KR101801223B1

KR101801223B1 - 당광나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 광반응성 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101801223B1
Application number: KR1020170028341A
Authority: KR
Inventors: 박시준; 김정수; 유대성; 신아름; 유영진
Original assignee: (주)에이씨티
Priority date: 2017-03-06
Filing date: 2017-03-06
Publication date: 2017-11-24

Abstract

본 발명은 LED/OLED 광원을 이용하여 피부에 특정 파장의 광을 조사하여 피부를 개선하는 광조사 피부미용기기와 함께 사용되어 더욱 우수한 피부주름개선, 피부미백, 피부자극완화효과를 나타내는 당광나무 추출물을 함유하는 광반응성 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

당광나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 광반응성 화장료 조성물{Cosmetic composition containing extract of Ligustrum Lucidum as active ingredient}

본 발명은 당광나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 광반응성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 LED/OLED 광원을 이용하여 피부에 특정 파장의 광을 조사하여 피부를 개선하는 광(光) 조사(照射) 피부미용기기와 함께 사용하여 더욱 우수한 피부주름개선, 피부미백, 피부자극완화 효과를 나타내는 광반응성 화장료 조성물에 관한 것이다.

화장품은 피부를 보호하고 아름다움을 부여하는 목적으로 사용되어 왔다. 그러나 최근에는 기능성을 강조하여 기존의 단순한 피부보호나 보습 등을 넘어서 피부주름이나 탄력개선, 항산화, 미백 등 다양한 기능을 가지는 기능성 화장품이 각광을 받고 있다. 이에 따라 다양한 활성을 가지는 성분들이 함유되게 되고, 이는 피부 트러블이나 염증을 유발하기도 한다. 이에 따라 안전한 천연물 성분을 이용하는 화장료에 대한 관심 높아지고 있으며, 안전하고도 피부유용활성을 가지는 천연물 소재를 찾는데 노력을 기울이고 있는 실정이다.

본 발명자들은 이러한 다양한 피부유용활성을 가지는 천연물 소재를 탐색 및 연구하여 왔으며, 그 예로서 대한민국 등록특허 제2010-1081585호 “광나무 및 원추리 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장료 조성물”에는 광나무와 원추리 혼합추출물이 피부 주름개선 효과에 있어서 크게 향상된 시너지 효과를 나타내는 화장료 조성물이 개시되어 있다.

한편, 최근 들어 노화 등을 예방하고자 항노화 및 주름개선 등의 미용기기가 개발되어 왔으며, 고령화 인구의 증가로 인한 다양한 소비자층의 확대와 미용 및 의료기술의 발전, 건강하고 아름다운 피부를 원하는 소비자들의 관심 증가 등으로 인해 더 활발하게 사용되어 왔다.

이에 기능성을 더욱 강조하여 피부주름개선이나 탄력개선, 미백 등의 다양한 기능을 가지는 화장품과 미용기기를 함께 사용하는 에스테틱 샵(aesthetic shop), 피부과 등이 각광을 받고 있다. 이와 함께 집에서도 개인이 안전하게 이용할 수 있는 화장품과 미용기기에 대한 관심이 높아지고 있으며, 그 효능, 효과를 촉진하고 피부 미용적으로 극대화할 수 있는 소재를 찾는데 노력을 기울이고 있는 실정이다.

이러한 연구개발의 일례로서, 대한한국 공개특허 제2015-0125149호에는 “디스플레이 장치 및 이를 이용한 광 치료 방법”에는 발광 다이오드(Light Emitting-Diode, LED) 또는 유기 발광 다이오드(Organic Light Emitting-Diode, OLED) 장치를 이용하여, 시간과 장소에 구애받지 않고 사용자가 손쉽게 광치료를 할 수 있는 방법이 개시되어 있다.

본 발명자들은 이러한 항노화 효과가 있는 LED/OLED 장치의 응용 가능성을 연구하는 과정에서, 다양한 피부유용활성을 가지는 천연물 소재를 탐색하여 왔으며, 기존에 연구개발된 천연물 소재의 유효성분과의 조합을 통해 그 피부 주름개선 및 피부자극완화 효과 등의 활성에 영향을 미치는 물질을 찾기 위하여 노력하였다. 그 결과 당광나무 추출물을 LED/OLED 광원을 이용하여 피부에 특정 파장의 광을 조사하여 피부를 개선하는 광 조사 피부미용기기와 함께 사용하는 경우에 더욱 우수한 피부개선활성을 나타내는 것을 확인하였으며, 이를 함유하는 화장료 조성물이 우수한 피부주름개선, 피부미백, 피부자극완화 효과를 나타낸다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 LED/OLED 광원을 이용하여 피부에 특정 파장의 광을 조사하여 피부를 개선하는 광 조사 피부미용기기와 함께 사용하여 더욱 우수한 피부개선활성을 나타내는 당광나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 당광나무 추출물을 유효성분으로 함유하여, 특정 파장의 광 조건에서 반응하여 더욱 우수한 효과를 나타내는 피부주름개선용, 피부미백용, 피부자극완화용 화장료 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 당광나무 추출물의 제조방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 광반응성 화장료 조성물을 피부에 도포한 후 LED 또는 OLED 광원으로 633±5nm의 광을 피부에 조사하여, 피부주름을 개선하고, 멜라닌 생성을 억제하고, 피부자극을 완화하는 것을 특징으로 하는 화장방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따르면 당광나무 추출물을 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.01 ~ 20.0중량% 함유하며, 633±5nm 파장의 광 조건에서 사용되어 피부 주름 개선, 피부 미백, 피부자극 완화효과를 나타내는 광반응성 화장료 조성물이 제공된다.

상기 당광나무 추출물은 당광나무의 열매, 잎 및 가지로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추출물이며, 바람직하게는 당광나무의 열매와 가지의 혼합추출물이다.

상기 광반응성 화장료 조성물은 피부 주름 개선용, 피부 미백용 또는 자외선으로 인한 피부 자극완화용 화장료 조성물이다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, (A)정제수로 세척하고 건조시킨 당광나무의 열매, 잎, 가지 또는 그 혼합물을 분쇄하여 분말화하는 단계; (B)5~10배 중량의 용매를 가하여 100~120℃에서 추출하는 단계; (C)얻어진 열수 추출액을 여과 및 회수한 후, 초기 부피의 1/10~1/3이 되도록 감압 농축하는 단계; (D)최종 농축액의 2~6배 부피의 에탄올을 가하여 침전반응이 생길 때까지 교반하는 단계; 및 (E)침전물을 여과하여 제거하는 단계를 포함하는 당광나무 추출물의 제조방법이 제공된다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따르면 상기 광반응성 화장료 조성물을 인간의 피부에 도포한 후, LED 또는 OLED 광원으로 633±5nm의 광을 피부에 조사하여, 피부주름을 개선하고, 멜라닌 생성을 억제하고, 피부자극을 완화하는 것을 특징으로 하는 화장방법이 제공된다.

본 발명의 당광나무 추출물은 특정 파장의 광조건에서 더욱 우수한 세포 재생 효과, 콜라겐 합성 증진 효과, 멜라닌 생성 억제 효과, 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화 효과, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 나타내므로, 이를 함유하는 화장료 조성물은 LED 또는 OLED 광원을 이용하는 피부미용기기와 함께 사용되어 피부주름을 개선하고, 피부 미백 및 피부 자극을 완화하는 기능성 화장품으로 사용될 수 있다.

본 발명은 발광 다이오드(LED)나 유기 발광 다이오드(OLED) 광원을 이용하여 피부에 특정 조건의 광을 조사하여 피부를 개선하는 피부미용기기와 함께 사용되는 경우에 우수한 피부개선활성을 나타내는 광반응성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 당광나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용, 피부 미백용, 피부 자극 완화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

당광나무(Ligustrum lucidum)는 제주도 중국 등지에서 자생하며, 광나무(Ligustrum japonicum)보다 넓은 잎을 가지고 있다. 상록활엽 소교목으로 높이 5~10m이고 가지가 퍼지며 털이 없고 회색이며 피목이 있다. 잎은 대생하고 혁질이며 난형 또는 타원형으로 길이 5~12㎝, 너비 3~5㎝이고 양 끝이 뾰족하며 가장자리는 밋밋하고 표면은 녹색으로 윤채가 나며 뒷면은 연한 녹색으로 뚜렷하지 않은 잔 점이 있고 엽병은 길이 1~2㎝로 자줏빛이 돈다.

꽃은 6월에 백색으로 피고 가지 끝에 복총상화서(複總狀花序)로 달리며 화서는 길이 12~20㎝이고 소화경은 길이 2~5㎜이다. 화관은 길이 3~4㎜이고 통부는 열편보다 길며 수술은 2개이고 과실은 장과로 타원상 구형이며 9~10월에 자흑색으로 익는다. 본종은 광나무에 비해 잎은 넓은 난형 또는 난형으로 크고 화관 열편은 화통(花筒)의 반 길이에 불과하며 과실은 타원상 구형이다. 정원수, 과실은 약용으로 쓰인다.

본 발명에서 사용되는 당광나무 추출물은 당광나무의 열매, 잎 및 가지로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 추출한 것이다.

본 발명에서 사용되는 당광나무 추출물은 통상의 용매추출법에 따라 제조될 수 있다. 즉, 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 이용한 용매 추출법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 당광나무의 열매, 잎, 가지를 물로 깨끗이 세척한 후, 그늘에서 건조한다. 건조물을 추출용기에 넣고, 적당량의 추출 용매에 적절한 온도에서 일정 시간 추출한다. 상기 추출물은 여과되고, 진공회전증발기 등을 이용하여 농축될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 구체예에 따르면, 당광나무 추출물은 다음과 같은 방법으로 제조된다.

(A)정제수로 세척하고 건조시킨 당광나무의 열매, 잎, 가지 또는 그 혼합물을 분쇄하여 분말화하는 단계; (B)5~10배 중량의 용매를 가하여 100~120℃에서 추출하는 단계; (C)얻어진 열수 추출액을 여과 및 회수한 후, 초기 부피의 1/10~1/3이 되도록 감압 농축하는 단계; (D)최종 농축액의 2~6배 부피의 에탄올을 가하여 침전반응이 생길 때까지 교반하는 단계; 및 (E)침전물을 여과하여 제거하여 비활성 다당체가 제거된 당광나무 추출물을 제조할 수 있다.

상기의 방법에 의하여 제조된 당광나무 추출물은 633±5nm 파장의 광 조건에서 사용하는 경우 활성화되어 더욱 우수한 피부주름개선, 피부미백, 피부자극 완화효과를 나타내는 것을 확인하였다. 구체적으로는 633±5nm 파장의 광 조건에서 사용하는 경우 우수한 세포 재생 효과(시험예 2), MMP생성억제 효과(시험예 3), 콜라겐 합성 증진 효과(시험예 4), B16F10 멜라닌 형성 세포에 대한 멜라닌 생성 억제 효과(시험예 5), 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화 효과(시험예 6), 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 효과(시험예 7), 피부 주름 개선 효과시험(시험예 8) 및 피부 미백 개선 효과(시험예 9)를 나타내었다. 특히, 비활성다당체를 제거한 당광나무 추출물의 경우 더욱 우수한 효과를 나타내었다.

본 발명에 따르면 상기 당광나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 광반응성 화장료 조성물이 제공된다. 본 발명의 명세서에서 “광반응성 화장료 조성물”은 LED/OLED 광원 등을 이용하여 특정조건의 광을 피부에 조사하여 피부를 개선하는 피부미용기기와 함께 사용되어, 특정조건의 광에 반응하여 그 피부개선활성이 증가되는 화장료 조성물을 의미하는 것으로 사용되었다.

활성성분으로서의 상기 당광나무 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.01 ~ 20.0중량% 함유된다.

본 발명에 따르면 상기 광반응성 화장료 조성물을 사용하는 화장방법이 제공된다. 상기 광반응성 화장료 조성물은 특정 파장의 광 조건에서 더욱 우수한 활성을 나타내므로, 먼저 상기 광반응성 화장료 조성물을 피부에 도포한 후, 특정 조건의 빛을 낼 수 있는 광원을 이용, 해당부위에 조사하여 활성화시킨다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 광반응성 화장료 조성물을 피부에 도포한 후, 대한민국 공개 특허 제2015-0125149호“디스플레이 장치 및 이를 이용한 광 치료 방법”에 개시되어 있는 발광 다이오드(LED) 또는 유기 발광 다이오드(OLED)를 이용한 광 장치 등을 사용하여 상기 화장료 조성물을 도포한 부위에 633±5nm 파장의 적색광을 일정시간 조사하여 활성화 시킨다. 상기 파장의 광을 조사하는 경우에 가장 우수한 피부주름개선, 미백, 피부자극완화 활성을 나타내었다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 시험예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.

실시예 1 ~ 19: 당광나무 추출물의 제조

음지에서 건조한 동일 중량의 당광나무의 열매와 줄기를 각각 분쇄한 뒤 분쇄한 조분쇄 분말 200g에 물과 에탄올의 비율을 7:3으로 조정한 70% 에탄올 2L를 가하여 110℃, 6시간 동안 환류추출하고 냉침한 후, 8㎛ 투과사이즈를 갖는 여과지로 여과하였다. 여과된 여액을 진공 농축하여 완전히 건조된 건조 추출물을 얻었으며, 추출 수율은 29.7g/1000g이었다. 상기 건조 추출물을 1%(w/v) 농도가 되도록 50% 1,3-부틸렌 글리콜 용액으로 용해하고 여과한 후 본 발명의 실험에 적용하였다. 또한 하기 표 1과 같이 추출용매를 달리하여 상기 실시예 1과 같은 방법으로 당광나무를 추출하여 각각의 추출물을 얻었다(실시예 2~19).

실시예 20: 비활성 다당체 제거 당광나무 추출물의 제조

정제수로 세척하고 음지에서 건조시킨 동일중량의 당광나무의 열매와 줄기를 각각 분쇄하여 분말화한 후 300메시 시브를 이용하여 미세하게 만든 뒤, 분쇄한 조분쇄 분말 200g에 10배 중량의 용매를 가하여 110℃, 6시간 동안 고온고압 추출조건에서 추출하였다. 얻어진 열수 추출액을 여과 및 회수한 후, 초기 부피의 1/10~1/3이 되도록 감압 농축하였다. 최종 농축액의 2배, 4배, 6배 부피의 에탄올을 가하여 침전반응이 생길 때까지 교반한 후 가라앉은 침전물을 여과하여 제거하였다. 이렇게 얻은 여액을 진공 농축하여 건조 추출물을 얻었으며, 각 에탄올 처리 농도에 의한 추출 수율은 하기 표 2와 같다.

이 여과액을 비활성 다당체 제거 당광나무 추출물이라 칭하였다. 또한 이하 실험에 사용된 비활성 다당체 제거 당광나무 추출물은 1%(w/v) 농도가 되도록 50% 1,3-부틸렌 글리콜 용액으로 용해하고 여과한 후 본 발명의 실험에 적용하였다.

<시험예>

상기 실시예로부터 수득한 생성물인 당광나무 추출물은 실험에 적용시 농도가 각각 1%(w/v) 농도가 되도록 50% 1,3-부틸렌 글리콜 용액으로 용해하고 여과한 후 본 발명의 실험에 적용하여 사용하였다. 특정 파장의 광을 발산하는 피부미용기기로는 대한민국 공개 특허 제2015-0125149호“디스플레이 장치 및 이를 이용한 광 치료 방법”에 개시된 장치를 사용하였다.

시험예 1: 비활성 다당체 제거 추출법에 의한 추출물의 활성시험

상기 실시예 20에서 각 에탄올 혼합비율에 따라 제조된 추출물에 대하여 아래의 활성시험을 수행하였다.

1. 피부재생 효과

24공 평판배양기에 Hacat keratinocyte(German Cancer Research Institute, Germany)를 2×10₅ cells/well의 농도로 배양한 다음, 24시간 동안 10% FBS 첨가 배지 조건하에 안정화시킨 뒤, 무혈청 배지로 교환 후, 전술한 광 장치가 설치된 배양기에서 상기 비활성 다당체 제거 추출법으로 추출한 당광나무 추출물을 농도를 달리하여 첨가한 후 3일간 적색광을 조사하여 배양하였다. 배양 후 세포생성 효과를 보기 위해 MTT assay법을 이용하여 세포의 생성 정도를 비교 평가하였으며, 양성 대조군으로 TGF-β(10ng/mL)를 적용하였고 음성 대조군으로는 상기 시료를 처리하지 않고 3일 동안 적색광만을 조사한 결과와 적색광 조사없이 당광나무 추출물만을 첨가한 결과 그리고 아무것도 처리하지 않은 결과를 대조군으로 비교하였으며, 전체 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

2. 콜라겐 분해 효소인 MMP-1, 2 생성 억제

인간 정상 섬유아세포를 48공 평판배양기에 1×10⁶ cells/well의 농도로 배양한 다음, 24시간 동안 10% FBS 첨가 배지 조건하에 안정화시킨 뒤, 무혈청 배지로 교환 후, 시험예 1-1의 배양기에서 상기 당광나무 추출물을 여러 조건으로 첨가하고 3일간 적색광을 조사하여 배양하였다. 양성 대조군으로는 콜라겐 분해 효소인 MMP(matrix metalloproteinase)-1, 2의 생성을 억제하는 효과가 있는 것으로 알려진 TGF-β(10ng/㎖)를 사용하였으며, 음성 대조군으로는 상기 시료를 처리하지 않고 3일 동안 적색광만을 조사한 결과와 적색광 조사없이 당광나무 추출물만을 첨가한 결과를 비교하였다. 배양 후 각 샘플의 상층액을 모아 MMP-1, 2 분석 Kit(Amersham, USA)를 이용하여 합성된 MMP-1, 2의 양(ng/㎖)을 측정하고, 하기 식에 따라 MMP 생성 억제율(%)을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

3. 콜라겐 합성증진

인간 정상 섬유아세포를 48공 평판배양기에 1×10⁶ cells/well의 농도로 배양한 다음, 24시간 동안 10% FBS 첨가 배지 조건하에 안정화시킨 뒤, 무혈청 배지로 교환 후, 시험예 1-1의 배양기에서 상기 당광나무 추출물을 여러 조건으로 첨가하고 3일간 적색광을 조사하여 배양하였다.

양성 대조군으로는 콜라겐 합성 증진 효과가 있는 것으로 알려진 TGF-β(10ng/㎖)를 사용하였으며, 음성 대조군으로는 상기 시료를 처리하지 않고 3일 동안 적색광만을 조사한 결과와 적색광 조사없이 당광나무 추출물만을 첨가한 결과 그리고 아무것도 처리하지 않은 결과를 대조군으로 비교하였다. 배양 후 각 샘플의 상층액을 모아 Collagen Kit(Takara, Japan)를 이용하여 프로콜라겐(procollagen) 타입 I C-펩타이드 (PICP) 양을 측정하여 ng/㎖ 환산하였으며, 이에 의해 합성된 콜라겐 양을 측정하였다. 콜라겐 생합성 증가율(%)은 하기 식에 따라 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

위와 같은 실험 결과를 바탕으로 가장 효과가 우수하게 나타난 비활성 다당체가 제거된 당광나무 추출물(실시예 20-3)을 실험에 사용하였다.

시험예 2: 피부세포 재생

24공 평판배양기에 Hacat keratinocyte(German Cancer Research Institute, Germany)를 2×10⁵ cells/well의 농도로 배양한 다음, 24시간 동안 10% FBS 첨가 배지 조건하에 안정화시킨 뒤, 무혈청 배지로 교환 후, 전술한 광 장치가 설치된 배양기에서 상기 다양한 용매로 추출한 당광나무 추출물의 농도를 달리하여 첨가한 후 3일간 적색광을 조사하여 배양하였다. 배양 후 세포생성 효과를 보기 위해 MTT assay법을 이용하여 세포의 생성 정도를 비교 평가하였으며, 양성 대조군으로 TGF-β(10ng/mL)를 적용하였고 음성 대조군으로는 상기 시료를 처리하지 않고 3일 동안 적색광만을 조사한 결과와 적색광 조사 없이 당광나무 추출물만을 첨가한 결과 그리고 아무것도 처리하지 않은 결과를 대조군으로 비교하였으며, 전체 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

상기 실험에서 진행되었던 적색광의 세기는 47.5μW/cm²을 사용하였으며, 일반적으로 피부 세포 재생은 세포 활성율로 측정하는데, 세포 활성율이 당광나무 추출물을 첨가와 633±5nm 파장의 광을 같이 처리한 실험군, 광 장치만 사용한 실험군, 광 조사 없이 당광나무 추출물만 사용한 실험군 순으로 세포 재생 효과가 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 광 장치 조건하에서의 당광나무 추출물은 세포 재생 효과가 있는 것으로 알려진 TGF-β를 사용한 양성 대조군보다 현저히 우수한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 특히 비활성 다당체 제거법에 의한 당광나무 추출물(실시예 20-3) 0.1% 처리 농도와 적색광 조사를 동시에 진행한 실험군에서 2.119(at 570nm)의 흡광도 값을 나타내며 가장 우수한 효과를 나타내었다.

시험예 3: 콜라겐 분해 효소 MMP -1, 2 생성 억제

인간 정상 섬유아세포를 48공 평판배양기에 1×10⁶ cells/well의 농도로 배양한 다음, 24시간 동안 10% FBS 첨가 배지 조건하에 안정화시킨 뒤, 무혈청 배지로 교환 후, 시험예 1-1의 배양기에서 상기 당광나무 추출물을 여러 조건으로 첨가하고 3일간 적색광을 조사하여 배양하였다. 양성 대조군으로는 콜라겐 분해 효소인 MMP(matrix metalloproteinase)-1, 2의 생성을 억제하는 효과가 있는 것으로 알려진 TGF-β(10ng/㎖)를 사용하였으며, 음성 대조군으로는 상기 시료를 처리하지 않고 3일동안 적색광만을 조사한 결과와 적색광 조사없이 당광나무 추출물만을 첨가한 결과를 비교하였다. 배양 후 각 샘플의 상층액을 모아 MMP-1, 2 분석 Kit(Amersham, USA)를 이용하여 합성된 MMP-1, 2의 양(ng/㎖)을 측정하고, 하기 식에 따라 MMP 생성 억제율(%)을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

상기 실험에서 진행되었던 적색광의 세기는 47.5μW/cm²을 사용하였으며 상기 표 7의 결과에서 보는 바와 같이, 당광나무 추출물을 단독으로 적용한 경우보다 당광나무 추출물을 첨가하고 광 장치에서 633±5nm 파장의 광을 조사한 경우가 MMP-1, 2 생성 억제율 효과가 더 높았으며, 보다 우수한 시너지 효과를 보여주었다. 특히 비활성 다당체 제거법에 의한 당광나무 추출물(실시예 20-3) 0.1% 처리 농도와 적색광 조사를 동시에 진행한 실험군에서 각각 93.2%와 95.0%의 억제율을 나타내며 가장 우수한 효과를 나타내었다.

시험예 4: 콜라겐 합성증진

인간 정상 섬유아세포를 48공 평판배양기에 1×10⁶ cells/well의 농도로 배양한 다음, 24시간 동안 10% FBS 첨가 배지 조건하에 안정화시킨 뒤, 무혈청 배지로 교환 후, 시험예 1-1의 배양기에서 상기 당광나무 추출물을 여러 조건으로 첨가하고 3일간 적색광을 조사하여 배양하였다. 양성 대조군으로는 콜라겐 합성 증진 효과가 있는 것으로 알려진 TGF-β(10ng/㎖)를 사용하였으며, 음성 대조군으로는 상기 시료를 처리하지 않고 3일동안 적색광만을 조사한 결과와 적색광 조사없이 당광나무 추출물만을 첨가한 결과 그리고 아무것도 처리하지 않은 결과를 대조군으로 비교하였다. 배양 후 각 샘플의 상층액을 모아 Collagen Kit(Takara, Japan)를 이용하여 프로콜라겐 (procollagen) 타입 I C-펩타이드 (PICP) 양을 측정하여 ng/㎖ 환산하였으며, 이에 의해 합성된 콜라겐 양을 측정하였다. 콜라겐 생합성 증가율(%)은 하기 식에 따라 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

상기 실험에서 진행되었던 적색광의 세기는 47.5μW/cm²을 사용하였으며, 상기 표 8의 결과에서 보는 바와 같이, 섬유아세포를 이용하여 당광나무 추출물을 단독으로 적용한 경우보다 당광나무 추출물을 첨가하고 광 장치에서 633±5nm 파장의 광을 조사한 경우가 콜라겐 합성 증진 효과가 더 높았으며, 보다 우수한 시너지 효과를 보여주었다. 또한, 광 장치 조건하에서의 당광나무 추출물은 콜라겐 합성 증진 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β를 사용한 양성 대조군보다 현저히 우수한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 특히 비활성 다당체 제거법에 의한 당광나무 추출물(실시예 20-3) 0.1% 처리 농도와 적색광 조사를 동시에 진행한 실험군에서 콜라겐 생합성 증가율 93.5% 값을 나타내며 가장 우수한 효과를 나타내었다.

시험예 5: B16F10 멜라닌 형성 세포에 의한 멜라닌 생성 억제

B16F10 멜라닌 형성 세포는 마우스에서 유래한 세포주이며, 멜라닌이라는 흑색 색소를 분비하는 세포이다. 본 시험예에 사용된 B16F10 멜라닌 형성 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F10 멜라닌 형성 세포를 6공 평판배양기에 2 × 10⁶ 개의 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 시험예 1-1의 배양기에서 상기 당광나무 추출물을 첨가하고 72시간 적색광을 조사하여 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)로 떼어내고, 세포 수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan)의 방법을 변형하여 실시하였다. 회수한 세포를 PBS(phosphate buffer saline)로 1회 세척한 후 균질화 용액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% 디메틸 설폭사이드(DMSO))를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해하고, 마이크로 플레이트 판독기로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. 비교 실험을 위해 멜라닌 생성 억제 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 하이드로퀴논과 알부틴을 양성 대조군으로 사용하였다. B16F10 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 생성 저해율(%)은 하기식에 의해 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

A:시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B:시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

상기 실험에서 진행되었던 적색광의 세기는 20μW/cm²을 사용하였으며, 상기 표 9의 결과에서 보는 바와 같이, 당광나무 추출물을 단독으로 적용한 경우보다 당광나무 추출물을 첨가하고 광 장치에서 633±5nm 파장의 광을 조사한 경우가 B16F10 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 생성 저해율이 더 높았으며, 보다 우수한 시너지 효과를 보여주었다.

시험예 6: 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화

인간 정상 섬유아세포(fibroblast)를 24공 평판배양기에 5×10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 1000㎕의 PBS를 추가하였다. 이 섬유아세포에 자외선 B 램프를 이용하여 자외선 10mJ/cm²를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포 배양 배지(10% FBS가 첨가된 DMEM) 1㎖를 첨가하였다. 여기에 시험예 1-1의 배양기에서 상기 당광나무 추출물을 첨가하고 24시간 적색 광을 조사하여 배양하였다. 24시간 배양 후 배지를 제거하고, 각 웰당 세포 배양 배지 500㎕와 MTT 용액(2.5mg/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃ 및 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후 마이크로 플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다. 비교 실험을 위해 양성 대조군으로 TGF-β를 사용하였다. 하기 식에 의해 세포 생존율(%)과 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화율(%)을 계산하였다.

Bo:세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

Bt:시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

St:시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

Bo:자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt:자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St:자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

세포 독성 완화율을 하기 표 10에 나타내었다.

상기 실험에서 진행되었던 적색광의 세기는 47.5μW/cm²을 사용하였으며 상기 표 10의 결과에서 보는 바와 같이, 당광나무 추출물을 단독으로 적용한 경우보다 당광나무 추출물을 첨가하고 광 장치에서 633±5nm 파장의 광을 조사한 경우가 자외선에 의한 세포 독성 완화율 효과가 더 높았으며, 보다 우수한 시너지 효과를 보여주었다.

시험예 7: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제

사람의 표피 조직에서 분리한 각질 형성 세포(Keratinocyte)를 24공 평판배양기에 5×10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 각질 형성 세포에 자외선 B 램프를 이용하여 자외선 10mJ/cm²를 조사한 다음 PBS를 덜어내고 세포 배양 배지(FBS가 첨가되지 않은 DMEM) 350㎕를 첨가하였다. 그리고 시험예 1-1의 배양기에서 상기 당광나무 추출물를 첨가하고 72시간 적색광을 조사하여 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕ 취하여 염증성 사이토카인(1L-1α)을 정량함으로써 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 판단하였다. 염증성 사이토카인의 양은 효소 면역 분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량화하였으며, 양성 대조군으로서 염증성 사이토카인 억제 물질로 알려진 케토프로펜(ketoprofen)을 사용하였다. 염증성 사이토카인의 발현 억제율(%)은 하기식에 의해 계산하였고, 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.

Bo:자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

Bt:자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

St:자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량

상기 실험에서 진행되었던 적색광의 세기는 47.5μW/cm²을 사용하였으며 상기 표 11의 결과에서 보는 바와 같이, 당광나무 추출물을 단독으로 적용한 경우보다 당광나무 추출물을 첨가하고 광 장치에서 633±5nm 파장의 광을 조사한 경우가 자외선에 의한 염증성 사이토카인의 발현 억제 효과가 더 높았으며, 보다 우수한 시너지 효과를 보여주었다. 특히 비활성 다당체 제거법에 의한 당광나무 추출물(실시예 20-3)과 적색광 조사를 동시에 진행한 실험군에서 63.2%의 억제율을 나타내며 가장 우수한 효과를 나타내었다.

제형 실시예 1: 크림의 제조

하기 표 12의 조성에 따라 통상의 방법으로 크림을 제조하였다.

시험예 7: 피부 주름 개선 효과

30 ~ 50대의 성인 여성 60명을 대상으로 상기 제형 실시예에서 제조된 크림을 얼굴 양쪽 면에 바르고, LED 광원장치로 633nm의 적색광(90.0μW/cm²)을 6주간 누적시간 24시간 조사한 후, 주름 개선 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.

상기 당광나무 추출물을 함유하는 크림(제형실시예 1), 당광나무 추출물을 정제수로 대체한 크림(비교제형예 1), 당광나무 추출물 대신 주름개선효과가 있는 것으로 알려진 물질인 아데노신을 함유하는 크림(비교제형예 2)을 사용하였다. 이 평가를 토대한 주름 개선 효과 결과는 하기의 표 13에 나타내었다.

상기 표 13의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 당광나무 추출물을 함유한 제형 실시예 1의 크림은 적색광 조사 조건하에서 당광나무 추출물를 함유하지 않은 비교 제형예 1의 크림에 비하여 높은 주름개선 효과를 보여주었다. 또한, 당광나무 추출물 대신 아데노신을 함유하는 비교 제형예 2의 크림과 유사한 우수한 피부 주름개선 효과를 나타내었다.

시험예 8: 피부 미백 개선 효과

본 발명의 당광나무 추출물를 함유하는 화장료 조성물의 미백 개선효과를 실제 사용테스트를 통하여 평가하였다.

상기 표 12의 당광나무 추출물을 함유하는 크림(제형실시예 1), 당광나무 추출물를 정제수로 대체한 크림(비교제형예 1), 당광나무 추출물 대신 미백개선효과가 있는 것으로 알려진 물질인 알부틴을 함유하는 크림(비교제형예 3)을 사용하였다.

30 ~ 50대의 성인 여성 60명을 대상으로 상기 제형 실시예에 제조된 크림을 얼굴 양쪽 면에 바르고, LED 광원장치로 633nm의 적색광을 6주간 누적시간 24시간 조사한 후, 육안으로 평가하여 미백 개선 효과를 확인하였으며, 그 결과를 하기의 표 14에 나타내었다.

상기 표 14의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 당광나무 추출물을 함유한 제형실시예 1의 크림은 적색광 조사 조건하에서 당광나무 추출물을 함유하지 않은 비교제형예 1의 크림에 비하여 높은 미백개선 효과를 보여주었다. 또한, 당광나무 추출물 대신 알부틴을 함유하는 비교제형예 3의 크림과 유사한 우수한 피부 미백개선 효과를 나타내었다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고 특허청구범위와 발명의 상세한 설명의 범위 안에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고 이 또한 본 발명의 범위에 속하는 것은 당연하다.

Claims

당광나무의 열매 및 가지의 혼합추출물로서, 에탄올 침전반응에 의하여 비활성 다당체가 제거된 당광나무 추출물을 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.01 ~ 20.0중량% 함유하며, 633±5nm 파장의 광 조건에서 사용되어 피부 주름 개선, 피부 미백 및 자외선으로 인한 피부자극 완화효과를 나타내는 광반응성 화장료 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부주름 개선용인 것을 특징으로 하는 광반응성 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부미백용인 것을 특징으로 하는 광반응성 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 자외선으로 인한 피부자극 완화용인 것을 특징으로 하는 광반응성 화장료 조성물.
(A)정제수로 세척하고 건조시킨 동일 중량의 당광나무의 열매와 가지 혼합물을 분쇄하여 분말화하는 단계;
(B)5~10배 중량의 용매를 가하여 100~120℃에서 추출하는 단계;
(C)얻어진 열수 추출액을 여과 및 회수한 후, 초기 부피의 1/10~1/3이 되도록 감압 농축하는 단계;
(D)최종 농축액의 4~6배 부피의 에탄올을 가하여 침전반응이 생길 때까지 교반하는 단계; 및
(E)침전물을 여과하여 제거하는 단계를 포함하는 당광나무 추출물의 제조방법.
제1항의 광반응성 화장료 조성물을 인간의 피부에 도포한 후, LED 또는 OLED 광원으로 633±5nm의 광을 피부에 조사하여, 피부주름을 개선하고, 멜라닌 생성을 억제하고, 자외선으로 인한 피부자극을 완화하는 것을 특징으로 하는 화장방법.
제7항의 제조방법에 의하여 제조된 당광나무 추출물을 함유하는 피부세포재생용 광반응성 화장료 조성물.