KR101857000B1

KR101857000B1 - Ｐｉ3 키나아제 저해제로 사용되는 퀴나졸린-4(3ｈ)-온 유도체

Info

Publication number: KR101857000B1
Application number: KR1020137011430A
Authority: KR
Inventors: 존 킹-언더우드; 카츠히로 잇토; 피터 존 머레이; 조지 하디; 프레데릭 아서 브룩필드; 크리스토퍼 존 브라운
Original assignee: 레스피버트 리미티드
Priority date: 2010-10-18
Filing date: 2011-10-18
Publication date: 2018-05-14
Also published as: DK2630149T3; US9637494B2; HRP20150318T1; IL225212A0; SI2630149T1; EP2630149A1; PL2630149T3; CL2013001057A1; MX2013004298A; EA201390579A1; ECSP13012612A; WO2012052753A1; EP2630149B1; HK1184461A1; SG188958A1; US20130231355A1; GT201300097A; AU2011317334B2; US20160222019A1; ES2533570T3

Abstract

본 발명은 하기 화학식 (I)의 화합물, 이를 포함하는 조성물, 치료, 예를 들어 염증성 질환, 특히 호흡기 염증성 질환의 치료에 있어서 상기 화합물 및 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 화합물의 제조 방법을 포함한다:

Description

ＰＩ3 키나아제 저해제로 사용되는 퀴나졸린-4(3Ｈ)-온 유도체{QUINAZOLIN-4 (3H) -ONE DERIVATIVES USED AS PI3 KINASE INHIBITORS}

본 발명은 포스포이노시티드 3-키나아제(PI3 키나아제) 저해 화합물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 PI3 키나아제 델타 서브타입 및 또한 그의 감마 및 알파 서브타입을 저해하는 화합물, 및 약제학적 조합을 포함하여 치료, 특히, COPD 및 천식과 같은 폐의 염증성 질환을 비롯한 염증성 질환의 치료에 있어서 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 개시내용은 또한 상기 화합물 및 이를 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법도 포함한다.

지질 키나아제는 지질의 인산화를 촉매화하여 세포 이동 및 부착을 비롯한 다양한 생리 과정의 조절에 관여하는 물질을 제공한다. PI3-키나아제는 막결합 단백질(membrane associated protein)로서, 자체가 세포막에 결합하여 지질의 인산화를 촉매화하는 상기한 종류의 효소에 속한다. PI3-키나아제 델타(δ) 이소자임(PI3 키나아제 δ)은 다양한 3'-인산화 포스포이노시티드의 생성에 연루되는 타입 I PI3 키나아제의 4가지 아이소형 중 하나로서, 세포 시그널링(signalling)을 중개하며 염증, 성장인자 시그널링, 악성 전환(malignant transformation) 및 면역과 같은 많은 세포 과정에 관여한다(「Rameh, L. E. and Cantley, L. C. J. Biol. Chem., 1999, 274:8347-8350」의 리뷰 참조).

PI3 키나아제가 염증 조절에 관여한다는 것은, LY-294002 및 보르트만닌(wortmannin)과 같은 pan-PI3 키나아제 저해제를 사용한 다양한 모델에서 확인되었다(Ito, K. et al., J Pharmacol. Exp. Ther., 2007, 321:1-8). 최근 연구는 선택적 PI3 키나아제 저해제를 사용하거나, 특정 효소 아이소형이 없는 녹-아웃 마우스(knock-out 마우스)에서 수행되었다. 이들 연구는 염증에 있어서 PI3 키나아제 효소에 의해 조절되는 경로의 역할을 증명하였다. PI3 키나아제 δ 선택적 저해제 IC-87114가 기도 과민 반응, IgE 방출, 프로-염증성 사이토카인 발현(pro-inflammatory cytokine expression), 폐에 염증성 세포 축적 및 난백알부민(ovalbumin)-민감성의 난백알부민-투여(challeged) 마우스에서 혈관 투과성을 저해하는 것으로 밝혀졌다「Lee, K. S. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 2006, 118:403-409 및 Lee, K. S. et al., FASEB J., 2006, 20:455-65」. 또한, IC-87114는 TNFα에 의해 촉진되는, 마우스 폐에서의 중성구 축적 및 중성구 기능을 감소시킨다「Sadhu, C. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, 308:764-9」. PI3 키나아제 δ 아이소형은, G-단백질 연관(G-protein coupled) 단백질 신호전달 및 염증성 사이토카인뿐만 아니라, 인슐린 및 기타 성장 인자에 의해 활성화된다. 최근, PI3 키나아제 이중 δ/γ 저해제 TG100-115가 에어로졸로 투여된 경우 쥐 모델에서 뮤신 축적 및 기도 과민 반응뿐만 아니라 폐호산구 증가 및 인터류킨-13을 저해한다고 보고되었다. 또한, 동일 저자들은 상기 화합물이 LPS나 담배 연기에 의해 유발되는 폐호중구 증가를 저해할 수 있다고 보고하였다[Doukas, J. et al., J Pharmacol. Exp. Ther., 2009, 328:758-765].

또한, PI3 키나아제 δ 아이소형은 산화적 스트레스에 의해 활성화되기 때문에, 이는 높은 산화 스트레스 수준과 관련된 질환에서 치료적 개입을 위한 표적으로서 연관될 수 있을 것으로 보인다. PI3 키나아제 신호 전달 경로의 다운스트림 매개자(downnstream mediator)는 Akt(세린/트레오닌 단백질 키나아제) 및 라파마이신(rapamycin)의 포유동물 표적인 효소 mTOR를 포함한다. 최근의 연구는, PI3 키나아제 δ가 활성화되어 Akt를 인산화하면 코르티코스테로이드 내성, 아니면 코르티코스테로이드-민감성 세포 상태가 유도될 수 있다고 제안하였다「To, Y. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2010, 182:897-904」. 이러한 관찰에 의하면, 상기 시그널링 캐스케이드(signalling cascade)는 흡연으로 인해 폐의 산화적 스트레스가 증가하는 천식 환자뿐만 아니라, COPD 환자의 폐에서 관찰되는 염증이 코르티코스테로이드에 반응하지 않는 원인이 되는 단일 메카니즘일 수 있다는 가설이 가능하다. 실제로, COPD 및 천식 치료 모두에 사용되는 화합물인 테오필린(theophylline)은 PI3 키나아제 δ에 의해 조절되는 경로와의 상호작용을 포함하는 메커니즘을 통해 스테로이드 무반응성을 역전시킨다고 제안되어 왔다「To, Y. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2010, 182:897-904」.

현재, 천식 및 COPD 양자의 주된 치료는 코르티코스테로이드, 무스카린성 길항제(muscarinic antagonist) 및 β₂-효능제(agonist)를 적절한 임상적 판단에 따라 병용 사용하는 흡입 요법이다. COPD 및 천식에 있어서 충족되지 않은 의학적 요구를 다루는 한 가지 방법은, 예를 들어, 흡입용 약물로 사용하기에 적절한 신규 치료제를 찾는 것인데, 이는 단일요법 또는 상기 3가지 종류의 약물 중 하나 이상을 병용하여 사용하는 경우 의미 있는 이점을 제공할 가능성이 있어야 한다. 따라서, 천식, COPD 및 기타 염증성 질환에 있어서 향상된 치료 효과를 제공할 가능성을 갖는 선택적 PI3 키나아제 저해제의 아이소형을 발견하고 개발할 필요가 있다.

본 발명에 따라, 하기 화학식 (I)의 화합물, 즉 6-(2-((4-아미노-3-(3-하이드록시페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-(2-클로로벤질)-4-옥소-3,4-디하이드로퀴나졸린-5-일)-N,N-비스(2-메톡시에틸)헥스-5-인아미드, 그의 모든 입체이성체, 토토머 및 동위원소 유도체 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염이 제공된다:

본 발명에서 개시된 화합물은 이중 PI3K 델타 PI3K 감마 저해제이다.

본 원에서 사용된 용어 저해제는 시험관내 효소 분석에서 표적 단백질, 예를 들어, PI3K 델타 이소자임의 생물학적 활성을 감소시키거나(예를 들면 적어도 50% 까지), 제거하는 화합물을 의미한다.

본 원에서 사용된 용어 델타/감마 저해제는 화합물이 양 효소 아이소형을 반드시 동일한 정도일 필요는 없더라도 어느 정도까지 저해함을 가리키도록 의도된다.

본 발명에서 개시된 화합물은 세포 기반의 스크리닝 시스템에서 활성을 나타내므로, 이는 적절한 세포 침투 능력을 보유하고 따라서 세포내 약리 효과를 발휘하고 있음을 증명하는 것이다.

본 발명에서 개시된 화합물은 치료적으로 관련된 바람직한 약제학적 성질, 예를 들면 충분한 안정성, 용해성 및 효능있는 활성을 가진다.

본 발명의 일 구체예에서 화합물의 약제학적으로 허용가능한 산부가염이 제공된다.

본 원에서 상기 언급된 바와 같은 약제학적으로 허용가능한 산부가염은, 화학식 (I)의 화합물이 형성할 수 있는 치료적으로 활성인 비독성 산부가염을 포함한다. 이들 약제학적으로 허용가능한 산 부가염은 적당한 산으로 화학식 (I)의 화합물의 유리 염기 형태를 처리함으로써 용이하게 수득할 수 있다. 적당한 산은, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산 등과 같은 무기산; 또는, 예를 들어, 아세트산, 프로피온산, 하이드록시아세트산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 말산, 타타르산, 시트르산, 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 사이클람산, 살리실산, p-아미노살리실산, 파모산 등과 같은 유기산을 포함한다.

화합물 (I)의 염의 예로서는, HCl 및 HBr 염과 같은 광산의 산 부가염 및 메탄설폰산염과 같은 유기산의 부가염 등과 같은 약제학적으로 허용가능한 모든 염을 제한없이 포함한다. 추가 예로 황산염 및 인산염을 포함한다.

일 구체예로 6-(2-((4-아미노-3-(3-하이드록시페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-(2-클로로벤질)-4-옥소-3,4-디하이드로퀴나졸린-5-일)-N,N-비스(2-메톡시에틸)헥스-5-인아미드 하이드로클로라이드가 제공된다.

일 구체예로 6-(2-((4-아미노-3-(3-하이드록시페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-(2-클로로벤질)-4-옥소-3,4-디하이드로퀴나졸린-5-일)-N,N-비스(2-메톡시에틸)헥스-5-인아미드 하이드로브로마이드가 제공된다.

일 구체예로 6-(2-((4-아미노-3-(3-하이드록시페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-(2-클로로벤질)-4-옥소-3,4-디하이드로퀴나졸린-5-일)-N,N-비스(2-메톡시에틸)헥스-5-인아미드 토실레이트가 제공된다.

또한, 본 원 화합물의 용매화물(solvate)도 개시되었다. 용매화물의 예는 수화물을 포함한다.

개시된 화합물은, 명시된 원자가 자연발생적이거나 비자연발생적인 동위원소인 것들을 포함한다. 일 구체예에서 동위원소는 안정한 동위원소이다. 따라서, 개시된 화합물은, 예를 들어, 수소 원자 대신 하나 이상의 중수소 등을 함유하는 것을 포함한다.

화학식 (I)의 화합물이 중수소 표지된 화합물인 본 발명의 일 구체예에서, 동위원소 표지된 화합물은 화학식 (IA)의 헥사듀테리오(hexadeuterio) 유도체이다:

또한, 개시된 범위는 본 원에서 정의된 화합물의 모든 다형체(polymorphic form)도 포함한다.

화학식 (I)의 화합물은 화학식 (II)의 화합물 또는 그의 보호된 유도체를 극성 비양성자성 용매중 적합한 촉매 및 유기 염기의 존재하에 불활성 분위기하에서 화학식 (III)의 화합물과 반응시켜 용이하게 제조될 수 있다:

상기 식에서,

LG₁은 할로, 특히 브로모와 같은 이탈기를 나타낸다.

적합한 촉매는 요오드화구리 존재하의 팔라듐 촉매, 예컨대 비스(트리페닐포스핀)팔라듐 (II) 디클로라이드를 포함하고, 적합한 극성 비양성자성 용매는 DMF이다. 적합한 불활성 분위기는 질소이다.

다른 한편으로, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (II)의 화합물 또는 그의 보호된 유도체를 화학식 (IV)의 화합물과 반응시켜 화학식 (V)의 화합물 또는 그의 보호된 유도체를 제공하는 것을 포함하는 방법으로 제조될 수 있다:

상기 식에서,

R은 적합하게는 H이다.

화학식 (I)의 화합물은 이어, 화학식 (V)의 화합물로부터 하나 이상의 표준 작용기 변환으로 얻는다. 예를 들어, R이 H인 경우, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (V)의 화합물을 아민, 가장 적합하게는 비스(2-메톡시에틸)아민과 아미드 커플링 반응시켜 생성될 수 있다.

화학식 (II)의 화합물이 보호된 유도체인 합성 방법의 경우에는, 화학식 (I)의 화합물이 업계에서 주지되고 행해지고 있는 적절한 탈보호 단계로 방출된다. 예를 들어, 화학식 (I)의 화합물에 존재하는 페놀이 실릴 그룹, 예를 들어 tert-부틸디메틸실릴 그룹으로 보호된 경우, 탈보호 단계는 DMF와 같은 극성 비양성자성 용매의 존재하에 테트라부틸암모늄 플루오라이드와 같은 시약으로 처리함으로써 행해질 수 있다. 반응은 낮은 온도, 예컨대 약 0 ℃에서 수행될 수 있다.

화학식 (II)의 화합물은 화학식 (VI)의 화합물 또는 그의 보호된 유도체를 극성 비양성자성 용매중에서 염기의 존재하에 화학식 (VII)의 화합물 또는 그의 보호된 유도체와 반응시켜 제조될 수 있다:

상기 식에서,

LG₁은 화학식 (II)의 화합물에 대해 상기 정의된 바와 같은 이탈기를 나타내고,

LG₂는 할로, 예를 들어 할로겐 원자 및 적합하게는 염소와 같은 이탈기를 나타낸다.

상기 변환에 적합한 염기는 탄산칼륨을 포함하고, 적합한 극성 비양성자성 용매는 DMF이다.

합성 공정은 커플링 단계동안 화학식 (VII)의 화합물의 페놀성 하이드록실을 보호하는 것이 유리한 것으로 생각되며, 적합한 보호된 유도체는 tert-부틸디메틸실릴 에테르 및 tert-부틸 에테르를 포함한다.

다른 한편으로, 화학식 (II)의 화합물은 화학식 (VIII)의 화합물 또는 그의 보호된 유도체를 적합한 귀금속 촉매, 무기 염기 및 극성 양성자성 용매의 존재하에 불활성 분위기하에서 화학식 (IX)의 화합물 또는 그의 보호된 유도체와 반응시킨 후, 필요에 따라 탈보호하여 제조될 수 있다:

상기 식에서,

LG₁은 화학식 (II)의 화합물에 대해 상기 정의된 바와 같고,

LG₃은 할로, 특히 요오도와 같은 이탈기를 나타낸다.

적합한 촉매는 테트라카스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)이다.

적합한 무기 염기는 탄산나트륨이고, 적합한 극성 양성자성 용매는 에탄올이다.

반응은 높은 온도, 예를 들어 85 ℃에서 장시간, 예를 들어, 3 일동안, 이어 RT로 냉각하여 수행될 수 있다.

보호기는 상술된 하나 이상의 반응이 진행되는 동안 화학 민감성 그룹(chemically sensitive group)을 보호하여 하나 이상의 공정 효율성을 확보하기 위해 필요할 수 있다. 따라서, 바람직하거나 필요한 경우, 중간체 화합물은 통상적인 보호기를 사용함으로써 보호될 수 있다. 보호기 및 이들의 제거 수단은 ["Protective Groups in Organic Synthesis", by Theodora W. Greene and Peter G.M. Wuts, published by John Wiley & Sons Inc; 4^th Rev Ed., 2006, ISBN-10: 0471697540]에 기술되어 있다.

신규 중간체가 본 발명의 일 측면으로서 청구된다.

유리하게는, 본 발명의 화합물은, 아트로프 이성체(atropisomer)를 나타내지 않는다.

일 측면에 있어서, 화합물은 치료, 예를 들어, COPD 및/또는 천식 치료에 유용하다.

현재까지 개발된 PI3K 화합물은 전형적으로 경구 투여를 위한 것이었다. 전형적으로, 이들 방법은 적정 시간 동안 작용이 지속되도록 하기 위하여 화합물의 약물동태학적 프로파일의 최적화가 필요하다. 이러한 방식에서는, 투여 간에 충분히 높은 약물 농도를 수립하고 유지하여 연속적인 임상 효과를 제공하게 된다. 이러한 접근법의 피할 수 없고도 보통은 바람직하지 않은 결과는 표적화되지 않은 신체 조직, 특히 간 및 소화관이 약물학적으로 활성인 약물 농도에 노출되기 쉽다는 것이다.

대안적인 방법은 약물을 염증이 생긴 기관에 직접 투여하는(예를 들어, 국소 치료) 치료 요법획을 계획하는 것이다. 이러한 접근법이 모든 만성 염증성 상태를 치료하는데 적합하지는 않더라도, 폐 질환(천식, COPD), 피부 환부(아토피 피부염 및 건선), 비 질환(알레르기성 비염) 및 위장 장애(궤양 대장염)의 치료에 광범위하게 이용되어 왔다.

국소 치료에 있어서, 원하는 효능은 때때로 약물의 작용 기간을 지속시키고 표적 기관에 우세하게 유지되게 하여 전신 독성의 위험을 최소화함으로써 달성될 수 있다. 이와 달리, 활성 약물의 "저장소(reservoir)"를 생성하여 원하는 효과를 유지할 수 있는 적절한 제제를 사용할 수 있다. 첫번째 접근법의 예는, 항콜린성 약물 티오트로피움 브로마이드(anticholinergic drug tiotropium bromide, Spiriva HandiHaler^®)를 사용하는 것인데, 이는 COPD 치료제로서 폐에 국소적으로 투여된다. 이 화합물은 표적 수용체에 특히 높은 친화도를 가져, 매우 낮은 오프율(해리 속도) 및 그에 따른 지속적인 작용 기간을 갖는다.

본 발명의 개시의 일 측면에 따라, 예를 들어, 폐에 국소적으로 투여되는 PI3 키나아제 저해제로서의 화학식 (I)의 화합물 또는 그로부터 유도된 적합한 제제의 용도가 제공된다.

본 발명의 개시의 일 측면에서, 본 원의 화합물은 특히, COPD 치료용으로 폐로의 국소 전달과 같은, 국소 전달에 특히 적합하다.

요컨대, 본 발명의 일 측면은 흡입, 즉 폐로의 국소 투여에 의해 COPD 및/또는 천식, 특히 COPD 또는 중증 천식을 치료하기 위한 본 발명의 화합물의 용도를 제공하는 것이다. 폐로의 투여는 실현될 화합물의 유익한 효과를 가능케 하면서 환자에 대한 부작용을 최소화한다는 점에서 유리하다.

일 구체예에서, 화합물은 코르티코스테로이드 치료에 민감한 환자에 적합하다.

또한, 본 원의 화합물은 류마티스 관절염의 치료에도 유용하다.

또, 본 발명은, 본 발명의 개시에 따른 화합물을 임의로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

희석제 및 담체는 비경구, 경구, 국소, 점막 및 직장 투여에 적합한 것을 포함할 수 있으며, 투여 경로에 따라 달라질 수 있다.

일 구체예에서, 조성물은 예를 들어 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내 또는 관절 주위 투여를 위해, 특히 액체 용액 또는 현탁물의 형태; 경구 투여를 위해, 특히 정제 또는 캡슐의 형태; 국소, 예를 들어, 폐 또는 비강내 투여를 위해, 특히 파우더, 점비제(nasal drop) 또는 에어로졸 및 경피 투여의 형태; 예를 들어, 볼(buccal), 혀밑(sublingual) 또는 질 점막에 대한 점막 투여, 및 직장 투여(rectal administration)를 위해, 예를 들어, 좌약의 형태로 제조될 수 있다.

조성물은 단위 투약 형태로 편리하게 투여될 수 있으며, 예를 들어, 「Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985)」에 기술된 바와 같이, 약학 분야에서 잘 알려진 임의 방법으로 제조될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제는 멸균수 또는 염수, 프로필렌 글리콜과 같은 알킬렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물성 유래 기름, 수소화된 나프탈렌 등을 부형제로 함유할 수 있다.

비강내 투여용 제제는 고체일 수 있으며, 부형제, 예를 들어, 락토스 또는 덱스트란을 함유할 수 있거나, 또는 점비제 또는 계량 스프레이(metered spray) 형태로 사용하기 위한 수성 또는 유성 용액일 수 있다. 볼 투여의 경우, 전형적인 부형제에는 당, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 전호화분 녹말(pregelatinated starch) 등이 포함된다.

경구 투여에 적당한 조성물은 하나 이상의 생리적으로 양립가능한 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있으며 이는 고체 또는 액체 형태일 수 있다. 정제 및 캡슐은, 결합제, 예를 들어, 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨, 트래거캔스, 또는 폴리-비닐피롤리돈; 락토스, 수크로스, 옥수수 전분, 칼슘 포스페이트, 소르비톨, 또는 글리신과 같은 충전제; 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 실리카와 같은 윤활제; 및 소듐 라우릴 설페이트와 같은 계면활성제와 함께 제조될 수 있다. 액체 조성물은, 현탁화제, 예를 들어, 소르비톨 시럽, 메틸 셀룰로오스, 당 시럽, 젤라틴, 카복시메틸-셀룰로오스, 또는 식용 지방과 같은 통상적인 첨가제; 레시틴, 또는 아카시아와 같은 유화제; 아몬드 오일, 코코넛 오일, 대구 간유, 또는 땅콩 오일과 같은 식물성 오일; 부틸 하이드록시아니솔(BHA) 및 부틸 하이드록시톨루엔(BHT)과 같은 보존제를 함유할 수 있다. 액체 조성물은, 예를 들어, 젤라틴으로 캡슐화되어 단위 투여 형태를 제공할 수 있다.

고체 경구 투여 형태는 정제, 투-피스 경질 쉘 캡슐(two-piece hard shell capsule) 및 연질 탄성 젤라틴(soft elastic gelatin; SEG) 캡슐을 포함한다.

전형적으로, 건조 쉘 제제는 약 40% 내지 60% 농도의 젤라틴, 약 20% 내지 30% 농도의 가소제(예컨대 글리세린, 소르비톨 또는 프로필렌 글리콜) 및 약 30% 내지 40% 농도의 물로 구성되어 있다. 또한, 보존제, 색소, 유백제(opacifier) 및 향미제와 같은 기타 물질도 존재할 수 있다. 액체 충전 물질은 (밀랍, 수소화된 파마자유 또는 폴리에틸렌 글리콜 4000과 같은 현탁화제와 함께) 용해, 가용화 또는 분산된 고체 약물 또는 비히클 또는 광유, 식물성 기름, 트리글리세리드, 글리콜, 폴리올과 같은 비히클 조합중의 액체 약물 및 표면활성제를 포함한다.

적절하게는, 화학식 (I)의 화합물은 폐에 국소적으로 투여된다. 따라서 일 구체예에서, 본 발명에서 개시된 화합물과 임의로 하나 이상의 국소적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 함께 포함하는 약물학적 조성물이 제공된다. 폐로의 국소적 투여는 에어로졸 제제를 사용함으로써 가능해질 수 있다. 전형적으로, 에어로졸 제제는, 클로로플루오로카본(CFC) 또는 하이드로플루오로카본(HFC)와 같은, 적절한 에어로졸 분사제(propellant)에 현탁 또는 용해된 활성 성분을 포함한다. 적당한 CFC 분사제는 트리클로로모노플루오로메탄(분사제 11), 디클로로테트라플루오로메탄(분사제 114), 및 디클로로디플루오로메탄(분사제 12)을 포함한다. 적당한 HFC 분사제는 테트라플루오로에탄(HFC-134a) 및 헵타플루오로프로판(HFC-227)을 포함한다. 전형적으로 분사제는 전체 흡입 조성물의 40 내지 99.5 중량%, 예를 들어, 40 내지 90 중량%로 포함된다. 제제는 공용매(예를 들어, 에탄올) 및 계면활성제(예를 들어, 레시틴, 소르비탄 트리올리에이트 등)를 포함하는 부형제를 포함할 수 있다. 에어로졸 제제는 통에 패키지화되거나 적정 투여량이 계량 밸브에 의해 전달된다(예를 들어, Bespack, Valois 또는 3M에 의해 제공되는 것).

또한, 폐로의 국소 투여는 수용액 또는 현탁물과 같이 무압 제제를 사용하여 이루어질 수 있다. 이는 분무기(nebuliser)에 의해 투여될 수 있다. 또한, 폐로의 국소 투여는 건조-파우더 제제를 사용하여 이루어질 수도 있다. 건조 파우더 제제는 본 발명의 화합물을 미분 형태, 전형적으로는 1 내지 10 ㎛의 질량 평균 직경(MMAD)으로 함유할 것이다. 전형적으로 그 제제는, 보통 큰 입자 크기, 예를 들어, 100 ㎛ 이상의 질량 평균 직경(MMAD)의 락토스와 같은 국소적으로 허용가능한 희석제를 함유할 것이다. 건조 파우더 전달 시스템의 예는 SPIHALER, DISKHALER, TURBOHALER, DISKUS, SKYEHALER, ACCUHALER 및 CLICKHALER를 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 화합물은 DISKUS와 같은 장치에 채워진, 예를 들어, 적당한 등급의 락토스를 포함하는 마이크로화된 건조 파우더 제제로 제공된다.

본 발명에 따른 화합물은 치료적 활성을 갖도록 의도되었다. 다른 측면에 있어서, 본 발명은 의약으로서의 용도를 위한 화합물을 제공한다.

또한, 본 원에 개시된 화합물은 (만성 기관지염 및 폐기종을 포함하는) COPD, 천식, 소아 천식, 낭성 섬유증, 사르코이드증, 특발성 폐섬유증, 알레르기성 비염, 비염, 동염, 특히 천식, 만성 기관지염 및 COPD를 포함하는 호흡기 장애의 치료에 유용할 수 있다.

또한, 본 원에 개시된 화합물은, 환자의 상태가 이전에 코르티코스테로이드에 반응하지 않았던 경우, 환자의 상태를 이에 의한 치료에 다시 민감화(re-sensitise)시킬 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 단일요법으로 사용하기에 적합하나, 코르티코스테로이드와 병용하여 투여되는 용량의 본 발명의 화합물이 사용된다.

일 구체예에서, 단일 약제로서 치료량 이하일 수 있는 용량의 화학식 (I)의 화합물이 코르티코스테로이드와 병용하여 사용되며, 이에 따라 환자가 이전에 후자에 반응하지 않았던 경우, 후자에 대한 환자의 반응성이 복원된다.

또한, 본 발명의 화합물은 항-바이러스 활성을 나타낼 수 있으며, 천식 및/또는 COPD와 같은 염증성 장애의 바이러스에 의한 악화를 치료하는데 유용하다는 것이 증명되었다.

본 원에 개시된 화합물은 또한, 플루 바이러스, 리노바이러스 및/또는 호흡기 세포융합 바이러스의 예방, 치료 또는 개선에 유용할 수 있다.

또한, 본 원에 개시된 화학식 (I)의 화합물은 알레르기성 결막염, 결막염, 알레르기성 피부염, 접촉성 피부염, 건선, 궤양성 대장염, 류마티스 관절염 또는 골관절염으로 인한 염증 관절을 포함하여, 국소 또는 국부 요법에 의해 치료될 수 있는 특정 상태의 치료에 유용할 것으로 기대된다.

일 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 적절한 경로로 투여되는 경우, C형 간염 및/또는 HIV의 치료에 유용할 것으로 생각된다. 적절한 투여 경로는 경구, 정맥 주사 또는 주입을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, C형 간염의 치료를 위한 화학식 (I)의 화합물은 간으로의 혈액 사전-유입(pre-entry)으로 전달된다.

또한, 본 발명의 화합물은 류마티스 관절염, 췌장염, 카켁시아를 포함하는 기타 특정 상태의 치료, 비소세포 폐암종, 유방암종, 위암종, 결장직장암종 및 악성 흑색종을 포함한 종양의 성장 및 전이의 저해에 유용할 것으로 기대된다.

일 구체예에서, 본 발명의 개시된 화합물 및 이를 포함하는 약제학적 제제는 특히 폐에 국소 투여함으로써 암, 특히 폐암을 치료 또는 예방하는데 유용하다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 하나 이상의 상태의 치료에 사용하기 위한 본 원에서 설명된 바와 같은 화합물을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 하나 이상의 상태의 치료용 의약을 제조하기 위한 본 원에서 설명된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 원에서 개시된 화합물 또는 그의 약제학적 조성물의 유효량을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 상기 언급된 상태의 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 원에서 설명된 화합물은 하나 이상의 상기 언급된 질환의 치료용 의약의 제조에 사용될 수 있다.

용어 "치료"는 치료적 치료뿐만 아니라 예방까지를 포함하는 의미이다.

또한, 본 원에서 개시된 화합물은 하나 이상의 기타 활성 성분, 예를 들어, 상기 언급된 상태의 치료에 적합한 활성 성분과 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 호흡기 장애의 치료를 위해 가능한 조합은 스테로이드(예를 들어, 부데소니드, 베클로메타손 디프로피오네이트, 플루티카손 프로피오네이트, 모메타손 푸로에이트, 플루티카손 푸로에이트), 베타 효능제(예를 들어, 터부탈린, 살부타몰, 살메테롤, 포모테롤, 인다카테롤) 및/또는 크산틴(예를 들어, 테오필린), 무스카린 길항제(예를 들어, 이프라트로피움) 및/또는 p38 MAP 키나아제 저해제와의 조합을 포함한다.

일 구체예에서, 본 원에서 개시된 화합물은 항바이러스제, 예를 들어, 아시클로비르, 타미플루, 레렌자 또는 인터페론과 함께 투여된다.

일 구체예에서, 활성 성분의 조합은 공동 제제화된다.

일 구체예에서, 본 원에서 개시된 화합물은 예를 들면 예방을 포함하여 COPD 또는 폐암의 유지 요법에 사용하기 위해 흡입용 제제로서 코르티코스테로이드와 함께 공동 제제화된다.

일 구체예에서, 활성 성분의 조합은 단순히 공동 투여된다.

일 구체예에서, 본 원에서 개시된 화합물은 흡입으로 투여되고, 코르티코스테로이드는 병용으로 또는 별도로 경구 또는 흡입으로 투여된다.

실험부분

본 원에서 사용된 약어는 하기 표 1에 정의된 의미를 갖는다. 정의되지 않은 모든 약어는 일반적으로 받아들여지는 이들의 의미로 사용되도록 의도된다.

표 1: 약어

aq 수성

Ac 아세틸

ATP 아데노신-5'-트리포스페이트

BALF 기관지 폐포성 유출액(bronchoalveolae lavage fluid)

br 브로드(broad)

BSA 소혈청알부민

COPD 만성 폐쇄성 폐질환

d 이중선

DCM 디클로로메탄

DMAP 4-디메틸아미노피리딘

DMSO 디메틸 설폭사이드

EDC.HCl 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라 이드

(ES⁺) 전기분무 이온화, 양성 모드

Et 에틸

EtOAc 에틸 아세테이트

EtOH 에탄올

FACS 형광-활성 세포 분류

FCS 소태아혈청

FP 플루티카손 프로피오네이트

g 그램

HPLC-MS 고성능 액체 크로마토그래피 질량 분석

hr 시간

HRP 호스래디시 퍼옥시다제

HRV 인간 리노바이러스

i-n 비강내

i-t 기관내

IL-8 인터류킨 8

μL 마이크로리터

LPS 리포폴리사카라이드

μM 마이크로몰

M 몰

(M+H)⁺ 양성자화된 분자 이온

MCP-1 단핵구 주화성 단백질

Me 메틸

MeOH 메탄올

mg 밀리그램

MHz 메가헤르츠

min 분

mL 밀리리터

mM 밀리몰의

mmol 밀리몰

MTT 3-(4,5-디메틸티아졸-2일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드

m/z 단위전하당 질량

ng 나노그램

nM 나노몰의

nm 나노미터

NMR 핵자기공명(분광법)

OVA 난백알부민

PBS 인산 완충 염수

Ph 페닐

PIP2 포스파티딜이노시톨 4,5-비포스페이트

PIP3 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리포스페이트

PMA 포르볼 미리스테이트 아세테이트

Po 경구 투여에 의함

PPh₃ 트리페닐포스핀

q 사중선

quin 오중선

R^t 체류시간

RT 실온

RP HPLC 역상 고성능 액체 크로마토그래피

RSV 호흡기세포융합 바이러스

s 단일선

SDS 소듐 도데실 설페이트

SEM 평균 표준오차

t 삼중선

TMB 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘

TNFα 종양괴사인자 α

TR-FRET 시분해 형광 공명 에너지 전달

vol 부피.

일반적인 절차

모든 출발 물질 및 용매는 상업적 공급처로부터 얻었거나, 문헌 인용에 따라 제조되었다. 별도의 언급이 없으면, 모든 반응물은 교반되었다. 유기 용액은 무수 황산마그네슘에서 통상적으로 건조하였다.

HPLC-MS는, 40 ℃에서 2.5-4.5 mL min^-1의 유량으로 0.1% v/v 포름산을 함유하는 H₂O-MeCN 구배로 4 분에 걸쳐 용출하면서 Agilent Extend C18 칼럼 (1.8 ㎛, 4.6 x 30 mm)을 사용하는 Agilent HP1200 시스템상에서 수행하였다. 구배 정보: 0-3.00 min, 95% H₂O-5% MeCN 에서 5% H₂O-95% MeCN으로 경사; 3.00-3.01 min, 5% H₂O-95% MeCN에서 유지, 유량을 4.5 mL min^-1으로 증가; 3.01-3.50 min, 5% H₂O-95% MeCN에서 유지; 3.50-3.60 min, 95% H₂O-5% MeCN으로 복귀; 유량을 3.50 mL min^-1으로 감소; 3.60-3.90 min, 95% H₂O-5% MeCN에서 유지; 3.90-4.00 min, 95% H₂O-5% MeCN에서 유지, 유량을 2.5 mL min^-1으로 감소. UV 검출은 Agilent G1314B 가변 파장 검출기를 사용하여 254 nm에서 수행하였다.

Agilent G1956B를 사용하여 1.6 sec/cycle의 샘플링 속도에서 범위 m/z 60 내지 2000에 걸쳐, Waters ZMD를 사용하여 2 Hz의 샘플링 속도에서 m/z 150 내지 850에 걸쳐, 또는 Shimadzu 2010 LC-MS 시스템을 사용하여 2 Hz의 샘플링 속도에서 m/z 100 내지 1000에 걸쳐 전기분무 이온화 (ES)를 사용하여 질량 스펙트럼을 얻었다. 잔류 중수소화(deuterated) 용매를 기준으로 사용하여 400 MHz Bruker Avance III 분광계에서 ¹H NMR 스펙트럼을 얻었다.

5-브로모-3-(2-클로로벤질)-2-(클로로메틸)퀴나졸린-4(3 H )-온.

빙조에서 0 ℃로 냉각시킨 톨루엔 (75 mL) 중 2-아미노-6-브로모-벤조산 (3.06 g, 14.2 mmol)의 교반 용액에 피리딘 (0.60 mL, 7.10 mmol)을 첨가한 후, 톨루엔 (75 mL) 중 클로로아세틸 클로라이드 (2.26 mL, 28.4 mmol)의 용액을 1 시간에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 RT로 가온하고, 115 ℃에서 3 시간동안 가열한 뒤, RT로 냉각하였다. 진공중에 증발시켜 용매 부피를 반으로 줄였다. 밤새 방치하고, 침전된 생성물을 여과로 수집하여 2-브로모-6-(2-클로로아세트아미도)벤조산 (1a, X = Cl) (1.44 g)을 백색 고체로 수득하였다: m/z 290/292 (M+H)⁺ (ES⁺). 여액을 진공중에 농축하고, 잔사를 에탄올/헵탄에서 연마하여 2-브로모-6-(2-하이드록시아세트아미도) 벤조산 (1b X =OH)을 수득하였다 (1.02 g, 합한 수율, 59%): m/z 274/276 (M+H)⁺ (ES⁺). 1a 및 1b는 모두 다음 단계에 추가 정제없이 사용될 수 있다.

톨루엔 (250 mL) 중 화합물 (1a) (7.50 g, 27.4 mmol), 2-클로로벤질아민 (5.00 mL, 41.05 mmol) 및 트리에틸아민 (5.70 mL, 41.1 mmol)의 교반 혼합물에 톨루엔 (250 mL) 중 삼염화인 (2.60 mL, 30.1 mmol)의 용액을 1 시간에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 24 시간동안 110 ℃로 가열하고, 용액을 뜨거운 채로 따라내고, 진공중에 농축하였다. 잔사를 프로판-2-올 (50 mL)에서 연마하여 표제 화합물 (2) (6.41 g, 59%)을 황색 고체로 수득하였다: R^t 2.67 min; m/z 397/399 (M+H)⁺ (ES⁺).

2-((4-아미노-3-요오도-1 H -피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)메틸)-5-브로모-3-(2-클로로벤질)퀴나졸린-4(3 H )-온.

DMF (300 mL) 중 5-브로모-3-(2-클로로벤질)-2-(클로로메틸)퀴나졸린-4(3H)-온, (2), (13.6 g, 30.7 mmol) 및 3-요오도-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민 (3) (8.09 g, 30.7 mmol)의 교반 혼합물에 탄산칼륨 (6.36 g, 46.0 mmol)을 첨가하고 반응물을 RT에서 24 시간동안 어두운 곳에 두었다. 혼합물을 물 (4.0 L)에 붓고, 생성된 현탁액을 RT에서 1 시간동안 교반하였다. 침전을 여과로 분리하고, 진공중에 건조하여 표제 화합물, (4)를 무색 고체로 수득하였다 (18.0 g, 94%); R^t 2.17 min; m/z 622/624 [M+H]⁺ (ES⁺).

3-(3-( tert -부틸디메틸실릴옥시)페닐)-1 H -피라졸로[3,4- d ]피리미딘-4-아민.

탈기한 DMF/물 (3:2, 140 mL) 중 3-요오도-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민 (3) (8.22 g, 31.5 mmol), 3-페놀 보론산 (13.0 g, 94.5 mmol) 및 인산칼륨 (10.0 g, 47.3 mmol)의 교반 현탁액에 [dppf] 팔라듐 (II) 디클로라이드 (13.0 g, 15.7 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소로 플러싱하고, 120 ℃에서 2 시간동안 가열한 후, RT로 냉각하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (500 mL) 및 염산 (2 M, 500 mL)으로 희석하고, 생성된 현탁액을 여과하였다. 여액을 염산 (2 M, 2 x 500 mL)으로 추출하였다. 모은 수성 추출물을 탄산나트륨 포화 수용액으로 pH 10이 되도록 조정하였다. 형성된 침전을 여과하고, 여액을 EtOAc (3 x 1 L)로 추출하였다. 유기 추출물을 합해 건조시키고, 여과한 후, 용매를 진공중에 제거하여 회색 고체를 수득하였다. 후처리 과정동안 생성된 모든 고체 물질을 모으고, DCM에서 연마하여 3-(4-아미노-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)페놀 (5) (6.04 g, 84%)을 회색 고체로 수득하였다: m/z 228 (M+H)⁺ (ES⁺).

무수 DMF (100 mL) 중 페놀 (5) (4.69 g, 20.66 mmol) 및 이미다졸 (2.10 g, 30.99 mmol)의 교반 용액에 TBDMSCl (4.70 g, 30.99 mmol)을 첨가하였다. 16 시간 후, 추가 분량의 이미다졸 (2.10 g, 30.99 mmol) 및 TBDMSCl (4.70 g, 30.99 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 48 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 (120 mL)로 희석하고, DCM (2 x 200 mL)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합해 물 (2 x 200 mL)로 세척하고, 건조시키고, 여과한 후, 진공중에 증발시켜 부피를 거의 100 mL로 감소시켰다. 생성된 슬러리를 여과한 후, 고체를 헵탄 (50 mL)으로 세척하여 표제 화합물 (6) (6.05 g, 85%)을 회백색 고체로 수득하였다: m/z 343 (M+H)⁺ (ES⁺).

중간체 A: 2-((4-아미노-3-(3-하이드록시페닐)-1 H -피라졸로[3,4- d ]피리미딘-1-일)메틸)-5-브로모-3-(2-클로로벤질)퀴나졸린-4(3 H )-온.

DMF (2.5 mL) 중 5-브로모-3-(2-클로로벤질)-2-(클로로메틸)퀴나졸린-4(3H)-온 (2) (100 mg, 0.25 mmol) 및 탄산칼륨 (42 mg, 0.30 mmol)의 교반 혼합물에 DMF (2.5 mL) 중 3-(3-tert-부틸디메틸실릴옥시)페닐-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민 (6) (94 mg, 0.28 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 RT에서 18 시간동안 교반하였다. 탄산칼륨 (3 x 35 mg, 0.75 mmol)을 30 시간동안 세번에 나누어 첨가하였다. 용매를 진공중에 제거한 후, 조 물질을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에서 DCM 중 4.5% 메탄올로 용출하면서 정제하여 표제 화합물인 중간체 A, (94 mg, 64%)를 회백색 고체로 수득하였다: R^t 2.01 min; m/z 588/590 (M+H)⁺, (ES⁺).

중간체 B: N,N -비스(2-메톡시에틸)헥스-5-인아미드.

0 ℃에서 DCM (600 mL) 중 헥스-5-이논산 (7.11 g, 63.4 mmol), EDC.HCl (14.0 g, 72.9 mmol) 및 DMAP (387 mg, 3.17 mmol)의 용액에 비스(2-메톡시에틸)아민 (9.3 mL, 63 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20 시간동안 RT로 가온한 후, 염산 (1 M, 2 x 500 mL) 및 물 (500 mL)로 세척하였다. 유기층을 건조시키고,진공중에 증발시켜 표제 화합물인 중간체 B를 황색 오일 (16 g, 97%)로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 1.88 (3H, m), 2.26 (2H, m), 2.49 (2H, m), 3.32 (6H, s), 3.51 (4H, m), 3.55 (4H, m)

6-(2-((4-아미노-3-(3-하이드록시페닐)-1 H -피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-(2-클로로벤질)-4-옥소-3,4-디하이드로퀴나졸린-5-일)- N , N -비스(2-메톡시에틸)헥스-5-인아미드: 화학식 (I)의 화합물.

디에틸아민 (400 mL, 3.8 mol) 중 중간체 B (9.11 g, 34.9 mmol), 비스-트리페닐포스핀 팔라듐(II) 디클로라이드 (0.98 g, 1.4 mmol), 중간체 A (8.3 g, 14 mmol) 및 요오드화구리(I) (0.27 g, 1.4 mmol)의 혼합물을 질소로 탈기하고, 60 ℃에서 4 시간동안 교반한 후, 72 시간동안 RT로 냉각하였다. 혼합물을 진공중에 증발시키고, 잔사를 수성 암모늄 아세테이트 (500 mL) 및 EtOAc (500 mL)로 분배하였다. 유기층을 분리하여 염수 (2 x 500 mL)로 세척하고, 건조시킨 다음, 진공중에 증발시켰다. 잔사를 플래쉬 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 (SiO₂, 120 g, MeOH/DCM, 0-5%, 구배 용출) 화학식 (I)의 표제 화합물을 회백색 고체 (6.9 g, 66%)로 수득하였다: R^t 1.92 min; m/z 735/737 (M+H)⁺ (ES⁺) (방법 D); ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ: 1.70 (2H, quin), 2.46 (2H, t), 2.55 (2H, t), 3.12 (3H, s), 3.19 (3H, s), 3.26 (2H, 중첩 m), 3.31 (4H, m, HOD 피크에 의해 일부 모호), 3.35 (2H, q), 5.30 (2H, s), 5.76 (2H, s), 6.18 (1H, dd), 6.80 (1H, dt), 6.85 (1H ddd), 6.92-6.94 (2H, 중첩 m), 7.05 (1H, td), 7.13 (1H, dd), 7.31 (1H, t), 7.61 (1H, dd), 7.68 (1H, dd), 7.81 (1H, dd), 8.18 (1H, br s), 9.65 (1H, br s).

아트로프 이성체로 비롯되는 약물 개발에 따르는 추가 복잡성 및 결과는 입체 중심의 존재와 같은 기타 분자 이성원으로부터 발생하는 것과 유사하다. 이러한 특성은 분자를 키랄이면서, 분할되지 않는다면 라세미체 혼합물로 만든다; 이들 성분은 상이한 약리학적 및 독물학적 프로파일을 가질 수 있다. 이러한 특성은 이들 분자에 대한 후속적인 개발 비용을 상당히 증가시킬 것이기 때문에, 본 원에 개시된 화학식 (I)의 화합물에 아트로프 이성체가 존재하지 않는 것은 매우 바람직하고 유리한 특성이다.

생물학적 시험: 실험 방법

효소 저해 분석

PI3 키나아제는 ATP 및 Mg²⁺ 이온의 존재하에서 포스파티딜이노시톨 4,5-비포스페이트(PIP2)의 포스파티딜이노시톨의 3,4,5-트리포스페이트(PIP3)로의 인산화를 촉매화한다. PIP3 생성물은, 시분해 형광 공명 에너지 전달(TR-FRET)(HTRF®PI3K 효소 분석, Millipore)에 의하여, 유로퓸 표지된 항-GST 모노글로날 항체, GST-태깅된 플렉스트린 상동(Pleckstrin homology; PH) 도메인, 비오티닐화된 PIP3 및 스트렙타비딘-알로파이코시아닌(allophycocyanin; APC)으로 구성된 에너지 전이 복합체(energy transfer complex)로부터 비오틴-PIP3의 대체로 검출될 수 있다. 유로퓸 자체는 이의 특징적인 620 nm에서 방출이 있지만, 복합체중 유로퓸의 여기(330 nm)로 인해 APC로의 에너지 전이 및 665 nm에서의 형광 방출이 일어난다. PI3K 활성에 의해 생성된 PIP3 산물은 복합체로부터 비오틴-PIP3를 대체하고 이에 따라 에너지 전이의 손실(신호의 감소)을 가져온다.

시험될 화합물을 목적는 최종 농도로 PIP2 기질 및 재조합 PI3 키나아제 α, δ 또는 γ 효소(Millipore)의 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2 시간동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, ATP(20 μM)를 효소/화합물/PIP2 기질 혼합물에 첨가하고 생성된 혼합물을 실온에서 30 분간 인큐베이션하였다. 형광 미이크로플레이트 리더(Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific)에서 검출하기 전에, 비오티닐화 PIP3를 함유하는 중단 용액(stopping solution) 및 GST 태깅된 GRP1 플렉스트린 상동(PH) 도메인 및 형광단(fluorophore)을 함유하는 검출 믹스를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15 내지 18 시간동안 인큐베이션하였다.

결과를 다음 식에 따라 계산하였다: APC 신호(665 nm에서 방출)/유로퓸 신호(620 nm에서 방출)×10⁴. DMSO 처리 대조군에 대한 각 반응의 저해 퍼센트를 계산한 후, 농도-반응 곡선으로부터 50% 저해 농도(IC₅₀ 값)를 계산하였다.

PI3Kδ 세포 기반 분석

자극에 대한 PI3Kδ 활성화를 평가하기 위한 수단으로 인산화 상태의 단백질 Akt, PI3Kδ의 다운스트림 산물, 신호전달을 결정하였다.

인간 단핵구 세포(U937 세포)를 PMA(100 ng/mL)와 함께 48 내지 72 시간동안 배양하여 대식세포-타입의 세포로 분화시켰다. 이후, 세포를 시험 화합물 또는 비히클과 2 시간동안 예비배양한 후, H₂O₂(10 mM; 5-7 분)에 노출시켜 잠깐동안 자극하고 배지를 4% 포름알데히드 용액으로 대체하여 반응을 중단시켰다. 내인성 퍼옥사이드 활성 및 포름알데히드를 20 분간 켄칭 버퍼(quenching buffer)(0.1% 소듐 아자이드, 0.1% Triton X-100를 함유한 PBS 중의 1% H₂O₂)와 함께 인큐베이션하여 불활성화시켰다. 세포를 버퍼(0.1% Triton X-100 함유 PBS)로 세척하고, 1 시간동안 블로킹 용액(PBS 중의 1% BSA)과 함께 인큐베이션한 후, 버퍼로 재세척하고 항-pAkt 항체 또는 항-pan-Akt 항체(양자 모두 Cell Signaling Technology사 제품)와 함께 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 버퍼(0.1% Triton X-100를 함유하는 PBS)로 세척한 후, 세포를 HRP-컨쥬게이션된 2차 항체(Dako)와 함께 인큐베이션하고 생성된 신호를 TMB 기질을 사용하는 비색분석방법(colorimetry)에 의해 판정하였다(OD: 450 nm, 기준 파장 - 655 nm).

상기 반응을 100 μL의 1N H₂SO₄ 용액을 첨가하여 중단시켰다. 이후, 세포를 버퍼(0.1% Triton X-100를 함유하는 PBS)로 세척하고, 100 μL의 5% 크리스탈 바이올렛 용액을 30 분간 적용하였다. 595 nm에서의 흡광을 측정(Varioskan® Flash, Thermo-Fisher Scientific)하기 전에, 버퍼(0.1% Triton X-100를 함유하는 PBS)로 세척한 후, 100 μL의 1% SDS를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 1 시간동안 가볍게 흔들어주었다. OD_450-655를 OD₅₉₅ 측정값으로 나누어, 측정된 OD_450-655 값을 세포 수에 대하여 보정하였다. pAkt 신호 대 전체 Akt 신호의 비를 PI3K δ의 활성화 정도를 정량화하기 위하여 사용하였다. 각 웰에 대한 저해 백분율을, 0% 저해로서 H₂O₂-만의 대조군에 대해 100% 저해로 설정된 10 ㎍/mL 표준 대조군(LY294002)과 비교하여 계산하였다. IC₅₀ 수치는, 시험 화합물의 연속 희석액에 의해 생성된 농도-반응 곡선으로부터 계산하였다.

PI3Kγ 세포 기반 분석

자극에 대한 반응으로 PI3Kγ의 활성화를 평가하기 위한 수단으로, 인산화 상태의 단백질 Akt, PI3Kγ의 다운스트림 산물, 신호전달을 MCP-1로 자극 후 결정하였다.

인간 단핵구 세포(THP1 세포)를 1% FCS RPMI-1640 배지에서 1 시간동안 예비배양하였다. 이후, 세포를 시험 화합물 또는 비히클로 1 시간동안 처리한 후, MCP-1(50 nM, 5-7 분; R&D Systems, MN, USA)에 노출시켜 잠깐동안 자극하였다. 배지를 4% 포름알데히드 용액으로 대체하여 반응을 중단시킨 후, IntraPrep^TM(Beckman Coulter, France)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 투과하였다. 세포를 버퍼(0.1% BSA 함유 PBS)로 세척하고, 항-포스포-Akt(#9271; Cell Signaling, Danvers, MA, USA)와 함께 RT에서 15 분동안 인큐베이션하였다. 세척 버퍼로 세척한 후, 세포를 Pacific 블루-접합 염소 항-토끼 항체(Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA)와 인큐베이션하고, ATTUNE 유세포 분석기(Life Technologies Corp.)를 사용하여 형광 수준을 측정하였다. 히스토그램(histogram)으로부터, 각 샘플에서 양성 세포의 최소 백분율을 기준 대조군과 비교하여 계산하고, PI3Kγ 활성화 정도를 정량하는데 사용하였다. 각 웰에 대한 저해 백분율을, 0% 저해로서 MCP1-만의 대조군에 대해 100% 저해로 설정된 10 ㎍/mL 표준 대조군(LY294002)과 비교하여 계산하였다. IC₅₀ 수치는, 시험 화합물의 연속 희석액에 의해 생성된 농도-반응 곡선으로부터 계산하였다.

리노바이러스-유도된 IL-8 방출

인간 리노바이러스 RV16을 ATCC(American Type Culture Collection)(Manassas, VA)로부터 입수하였다. Hela 세포를 HRV로 세포의 80%가 세포변성될 때까지 감염시켜 바이러스 원액을 생성하였다. BEAS2B 세포를 HRV로 5의 MOI로 감염시키고, 부착 촉진을 위해 살살 흔들면서 33 ℃에서 2 시간동안 인큐베이션하였다. 이어, 세포를 PBS로 세척하고, 새로운 배지를 첨가한 후, 세포를 72 시간 더 인큐베이션하였다. IL-8 농도 분석을 위해 상등액을 Duoset ELISA 개발 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN)로 수집하였다.

일차 기관지 상피세포에서 시험관내 RSV 바이러스 부하

96 웰 플레이트에서 증식시킨 NHBEC(정상 인간 기관지 상피)를 LHC8 배지:RPMI-1640 (50:50)(15 mM 염화마그네슘 함유)에서 RSV A2(Strain A2, HPA, Salisbury, UK; 0.001의 MOI)로 감염시키고, 흡착되도록 37 ℃에서 1 시간동안 인큐베이션하였다. 이어, 세포를 PBS로 세척하고, 새로운 배지를 첨가한 후, 세포를 4 일간 인큐베이션하였다. 필요에 따라, 세포를 시험 화합물 또는 DMSO와 2 시간동안 예비인큐베이션한 다음, 바이러스 세척 후 재첨가하였다.

세포를 20 분동안 PBS 용액에서 4% 포름알데히드로 고정시키고, 세척 버퍼(0.5% BSA 및 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS)로 세척한 후, 블록킹 용액(PBS중 5% 연유)과 1 시간동안 인큐베이션하였다. 이어, 세포를 세척 버퍼로 세척한 후, RT에서 항-RSV(2F7) F-융합 단백질 항체(마우스 모노클로날; lot 798760, Cat. No. ab43812, Abcam)와 함께 1 시간동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포를 HRP-접합 이차 항체(lot 00053170, Cat. No. P0447, Dako)와 인큐베이션한 후, TMB 기질(기질 시약 팩 로트 269472, Cat. No. DY999, R&D Systems, Inc.)을 첨가하였다. 2N H₂SO₄(50 ㎕)를 첨가하여 반응을 중단시키고, 생성된 신호를 마이크로플레이트 리더(Varioskan^® Falsh, ThermoFisher Scientific)에서 비색분석방법으로 측정하였다(OD: 655 nm의 기준 파장을 갖는 450 nm). 이어, 세포를 세척하고, 2.5% 크리스탈 바이올렛 용액(lot 8656, Cat. No. PL7000, Pro-Lab Diagnostics)을 30 분간 적용하였다. 세척 버퍼로 세척한 후, 100 ㎕의 1% SDS를 각 웰에 첨가하고, 595 nm에서 흡광도를 읽기 전에 플레이트를 1 시간동안 가볍게 흔들어주었다. OD_450-655를 OD₅₉₅ 측정값으로 나누어, 측정된 OD_450-655 값을 세포 수에 대하여 보정하였다. 각 웰에 대한 저해 백분율을 계산하고, IC₅₀ 수치를 시험 화합물의 연속 희석액에 의해 생성된 농도-반응 곡선으로부터 계산하였다.

MTT 분석

PMA-분화된 U937 세포를 시험 화합물과 함께 5% FCS에서 4 시간 또는 10% FCS에서 24 시간동안 예비인큐베이션하였다. 상등액을 200 μL의 새 배지로 교체하고 10 μL의 MTT 모액(stock solution)(5 mg/ml)을 각 웰에 첨가하였다. 1 시간동안 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고, 각 웰에 200 μL의 DMSO를 첨가한 후, 550 nm에서의 흡광을 측정하기 전에 플레이트를 1 시간동안 가볍게 흔들어주었다. 세포 생존의 손실 백분율을 비히클(0.5% DMSO)-처리군과 비교하여 각 웰에 대해 계산하였다

생체내 스크리닝: 약력학 및 항염증 활성

마우스에서 난백알부민-유도된 비강내 호산구 및 중성구 축적

BALB/c 마우스(6-8 주령)를 1 및 5 일에 OVA(40 ㎍/kg i.p.)로 면역화하였다. 코에서 국소적 염증성 반응을 끌어내기 위해, 12-19 일에 마우스에 OVA(염수중 3% OVA)를 (콧구멍당 10 ㎕)로 비강내적으로 반복 투여하였다. 19 일에 굶기지 않은 마우스에 비히클 또는 시험 화합물을 최종 OVA 시도 개시에 대해 T = -2 시간에서 비강내로 투여하였다(콧구멍당 10 ㎕). T = 0에서, 각 동물에 OVA(3%)를 최종적으로 비강내 투여하였다. 8 시간후, 각 동물을 마취시키고, PBS 1 mL를 후비공 약 1 mm 앞 위치까지 연장되어 있는 부리 모양으로 삽입된 기관 캐뉼라를 통해 후비공으로 주입하여 비강내 세척을 수행하였다. 이 과정을 약 2 mL의 세포 유액으로 될 때까지 반복하였다. 비강내 세포 유액 샘플내 총 세포수를 해모사이토미터(haemocytometer)를 사용해 측정하였다. RT에서 2 분간 1200 rpm으로 원심분리하고, 세포 감별 계수를 위해 DiffQuik 염색 시스템(Dade Behring)을 사용해 염색하여 비강내 세포 유액 샘플의 사이토스핀 도말을 준비하였다. 유침 현미경검사법으로 세포수를 세었다. 데이터를 비강내 세포 유액 mL당 세포 감별수, 평균±S.E.M으로 나타내었다.

마우스에서 폴리-I:C-유도된 세포 축적

특정 무병원체 A/J 마우스(수컷, 5 주령)에 폴리(I:C)-LMW(폴리-IC; 1 mg/mL, 40 ㎕, in; InvivoGen, San Diego, CA, USA)를 3% 이소플루란 마취하에 1일 2회 3 일간 비강내 투여하였다. 각 폴리-I:C 처리 2 시간전에 시험 물질을 비강내로 주입하였다(50% DMSO/PBS중 용액 35 ㎕). 최종 폴리-I:C 투여 24 시간후에 동물을 마취시키고, 기관에 캐뉼러를 삽입하고, BALF를 수집하였다. 항-마우스 MOMA2 항체(대식세포) 또는 항-마우스 7/4 항체(중성구)를 사용하여 FACS 분석(EPICS^®ALTRA II, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA)으로 BALF내 폐포대식세포 및 중성구의 농도를 측정하였다.

담배연기 모델

작은 동물용 담배연기 흡입 실험 시스템(모델 SIS-CS; Sibata Scientific Technology, Tokyo, Japan)을 이용하여 A/J 마우스(수컷, 생후 5주)를 담배 연기(4% 담배 연기, 압축 공기로 희석)에 11 일간 30 분/일로 노출시켰다. 담배 연기에 마지막으로 노출한 후, 시험 물질(50% DMSO/PBS 중 35 μL의 용액)을 3 일간 1일 2회 비강내로 치료상 주입하였다. 최종 투여 12 시간후, 동물을 마취시키고, 기관에 캐뉼라를 삽입하여 기관지 폐포성 세척 유액(BALF)을 수집하였다. 항-마우스 MOMA2 항체(대식세포) 또는 항-마우스 7/4 항체(호중구)를 사용하여 FACS 분석(EPICS^® ALTRAⅡ, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA)으로 폐포대식세포 및 호중구의 수를 측정하였다.

시험관내 및 생체내 스크리닝 결과 요약

상술된 방법을 이용하여 결정된, 본 원에 개시된 화학식 (I)의 화합물의 시험관내 프로파일을 하기 (표 2 및 3)에 나타내었다. 본 발명의 화합물은 PI3 키나아제 δ 및 γ 아이소형 모두를 강력하게 저해하는 것으로 입증되었으며, 효소 분석에서 PI3 키나아제 α에 대해서만 보통 정도의 저해 활성을 나타내었다. 이러한 효과는 과산화수소 또는 MCP-1에 의한 세포 자극으로 유도되는 Akt 인산화의 강력한 저해일뿐 아니라 상피 세포에서 HRV-유도된 IL-8 방출 및 RSV-유도된 F-단백질 발현에 대한 저해 활성으로 해석된다. 화학식 (I)의 화합물과의 인큐베이션에 따른 세포 생존성에 대한 효과는 검출되지 않았다.

표 2: PI3K 아이소형; 세포상에 과산화수소 또는 MCP-1로 유도되는 Akt의 인산화 및 세포 생존성에 대한 화학식 (I)의 화합물의 효과

표 3: HRV-유도된 IL-8 방출 및 RSV-유도된 F-단백질 발현에 대한 화학식 (I)의 화합물의 효과

본 원에 개시된 화합물로 마우스를 비강내 처리하는 것은 알레르겐 투여후 비강내 세척액에서 호산구 및 중성구 축적 둘 다에 대해 용량-의존성 저해를 나타내는 것으로 밝혀졌다(표 4).

표 4: 마우스에서 OVA-유도된 기도 호산구증가 및 중성구증가에 대한 화학식 (I)의 화합물 처리 효과

마우스를 폴리-I:C에 노출시킨 후 BALF에서 대식세포 및 중성구 축적에 대한 본 발명의 화합물 처리 효과를 또한 조사하였다. 화학식 (I)의 화합물로 처리하는 것은 BALF에 폴리-I:C-유도된 대식세포 및 중성구 축적을 용량-의존성으로 저해하는 것으로 나타났다(표 5).

표 5: 마우스 기도에서 폴리-I:C-유도된 세포 축적에 대한 화학식 (I)의 화합물 처리 효과

담배연기에 노출시킨 후 BALF에서 대식세포 및 중성구 축적에 대한 화학식 (I)의 화합물 처리 효과를 또한 조사하였다(표 6).

표 6: 뮤린 BALF에서 담배연기-유도된 세포 축적에 대한 화학식 (I)의 화합물 ± 플루티카손 프로피오네이트 처리 효과

본 조사를 위해 사용된 담배연기 모델은 코르티코스테로이드 무반응성 시스템인 것으로 보고되었으며[To, Y. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2010, 182:897-904; Medicherla, S. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther . 2008, 324:921-9], 데이터는 기대한 대로, 덱사메타손(0.3-10 mg/kg, p.o.)이 불활성인 것으로 나타났다. BALF 중성구 및 활성화된 폐포대식세포 수에 대한 화학식 (I)의 화합물 처리 효과는 이것이 단일치료제로 투여된 경우 항-염증성 활성을 보유함을 입증한다. 또한, 본 발명의 화합물이 플루티카손 프로피오네이트와 단일치료제로서 어떤 유의적인 효과도 보이지 않는 용량으로 병용 투여된 경우, 항-염증성 활성이 현저히 향상된 것으로 검출되었다.

요약하면, 본 발명의 화합물은 PI3 키나아제 δ 및 γ 아이소형 둘 다의 강력한 저해제이다. 시험관내 프로파일은 생체내 광범위 항-염증성 표현형으로 해석된다. 이러한 배경하에, 기도에서 폴리 I:C-유도된 세포 축적에 대한 본 발명의 화합물의 저해 효과는 현저하다. 또한 특히 놀랍게도, PI3 키나아제 δ의 선택적 저해제와 달리, 본 발명의 화합물로의 처리는 단독으로 담배연기로 유도되는 기도 염증을 현저히 억제하며, 코르티코스테로이드 단독 처리로는 효과가 없는 상황에서, 코르티코스테로이드인 플루티카손 프로피오네이트와 함께 병용 투여하는 경우 상기 효과를 저 용량에서 나타내었다.

문맥상 달리 해석되지 않는 한, 본 발명의 명세서 및 청구범위를 통해 용어 "포함하다"와 "포함하는"과 같은 그의 변형어는 언급된 정수, 단계, 정수군 또는 단계군을 포함하는 의미이나, 기타 다른 정수, 단계, 정수군 또는 단계군을 배제하지는 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 원에서 언급된 모든 특허 및 특허 출원은 전체가 참고로 본 원에 포함되어 있다.

Claims

하기 화학식 (I)의 화합물인 6-(2-((4-아미노-3-(3-하이드록시페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-(2-클로로벤질)-4-옥소-3,4-디하이드로퀴나졸린-5-일)-N,N-비스(2-메톡시에틸)헥스-5-인아미드, 또는 그의 모든 입체이성체, 토토머 또는 동위원소 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염:
제1항에 따른 화학식 (I)의 화합물과 함께 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는, COPD(만성 폐쇄성 폐질환), 만성 기관지염, 폐기종, 천식, 소아 천식, 낭성 섬유증, 사르코이드증, 특발성 폐섬유증, 알레르기성 비염, 비염, 동염(sinusitis), 알레르기성 결막염, 결막염, 알레르기성 피부염, 접촉성 피부염, 건선, 궤양성 대장염, 류마티스 관절염 또는 골관절염으로 인한 염증 관절, 류마티스 관절염, 췌장염 또는 카켁시아로부터 선택되는 상태의 치료 또는 예방용; 또는 비소세포 폐암종, 유방암종, 위암종, 결장직장암종 또는 악성 흑색종을 포함한 종양의 성장 또는 전이의 저해용, 약제학적 조성물.
의약으로서 사용하기 위한 제1항에 따른 화학식 (I)의 화합물.
COPD(만성 폐쇄성 폐질환), 만성 기관지염, 폐기종, 천식, 소아 천식, 낭성 섬유증, 사르코이드증, 특발성 폐섬유증, 알레르기성 비염, 비염, 동염(sinusitis), 알레르기성 결막염, 결막염, 알레르기성 피부염, 접촉성 피부염, 건선, 궤양성 대장염, 류마티스 관절염 또는 골관절염으로 인한 염증 관절, 류마티스 관절염, 췌장염 또는 카켁시아로부터 선택되는 상태의 치료 또는 예방; 또는 비소세포 폐암종, 유방암종, 위암종, 결장직장암종 또는 악성 흑색종을 포함한 종양의 성장 또는 전이의 저해에 사용하기 위한 제1항에 따른 화학식 (I)의 화합물.
제1항에 따른 화학식 (I)의 화합물을 포함하는, COPD(만성 폐쇄성 폐질환), 만성 기관지염, 폐기종, 천식, 소아 천식, 낭성 섬유증, 사르코이드증, 특발성 폐섬유증, 알레르기성 비염, 비염, 동염(sinusitis), 알레르기성 결막염, 결막염, 알레르기성 피부염, 접촉성 피부염, 건선, 궤양성 대장염, 류마티스 관절염 또는 골관절염으로 인한 염증 관절, 류마티스 관절염, 췌장염 또는 카켁시아로부터 선택되는 상태의 치료 또는 예방용; 또는 비소세포 폐암종, 유방암종, 위암종, 결장직장암종 또는 악성 흑색종을 포함한 종양의 성장 또는 전이의 저해용, 약제.
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