KR101819727B1 - 포제를 이용한 인삼 열매 추출물을 함유하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한방 가공 기술인 포제를 활용하여 가공된 인삼 열매 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인삼의 지상부 중에서 독특한 성분과 조성을 갖는 인삼 열매를 포제를 이용하여 가공된 인삼 열매 추출물을 함유함으로써 미백, 항노화, 보습 등의 효능을 제공할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

Description

포제를 이용한 인삼 열매 추출물을 함유하는 조성물{Composition containing ginseng berry extract using processing of herbal medicine}

본 발명은 한방 가공 기술인 포제를 활용하여 가공된 인삼 열매 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인삼의 지상부 중에서 독특한 성분과 조성을 갖는 인삼 열매를 포제를 이용하여 가공된 인삼 열매 추출물을 함유함으로써 미백, 항노화, 보습 등의 효능을 제공할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

포제(匍制)는 한방이론에 근거하여 약재를 가공처리 함으로써 약재 본래의 성질을 변화시키는 제약기술(製藥技術)이다. 어떤 약재는 독성이 있거나 성질이 매우 강하여 직접 복용할 수 없고 어떤 약재는 쉽게 약성이 변해 오래 저장 할 수 없으며 또 어떤 것은 잡질과 어느 부분을 제거하여야 사용할 수 있는 것이 있다. 또한 동일한 약재라고 하여도 생재와 숙재는 성질이 같지 않거나 작용에서 차이가 나는 경우가 있다. 이런 약재를 사용하기에 앞서 반드시 가공을 하여야 하는데 이를 약용식물의 포제(匍制)라 한다.

포제는 경우에 따라서 보료(輔料)를 가하여 함께 가공하는데, 보료를 사용하는 것은 변증에 따라 용약의 목적을 달성하기 위함이다. 약물의 포제에 사용하는 보료의 종류가 다양하기 때문에 각기 다른 성질과 작용이 있으며, 이로 인해 포제한 약재가 일으키는 작용도 각기 다르다. 상용되는 보료의 종류는 무수히 많으나, 일반적으로는 크게 액체 보료와 고체 보료로 분류할 수 있다. 액체 보료로는 술, 식초, 꿀, 생강즙, 감초즙, 흑두즙, 식염수, 미감수, 젖, 동변(7세 미만 아이의 소변), 석회수 등을 사용하며, 고체 보료로는 쌀, 밀기울, 백반, 두부, 흙, 합분, 모래 등을 사용한다.

한약재를 포제하는 목적은 ① 약물을 청결하게 하고, 저장에 용이하게 하며, ② 약물의 독성과 부작용을 저하시키거나 제거하고, ③ 약성을 변화시켜 약을 더욱 효과적으로 만드며, ④ 약물의 치료 효과를 증강시키고, ⑤ 약재의 나쁜 냄새와 맛을 없애 복용하기 좋게 하기 위함이다.

한편, 피부는 신체 표면을 완전히 덮고 있는 가장 큰 기관으로, 외부로부터 신체를 보호하는 최외곽 방어막을 형성하고 있다. 나이가 증가함에 따라 다른 신체 기관과 마찬가지로 노화가 진행되는데, 피부의 경우 미적 판단의 기준이 되는 경우가 많아 최근 피부 노화의 예방 및 억제에 관심이 모아지고 있다.

진피의 구조를 살펴보면, 교원섬유(콜라겐, collagen)가 입체구조를 이루고 그 사이에 신축성이 강한 탄력섬유(elastin)가 스프링처럼 작용하여 피부의 탄력을 유지해 준다. 나이가 들어감에 따라 진피 중의 교원섬유가 파괴되고 탄력섬유도 체내에서 생성되는 말론 디알데히드(MDA)에 의해 분자 사슬 사이의 가교 결합이 형성되어 신축성이 떨어지게 된다. 노화가 진행되면 피부 구조를 유지하는 섬유 외에 세포외 공간을 채우고 있는 물질들의 체내 생성량도 줄어들게 된다. 건강한 피부의 각질층은 15~20%의 수분을 함유하고 있으며 수분이 10% 이하로 떨어지면 피부가 건조해지고 윤기와 탄력이 없어져 주름이 증가하게 된다. 이 모든 결과로 인해 노화된 피부는 탄력을 잃고 주름이 발생하게 된다.

또한, 피부에 대하여 관심이 집중되는 다른 부분은 피부색과 관련된 것으로서, 피부색 결정 요인 중에서 가장 큰 부분을 차지하는 것이 피부 중 멜라닌의 분포상태 및 양이다. 멜라닌(melanin)은 멜라노사이트(melanocyte)에서 생성이 되는데 이 멜라노사이트에는 티로시나제 등의 효소가 존재하며, 이들이 함께 작용하여, 생체내에 항상 존재하는 티로신(tyrosine)이라는 아미노산을 기질로 중합화 산화반응을 함으로 흑갈색의 색소인 멜라닌을 형성 하게 된다. 이렇게 형성된 멜라닌은 멜라노사이트의 수지상 돌기를 통하여 케라티노사이트(keratinocyte)라는 표피 세포로 이동한다. 여기서 멜라닌은 핵주변에 모자와 같은 구조를 형성하여 자외선으로부터 유전자를 보호하고 자유 라디칼(free radical)을 제거하여 세포 내 단백질을 보호하는 등 중요한 역할을 하게 된다. 생체 내에는 멜라닌을 분해하는 효소가 없고 다만 케라티노사이트가 표피에서 떨어져나갈 때 같이 피부에서 떨어져나가는 것으로 제거된다. 하지만 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미나 주근깨, 점 등과 같은 과색소침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다. 멜라닌 생성에 영향을 미치는 인자는 여러 가지가 알려져 있는데, 자외선에 의하여 일어나는 멜라닌 생산의 항진 그리고 이에 따른 색소 침착이 화장품 분야에서 아주 중요하다. 색소 침착 예방목적으로 미백화장품에 배합되는 약제의 기본적인 메커니즘은 티로시나아제(tyrosinase) 작용 억제, 티로시나아제 생성 억제, 멜라닌 생성 미디에이터의 억제, 기존 멜라닌의 환원 및 광산화 억제, 멜라닌 배설의 촉진, 및 자외선 커트 등이다.

자외선 노출 환경속에서도 하얀 피부를 갖고자 하는 여성들의 욕구에 따라서 피부 색소 이상 증상과 과색소 침착 등의 예방과 개선에 대한 수요가 더욱 늘어 나고 있으며 이에 과도한 멜라닌 생성을 막는 미백제품 개발이 필요하게 되었고 그 동안 많은 노력들이 이루어졌다. 그 구체적인 예를 들면, 코지산(kojic acid), 알부틴(arbutin) 등과 같은 티로시나제 활성을 저해하는 억제제들, 하이드로퀴논(hydroquinone), 비타민 A, 비타민 C 및 이들의 유도체 등이 있다. 그러나, 이들은 피부에 대한 안전성, 제형 내에서의 안정성 및 미백효과의 불충분으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.

최근 화장품 분야에서는 천연물의 사용이 두드러지고 있으며, 보습력과 노화 개선 기능, 항산화 효과가 우수하고, 특히 피부 노화 개선 효과 면에서 우수하다고 보고된 천연물 추출물을 이용한 화장료 조성물에 대해서도 많은 연구가 이루어지고 있다. 그러나, 통상의 방법으로 추출한 천연물 추출물을 사용하는 조성물들은 원하는 미백, 주름 개선, 항산화 등의 효과가 미미할 뿐 아니라, 이러한 추출물의 활성을 지속적으로 유지, 제어하기가 어려워 실용성이 높지 않았다.

이에, 본 발명자들은 피부 상태 개선 효과를 제공할 수 있는 물질을 찾고자 연구한 결과, 한방 가공 기술인 포제를 활용하여 가공된 인삼 열매 추출물을 함유하는 조성물이 항노화, 보습, 미백 등의 피부 상태 개선 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 포제를 활용한 인삼 열매 추출물을 제조하고 상기 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 항노화, 보습, 미백 등의 피부 상태 개선 효과가 우수하면서 피부에 안전한 천연물을 함유한 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포제를 활용한 인삼 열매 추출물을 함유하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 포제를 활용한 인삼 열매 추출물을 함유함으로써 엘라스타아제 및 콜라게나아제의 발현을 억제시키는 효능이 우수하여 항노화 및 탄력 향상 효과가 우수하며 피부 노화를 억제하고 피부 수분 보유력을 증가시키며, 또한 피부 미백에 우수한 효능이 있어 피부에 안전하면서도 전반적인 피부 상태를 개선시키는 효과를 제공할 수 있다.

본 발명의 조성물은 포제를 활용한 인삼 열매 추출물을 함유하며, 화장료 조성물 또는 식품 조성물로서 제공될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 항노화, 보습, 미백 등의 효과를 제공한다.

이하 본 발명에 대하여 보다 구체적으로 살펴본다.

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 오가피과 인삼 속에 속하는 식물로서 한국, 중국 및 일본 등지에서 2,000여년 전부터 사용되어 온 생약이며, 경험적으로 질병을 예방하고 수명을 연장시킬 목적으로 사용되어 왔다. 지금까지 알려진 인삼의 효능 및 효과는 중추신경계에 대한 작용, 항발암 작용, 항암활성, 면역기능 조절작용, 항당뇨 작용, 간기능 항진효능, 심혈관 장해개선, 항동맥경화 작용, 혈압조절 작용, 갱년기 장애 개선, 골다공증에 미치는 효과, 항스트레스 및 항피로 작용, 항산화 활성 및 노화억제 효능 등이 있다(최신고려인삼 '성분 및 효능편', 한국인삼연초연구원, 56-112, 1996).

인삼의 대표적 생리활성 성분인 진세노사이드(Ginsenoside)는 인삼의 지상 및 지하부에 고르게 분포되어 있으며, 특히 인삼 근(뿌리), 인삼엽 및 인삼 열매 등 부위에 따라 진세노사이드 함량뿐만 아니라 조성도 다른 것으로 알려져 있다(Attele AS et al, Biochem Pharmacol, 58; 1685-1693, 1999).

한편, 본 발명에서 사용되는 인삼 열매의 추출방법은 하기와 같다.

(1) 포제 가공 단계.

인삼 열매를 삶거나, 찌거나, 불에 볶거나, 불에 굽거나 달구는 방법으로 포제를 행하며, 또는 상기 방법들을 혼합하여 포제를 행할 수도 있다. 삶는 경우에는 100-180℃에서 0.1-1시간, 찌는 경우에는 150-200℃에서 1-48시간, 볶는 경우 100-300℃에서 0.1-1시간, 굽는 경우 180-300℃에서 0.5-5시간 등의 조건에서 가공할 수 있다.

(2) 추출물을 수득 단계.

물 또는 유기용매를 이용하여 상기 (1) 단계를 거친 인삼 열매의 포제 추출물을 수득한다. 유기용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 또는 이들 유기용매와 물과의 혼합용매를 사용할 수 있다. 바람직하게는 80% 에탄올을 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기의 방법으로 추출된 인삼 열매 포제 추출물을 유효성분으로 하여 조성물 총 중량에 대하여 0.001-30.0 중량%의 양으로 함유한다.

본 발명에 의한 조성물은 화장품용 조성물 또는 식품용 조성물로서 제조될 수 있으며, 본 발명에 의한 조성물은 경피 조성물 또는 경구 조성물로서 제조될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면 유연화장수, 영양화장수, 유액, 마사지크림, 영양크림, 팩, 패치, 젤, 스틱, 고 타입 또는 피부 점착 타입, 분무제 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있다. 예를 들면 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 보디로션, 보디크림, 보디오일, 보디에센스 등의 화장료 제형을 가질 수 있으며 또한 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투과형 제형을 갖는 화장료 조성물 일 수 있다

또한 본 발명의 경구 투여용 제형으로는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 제형으로는, 피부 외용제, 주사제 등을 포함하고, 피부 외용제로는 연고제가 바람직하며, 주사제 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액일 수 있다.

또한 본 발명을 식품 조성물로 제형화할 경우 육류, 소시지, 빵, 초코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함하고 이에 한정되지는 않는다.

또한, 각각의 제형에 있어서 상기한 필수성분 이외에 다른 성분들은 기타 제형의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적합하게 선정하여 배합할 수 있다.

본 발명에 의한 조성물은 항노화 효능이 우수하여 주름 개선 및 예방의 효과를 제공하며, 피부 보습력을 증진시킨다. 또한 피부 미백 효과도 제공하여 본 발명에 의한 조성물은 피부 상태를 전반적으로 개선시킬 수 있다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

[비교예 1] 인삼 열매 생품의 제조

건조한 인삼 열매 1kg에 80% 에탄올 수용액 5ℓ을 넣고, 3회 환류 추출한 다음, 15℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압 농축하여 인삼 열매 추출물을 얻었다.

[실시예 1] 인삼 열매 주초(酒炒)의 제조

깨끗한 인삼 열매 1kg을 일정량의 황주(10~30%)를 골고루 뿌려 술이 모두 흡수될 정도로 축축해지도록 담가 두고 이것을 초제 용기에 넣어 100~180℃에서 15분~30분 동안 볶았다. 초건(炒乾)한 인삼 열매를 꺼내서 식힌 후 80% 에탄올 수용액 5ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 다음, 15℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압 농축하여 인삼 열매 주초 추출물을 얻었다.

[실시예 2] 인삼 열매 초자(醋炙)의 제조

건조한 인삼 열매 1kg에 식초 150~300g을 약재에 충분히 흡수 시킨 후 100~160℃에서 10분~1시간 동안 볶은 후 그늘에 말렸다. 이것에 80% 에탄올 수용액 5ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 다음, 15℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압 농축하여 인삼 열매 초자 추출물을 얻었다.

[실시예 3] 인삼 열매 초탄(炒炭)의 제조

건조한 인삼 열매 1kg을 230~300℃에서 인삼 열매의 외부를 탄화시켜 흑색이 되면 가열을 중지하고 상온에서 식혀 이것에 80% 에탄올 수용액 5ℓ를 넣은 후, 3회 환류 추출한 다음, 15℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압 농축하여 인삼 열매 초탄 추출물을 얻었다.

[실시예 4] 인삼 열매 밀자(蜜炙)의 제조

건조한 인삼 열매 1kg에 꿀 200~300g을 약재에 충분히 흡수시킨 다음 100~160℃에서 10분~1시간 동안 볶은 후 그늘에 말렸다. 이것에 80% 에탄올 수용액 5ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 다음, 15℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압 농축하여 인삼 열매 밀자 추출물을 얻었다.

[실시예 5] 인삼 열매 염자(鹽炙)의 제조

건조한 인삼 열매 1kg을 소금물(2~3%)에 잘 혼합 시킨 후 밀폐시켜 완전히 흡수 되도록 방치하고, 소금물이 완전히 흡수된 인삼 열매를 100~180℃에서 초제 용기에 넣은 다음 10분~1시간 동안 볶은 후 그늘에 말렸다. 이것에 80% 에탄올 수용액 5ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 다음, 15℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압 농축하여 인삼 열매 염자 추출물을 얻었다.

[실시예 6] 인삼 열매 강자(薑炙)의 제조

신선한 생강을 마쇄한 후 두배의 물을 넣어 혼합하여 압착한뒤 즙을 짜내었다. 이를 2~3회 반복하여 수행하여 생강즙을 준비하고, 인삼 열매 1kg에 생강즙 100~150g을 뿌려 골고루 축인 후 생강즙이 스며들면 100~180℃에서 용기에 넣고 10분~1시간 동안 볶은 후 그늘에 말렸다. 이것에 80% 에탄올 수용액 5ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 다음, 15℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압 농축하여 인삼 열매 강자 추출물을 얻었다.

[시험예 1] 엘라스타아제 발현 억제 효능 측정

상기 비교예 1과 실시예 1~6으로부터 얻은 인삼 열매 및 인삼 열매 포제 추출물의 엘라스타아제 생성 저해능을 토코페롤 및 EGCG와 비교하여 측정하였다.

2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 들어있는 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/공(well)이 되도록 넣고, 90% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 후 무혈청 배지로 24시간 배양하고, 무혈청 배지에 녹여진 상기 비교예 1과 실시예 1~6의 인삼 열매 및 인삼 열매 포제 추출물, 토코페롤 및 EGCG를 10^-4 몰농도로 24시간 동안 처리한 다음, 세포배양액을 채취하였다.

상업적으로 이용가능한 엘라스타아제 측정기구(미국 아머샴파마샤 사)를 이용하여 채취한 세포배양액의 엘라스타아제 생성 정도를 측정하였다. 먼저 1차 엘라스타아제 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)에 채취된 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 엘라스틴 항체를 96-공 평판(96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 발색반응을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띠게 되며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타났다.

노란색을 띠는 96-공 평판(96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하고, 하기 수학식 1에 의해 엘라스타아제의 발현정도를 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 이때 조성물을 처리하지 않은 군에서 채취된 세포배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다.

화합물	발현정도(%)
비처리군	100
토코페롤	89
EGCG	67
비교예 1	90
실시예 1	71
실시예 2	72
실시예 3	77
실시예 4	82
실시예 5	86
실시예 6	79

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 시험관내(in vitro)에서 실시예 1~6의 엘라스타아제 발현 정도가 인삼 열매 추출물 비교예 1과 비교하여 낮은 것을 통해 본 발명에 의한 인삼 열매 포제 추출물의 엘라스타아제 발현 저해 효과가 더 좋음을 확인할 수 있다. 또한, 엘라스타아제 발현 저해제로 알려져 있는 토코페롤 및 EGCG와 비교하여서도 본 발명에 의한 인삼 열매 포제 추출물의 엘라스타아제 발현 저해 효과가 토코페롤보다는 우수하고, EGCG와는 비슷한 수준임을 알 수 있다.

[시험예 2] 콜라게나아제(MMP-1) 저해능

상기 비교예 1과 실시예 1~6으로부터 얻은 인삼 열매 및 인삼 열매 포제 추출물의 콜라게나아제 생성 저해능을 레티노익산과 비교하여 측정하였다.

2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 들어있는 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/공(well)이 되도록 넣고, 70~80% 정도 자랄 때까지 CO₂ 5%, 37℃ 배양기(incubator)에서 배양하였다. 그 후 비교예 1과 실시예 1~6의 인삼 열매 및 인삼 열매 포제 추출물을 10^-4 몰농도로 24시간 동안 처리한 다음, 세포배양액을 채취하였다.

상업적으로 이용가능한 콜라게나아제 측정기구(미국 아머샴파마샤 사, Catalog #: RPN 2610)를 이용하여 채취한 세포배양액의 콜라게나아제 생성 정도를 측정하였다. 먼저 1차 콜라게나아제 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)에 채취한 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96-공 평판(96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, sigma)을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 발색반응을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띠게 되며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타났다.

노란색을 띠는 96-공 평판(96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하고, 하기 수학식 2에 의해 콜라게나아제의 합성 정도를 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 이때 조성물을 처리하지 않은 군에서 채취한 세포 배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다.

화합물	발현정도(%)
비처리군	100
레티노익산	75
비교예 1	93
실시예 1	78
실시예 2	80
실시예 3	77
실시예 4	82
실시예 5	84
실시예 6	79

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 시험관내(in vitro)에서 실시예 1~6의 콜라게나아제 발현 정도가 인삼 열매 추출물 비교예 1과 비교하여 낮은 것을 통해 본 발명에 의한 인삼 열매 포제 추출물의 콜라게나아제 발현 저해 효과가 더 좋음을 확인할 수 있다. 또한, 콜라게나아제 발현 저해제로 알려져 있는 레티노익산과 비교하여서도 본 발명에 의한 인삼 열매 포제 추출물의 콜라게나아제 발현 저해 효과가 레티노익산과 비슷한 수준임을 알 수 있다.

이와 같은 결과를 통하여, 본 발명에 의한 인삼 열매 포제 추출물은 기질 메탈로 프로테아제(MMP-1)를 저해시키는 효과를 가짐을 확인할 수 있다.

[시험예 3] 피부 탄력 향상 효능 확인

피부 탄력 향상 효능 확인을 위하여 상기 비교예 1 및 실시예 1~6에서 얻은 인삼 열매 및 인삼 열매 포제 추출물을 활용하여 하기 표 3의 조성으로 비교제형예 1 및 제형예 1~6의 화장수를 제조하고 인삼 열매 또는 인삼 열매 포제 추출물을 함유하지 않는 화장수를 대조군으로 제조하였다.

성 분(함량 : 중량%)	대조군	비교제형예 1	제형예 1	제형예 2	제형예 3	제형예 4	제형예 5	제형예 6
세테아릴글루코사이드	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
세틸옥타노에이트	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
메칠파라벤	0.14	0.14	0.14	0.14	0.14	0.14	0.14	0.14
에칠렌디아민테트라초산디나트륨	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
비교예1	-	10	-	-	-	-	-	-
실시예1	-	-	10	-	-	-	-	-
실시예2	-	-	-	10	-	-	-	-
실시예3	-	-	-	-	10	-	-	-
실시예4	-	-	-	-	-	10	-	-
실시예5	-	-	-	-	-	-	10	-
실시예6	-	-	-	-	-	-	-	10
정제수	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100

상기 대조군, 비교제형예 1 및 제형예 1~6 화장수의 피부 탄력 향상 효과를 비교하기 위하여, 30~40대 여성 160명을 대상으로 20명을 1개군으로 하여 8개군으로 나누어 측정하였다. 실험 방법은 다음과 같다.

각 조에 대조군, 비교제형예 1 또는 제형예 1~6의 화장수를 각각 나누어 주고 매일 1회 12주간 눈가에 일정량을 도포하게 하였다. 이때, 피검자의 눈가의 왼쪽에는 상기 대조군의 화장수를, 오른쪽에는 비교제형예 1 또는 제형예 1~6의 화장수를 도포하게 하였다. 12주 뒤 피부탄력을 측정할 수 있는 큐토미터(cutometer; SEM474, Courage+Khazaka electronic GmbH. Germany)를 이용하여 각 그룹의 피부 탄력을 측정하고 그 평균을 구하였으며, 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

화합물	피부탄력향상도 (%)
대조군	18
비교제형예 1	39
제형예 1	58
제형예 2	46
제형예 3	48
제형예 4	47
제형예 5	50
제형예 6	55

상기 표 4의 결과를 보면, 본 발명에 의한 인삼 열매 포제 추출물을 함유한 제형예 1~6의 화장수를 사용한 경우에 인삼 열매 추출물을 함유하고 있지 않은 대조군과 비교하여 피부 탄력 향상도가 3배 정도 높게 나타남을 확인할 수 있으며, 인삼 열매의 단순 추출물을 함유한 비교제형예 1의 화장수를 사용한 경우와 비교하여서도 피부 탄력 향상도가 월등히 우수함을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 인삼 열매 포제 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 피부 탄력 향상에 매우 효과적임을 확인할 수 있다.

[시험예 4] 쥐의 색소세포를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정

C57BL/6 마우스 유래의 쥐의 색소세포(Mel-Ab cell)(Dooley, T.P. et al, Skin pharmacol, 7, pp 188-200)를 DMEM에 10% 우태반 혈청, 100nM 12-O-테트라데카노일포르볼(tetradecanoylphorbol)-13-아세테이트, 1nM 콜레라 독소(cholera toxin)를 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 배양된 Mel-Ab 세포를 0.25% 트립신-EDTA로 떼어내고, 24-웰 플레이트에 10⁵ 세포/웰(cells/well)의 농도로 세포를 배양한 다음, 이틀째부터 3일 연속으로 각 시험물질을 가하여 배양하였다. 시험물질로는 하이드로퀴논과 상기 실시예 1~6의 인삼 열매 포제 추출물을 10ppm의 농도로 하여 사용하였다. 이때, 상기 하이드로퀴논은 양성대조군으로 사용하였다. 그 다음 배양액을 제거하고, PBS로 세척한 후, 1N 수산화나트륨으로 세포를 녹여 400nm에서 흡광도를 측정한 다음, 하기 수학식 3에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하여 그 결과를 표 5에 나타내었다(Dooley의 방법).

시험물질	멜라닌 생성 억제율 (%)
비처리군	100
실시예 1	37.4
실시예 2	35.2
실시예 3	36.8
실시예 4	38.3
실시예 5	34.9
실시예 6	37.1
하이드로 퀴논(양성 대조군)	41.1

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 인삼 열매 포제 추출물이 공지된 미백 물질인 하이드로 퀴논과 유사한 정도의 멜라닌 생성 억제율을 보이는 것을 확인할 수 있다.

[시험예 5] PPARs 활성화 확인

인체 각질형성 세포주(human keratinocyte)인 HaCaT을 10% 우태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지에 계대 배양하고 페놀 레드의 에스트로겐에 의한 효과를 제거하기 위해 페놀 레드-프리(phenol red-free) 배지를 사용하였다. 플라스미드는 일반적인 배양 조건에서도 발현되는 유니버설(universal) 프로모터 뒤에 PPARα, PPARβ/δ, PPARγ 유전자를 지닌 플라스미드와 리간드 결합형의 PPARs가 결합하여 활성화되는 PPARs 반응 요소(PPARs Response Element, “PPRE”)를 프로모터로 가지고 뒤에 리포터로써 역할을 하는 반디불(firefly) 루시퍼라제(luciferase) 유전자를 지닌 것, 그리고 참조(reference)로 사용될 유니버설 프로모터에 β-갈락토시다제(β-galactosidase) 유전자가 결합된 플라스미드가 사용되었다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (1994) 7355-7359).

HaCaT 세포를 5x10⁴의 농도로 24 웰(well)형 플레이트에 분주하고 24 시간 배양한 후, 상기 플라스미드 유전자를 일시적 트랜스펙션(transient transfection)하였다. 24 시간 배양 후 인산완충용약(PBS)으로 세척한 후 7,3',4'-트리하이드록시이소플라본과 양성대조군으로 기존에 알려진 PPARs 리간드(PPARα 리간드인 Wy-14,643, PPARγ 리간드인 트로글리타존(troglitazone, “TGZ”))를 명시된 농도로 처리하였다. 음성대조군으로는 시료들을 녹일 때 사용한 에탄올을 처리한 군을 이용하였다. 24 시간 배양 후 PBS로 세척하고 세포를 수확하여 루시퍼라제 활성을 측정하여 표 6 및 표 7에 나타내었다.

표 6은 연구에 사용되는 HaCaT 세포주에 PPRE 프로모터 리포터 플라즈미드와 PPARα 발현 플라즈미드를 트랜스펙션 시킨 후, 약물을 처리하고 루시퍼라제 활성을 측정한 결과이다. 표 7은 PPARγ 발현 플라즈미드와 PPRE 프로모터 리포터 플라즈미드를 동시에 트랜스펙션시킨 후 약물을 처리하고 루시퍼라제 활성을 측정한 결과이다.

	농도	루시퍼라제 활성도
대조군		100
WY-14643	10 μM	300
비교예 1	10 ppm	104
실시예 1	10 ppm	124
실시예 2	10 ppm	115
실시예 3	10 ppm	123
실시예 4	10 ppm	128
실시예 5	10 ppm	138
실시예 6	10 ppm	132

	농도	루시퍼라제 활성도
대조군		100
TGZ	10 μM	300
비교예 1	10 ppm	104
실시예 1	10 ppm	125
실시예 2	10 ppm	116
실시예 3	10 ppm	124
실시예 4	10 ppm	128
실시예 5	10 ppm	139
실시예 6	10 ppm	132

표 6 및 표 7을 보면, 본 발명에 의한 실시예 1~6을 사용한 경우 유의한 정도의 PPARα 및 PPARγ의 활성을 유도하여 높은 루시퍼라제 활성을 나타냄을 확인할 수 있다.

[시험예 6] 각질형성세포 분화 촉진 효과

상기 샘플들의 각질형성세포의 분화 촉진 효과를 알아보기 위해, 하기와 같이 각질형성세포의 분화시 생성되는 CE(Cornified Envelop)양을 흡광도를 이용하여 측정하였다.

먼저, 신생아의 표피로부터 분리해 일차 배양한 사람의 각질형성세포를 배양용 플라스크에 넣어 바닥에 부착시킨 뒤 하기 표 8의 시험물질을 배양액에 1ppm 농도로 처리한 후 세포가 바닥 면적의 70~80 % 정도 자랄 때까지 5일간 배양하였다. 이때, 저칼슘(0.03mM) 처리군과 고칼슘(1.2mM) 처리군을 각각 음성 대조군, 양성 대조군으로 하였다. 그 다음 상기 배양한 세포를 수확하여 PBS(Phophate buffered saline)로 세척한 뒤 2% SDS(sodium dodecyl sulfate)와 20mM 농도의 DTT(Dithiothreitol)를 함유한 10mM 농도의 트리스-염산 완충액(Tris-HCl, pH 7.4) 1ml를 가하여 소니케이션(sonication), 보일링(boiling), 원심분리한 후 침전물을 다시 PBS 1ml에 현탁시켜 340 nm 에서의 흡광도를 측정하였다. 이와 별도로 상기 소니케이션 후의 용액을 일부 취하여 단백질 함량을 측정하고, 세포 분화정도 평가시 기준으로 삼았다. 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

시험물질	각질형성세포에서의 분화능(%)
저칼슘(0.03mM) 용액 (음성 대조군)	100
고칼슘(1.2mM) 용액 (양성 대조군)	210
비교예 1	105
실시예 1	120
실시예 2	134
실시예 3	124
실시예 4	123
실시예 5	121
실시예 6	125

상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 의한 실시예 1~6이 유의한 정도의 각질형성세포의 분화를 촉진하는 것을 알 수 있다.

[시험예 7] 무모생쥐 피부에서의 피부 장벽기능 회복 및 피부 보습력 증가 효과 측정

상기 샘플들이 피부 손상으로 인해 손상된 피부 장벽기능의 회복에 미치는 효과 및 피부 보습력 증가에 미치는 효과를 측정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 출생 후 8∼10 주 경과한 무모생쥐(Charles River, Japan)의 등에 아세톤을 1일 2회씩 5일 동안 주기적으로 도포하여 실험동물 등 피부의 장벽 기능 손실을 유도한 다음 증발계(Evaporimeter)로 TEWL(Transepidermal water loss, 경피수분손실)을 측정하여 40g/m²/hr 이상의 경피수분손실을 나타내는 피부를 가진 실험동물만을 대상으로 하였다. 선택한 실험동물에 대하여 시험물질로 프로필렌 글리콜과 에탄올을 7:3의 비율로 혼합한 비히클(Vehicle)(비히클 처리군)과 실시예 1~6을 각각 1% 함유한 샘플을 피부면적 5cm² 당 200μl의 용량으로 1일 2회씩 3일 동안 연속 도포하면서 일정 시간마다 TEWL을 측정하였으며, 그 결과를 표 9에 나타내었다.

또한, 코니오미터(Corneometer, 독일 Courage Khazaka 사)를 사용하여 피부 수분량을 동시에 측정하였으며, 그 결과를 표 10에 나타내었다. 이때 무처리군의 피부 수분량도 함께 측정하였다.

	시간 (h)
	0	6	12	24	48	72
비히클	44.3	42.5	38.7	23.5	19.7	16.3
비교예 1	44.5	41.1	38.4	21.1	16.4	14.2
실시예 1	44.9	41.4	28.5	15.4	10.4	7.5
실시예 2	44.2	40.4	27.3	16.4	11.4	8.5
실시예 3	44.5	41.4	27.7	15.2	11.1	7.1
실시예 4	44.8	40.9	27.6	15.1	11.5	7.2
실시예 5	44.5	41.2	28.1	14.9	10.9	6.1
실시예 6	44.1	41.0	27.9	15.6	11.2	6.5

	시간 (h)
	0	6	24	48
무처치군	100	91	86	81
비히클	100	93	88	83
비교예 1	100	97	89	87
실시예 1	100	104.5	109.7	113.8
실시예 2	100	103.5	107.9	112.4
실시예 3	100	105.1	106.8	114.5
실시예 4	100	105.6	109.6	121.2
실시예 5	100	104.9	109.8	114.1
실시예 6	100	104.2	108.9	112.9

표 9에 나타낸 바와 같이 상기 실시예 1~6의 처리군이 빠르게 장벽 손상이 회복되었음을 알 수 있다. 또한 표 10에 나타낸 바와 같이 피부 수분량에 있어서도 실시예 1~6의 처리군이 높게 나타남을 확인할 수 있다.

따라서, 이를 통해 상기 인삼 열매 포제 추출물을 처리한 경우 장벽 손상 회복과 더불어 피부 수분량도 증가함을 알 수 있으며, 또한 인삼 열매 포제 추출물을 사용할 경우 인삼 열매 생품의 추출물을 사용할 경우보다 그 효능이 더 우수함을 확인할 수 있다.

Claims (9)

1. 삭제
2. 밀자 포제법으로 포제 처리한 인삼열매의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습 개선용 화장료 조성물로서,
   상기 밀자 포제 처리한 인삼열매는 인삼열매를 꿀에 넣어 꿀을 흡수시킨 후, 100~160℃의 온도에서 10분~1시간 동안 볶은 다음, 음지에서 건조시켜 얻은 것임을 특징으로 하는, 피부 보습 개선용 화장료 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제