CN114292918A - 一种基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及前列腺癌技术领域，具体地说，涉及一种基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法。其包括以下步骤：对患者尿液标本进行采集；对尿液标本通过离心机进行处理；采用TRlzol法提取RNA，并对提取的RNA进行纯度分析，用DEPC水稀释并测其浓度；将RNA进行转录组的逆转录与扩增，生成cDNA；S1.5、将cDNA用无酶水稀释10倍后用于实时聚合酶链反应；采用贴壁细胞培养方法进行细胞培养；对细胞进行冻存与复苏；进行统计学分析；该基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法中，LncRNA546可作为前列腺癌早期诊断的新型生物标志物，可根据LncRNA546构建Logistic回归模型，绘制nomogram用于预测患前列腺癌概率。

Description

一种基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法

技术领域

本发明涉及前列腺癌技术领域，具体地说，涉及一种基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法。

背景技术

前列腺癌发病率逐年升高，传统的检测PSA的诊断方式特异性较低，导致大量患者进行非必要前列腺穿刺，故而寻找无创的特异性好的早期诊断方式尤为重要。

早期局限性前列腺癌的5年生存率接近100％，而晚期转移性前列腺癌仅仅为28％，因此早期诊断前列腺癌尤其重要。早期前列腺癌常无任何症状，直肠指检(DRE)、经直肠超声检查(TRUS)联合前列腺特异性抗原(PSA)检查是目前公认的前列腺癌早期筛查方法。

DRE操作方便，相对无创，但DRE受操作者经验水平影响较大，敏感性较低，且发现时往往已到中晚期，只能作为辅助诊断方式。典型的前列腺癌可在TRUS表现为外周带的低回声结节，通过TRUS可初步判断肿瘤的体积大小及位置，但TRUS对诊断前列腺癌的特异性较低，部分前列腺肿瘤表现为等回声结节，且常需与急性或慢性前列腺炎、前列腺增生(BPH)、前列腺上皮内瘤变(PIN)等鉴别诊断。

PSA作为单一检测指标，和DRE、TRUS相比，具有更高的阳性诊断率。美国泌尿外科学会(AUA)及美国临床肿瘤学会(ASCO)均建议50岁以上男性应每年例行进行PSA检查，对于有家族史的人群，应该从45岁起常规PSA筛查。由于PSA的应用，前列腺癌的早期诊断率大大提升，死亡人数也逐年下降。然而，血清PSA水平容易受到多种因素的影响，如导尿、膀胱镜检查、DRE、射精、前列腺穿刺、急性前列腺炎、尿潴留等。且当PSA介于4-10ng/ml时，前列腺穿刺阳性率在欧美人群低至25％,在中国人群则更低，大约为15.9％。围绕这一PSA灰区，需要其他额外检查如游离PSA(fPSA)、PSA密度(PSAD)、PSA速率(PSAV)等配合进行以提高诊断阳性率。由于PSA的诊断特异性较低，导致大量非必要的前列腺穿刺活检，由此带来的操作相关并发症和经济及心理负担给患者造成巨大压力。

目前，许多研究正在寻找合适的生物标志物以帮助前列腺癌早期诊断，PCA3、融合基因TMPRESS:ETS、GSTP1、AMACR、MALAT-1、EPCA、GOLPH2和肌氨酸等被相继报道，但依然存在各种问题。

本研究拟通过检测多中心样本尿液LncRNA546的含量，探索其作为前列腺癌早期诊断生物标志物的可能性，并尝试建立模型工具将其应用到临床。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供一种基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，包括以下步骤：

S1.1、对患者尿液标本进行采集；

S1.2、对尿液标本通过离心机进行处理；

S1.3、采用TRlzol法提取RNA，并对提取的RNA进行纯度分析，用DEPC水稀释并测其浓度；

S1.4、将RNA进行转录组的逆转录与扩增，生成cDNA；

S1.5、将cDNA用无酶水稀释10倍后用于实时聚合酶链反应；

S1.6、采用贴壁细胞培养方法进行细胞培养；

S1.7、对细胞进行冻存与复苏；

S1.8、进行统计学分析。

作为本技术方案的进一步改进，所述S1.1中，尿液采集前应多饮水，采集时，先作前列腺按摩，具体步骤如下：患者取胸膝位，术者以惯用手指戴橡皮手套，涂润滑石蜡油先轻柔按摩肛周，后缓慢深入直肠，摸到前列腺后，用食指的最末指节对着直肠前列腺侧，压力使前列腺表面下压1cm，从外向内，从基底部向尖部，对前列腺进行按压，每叶按摩3-4次，再从中央沟自上而下向尿道外口挤压出前列腺液，按摩完后取患者首次前段尿液40-50ml，注意不能使用患者晨尿。

作为本技术方案的进一步改进，所述S1.2中，尿液标本采集后，立即置于冰上，2小时内将尿液置于低温4℃的离心机上以4000rpm转速离心15min；弃去上清液，用低温保存的PBS洗涤尿沉渣后，再置于低温4℃离心机4000rpm转速离心15min；最后留取尿沉渣，保存存于-20℃或-80℃冰箱，离心完后尿沉渣应该为透明胶状，若为红色或者深红色，则说明杂质较多，不适合接下来的实验分析。

作为本技术方案的进一步改进，所述S1.3中，TRIzol法提取RNA的具体步骤如下：

S2.1、将之前保存的尿沉渣标本取出，室温放置5-6min后，置于1.5ml EP管加入1000ul的TRIzol试剂，吹打、震荡混匀；

S2.2、将上述标本置于于EP管内加入200ul氯仿，剧烈震荡混匀，室温放置5min，在4℃离心机离心12000rpm转速离心15min，可见液体分为三层，用移液枪吸取上层清凉液体，吸入新的无酶1.5ml EP管；

S2.3、在新管内加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，并于室温静置10min，在4℃离心机中配平离心10min，转速为12000rpm；

S2.4、弃去上清液，加入低温预冷的75％乙醇1000ul，上下颠倒混匀，在4℃离心机中配平离心5min，转速为7500rpm；

S2.5、弃去上清，用移液枪吸掉剩下的少量液体，自然风干10min左右，剩下的管底白色絮状沉淀即为RNA。

作为本技术方案的进一步改进，所述S1.3中，RNA提取之后纯度分析的具体步骤如下：

S3.1、琼脂糖凝胶电泳：取0.5-1ug的RNA上样置于1％琼脂糖凝胶，电泳，参数为120V，15min，对于没有降解的RNA可能是2种核糖体RNA，真核细胞：28S和18S，条带亮度约为2:1，但如果核糖体RNA条带弥散，说明可能RNA降解，如果条带超过28S，可能存在基因组DNA污染；

S3.2、吸光度分析：用DEPC水稀释RNA后用紫外分光光度计测定吸光度，测量230nm盐、260nm核酸、280nm蛋白和320nm不溶物的吸光值，本实验控制RNA的纯度为OD260/OD280＝1.9-2.1，比值<1.9说明有DNA或蛋白污染，>2.1说明RNA有降解，符合标准后，读取三次Nanodrop的RNA浓度数值，取平均值，提取完RNA后，可用于下面的实验，也可将符合纯度的RNA保存于-80℃冰箱以备下次使用。

作为本技术方案的进一步改进，所述S1.4中，RNA进行转录组的逆转录与扩增的具体步骤如下：

S4.1、取50ng纯度达标的RNA，用移液枪移入新的200ul无酶EP管，加入0.5ulLibrary Synthesis Solution，之后加无酶水将体系补至3.32ul，混匀；

S4.2、将反应体系置于PCR仪孵育，设置参数70℃，5min→18℃，∞；期间配制下一步要使用的Mix混合液：0.4ul Library Synthesis Enzyme加0.5ul Library SynthesisBuffer+0.78ul无酶水；

S4.3、在冷却后的反应体系中快速加入步骤2配制好的Mix，混匀；

S4.4、PCR仪孵育，设置参数：18℃，10min→25℃，10min→37℃，30min→42℃，10min→70℃，20min→4℃，∞；期间配制好下一步要使用的Master Mix混合液：0.75ulAmplication Enzyme加7.5ul Amplication Mix加1.5ul 10mM dNTP Mix；

S4.5、在将冷却的反应体系中迅速加入步骤4中的Master Mix，混匀；

S4.6、PCR仪孵育，设置参数：94℃，2min→94℃，30s→70℃，5min→4℃，∞；结束后的反应体系内即为cDNA，可用于下面的实验，也可保存于-20℃。

作为本技术方案的进一步改进，所述S1.6中，前列腺癌细胞系为LNCaP及PC-3细胞系，培养基为10％胎牛血清与RPMI-1640培养基配制，再加入1％双抗。

作为本技术方案的进一步改进，所述S1.6中，细胞培养的具体步骤如下：

S5.1、显微镜下观察细胞密度及培养基颜色，当颜色微黄且细胞密度80％以上时则判断可传代；

S5.2、超净台内，用移液器沿培养皿边缘吸出原有培养液，弃去；用移液器沿培养皿边缘缓慢加入1000ul无菌PBS，轻轻缓慢摇动培养皿以洗涤剩余培养液，重复2次；

S5.3、将配制好的500ul 0.25％胰蛋白酶溶液均匀加入培养皿，轻轻摇晃，之后盖上皿盖，迅速放入培养箱，2min后于显微镜下观察，细胞由贴壁变为趋于圆形则表明消化成功；

S5.4、超净台内，用移液器加入1000ul培养液终止消化，适当吹打，使细胞完全脱壁，收集于1.5ml EP管；

S5.5、离心机离心2min，转速为1000rpm；离心后弃去上清液，加入1000ul新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液；

S5.6、接入适量的细胞到培养皿中，最后补足培养液，摇匀后放入培养箱。

作为本技术方案的进一步改进，所述S1.7中，细胞进行冻存的具体步骤如下：

S6.1、将需要冻存的细胞消化离心，扩大到2个10cm培养皿中培养；

S6.2、选择对数生长期的细胞冻存，冻存前一天换液。

S6.3、配制冻存液：70％RPMI-1640培养基加20％胎牛血清加10％DMSO，两个10cm培养皿需6个冻存管，混匀后静置备用。

S6.4、从培养箱中取出需要冻存的细胞，弃去上清，加入PBS液洗涤，弃去后在每皿中加入约500ul 0.25％胰蛋白酶消化液，置于培养箱消化2min，显微镜下观察细胞回缩变圆后，1000ul RPMI-1640培养基终止消化，轻轻吹下细胞后收集于1.5mL EP管中离心，离心2min，转速1000rpm；

S6.5、离心停止后弃去上清液，加入1000ul预先配置的冻存液重悬所有细胞，然后转移至总冻存液中混匀，冻存管每管分装1000ul，管上标记：细胞名称、冻存日期、操作人员；

S6.6、将所有细胞放入冻存盒内，迅速放入-80℃冰箱过夜，次日再转移到相应的液氮罐中长期保存。

作为本技术方案的进一步改进，所述S1.7中，细胞复苏的具体步骤如下：

S7.1、复苏之前确定该细胞的冻存批次，然后找出液氮罐中的具体位置，填写复苏登记表，包括复苏日期，细胞名称，具体位置，冻存日期，复苏人姓名，数量，合同号信息，次日复苏状态描述。

S7.2、准备37℃水浴，迅速取出细胞，将冻存管放入水浴中快速摇晃使之融化。

S7.3、融化完全后的冻存管放入离心机中，离心转速为1000rpm下离心2min，停止后取出冻存管，酒精棉擦拭消毒，直立放入超净工作台中；

S7.4、小心倒去上清液，加入1ml RPMI-1640培养基，轻吹打混匀成悬液，全部吸取转移到6cm培养皿中，再补足4ml RPMI-1640培养基，混匀后放置37℃二氧化碳培养箱培养。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

该基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法中，LncRNA546可作为前列腺癌早期诊断的新型生物标志物，可根据LncRNA546构建Logistic回归模型，绘制nomogram用于预测患前列腺癌概率。

附图说明

图1为本发明的整体流程框图；

图2为本发明的PCA3在不同人群中的差异分析图；

图3为本发明的LncRNA546在不同人群中的差异分析图；

图4为本发明的各人群中前列腺癌诊断率与PCA3之间关系柱形图；

图5为本发明的各人群中前列腺癌诊断率与LncRNA546之间关系柱形图；

图6为本发明的总人群中前列腺癌相关标志物ROC曲线图；

图7为本发明的总人群中前列腺癌相关标志物AUC柱形图；

图8为本发明的PSA 4-10ng/ml人群中前列腺癌相关标志物ROC曲线图；

图9为本发明的PSA 4-10ng/ml人群中前列腺癌相关标志物AUC柱形图；

图10为本发明的PSA 4-20ng/m人群中前列腺癌相关标志物ROC曲线图；

图11为本发明的PSA 4-20ng/m人群中前列腺癌相关标志物AUC柱形图；

图12为本发明的PSA 10-20ng/ml人群中前列腺癌相关标志物ROC曲线图；

图13为本发明的PSA 10-20ng/ml人群中前列腺癌相关标志物AUC柱形图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1一种基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，包括：

一、标本采集

尿液采集前应多饮水，采集时，先作前列腺按摩，具体步骤如下：患者取胸膝位，术者以惯用手指戴橡皮手套，涂润滑石蜡油先轻柔按摩肛周，后缓慢深入直肠，摸到前列腺后，用食指的最末指节对着直肠前列腺侧，压力使前列腺表面下压1cm，从外向内，从基底部向尖部，对前列腺进行按压，每叶按摩3-4次，再从中央沟自上而下向尿道外口挤压出前列腺液，按摩完后取患者首次前段尿液40-50ml，注意不能使用患者晨尿。

二、标本处理

尿液标本采集后，立即置于冰上，2小时内将尿液置于低温4℃的离心机上以4000rpm转速离心15min；弃去上清液，用低温保存的PBS洗涤尿沉渣后，再置于低温4℃离心机4000rpm转速离心15min；最后留取尿沉渣，保存存于-20℃或-80℃冰箱，离心完后尿沉渣应该为透明胶状，若为红色或者深红色，则说明杂质较多，不适合接下来的实验分析。

三、RNA提取

1、采用传统的TRIzol法提取RNA，具体步骤如下：

(1)、将之前保存的尿沉渣标本取出，室温放置5-6min后，置于1.5ml EP管加入1000ul的TRIzol试剂，吹打、震荡混匀；

(2)、将上述标本置于于EP管内加入200ul氯仿，剧烈震荡混匀，室温放置5min，在4℃离心机离心12000rpm转速离心15min，可见液体分为三层，用移液枪吸取上层清凉液体，吸入新的无酶1.5ml EP管；

(3)、在新管内加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，并于室温静置10min，在4℃离心机中配平离心10min，转速为12000rpm；

(4)、弃去上清液，加入低温预冷的75％乙醇1000ul，上下颠倒混匀，在4℃离心机中配平离心5min，转速为7500rpm；

(5)、弃去上清，用移液枪吸掉剩下的少量液体，自然风干10min左右，剩下的管底白色絮状沉淀即为RNA。

2、将RNA提取之后，需分析其纯度，并用DEPC水稀释并测其浓度，具体步骤如下：

(1)、琼脂糖凝胶电泳：取0.5-1ug的RNA上样置于1％琼脂糖凝胶，电泳，参数为120V，15min，对于没有降解的RNA可能是2种核糖体RNA，真核细胞：28S和18S，条带亮度约为2:1，但如果核糖体RNA条带弥散，说明可能RNA降解，如果条带超过28S，可能存在基因组DNA污染；

(2)、吸光度分析：用DEPC水稀释RNA后用紫外分光光度计测定吸光度，测量230nm盐、260nm核酸、280nm蛋白和320nm不溶物的吸光值，本实验控制RNA的纯度为OD260/OD280＝1.9-2.1，比值<1.9说明有DNA或蛋白污染，>2.1说明RNA有降解，符合标准后，读取三次Nanodrop的RNA浓度数值，取平均值，提取完RNA后，可用于下面的实验，也可将符合纯度的RNA保存于-80℃冰箱以备下次使用。

四、全转录组扩增

RNA进行转录组的逆转录与扩增的具体步骤如下：

1、取50ng纯度达标的RNA，用移液枪移入新的200ul无酶EP管，加入0.5ul LibrarySynthesis Solution，之后加无酶水将体系补至3.32ul，混匀；

2、将反应体系置于PCR仪孵育，设置参数70℃，5min→18℃，∞；期间配制下一步要使用的Mix混合液：0.4ul Library Synthesis Enzyme加0.5ul Library SynthesisBuffer+0.78ul无酶水；

3、在冷却后的反应体系中快速加入步骤2配制好的Mix，混匀；

4、PCR仪孵育，设置参数：18℃，10min→25℃，10min→37℃，30min→42℃，10min→70℃，20min→4℃，∞；期间配制好下一步要使用的Master Mix混合液：0.75ulAmplication Enzyme加7.5ul Amplication Mix加1.5ul 10mM dNTP Mix；

5、在将冷却的反应体系中迅速加入步骤4中的Master Mix，混匀；

6、PCR仪孵育，设置参数：94℃，2min→17次循环(94℃，30s→70℃，5min)→4℃，∞；结束后的反应体系内即为cDNA，可用于下面的实验，也可保存于-20℃。

五、实时聚合酶链反应

将cDNA用无酶水稀释10倍后用于实时聚合酶链式反应，实时聚合酶链式反应体系如具体见表1：

表1

试剂	剂量
		cDNA	2ul
ddH<sub>2</sub>O	5.6ul
		SYBRGREENMIX	10ul
ROXDYE	0.4ul
		Primer-Forward	1ul
Primer-Reverse	1ul

其中所用引物序列表2所示，包括PSA、PCA3、LncRNA546的不同位点引物序列：

表2

引物名称	引物序列(5'～3')
		PSA-Forward	GTCTGCGGCGGTGTTCTG
PSA-Reverse	TGCCGACCCAGCAAGATC
		PCA3-Forward	GAGAACAGGGGAGGGAGAG
PCA3-Reverse	ACGTTCTGGGATACATGTGC
		LncRNA546-Forward	TCCTCCTAAGCCGTATCCCATCTG
LncRNA546-Reverse	CCAGGTGAGTTGAACAGTCCGATT

反应体系加入ABI的96孔板，每个样本3个复孔，将96孔板置于实时聚合酶链式反应仪ABI StepOne Plus，扩增条件为：95℃，10min→40个循环(95℃，15s，→60℃，60s)→4℃，∞；最后通过StepOne Software v2.1软件进行分析数据，测得样本目的基因及内参的Ct值；为了保证样品中有足够的前列腺细胞，排除PSA的Ct值>28的样本；定义LncRNA546score＝LncRNA546 mRNA/PSA mRNA×100＝2Ct(PSA)-Ct(LncRNA546)×100，PCA3score＝PCA3 mRNA/PSA mRNA＝2Ct(PSA)-Ct(PCA3)。

六、贴壁细胞培养

前列腺癌细胞系为LNCaP及PC-3细胞系，培养基为10％胎牛血清与RPMI-1640培养基配制，再加入1％双抗；

细胞培养的具体步骤如下：

1、显微镜下观察细胞密度及培养基颜色，当颜色微黄且细胞密度80％以上时则判断可传代；

2、超净台内，用移液器沿培养皿边缘吸出原有培养液，弃去；用移液器沿培养皿边缘缓慢加入1000ul无菌PBS，轻轻缓慢摇动培养皿以洗涤剩余培养液，重复2次；

3、将配制好的500ul 0.25％胰蛋白酶溶液均匀加入培养皿，轻轻摇晃，之后盖上皿盖，迅速放入培养箱，2min后于显微镜下观察，细胞由贴壁变为趋于圆形则表明消化成功；

4、超净台内，用移液器加入1000ul培养液终止消化，适当吹打，使细胞完全脱壁，收集于1.5ml EP管；

5、离心机离心2min，转速为1000rpm；离心后弃去上清液，加入1000ul新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液；

6、接入适量的细胞到培养皿中，最后补足培养液，摇匀后放入培养箱

七、细胞冻存与复苏

1、细胞进行冻存的具体步骤如下：

(1)、将需要冻存的细胞消化离心，扩大到2个10cm培养皿中培养；

(2)、选择对数生长期的细胞冻存，冻存前一天换液。

(3)、配制冻存液：70％RPMI-1640培养基加20％胎牛血清加10％DMSO，两个10cm培养皿需6个冻存管，混匀后静置备用。

(4)、从培养箱中取出需要冻存的细胞，弃去上清，加入PBS液洗涤，弃去后在每皿中加入约500ul 0.25％胰蛋白酶消化液，置于培养箱消化2min，显微镜下观察细胞回缩变圆后，1000ul RPMI-1640培养基终止消化，轻轻吹下细胞后收集于1.5mL EP管中离心，离心2min，转速1000rpm；

(5)、离心停止后弃去上清液，加入1000ul预先配置的冻存液重悬所有细胞，然后转移至总冻存液中混匀，冻存管每管分装1000ul，管上标记：细胞名称、冻存日期、操作人员；

(6)、将所有细胞放入冻存盒内，迅速放入-80℃冰箱过夜，次日再转移到相应的液氮罐中长期保存。

2、细胞复苏的具体步骤如下：

(1)、复苏之前确定该细胞的冻存批次，然后找出液氮罐中的具体位置，填写复苏登记表，包括复苏日期，细胞名称，具体位置，冻存日期，复苏人姓名，数量，合同号信息，次日复苏状态描述。

(2)、准备37℃水浴，迅速取出细胞，将冻存管放入水浴中快速摇晃使之融化。

(3)、融化完全后的冻存管放入离心机中，离心转速为1000rpm下离心2min，停止后取出冻存管，酒精棉擦拭消毒，直立放入超净工作台中；

(4)、小心倒去上清液，加入1ml RPMI-1640培养基，轻吹打混匀成悬液，全部吸取转移到6cm培养皿中，再补足4ml RPMI-1640培养基，混匀后放置37℃二氧化碳培养箱培养。

八、统计学分析

正态分布的计量资料以平均值表示，Student’t test检验，非正态分布的计量资料以中位数表示，Mann-Whitney U test检验，计数资料以百分数表示，Pearson chi-square test或Fisher exact test检验；诊断效能通过ROC曲线，曲线下面积AUC定量表示；建立单变量及多变量的Logistic回归模型预测前列腺癌活检结果；决策曲线分析用于评估临床效益，诺模图用于指导临床实践，Bootstrap resamples＝1000；统计分析使用的软件有SPSS v.19.0(SPSS,IL USA),MedCalc v.11.4(MedCalc Software bvba,Mariakerke,Belgium),Stata v.12.0(StataCorp,Texas,USA)和R software v.3.2.2(R Foundationfor Statistical Computing,Vienna,Austria)。

实验例1

1、本发明纳入了2015年1月～6月全国四家医院泌尿外科患者尿液标本440例，其中包括长海医院248例，华西医院109例，长征医院54例，解放军总医院29例；

纳入标准：因DRE异常、PSA升高或其他相关前列腺检查异常入院，拟行前列腺穿刺活检的病人。

排除标准：(1)既往有前列腺癌病史；(2)既往有泌尿系统其他器官肿瘤病史，如肾上腺、肾、尿路上皮肿瘤病史；(3)伴有可能会影响PSA的泌尿系感染或手术。

2、应用实时聚合酶链式反应的方法，计算PCA3与LncRNA546的评分，LncRNA546score＝2Ct(PSA)-Ct(LncRNA546)×100，PCA3 score＝2Ct(PSA)-Ct(PCA3)；本实验对PSA的数值进行分组时，将PSA分为overall,PSA 4-10,PSA 4-20,PSA 10-20ng/ml四个亚群；其中PSA 4-10ng/ml区间的人群穿刺结果阳性者有20例，穿刺结果阴性者有73例；PSA 4-20ng/ml区间穿刺结果阳性者有39例，穿刺结果阴性者有124例；PSA 10-20ng/ml区间穿刺结果阳性者有19例，穿刺结果阴性者有51例。

PCA3表达水平结果如图2所示，在总人群中，前列腺穿刺结果阳性的病人PCA3分数(中位数97.2，四分位数间距50-199)高于阴性病人PCA3分数(中位数57.8，四分位数间距19-112)，且有统计差异(p<0.001)；在PSA灰区人群中，前列腺穿刺结果阳性的病人PCA3分数(中位数76.0，四分位数间距51.9-119)高于阴性病人PCA3分数(中位数57.8，四分卫数间距12.8-97.4)，但无统计差异(p＝0.078)；在PSA 4-20人群中，前列腺穿刺结果阳性病人PCA3分数(中位数80.1，四分卫数间距42.8-142)高于阴性病人PCA3分数(中位数60.8，四分卫数间距17.8-117)，但无统计差异(p＝0.071)；在PSA 10-20人群中，前列腺穿刺结果阳性的病人PCA3分数(中位数97.2，四分卫数间距17.8-234)高于阴性病人分数(中位数79.6，四分位数间距26.1-169)，但同样并无统计意义(p＝0.479)；因此PCA3只在总人群中的表达有差异，在PSA 4-10、4-20、10-20ng/ml人群中均无明显差异。

LncRNA546的结果如图3所示，在总人群中，前列腺穿刺结果阳性病人LncRNA546分数(中位数105，四分位数间距54.7-202)高于阴性结果病人(中位数42.9，四分位数间距17.4-69.0)，且有统计差异(p<0.001)；在PSA 4-10ng/ml人群中前列腺穿刺结果阳性病人LncRNA546分数(中位数95.8，四分位数间距67.2-177)，且有统计差异(p<0.001)；在PSA 4-20ng/ml人群中，前列腺穿刺结果阳性病人LncRNA546分数(中位数86.4，四分位数间距59.8-187)高于阴性结果病人(中位数43.2，四分位数间距17.0-76.3)，且有统计差异(p<0.001)；在PSA 10-20ng/ml人群中，前列腺穿刺结果阳性病人LncRNA546分数(中位数78.9，四分位数间距32.6-215)高于阴性结果病人(中位数49.3，四分位数间距19.3-66.5)，且有统计差异(p＝0.013)；因此，LncRNA546在总人群、PSA 4-10、4-20、10-20ng/ml区间均有差异。

以上结果表明，LncRNA546很有希望成为前列腺癌早期诊断的生物标志物。

3、我们继续分析LncRNA546与PCA3评分与前列腺癌的诊断率之间的关系，将病人的LncRNA546与PCA3分数按从小到大分别排序，并按大小分为四个组：前0-25％、中前25-50％、中后50-75％、后75-100％。

PCA3与前列腺癌诊断率之间的关系如图4所示；在总人群中，PCA3分数排前25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人16例，阴性病人46例，前列腺穿刺结果阳性率为25.8％；PCA3分数排中前25％的患者中，阳性病人21例，阴性病人41例，前列腺穿刺结果阳性率为33.9％；PCA3分数排名中后25％的患者中，阳性病人26例，阴性病人36例，前列腺穿刺结果阳性率为41.9％；PCA3分数排名后25％的患者中，阳性病人36例，阴性病人26例，前列腺穿刺结果阳性率为58.1％，组间的阳性率比较有统计差异(p＝0.002)；而在PSA<10ng/ml人群中，PCA3分数前25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人1例，阴性病人24例，前列腺穿刺结果阳性率为4％；PCA3分数中前25％的患者中，前列腺穿刺结果阳性病人6例，阴性病人19例，前列腺穿刺结果阳性率为24％；PCA3分数中后25％的患者中，前列腺穿刺结果阳性病人6例，阴性结果19例，前列腺穿刺结果阳性率为24％；PCA3分数后25％的患者中，前列腺穿刺结果阳性病人9例，阴性病人17例，前列腺穿刺结果阳性率为34.6％；但组间的阳性率比较无统计差异(p＝0.063)；在PSA 10-20ng/ml人群中，PCA3分数前25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人5例，阴性病人12例，前列腺穿刺结果阳性率为29.4％；PCA3分数中前25％的患者中，前列腺穿刺结果阳性病人3例，阴性病人15例，前列腺穿刺结果阳性率为16.7％；PCA3分数中后25％的患者中，前列腺穿刺结果阳性病人5例，阴性病人12例，前列腺穿刺结果阳性率为29.4％；PCA3分数后25％的患者中，前列腺穿刺结果阳性病人6例，阴性病人12例，前列腺穿刺结果阳性率为33.3％；但组间的阳性率比较无统计差异(p＝0.720)；在PSA>20ng/ml人群中，PCA3分数前25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人9例，阴性病人7例，前列腺穿刺结果阳性率为56.3％；PCA3分数中前25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人13例，阴性病人4例，前列腺穿刺结果阳性率为76.5％；PCA3分数中后25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人14例，阴性病人2例，前列腺穿刺结果阳性率为87.5％；PCA3分数后25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人16例，阴性病人1例，前列腺穿刺结果阳性率为94.1％；且组间阳性率的比较无统计差异(p＝0.060)。

LncRNA546与前列腺癌诊断率之间的关系如图5所示；在总人群中，LncRNA546分数前25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人10例，阴性病人52例，前列腺穿刺结果阳性率为16.1％；LncRNA546分数中前25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人15例，阴性病人47例，前列腺穿刺结果阳性率为24.2％；LncRNA546分数中后25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人26例，阴性病人36例，前列腺穿刺结果阳性率为41.9％；LncRNA546分数后25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人48例，阴性病人14例，前列腺穿刺结果阳性率为77.4％；且组间的阳性率比较有统计差异(p<0.001)；在PSA<10ng/ml人群中，LncRNA546分数前25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人为0，阴性病人25例，前列腺穿刺结果阳性率为0％；LncRNA546分数中前25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人3例，阴性病人22例，前列腺穿刺结果阳性率为12％；LncRNA546分数中后25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人6例，阴性病人19例，前列腺穿刺结果阳性率为24％；LncRNA546分数后25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人13例，阴性病人13例，前列腺穿刺结果阳性率为50％；且组间阳性率的比较有统计差异(p<0.001)；在PSA 10～20ng/ml的人群中，LncRNA546分数前25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人3例，阴性病人14例，前列腺穿刺结果阳性率为17.6％；LncRNA546分数中前25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人3例，阴性病人15例，前列腺穿刺结果阳性率为16.7％；LncRNA546分数中后25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人4例，阴性13例，前列腺穿刺结果阳性率为23.5％；LncRNA546分数后25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人9例，阴性病人9例，前列腺穿刺结果阳性率为50％；但组间的阳性率比较无统计差异(p＝0.116)；在PSA>20ng/ml的人群中，LncRNA546分数前25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人10例，阴性病人6例，前列腺穿刺结果阳性率为62.5％；LncRNA546分数中前25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人9例，阴性病人8例，前列腺穿刺结果阳性率为52.9％；LncRNA546分数中后25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人16例，阴性病人为0，前列腺穿刺结果阳性率为100％；LncRNA546分数后25％的患者，前列腺穿刺结果阳性病人17例，阴性为0，前列腺穿刺结果阳性率为100％；且组间阳性率的比较有统计差异(p<0.001)；

从图4和图5的数据可以看出，在总人群PSA<10ng/ml及PSA>20ng/ml中，随着LncRNA546分数的增加，前列腺癌诊断率不断提升，进一步说明LncRNA546有望成为早期诊断前列腺癌的新型生物标志物。

4、为了更加全面反映和进一步分析LncRNA546对前列腺癌早期诊断的价值，我们绘制了ROC曲线图，并与PSAD、tPSA、PCA3及％fPSA做比较，结果如图6-图13所示。

总人群中各变量ROC曲线图如图6所示，其中PSAD的AUC最大(0.822，95％CI0.768-0.877)，LncRNA546的AUC次之(0.780，95％CI 0.720-0.840)，其后依次为tPSA(0.770，95％CI 0.706-0.833)、PCA3(0.659，95％CI 0.590-0.727)、％fPSA(0.624，95％CI 0.552-0.695)；如图7所示，当统计分析LncRNA546与其他各变量之间的差异时可以发现，LncRNA546与PSAD(p＝0.32)、tPSA(p＝0.83)之前无差异，但显著大于％fPSA(p<0.01)与PCA3(p<0.01)。

PSA 4-10ng/ml人群中各变量的ROC曲线图如图8所示，其中LncRNA546的AUC最大(0.798，95％CI 0.695-0.901)，PSAD的AUC次之(0.758，95％CI 0.655-0.860)，其后依次为％fPSA(0.638，95％CI 0.507-0.770)、PCA3(0.629，95％CI 0.508-0.751)、tPSA(0.570，95％CI 0.417-0.723)；如图9所示，统计分析LncRNA546与其他各变量之间的差异时可以发现，LncRNA546与PSAD(p＝0.61)差异不明显；与％fPSA(p＝0.08)AUC差距不小，但依然大于0.05；LncRNA546的AUC显著大于PCA3(p<0.01)与tPSA(p＝0.02)。

PSA 4-20ng/ml人群中各变量的ROC曲线如图10所示，其中LncRNA546的AUC为0.748(95％CI 0.655-0.840)，PSAD的AUC为0.712(95％CI 0.623-0.802)，％fPSA的AUC为0.641(95％CI 0.543-0.739)，PCA3的AUC为0.596(95％CI 0.500-0.691)，tPSA的AUC为0.562(95％CI 0.460-0.665)；如图11所示，统计分析LncRNA546与其他各变量之间的差异时可以发现，LncRNA546与PSAD(p＝0.61)差异不明显；与％fPSA差异也不明显(p＝0.15)；但显著大于PCA3(p<0.01)与tPSA(p＝0.01)。

PSA 10-20ng/ml人群中各变量的ROC曲线图如图12所示，其中LncRNA546的AUC为0.693(95％CI 0.538-0.849)，PSAD的AUC为0.729(95％CI 0.584-0.874)，％fPSA的AUC为0.653(95％CI 0.510-0.797)，PCA3的AUC为0.556(95％CI 0.403-0.710)，tPSA的AUC为0.516(95％CI 0.367-0.665)；如图13所示，统计分析LncRNA546与其他变量之间的差异时可以发现，LncRNA546与PSAD差异不明显(p＝0.72)；与％fPSA差异不明显(p＝0.71)；与tPSA差异也不明显(p＝0.06)，显著高于PCA3(p<0.01)。

根据LncRNA546在各人群中(总人群、PSA 4-10ng/ml、4-20ng/ml、10-20ng/ml)中的ROC曲线图及与各变量之间的AUC对比可以发现，LncRNA546对于早期诊断前列腺癌拥有较大的优势，尤其是在总人群与PSA 4-10ng/ml人群中，其不仅表达差异明显，而且ROC曲线的AUC也较其他变量更具效能；虽然在总人群中弱于PSAD，但无统计差异，且由于PSAD是tPSA与前列腺体积之比，为计算值，而不是客观存在的实体物质，就寻找理想的客观存在的前列腺癌早期诊断生物标志物而言，LncRNA546在我们的数据对比当中无疑是最佳选择。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.1、对患者尿液标本进行采集；

S1.2、对尿液标本通过离心机进行处理；

S1.3、采用TRlzol法提取RNA，并对提取的RNA进行纯度分析，用DEPC水稀释并测其浓度；

S1.4、将RNA进行转录组的逆转录与扩增，生成cDNA；

S1.5、将cDNA用无酶水稀释10倍后用于实时聚合酶链反应；

S1.6、采用贴壁细胞培养方法进行细胞培养；

S1.7、对细胞进行冻存与复苏；

S1.8、进行统计学分析。

2.根据权利要求1所述的基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，其特征在于：所述S1.1中，尿液采集前应多饮水，采集时，先作前列腺按摩，具体步骤如下：患者取胸膝位，术者以惯用手指戴橡皮手套，涂润滑石蜡油先轻柔按摩肛周，后缓慢深入直肠，摸到前列腺后，用食指的最末指节对着直肠前列腺侧，压力使前列腺表面下压1cm，从外向内，从基底部向尖部，对前列腺进行按压，每叶按摩3-4次，再从中央沟自上而下向尿道外口挤压出前列腺液，按摩完后取患者首次前段尿液40-50ml。

3.根据权利要求1所述的基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，其特征在于：所述S1.2中，尿液标本采集后，立即置于冰上，2小时内将尿液置于低温4℃的离心机上以4000rpm转速离心15min；弃去上清液，用低温保存的PBS洗涤尿沉渣后，再置于低温4℃离心机4000rpm转速离心15min；最后留取尿沉渣，保存存于-20℃或-80℃冰箱。

4.根据权利要求1所述的基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，其特征在于：所述S1.3中，TRIzol法提取RNA的具体步骤如下：

S2.1、将之前保存的尿沉渣标本取出，室温放置5-6min后，置于1.5mlEP管加入1000ul的TRIzol试剂，吹打、震荡混匀；

S2.2、将上述标本置于于EP管内加入200ul氯仿，剧烈震荡混匀，室温放置5min，在4℃离心机离心12000rpm转速离心15min，可见液体分为三层，用移液枪吸取上层清凉液体，吸入新的无酶1.5ml EP管；

S2.3、在新管内加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，并于室温静置10min，在4℃离心机中配平离心10min，转速为12000rpm；

S2.4、弃去上清液，加入低温预冷的75％乙醇1000ul，上下颠倒混匀，在4℃离心机中配平离心5min，转速为7500rpm；

S2.5、弃去上清，用移液枪吸掉剩下的少量液体，自然风干10min左右，剩下的管底白色絮状沉淀即为RNA。

5.根据权利要求1所述的基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，其特征在于：所述S1.3中，RNA提取之后纯度分析的具体步骤如下：

S3.1、琼脂糖凝胶电泳：取0.5-1ug的RNA上样置于1％琼脂糖凝胶，电泳，参数为120V，15min；

S3.2、吸光度分析：用DEPC水稀释RNA后用紫外分光光度计测定吸光度，测量230nm盐、260nm核酸、280nm蛋白和320nm不溶物的吸光值。

6.根据权利要求1所述的基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，其特征在于：所述S1.4中，RNA进行转录组的逆转录与扩增的具体步骤如下：

S4.1、取50ng纯度达标的RNA，用移液枪移入新的200ul无酶EP管，加入0.5ulLibrarySynthesis Solution，之后加无酶水将体系补至3.32ul，混匀；

S4.2、将反应体系置于PCR仪孵育，设置参数70℃，5min→18℃，∞；期间配制下一步要使用的Mix混合液：0.4ul Library Synthesis Enzyme加0.5ul Library SynthesisBuffer+0.78ul无酶水；

S4.3、在冷却后的反应体系中快速加入步骤2配制好的Mix，混匀；

S4.4、PCR仪孵育，设置参数：18℃，10min→25℃，10min→37℃，30min→42℃，10min→70℃，20min→4℃，∞；期间配制好下一步要使用的Master Mix混合液：0.75ulAmplication Enzyme加7.5ul Amplication Mix加1.5ul 10mM dNTP Mix；

S4.5、在将冷却的反应体系中迅速加入步骤4中的Master Mix，混匀；

S4.6、PCR仪孵育，设置参数：94℃，2min→94℃，30s→70℃，5min→4℃，∞；结束后的反应体系内即为cDNA。

7.根据权利要求1所述的基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，其特征在于：所述S1.6中，前列腺癌细胞系为LNCaP及PC-3细胞系，培养基为10％胎牛血清与RPMI-1640培养基配制，再加入1％双抗。

8.根据权利要求1所述的基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，其特征在于：所述S1.6中，细胞培养的具体步骤如下：

S5.1、显微镜下观察细胞密度及培养基颜色，当颜色微黄且细胞密度80％以上时则判断可传代；

S5.2、超净台内，用移液器沿培养皿边缘吸出原有培养液，弃去；用移液器沿培养皿边缘缓慢加入1000ul无菌PBS，轻轻缓慢摇动培养皿以洗涤剩余培养液，重复2次；

S5.3、将配制好的500ul 0.25％胰蛋白酶溶液均匀加入培养皿，轻轻摇晃，之后盖上皿盖，迅速放入培养箱，2min后于显微镜下观察，细胞由贴壁变为趋于圆形则表明消化成功；

S5.4、超净台内，用移液器加入1000ul培养液终止消化，适当吹打，使细胞完全脱壁，收集于1.5ml EP管；

S5.5、离心机离心2min，转速为1000rpm；离心后弃去上清液，加入1000ul新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液；

S5.6、接入适量的细胞到培养皿中，最后补足培养液，摇匀后放入培养箱。

9.根据权利要求1所述的基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，其特征在于：所述S1.7中，细胞进行冻存的具体步骤如下：

S6.1、将需要冻存的细胞消化离心，扩大到2个10cm培养皿中培养；

S6.2、选择对数生长期的细胞冻存，冻存前一天换液。

S6.3、配制冻存液：70％RPMI-1640培养基加20％胎牛血清加10％DMSO，两个10cm培养皿需6个冻存管，混匀后静置备用。

S6.4、从培养箱中取出需要冻存的细胞，弃去上清，加入PBS液洗涤，弃去后在每皿中加入约500ul 0.25％胰蛋白酶消化液，置于培养箱消化2min，显微镜下观察细胞回缩变圆后，1000ul RPMI-1640培养基终止消化，轻轻吹下细胞后收集于1.5mL EP管中离心，离心2min，转速1000rpm；

S6.5、离心停止后弃去上清液，加入1000ul预先配置的冻存液重悬所有细胞，然后转移至总冻存液中混匀，冻存管每管分装1000ul；

S6.6、将所有细胞放入冻存盒内，迅速放入-80℃冰箱过夜，次日再转移到相应的液氮罐中长期保存。

10.根据权利要求1所述的基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，其特征在于：所述S1.7中，细胞复苏的具体步骤如下：

S7.1、复苏之前确定该细胞的冻存批次，然后找出液氮罐中的具体位置，填写复苏登记表。

S7.2、准备37℃水浴，迅速取出细胞，将冻存管放入水浴中快速摇晃使之融化。

S7.3、融化完全后的冻存管放入离心机中，离心转速为1000rpm下离心2min，停止后取出冻存管，酒精棉擦拭消毒，直立放入超净工作台中；

S7.4、小心倒去上清液，加入1ml RPMI-1640培养基，轻吹打混匀成悬液，全部吸取转移到6cm培养皿中，再补足4ml RPMI-1640培养基，混匀后放置37℃二氧化碳培养箱培养。

Images