KR101865140B1 - 복령 재배용 배지 조성물 및 이를 이용한 복령의 재배방법 - Google Patents

복령 재배용 배지 조성물 및 이를 이용한 복령의 재배방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 복령 재배용 배지 조성물 및 이를 이용한 복령의 재배방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 톱밥 및 영양원을 포함하는 복령 재배용 배지 조성물을 이용하여 오염없는 청정 복령을 대량생산하기 위한 복령의 재배방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 복령 생산을 위하여 원목을 사용하지 않고 톱밥을 이용하여 병 또는 봉지에 재배하므로 복령의 대량생산이 가능하고, 원목을 토양에 직접 매립하지 않고 톱밥을 이용하여 복령을 재배하므로 모래, 흙 등과 같은 이물질이 복령에 혼입되는 것이 방지되고, 원목을 이용하는 비매립 원목 비닐봉지 재배방법보다는 자동화에 의한 복령 대량생산이 가능하므로 생산비 절감효과가 있다. 또한, 톱밥재배에 의한 복령 대량생산 기술개발로 원료의 표준화 및 지속적인 원료 공급시스템 확립으로 원료의 안정적인 공급 및 복령 소비확대 기여할 수 있다.

Description

복령 재배용 배지 조성물 및 이를 이용한 복령의 재배방법{Medium composition for culturing Poria cocos and the culturing method for Poria cocos thereby}
본 발명은 복령 재배용 배지 조성물 및 이를 이용한 복령의 재배방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 톱밥 및 영양원을 포함하는 복령 재배용 배지 조성물을 이용하여 오염없는 청정 복령을 대량생산하기 위한 복령의 재배방법에 관한 것이다.
버섯은 종류에 따라 재배방법에 차이가 있으며, 크게 ① 느타리, 양송이 등 균상재배 ② 팽이버섯, 큰느타리 등 병재배 ③ 표고버섯, 영지버섯, 복령 등 원목재배로 구분한다.
우리나라에서 버섯 재배는 균상재배 위주에서 1990년대 이후 병재배로 전환되었으며, 2000년대에는 최대 10만병/일 정도로 대규모 농장들이 설립되었다. 최근에는 거의 모든 버섯재배가 자동화를 통한 대량생산체계로 전환되고 있으나, 복령 등은 아직도 원목을 이용하여 재배되고 있어 이들 버섯의 대량생산을 위한 새로운 재배기술이 요구되고 있다.
한편, 복령(茯笭)은 구멍버섯 속에 속하는 복령(Poria cocos)균이 소나무 뿌리에 기생하여 균핵을 형성한 것으로 한방에서 중요한 필수약재로서 주로 임야에서 자생하는 복령을 채취하여 한약재로 이용하여 왔다. 최근에는 국민소득 수준 향상 및 건강에 대한 관심이 높아지면서 한약의 수요가 급증하였고, 인공 재배되고 있으며 이와 같은 복령은 그 품질이 낮아 새로운 복령 재배기술의 개발이 절실히 필요하게 되었다.
종래 복령 재배방법으로는 국내 최초 소나무 원목을 일정길이로 토막치기하여 톱밥 복령균주를 접종하고 마개로 막은 후 그 소나무 원목을 1년간 양생하여 땅에 뭍어 원목의 내부에 균사가 만연된 복령골목을 얻은 후 이를 절단하여 소나무 뿌리에 연장되게 타입 매설하여 재배하는 방법이 특허공고 제86-2180호로 공지되었다.
또한, 소나무 원목을 60cm 길이로 절단하고 절단면이 육각형이 되도록 원목의 둘레에 따라 한 면씩 교호로 표피를 박피하여 건조시킨 다음 복령균이 만연된 목편종균을 나무 사이에 끼워 놓고 복토한 후 비닐로 덮어 1년동안 관리하여 형성된 복령을 수확하는 재배방법이 특허공고 제96-3574호로 개시되었다.
이외에, 길이 20~60cm 나무토막에 검은 비닐봉지로 밀봉하여 톱밥 또는 곡물 종균을 접종하는 입봉접종법과 원목과 원목사이에 샌드위치 접착법에 의해 상기 종균을 접종한 후 암실에서 배양되도록 한 후 복령을 수확하는 방법이 특허공고 제10-2005-0051801호로 개시되어 있다.
상기 재배 방법에 따르면 4~11월에 실시하며 토양에 원목과 종균 또는 톱밥 또는 곡립 배지에 종균을 배양하여 원목에 부착하여 비닐봉지에 밀봉한 후 재배사에 적치한 다음 최소한 6개월~2년사이에 수확한다. 이 방법에 따르면 검정비닐을 멸균할 수 없으므로 멸균과정이 없어서 재배기간 중 오염으로 실패율이 높고 특히 액체 종균 접종이 불가하며, 복령 형성과정을 육안으로 확인할 수 없고 특히 균주 배양시 마개와 필터를 사용하지 아니하여 활착이후에 복령의 성장이 정지되며 또, 원목에 수분이 부족하게 되면서 공기부족으로 오염되거나 복령 형성이 정지되는 등 단점이 있었다.
이 밖에도 상기 공지된 복령의 매립 재배법으로 생산된 복령들은 약재상에서는 취급이 불가능할 정도로 모래, 흙, 톱밥 등 이물질이 많이 혼입되어 있고, 경도가 낮아서 약재로 가공하기 위해 절단시 부스러지는 문제가 있어 한약재로는 사용하기 곤란한 문제점이 있다.
본 발명은 상기 문제점을 극복하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 종래의 토양 지하재배 방식과 원목 비매립 봉지 재배법과는 다르게 순수한 톱밥을 이용하여 오염 없는 청정 복령을 생산하는 방법으로 균 접종 후 원목을 이용하지 않고 톱밥에서 복령을 대량생산할 수 있는 복령 재배용 배지 조성물 및 이를 이용한 복령의 재배방법을 제공하는 데 있다.
이를 위하여, 본 발명은 톱밥; 및 미강, 밀기울 및 면실박으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 영양원;을 포함하고, 상기 톱밥 100 중량부에 대하여 상기 영양원 1 ~ 300 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 복령 재배용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 영양원이 미강인 경우, 상기 톱밥 100 중량부에 대하여 미강 1 ~ 45 중량부를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 영양원이 밀기울인 경우, 상기 톱밥 100 중량부에 대하여 밀기울 1 ~ 300 중량부를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 영양원이 면실박인 경우, 상기 톱밥 100 중량부에 대하여 면실박 1 ~ 20 중량부를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에 복령균을 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 복령의 재배방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 재배방법은 상기 배지 조성물에 복령균을 접종하는 1단계; 상기 접종된 복령균을 배양하여 복령균으로부터 균핵을 형성하는 2단계; 및 상기 2단계에서 형성된 균핵으로부터 복령을 생육하는 3단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 2단계의 배양은 20 ~ 35℃의 온도 및 60 ~ 70 %의 상대습도에서 45 ~ 50 일 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 2단계에서 균핵의 형성은 20 ~ 25℃의 온도, 60 ~ 80 %의 상대습도 및 800 ~ 1200 ppm의 이산화탄소 농도에서 20 ~ 25일 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 3단계에서 복령의 생육은 20 ~ 30℃의 온도, 60 ~ 90 %의 상대습도 및 800 ~ 1200 ppm의 이산화탄소 농도에서 수행될 수 있다.
본 발명은 상기의 재배방법으로 재배한 복령에 있어서, L-Aspartic acid 함량이 1.3 ~ 1.5 mg/g이고, L-Glutamic acid 함량이 1.4 ~ 1.6 mg/g이고, L-Histidine 함량이 0.2 ~ 0.4 mg/g 이고, L-Alanine 함량이 0.8 ~ 1.0 mg/g 이고, L-Proline 함량이 0.7 ~ 0.9 mg/g 이고, L-Methionine 함량이 0.2 ~ 0.4 mg/g 이고, L-Lysin 함량이 0.6 ~ 0.8 mg/g 이고, L-Leucine 함량이 0.7 ~ 0.9 mg/g 이고, L-Phenylalanine 함량이 0.5 ~ 0.7 mg/g인 것을 특징으로 하는 복령을 제공한다.
본 발명에 따르면 복령 생산을 위하여 원목을 사용하지 않고 톱밥을 이용하여 병 또는 봉지에 재배하므로 복령의 대량생산이 가능하고, 원목을 토양에 직접 매립하지 않고 톱밥을 이용하여 복령을 재배하므로 모래, 흙 등과 같은 이물질이 복령에 혼입되는 것이 방지되고, 원목을 이용하는 비매립 원목 비닐봉지 재배방법보다는 자동화에 의한 복령 대량생산이 가능하므로 생산비 절감효과가 있다. 또한, 톱밥재배에 의한 복령 대량생산 기술개발로 원료의 표준화 및 지속적인 원료 공급시스템 확립으로 원료의 안정적인 공급 및 복령 소비확대 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 복령 재배용 톱밥의 이미지이다.
도 2는 미강 첨가량에 따른 복령균의 균사 생육 실험과정을 나타낸 이미지 이다.
도 3은 밀기울 첨가량에 따른 복령균의 균사 생육 실험과정을 나타낸 이미지이다.
도 4는 면실박 첨가량에 따른 복령균의 균사 생육 실험과정을 나타낸 이미지이다.
도 5(A)는 복령의 균핵 형성을 관찰한 이미지이고; (B)는 복령의 결령을 나타낸 이미지이다.
도 6(A)는 봉지를 씌운 복령의 이미지이고; (B)는 봉지를 씌우지 않은 복령의 이미지이고; (C)는 푸른 곰팡이에 오염된 복령의 이미지;이다.
도 7(A) 및 (B)는 톱밥 배지 및 톱밥과 영양원 첨가 배지에서의 복령의 이미지이다.
도 8는 본 발명의 바람직한 일실시예의 톱밥배지에서 병재배한 복령을 나타낸 이미지이다.
도 9는 본 발명의 바람직한 일실시예의 톱밥배지에서 수확한 복령을 나타낸 이미지이다.
도 10는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 복령 시료별 아미노산 함량을 나타낸 그래프이다.
도 11는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 아미노산 함량의 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 TLC 분석 결과를 나타낸 이미지이다.
도 13는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 HPLC 크로마토그램이다.
종래의 복령 재배 방법에 따르면 비닐을 멸균할 수 없으므로 멸균과정이 없어서 재배기간 중 오염으로 실패율이 높고 특히 액체 종균 접종이 불가하며, 복령 형성과정을 육안으로 확인할 수 없고 특히 균주 배양시 마개와 필터를 사용하지 아니하여 활착이후에 복령의 성장이 정지되며 또, 원목에 수분이 부족하게 되면서 공기부족으로 오염되거나 복령 형성이 정지되는 등 단점이 있었다.
이 밖에도 상기 공지된 복령의 매립 재배법으로 생산된 복령들은 약재상에서는 취급이 불가능할 정도로 모래, 흙, 톱밥 등 이물질이 많이 혼입되어 있고, 경도가 낮아서 약재로 가공하기 위해 절단시 부스러지는 문제가 있어 한약재로는 사용하기 곤란한 문제점이 있었다.
이에, 본 발명은 톱밥; 및 미강, 밀기울 및 면실박으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 영양원;을 포함하는 복령 재배용 배지 조성물을 제공함으로써, 이물질이 복령에 혼입되는 것을 방지하고, 원목을 이용하는 비매립 원목 비닐봉지 재배방법보다는 자동화에 의한 복령 대량생산이 가능하므로 생산비 절감효과가 있는 복령의 재배방법을 제공할 수 있다. 이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 톱밥을 포함한다. 상기 톱밥은 영양원과 혼합되어 밀폐된 공간에 멸균 상태로 담겨 복령 균을 배양할 수 있는 배지의 주 원료로 사용될 수 있다. 상기 톱밥은 소나무뿐만 아니라 침엽수, 활엽수 등 다양한 톱밥을 사용할 수 있고 수종에 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 소나무 톱밥, 미루나무 톱밥, 미송 톱밥 및 참나무 톱밥으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다(도 1 참조).
본 발명은 미강, 밀기울 및 면실박으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 영양원을 포함한다. 상기 영양원은 톱밥과 적정 비율로 혼합되어 균사 생육속도 및 균사 밀도가 우수하고, 높은 수량성 및 수분 함량을 나타내며 아미노산 함량이 향상된 복령을 재배할 수 있는 배지를 제조할 수 있다. 이때, 상기 톱밥 100 중량부에 대하여 상기 영양원 1 ~ 300 중량부를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 복령 재배용 배지 조성물에 있어서, 상기 영양원이 미강인 경우, 상기 톱밥 100 중량부에 대하여 미강 1 ~ 45 중량부를 포함할 수 있고, 바람직하게는 톱밥 100 중량부에 대하여 미강 1 ~ 25 중량부를 포함할 수 있다. 상기 배지 조성물이 톱밥과 영양원을 상기 범위로 포함하는 경우 복령균의 균사 생육속도 및 균사 밀도가 우수하고, 높은 수량성 및 수분 함량을 나타내며 아미노산 함량이 향상될 수 있다.
본 발명에 따른 복령 재배용 배지 조성물에 있어서, 상기 영양원이 밀기울인 경우, 상기 톱밥 100 중량부에 대하여 밀기울 1 ~ 300 중량부를 포함할 수 있고, 바람직하게는 톱밥 100 중량부에 대하여 밀기울 1 ~ 45 중량부를 포함할 수 있다. 상기 배지 조성물이 톱밥과 영양원을 상기 범위로 포함하는 경우 복령균의 균사 생육속도 및 균사 밀도가 우수하고, 높은 수량성 및 수분 함량을 나타내며 아미노산 함량이 향상될 수 있다.
본 발명에 따른 복령 재배용 배지 조성물에 있어서, 상기 영양원이 면실박인 경우, 상기 톱밥 100 중량부에 대하여 면실박 1 ~ 20 중량부를 포함할 수 있고, 바람직하게는 톱밥 100 중량부에 대하여 면실박 1 ~ 12 중량부를 포함할 수 있다. 상기 배지 조성물이 톱밥과 영양원을 상기 범위로 포함하는 경우 복령균의 균사 생육속도 및 균사 밀도가 우수하고, 높은 수량성 및 수분 함량을 나타내며 아미노산 함량이 향상될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에 복령균을 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 복령의 재배방법을 제공한다. 이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 복령의 재배방법은 상기 배지 조성물에 복령균을 접종하여 배양함으로써 복령균의 균사 생육속도 및 균사 밀도가 우수하고, 높은 수량성 및 수분 함량을 나타내며 아미노산 함량이 향상된 복령을 제조할 수 있다.
보다 상세하게는, 상기 복령의 재배방법에 따르면 상기 배지 조성물에 복령균을 접종하는 1단계; 상기 접종된 복령균을 배양하여 복령균으로부터 균핵을 형성하는 2단계; 및 상기 2단계에서 형성된 균핵으로부터 복령을 생육하는 3단계;를 포함할 수 있다.
상기 1단계는 상기 배지 조성물에 복령균을 접종하는 하는 단계로서, 이후의 단계에서 복령균의 균사가 생육되고 이로부터 균핵이 형성될 수 있다.
상기 2단계는 상기 접종된 복령균을 배양하여 복령균으로부터 균핵을 형성하는 단계이다.(도 5 참조).
이때, 상기 2단계의 배양은 20 ~ 35℃의 온도 및 60 ~ 70 %의 상대습도에서 45 ~ 50 일 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 20 ~ 28℃의 온도 및 60 ~ 70 %의 상대습도에서 45 ~ 50 일 동안 수행되는 것이 좋다. 일반적으로 복령 균사는 10 ~ 35℃의 온도범위에서 생육하고, 35℃를 초과하는 온도에서 배양하는 경우 복령 균사가 사멸되거나 노쇠하는 문제점이 있고, 20℃ 미만의 온도에서는 균사의 생장속도가 현저히 늦어지며, 5℃ 이하에서는 균사의 생육이 정지하는 문제점이 있다.
또한, 상기 2단계에서 균핵의 형성은 20 ~ 25℃의 온도, 60 ~ 80 %의 상대습도 및 800 ~ 1200 ppm의 이산화탄소 농도에서 20 ~ 25일 동안 수행될 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 경우 균핵의 형성이 늦어지거나 균핵이 형성되지 않는 문제점이 있다.
이때, 상기 복령의 재배방법에 있어서, 상기 1단계 및 2단계는 외부 환경과 분리되어 밀폐된 분위기에서 수행되는 것이 바람직하다. 따라서 비닐봉지 또는 병 등의 내부에 본 발명에 따른 배지를 담아 마개로 덮어 밀폐된 분위기를 조성할 수 있다. 이때, 상기와 같이 밀폐된 분위기가 조성되지 않은 경우 복령에 오염이 발생할 수 있는 문제점이 있다(도 6 참조). 또한, 상기 비닐봉지 또는 병 등 밀폐된 분위기를 조성하는 용기에 따라 복령의 생산성에 영향을 미칠 수 있다(도 8 참조). 구체적으로, 배지의 종류에 따라 복령균핵의 형성에는 뚜렷한 차이를 보이지 않으나, 균핵이 형성된 배지로부터 복령을 재배할 경우에 있어서, 비닐봉지에서 재배될 경우 병(폴리프로필렌 병)에서 재배되는 경우에 비해 수량성이 우수한 경향이 있다. 보다 상세하게는, 봉지배지에서 재배된 복령은 높은 수량성을 보일 수 있고, PP(Polyproylene)병과 봉지 측면에서 형성된 균핵을 이용한 재배에서는 수량이 떨어지는 경향을 보일 수 있다.
한편, 복령균으로부터 균핵이 형성된 이후에는 마개를 제거하여 복령 자실체를 유도할 수 있다.
또한, 상기 3단계에서 복령의 생육은 20 ~ 30℃의 온도, 60 ~ 90 %의 상대습도 및 800 ~ 1200 ppm의 이산화탄소 농도에서 수행될 수 있다. 상기 생육온도가 20℃ 미만인 경우 복령의 생육이 늦어지고, 30℃를 초과하는 경우 복령의 생육이 문제점이 있다.
일반적으로 복령의 상업화를 위해서는 직경이 약 10cm 이상이 되어야하는데, 본 발명에 따른 복령의 경우 5 ~ 6개월 정도 성장시키면 복령의 직경이 약 10 cm를 넘어 수확이 가능한 상태로 성장할 수 있다.
본 발명은 상기의 재배방법으로 재배한 복령에 있어서, L-Aspartic acid 함량이 1.3 ~ 1.5 mg/g이고, L-Glutamic acid 함량이 1.4 ~ 1.6 mg/g이고, L-Histidine 함량이 0.2 ~ 0.4 mg/g 이고, L-Alanine 함량이 0.8 ~ 1.0 mg/g 이고, L-Proline 함량이 0.7 ~ 0.9 mg/g 이고, L-Methionine 함량이 0.2 ~ 0.4 mg/g 이고, L-Lysin 함량이 0.6 ~ 0.8 mg/g 이고, L-Leucine 함량이 0.7 ~ 0.9 mg/g 이고, L-Phenylalanine 함량이 0.5 ~ 0.7 mg/g인 것을 특징으로 하는 복령을 제공한다. 본 발명에 따른 복령은 상기 제시된 복령재배용 배지에서 복령을 재배함으로써 종래의 제조방법에 비해 아미노산 함량이 향상된 복령을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 복령은 L-Serine의 함량이 0.8 ~ 0.9 mg/g이고, Glycine의 함량이 0.5 ~ 0.6 mg/g 이고, Ammonium chloride의 함량이 2.1 ~ 2.2 mg/g이고, L-Arginine의 함량이 0.6 ~ 0.7 mg/g 이고, L-Threonine의 함량이 0.7 ~ 0.8 mg/g 이고, L--Cystine의 함량이 0.15 ~ 0.25 mg/g 이고, L-Tyrosine의 함량이 0.1 ~ 0.2 mg/g 이고, L-Valine의 함량이 0.65 ~ 0.75 mg/g 이고, L-Isoleucine의 함량이 0.1 ~ 0.2 mg/g 일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기와 같은 아미노신 이외에도 상대적으로 함량이 높은 성분이 다량 함유되어 있고, 종래의 재배방법에 따라 재배된 복령에는 존재하지 않으나 본 발명에 따른 복령에만 함유되는 물질이 존재하는 것을 확인할 수 있다(도 13 참조).
이하, 본 발명을 하기 실시예들을 통해 보다 상세하게 설명한다. 이때, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
준비예 1. 시험균주 및 종균의 준비
본 발명에서 사용한 균주는 국립원예특작과학원 버섯과에 보관하고 있는 복령1호(Poria cocos)를 시험균주로 사용하였다.
준비예 2. 복령 재배용 배지의 준비
하기 표 1과 같은 조성으로 복령 재배용 배지를 준비하였다.
톱밥 영양원
종류 함량 (v/v) 종류 함량
(v/v)
준비예 2 소나무톱밥 95 미강 5
준비예 3 소나무톱밥 90 미강 10
준비예 4 소나무톱밥 80 미강 20
준비예 5 소나무톱밥 70 미강 30
준비예 6 소나무톱밥 50 미강 50
준비예 7 소나무톱밥 30 미강 70
준비예 8 소나무톱밥 100 미강 0
준비예 9 소나무톱밥 95 밀기울 5
준비예 10 소나무톱밥 90 밀기울 10
준비예 11 소나무톱밥 80 밀기울 20
준비예 12 소나무톱밥 70 밀기울 30
준비예 13 소나무톱밥 50 밀기울 50
준비예 14 소나무톱밥 30 밀기울 70
준비예 15 소나무톱밥 95 면실박 5
준비예 16 소나무톱밥 90 면실박 10
준비예 17 소나무톱밥 80 면실박 20
준비예 18 소나무톱밥 70 면실박 30
준비예 19 소나무톱밥 50 면실박 50
준비예 20 소나무톱밥 30 면실박 70
실시예 1. 복령의 재배
(1) 상기 준비예 1의 균주를 PDA 평판배지에서 7 일간 배양한 후 미송톱밥과 미강을 혼합한 배지(80:20, v/v)를 250 ml 삼각플라스크에 100 ml가량 담아 121℃에서 40분간 살균한 배지에 복령균을 접종하여 20일간 배양한 후 접종원으로 사용하였다.
(2) 상기 준비예 2의 배지를 수분함량 65 % 내외로 조절하였고, PP(Polyproylene)병과 봉지에 목까지 동일한 압력으로 배지를 담아서 121℃에서 90분간 고압살균 후 20℃ 내외로 냉각하고 준비된 종균을 접종하였다. 접종된 배지는 배양 온도 20 ~ 25℃, 상대습도 60 ~ 70%로 조절된 배양실에서 45 ~ 50일간 배양하였다. 배양기간 중에 혼합배지의 잡균 오염 여부를 조사하여 오염된 배지를 즉시 제거하였다.
(3) 상기 배양이 완료된 배지는 생육실(온도 20℃ ~ 25℃, 상대습도 60 ~ 80 %, CO2 농도 1000 ppm)로 옮겨 봉지의 마개를 제거하지 말고 약 20 ~ 25 일간 반드시 균핵의 형성을 유도하였다.
(4) 복령 균핵 형성이 완료된 배지는 조심스럽게 봉지의 마개를 제거하고 균핵이 오염되지 않도록 비닐봉지로 덮어서 복령의 발생 및 생육을 유도하며, 20일 후 갈색의 복령이 결령되기 시작하였다. 복령의 생육 온도는 20 ~ 25℃, 상대습도는 60 ~ 90 %, CO2 농도는 1000 ppm로 재배사를 관리하여 복령의 생육을 유도하였다.
실시예 2 ~ 19. 복령의 재배
상기 실시예 1의 단계에서 하기 표 2와 동일한 배지를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건에서 복령을 재배하였다.
실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5 실시예 6 실시예 7
배지 준비예 2 준비예 3 준비예 4 준비예 5 준비예 6 준비예 7 준비예 8
실시예 8 실시예 9 실시예 10 실시예 11 실시예 12 실시예 13 실시예 14
배지 준비예 9 준비예 10 준비예 11 준비예 12 준비예 13 준비예 14 준비예 15
실시예 15 실시예 16 실시예 17 실시예 18 실시예 19
배지 준비예 16 준비예 17 준비예 18 준비예 19 준비예 20
비교예 1. 자연산 복령
강원도 태백산에서 채취된 자연산 복령을 준비하였다.
비교예 2. 매립원목 복령
매립원목을 이용하여 톱밥 종균 접종 재배법으로 재배된 복령을 준비하였다.
비교예 3. 중국산 복령
중국에서 재배되고 운곡 한약품에서 구매된 중국산 복령을 준비하였다.
실험예 1. 영양원에 따른 균사 생장량 및 밀도 분석
상기 실시예 1 ~ 19의 배지에 따른 균사 생장량과 균사밀도를 하기 도 2 ~ 도 4와 같이 컬럼을 이용하여 생장시켜 조사하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 또한 이때의 균사생육 상태를 하기 도 2 ~ 4에 나타내었다. 이때, 하기 균사밀도는 + 약, ++ 중; +++ 강으로 표시하였다.
배지 균사생육속도
(단위: cm/5일)		 균사밀도
실시예 1 준비예2 11.4 +
실시예 2 준비예3 12.3 ++
실시예 3 준비예4 11.9 ++
실시예 4 준비예5 10.8 ++
실시예 5 준비예6 7.5 ++
실시예 6 준비예7 5.8 ++
실시예 7 준비예8 7.4
실시예 8 준비예9 9.3 +
실시예 9 준비예10 10.0 +
실시예 10 준비예11 10.9 +
실시예 11 준비예12 11.2 ++
실시예 12 준비예13 8.3 ++
실시예 13 준비예14 10.7 ++
실시예 14 준비예15 11.9 +
실시예 15 준비예16 10.5 +
실시예 16 준비예17 2.6 +
실시예 17 준비예18 2.3 +
실시예 18 준비예19 1.1 +
실시예 19 준비예20 0.7 +
표 3에 따르면, 톱밥에 영양원을 첨가하여 배양한 결과 순수한 톱밥 배지(실시예7)보다는 영양원이 첨가된 배지에서 배양일수가 빨랐다. 또한, 균사 생장량은 배양 4일 후 미강 10% 첨가된 배지(실시예 2)에서 12.3 cm, 밀기울 30% 첨가된 배지(실시예 11)에서는 11.2 cm 그리고 면실박 5% 첨가된 배지(실시예 14)에서는 11.9 cm였으며, 톱밥배지에서는 7.4 cm로 영양원이 첨가된 배지에서 균사생장이 빨랐다. 또한, 영양원이 첨가된 배지 중 미강을 첨가한 배지(실시예 1 ~ 6)가 다른 배지에 비해 상대적으로 균사생장이 빠른 것을 확인할 수 있었다. 영양원의 첨가량에 따른 균사밀도는 미강 5% 첨가배지(실시예 1), 밀기울 5 ~ 20% 첨가 배지(실시예 8 ~ 10) 및 면실박 첨가배지(실시예 5 ~ 10)에서 낮은 밀도를 보였고, 톱밥 100% 배지(실시예 7)에서도 낮은 밀도를 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 복령의 생육 및 수량특성
상기 실시예 7 및 실시예 2의 배지에서 배양된 복령에 있어서, 생육 및 수량특성을 조사하기 위하여 봉지당 평균 수량 및 평균건조 중량 및 수분함량을 측정하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
배지종류 평균수량
(g/봉지)		 평균건조중량
(g/봉지)		 수분함량
(%)
실시예 7(톱밥 100%) 230 86.3 62.5
실시예 2
(톱밥 + 영양원)		 260 96.2 63.0
상기 표 4 및 도 7 에 따르면, 톱밥 100% 배지에서 재배된 복령의 평균 무게는 230g/봉지였으며, 건조 중량은 86.3g/봉지으로 수분함량은 약 62.5%였으며, 톱밥과 영양원 혼합배지에서 재배된 복령의 평균 무게는 260g/봉지였으며, 건조 중량은 96.2g/봉지으로 수분함량은 약 63%였다. 따라서 톱밥 100% 배지보다는 톱밥에 영양원을 첨가한 배지에서 높은 수량성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3. 복령의 아미노산 함량 분석
상기 실시예 2 및 비교예 1 ~ 3의 복령을 냉동건조 후 분쇄하여 파우더 형태로 제조하여 아미노산 함량 분석을 위한 분석시료를 준비하였다. 상기 분석시료 0.1 g을 6N HCl 1 ml와 섞어 Fluorescence Waters Pico-Tag Workstation으로 N2 gas 충진 후 24 시간 동안 가수분해하였다. 이를 가수분해 후 원심분리하여, 상등액 200 ㎕을 취해 농축 한 다음 25 mM HCl 500 ㎕에 녹였다. 이 용액을 주사기에 취하여 syringe filter (Whatman PVDF syringe filter 13 mm, 0.3 ㎛)로 여과하고 AccQ-Fluor Reagent kit로 형광유도체화 반응시켰다. 형광유도체 반응은 AccQ fluor reagent borate buffer sample(standard) = 2 : 1로 전체 양은 100 ㎕가 되게 혼합한 후 55℃에서 반응시켜 HPLC 분석시료로 사용하였다. 이때, 아미노산 분석ㅇ에 이용된 HPLC의 구성은 하기 표 5과 같다.
또한, 아미노산 표준물질은 L-alanine을 포함하여 17 종과 암모니아(ammonia)를 3차 증류수로 희석하고 각 농도별 표준용액을 조제하여 HPLC 분석을 실시하고 피크 면적으로부터 검량선을 작성하여 시료 내 성분량을 정량하였다. 희석농도는 12.5 배, 25 배, 50 배, 100 배로 하였고, 표준품은 Amino Acid Standard H를 사용하였다. 그 결과를 하기 표 6 및 도 10 및 도 11에 나타내었다.
모델명 Waters 2795 Separations module
컬럼 AccQ-Tag For Hydrolysate Amino Acid Analysis column (3.9 ×150 mm)
이동상
 10% AccQ-Tag Eluent A (A 용매)
60% Acetonitrile (B 용매)
탐지 Waters 2475 Fluorscene detector (λ=248)
용매속력 1 ml/min (gradient mode)
주입량 10 ㎕
오븐온도 37℃
소프트웨어 Empower pro
아미노산 명 복령 함량
자연산 중국산 매립원목 톱밥재배
L-Aspartic acid 0.60 0.70 0.63 1.42
L-Serine 0.47 0.55 0.50 0.88
L-Glutamic acid 0.53 0.62 0.53 1.53
Glycine 0.22 0.25 0.23 0.57
L-Histidine 0.10 0.12 0.12 0.32
Ammonium chloride 2.02 1.78 1.67 2.17
L-Arginine 0.17 0.18 0.15 0.62
L-Threonine 0.42 0.50 0.45 0.78
L-Alanine 0.33 0.42 0.35 0.90
L-Proline 0.25 0.28 0.22 0.77
L-Cystine 0.38 0.35 0.33 0.20
L-Tyrosine 0.12 0.13 0.10 0.18
L-Tyrosine 0.33 0.40 0.35 0.70
L-Methionine 0.18 0.22 0.18 0.30
L-Lysine 0.13 0.13 0.10 0.70
L-Lysine 0.18 0.22 0.17 0.17
L-Leucine 0.30 0.35 0.30 0.78
L-Phenylalanine 0.28 0.32 0.28 0.57
표 6, 도 10 및 11에 따르면, 본 발명에 따른 복령 재배용 배지에서 재배된 복령의 아미노산 함량을 조사한 결과 18종류의 아미노산 중 L-Aspartic acid, L-Serine 등 16종류의 아미노산 함량이 자연산과 원목재배 복령보다 높았으나, L-Systeine과 L-Isoleucine은 자연산과 원목재배 복령과 비슷하거나 조금 낮은 경향을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 아미노산 중 Ammonium chloride, L-Aspartic acid, L-Glutamic acid가 가장 높은 함량을 보였고, 산성 아미노산인 L-Aspartic acid와 L-Glutamic acid가 염기성 아미노산인 L-Arginine와 L-Histidine 보다 높은 훨씬 함량을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 복령 재배용 배지에서 재배된 복령은 다른 재배방법에 의해 재배된 복령에 비해 아미노산 성분이 우수한 것을 알 수 있었다.
실험예 2. 복령의 TLC 분석
비교예 1 ~ 3 및 실시예 2의 복령을 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 분석시료를 제조하였고, 이를 TLC plate의 아래에서 2 cm 위에 1 cm 간격으로 1.0 ㎕씩 로딩하였다. 이동상은 methylchloroform : methanol : water(25:3:1, v/v)을 사용하였다. 전개 후 TLC plate에 염색 용액이 스며들게 한 후 70℃ 오븐에서 10분간 처리 후 밴드를 확인하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다. 이때, 상기 비교예 2의 복령이 1번, 실시예 2의 복령이 2번, 비교예 3의 복령이 3번, 비교예 1의 복령이 4번에 해당한다.
도 12에 따르면, 농축된 시료를 TLC로 분석한 결과 톱밥재배 복령이 다른 복령보다는 함유성분이 다양하고, 특히 함량(빨강색 원)이 높은 성분도 함유되어 있는 것으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3. HPLC 에 의한 복령의 함량 분석
실시예 2 및 비교예 1 ~ 3의 복령을 건조 후 분쇄하여 파우더 형태로 제조하여 분석시료로서 사용하였다. 전처리는 시료별 복령 100g을 MeOH로 3회 반복 추출하여 시료를 농축하였다. 또한, 농축된 시료는 에틸아세테이트로 분획하여 HPLC 분석에 사용하였다. 분석에 이용된 HPLC의 조건은 하기 표 7과 같다. 그 결과를 하기 도 13에 나타내었다. 이때, 본 발명에 따른 실시예 2의 시료가 A, 비교예 1의 시료가 B, 비교예 2의 시료가 C, 비교예 3의 시료가 D에 해당한다.
(사용기기 : Waters 515 HPLC pump, Waters Pump Control Module, Waters 717 Plus Auto-sampler, Waters Temperature Control Modul, Waters 2996 Photodiode Array Detector, Empower pro software, Column: Waters Sunfire C18 5 ㎛ (4.6×150 mm), 이동상 : Mobile phase : A-10% ACN(in 0.1% HOAc), B- 95% ACN→AB for 25 min, B for 15 min, Column temperature: 28℃, flow rate: 1 ml/min)
모델명

 Waters 515 HPLC pump
Waters 717plus auto-sampler
Waters pump control module
컬럼 Grace Prevail carbohydrate ES 5μ(250 ×4.6 mm)
이동상 75% Acetonitrile
탐지 waters 410 Differential Refractometer detector
용매속력 0.9 ml/min (isocratic mode)
주입량 10 ㎕
오븐온도 27℃
소프트웨어 Empower pro
도 13에 따르면, 실시예 2 및 비교예1 ~ 3의 시료에 각각 상이한 종류 및 함량의 성분들이 포함되어 있는 것을 확인할 수 있었고, 특히 본 발명에 따른 실시예 2의 경우 상대적으로 함량이 높은 성분이 다량 함유되어 있고, 비교예1 ~ 3에는 존재하지 않으나 본 실시예 2의 복령에만 함유되는 물질(도 13의 파란색 원 참조)이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. (i) 톱밥과 미강으로 혼합한 배지에 복령균을 접종하여 배양하는 단계;
    (ii) 상기 배양된 복령균을 7:3 내지 9:1 부피비의 톱밥 및 미강을 포함하는 배지 조성물에 상기 복령균을 접종하는 단계
    (iii) 상기 접종된 복령균을 20 내지 25℃, 상대습도 60 내지 70%의 조건에서 45일 내지 50일간 1차 배양하는 단계;
    (iv) 상기 1차 배양이 끝난 복령균을 20 내지 25℃의 온도, 상대습도 60 내지 80%의 상대습도 및 800 내지 1200 ppm의 이산화탄소 농도에서 20 내지 25일 동안 2차 배양하여 복령균으로부터 균핵을 형성하는 단계; 및
    (V) 상기 균핵을 형성하는 단계에서 형성된 균핵으로부터 복령의 결령을 생육하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 복령의 재배방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제5항에 있어서,
    상기 복령의 결령을 생육하는 단계에서 복령의 생육은 20 내지 30℃의 온도, 60 내지 90%의 상대습도 및 800 내지 1200 ppm의 이산화탄소 농도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 복령의 재배 방법.
  10. 제 5항의 방법으로 제조되고, 하기 아미노산 함량을 포함하는 것을 특징으로 하는 복령:
    상기 복령을 기준으로
    L-Aspartic acid 함량이 1.3 ~ 1.5 mg/g이고,
    L-Glutamic acid 함량이 1.4 ~ 1.6 mg/g이고,
    L-Histidine 함량이 0.2 ~ 0.4 mg/g 이고,
    L-Alanine 함량이 0.8 ~ 1.0 mg/g 이고
    L-Proline 함량이 0.7 ~ 0.9 mg/g 이고,
    L-Methionine 함량이 0.2 ~ 0.4 mg/g 이고,
    L-Lysin 함량이 0.6 ~ 0.8 mg/g 이고,
    L-Leucine 함량이 0.7 ~ 0.9 mg/g 이고,
    L-Phenylalanine 함량이 0.5 ~ 0.7 mg/g 이다.
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