상의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 치료학적 유효량으로 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 종양 또는 CACNA2D1 단백질-관련 질환 또는 장애의 치료 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 예방학적 유효량으로 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 종양 또는 CACNA2D1 단백질-관련 질환 또는 장애의 예방 방법을 제공한다.
상기한 진단, 치료 및 예방 방법에 있어서, 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 생물학적 효과를 강화하는 다른 제제와 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 치료용 제제의 예로는, 다른 종류의 항체, 세포 증식을 저해하거나 세포를 사멸시키는 세포독소, 방사성 원소 및/또는 항-염증제, 항생제 등을 포함하는 기타 치료학적 제제를 포함한다.
본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 액체 조제물로서 직접 적정 용매에 혼합하거나, 또는 경구 또는 비경구로 투여하는 적절한 투약 형태의 약학 조성물로서 조제할 수 있다.
본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합하여, 경구 또는 비경구 투여에 적합한 약학 조성물을 조제할 수 있다. 본 발명의 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약학 조성물은 리포좀 캡슐화, 미세입자, 미세캡슐제 등의 다양한 공지된 전달 시스템으로 투여할 수 있다. 투여 방법은, 비제한적인 예로서, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 코내, 경막외 및 경구 투여를 포함한다. 조성물은 주입 또는 볼루스 주입 (bolus infusion) 등의 임의의 방식으로 투여할 수 있거나, 또는 상피 또는 점막을 통한 흡수에 의해 (예, 입 점막 또는 직장 등) 투여할 수 있다. 이들 화합물은 다른 생물학적 활성 물질과 함께 투여할 수 있다. 투여는 전신 또는 국소적으로 수행할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 정맥내로 투여한다. 본 발명의 단일클론 항체는 또한 이러한 치료가 필요한 부위에 국소 투여할 수 있다. 조성물은 널리 공지된 방법들로 조제할 수 있으며, 약물 조제 분야에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 정제에 사용되는 상기 담체 또는 부형제의 예로는 락토스, 전분, 슈크로스, 마그네슘 스테아레이트 등을 포함한다.
주사용 조제물은 정맥내 주입, 피하 주입, 피내 주입 및 근육내 주입 뿐만 아니라 점적 (instillation)에 사용될 수 있는 투약 형태들을 포함할 수 있다. 이들 주사용 조제물은 널리 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 주사용 조제물은, 예를 들어, 상기 항체 또는 이의 염을 통상적인 주입용 멸균 수계 매질 또는 주입용 오일 매질에 용해, 현탁 또는 에멀젼화함으로써, 조제할 수 있다. 주입용 수계 매질은, 예를 들어, 생리 식염수, 글루코르 및 기타 보조 성분을 포함하는 등장액일 수 있다. 상기 매질은 알코올 (예, 에탄올), 폴리올 (예, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제 (예, 폴리소르베이트 80) 등의 적정 가용화제와 조합하여 사용할 수 있다. 직장 투여용 좌제는 상기 항체 도는 이의 염을 통상적인 좌제용 베이스 물질과 혼합하여 조제할 수 있다.
구현예에 따라, 본 발명은, 타겟으로서 CACNA2D1을 이용하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드, 핵산, 짧은 펩타이드 또는 이의 소분자 화합물 제제를 개발 및 스크리닝하는 단계를 포함하는, 종양 또는 CACNA2D1 단백질-관련 질환 또는 장애의 치료용 약물의 제조 및 스크리닝 방법을 추가로 제공하며, 이때 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드, 핵산, 짧은 펩타이드 또는 이의 소분자 화합물 제제는 CACNA2D1의 유전자 발현 및/또는 단백질 활성을 감소시키거나 또는 상기 분자의 타겟팅 후 세포독성 반응을 야기한다.
바람직하게는, 전술한 본 발명의 계획은 주로 간세포 암에 관한 것이며, 위암, 결장암, 직장암, 신장암, 식도암, 폐암, 유방암, 전립선암 등도 관련된다.
아울러, 본 발명에 제시된 종양 개시 세포의 CACNA2D1 항원을 토대로, 선도 화합물들로 구성된 기존 라이브러리에서 스크리닝하거나 컴퓨터 시뮬레이션함으로써, 상기 항원에 특이적인 소분자 화합물 저해제를 용이하게 수득할 수 있다.
본 발명의 구체적인 예로서, 간섭 RNA ShRNA1 (서열번호 7) 및 ShRNA2 (서열번호 8)를 CACNA2D1의 유전자에 대해 설계 및 합성하고, 이를 렌티바이러스 발현 벡터에 적재한다. 이 렌티바이러스는 상기 유전자의 발현을 저해하여, 면역결핍 동물에서 Hep-12 세포의 증식에 상당한 저해 효과를 나타낸다. 제공된 shRNA 서열을 기반으로, 화학 합성과 당해 기술 분야의 당업자의 공통된 지식에 따라 코어로서 매칭 서열로 변형시킴으로써, 여러가지 단일 가닥 RNA를 수득할 수 있다. 다른 예로, 이들 코어 서열들은 여러가지 프로모터를 구비한 유전자 재조합용 일반 벡터와 클로닝 벡터에 포함시킬 수 있다.
정의
본 발명에 사용되는 일부 용어들은 다음과 같이 정의된다.
용어 '종양 개시 세포', '종양 줄기 세포' 및 '종양 증식 세포'는 본원에서 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 이들 용어는 실제 사용되는 세포 유형을 지칭하는데 사용되며, 이들 세포의 생물학적 특성은 추가로 평가되어야 한다. 이들 세포는 일반적으로 비제한적인 예로서 다음과 같은 특성을 가진다: (1) 고도의 악성: 세포 몇개 (100개 또는 심지어 100개 미만)로도 면역결핍 마우스에서 종양을 유도할 수 있으며, 이러한 종양형성능은 매우 안정적임; (2) 기존 치료제에 대해 내성임: 기존 방사성치료 및 화학요법에 대해 내성이거나 반응하지 않음.
본 발명에 사용되는 용어 '항체'는 타겟 폴리펩타이드 또는 타겟 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 분자를 지칭한다. 또한, 이 용어는 완전체 항체(complete antibody) 또는 이의 항원 결합 단편 등의, 이의 단편을 망라한다.
본 발명에 사용되는 '이의 항원 결합 단편'은 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 이황화 결합(들)으로 연결된 단쇄 항체들 (sFv), 경쇄 가변부(VL) 및/또는 중쇄 가변부 중 어느 하나를 포함하는 단편, 또는 타겟 단백질, 폴리펩타이드 또는 서열에 특이적으로 결합하는 CDR(들)을 포함하는 단편 등의, 타겟 단백질, 폴리펩타이드 또는 서열에 대한 특이적인 결합력을 유지하는, 모든 항체 단편을 지칭한다. 이러한 항체 단편을 수득하기 위한 다양한 방법들이 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명에 사용되는 용어 '상보성 결정 영역(CDR)'은 항원에 대한 항체의 특이성 또는 항체의 결합 활성을 직접 결정하는 특이적인 아미노산 서열을 포함하는, 항원을 인지하여 결합하는, 항체의 영역을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 용어 '특이적으로 인지한다'라는 것은 타겟 단백질, 폴리펩타이드 또는 서열에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 능력을 지칭한다. 항체는 비특적이적으로 다른 폴리펩타이드나 단백질에 결합하지 않는다. 바람직하게는, CACNA2D1을 특이적으로 인지하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다른 항원들과는 교차 반응하지 않는다.
본 발명에 사용되는 용어 '유효량'은 '증식을 저해하기 위한 치료학적 유효량' 또는 '증식을 저해하기 위한 예방학적 유효량'을 지칭한다. 이들 용어는 예를 들어 세포 증식 질환들을 치료하는데 충분한, 바람직한 결과를 달성하기 위한, 필수적인 시간 기간 동안 투여량으로 유효한 함량을 포함한다. 본 발명의 화합물이 유효량은 개체의 질환 상태, 연령 및 체중과, 개체에서의 본 발명의 화합물의 바람직한 반응 유발력 등의 인자에 따라 달라질 수 있다. 투여량 용법은 최적의 치료적학 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 또한, 유효량은 치료학적으로 유익한 효과가 본 발명의 화합물의 임의의 독성 또는 유해한 효과 (예, 부작용)가 보다 큰 함량이다.
도 1은 간암 줄기 세포에 풍부한 Hep-12 세포에서 항체 1B50-1의 면역형광 염색 결과를 나타낸 것으로, 1b50-1 항체에 의해 인지되는 항원이 세포 막에 위치함을 보여준다. Hep-12 세포 대부분은 양성이지만, Hep-11 세포 대부분은 음성이다.
도 2는 1B50-1 양성 세포가 종양 개시 세포로서의 특성을 가짐을 보여주는, 동물 접종 실험 결과를 나타낸 것이다. 도 2 (A)는 여러가지 소스로부터 유래된 1B50-1 양성 세포에 의해 유발되는 NOD/SCID 마우스에서 발생된 종양을 나타낸 것이고; 도 2 (B)는 NOD/SCID 마우스에서 1B50-1 양성 세포에 의해 발생된 종양의 에오신-헤마톡실린 염색 결과로서, 이들 종양의 형태가 이들 1B50-1 양성 세포를 제공한 환자의 종양 조직 형태와 비슷함을 보여주며; 도 2 (C)는 유세포 측정 분석 결과로서, 정제한 1B50-1 양성 세포가 1B50-1 양성 세포와 1B50-1 음성 세포로 분화될 수 있음을 나타낸 것이고; 도 2 (D)는 실시간 형광 정량 RT-PCR의 결과로서, 1B50-1 양성 세포가 줄기 세포와 관련된 수종의 유전자들을 고도로 발현함을 보여준다.
도 3은 1B50-1에 의해 인지되는 CACNA2D1의 동정을 도시한 것이다. 도 3A는 면역침강 분석 결과를 나타낸 것이고; 도 3B는 CACNA2D1-myc를 발현하는 플라스미드로 형질전환된 1B50-1 음성 세포로서, Myc 및 1B50-1 염색이 세포막에 함께 위치함을 나타낸 것이다. Merge 패널은 Myc 염색과 1B50-1 염색을 겹친 것이다.
도 4는 간암 생검에서의 1B50-1의 면역조직화학적 염색 결과로서, 1B50-1 양성 세포가 종양 조직에 분산되어 있음을 보여준다. 도 4(A)는 암 조직, 암 주위 조직 및 정상적인 간 조직에 대한 대표적인 1B50-1의 면역조직화학적 염색 결과를 나타낸 사진이다. 화살표는 양성 세포를 나타낸다. 도 4(B-E)는 86쌍의 간암 생검의 1B50-1 염색 프로파일에 대한 카플란-메이어 생존 곡선으로서, 1B50-1 양성 세포가 암 주위 조직내 절단면 가장자리 (C 및 E)에는 존재하지만 간암 조직내에는 없다는 (B 및 D) 것이 수술 후 질병-관해 생존율 및 환자의 전체 생존율과 부정적인 상관관계에 있음을 보여준다. 도 4(F)는 다중-인자 분석 결과로서, 암 주위 조직의 절개면 가장자리에 1B50-1 양성 세포의 존재가 간암 예후를 예측하기 위한 부정적인 독립 인자임을 보여준다. a 카이 스퀘어 검정. 약어: 4y, 4년; Ca, 암 조직; CI, 신뢰구간; DFS, 질병-관해 생존율; OS, 전체 생존율; PCa, 암 주위 조직; RR, 상대적인 위험도.
도 5는 다양한 종양 세포주들에서 CACNA2D1 유전자의 발현을 나타낸 것이다. 도 5A는 여러가지 세포주들에서의 CACNA2D1 유전자 발현에 대한 RT-PCR 분석 결과이고; 도 5B는 여러가지 세포주들에서의 1B50-1 면역형광 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 인간 종양 조직 (T)와 정상적인 쌍을 이룬 암 주위 조직 (N)들의 생검에서의 CACNA2D1 발현의 분석 결과를 나타낸 것이다. 좌측 패널은 웨스턴 블롯 결과이고, 우측 패널은 밴드의 회색 스케일을 스캐닝하여 β-액틴으로 보정한 정량 결과이다. Ca, 암 조직; CaP, 암 주위 조직.
도 7은 NOD/SCID (비-비만 당뇨병성/중증 복합 면역-결핍) 마우스에서 인간 Hep-12 세포에 의해 유발된 이식된 종양의 증식에 대한 1B50-1 항체의 저해 효과를 나타낸 것이다. 도 7A는 여러가지 군의 세포에 의해 유발된 종양을 나타낸 것이고; 도 7B는 NOD/SCID 마우스의 여러 그룹들의 종양 증식 곡선이고; 도 7C는 여러 그룹들의 해부한 종양의 무게를 나타낸 것이고; 도 7D는 여러 그룹들의 해부한 종양의 체적을 나타낸 것이다.
도 8은 NOD/SCID 마우스에서 인간 HuH7 세포에 의해 유발된 이식된 종양의 증식에 대한 1B50-1 항체의 저해 효과를 나타낸 것이다. 도 8A는 여러가지 군의 세포에 의해 유발된 종양을 나타낸 것이고; 도 8B는 NOD/SCID 마우스의 여러 그룹들의 종양 증식 곡선이고; 도 8C는 여러 그룹들의 해부한 종양의 무게를 나타낸 것이고; 도 8D는 여러 그룹들의 해부한 종양의 체적을 나타낸 것이다.
도 9는 NOD/SCID 마우스에서 Hep-12 세포의 증식에 대한 CACNA2D1 유전자의 RNA 간섭에 의한 저해 효과를 나타낸 것이다. 도 9A는 RNA 간섭 후 1B50-1 염색 결과로서, 세포내 CACNA2D1의 유의한 감소를 보여주며; 도 9B는 RNA 간섭 후 동물에서의 종양 증식 곡선을 나타낸 것이고; 도 9C는 해부한 종양의 체적을 나타낸 것이고; 도 9D는 해부한 종양의 무게를 나타낸 것이다.
도 10은 QM-7 세포에서 발현된 단쇄 항체가 CACNA2D1 유전자 양성 세포에 결합할 수 있음을 보여주는 것이다.
본 발명은 아래 실시예들을 들어 보다 상세하게 설명될 것이다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예들로 한정되지 않는다.
아래 실시예들에서 사용되는 실험적인 방법들은 구체적으로 다른 것으로 명시되지 않은 한 모두 통상적인 방법들이다.
아래 실시예들에서 사용되는 재료 및 시약들은 구체적으로 다른 것으로 명시되지 않은 한 모두 통상적인 방법들이다.
시약 및 재료
환자 한명의, 원발성 간암 조직과 재발성 간암 조직으로부터 각각 유래된주 Hep-11 및 Hep-12를 일차 배양에 의해 확립하였다 (상기 세포 상에 대한 상세한 백그라운드는 하기 문헌을 참조함: Zhang Z, Xu X, Xing B, Wang Y, Han H, Zhao W. Identification and characterization of tumor-initiating cells with stem-like properties from a recurrent hepatocellular carcinoma [abstract], Proceedings of the 100th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, 2009 Apr 18-22; Denver, CO. Philadelphia (PA): AACR, 2009. Abstract nr 190; Xu XL, Xing BC, Han HB, Zhao W, Hu MH, Xu ZL, Li JY, Xie Y, Gu J, Wang Y,Zhang ZQ. The properties of tumor-initiating cells from a hepatocellular carcinoma patient's primary and recurrent tumor, Carcinogenesis, 2010; 31(2):167-74.). 간암 세포주 HuH7 (Japan Society for the Promotion of Science), HepG2 (ATCC), SMMC-7721; 유방암 세포주 ZR-75 (ATCC), MCF-7 (ATCC), MDA-MB-231 (ATCC), BICR-H1 (Professor Xinfu Huang from Beijing Cancer Hospital); 폐암 세포주 A549 (ATCC), Calu-3 (ATCC), Calu6 (ATCC), PG (Professor Bingquan Wu from School of Basic Medical Sciences, Peking University); 식도암 세포주 KYSE150, KYSE510 (Professor Fengmin Lu from School of Basic Medical Sciences, Peking University); 위암 세포주 BGC823, MGC803, SGC7901; 전립선암 세포주 PC3M1E7, PC3M2B4는 일반적인 세포주들로서, 본 발명자들의 실험실에 보관되어 있다.
임상 조직 생검은 베이징 암 병원에서 수술에서 적출한 생검이며, 병리학적 타입은 병리학적 의사가 파악하였다.
하이브리도마의 제조
a) 마우스 면역화 및 세포 융합: Hep-11 세포와 Hep-12 세포를 사용하여, 감법 면역화(subtractive immunization)를 통해 6주령의 암컷 Balb/c 마우스 (Vital River Laboratories Animal Technology Co., Ltd., Beijing)를 면역화하였다 (Brooks, P. C., Lin, J. M., French, D. L., and Quigley, J. P.. Subtractive immunization yields monoclonal antibodies that specifically inhibit metastasis. J Cell Biol，1993, 122, 1351-1359；Rasmussen, N., and Ditzel, H. J.. Scanning the cell surface proteome of cancer cells and identification of metastasis-associated proteins using a subtractive immunization strategy. J Proteome Res, 2009, 8:5048-5059). 거의 포화된 밀도의 Hep-11 세포를 PBS로 3번 세척한 다음, 세포 스크랩퍼로 세포를 모았다. 이들 세포를 원심분리한 후 멸균 PBS (~5 x 106 cells/ml)에 현탁하였다. 그런 후, 4 내지 6주령의 Balb/c 암컷 마우스에 준비한 현탁물을 0.5 ml/동물로 총 4마리에 복막내로 접종하였다. Hep-11 세포를 접종한 후 2일째와 4일째에 사이클로포스파미드 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)를 마우스에 복막내로 주입하였다 (200 mg/kg 체중). 18일째에, Hep-11 세포에 대한 상기한 방법과 동일한 방법으로 Hep-12 세포를 준비하였다. 각 마우스에 Hep-12 세포 (2.5 x 106 cells/0.5 ml PBS)를 복막내로 접종하였다. Hep-12 세포를 동량으로 총 3회 3주에 한번 주입하여, 면역화를 강화하였다. 마지막 면역화 강화 후 3일째에 비장을 적출하여, 세포 현탁물을 제조하였다. 이 세포를 108 SP2/0 세포 (ATCC)와 혼합하였다. 무혈청 RPMI1640 배지 (Invitrogen)로 2번 세척한 다음, 혼합한 세포를 통상적인 프로토콜에 따라 50% PEG4000 중에서 융합시켰다. 이들 세포를 HAT (Sigma-Aldrich)와 15% 소 혈청이 첨가된 1640 배지에 재현탁하였다. 그런 후, 세포를 96웰 플레이트에 접종하여, CO2 배양기에서 배양하였다. 5일 후, 배양 배지를 HAT와 15% 소 혈청이 첨가된 새로운 1640 배지로 교체하였다. 세포 융합 후 (하이브리도마의 증식에 따라) 약 2주 후에, 현탁물을 샘플링하여, 특정 항체를 분비하는 하이브리도마 클론을 테스트 및 스크리닝하였다.
b) 하이브리도마 클론들에서 서브클론을 테스트하고 스크리닝하였다: Hep11 및 Hep12 간암 세포주들을, HAT와 15% 소 혈청이 첨가된 1640 배지에서, 96웰 세포 배양 플레이트에 각각 접종하였다. 세포가 벽에 부착되어 모이게 되면, 상층액을 버리고, 0.125% 글루타르알데하이드가 첨가된 사전-냉각시킨 PBS를 첨가하였다. 플레이트를 5분간 실온에 둔 후, 액체를 비웠다. 세포를 PBS로 3번 세척하였다. 그 후, 탈지분유 5%가 첨가된 PBS를 플레이트에 첨가하여, 플레이트를 4℃에서 밤새 블럭킹하였다. 블럭킹 용액을 제거한 다음, 배양한 하이브리도마 클론과 상층액을 넣고, 플레이트를 다시 1시간 동안 실온에 두었다. 상층액은 버리고, 플레이트를 PBS로 2번 헹구었다. 말의 라디시 퍼옥시다제-표지된 염소-항-마우스 항체를 5% 탈지분유가 첨가된 PBS로 희석하여 잘 혼합하였다. 그 후, 이 혼합물을 상기 96웰 세포 배양 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 배양하였다. 그런 후, 상층액을 버리고, 플레이트를 PBS로 5번 헹구었다. ELISA의 기질 용액을 여기에 첨가한 후, 반응을 중지시키기 위해 오리지날 용액과 동일 부피로 12.5% 황산을 첨가할 때까지, 실온에서 암 조건 하에 30분간 반응을 지속시켰다. 플레이트를 ELISA 판독기에 장착하여, 492 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. Hep11에는 음성이고 Hep12에는 양성인 하이브리도마 클론들을 취하여, 제한 희석 방식으로 서브클로닝하였다. 3번의 연속 서브클로닝을 걸친 후에도 안정적인 양성인 하이브리도마 클론들을 대량으로 배양하고, 수득한 세포들은 냉동 상태로 보관하였다.
서브클로닝과 동정을 통해 30개 이상의 세포 염색물을 수득하였고, 이중 하나를 1B50-1로 명명하였다. 이 균주는 2010년 12월 8일자로 중국 일반 미생물 보존 센터 (CGMCC)에 기탁번호 CGMCC No. 4416으로 기탁하였다.
항체의 제조 및 정제
대량 배양한 후, 특이 항체 1B50-1을 분비하는 하이브리도마 클론들을 미리 프리스탄(Sigma-Aldrich)을 처리한 Balb/c 암컷 마우스에 마우스 당 2 x 106 개의 세포로 복막내로 접종하였다. 약 1주일 후에 마우스를 희생시키고, 향후 검사를 위해 복수를 취하였다. 1B50-1을 정제하기 위해 단백질 G 친화성 크로마토그래피를 통상적인 방식으로 수행하였다. 정제한 1B50-1의 농도를 아래 등식에 따라 계산하였다: 항체 (mg/ml) = OD280 x 0.6868. 항체의 순도는 SDS-PAGE로 분석하였으며, 전기영공(electrophoresis) 등급에 해당되는 순도를 가진 항체를 해당 실험에 사용하였다.
항체의 서브타입 결정
1B50-1 하이브리도마에서 분비되는 항체의 서브타입들을 마우스 단일클론 항체 이소타이핑 시약 (Cat# Iso2-1KT, Sigmal-Aldrich, St Louis, MO, USA)의 설명서에 권고된 절차에 따라 확인하였다. 서브타입-특이 항체들을 PBS에 1:1000의 비율로 ?M석한 다음, 96웰 테스트 플레이트에 웰 당 100 ㎕로 2세트로 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 배양한 다음 PBS로 3번 헹구었다. 그 후, 1B50-1 하이브리도마 상층액을 첨가하여, 플레이트를 1시간 배양한 다음 PBS로 3번 헹구었다. 말의 라디시 퍼옥시다제-표지된 염소-항-마우스 항체를 5% 탈지분유가 첨가된 PBS로 희석하여, 상기 테스트 플레이트에 첨가하였다. 플레이를 실온에서 1시간 인큐베이션한 다음, PBS로 5번 헹구었다. ELISA의 기질 용액을 여기에 첨가한 후, 반응을 중지시키기 위해 오리지날 용액과 동일 부피로 12.5% 황산을 첨가할 때까지, 실온에서 암 조건 하에 30분간 반응을 지속시켰다.
항체 1B50-1의 결정에 따르면, 반응물은 서브타입 IgG3와 강하게 양성으로 반응한 반면, 다른 서브타입들은 약한 양성 반응을 보이거나 음성 반응을 보였는데, 이는 항체 1B50-1이 서브타입 IgG3에 속한다는 것을 의미한다.
항체의 중쇄 가변부와 경쇄 가변부에 대한 클로닝 및 동정
1B50-1 하이브리도마 세포로부터 트리졸 방법에 의해 총 세포 RNA를 추출한 다음, 역전사효소 Superscript III (Invitrogen)를 사용하여 cDNA로 역전사하였다. 1B50-1의 중쇄 가변부와 경쇄 가변부를 각각, 중쇄 가변부용 5'말단 축중 프라이머(degenerate primer), 5'- CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC -3' + 5'- CTTCCGGAATTCSARGTNMA GCTGSAGSAGTCWGG -3', 중쇄 가변부용 3'-말단 프라이머 5'- GGAGGATCCAGGGACCAAGGGATAGAC AGATGG -3', 경쇄 가변부용 정방향 프라이머 5'- GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA -3' 및 경쇄 가변부용 역방향 프라이머 5'- TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTC -3'을 이용하여 PCR로 증폭시켰다. 증폭된 산물을 PCR 블런트 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하였다. 양성 클론을 선별하여, 양 방향으로 서열분석하였다. 코티아 표준 도메인 (Morea V, Tramontano A, Rustici M, Chothia C, Lesk AM. Antibody structure, prediction and redesign. Biophys Chem . 1997 Oct;68(1-3):9-16. Al-Lazikani B, Lesk AM, Chothia C. Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins. J Mol Biol . 1997; 273(4):927-48.)들을, http:// www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html에 제공된 툴을 이용하여, 수득한 아미노산 서열을 토대로 중쇄와 경쇄에서 확인하였다.
1B50-1의 가변부들로 구성된 단쇄 항체를 발현하는 벡터의 구축 및 발현
클로닝된 가변부를 확인하기 위해, 신호 펩타이드 MMP-3에 의해 유도되는 단쇄 항체를 발현하도록 벡터를 구축하였다. 이 벡터를 사용하여 QM-7 근모세포를 형질전환하였다. 유도성 분화를 수행한 후, 배지를 Hep-12 세포와 함께 배양한 다음, MYC가 달린 항체로 비간접 면역형광 염색을 수행하였으며, 따라서, 형질전환된 세포가 Hep-12 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 지를 확인할 수 있었다.
1B50-1에 의해 인지되는 항원의 동정
Hep-11 및 Hep-12 세포의 배양물들에서 배지를 제거한 후, 수득물을 각각 1B50-1 하이브리도마 배양물의 상층액에 첨가하였다. 이를 배양기에서 37℃에서 2시간 배양한 후, 배양 배지를 버리고, 세포를 PBS로 3번 헹구었다. 세포를 세포 스크랩퍼로 회수하여, 원심분리하였다. 그 후, 이들 세포를 탈이온수 5 ml에 재현탁하고, 초음파 처리를 수행하였다. 이들 세포에 2 x 라이시스 용액을 첨가한 후 다시 초음파 처리를 수행하였다. 이 용액을 4℃에서 10분간 10000 rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 취하여, 미리 평형화한 세파로스 4B-단백질 G (Pharmacia, Uppsala, Sweden) 친화성 크로마토그래피 컬럼에 주입하였다. 실온에서 1시간 둔 후, 컬럼을 PBS로 헹구었다. 0.1 M 글리신-HCl 완충액 (pH2.5)을 사용하여 결합된 항원들을 용리시켰다. 수득되는 용액을 1 M Tris-HCl (9.0)을 첨가하여 pH 7.0로 조정하였다. 그런 후, 2x SDS-PAGE 샘플링 완충액을 동량으로 첨가하여, SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 이를 코마시 브릴리언트 블루 R250으로 염색한 후, Hep12 세포에서 특이적인 발현을 나타내고 1B50-1으로 면역침강된 밴드를 잘라내어, 이를 이후 트립신으로 분해한 후 MALDI-TOF-MS 분석에 사용하였다.
CACNA2D1 유전자 발현을 분석하기 위한 역전사-PCR
배양 배지를 제거한 후, 거의 포화된 밀도의 세포를 PBS로 세척하고, 트리졸 방법으로 총 세포 RNA를 추출하였다. 총 세포 RNA 3 ㎍으로 역전사를 수행하여, 1 x 역전사 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 8.3, 75 mM KCl 및 3 mM MgCl2), 20 U의 RNase 저해제 (Promega, Madison, WI, USA), 10 mM DTT, 50 mM dNTP, 0.5 ㎍의 oligo-(dT)15 (Promega) 및 200 U의 설치류 백혈병 바이러스 역전사효소 (M-MLV-RT; Invitrogen)로 구성된 반응 시스템 20 ㎕에서 제1 가닥 cDNA를 합성하였다. PCR은 CACNA2D1 유전자에 대한 정방향 프라이머: 5'-ACAGCAAGTGGAGTCAATCA-3'와 역방향 프라이머: 5'-ACTGCTGCGTGCTGATAAG A-3'를 사용하여 Taq DNA 중합효소로 cDNA 1 ㎕에 대해 수행하였다. PCR은 다음과 같이 수행하였다: 94℃에서 5분 (사전-변성); 94℃에서 45초; 56℃에서 45초; 72℃에서 1분, 총 사이클 25회; 72℃에서 10분 (연장). 산물은 아가로스 겔 전기영동을 수행한 다음 에티듐 브로마이드로 염색하고, 자외선 조명 하에서 산물을 확인하고 사진 촬영하였다.
실시간 형광 정량 RT-PCR 분석
총 세포 RNA로부터 설치류 백혈병 바이러스 역전사효소 (M-MLV-RT; Invitrogen)에 의해 cDNA를 전사한 다음, SYBR Green PCR 형광 염료 혼합물 (Toyobo Co. Ltd., Osaka, Japan)을 이용하여 ABI7500 PCR 시스템에서 실시간 PCR 증폭을 수행하였다. 표 1에 프라이머들을 열거하였다. 유전자 발현의 배수 변화를 내부 대조 참조물로 GAPDH를 이용하여 2- ΔΔCt 방법으로 계산하였다 (Pfaffl, M. W.. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 2001，29：e45).
표 1. PCR 프라이머
유전자 센스 안티센스
Sox2 5'-ACATGAACGGCTGGAGCAAC-3' 5'-AGGAAGAGGTAACCACAGGG-3'
Oct-4 5'-GACAACAATGAAAATCTTCAGGAGA-3' 5'-CTGGCGCCGGTTACAGAACCA-3'
Nanog 5'-TGCCTCACACGGAGACTGTC-3' 5'-TGCTATTCTTCGGCCAGTTG-3'
AFP 5'-accatgaagtgggtggaatc-3' 5'-tggtagccaggtcagctaaa-3'
CACNA2D1 5'-ACAGCAAGTGGAGTCAATCA-3' 5'-ACTGCTGCGTGCTGATAAGA -3'
CEACAM6 5'-GAAATACAGAACCCAGCGAGTGC-3' 5'-CAGTGATGTTGGGGATAAAGAGC-3'
CTNNB 5'-TGATGGAGTTGGACATGGCC-3' 5'-CTCATACAGGACTTGGGAGG-3'
KLF4 5'-AAGCCAAAGAGGGGAAGAC-3' 5'-CATCTGAGCGGGCGAATTTC-3'
MDR-1 5'-GCCTGGCAGCTGGAAGACAAATAC-3' 5'-ATGGCCAAAATCACAAGGGTTAGC-3'
ABCG2 5'-GGAGGCCTTGGGATACTTTGAA-3' 5'-GAGCTATAGAGGCCTGGGGATTAC-3'
BMI1 5'-AGCAGCAATGACTGTGATGC -3' 5'-CAGTCTCAGGTATCAACCAG -3'
GAPDH 5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3' 5'-CTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3'
CACNA2D1 유전자 클로닝 및 발현 벡터 구축
CACNA2D1 유전자 (NM_000722.2; 칼슘 채널, 전압-의존형, α 2/δ 서브유닛 1)를 유전자은행에 기재된 서열에 따라 3파트로 나누었으며, 다음과 같은 3쌍의 프라이머를 설계하였다:
제1 부위의 정방향 프라이머: 5'-CCGgaattcTATGGCTGCTGGCTGCCTGCTGG-3',
제1 부위의 역방향 프라이머: 5'-AACCATTAGGATCGATTGCAAAG-3';
제2 부위의 정방향 프라이머: 5'-TGTGTACCTGGATGCATTGGAACTG-3',
제2 부위의 역방향 프라이머: 5'-ACCATCATCCAGAATCACACAATC-3';
제3 부위의 정방향 프라이머: 5'-AGAGACATATGAGGACAGCTTC-3',
제3 부위의 역방향 프라이머:
5'-GTCGACTACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCCTCGAGTAACAGGCGGTGTGTGCTG-3'.
유전자의 전장을 망라하는 3개의 단편들을 주형으로서 Hep-12 세포의 cDNA를 이용하고 전술한 프라이머를 이용한 PCR로 증폭시켰다. 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 정제한 다음, 서열분석을 위해 벡터 PCR-블런트에 도입하였다. 이들 3개의 단편들을 적절한 효소로 절단하여, 중간 벡터(들)에 연결하고, 최종적으로 완전한 전장 유전자 CACNA2D1을 수득하였다. 전장 CACNA2D1 유전자를 벡터 pcDNA3.0-mychis (Invitrogen 사의 pcDNA3.0을 기초로, 본 발명에서 구축함)에 클로닝하였다.
유전자 형질전환
세포를 접종하여, 다음날까지 포화 밀도 (80 내지 90%)로 배양하였다. 이들 세포를 권고된 프로토콜에 따라 리포펙타민 2000 (Invitrogen)을 통해 구축한 벡터 CACNA2D1 mychis/pcDNA3.0로 형질전환하였다. 형질전환 후 24시간 및 48시간째에 면역형광 염색 세포화학법으로 유전자 발현을 분석하였다.
세포의 면역형광 염색
배양한 세포를 트립신 : EDTA로 분해하여, 단일 세포 현탁물을 제조하였였다. 세포 2 x 106 개의 현탁물을 취하고, 정제 항체 1B50-1을 첨가하였다 (1:100 비율로 희석된 것임, 원액은 1 mg/ml임). 이 혼합물을 37℃에서 1시간 인큐베이션한 다음 PBS로 3번 세척하였다. 그런 후, FITC-표지된 염소-항-마우스 IgG 이차 항체 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA, 0.5 mg/ml; 1:100로 희석)를 첨가하여, 1시간 반응시켰다. PBS로 헹군 다음, 세포를 레이카 SP5 공초점 레이저 현미경에서 검경하거나, Aria 유세포 측정기로 분석 및 분류하였다. CACNA2D1 mychis/pcDNA3.0로 형질전환된 세포를 단일클론 1b50-1과 토끼 다클론 mys 항체로 2중 염색하였다. 로다민-표지된 염소-항-마우스 IgG와 FITC-표지된 염소-항-토끼 IgG를 각각 이차 항체로 사용하였다.
면역조직화학적 염색
냉동 유지시킨 임상적인 암 주위 조직과 간 암 조직 단편을 30초간 메탄올로 고정한 다음, 5% 탈지 분말로 블록킹하였다. 단편을 단일클론 항체 1B50-1 (1:100으로 희석함, 5% BSA 함유)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, PBS로 헹구었다. 그 후, FITC-표지된 염소-항-마우스 IgG를 이용하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 단편들을 PBS로 헹구고, DAPI (1:2000)로 5분간 핵소체(nucleoli)를 염색하였다. 단편들을 글리세롤 중의 2% DABCO를 이용하여 올려놓고, 레이카 SP5 공초점 레이저 현미경에서 검경하였다.
웨스턴 블롯 분석
조직 또는 배양한 세포를, 1 mM PMSF, 완전 프로테아제 저해제 칵테일 및 포스파타제 저해제 칵테일 (Roche, Mannheim, Germany)로 이루어진 혼합물이 포함된, 라디오 면역-침강 분석 완충액 (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd)에서 라이시스시켰다. 10% SDS-PAGE에서 전기영동한 후, 단백질을 Immobilon-P 막 (Millipore)으로 이동시켰다. 막을 5% 탈지 분말로 블록킹한 후, 단백질을 일차 항체 CACNA2D1 (Abcam, Cambridge, MA) 또는 내부 참조 β-액틴에 대한 특이 항체 (Roche Applied Science)와 반응시킨 다음, HRP-표지된 염소-항-마우스 이차 항체 (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA)와 반응시켰다. 화학 발광 방법(chemical luminance method)을 통해 ImmobilonTM 웨스턴 화학발광 HRP 기질 (Millipore)로 양성 신호를 검출하였다. 밴드의 신호를 ChemiImager 스캐너 (Alpha Innotech)로 스캐닝하고, 회색 스케일을 소프트웨어 AlphaEaseFC를 사용하여 정량 및 분석하였다. CACNA2D1의 상대적인 양을 내부 참조 물질로서 β-액틴의 회색 스케일을 이용하여 계산하였다.
CACNA2D1 유전자에 대한 RNA 간섭용 렌티바이러스 벡터의 구축, 패키지 및 감염
CACNA2D1 유전자를 간섭하기 위한 RNA 서열을 설계하여 Origene 사에서 합성하였다. 레트로바이러스계 벡터를 프로모터로서 U6 프로모터를 사용하여 구축하였으며, 이때 서열 1은 CACNA2D1의 코딩 서열에서 546-574번 뉴클레오티드들 ACTCAACTGGACAAGTGCCTTAGATGAAG이며, 서열 2는 상기 코딩 서열에서 116-144번 뉴클레오티드들 AGATGCAAGAAGACCTTGTCACACTGGCA이다. Origene에서 무작위 합성한 동일 길이의 핵산들을 대조군 서열로 사용하였다. 이들 서열을 보유한 벡터를 각각 EcoRI과 SalI으로 자른 다음, U6 프로모터와 이들 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편들을 아가로스 겔 전기영동을 통해 분리 및 정제하였다. 제조한 단편들을, 동일 엔도뉴클레아제로 절단한 Plenti6-링커 벡터 (ClaI 및 AgeI으로 자른 Invitrogen 사의 plenti6 벡터에 다중 클로닝 사이트가 포함된 링커를 도입함으로써 수득함, 이는 본 발명자들의 실험실에 보관 중임)에 연결하였다. 확인하여, 렌티바이러스 플라스미드 벡터들 plenti6U6CACNA2D1ShRNA-1, plenti6U6CACNA2D1ShRNA-2 및 plenti6U6-대조군을 수득하였다. 렌티바이러스의 패키징은 Invitrogen 사에서 제공한 권고 프로토콜을 정확하게 따라 수행하였다. 렌티바이러스 입자가 포함된 상층물을 사용하여 Hep-12 세포를 직접 감염시켰다. 48시간 후, 6 ㎍/ml 블라스티시딘 (Invitrogen)을 첨가하여, 렌티바이러스에 감염된 세포를 스크리닝하고, 3일마다 배지를 새 배지로 교체하였다. 이런 방식으로, 상기 렌티바이러스로 감염된 세포 집단을 수득하고, 전체 실험 기간 동안 지속적으로 6 ㎍/ml로 포함된 블라스티시딘을 사용하여, 세포에 대한 스크리닝 압박(screening pressure)을 유지시켰다. 유전자 CACNA 2 D 1 에 대한 저해 효과를 RT-PCR과 면역형광 세포화학 염색에 의해 감염된 세포에서 추가로 관찰하였다. 또한, 종양 형성 및 증식에 대한 저해 효과를 면역결핍 동물을 대상으로 한 종양발생 실험을 통해 관찰하였다.
동물에서의 종양 개시 및 종양에 대한 항체의 저해 효과
종양 개시 실험: 종양 개시 세포의 종양 개시력과 자가-재생력을 분석하기 위한 실험에서, 여러가지 소스로부터 유래되며 유세포 분류를 통해 분류한, 1B50-1 양성 세포 또는 1B50-1 음성 세포를 다양한 양 (104, 103, 102)으로 Matrigel (BD Biosciences) (1:1)과 동일 부피로 혼합하고, 혼합물을 사용하여 4-6주령의 NOD/SCID 마우스 (Vital River Laboratories Animal Technology Co., Ltd., Beijing, SPF)에 피하 접종하였다 (항체 음성 세포는 마우스의 한 쪽에 접종하고, 항체 양성 세포는 동일 마우스의 다른 쪽에 접종하였음). 각 그룹은 동물 5마리로 이루어진다. 매주 종양의 증식을 관찰하였다. 그런 후, CACNA 2 D 1 을 저해한 후 동물에서 종양 형성 및 종양 증식에서의 변화를 관찰하기 위한 실험으로, 세포 2 x 106개를 NOD/SCID 마우스에 피하 접종하였다. 종양이 눈으로 보이는 크기로 커지면, 종양의 장축과 단축을 3일마다 측정하였다. 종양의 크기를 등식: '종양의 크기 = 장축 x 단축2/2'으로 계산할 수 있으며, 데이타를 사용하여 성장 곡선을 작성하였다.
종양에 대한 항체의 저해 효과: 4-6주령의 NOD/SCID 마우스에 간암 세포 2 x 106개를 피하 접종하였다. 종양이 눈으로 보이는 크기 (약 0.02-0.03 cm3)로 커지면, 동물들을 그룹 당 동물 6마리로 구성된 몇몇 그룹으로 무작위 분류하였다. 이들 동물에 2일에 한번 PBS, 대조군 IgG (800 ㎍/동물, Zhongshan Golden Bridge Biotechnology) 및 1B50-1 (동물 당 각각 200, 400 및 800 ㎍)을 각각 복막내로 주입하였다. 장축과 단축을 버니어 캘리퍼 (vernier caliper)로 각 주입 전에 측정하고, 종양의 크기를 등식: '종양의 크기 = 장축 x 단축2/2'으로 계산하였다. 총 7회 투여 후, 마지막 투여한 다음날 동물을 희생시켰다. 종양을 적출하여, 습중량 (wet weight)과 크기를 각 종양에서 측정하였다.
적용 효과
효과예 1: 1B50-1은 막 상의 항원을 인지하며, 간암 세포주들간에 양성 비율은 상이함
감법 면역화를 통해 하이브리도마를 제조하고, Hep-11 세포와 Hep-12 세포를 통해 스크리닝하였다. 3번 융합 후, Hep-12 세포에 잠재적으로 특이적인 단일클론 항체 37종을 1차 라운드에서 수득하였다. 이들 항체를 추가로 서브클로닝과 예비 분석을 수행하였다. 세포 막 상에 위치한 항체를 분비하는 하이브리도마를 1B50-1으로 명명하였다 (도 1). 1B50-1 양성 세포들의 비율을 여러가지 간암 세포주들과 간암에 걸린 임상 생검의 일차 배양으로부터 기원한 세포들에서 유세포 측정으로 분석하였다. 그 결과를 표 2에 열거하였다. 종양 개시 세포가 풍부한 재발성 간세포 암으로부터 유래된 Hep-12 세포는 1B50-1 양성 비율이 상대적으로 높은 반면, 다른 세포들은 비율이 낮았다.
표 2. NOD/SCID 마우스에서 1B50-1 양성 세포의 양과 종양 개시능
세포 1B50-1+ 세포 퍼센트 # 1B50-1 양성 1B50-1 음성
103 102 103 102
HuH-7 0.9-2.2 5/5 5/5 3/5* 0/5
Hep-11 0.4-0.7 5/5 1/5 0/5 0/5
Hep-12 92.1-94.8 5/5 5/5 3/5* 0/5
HepG2 0.5-2.1 4/5 4/5 0/5 0/5
SMMC7721 0.5-0.6 5/5 5/5 0/5 0/5
Case-1 1.7-3.3 5/5 5/5 3/5* 0/5
Case -2 0.6-2.1 3/5 2/5 0/5 0/5
Case -3 0.4-1.8 5/5 3/5 5/5* 1/5
Case -4 0.6-1.3 2/5 0/5 0/5 0/5
# 2-8번의 유세포 측정을 토대로 한 결과;
* 형성된 종양은 대응되는 양성 세포 보다 훨씬 작았음.
효과예 2: 1B50-1에 의해 인지되는 양성 세포는 종양 개시 세포로서의 특성을 가진다
Hep-11, Hep-12, HuH7, HepG2 및 SMMC-7721을 비롯하여 간세포 암 세포주 5종으로부터 유세포 측정을 통해 1B50-1 양성/음성 세포들을 분류하였다. 선택한 세포 100 또는 1000개 (항체 음성 세포는 마우스의 한 부위에 접종하고, 항체 양성 세포는 동일 마우스의 다른 부위에 접종함)를 NOD/SCID 마우스에 피하 주입하였다. 12-18주 후, 100-1000개의 1B50-1-양성 세포는 피하에 종양 발생을 시작하는데 충분하였지만, 음성 세포는 증식하지 못하거나 작은 결절로 증식하였는데 (표 2, 도 2), 이는 1B50-1 양성 세포가 종양 개시 세포로서의 특성을 가지고 있다는 것을 의미한다. 임상적인 간암 조직의 일차 배양물에서 분류한 1B50-1 양성/음성 세포를 이용한 종양 개시 실험에서도 유사한 결과가 확인되었다 (표 2). 1B50-1 양성 Huh7 세포에 의해 유발된 종양에서 유세포 측정을 통해 1B50-1 양성 세포를 분류하여, NOD/SCID 마우스에 피하 접종하였다. 이들 1B50-1+ 세포는 100% (5/5)가 종양을 형성할 수 있는 것으로 나타났는데, 이는 1B50-1+ 세포가 자가-재생력을 가지고 있음을 시사해준다. 1B50-1 양성 세포와 음성 세포에서 줄기 세포와 관련된 유전자들의 발현을 실시간 정량적인 형광 RT-PCR로 분석하였다. 1B50-1+ 세포에서 Nanog, Sox-2, AFP 및 ABCG2 등의 줄기 세포 관련 유전자들이 높은 수준으로 발현되었다는 것이 확인되었다 (도 D). 1B50-1 양성 세포들을 10% 소 태아 혈청이 첨가된 배지에서 배양하고, 1B50-1 양성인 세포의 퍼센트를 분석하였다. 1B50-1+ 세포의 퍼센트는 모 세포에서 측정되는 수준으로 감소된 것으로 나타났으며 (도 2C), 이는 1B50-1 양성 세포가 1B50-1 양성 세포와 1B50-1 음성 세포 둘다로 분화될 수 있다는 것을 의미한다. 이들 결과들은, 1B50-1 양성 세포가 종양 개시 세포로서의 특성을 가지고 있음을 시사해준다.
효과예 3. 1B50-1에 의해 인지되는 항원은 CACNA2D1이다
Hep-12 세포에서 1B50-1에 의한 면역침강을 통해 약 150 kDa의 특이적인 밴드가 수득되었다 (도 3의 좌측 패널, 화살표는 밴드를 표시함). MS 분석을 통해, 이 단백질이 CACNA2D1이라는 것이 확인되었다. 대응되는 유전자를 주형으로서 Hep-12 세포의 cDNA를 이용한 PCR로 증폭시켰다. 통상적인 DNA 재조합을 통해, 증폭시킨 유전자의 C 말단에 MYC 텍 펩타이드의 코딩 서열을 첨가하였다. 그런 후, 이 유전자를 진핵생물 발현 벡터인 pcDNA3.0mychis에 도입한 다음, 이 유전자를 발현하지 않는 세포에 상기 벡터를 형질전환시켰다. 그 후, 다클론 MYC 항체와 1B50-1을 이용하여 이중 염색을 수행하였다. 그 결과, MYC 텍과 1B50-1에 특이적인 항체들이 상기 형질전환된 세포의 세포 표면 상에 일치되게 위치되어 있는 것으로 확인되었는데, 이는 1B50-1이 CACNA2D1을 인지한다는 것을 의미한다 (도 3의 우측 패널).
효과예 4. 임상 간암 생검에서의 유전자 CACNA2D1의 발현
임상적인 간세포성 암종 사례들의 신선한 생검에 대한 암 또는 쌍을 이룬 암 주위 조직으로부터 냉동 보존시킨 단편을 수득하였다 (환자 총 86명). 이들 단편들을 고정한 다음, 면역형광 조직화학법으로 1B50-1으로 염색하였다. 그 결과는 도 4와 표 2에 나타낸다. 상기 사례들 중 72.1% (86건 중 62건)는, 1B50-1 양성 세포가 병소에 분산되어 있었다 (도 4). 암 주위 조직에서의 양성 세포의 검출율은 암 조직에서의 결과 보다 낮은 46.5% (40/86)였다. 정상 간 생검 (혈관종 관련 수술에서 적출된 생검으로부터 유래함) 5종에서는, 1B50-1 양성 세포의 존재는 검출되지 않았다. 암 병소와 암 주위 조직의 경우, 1B50-1 양성 세포를 환자의 임상 지수와 함께 통계학적으로 분석하였다 (표 3). 암 병소에서의 1B50-1 양성 세포의 존재는 연령, 성별 및 간경화의 발생 등의 지수와 무관하였다. 그러나, 암 주위 조직내 1B50-1 양성 세포는 간경화 발병, 수술 후 4년 미만의 생존율 및 2년내 재발율과 확실한 상관성이 있었다. 카플란-마이어 곡선과 콕스의 회귀 모델을 이용한 다변량 분석을 통해, 1B50-1 양성 세포가 간암 환자의 암 주위 조직에 존재하는 것은, 환자의 수술 후 무병 생존율 및 전체 생존율이 암 주위 조직에 1B50-1 음성 세포가 존재하는 환자 보다 좋지 않다는 것을 예측하는 것임이 확인되었다 (도 4). 암 주위 조직은 실제 적출된 암의 가장자리에서 기원한 것이므로, 1B50-1 양성 세포의 암 주위 조직내 존재 여부는 환자에서 재발과 예후를 예측하는데 이용할 수 있다. 즉, 암 주위 조직내 1B50-1 양성 세포의 존재는 HCC 예후 지표로 사용할 수 있다.
표 3. 간암 환자에서 1B50-1 염색 및 임상 증상들 간의 상관성 분석
변수 건수 암 주위 조직내 1B50-1 양성 1 암 조직내 1B50-1 양성 1
사례 퍼센트 p 값2 사례 퍼센트 P 값2
성별 0.223 0.960
남성 75 33 44 54 72
여성 11 7 63.6 8 72.7
연령 0.733 0.063
≤ 60 63 30 47.6 42 66.7
> 60 23 10 43.5 20 87.0
간경화 0.002 0.448
없음 27 6 22.2 18 66.7
있음 59 34 57.6 44 74.6
종양의 크기 0.141 0.171
≤ 5 cm 46 18 39.1 36 78.3
> 5 40 22 55 26 65
종양의 크기 0.535 0.109
≤ 3 cm 21 11 52.4 18 85.7
> 3 65 29 44.6 44 67.7
림프 혈관 종양 색전 0.170 0.635
없음 64 27 42.2 47 73.4
있음 22 13 59.1 15 68.2
생존율 0.00005 0.810
< 4년 34 25 73.5 25 73.5
≥ 4년 52 15 28.8 37 71.2
재발 0.00004 0.893
≤ 2년 42 29 69.0 30 71.4
≥ 4년 44 11 25 32 72.7
총 86 40 46.5 62 72.1 0.0006*
1) 1B50-1 염색에 양성이 세포가 하나 이상 존재하는 단편은 1B50-1 양성으로 규정함.
2) 카이-스퀘어 검정법
* 종양 조직 그룹 대 암 주위 조직 그룹.
효과예 5. 위암, 식도암, 유방암 및 폐암 세포주들에서의 CACNA2D1 유전자의 발현
위암, 폐암, 유방암 및 전립선암 등의 간암 이외의 흔하게 발생하는 암의 세포주들에서 CACNA2D1 유전자의 발현을 RT-PCR로 검출하였다. 그 결과는 도 5A에 나타내었다. 양성 밴드가 위암 세포들 중에서도 MGC-803와 SGC7901에서 확인되었고; 폐암 세포들 중에서는 PG와 A549에서; 유방암 세포들 중에서는 BICR-H1과 MDA-MB-231에서 확인되었다. 전이성이 높은 PC3M1E7 전립선 암에서는 상기 유전자가 높은 수준으로 발현되었지만, 전이성이 낮은 PC3M2B4 세포에서는 밴드가 검출되지 않았다. 그 결과, 세포들이 모두 양성인 것은 아니더라도, 상기 유전자가 대부분의 암들에서 일부 세포에서 실제 명확하게 발현되며, 간암 사례에서 관찰되는 결과와 비슷한 결과를 보인다는 것이, 확인되었다. 상기 전이성이 높은 양성 세포는, 상기 유전자가 종양의 전이와 확실한 상관성이 있을 수 있음을 시사해준다. 아울러, 일부 세포에 대한 면역형광 세포화학 염색에서 1B50-1을 사용하였다. CACNA2D1가 SGC7901 위암 세포, KYSE-510 및 KYSE-150 식도암 세포, 및 ZR-75 유방암 세포에서 명확하게 발현되었으며, 세포 막 상에 위치하는 것으로 확인되었다. 양성 세포의 수는 여러가지 세포주들 간에 큰 차이를 나타내었으며, 양성 세포는 이들 세포주들에서 낮은 퍼센트에 불과하였다 (도 5B). 상기한 결과들은 간암에서 관찰된 결과들과 유사하였으며, 이는 간암에서의 발견 사실들이 어쩌면 다른 종양에도 적용될 수 있음을 시사해준다. 즉, CACNA2D1은 종양 진단과 종양 치료에 분자 타겟으로서 사용가능할 수 있다.
효과예 6. 다른 종양 조직 생검에서의 1B50-1 양성 세포의 분포 및 웨스턴 블롯 분석
간암 조직에서 수득한 결론이 다른 유형의 종양에도 적용가능한지를 추가적으로 확인하기 위해, 임상 결장직장암, 신장암, 폐암 및 식도암 뿐만 아니라 이들의 쌍을 이룬 암 주위 조직에 대해 면역조직 염색을 수행하였으며, 각 타입의 암에 대해 10쌍을 사용하였다. 1B50-1 양성 세포의 분포는 간암에서의 결과와 비슷하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다. 암 조직에 1B50-1 양성 세포가 존재하는 경우가 암 주위 조직에 1B50-1 양성 세포가 존재하는 경우 보다 많았다. 그러나, 이들 경우는 통계학적으로 분석하기에는 그 수가 매우 적었다. 면역조직화학법으로 수득한 결과들을, 시판되는 CACNA2D1 특이 항체를 이용한 임상 조직에 대한 웨스턴 블롯을 수행하여, 추가로 조사하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 일부 암 조직들에서는 CACNA2D1의 발현이 암 주위 조직에서 보다 확실히 높았는데 (CACNA2D1의 발현 수준은 여러가지 타입의 종양들 간에 차이가 있었음), 이는 CACNA2D1이 암이 개시될 때 보다 높은 수준으로 발현된다는 것을 의미한다. 간암 뿐만 아니라 다른 암들에서도 CACNA2D1의 고 발현성이 존재하였다. 따라서, CACNA2D1을 겨냥하는 약물 및 분자 마커들은 간암 이외의 암에도 사용할 수 있다.
표 4. 여러가지 종양 조직들과 암 주위 조직들에서의 1B50-1 양성 세포의 검출
암 총 건수 양성으로 검출된 암 조직이 존재하는 사례의 수 양성으로 검출된 암 주위 조직이 존재하는 사례의 수
결장직장암 10 8 3
폐암 10 3 0
신장암 10 4 1
식도암 10 1 0
효과예 7. 간에 종양을 가지고 있는 간암 마우스의 증식에 대한 1B50-1의 저해 효과
Hep-12와 HuH7 간 암세포를 면역결핍 동물에 각각 피하로 접종하였다. 종양의 크기가 0.02-0.03 cm3로 커지면, 1B50-1을 여러가지 함량으로 동물의 복막내로 주입하였다. 표 및 도면에 나타낸 바와 같이, Hep-12 및 HuH-7 간암 세포주들에 대한 종양 저해율은, 800 ㎍/마우스 1B50-1 처리군에서, 높게는 각각 (무게로 측정시) 80.4% 및 65.5%이었다. 이러한 저해율은 용량 의존적이었으며, PBS 대조군과 IgG 처리군과 통계학적으로 유의한 차이를 나타내었다.
효과예 8. ShRNA는 Hep-12 세포에서 CACNA2D1의 발현을 저해하며, 동물에서의 증식을 추가로 방지한다.
1B50-1에 의해 인지되는 항원 CACNA2D1이 종양 치료의 타겟 분자인지를 검증하기 위해, CACNA2D1 간섭용 RNA를 발현하는 렌티바이러스 벡터 plenti6U6CACNA2D1shRNA-1과 plenti6U6CACNA2D1shRNA-2를 구축하였으며, 대조군으로서 plenti6U6를 렌티바이러스에 도입하였다. 이들 벡터를 사용하여 Hep-12 세포를 감염시키고, 블라스티시딘 (Invitrogen)을 사용하여 감염된 세포를 스크리닝하였다. 1B50-1에 대한 면역형광 세포화학 염색 (도 9A)에서, 세포가 CACNA2D1 간섭용 RNA를 포함하는 렌티바이러스 2종으로 감염되었을 때, CACNA2D1의 발현이 명확하게 억제되며, 세포 막에서 매우 드물게 양성의 형광 점들이 나타나는 것으로 확인되었다. 형광 강도는 대조군에서는 매우 높았고, 대부분의 세포들에서 신호가 확인되었다. 상기와 같이 렌티바이러스로 감염된 세포를 마우스 당 세포 2 x 106 개로, 그룹 당 동물 5마리로 이루어진 NOD/SCID 마우스에 피하로 접종하였다. 종양의 형성을 관찰하였다. 도 9B에 나타낸 바와 같이, CACNA2D1 간섭용 RNA를 보유한 2종의 렌티바이러스로 감염된 세포는 대조군 벡터에 비해 동물에서 느리게 증식하였다. 종양 저해율은 각각 (무게로 측정시) 57.5% 및 59.6%이었다. t 검정에서의 p 값은 대조군 대비 각각 0.0164 및 0.014였다. 이러한 결과들은, CACNA2D1의 발현 저해가 실제 Hep-12 세포의 생체내 증식을 억제한다는 것을 시사한다. 따라서, CACNA2D1은 종양을 치료하기 위한 분자 타겟이었다.
효과예 9. 진핵생물 세포에서 발현시킨 단쇄 항체는 Hep-12 세포를 인지할 수 있다
QM-7 세포에서 발현시킨 1B50-1의 단쇄 항체가 포함된 상층액을 Hep-12 세포와 함께 인큐베이션하였다. 염색에서 MYC-텍이 달린 9E10을 일차 항체로 사용하였고, FITC-텍이 달린 염소-항-마우스를 이차 항체로 사용하였다. 염색은 형광 현미경 하에서 검경하였다. Hep-12 세포의 세포 표면 상에 존재한 단백질은 MYC-텍이 달린 9E10에 의해 인지할 수 있었다 (도 10). 형광 염색 패턴은 1B50-1의 경우와 동일하였는데, 이는 발현된 단쇄 항체가 1B50-1과 유사한 결합 활성을 가지고 있다는 것을 의미한다. 또한, 이 결과는, 1B50-1의 경쇄 가변부와 중쇄 가변부가 올바른 서열로 클로닝되었다는 것을 추가로 검증해 주었다. 항체-약물에 대한 변형을 유전자 조작을 통해 이들 서열을 기반으로 추가로 수행할 수 있었다.
본 발명의 구체적인 구현예들이 기술되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 원리나 사상으로부터 이탈되지 않는 범위내에서 다양한 변형과 수정을 가할 수 있다는 것을 알 것이다. 즉, 본 발명은 첨부된 청구항과 이의 등가 범위로 규정되는 범위내에서 이러한 변형과 수정들을 모두 포괄하는 것으로 의도된다.
본 발명을 통해 종양 개시 세포의 마커들을 발굴, 식별 또는 동정할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법을 통해 동정된 마커는 종양을 진단, 치료 및 예방하는데 사용할 수 있다. 특히, 본 발명을 이용하여 종양 개시 세포에 특이적인 마커를 동정할 수 있으며, 이 마커를 종양 개시 세포에 대한 치료학적 제제의 제조와 진단, 치료 및 예후 예측 전략 확립에 사용할 수 있다. 이들 모두 종양 재발 및 전이와 같은 문제점을 해결하는데 도움이 될 수 있으며, 종양 정복에 대한 유망한 전략을 제공해준다. 나아가, 본 발명에 제공되는 CACNA2D1을 특이적으로 인지하는 단일클론 항체 또는 이의 단일클론 단편은 종양 또는 CACNA2D1 단백질-관련 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는데 직접 사용할 수 있다. 또한, 상기 단일클론 항체 또는 이의 단일클론 단편은 약학 조성물 및 진단 키트의 제조에도 사용할 수 있다.
China General Microbiological Culture Collection Center CGMCC4416 20101208
SEQUENCE LISTING <110> Beijing Institute for Cancer Research <120> Antibody and Antigen Recognizing Tumor-Initiating Cells and Use Thereof <150> CN201110042166.6 <151> 2011-02-22 <160> 8 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Mouse (Mus musculus) <220> <221> Complementarity determining region 1 of heavy chain of the antibody (CDRH1) <222> (1)...(7) <400> 1 Thr Ser Gly Met Gly Val Ser 7 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Mouse (Mus musculus) <220> <221> Complementarity determining region 2 of heavy chain of the antibody (CDRH2) <222> (1)...(16) <400> 1 Gln Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Ser 16 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Mouse (Mus musculus) <220> <221> Complementarity determining region 3 of heavy chain of the antibody (CDRH3) <222> (1)...(9) <400> 1 Arg Gly Thr Gly Thr Phe Pro Asp Val 9 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Mouse (Mus musculus) <220> <221> Complementarity determining region 1 of light chain of the antibody (CDR L1) <222> (1)...(11) <400> 1 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His 11 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mouse (Mus musculus) <220> <221> Complementarity determining region 2 of light chain of the antibody (CDR L2) <222> (1)...(7) <400> 1 Tyr Ala Ser Asp Ser Ile Ser 7 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Mouse (Mus musculus) <220> <221> Complementarity determining region 3 of light chain of the antibody (CDR L3) <222> (1)...(8) <400> 1 Leu Gln Thr Asn Ser Trp Pro Trp 8 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> Sequence 1 for RNA interfering of target gene <222> (1)...(29) <400> 1 ACTCAACTGG ACAAGTGCCT TAGATGAAG 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> Sequence 2 for RNA interfering of target gene <222> (1)...(29) <400> 1 AGATGCAAGA AGACCTTGTC ACACTGGCA 29

Claims (43)

  1. CACNA2D1 의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, CACNA2D1을 발현하는 암의 치료용 조성물로서,
    상기 CACNA2D1의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은, CACNA2D1 에 특이적인, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드, 핵산, 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 하기 특성을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물:
    (1) 종양 세포 상의 CACNA2D1에 대한 특이적인 결합성;
    (2) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하는 종양 세포는 종양 줄기 세포의 특성을 가짐; 및
    (3) 생체내 CACNA2D1-발현성 종양 세포의 증식 저해성.
  3. 제1항에 있어서, 상기 CACNA2D1을 발현하는 암은 간암, 결장암, 직장암, 신장암, 식도암, 위암, 폐암, 유방암, 또는 전립선암인, 조성물.
  4. CACNA2D1의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 종양 줄기 세포의 증식 억제용 조성물로서,
    상기 CACNA2D1의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은, CACNA2D1 에 특이적인, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드, 핵산, 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항체는 하기 특성을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물:
    (1) 종양 세포 상의 CACNA2D1에 대한 특이적인 결합성;
    (2) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하는 종양 세포는 종양 줄기 세포의 특성을 가짐; 및
    (3) 생체내 CACNA2D1-발현성 종양 세포의 증식 저해성.
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