CN107163146B - 一种靶向人肿瘤干细胞的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明涉及一种针对人肿瘤干细胞的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及所述抗体或片段在肿瘤治疗和诊断中的用途。

Description

一种靶向人肿瘤干细胞的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明涉及一种针对人肿瘤干细胞的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及所述抗体或片段在肿瘤治疗和诊断中的用途。
背景技术
恶性肿瘤(癌症)已成为威胁全世界人民生命与健康的“头号杀手”。全世界每年肿瘤的发病人数超过1400万，仅在我国每年新增的肿瘤患者超过300万。
导致癌症高死亡率的根本原因是癌细胞的扩散、转移和治疗后多数患者易复发和耐药。临床上现有的治疗手段，手术、放疗、化疗对癌细胞转移、复发、耐药疗效甚微，或只有近期疗效，并不能改变患者长期的存活情况。目前，手术切除对大约10-20％的早期患者效果好，但对已发生扩散转移的患者几乎无效。放疗只能治疗局部病灶，常作为术前、术后的辅助治疗和少数种类癌症的根治性治疗。化疗可用于已发生扩散转移的患者，但因毒副作用大，容易产生近期或远期的耐药，因而只能对大约20-30％的患者有明显的近期疗效。即使采用手术、放疗和化疗联合应用的综合治疗措施，其生存5年的远期疗效多年一直徘徊在20-30％，约70-80％的患者在治疗后因转移、复发和耐药在5年内死亡。即便是就诊时无转移的早期癌症患者，也还是有一部分在治疗后发生转移复发而死亡。近年发展起来的肿瘤的新型靶向药物，包括多肽、小分子、蛋白因子、基因治疗及抗体药物，与化疗药联合应用通常也只能相对现有治疗手段延长患者生存期3～9个月，对远期患者的5年生存率没有显著的提高。最近两年新兴起的肿瘤免疫治疗手段，例如针对免疫检查点的PD-1单抗药物以及CAR-T细胞疗法，虽然已经表现出可取得一些令人鼓舞的远期疗效的迹象，但总体对癌症患者的有效率仅能达到20-30％左右，仍然有大量的癌症患者得不到真正有效的药物的救治。因此提高肿瘤患者远期疗效、延长生存期的关键是开发抑制肿瘤转移、复发、耐药的新型药物。
发明概述
在第一方面，本发明提供了一种针对肿瘤干细胞的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:2具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:3具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:4具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:6具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:7具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO:8具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体是人源化抗体。
在一些实施方案中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或与SEQID NO:1具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或与SEQID NO:5具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体包含人重链恒定区，例如，包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的人重链恒定区。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体包含人轻链恒定区，例如，包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的人轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体包含具有SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的轻链。
在第二方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段与选自细胞毒素、放射性同位素或生物活性蛋白质的治疗性部分缀合。
在第三方面，本发明提供了一种在患者中治疗恶性肿瘤、预防和/或治疗恶性肿瘤转移或复发的方法，所述方法包括给所述患者施用有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物。
在一些实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。
在一些实施方案中，所述方法还包括给所述患者施用其它抗肿瘤治疗手段，例如施用化疗剂、靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体或放疗。
在第四方面，本发明提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物在制备用于治疗恶性肿瘤、预防和/或治疗恶性肿瘤转移或复发的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。
在第五方面，本发明提供了一种检测生物学样品中肿瘤干细胞存在的方法，包括：
a)使所述生物学样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；
b)检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述生物学样品中的靶抗原的结合，其中检出所述结合代表所述生物学样品中存在肿瘤干细胞。
在第六方面，本发明还提供一种用于分离肿瘤干细胞的方法，所述方法包括：
(a)提供疑似包含肿瘤干细胞的细胞群；
(b)鉴定所述细胞的亚群，其结合本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段；和
(c)分离所述亚群。
在第五和第六方面的一些实施方案中，所述肿瘤干细胞选自乳腺癌干细胞、大肠癌干细胞、胰腺癌干细胞、前列腺癌干细胞、肝癌干细胞、肺癌干细胞和胃癌干细胞。
在第七方面，本发明还提供了一种检测患者中恶性肿瘤的存在的方法，包括：
a)使获得自所述患者的生物学样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；
b)检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述生物学样品中的靶抗原的结合，其中检出代表所述患者中存在恶性肿瘤。
在第八方面，本发明还提供一种用于预后患者中恶性肿瘤复发或进展的方法，所述方法包括：
(a)从所述患者中分离包含循环细胞的生物学样品；
(b)使所述包含循环细胞的生物学样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；和
(c)鉴定结合本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的循环细胞的存在，
从而预后所述患者中恶性肿瘤的复发或进展。
在一些实施方案中，所述恶性肿瘤的进展包含所述恶性肿瘤在患者中的转移。
在第七和第八方面的一些实施方案中，所述生物学样品包括血液样品、淋巴样品或其组分。在一些实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。
在第九方面，本发明还提供一种分离的核酸分子，其编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述核酸分子与表达调控序列可操作地连接。
在第十方面，本发明还提供一种表达载体，其包含本发明的核酸分子。
在第十一方面，本发明还提供一种宿主细胞，其由本发明的核酸分子或本发明的表达载体转化。
在第十二方面，本发明还提供一种生产针对人肿瘤干细胞的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括：
(i)在适合本发明的核酸分子或表达载体表达的情况下培养本发明的宿主细胞，和
(ii)分离并纯化由所述核酸分子或表达载体表达的抗体或其抗原结合片段。
附图说明
图1.活细胞免疫荧光技术检测单抗Hetumomab靶抗原在多种肿瘤细胞活细胞表面的表达(部分典型阳性结果)。
图2.免疫组化检测单抗Hetumomab靶抗原在人肝癌、肺癌、胃癌组织中特异高表达(部分典型阳性结果)。
图3.免疫流式荧光检测单抗Hetumomab识别的癌细胞在人多种肿瘤细胞系的sphere培养细胞中均显著富集(部分典型的流式荧光图谱)。
图4.CCK8法检测单抗Hetumomab识别的多种人肿瘤细胞(如肝癌、肺癌、胃癌)的Hetumomab+细胞的耐药能力(IC50)。
图5.单抗Hetumomab显著抑制多种肿瘤(如肝癌、肺癌、胃癌)的肿瘤干细胞的自我更新能力(成球)。
图6.单抗Hetumomab显著抑制多种肿瘤(如肝癌、肺癌、胃癌)的肿瘤干细胞的侵袭能力。
图7.单抗Hetumomab显著抑制多种肿瘤的肿瘤干细胞的侵袭能力。
图8.单抗Hetumomab及联合化疗药物治疗人肝癌移植瘤Bel7402-V13的体内肿瘤生长曲线。
图9.单抗Hetumomab及联合化疗药物治疗人肝癌移植瘤Bel7402-V13的体内肿瘤体积抑制率(停药时)。
图10.单抗Hetumomab及联合化疗药物治疗人肝癌移植瘤Bel7402-V13的体内肿瘤体积抑制率(停药一个月后)。
图11.单抗Hetumomab及联合化疗药物治疗人肝癌移植瘤Bel7402-V13的小鼠的生存曲线。
图12.单抗Hetumomab治疗人肺癌移植瘤SPCA-1的体内肿瘤生长曲线。
图13.单抗Hetumomab及联合化疗药物治疗人胃癌移植瘤SNU-5的体内肿瘤生长曲线。
图14.示出嵌合抗体Hetuximab与亲本抗体Hetumomab结合肿瘤干细胞上相同的抗原蛋白。
图15.示出嵌合抗体Hetuximab与亲本抗体Hetumomab相互竞争与抗原的结合。
发明详述
一、定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所用，“抗体”指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论天然的或者部分或全部合成(例如重组)产生的，包括其至少包含免疫球蛋白分子的部分可变区的保留全长免疫球蛋白的结合特异性能力的任何片段。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白。抗体包括抗体片段，例如抗肿瘤干细胞抗体片段。如本文所用，因此术语抗体包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体以及抗体片段，例如但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型(抗Id)抗体、或者上述任何抗体的抗原结合片段。本文所提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的成员。
如本文所用，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，其少于全长，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个CDR和/或一个或多个抗体结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此，抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段以及其他片段，包括修饰的片段(参见，例如，Methods in Molecular Biology,Vol 207:Recombinant Antibodies forCancer Therapy Methods and Protocols(2003)；Chapter 1；p 3-25,Kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合(即表现出至少或至少约107-108M-1的Ka)抗原的抗体。
如本文所用，“单克隆抗体”指相同抗体的群体，表示单克隆抗体群体中的每个单独的抗体分子与其他抗体分子相同。这种特性与抗体的多克隆群体的特性相反，所述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的方法来制备(Smith et al.(2004)J.Clin.Pathol.57,912-917；和Nelson et al.,J Clin Pathol(2000),53,111-117)。例如，单克隆抗体可以通过永生化B细胞来制备，例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如EBV的病毒感染B细胞。重组技术还可以用来在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备抗体。
如本文中所用，术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”指由融合产抗体的淋巴细胞和不产抗体的癌细胞而产生的细胞或细胞系(通常为骨髓瘤或淋巴瘤细胞)。如本领域普通技术人员所知的，杂交瘤可增殖并持续供应产生特定单克隆抗体。用于产生杂交瘤的方法为本领域已知的(见例如，Harlow&Lane，1988)。当提及术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。
如本文所用，“常规抗体”指包含两条重链(其可以标示为H和H’)和两条轻链(其可以标示为L和L’)和两个抗原结合位点的抗体，其中每条重链可以是全长免疫球蛋白重链或保留抗原结合能力的其任何功能区(例如重链包括但不限于VH链、VH-CH1链和VH-CH1-CH2-CH3链)，并且每条轻链可以是全长轻链或任何功能区(例如轻链包括但不限于VL链和VL-CL链)。每条重链(H和H’)与一条轻链(分别为L和L’)配对。
如本文所用，全长抗体是具有两条全长重链(例如VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两条全长轻链(VL-CL)和铰链区的抗体，例如通过抗体分泌B细胞天然产生的抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。
如本文所用，dsFv指具有稳定VH-VL对的工程化分子间二硫键的Fv。
如本文所用，Fab片段是用木瓜蛋白酶消化全长免疫球蛋白所获得的抗体片段，或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。Fab片段包含轻链(包含VL和CL)和另一条链，所述另一条链包含重链的可变结构域(VH)和重链的一个恒定区结构域(CH1)。
如本文所用，F(ab’)2片段是在pH 4.0-4.5下用胃蛋白酶消化免疫球蛋白所导致的抗体片段，或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。F(ab’)2片段基本上包含两个Fab片段，其中每个重链部分包含额外的几个氨基酸，包括形成连接两个片段的二硫键的半胱氨酸。
如本文所用，Fab’片段是包含F(ab’)2片段的一半(一条重链和一条轻链)的片段。
如本文所用，scFv片段指包含通过多肽接头以任何顺序共价连接的可变轻链(VL)和可变重链(VH)的抗体片段。接头长度使得两个可变结构域基本不干扰地桥接。示例性接头是分散有一些Glu或Lys残基以增加溶解性的(Gly-Ser)n残基。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列源自一个物种，恒定区序列源自另一物种，如其中可变区序列源自小鼠抗体及恒定区序列源自人抗体的抗体。
“人源化”抗体是指非人(例如小鼠)抗体形式，其是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或者抗体的其它抗原结合亚序列)，含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者抗体的互补决定区(CDR)的残基由来自具有希望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或者兔的CDR残基置换。
此外，在人源化中，还可能对VH和/或VL的CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，由此改善抗体的一或多种结合特性(例如亲和性)。可进行例如PCR介导的突变引入突变，其对抗体结合或其它功能特性的影响可利用本文所述的体外或体内测试评估。通常，引入保守性突变。此类突变可为氨基酸取代、添加或缺失。另外，CDR内的突变通常不超过一个或两个。因此，本发明所述人源化抗体还涵盖CDR内包含1或2两个氨基酸突变的抗体。
如本文所用，术语“表位”指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常包含分子的化学活性表面分型，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
如本文所用，可变结构域或可变区是抗体重链或轻链的特定Ig结构域，其包含在不同抗体之间变化的氨基酸序列。每条轻链和每条重链分别具有一个可变区结构域VL和VH。可变结构域提供抗原特异性，并且因此负责抗原识别。每个可变区包含CDR和框架区(FR)，CDR是抗原结合位点结构域的部分。
如本文所用，“抗原结合结构域”和“抗原结合位点(antigen-binding site)”同义地用来指识别并与同种(cognate)抗原物理相互作用的抗体内的结构域。天然的常规全长抗体分子具有两个常规抗原结合位点，每个包含重链可变区部分和轻链可变区部分。常规抗原结合位点包含连接可变区结构域内反向平行的β链的环。抗原结合位点可以包含可变区结构域的其他部分。每个常规抗原结合位点包含3个来自重链的高变区和3个来自轻链的高变区。高变区也称为互补决定区(CDR)。
如本文所用，“高变区”、“HV”、“互补决定区”和“CDR”和“抗体CDR”可交换地用来指一起形成抗体的抗原结合位点的每个可变区内的多个部分中的一个。每个可变区结构域包含3个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。例如，轻链可变区结构域包含3个CDR，命名为VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；重链可变区结构域包含3个CDR，命名为VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。可变区中的3个CDR沿线性氨基酸序列是不连续的，但是在折叠的多肽中接近。CDR位于连接可变结构域的β折叠的平行链的环内。如本文所述，本领域技术人员知道并且可以基于Kabat或Chothia编号鉴定CDR(参见例如，Kabat,E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242,和Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。
如本文所用，框架区(FR)是位于β折叠内的抗体可变区结构域内的结构域；在氨基酸序列方面，FR区比高变区相对更保守。
如本文所用，“恒定区”结构域是抗体重链或轻链中的结构域，其包含比可变区结构域的氨基酸序列相对更保守的氨基酸序列。在常规全长抗体分子中，每条轻链具有单个轻链恒定区(CL)结构域，而每条重链包含一个或多个重链恒定区(CH)结构域，包括CH1、CH2、CH3和CH4。全长IgA、IgD和IgG同种型包含CH1、CH2、CH3和铰链区，而IgE和IgM包含CH1、CH2、CH3和CH4。CH1和CL结构域延伸抗体分子的Fab臂，因此有助于与抗原相互作用以及转动抗体臂。抗体恒定区可以服务于效应子功能，例如但不限于清除该抗体特异性结合的抗原、病原体和毒素，例如通过与各种细胞、生物分子和组织相互作用。
如本文所用，抗体的功能区是包含该抗体的至少VH、VL、CH(例如CH1、CH2或CH3)、CL或铰链区结构域或者至少其功能区的抗体部分。
如本文所用，VH结构域的功能区是保留完整VH结构域的至少部分结合特异性(例如通过保留完整VH结构域的一个或多个CDR)的完整VH结构域的至少一部分，从而所述VH结构域的功能区单独地或者与另一抗体结构域(例如VL结构域)或其区域组合地结合抗原。示例性VH结构域的功能区是包含VH结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的区域。
如本文所用，VL结构域的功能区是保留完整VL结构域的至少部分结合特异性(例如通过保留完整VL结构域的一个或多个CDR)的完整VL结构域的至少一部分，从而所述VL结构域的功能区单独地或者与另一抗体结构域(例如VH结构域)或其区域组合地结合抗原。示例性VL结构域的功能区是包含VL结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的区域。
如本文所用，关于抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”或“免疫特异性地结合”在本文中可交换使用，并且指抗体或抗原结合片段通过抗体和抗原的抗体结合位点之间的非共价相互作用与同种抗原形成一个或多个非共价键的能力。所述抗原可以是分离的抗原或存在于肿瘤细胞。通常，免疫特异性地结合(或特异性结合)抗原的抗体是以约或1×107M-1或1x108M-1或更大的亲和常数Ka(或者1x10-7M或1×10-8M或更低的解离常数(Kd))结合所述抗原。亲和常数可以通过抗体反应的标准动力学方法来测定，例如，免疫测定、表面等离子共振(SPR)(Rich and Myszka(2000)Curr.Opin.Biotechnol 11:54；Englebienne(1998)Analyst.123:1599)、等温滴定量热法(ITC)或本领域已知的其他动力学相互作用测定(参见，例如，Paul,ed.,Fundamental Immunology,2nd ed.,Raven Press,New York,pages332-336(1989)；还参见描述用于计算抗体的结合亲和力的示例性SPR和ITC方法的美国专利第7,229,619号)。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的，并且可商购(参见，BiaCore 2000,Biacore AB,Upsala,Sweden and GE Healthcare Life Sciences；Malmqvist(2000)Biochem.Soc.Trans.27:335)。
如本文所用，关于抗体的术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合片段以与第二抗体或其抗原结合片段足够相似的方式结合一个表位，由此第一抗体与其关联表位的结合结果在存在第二抗体的条件下与不存在第二抗体的条件下相比可检测地降低。或者，在第二抗体与其表位的结合在存在第一抗体条件下也可检测地降低的情况中，可以但不必需是这种情况。也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而不用第二抗体抑制第一抗体与其各自表位的结合。然而，在每个抗体均可检测地抑制另一抗体与其关联表位或配体的结合的情况中，无论是相同、更高或更低程度，所述抗体被称为彼此“交叉竞争”结合其各自的表位。竞争及交叉竞争抗体均涵盖在本发明中。无论这种竞争或交叉竞争发生的机制如何(例如位阻、构象改变或者结合共同表位或其片段)，本领域技术人员基于本发明提供的教导将意识到这种竞争和/或交叉竞争抗体涵盖在本发明中且可用于本发明揭示的方法中。
如本文所用，“多肽”指共价连接的两个或更多个氨基酸。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可交换使用。
"分离的蛋白质"、"分离的多肽"或"分离的抗体"指所述蛋白质、多肽或抗体(1)不与在其天然状态下伴随其天然相关成分关联，(2)不含来自相同物种的其它蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不在天然中发生。因此，经化学合成的多肽或在不同于多肽的天然来源细胞的细胞系统中合成的多肽将会与其天然相关成分"分离"。还可通过分离以使蛋白质实质上不含天然相关成分，即使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术。
在肽或蛋白中，合适的保守氨基酸取代是本领域技术人员已知的，并且一般可以进行而不改变所得分子的生物活性。通常，本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见，例如，Watson et al.,Molecular Biology ofthe Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
如本文所用，分离的核酸分子是从存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。诸如cDNA分子的“分离的”核酸分子可以在通过重组技术制备时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。本文所提供的示例性分离的核酸分子包括编码所提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
序列“相同性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性。(参见，例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,NewJersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987；and Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,MStockton Press,New York,1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法，但是术语“相同性”是技术人员公知的(Carrillo,H.&Lipman,D.,SIAM J AppliedMath 48:1073(1988))。
如本文所用，关于核酸序列、区域、元件或结构域的“可操作地连接”表示核酸区域互相功能相关。例如，启动子可以可操作地连接至编码多肽的核酸，从而所述启动子调控或介导所述核酸的转录。
如本文所用，“表达”指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水平可以利用本领域已知的任何方法来评价，包括例如测定从宿主细胞产生的多肽的量的方法。这类方法可以包括但不限于通过ELISA定量细胞裂解物中的多肽，凝胶电泳之后考马斯蓝染色，Lowry蛋白测定以及Bradford蛋白测定。
如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达载体所编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所含的核酸复制，从而扩增核酸。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于CHO细胞、各种COS细胞、HeLa细胞、HEK细胞例如HEK 293细胞。
“密码子优化”是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地或者最频繁地使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子(例如约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子同时维持该天然氨基酸序列而修饰核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的表达的方法。不同的物种对于特定氨基酸的某些密码子展示出特定的偏好。密码子偏好性(在生物之间的密码子使用的差异)经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率则被认为依赖于被翻译的密码子的性质和特定的转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞内选定的tRNA的优势一般反映了最频繁用于肽合成的密码子。因此，可以将基因定制为基于密码子优化在给定生物中的最佳基因表达。密码子利用率表可以容易地获得，例如在www.kazusa.orjp/codon/上可获得的密码子使用数据库(“Codon Usage Database”)中，并且这些表可以通过不同的方式调整适用。参见，Nakamura Y.等，“Codon usage tabulatedfrom the international DNA sequence databases:status for theyear2000.Nucl.Acids Res.，28:292(2000)。
如本文所用，“载体”是可复制的核酸，当载体转化入适当的宿主细胞时，可以从该载体表达一种或多种异源蛋白。关于载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。关于载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体用来将编码多肽的核酸引入宿主细胞，用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所编码的多肽。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择和用途是本领域技术人员公知的。
如本文所用，载体还包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒的载体是工程化的病毒，其可操作地连接至外源基因以将外源基因转移(作为媒介物或穿梭(shuttle))入细胞。
如本文所用，“表达载体”包括能够表达DNA的载体，所述DNA与诸如启动子区的能够影响这类DNA片段表达的调控序列可操作地连接。这类额外的片段可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或者可以包含这两者的元件。因此，表达载体指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆DNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入宿主细胞基因组的表达载体。
如本文所用，“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。治疗还包括所提供的任何抗体或其抗原结合片段以及本文所提供的组合物的任何药学用途。
如本文所用，“疗效”表示由个体的治疗所导致的效果，其改变、通常改良或改善疾病或疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。
如本文所用，“预防有效量”或“预防有效剂量”指在施用于对象时会具有预期的预防效果的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，例如，防止或延迟疾病或症状的发生或复发，减少疾病或症状发生或复发的可能性。完全预防有效剂量不必通过施用一个剂量发生，并且可以仅在施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次施用中施用。
如本文中所使用的，术语“患者”是指哺乳动物，例如人。
“肿瘤干细胞”是指存在于肿瘤组织中的一小部分具有干性特征的癌细胞，其与普通癌细胞相比具有自我更新能力、强侵袭能力、耐受化疗药物能力和强致瘤能力。
二、针对肿瘤干细胞的单克隆抗体
在本发明中，采用人肿瘤多能干细胞系作为免疫原免疫小鼠，通过经典的杂交瘤融合技术获得了单克隆抗体Hetumomab。产生单克隆抗体Hetumomab的小鼠杂交瘤细胞株Hetumomab于2016年3月16日以保藏号CGMCC No.12251保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。(实施例1)
本发明人发现，本发明的单克隆抗体Hetumomab的靶抗原表达于多种人肿瘤细胞的活细胞表面，并且在多种肿瘤组织中特异性高表达(阳性率79％-94％)。本发明的Hetumomab单抗能够在多种肿瘤细胞的sphere培养细胞中富集且能够识别ESA、CD90等肿瘤干细胞标志物的肿瘤细胞，提示Hetumomab单抗是特异性针对肿瘤干细胞的单克隆抗体(实施例2)。
进一步的基于Hetumomab靶抗原阳性肿瘤细胞的研究显示，相对于亲本肿瘤细胞和Hetumomab靶抗原阴性肿瘤细胞，Hetumomab靶抗原阳性肿瘤细胞具有更强的自我更新、侵袭、耐药和体内致瘤能力，进一步证明Hetumomab单抗特异性靶向肿瘤干细胞(实施例3)。
本发明进一步鉴定了Hetumomab单抗的轻链可变区和重链可变区序列以及相应的CDR序列(实施例6)。将所述可变区序列分别与人轻链和重链恒定区组合，构建了人-鼠嵌合抗体Hetuximab(实施例7)。实验证明，嵌合抗体Hetuximab和小鼠抗体Hetumomab结合肿瘤干细胞上相同的抗原表位，具有类似的抑制肿瘤干细胞的药效学作用(实施例8-9)。
因此，本发明提供针对肿瘤干细胞的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:2具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:3具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:4具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:6具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:7具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO:8具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述单克隆抗体是人源化抗体。
在一些实施方式中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或与SEQID NO:1具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:1具有约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或与SEQID NO:5具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:5具有约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明的分离的单克隆抗体包含人重链恒定区。在一些具体实施方式中，所述人重链恒定区包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明的分离的单克隆抗体包含人轻链恒定区。在一些具体实施方式中，所述人重链恒定区包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明的分离的单克隆抗体包含具有SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的轻链。
在一些实施方式中，本发明的分离的单克隆抗体衍生自Hetumomab。在一些实施方式中，本发明的分离的单克隆抗体与Hetumomab结合肿瘤干细胞上的相同抗原。在一些实施方式中，本发明的分离的单克隆抗体与Hetumomab结合肿瘤干细胞上的相同表位。在一些实施方式中，本发明的分离的单克隆抗体与Hetumomab竞争结合肿瘤干细胞。
在一些实施方式中，本发明的分离的单克隆抗体特异性靶向肿瘤干细胞。本发明的分离的单克隆抗体特异性靶向的肿瘤干细胞包括但不限于乳腺癌干细胞、大肠癌干细胞、胰腺癌干细胞、前列腺癌干细胞、肝癌干细胞、肺癌干细胞和胃癌干细胞。
三、核酸、载体和抗体产生方法
在另一方面，本发明提供分离的核酸分子，其编码前述本发明的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列针对用于表达的宿主细胞进行密码子优化。
在一些实施方式中，本发明的核酸分子与表达调控序列可操作地连接。
本发明还提供表达载体，其包含至少一种前述本发明的核酸分子。
本发明还提供宿主细胞，其由至少一种前述本发明的核酸分子或表达载体转化。
在另一方面，本发明提供一种生产本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，包括：
(i)在适合所述核酸分子或表达载体表达的情况下培养本发明的宿主细胞，和
(ii)分离并纯化由所述宿主细胞表达的抗体或其抗原结合片段。
本发明还涉及通过上述本发明的方法获得的分离的抗体或其抗原结合片段，其能够特异性靶向肿瘤干细胞。
四、疾病治疗和/或预防
肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的一小部分具有干性特征的癌细胞，具有以下生物学特征：能够自我更新、复制，不定向分化，高致瘤性，高侵袭扩散转移能力，对放化疗均不敏感。由于存在肿瘤干细胞，使得肿瘤不断快速生长、扩散、转移、复发。更为严重的是肿瘤干细胞对几乎所有的传统化疗药物、放疗及近年上市的靶向药物(包括抗体靶向药物)均耐药。肿瘤干细胞均处于细胞周期的G0期不生长、不增殖状态。放化疗只对处于高度快速生长增殖的癌细胞有作用，而不能杀灭处于G0期的肿瘤干细胞。而且当放化疗将大量快速生长的癌细胞杀灭后，抵抗放化疗的肿瘤干细胞反而被筛选富集，比例大大提高。由于肿瘤干细胞具有极强的自我复制能力和扩散转移能力，这些肿瘤干细胞会快速分化增殖，生长并扩散，转移至全身各器官形成新的转移病灶，而这种转移病灶的癌细胞均抵抗放化疗，在乳腺癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胃癌等多种恶性肿瘤中已经证明了肿瘤干细胞的存在。恶性程度越高的癌症，肿瘤干细胞越多，而肿瘤干细胞比例越高的癌症患者转移、复发越多，生存期越短。
本发明人发现，本发明的特异性识别肿瘤干细胞的单克隆抗体能够在体外显著抑制多种肿瘤干细胞的自我更新、侵袭和耐药能力(实施例4)。进一步的实验表明，本发明的特异性识别肿瘤干细胞的单克隆抗体能够在动物模型中抑制多种肿瘤移植瘤的生长、转移和耐药(实施例5)。因此，本发明的单克隆抗体能够通过靶向肿瘤干细胞而用于治疗恶性肿瘤、预防或/或治疗恶性肿瘤转移或复发。
由此，本发明提供了一种在患者中治疗恶性肿瘤、预防或/或治疗恶性肿瘤转移或复发的方法，所述方法包括给所述患者施用有效量的本发明的针对肿瘤干细胞的抗体或其抗原结合片段。可以通过本发明的方法治疗和/或预防的恶性肿瘤包括但不限于乳腺癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。
五、药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，其包含本发明的针对肿瘤干细胞的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。所述药物组合物用于在患者中治疗恶性肿瘤、预防或/或治疗恶性肿瘤转移或复发。
本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即抗体分子、免疫缀合物包裹于一种材料中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。
本发明的药物组合物也可含有药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。
可以通过灭菌程序或通过包含诸如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各种抗细菌剂和抗真菌剂确保防止存在微生物。在很多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。常规介质或试剂，除了任何与活性化合物不相容的范围外，都可能在本发明的药物组合物中。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。
治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。
可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量根据所治疗的对象和特定给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分，与药学上可接受的载体相组合。
可以调节剂量方案以提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一推注，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的对象的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。
对于抗体分子的给药而言，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至20mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重，10mg/kg体重或20mg/kg体重，或在1-20mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、每3-6个月一次、或起始给药间隔略短(如每周一次至每三周一次)后期给药间隔加长(如每月一次至每3-6个月一次)。
或者，针对肿瘤干细胞的抗体分子也可以作为持续释放制剂来给药，在此情况中需要频率较低的给药。剂量和频率根据抗体分子在患者中的半衰期而不同。通常，人抗体表现出最长的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给药剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时间内以较不频繁的间隔给予相对较低的剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要以较短的间隔给予较高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选直到患者表现为疾病症状部分或完全改善。之后，可以以预防性方案给患者给药。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。
“有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于肿瘤的治疗，相对于未接受治疗的对象，“有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％。抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查抑制细胞生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解对象的症状如预防和/或治疗转移或复发。本领域技术人员可以根据如下因素确定这种量，如对象的大小、对象症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。
本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。本发明的抗体优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如注射或输注。本文使用的短语“肠胃外给药”是指除肠和局部给药以外的给药模式，通常是注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
或者，本发明的针对肿瘤干细胞的抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物也可以通过非肠胃外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。
活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法受专利保护或者通常为本领域技术人员所公知。参见，例如，Sustainedand controlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
治疗性组合物可应用本领域公知的医疗装置给药。例如，在一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物可用无针皮下注射装置给药，如在美国专利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。可用于本发明的公知的植入物和模块的例子包括：美国专利No.4,487,603，该专利公开了用于以受控速率分散药物的可植入微量输注泵；美国专利No.4,486,194，该专利公开了用于通过皮肤给药的治疗装置；美国专利No.4,447,233，该专利公开了用于以精确的输注速率递送药物的医用输注泵；美国专利No.4,447,224，该专利公开了用于连续递送药物的变流可植入输注装置；美国专利No.4,439,196，该专利公开了具有多腔区室的渗透药物递送系统：和美国专利No.4,475,196，该专利公开了一种渗透药物递送系统。这些专利引入本文作为参考。本领域技术人员公知许多其他这样的植入物、递送系统和模块。
在某些实施方案中，本发明的针对肿瘤干细胞的抗体可配制为确保在体内的正确分布。例如，血-脑屏障(BBB)阻止了许多高度亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物能够跨过BBB(如果需要时)，可将它们配制在如脂质体中。至于制备脂质体的方法，参见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548和5,399,331。脂质体包含可被选择性地转运入特定细胞或器官内的一个或多个靶向部分，从而增强靶向药物递送(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。靶向部分的例子包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
所述药物组合物中本发明的针对肿瘤干细胞的抗体或其抗原结合片段还可以与诸如细胞毒素、放射性同位素或生物活性蛋白质等治疗性部分缀合。
细胞毒素包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括：紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和它们的类似物或同系物。
可用于缀合的治疗剂还包括，例如：抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)，烷化剂(例如，氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合铂(II)(DDP)顺铂)，氨茴霉素类(例如，柔红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。
能与本发明的针对肿瘤干细胞的抗体缀合的治疗性细胞毒素的其他优选例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、阿里他汀、和它们的衍生物。
可以利用本领域使用的接头技术将细胞毒素与本发明的针对肿瘤干细胞的抗体缀合。已经用于将细胞毒素与针对肿瘤干细胞的抗体缀合的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接头。可以选择，例如，在溶酶体区室内易被低pH切割或易被蛋白酶切割的接头，该蛋白酶例如是在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D)。
关于细胞毒素的类型、用于缀合治疗剂与抗体的接头和方法的进一步讨论，参见Saito，G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等(2003)Cancer.Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53：247-264。
本发明的针对肿瘤干细胞的抗体也可以与放射性同位素缀合，产生细胞毒性放射性药物，也被称作放射性抗体缀合物。能够与诊断或治疗性使用的抗体缀合的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。制备放射性抗体缀合物的方法在本领域中已经建立。
本发明的针对肿瘤干细胞的抗体也可以与具有需要的生物活性的蛋白质缀合，可用于修饰特定的生物学反应。这样的生物活性蛋白质包括，例如：具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物学反应调节物，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、白介素-10(“IL-10”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他免疫因子如IFN等。
将这种治疗性部分与抗体分子缀合的技术是众所周知的，参见，例如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(ed.)，pp.243-56(AlanR.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，Controlled DrugDelivery(2nd Ed.)，Robinson等(ed.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，MonoclonalAntibodies’84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(ed.)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy，Baldwin等(ed.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates，”Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。
六、联合治疗
本发明的针对肿瘤干细胞的抗体或药物组合物可以与化疗剂或靶向其他肿瘤抗原的抗体联合施用。本申请实施例5证明了本发明的单克隆抗体与化疗剂联合施用在肿瘤治疗中具有协同作用。不受任何理论的限制，认为本发明的针对肿瘤干细胞的抗体能够抑制肿瘤耐药功能，从而能够在与化疗剂或靶向其他肿瘤抗原的抗体组合施用时取得协同效果。
可以与本发明的抗体或本发明的药物组合物组合使用的化疗剂或靶向其他肿瘤抗原的抗体没有特别限制。所述化疗剂和靶向其他肿瘤抗原的抗体的实例包括但不限于：异环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、美法仑、依诺他宾、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、替加氟、替加氟-尿嘧啶、TS-1、去氧氟尿苷、奈拉滨、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯嘌呤、甲氨蝶呤、伊立替康、依托泊苷、艾立布林、索布佐生、多西他赛、紫杉醇、长春瑞滨、长春新碱、长春地辛、长春碱、放线菌素D、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁酯、柔红霉素、多柔比星、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、奥沙利铂、卡铂、顺铂、奈达铂、阿那曲唑、依西美坦、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、比卡鲁胺、托瑞米芬、氟他胺、泼尼松龙、磷雌酚、米托坦、甲睾酮、亮丙瑞林、来曲唑、甲基安宫黄体酮、替伊莫单抗、伊马替尼、依维莫司、厄洛替尼、吉非替尼、舒尼替尼、西妥昔单抗、索拉非尼、达沙替尼、他米巴罗汀、曲妥珠单抗、维甲酸、帕木单抗、贝伐单抗、硼替佐米、和拉帕替尼。在一个具体的实施方式中，所述化疗剂是含铂的化疗剂，例如顺铂。
本发明的抗体和所述化疗剂或靶向其他肿瘤抗原的抗体可以全部在一次施用或分开施用。当分开施用时(采用互相不同的施用方案的情况下)，它们可以连续施用而不中断或以预定的间隔施用。
本发明的抗体和所述化疗剂或靶向其他肿瘤抗原的抗体在本发明的药物组合物中的组合剂量没有特别限制。如上所述，本发明的抗体的剂量可以通过参考当所述抗体单独使用时的剂量来确定。所述化疗剂和靶向其他肿瘤抗原的抗体可以根据各自药物标明的剂量使用或可以减少(考虑到和本发明的抗体的组合效果)。
本发明的抗体或本发明的药物组合物还可以与放疗联合，例如包括向患者施用电离辐射，其早于、在其过程中和/或晚于本发明的抗体或药物组合物的施用过程。
七、肿瘤干细胞检测和纯化
如本文所述，本发明的单克隆抗体特异性识别肿瘤干细胞。因此，本发明还提供一种检测生物学样品中肿瘤干细胞存在的方法，包括：
a)使所述生物学样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；
b)检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述生物学样品中的靶抗原的结合，其中检出代表所述生物学样品中存在肿瘤干细胞。
在一些实施方案中，所述肿瘤干细胞选自乳腺癌干细胞、大肠癌干细胞、胰腺癌干细胞、前列腺癌干细胞、肝癌干细胞、肺癌干细胞和胃癌干细胞。
在本发明上述检测方法的一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还缀合有可用于检测或可被其他试剂检测到的荧光染料、化学物质、多肽、酶、同位素、标签等。
用于检测抗体-抗原结合的方法是本领域已知的，例如ELISA等。
本发明还提供一种用于分离肿瘤干细胞的方法，所述方法包括：
(a)提供疑似包含肿瘤干细胞的细胞群；
(b)鉴定所述细胞的亚群，其结合本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段；和
(c)分离所述亚群。
例如，可以通过流式细胞术分离肿瘤干细胞。
八、诊断和预后
如本文所述，本发明的单克隆抗体的靶抗原表达于多种人肿瘤细胞的活细胞表面，并且在多种肿瘤组织中特异性高表达(阳性率79％-94％)。
因此，本发明还提供了一种检测患者中恶性肿瘤的存在的方法，包括：
a)使获得自所述患者的生物学样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；
b)检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述生物学样品中的靶抗原的结合，其中检出代表所述患者中存在恶性肿瘤。
本发明还提供一种用于预后患者中恶性肿瘤复发或进展的方法，所述方法包括：
(a)从所述患者中分离包含循环细胞的生物学样品；
(b)使所述包含循环细胞的生物学样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；和
(c)鉴定结合本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的循环细胞的存在，
从而预后所述患者中恶性肿瘤的复发或进展。
在一些实施方案中，所述恶性肿瘤的进展包含所述恶性肿瘤在患者中的转移。
鉴定到结合本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的循环细胞的存在提示所述患者中恶性肿瘤复发或进展的高风险。
在一些实施方案中，所述生物学样品包括血液样品、淋巴样品或其组分。
在一些实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。
在本发明上述方法的一些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还缀合有可用于检测或可被其他试剂检测到的荧光染料、化学物质、多肽、酶、同位素、标签等。
用于检测抗体-抗原结合的方法是本领域已知的，例如ELISA等。
九、试剂盒
本发明的范围内还包括用于本发明的方法的试剂盒，该试剂盒包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及使用说明。该试剂盒可以进一步包括至少一种另外的检测试剂，其用于检测本发明的单克隆抗体的存在。试剂盒一般包括表明试剂盒内容物的预期用途和/或使用方法的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。
实施例
通过参考在此给出的一些具体实施例可获得对本发明的进一步的理解，这些实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，可以对本发明作出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。
实施例1 小鼠单克隆抗体Hetumomab的制备
一、抗人肿瘤多能干细胞小鼠单克隆抗体库的制备
本实施例采用一种人肿瘤多能干细胞系T3A-A3作为免疫原(Liu H,et al.CellDeath and Disease.2013,4:e857)。该人肿瘤干细胞系从原发肝癌患者手术切除的肝癌组织中分离获得，能够在体外长期传代培养。。该细胞系已传代超过100次，细胞仍然生长迅速，并保持干细胞性质。该细胞系既表达多种干细胞的标志物、具有干细胞的自我更新能力、具有向不同肿瘤细胞定向分化的潜能；同时也具有肿瘤性质，具有成瘤能力和转移能力。该细胞系在体外长期培养而保持性质不变，并且在免疫缺陷鼠体内成瘤能力和转移能力强。
将扩大培养获得的肝癌干细胞(人肿瘤多能干细胞)系T3A-A3采用多聚甲醛固定，免疫普通Balb/c鼠，2-4周一次，每次约1×107细胞。长期免疫，直至采用常规细胞免疫化学方法测定免疫小鼠血清抗人肝癌干细胞(人肿瘤多能干细胞)系T3A-A3的滴度超过1:50000。取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0采用常规的PEG介导融合的方法，融合形成分泌小鼠单克隆抗体的杂交瘤。采用常规的甲基纤维素平板法制备杂交瘤单克隆，待各个单克隆生长后将其分别挑取至96孔板继续培养，由此获得含有大量抗人肝癌干细胞(人肿瘤多能干细胞)系T3A-A3的单克隆抗体的杂交瘤克隆的文库。收集96孔板中每个杂交瘤克隆的培养上清，用于下一步的测定和筛选过程。
二、抗人肿瘤多能干细胞小鼠单克隆抗体Hetumomab的筛选
无血清悬浮培养基采用含20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、按1:50比例添加B27、10ng/mL LIF、2mmol/mL谷氨酰胺、1μ/mL Heparin的DMEM/F12(1:1)培养液。使用无血清培养基培养前洗涤1次细胞。将经无血清悬浮培养的人肝癌干细胞(人肿瘤多能干细胞)系T3A-A3球形细胞，轻柔吹散成单细胞，以2000细胞/孔接种96孔板。用无血清培养基培养24h后，用含1％BSA的PBS洗涤细胞，每孔中分别加入一个杂交瘤克隆的培养上清100μL，室温孵育2小时；用含1％BSA的PBS洗涤5次后，加入生物素标记抗鼠二抗室温，反应30分钟；再用含1％BSA的PBS洗涤5次后，加入Cy3标记的Avidin，室温反应30分钟；含1％BSA的PBS洗涤5次后，在荧光显微镜下进行荧光镜检，判断单抗库中的各个单抗杂交瘤上清与人肝癌干细胞(人肿瘤多能干细胞)系T3A-A3的反应。能观察到部分细胞具有荧光染色即判断为阳性，初步筛选获得能与人肝癌干细胞(人肿瘤多能干细胞)系T3A-A3膜表面抗原结合的鼠单克隆抗体。
进一步，选择无血清悬浮培养的人肝癌细胞系(Yan Li,Zhao-You Tang,Sheng-Long Ye,Yin-Kun Liu,Jie CHEN,Qiong Xue,Jun Chen,Dong-Mei Gao,Wei-HuaBao.Establishment of cell clones with different metastatic potential from themetastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97.世界胃肠病学杂志(英文版).2001,7(05):630-636.)的球形细胞，同样进行以上程序，荧光显微镜镜检判断单抗库中的杂交瘤单抗上清与人肝癌干细胞(MHCC97L球形细胞富含肝癌干细胞)的反应，获得能与肝癌干细胞膜表面抗原结合的鼠单克隆抗体。
从抗人肿瘤多能干细胞小鼠单克隆抗体库筛选出1株小鼠单克隆抗体Hetumomab，其不仅与人肿瘤多能干细胞系T3A-A3膜表面抗原结合，也同时与人肝癌MHCC97L细胞系的干细胞(MHCC97L球形细胞)膜表面抗原结合，证明小鼠单克隆抗体Hetumomab能够识别不同来源的人肝癌干细胞。选择小鼠单克隆抗体Hetumomab进行进一步鉴定和药效研究。
分泌Hetumomab单抗的小鼠杂交瘤细胞以保藏号CGMCC No.12251于2016年3月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)。
将Hetumomab杂交瘤细胞进行扩大培养，收集含抗体上清。采用Southern Biotech公司的单抗亚类检测试剂盒鉴定单抗的类和亚类以及Sigma公司的ELISA二抗检测上清的抗体产量。实验结果显示单抗Hetumomab为IgG1型重链、κ型轻链。
分泌单抗Hetumomab的杂交瘤细胞在体外扩大培养，待细胞长至80％，更换无血清培养基，继续培养4-5天后，收集分泌有抗体的无血清上清液。采用抗Protein G纯化柱纯化单抗Hetumomab。再用10％SDS-PAGE经考马斯亮兰染色鉴定分离纯化的Hetumomab单抗的纯度。结果显示，Hetumomab的重链分子量约在47kDa，轻链分子量约在26kDa，这与理论上一般IgG抗体重链和轻链的分子量相符合。扫描分析电泳目的条带的纯度在95％以上，纯化的Hetumomab单抗纯度满足后续实验的要求。
实施例2 Hetumomab靶抗原在多种肿瘤细胞及组织中特异表达
一、Hetumomab靶抗原在人多种肝癌、肺癌、胃癌细胞系中表达且可表达于活细胞表面。
采用常规活细胞免疫荧光染色技术检测了单抗Hetumomab靶抗原在人多种肿瘤细胞系如肝癌、肺癌、胃癌细胞系中在活细胞表面的表达情况。具体技术方法大致如下：细胞爬片或接种96孔培养板(4×103个/孔)，待细胞长到60％～70％满时，无血清培养液洗2次，PBS洗1次。加入一抗(杂交瘤上清或纯化抗体)，鼠抗α-tublin抗体(稀释度1:1000)作为细胞是否通透的对照，正常鼠IgG、SP2/0上清、PBS作为阴性对照，室温孵育1h；活细胞洗液(含1％BSA的PBS)洗涤5次，每次5min；4％多聚甲醛室温下固定15min；固定细胞洗液(含0.1％BSA、0.05％tween-20的PBS)洗涤5次，每次5min；加入100μl的二抗，避光室温孵育30min；固定细胞洗液洗涤5次，每次5min；50μl含10μg/ml DAPI、50％甘油的PBS封闭；荧光显微镜下观察。以观察到部分细胞出现膜荧光染色为阳性结果。
结果发现，单抗Hetumomab靶抗原可表达于以下这些人肝癌、肺癌、胃癌细胞系(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)活细胞的表面：
人肝癌细胞系：MHCC97L、Bel7402-V13；
人肺癌细胞系：A549、SPCA-1；
人胃癌细胞系：SNU-5、BGC-823。
部分典型的阳性结果照片如图1所示。
以上结果说明单抗Hetumomab靶抗原在人多种肿瘤，例如肝癌、肺癌、胃癌细胞系中均有表达且可表达于活的癌细胞的膜表面。
二、Hetumomab靶抗原在人肝癌、肺癌、胃癌组织中特异高表达。
采用传统的常规免疫组织化学技术，以Hetumomab为一抗，采用抗鼠抗体二抗，检测了单抗Hetumomab靶抗原在多例人肝癌、肺癌、胃癌患者及相关其他组织中的表达情况。
具体技术方法大致如下：将组织片子常规脱蜡；柠檬酸缓冲液(pH6.0)倒入抗原修复盒，放入片子，将修复盒置于沸水中，水浴加热30min，室温自然冷却2h；PBS洗涤3min×3次，将片子上的水甩干，立即用组化笔沿组织划圈；每块组织上加一滴内源性过氧化物酶阻断溶液，室温孵育20min，PBS洗涤3min×3次，甩掉洗液，加一滴正常动物血清——羊血清封闭，室温孵育20min；甩掉封闭血清，各组织点上加一抗，放入保湿盒中，4℃过夜孵育；甩掉一抗，PBS洗涤3min×3次，甩掉洗液，加二抗biotin-抗鼠抗体二抗，室温孵育20min；PBS洗涤3min×5次，甩掉洗液，加一滴Avidin-HRP，室温孵育10min；PBS洗涤3min×3次，甩掉洗液，加一滴新鲜配制的DAB，显微镜下观察，同时严格计时，待组织呈阳性后，自来水冲洗终止；苏木素复染5min，1％盐酸-75％酒精分色2秒，自来水冲洗；片子脱水后用中性树胶封片，显微镜下观察。
以单抗Hetumomab为一抗，检测了120例人肝癌组织、20例癌旁组织、10例正常肝组织、10例肝炎组织、40例肝硬化组织中单抗Hetumomab靶抗原的表达情况。实验结果(表1)显示：单抗Hetumomab的靶抗原在79.17％(95/120)的人肝癌组织中特异性表达，而在癌旁组织、正常肝组织、肝炎组织及肝硬化组织中均未见其表达，说明了单抗Hetumomab靶抗原在人肝癌组织中特异高表达。
表1.免疫组化技术检测单抗Hetumomab靶抗原在人肝癌组织中表达的结果
Figure BDA0001330205880000311
以单抗Hetumomab为一抗，检测了160例人肺癌组织、32例癌旁组织、3例正常肺组织中单抗Hetumomab靶抗原的表达情况。实验结果(表2)显示：单抗Hetumomab的靶抗原在82.5％(132/160)的人肺癌组织中特异性表达，而仅仅在6.25％的癌旁组织中表达，在正常肺组织中未见其表达，说明了单抗Hetumomab靶抗原在人肺癌组织中特异高表达。
表2.免疫组化技术检测Hetumomab靶抗原在人肺癌组织中的表达
Figure BDA0001330205880000312
以单抗Hetumomab为一抗，检测了110例人胃癌组织、20例癌旁组织、3例正常胃组织中单抗Hetumomab靶抗原的表达情况。实验结果(表3)显示：单抗Hetumomab的靶抗原在93.64％(103/110)的人胃癌组织中特异性表达，而在癌旁组织和正常胃组织中均未见其表达，说明了单抗Hetumomab靶抗原在人胃癌组织中特异高表达。
表3.免疫组化技术检测单抗Hetumomab靶抗原在人胃癌组织中表达的结果
Figure BDA0001330205880000313
以上免疫组化检测结果的部分典型的阳性结果照片如图2所示。
以上这些结果说明单抗Hetumomab靶抗原在人多种肿瘤，例如肝癌、肺癌、胃癌的多数患者的癌组织中均有特异的高表达。
实施例3 单抗Hetumomab识别肿瘤干细胞
一、单抗Hetumomab识别的癌细胞在癌细胞的sphere培养细胞中富集。
根据现有大量文献报道，无血清悬浮培养即sphere(成球)培养可以富集肿瘤干细胞(Reynolds,B.A.and S.Weiss,"Clonal and population analyses demonstrate thatan EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell."Dev Biol,1996.175(1):p.1-13.；Fang,N.,et al.,"pH responsive adhesion of phospholipidvesicle on poly(acrylic acid)cushion grafted to poly(ethylene terephthalate)surface."Colloids Surf B Biointerfaces,2005.42(3-4):p.245-52.；和Tirino,V.,etal.,"The role of CD133in the identification and characterisation of tumour-initiating cells in non-small-cell lung cancer."Eur J Cardiothorac Surg,2009.36(3):p.446-53.)。所以根据单抗Hetumomab识别的癌细胞能否在sphere培养中得到富集来初步判断单抗Hetumomab识别的细胞是否与肿瘤干细胞相关。
对人肝癌细胞系Bel7402-V13和MHCC97L细胞进行了无血清培养5天后，采用活细胞流式荧光术对亲本细胞和sphere培养细胞中Hetumomab+细胞进行了检测。实验结果(表4)显示Hetumomab+细胞在Bel7402-V13sphere细胞的比例为8.92％，比其在亲本细胞中的比例2.25％富集了3.96倍；Hetumomab+细胞在MHCC97L sphere细胞中的比例为7.51％，比其在亲本细胞中的比例3.45％富集了2.18倍。即经过无血清培养后，肝癌细胞系的Hetumomab+细胞得到了富集。
表4.免疫流式荧光技术检测单抗Hetumomab识别的肝癌细胞在肝癌细胞的sphere培养细胞中富集的结果
Figure BDA0001330205880000321
对人肺癌细胞系SPCA-1和A549细胞进行了无血清培养5天后，采用活细胞流式荧光术对亲本细胞和sphere培养细胞中Hetumomab+细胞进行了检测。实验结果(表5)显示Hetumomab+细胞在SPCA-1sphere细胞的比例为7.34％，比其在亲本细胞中的比例1.74％富集了4.22倍；Hetumomab+细胞在A549sphere细胞中的比例为13.30％，比其在亲本细胞中的比例7.23％富集了1.84倍。即经过无血清培养后，肺癌细胞系的Hetumomab+细胞得到了富集。
表5.免疫流式荧光技术检测单抗Hetumomab识别的肺癌细胞在肺癌细胞的sphere培养细胞中富集的结果
Figure BDA0001330205880000331
对人胃癌细胞系SNU-5和BGC-823细胞进行了无血清培养5天后，采用活细胞流式荧光术对亲本细胞和sphere培养细胞中Hetumomab+细胞进行了检测。实验结果(表6)显示Hetumomab+细胞在SNU-5 sphere细胞的比例为7.19％，比其在亲本细胞中的比例3.38％富集了2.13倍；Hetumomab+细胞在BGC-823 sphere细胞中的比例为7.45％，比其在亲本细胞中的比例2.95％富集了2.53倍。即经过无血清培养后，胃癌细胞系的Hetumomab+细胞得到了富集。
表6.免疫流式荧光技术检测单抗Hetumomab识别的胃癌细胞在胃癌细胞的sphere培养细胞中富集的结果
Figure BDA0001330205880000332
以上免疫流式荧光检测结果的部分典型的图谱如图3所示。
以上这些结果说明单抗Hetumomab识别的癌细胞在人多种肿瘤，例如肝癌、肺癌、胃癌细胞系的sphere培养细胞中均显著富集。
二、单抗Hetumomab识别ESA、CD90阳性的肿瘤干细胞。
现已有多篇文献(Yamashita T,et al.EpCAMpositive hepatocellularcarcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cellfeatures.Gastroenterology.2009,136(3):1012-1024.；和Yang ZF.Identification oflocal and circulating cancer stem cells in human livercancer.Hepatology.2008,47(3):919-928.)证明了ESA和CD90为一些肝癌细胞的肿瘤干细胞表面标志物。为了检测在人肝癌细胞Bel7402-V13细胞中单抗Hetumomab识肝癌细胞同时也是ESA、CD90标志物阳性的肝癌干细胞，我们采用双色流式荧光术，对在无血清培养基中培养5天的人肝癌Bel7402-V13细胞进行了染色。
结果(如表7)显示，单抗Hetumomab识别的细胞比例为8.52％，ESA+干细胞表达比例为9.02％，两者共染比例为3.63％，即单抗Hetumomab识别了40.2％的ESA+干细胞。对在无血清培养基中培养5天的人肝癌MHCC97L细胞进行了染色，结果(如表7)显示，单抗Hetumomab识别的细胞比例为2.38％，CD90+干细胞表达比例为4.54％，两者共染比例为2.01％，即单抗Hetumomab识别了44.3％的CD90+干细胞。
表7.双色流式荧光术检测单抗Hetumomab与ESA、CD90肝癌干细胞表面标志物在肝癌细胞中共染色的结果
Figure BDA0001330205880000341
以上这些结果说明单抗Hetumomab识别ESA、CD90等标志物阳性的人肿瘤干细胞。
三、单抗Hetumomab识别的癌细胞具有更强的自我更新能力
自我更新能力、强侵袭能力、耐受化疗药物能力和强致瘤能力是肿瘤干细胞区别于普通子代肿瘤细胞的重要基本特征。因此，为了进一步验证单抗Hetumomab识别的细胞是否具有肿瘤干细胞特性，分选了多种人肿瘤细胞中的Hetumomab+细胞，检测其自我更新、侵袭、耐药和体内致瘤能力。
肿瘤干细胞的自我更新能力主要的表现形式为在无血清培养基中的成球能力，其方式称为不对称分裂，即一个细胞分裂成两个子代细胞时，其中一个子代细胞保持着与亲代细胞完全相同的特征，而另一个子代细胞可以继续分裂，形成正常的子代细胞。因此，可以通过检测Hetumomab+细胞在无血清培养基中的成球能力来确定其自我更新能力。
采用流式分选技术从培养5天的人肝癌Bel7402-V13sphere细胞中分离出Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞。将分选得到的细胞以500个/孔接种于含0.8％甲基纤维素的半固态sphere培养基(半固态sphere培养基为含0.8％甲基纤维素、20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、按1:50比例添加B27、10ng/mL LIF、2mmol/mL谷氨酰胺、1u/mLHeparin的DMEM/F12(1:1)培养液)中，在超低粘附24孔板中培养，观察各细胞成球数量。结果显示(表8)，Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞在无血清培养基条件下的成球数分别为262±8.5、168±5.6、98±5.6，即Hetumomab+细胞的成球率明显高于其他两种细胞(p<0.05)。因此，Hetumomab+细胞比亲本细胞和Hetumomab-细胞具有更强的自我更新能力。
表8 肝癌细胞中Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞自我更新能力的比较
Figure BDA0001330205880000351
采用流式分选技术从人肺癌SPCA-1sphere细胞中分离出Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞。将分选得到的细胞以500个/孔接种于含0.8％甲基纤维素的半固态sphere培养基中，在超低粘附24孔板板中培养，观察各细胞成球数量。结果显示(表8)，Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞在无血清培养基条件下的成球数分别为165.7±6.0、127±5.6、83.7±4.7，即Hetumomab+细胞的成球率明显高于其他两种细胞(p<0.05)。因此，Hetumomab+细胞比亲本细胞和Hetumomab-细胞具有更强的自我更新能力。
表9 肺癌细胞中Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞自我更新能力的比较
Figure BDA0001330205880000352
Figure BDA0001330205880000361
采用流式分选技术从人胃癌SNU-5 sphere细胞中分离出Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞。将分选得到的细胞以500个/孔接种于含0.8％甲基纤维素的半固态sphere培养基中，在超低粘附24孔板板中培养，观察各细胞成球数量。结果显示(表10)，Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞在无血清培养基条件下的成球数分别为24±1.4、15.5±0.7、11.5±0.7，即Hetumomab+细胞的成球率明显高于其他两种细胞(p<0.05)。因此，Hetumomab+细胞比亲本细胞和Hetumomab-细胞具有更强的自我更新能力。
表10 胃癌细胞中Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞自我更新能力的比较
Figure BDA0001330205880000362
以上这些结果说明单抗Hetumomab识别的多种癌细胞(肝癌、肺癌、胃癌)均具有更强的自我更新能力，即具有肿瘤干细胞主要特征之一：高自我更新能力。
四、单抗Hetumomab识别的癌细胞具有更强的侵袭能力
自我更新能力、强侵袭能力、耐受化疗药物能力和强致瘤能力是肿瘤干细胞区别于普通子代肿瘤细胞的重要基本特征。因此，为了进一步验证单抗Hetumomab识别的细胞是否具有肿瘤干细胞特性，故分选了多种人肿瘤细胞中的Hetumomab+细胞，检测其自我更新、侵袭、耐药和体内致瘤能力。
采用流式分选技术从培养5天的人肝癌Bel7402-V13 sphere细胞中分离出Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞。将分选得到的细胞以相同数量接种于预先包被Matrigel胶的Transwell小室中，24h后固定，显微镜下观察穿膜的细胞数。结果显示(表11)，Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞穿膜的细胞数为分别为每视野308±9.5、210±10.7和132±14.7，即Hetumomab+细胞的侵袭穿过膜的数量明显高于其他两种细胞(p<0.05)。因此，Hetumomab+细胞比亲本细胞和Hetumomab-细胞具有更强的侵袭能力。
表11 肝癌细胞中Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞侵袭能力的比较
Figure BDA0001330205880000371
采用流式分选技术从培养的人肺癌SPCA-1 sphere细胞中分离出Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞。将分选得到的细胞以相同数量接种于预先包被Matrigel胶的Transwell小室中，24h后固定，显微镜下观察穿膜的细胞数。结果显示(表12)，Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞穿膜的细胞数为分别为每视野222±11.5、193.7±5.7、154.3±12.1，即Hetumomab+细胞的侵袭穿过膜的数量明显高于其他两种细胞(p<0.05)。因此，Hetumomab+细胞比亲本细胞和Hetumomab-细胞具有更强的侵袭能力。
表12 肺癌细胞中Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞侵袭能力的比较
Figure BDA0001330205880000372
采用流式分选技术从培养的人胃癌SNU-5 sphere细胞中分离出Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞。将分选得到的细胞以相同数量接种于预先包被Matrigel胶的Transwell小室中，24h后固定，显微镜下观察穿膜的细胞数。结果显示(表13)，Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞穿膜的细胞数为分别为每视野247.5±19.1、142.5±9.2和145.0±11.3，即Hetumomab+细胞的侵袭穿过膜的数量明显高于其他两种细胞(p<0.05)。因此，Hetumomab+细胞比亲本细胞和Hetumomab-细胞具有更强的侵袭能力。
表13 胃癌细胞中Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞侵袭能力的比较
Figure BDA0001330205880000381
以上这些结果说明单抗Hetumomab识别的多种癌细胞(肝癌、肺癌、胃癌)均具有更强的侵袭能力，即具有肿瘤干细胞主要特征之一：高侵袭性。
五、单抗Hetumomab识别的癌细胞具有更强的耐受化疗药物的能力
自我更新能力、强侵袭能力、耐受化疗药物能力和强致瘤能力是肿瘤干细胞区别于普通子代肿瘤细胞的重要基本特征。因此，为了进一步验证单抗Hetumomab识别的细胞是否具有肿瘤干细胞特性，故分选了多种人肿瘤细胞中的Hetumomab+细胞，检测其自我更新、侵袭、耐药和体内致瘤能力。
为了检测Hetumomab+肝癌细胞的耐药能力，将人肝癌细胞Bel7402-V13 sphere细胞流式分选获得的Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞以5000个/孔的数量接种于96孔板中，每组细胞均用含0μg/mL、0.0625μg/mL、0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL和4μg/mL 8种不同浓度的顺铂的完全培养基培养，3天后更换1次培养基，7天后用CCK8法检测OD值测定反映其耐药能力的IC50。实验结果显示(表14，图4)，Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞的IC50分别为0.739μg/mL、0.502μg/mL和0.313μg/mL，即Hetumomab+细胞的耐药性明显高于亲本细胞和Hetumomab-细胞，差异有统计学意义(p<0.05)。因此，Hetumomab+肝癌细胞比亲本细胞和Hetumomab-细胞具有更强的耐受化疗药物的能力。
表14 肝癌细胞中Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞耐受化疗药物能力的比较
Figure BDA0001330205880000391
为了检测Hetumomab+肺癌细胞的耐药能力，将人肺癌细胞SPCA-1 sphere细胞中流式分选获得的Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞以5000个/孔的数量接种于96孔板中，每组细胞均用含0μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.6μg/mL、0.8μg/mL、1μg/mL和2μg/mL 7种不同浓度的顺铂的完全培养基培养，之后用CCK8法检测OD值测定反映其耐药能力的IC50。实验结果显示(表15，图4)，Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞的IC50分别为0.707μg/mL、0.513μg/mL和0.180μg/mL，即Hetumomab+细胞的耐药性明显高于亲本细胞和Hetumomab-细胞，差异有统计学意义(p<0.05)。因此，Hetumomab+肺癌细胞比亲本细胞和Hetumomab-细胞具有更强的耐受化疗药物的能力。
表15 肺癌癌细胞中Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞耐受化疗药物能力的比较
Figure BDA0001330205880000392
为了检测Hetumomab+胃癌细胞的耐药能力，我们将人胃癌细胞SNU-5 sphere细胞中流式分选获得的Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞以5000个/孔的数量接种于96孔板中，每组细胞均用含0μg/mL、0.0125μg/mL、0.025μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL和0.8μg/mL 8种不同浓度的顺铂的完全培养基培养，之后用CCK8法检测OD值测定反映其耐药能力的IC50。实验结果显示(表16，图4)，Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞的IC50分别为0.285μmol/L、0.155μmol/L和0.094μmol/L，即Hetumomab+细胞的耐药性明显高于亲本细胞和Hetumomab-细胞，差异有统计学意义(p<0.05)。因此，Hetumomab+胃癌细胞比亲本细胞和Hetumomab-细胞具有更强的耐受化疗药物的能力。
表16 胃癌细胞中Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞耐受化疗药物能力的比较
Figure BDA0001330205880000401
以上这些结果说明单抗Hetumomab识别的多种癌细胞(肝癌、肺癌、胃癌)均具有更强的耐受化疗药物能力，即具有肿瘤干细胞主要特征之一：强耐药性。
六、单抗Hetumomab识别的癌细胞具有更强的体内致瘤能力
自我更新能力、强侵袭能力、耐受化疗药物能力和强致瘤能力是肿瘤干细胞区别于普通子代肿瘤细胞的重要基本特征。因此，为了进一步验证单抗Hetumomab识别的细胞是否具有肿瘤干细胞特性，故分选了多种人肿瘤细胞中的Hetumomab+细胞，检测其自我更新、侵袭、耐药和体内致瘤能力。
检验一种细胞是否为肿瘤干细胞的“金标准”是体内的强致瘤性。因此，将人肝癌细胞Bel7402-V13 sphere细胞流式分选获得的Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞分别接种至4周龄大小的裸鼠皮下，长时间观察其体内成瘤的情况。结果如表17所示，1×104个Hetumomab+细胞在接种3周时就可在小鼠体内致瘤，而亲本细胞则需1×105个细胞在接种3周后才出瘤，Hetumomab-细胞在观察期间始终没有出瘤。这项经典实验的结果说明Hetumomab+细胞的体内致瘤性较亲本和Hetumomab-细胞显著强。提示Hetumomab+细胞具有肿瘤干细胞的高致瘤性特征，符合肿瘤干细胞的判定“金标准”。因此，单抗Hetumomab识别的细胞是肝癌肿瘤干细胞。
表17 肝癌细胞Bel7402-V13中Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞体内致瘤能力的比较(成瘤的动物只数)
Figure BDA0001330205880000411
将人胃癌细胞SNU-5 sphere细胞流式分选获得的Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞分别接种至4周龄大小的裸鼠皮下，长时间观察其体内成瘤的情况。结果如表18所示，2×103个Hetumomab+细胞在接种3月时就可在小鼠体内半数小鼠致瘤，而亲本细胞2×103个细胞在接种4个月后仍未出瘤，Hetumomab-细胞在观察期间始终没有出瘤。这项经典实验的结果说明Hetumomab+细胞的体内致瘤性较亲本和Hetumomab-细胞显著强。提示Hetumomab+细胞具有肿瘤干细胞的高致瘤性特征，符合肿瘤干细胞的判定“金标准”。因此，单抗Hetumomab识别的细胞是胃癌肿瘤干细胞。
表18 胃癌细胞SNU-5中Hetumomab+细胞、亲本细胞和Hetumomab-细胞体内致瘤能力的比较(成瘤的动物只数)
Figure BDA0001330205880000412
Figure BDA0001330205880000421
以上这些结果说明单抗Hetumomab识别的多种癌细胞(肝癌、胃癌)均具有更强的体内致瘤能力，即具有肿瘤干细胞主要特征之一高致瘤性。
实施例4 单抗Hetumomab可以抑制肿瘤干细胞的自我更新、侵袭和耐药功能
一、单抗Hetumomab显著抑制多种肿瘤(肝癌、胃癌、肺癌)的肿瘤干细胞的自我更新能力(肿瘤干细胞主要特征之一)。
肿瘤干细胞的自我更新能力主要的表现形式为在无血清培养基中的成球能力，其方式称为不对称分裂，即一个细胞分裂成两个子代细胞时，其中一个子代细胞保持着与亲代细胞完全相同的特征，而另一个子代细胞可以继续分裂，形成正常的子代细胞。为了证明单抗Hetumomab是否是能够直接抑制肝癌干细胞的功能性单抗，我们将在无血清培养基中培养5天的人肝癌细胞系Bel7402-V13sphere细胞制备成单细胞悬液后，以纯化的单抗Hetumomab(250μg/mL)为实验组，以PBS为阴性对照组，与细胞在37℃孵育2h，期间每隔半小时将细胞与抗体或阴性对照混匀一次。各组取500个细胞接种于含0.8％甲基纤维素的半固态sphere培养基(含EGF、LIF、bFGF等)中，于超低粘附24孔板板中培养，隔天补液1-1.5mL，14天后观察两组细胞成球数量。实验结果(图5)显示，实验组的成球数量为212±2.8，而阴性对照组的成球数量为278.5±0.7个，明显高于实验组。单抗Hetumomab对Bel7402-V13细胞的成球抑制率达23.9％，p<0.05，有统计学差异。结果表明，单抗Hetumomab可直接作用于肝癌干细胞并抑制其自我更新能力。
为了证明单抗Hetumomab是否是能够直接抑制肺癌干细胞的功能性单抗，采用同样的方法检测了单抗Hetumomab对人肺癌细胞系SPCA-1成球的抑制作用。结果(如表19、图5)显示，实验组最高抗体浓度的成球数量为88.3±7.2，而阴性对照组的成球数量为151.3±9.1个，明显高于实验组，单抗Hetumomab对SPCA-1细胞的成球抑制率达41.6％，p<0.01，有统计学差异。结果表明，单抗Hetumomab可直接作用于肺癌干细胞并抑制其自我更新能力。
表19 检测单抗Hetumomab抑制人肺癌细胞系SPCA-1成球的结果
Figure BDA0001330205880000431
为了证明单抗Hetumomab是否是能够直接抑制胃癌干细胞的功能性单抗，采用同样的方法检测了单抗Hetumomab对人胃癌细胞系SNU-5的CD44阳性细胞肿瘤干细胞亚群成球的抑制作用。结果(如表20、图5)显示，实验组最高抗体浓度的成球数量为18±2.0，而阴性对照组的成球数量为128±4.0个，明显高于实验组，单抗Hetumomab对SNU-5 CD44+细胞的成球抑制率达85.9％，p<0.01，有统计学差异。结果表明，单抗Hetumomab可直接作用于胃癌干细胞并抑制其自我更新能力。
表20 检测单抗Hetumomab抑制人胃癌细胞系SNU-5 CD44+细胞成球的结果
Figure BDA0001330205880000432
以上这些结果说明单抗Hetumomab可以直接显著抑制多种癌细胞(肝癌、肺癌、胃癌)的自我更新能力，证明单抗Hetumomab不仅能识别靶向肿瘤干细胞，而且是可以直接抑制肿瘤干细胞的功能性(治疗性)抗肿瘤干细胞单抗。
二、单抗Hetumomab显著抑制多种肿瘤(肝癌、胃癌、肺癌)的肿瘤干细胞的侵袭能力(肿瘤干细胞主要特征之二)。
高侵袭性是肿瘤干细胞的另一个重要生物学特征。为了证明单抗Hetumomab是否是能够直接抑制肝癌干细胞的功能性单抗，采用Transwell侵袭实验对单抗Hetumomab抑制肝癌细胞的侵袭能力进行了分析。实验结果显示(图6)，PBS阴性对照组的侵袭细胞数为(301.0±16.3)/视野，单抗Hetumomab(0.5mg/ml)组的侵袭细胞数为(148±16.4)/视野。实验结果表明，单抗Hetumomab直接作用后的细胞侵袭能力明显减弱，其对Bel7402-V13sphere细胞侵袭的抑制率为50.8％，p<0.05，有统计学差异。该实验结果表明，单抗Hetumomab可直接作用于肝癌干细胞并抑制其侵袭能力。
为了证明单抗Hetumomab是否是能够直接抑制肺癌干细胞的功能性单抗，采用同样的方法检测了单抗Hetumomab对人肺癌细胞系SPCA-1侵袭的抑制作用。实验结果显示(表21、图6)，PBS阴性对照组的侵袭细胞数为(232.3±3.1)/视野，单抗Hetumomab组的侵袭细胞数最低为(153.0±6.1)/视野。实验结果表明，单抗Hetumomab直接作用后的细胞侵袭能力明显减弱，其对SPCA-1sphere细胞侵袭的抑制率为34.1％，p<0.05，有统计学差异。该实验结果表明，单抗Hetumomab可直接作用于肺癌干细胞并抑制其侵袭能力。
表21 检测单抗Hetumomab抑制人肺癌细胞系SPCA-1侵袭的结果
Figure BDA0001330205880000441
为了证明单抗Hetumomab是否是能够直接抑制胃癌干细胞的功能性单抗，采用同样的方法检测了单抗Hetumomab对人胃癌细胞系SNU-5的CD44阳性细胞肿瘤干细胞亚群侵袭的抑制作用。实验结果显示(表22、图6)，PBS阴性对照组的侵袭细胞数为(231±7.0)/视野，单抗Hetumomab组的侵袭细胞数最低为(56±4.0)/视野。实验结果表明，单抗Hetumomab直接作用后的细胞侵袭能力明显减弱，其对SNU-5 CD44+细胞侵袭的抑制率为75.8％，p<0.05，有统计学差异。该实验结果表明，单抗Hetumomab可直接作用于胃癌干细胞并抑制其侵袭能力。
表21 检测单抗Hetumomab抑制人胃癌细胞系SNU-5 CD44+细胞侵袭的结果
Figure BDA0001330205880000442
以上这些结果说明单抗Hetumomab可以直接显著抑制多种癌细胞(肝癌、肺癌、胃癌)的侵袭能力，证明单抗Hetumomab不仅能识别靶向肿瘤干细胞，而且是可以直接抑制肿瘤干细胞的功能性(治疗性)抗肿瘤干细胞单抗。
三、单抗Hetumomab显著抑制多种肿瘤(肝癌、肺癌)的肿瘤干细胞的耐受化疗药物的能力(肿瘤干细胞主要特征之三)。
耐药是肿瘤干细胞的生物学特征之一。为了证明单抗Hetumomab是否是能够直接抑制肝癌干细胞的功能性单抗，将培养5天的Bel7402-V13sphere细胞以5000个/孔的数量接种于96孔板中，并加入纯化的单抗Hetumomab(0.5mg/mL)和PBS于各孔中，在37℃，5％CO2孵箱中培养24h后，移去含抗体的培养基，每组细胞均用含0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4和8μg/mL共9不同浓度顺铂的培养基培养细胞，48h更换1次含顺铂的完全培养基，5天后按照CCK-8试剂盒说明书加入CCK-8试剂，检测OD450吸光度值，并计算各组IC50值。实验结果显示(图7)，单抗Hetumomab直接作用后的细胞的耐药能力明显下降，其IC50值为0.334μg/mL，而对照组的IC50值为0.9μg/mL，单抗Hetumomab直接作用的细胞耐药能力明显低于对照组。该实验结果表明，单抗Hetumomab可直接作用于肝癌干细胞并抑制其耐药的能力。
为了证明单抗Hetumomab是否是能够直接抑制肺癌干细胞的功能性单抗，采用同样的方法检测了单抗Hetumomab对人肺癌细胞系SPCA-1耐药的抑制作用。实验结果显示(图7)，单抗Hetumomab直接作用后的细胞的耐药能力明显下降，其IC50值最低为0.136μg/mL，而对照组的IC50值为0.351μg/mL，单抗Hetumomab直接作用的细胞耐药能力明显低于对照组。该实验结果表明，单抗Hetumomab可直接作用于肺癌干细胞并抑制其耐药的能力。
以上这些结果说明单抗Hetumomab可以直接显著抑制多种癌细胞(肝癌、肺癌)的耐受化疗药物的能力，证明单抗Hetumomab不仅能识别靶向肿瘤干细胞，而且是可以直接抑制肿瘤干细胞的功能性(治疗性)抗肿瘤干细胞单抗。
实施例5 单抗Hetumomab在动物体内具有抑制肿瘤移植瘤生长、协同化疗的药效学作用
前面的一系列实验结果证明，单抗Hetumomab是靶向多种肿瘤干细胞的单抗；并且体外药效学研究结果表明，单抗Hetumomab可以明显的抑制多种肿瘤干细胞的自我更新、侵袭和耐药能力。为了进一步明确单抗Hetumomab在体内对多种肿瘤生长、转移和耐药的影响，采用多种人肿瘤动物模型，评价了单抗Hetumomab在体内对多种肿瘤生长、转移和耐药的药效学作用。
一、单抗Hetumomab显著抑制人肝癌移植瘤在体内的生长，并能明显协同增强化疗的疗效、显著延长生存期，具有显著的抗肿瘤药效学作用。
进行了单抗Hetumomab在裸鼠体内治疗肝癌的实验研究，观察并比较单用单抗、单用化疗药及单抗联合化疗药治疗肝癌的疗效，分析比较单抗Hetumomab在体内能否治疗肝癌的生长和耐药，并探讨靶向肝癌干细胞治疗肝癌的最优方案。
将Bel7402-V13的sphere细胞以3万/只接种至裸鼠皮下，将裸鼠随机分为6组(6只/组)，分别为：单独化疗药组(顺铂0.3mg/kg，6只)；抗体高剂量组(10mg/kg，6只)；抗体高剂量+化疗组(6只)；抗体低剂量组(2.5mg/kg，6只)；抗体低剂量+化疗组(6只)；PBS组(6只)。接种细胞后第二天开始治疗，每周治疗2次，5周后结束治疗。每周2次测量皮下移植瘤的长径和短径，用公式V＝(π/6)×(长径×短径×短径)计算瘤体积，观察各组的肿瘤体积、生长速率的变化。停药后，继续观察移植瘤的生长情况，并记录肿瘤大小。肿瘤生长速率＝(Vt-V0)/天数，Vt是每次测量时的肿瘤体积，V0是给药前的肿瘤体积(V0指停止给药时的肿瘤体积)。
小鼠体内移植瘤的生长曲线如图8所示，单抗Hetumomab能显著抑制裸鼠体内移植瘤的生长。并且随着抗体的剂量升高移植瘤抑制率也逐渐升高，存在着剂量依赖关系。实验结果如图9显示，在治疗5个星期停药时，高、低剂量的单抗Hetumomab对移植瘤的抑制率分别为71.5％、54.4％，化疗药组的抑制率为83.5％，单抗高、低剂量联合化疗药组的抑制率相似，都达到了97％左右。结果提示，与单用单抗和单用化疗药组相比，单抗联合化疗药组在移植瘤的治疗中显示出了较好的治疗效果。
停药一个月时，小鼠出现死亡的情况。这时各组的抑制率如图10所示，单抗高、低对移植瘤的抑制率分别为49.1％、34.4％，单抗高、低联合化疗药组的抑制率相似，约为84.5％左右，但单用化疗药组的抑制率为48.6％。该结果提示，单抗联合化疗药组对小鼠移植瘤的抑制率高于其他几种治疗方案组，P<0.05，差异有统计学意义。停药后一个月时的移植瘤体积与停药时的相比，单抗联合化疗组的肿瘤生长速率为0.051cm3/天，比PBS对照组肿瘤生长速率(0.239cm3/天)低4.7倍，且比单抗高、低剂量组和化疗药组的肿瘤生长速率(0.148cm3/天、0.185cm3/天和0.154cm3/天)分别低2.9、3.6和3.1倍，该结果表明单抗联合化疗药的方法可有效抑制肿瘤的生长和复发。
整个治疗和观察过程持续六个月。小鼠在六个月中生存曲线(图11)显示，这6组小鼠的生存曲线分布差别有统计学意义，P<0.05。说明单抗联合化疗药组的小鼠生存状况明显好于PBS对照组、单抗组和化疗药组。提示，单抗联合化疗药治疗可以延长小鼠的生存期。
以上结果说明，单抗Hetumomab单独使用能够显著抑制人肝癌移植瘤的生长，具有显著的抑制肝癌的药效学作用。单抗Hetumomab联合化疗药组都显示出了对移植瘤高的抑制率，能显著抑制肿瘤的生长，且治疗效果优于单用抗体组和单用化疗药组，表明单抗联合化疗药可有效抑制肿瘤的生长，降低化疗耐药。联合用药组的小鼠生存期明显大于单用抗体组和单用化疗药组，表明单抗Hetumomab联合化疗药治疗肿瘤的方案不仅能治疗肿瘤的生长，还能延长小鼠的生存期，可能是显著抑制了肿瘤在体内的转移引起的小鼠死亡。
二、单抗Hetumomab显著抑制人肺癌移植瘤在体内的生长，具有显著的抗肿瘤药效学作用。
进行了单抗Hetumomab在裸鼠体内治疗肺癌的实验研究，并观察单用单抗、单用化疗药治疗肺癌的疗效。
具体地，收获人肺癌细胞系SPCA-1的球体细胞，以2.5×105个细胞/只接种裸小鼠。共分5组，每组5只：PBS对照组、单独化疗组(顺铂0.3mg/kg)、Hetumomab抗体高剂量组(40mg/kg)、Hetumomab抗体中剂量组(10mg/kg)、Hetumomab低剂量组(2.5mg/kg)。接种肺癌细胞后第2天开始抗体治疗，实验组以及对照组通过腹腔注射进行治疗，共治疗至接种28天后，停药。化疗药组治疗每周2次。每周2次测量皮下移植瘤的长径和短径，计算瘤体积，公式V＝(π/6)×(长径×短径×短径)。观察各组的肿瘤体积变化。
接种28天后停止治疗时，观察并测量小鼠瘤体积生长情况，计算抑制率。小鼠体内移植瘤的生长曲线如图12所示，瘤体积抑制率如表22所示，单抗Hetumomab能显著抑制裸鼠体内移植瘤的生长，并随着抗体的剂量升高移植瘤抑制率也相应升高，在停药时，高、中、低剂量的单抗Hetumomab对移植瘤的抑制率分别为55.97％、43.56％、35.58％，化疗药组的抑制率仅为24.91％。
以上结果说明，单抗Hetumomab单独使用能够显著抑制人肺癌移植瘤的生长，具有显著的抑制肺癌的药效学作用。
表22 单抗Hetumomab抑制动物体内人肺癌SPCA-1移植瘤生长的结果
Figure BDA0001330205880000481
三、单抗Hetumomab显著抑制人胃癌移植瘤在体内的生长，并能明显协同增强化疗的疗效，具有显著的抗肿瘤药效学作用。
进行了单抗Hetumomab在裸鼠体内治疗胃癌的实验研究，并观察比较单用单抗、单用化疗药及单抗联合化疗药治疗胃癌的疗效，分析比较单抗Hetumomab在体内能否治疗胃癌的生长和协同增强化疗疗效。
具体地，收获人胃癌细胞系SNU-5-V13的球体细胞，以2.5×105个细胞/只接种裸小鼠。共分7组，每组8只：PBS对照组、鼠IgG对照组、单独化疗组(顺铂0.3mg/kg)、Hetumomab抗体高剂量组(20mg/kg)、Hetumomab低剂量组(1.25mg/kg)、Hetumomab高剂量+化疗药、Hetumomab低剂量+化药。接种胃癌细胞后第2天开始抗体治疗，实验组以及对照组通过腹腔注射进行治疗，共治疗一个月后，停药。化疗药组治疗4周，每周2次后停药。每周2次测量皮下移植瘤的长径和短径，计算瘤体积，公式V＝(π/6)×(长径×短径×短径)。观察各组的肿瘤体积变化。
接种一个月后停止治疗时，观察并测量小鼠瘤体积生长情况，计算抑制率。小鼠体内移植瘤的生长曲线如图13所示，瘤体积抑制率如表23所示，单抗Hetumomab能显著抑制裸鼠体内移植瘤的生长，并随着抗体的剂量升高移植瘤抑制率也相应升高，在停药时，高、低剂量的单抗Hetumomab对移植瘤的抑制率分别为57.62％、30.68％，化疗药组的抑制率仅为33.16％，单抗高、低剂量联合化疗药组的抑制率分别达到了70.68％和47.93％，结果提示，单抗联合化疗药组对小鼠移植瘤的抑制率高于单独化疗和单独抗体治疗的治疗方案组，p<0.05，单抗联合化疗药组在移植瘤的治疗中显示出了更好的治疗效果。
以上结果说明，单抗Hetumomab单独使用能够显著抑制人胃癌移植瘤的生长，具有显著的抑制胃癌的药效学作用。单抗Hetumomab联合化疗药组都显示出了对移植瘤高的抑制率，能显著抑制肿瘤的生长，且治疗效果优于单用抗体组和单用化疗药组，表明单抗联合化疗药可有效抑制肿瘤的生长，降低化疗耐药。
表23 单抗Hetumomab抑制动物体内人胃癌SNU-5移植瘤生长的结果
Figure BDA0001330205880000491
以上这一系列动物体内抑制肿瘤的实验结果证明，单抗Hetumomab在体内对多种人肿瘤(如肝癌、肺癌、胃癌)的生长和耐药具有显著的抑制作用(药效学作用)，对于治疗多种肿瘤生长、转移和耐药具有重要的应用价值。
实施例6 小鼠单克隆抗体Hetumomab可变区序列的克隆及互补决定区序列分析
本实施例采用亚型为IgG1，Kappa轻链的小鼠单克隆抗体Hetumomab的杂交瘤细胞，以Trizol试剂裂解细胞，提取杂交瘤细胞的总RNA，经异丙醇沉淀和乙醇洗涤后，通过RNA电泳以及紫外分光光度计检测，确定RNA的浓度、纯度和完整性。结果获得了来自Hetumomab杂交瘤细胞的浓度为2.5μg/μl、OD260/OD280＝1.8左右的总RNA。常规方法反转录成cDNA第一链，稀释2倍后当做用于PCR扩增的模板。
设计合适的可变区引物组合进行随后的常规的PCR反应扩增抗体可变区基因序列，克隆入ZT4-Blunt载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆并测序。克隆得到Hetumomab单抗的轻链可变区氨基酸序列示于SEQ ID NO:1，重链可变区氨基酸序列示于示于SEQ ID NO:5。
Hetumomab单抗的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWFLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELYTFGGGTKLEIK
下划线分别依次标示VL-CDR1(SEQ ID NO:2：RSSKSLLHSNGITYLY)、VL-CDR2(SEQID NO:3：QMSNLAS)、VL-CDR3(SEQ ID NO:4：AQNLELYT)。
Hetumomab单抗的重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:5)：
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDSSNNQVFLKITSVDTADTATYYCARSFYYYANNSFAYWGQGTLVTVSS
下划线分别依次标示VH-CDR1(SEQ ID NO:6：TSGMGVS)、VH-CDR2(SEQ ID NO:7：HIYWDDDKRYNPSLKS)、VH-CDR3(SEQ ID NO:8：SFYYYANNSFAY)。
实施例7 衍生自小鼠单克隆抗体Hetumomab的人-鼠嵌合抗体Hetuximab的构建、表达及纯化
本实施例将小鼠单克隆抗体Hetumomab的轻、重链的可变区基因片段，分别克隆入含有人IgG1CH(重链恒定区基因)和人IgG CK(轻链恒定区基因)的瞬转表达载体中，转染真核细胞，从转染细胞的培养上清中采用常规的Protein A亲和层析法纯化Hetumomab的人-鼠嵌合抗体变体，命名为Hetuximab。
采用PCR的方法大量扩增Hetumomab的重链和轻链抗体可变区片段，克隆入pKN009(含有人IgG1CH编码序列)和pKN019(含有人IgG CK编码序列)瞬时表达载体的相应酶切克隆位点，转化大肠杆菌并筛选阳性克隆，阳性克隆进一步测序进行鉴定。结果获得衍生自Hetumomab的人-鼠嵌合抗体Hetuximab及其表达载体。该嵌合抗体的具体蛋白序列如下：
Hetuximab嵌合抗体重链氨基酸序列(SEQ ID NO:9)：
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDSSNNQVFLKITSVDTADTATYYCARSFYYYANNSFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
下划线分别依次标示VH-CDR1(SEQ ID NO:6)、VH-CDR2(SEQ ID NO:7)、VH-CD3(SEQ ID NO:8)、人IgG1CH(SEQ ID NO:11)。
Hetuximab嵌合抗体轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:10)：
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWFLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
下划线分别依次标示VL-CDR1(SEQ ID NO:2)、VL-CDR2(SEQ ID NO:3)、VL-CDR3(SEQ ID NO:4)、人IgG CK(SEQ ID NO:12)。
将上述鉴定正确的轻重链嵌合抗体基因表达载体采用脂质体常规转染真核细胞HEK-293细胞，瞬时表达嵌合抗体。收集上清先用Protein A亲和层析柱进行初步纯化，再进一步采用阳离子交换层析除去杂质，纯化产物采用SDS-PAGE电泳鉴定纯度。结果获得了纯度>95％，2mg/ml的衍生自Hetumomab的人-鼠嵌合抗体Hetuximab。
实施例8 嵌合抗体Hetuximab与亲本鼠单抗识别结合同一抗原蛋白的相同表位，具有相同的特异性和一致的亲和性。
一、采用Western Blot实验证明嵌合抗体Hetuximab与亲本鼠单抗Hetumomab识别结合同一抗原蛋白，具有相同的特异性。
采用常规方法提取Hetumomab靶抗原阳性表达的4种人肿瘤细胞SNU-5、BGC-823、MHCC-97L、BEL7402V13的细胞总蛋白，BCA试剂盒定量提取液蛋白浓度。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离适量蛋白样品(20μg)，采用半干式电转仪将蛋白转移至PVDF膜。然后将PVDF膜放入封闭液中(TBST/5％脱脂奶粉)，于水平摇床上，室温封闭1h。加入一抗(嵌合抗体Hetuximab与亲本鼠单抗Hetumomab，均为2ug/ml，用封闭液稀释)，4℃孵育过夜。用TBST漂洗5次，每次5min。相应加入抗人IgG Fc-HRP或抗鼠IgG Fc-HRP二抗(1:2000～1:5000稀释)，室温孵育1h。用TBST漂洗3次，每次5min；再用PBS漂洗3次。显影照相。结果如图14所示。
结果表明嵌合抗体Hetuximab与亲本鼠单抗Hetumomab两者识别的蛋白抗原是同一蛋白分子。同时，因两者均特异地与该抗原蛋白结合，而不识别人真核细胞的其他任何蛋白染色其他带，证明嵌合抗体Hetuximab与亲本鼠单抗Hetumomab两者的特异性相同。
二、采用免疫组织化学实验证明嵌合抗体Hetuximab与亲本鼠单抗Hetumomab识别结合同一抗原蛋白，具有相同的特异性。
采用前述的传统的常规免疫组织化学技术，以Hetumomab为一抗，采用抗鼠抗体二抗；以及以嵌合抗体Hetuximab为一抗，采用抗人抗体二抗，检测了单抗Hetumomab靶抗原阳性表达的3例人肝癌、肺癌、胃癌患者组织切片及阴性表达的3例人肝癌、肺癌、胃癌患者组织切片。
实验结果显示：嵌合抗体Hetuximab与亲本鼠单抗Hetumomab均能阳性染色单抗Hetumomab靶抗原阳性表达的3例人肝癌、肺癌、胃癌患者组织切片，且同时均不染色单抗Hetumomab靶抗原阴性表达的3例人肝癌、肺癌、胃癌患者组织切片，说明了嵌合抗体Hetuximab与亲本鼠单抗Hetumomab识别结合同一抗原蛋白，且不识别人组织中的其他蛋白，具有相同的特异性。
三、采用竞争抑制细胞ELISA实验证明嵌合抗体Hetuximab与亲本鼠单抗Hetumomab识别结合同一抗原蛋白的相同表位，具有一致的亲和性。
MHCC-97L细胞接种96孔培养板(4×103个/孔)，待细胞长到90％～100％满时进行实验。弃去孔中的培养液，用含0.05％Tween-20的PBS洗涤，300μl/孔，1min/次×5次；按如下设计加入样品，100μl/孔，复孔，37℃孵育1.5h；弃去孔中的液体，用含0.05％Tween-20的PBS洗涤，300μl/孔，1min/次×5次；加入抗人IgG Fc-HRP(不与鼠IgG Fc反应)或抗鼠IgGFc-HRP(不与人IgG Fc反应)相应二抗，1:5000，100μl/孔，37℃孵育1h；弃去孔中的液体，用含0.05％Tween-20的PBS洗涤，300μl/孔，1min/次×3次；纯水再洗涤2次；甩去纯水，加入TMB显色，100μl/孔，37℃孵育30min；加入2M H2SO4，50μl/孔；酶标仪测OD450。
采用抗人IgG Fc-HRP(不与鼠IgG Fc反应)作为二抗，结果如下表所示：
表24.
Figure BDA0001330205880000531
当采用抗鼠IgG Fc-HRP(不与人IgG Fc反应)作为二抗，结果如下表所示：
表25.
Figure BDA0001330205880000532
Figure BDA0001330205880000541
将表24和25的原始结果作图，示于图15。从图15可以看到，嵌合抗体Hetuximab和亲本鼠单抗Hetumomab均可相互显著地竞争抑制对方与靶细胞MHCC-97L细胞表面的靶抗原的结合，表明嵌合抗体Hetuximab和亲本鼠单抗Hetumomab识别结合同一抗原蛋白的相同表位；同时两者相互显示出相近的竞争抑制效率，提示嵌合抗体Hetuximab和亲本鼠单抗Hetumomab亲合力相当，具有一致的亲和性。
实施例9 嵌合抗体Hetuximab与亲本鼠单抗识别相同的肿瘤干细胞，具有相同的抑制肿瘤干细胞的药效学作用。
一、嵌合抗体Hetuximab与亲本鼠单抗Hetumomab识别相同的一群肿瘤干细胞。
同前所述方法，采用SNU-5、BGC-823、MHCC-97L、BEL7402V13这4种细胞系，同时收获亲本细胞和富含肿瘤干细胞的sphere细胞，同时分别采用Hetuximab(采用抗人IgG Fc作为二抗)和Hetumomab(采用抗鼠IgG Fc作为二抗)进行流式免疫荧光实验，检测了上述4种细胞系亲本细胞和富含肿瘤干细胞的sphere细胞中的阳性细胞比例及在sphere细胞中富集倍数。结果如下：
表26.比较Hetuximab与Hetumomab在不同肿瘤细胞的阳性率以及在sphere细胞中的富集倍数。
Figure BDA0001330205880000542
Figure BDA0001330205880000551
从以上结果可以看到，两者在4种肿瘤细胞及富含肿瘤干细胞的sphere细胞中的阳性率及富集情况均十分一致，因此，嵌合抗体Hetuximab与亲本鼠单抗Hetumomab识别相同的一群肿瘤干细胞。
二、嵌合抗体Hetuximab与亲本鼠单抗Hetumomab在体外具有相同的抑制肿瘤干细胞的药效学作用。
同前所述方法，采用SNU-5、BGC-823、MHCC-97L、BEL7402V13这4种细胞系的富含肿瘤干细胞的sphere细胞，同时分别采用Hetuximab和Hetumomab进行常规的成球抑制实验，检测了Hetuximab和Hetumomab对上述4种细胞系富含肿瘤干细胞的sphere细胞的抑制肿瘤干细胞的药效学作用。结果如下表所示：
表27.Hetuximab和Hetumomab对上述4种细胞系的成球抑制率
Figure BDA0001330205880000552
Figure BDA0001330205880000553
Figure BDA0001330205880000561
Figure BDA0001330205880000562
从以上结果可以看到，两者在4种肿瘤细胞系的富含肿瘤干细胞的sphere细胞中的各浓度梯度的抗体抑制肿瘤干细胞成球的效率均十分一致，因此，嵌合抗体Hetuximab与亲本鼠单抗Hetumomab在体外具有相同的抑制肿瘤干细胞的药效学作用。
序列表
>SEQ ID NO:1 Hetumomab轻链可变区
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWFLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELYTFGGGTKLEIK
>SEQ ID NO:2 Hetumomab VL-CDR1
RSSKSLLHSNGITYLY
>SEQ ID NO:3 Hetumomab VL-CDR2
QMSNLAS
>SEQ ID NO:4 Hetumomab VL-CDR3
AQNLELYT
>SEQ ID NO:5 Hetumomab重链可变区
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDSSNNQVFLKITSVDTADTATYYCARSFYYYANNSFAYWGQGTLVTVSS
>SEQ ID NO:6 Hetumomab VH-CDR1
TSGMGVS
>SEQ ID NO:7 Hetumomab VH-CDR2
HIYWDDDKRYNPSLKS
>SEQ ID NO:8 Hetumomab VH-CDR3
SFYYYANNSFAY
>SEQ ID NO:9 Hetuximab嵌合抗体重链氨基酸序列
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDSSNNQVFLKITSVDTADTATYYCARSFYYYANNSFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>SEQ ID NO:10 Hetuximab嵌合抗体轻链氨基酸序列
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWFLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>SEQ ID NO:11 人IgG1 CH
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>SEQ ID NO:12 人IgG CK
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Claims (26)

1.一种针对肿瘤干细胞的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成，
VL CDR2，其由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成，和
VL CDR3，其由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成；
所述重链可变区包含：
VH CDR1，其由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列组成，
VH CDR2，其由SEQ ID NO:7所示氨基酸序列组成，和
VH CDR3，其由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列组成；
其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少85％序列相同性的氨基酸序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或与SEQID NO:5具有至少85％序列相同性的氨基酸序列。
2.权利要求1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体是人源化抗体。
3.权利要求1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:1所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列。
4.权利要求1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ IDNO:5所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:5具有至少90％、至少95％或更高序列相同性的氨基酸序列。
5.权利要求1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体包含人重链恒定区。
6.权利要求5的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体包含SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列的人重链恒定区。
7.权利要求1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体包含人轻链恒定区。
8.权利要求7的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体包含SEQ IDNO:12所示的氨基酸序列的人轻链恒定区。
9.权利要求1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体包含具有SEQID NO:9所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的轻链。
10.一种药物组合物，其包含权利要求1-9中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
11.权利要求10的药物组合物，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段与选自细胞毒素、放射性同位素或生物活性蛋白质的治疗性部分缀合。
12.权利要求1-9中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段或权利要求10或11的药物组合物在制备用于治疗恶性肿瘤的药物中的用途，其中所述恶性肿瘤选自肝癌、胃癌和肺癌。
13.权利要求12的用途，其中所述药物用于与化疗剂、靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体或放疗组合使用。
14.权利要求1-9中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段或权利要求10或11的药物组合物在制备用于预防和/或治疗恶性肿瘤转移或复发的药物中的用途，其中所述恶性肿瘤选自肝癌、胃癌和肺癌。
15.权利要求14的用途，其中所述药物用于与化疗剂、靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体或放疗组合使用。
16.权利要求1-9中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于检测生物学样品中肿瘤干细胞存在的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于通过包括以下步骤的方法检测生物学样品中肿瘤干细胞存在：
a)使所述生物学样品与权利要求1-9中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；
b)检测所述单克隆抗体或其抗原结合片段与所述生物学样品中的靶抗原的结合，
其中检出所述结合代表所述生物学样品中存在肿瘤干细胞，其中所述肿瘤干细胞选自肝癌干细胞、胃癌干细胞或肺癌干细胞。
17.权利要求1-9中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于分离肿瘤干细胞的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于通过包括以下步骤的方法分离肿瘤干细胞：
(a)提供疑似包含肿瘤干细胞的细胞群；
(b)鉴定所述细胞的亚群，其结合权利要求1-9中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段；和
(c)分离所述亚群，
其中所述肿瘤干细胞选自肝癌干细胞、胃癌干细胞或肺癌干细胞。
18.权利要求1-9中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于检测患者中恶性肿瘤的存在的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于通过包括以下步骤的方法检测患者中恶性肿瘤的存在：
a)使获得自所述患者的生物学样品与权利要求1-9中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；
b)检测所述单克隆抗体或其抗原结合片段与所述生物学样品中的靶抗原的结合，其中检出所述结合代表所述患者中存在恶性肿瘤，其中所述恶性肿瘤选自肝癌、胃癌和肺癌。
19.权利要求1-9中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于预后患者中恶性肿瘤复发或进展的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于通过包括以下步骤的方法检测患者中恶性肿瘤的存在：
(a)从所述患者中分离包含循环细胞的生物学样品；
(b)使所述包含循环细胞的生物学样品与权利要求1-9中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；和
(c)鉴定结合所述单克隆抗体或其抗原结合片段的循环细胞的存在，
从而预后所述患者中恶性肿瘤的复发或进展，其中所述恶性肿瘤选自肝癌、胃癌和肺癌。
20.权利要求19的用途，其中所述恶性肿瘤的进展包含所述恶性肿瘤在患者中的转移。
21.权利要求16、19-20中任一项的用途，其中所述生物学样品包括血液样品、淋巴样品或其组分。
22.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-9中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段。
23.权利要求22的分离的核酸分子，所述核酸分子与表达调控序列可操作地连接。
24.一种表达载体，其包含权利要求22-23中任一项的核酸分子。
25.一种宿主细胞，其由权利要求22-23中任一项的核酸分子或权利要求24的表达载体转化。
26.一种生产针对人肿瘤干细胞的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括：
(i)培养权利要求25所述的由权利要求22-23中任一项的核酸分子或权利要求24的表达载体转化的宿主细胞，其中所述培养在适合所述核酸分子或表达载体表达的情况下进行，和
(ii)分离并纯化由所述核酸分子或表达载体表达的抗体或其抗原结合片段。
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