KR102435309B1

KR102435309B1 - 락토바실러스 플란타넘 kova-21a 균주와 당광나무 열매 추출물을 이용한 화장료용 발효 추출물 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR102435309B1
Application number: KR1020220075404A
Authority: KR
Inventors: 김나리; 김석종; 장준환; 이상종; 정용수; 민영희
Original assignee: 주식회사 제이투케이바이오; (주)코바스
Priority date: 2022-06-21
Filing date: 2022-06-21
Publication date: 2022-08-23

Abstract

본 발명은 락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A 균주와 당광나무 열매 추출물을 이용한 화장료용 발효 추출물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A 균주와 당광나무 열매 추출물을 이용한 화장료용 발효 추출물 제조 방법은 상기한 과제를 해결하기 위하여, 당광나무 열매를 추출하여 추출물을 수득하고, 상기 추출물에 매화꽃으로부터 분리된 기탁번호 KCTC 14594BP의 신규한 락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A 유산균 균주를 접종하여 발효시킨 후, 침전물과 유산균체를 제거하여 발효 추출물을 제조하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의해, 당광나무 열매 추출물을 화장료에 적용함에 있어서 매화꽃으로부터 분리한 신규한 락토바실러스 플란타넘 균주를 접종하여 발효시킴으로써 염증유발인자인 사이토카인 IL-6와 염증매개인자인 COX-2의 mRNA 발현을 억제하고, Nitric Oxide의 생성이 억제되는 화장료용 발효 추출물이 제공된다. 아울러, 특유의 이취가 있는 당광나무 열매 추출물을 활용하고, 통상적으로 발효시 퀴퀴한 냄새를 발생시키는 유산균이 적용됨에도 불구하고, 신규한 락토바실러스 플라터넘 균주를 활용함으로써 나쁜 냄새가 나지 않고 냄새를 통한 변질도 최소화된 화장료용 발효 추출물이 제공된다.

Description

락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A 균주와 당광나무 열매 추출물을 이용한 화장료용 발효 추출물 및 그 제조 방법{Fermentation Extract for cosmetic composition using Lactobacillus plantarum KOVA-21A strain and extract of Ligustrum Lucidum fruit and manufacturing method thereof}

본 발명은 화장료용 발효 추출물 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 특히 신규한 락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A 균주와 당광나무 열매 추출물을 이용한 화장료용 발효 추출물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

당광나무(Ligustrum lucidum Aiton)는 제주도 중국 등지에서 자생하는 물푸레나무과의 상록 활엽 소교목으로, 광나무(Ligustrum japonicum)보다 넓은 잎을 가지고 있다.

상록활엽 소교목으로 높이 5~10m이고 가지가 퍼지며 털이 없고 회색이며 피목이 있다.

잎은 대생하고 혁질이며 난형 또는 타원형으로 길이 5~12㎝, 너비 3~5㎝이고 양 끝이 뾰족하며 가장자리는 밋밋하고 표면은 녹색으로 윤채가 나며 뒷면은 연한 녹색으로 뚜렷하지 않은 잔 점이 있고 엽병은 길이 1~2㎝로 자줏빛이 돈다.

꽃은 6월에 백색으로 피고 가지 끝에 복총상화서(複總狀花序)로 달리며 화서는 길이 12~20㎝이고 소화경은 길이2~5㎜이다.

화관은 길이 3~4㎜이고 통부는 열편보다 길며 수술은 2개이고 과실은 장과로 타원상 구형이며 9~10월에 자흑색으로 익는다.

본종은 광나무에 비해 잎은 넓은 난형 또는 난형으로 크고 화관 열편은 화통(花筒)의 반 길이에 불과하며 과실은 타원상 구형이다. 정원수, 과실은 약용으로 쓰인다.

한방에서는 겨울에 채취한 당광나무 열매를 양지에서 말리거나 가볍게 증숙하여 양지에서 말린 것을 여정실(女貞實) 또는 여정자(女貞子)라 하여 강장약으로 사용하고 있다.

이러한 당광나무 열매를 화장료 조성물의 원료로 사용하기 위한 여러 연구가 진행되어 왔다.

일예로, "당광나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 광반응성 화장료 조성물"(한국 등록특허공보 제10-1801223호, 특허문헌 1)에서는 비활성 다당체 제거 추출법으로 추출한 당광나무 추출물이 특정 파장의 광을 같이 처리하였을 때 세포 재생 효과, 콜라겐 분해 효소의 생성 억제, 콜라겐 생합성 증가, 멜라닌 생성 억제, 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제, 피부 주름 개선, 피부 미백 개선 등의 효과를 가진다는 것이 공개되었다.

또, "홍삼박 또는 여정실을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물"(한국 등록특허공보 제10-1511308호, 특허문헌 2)에는 여정실 추출물이 티로시나제 활성 저해 효능, 멜라닌 합성 저해 효능, 멜라닌 합성 관련 단백질 발현에 대한 저해 효능을 가져 미백 효과를 가진다는 것이 공개되었다.

뿐만 아니라, "제주광나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물"(한국 등록특허공보 제10-2100345호, 특허문헌 3)에는 제주광나무 추출물이 자유라디칼 소거 활성이 높으며, 엘라스타저 저해 활성 효능이 우수하고, nitric oxide(NO)의 생성을 억제하고, 피부 탄력 개선, 피부염 개선 효과가 우수하다는 것이 공개되었다.

더하여, "식물 발효 추출물을 포함하는 프리바이오틱 화장료 조성물"(한국 공개특허공보 제10-2014-0052576호, 특허문헌 4)에는 광나무 열매를 균주에 접종 및 발효시킨 다음 배양물을 건조한 다음 배양물을 추출 용매로 추출하여 화장료 조성물을 제조하되, 균주로는 락토바실러스 플란타럼이 포함된 기술이 공개되어 있다.

그러나, 특허문헌 4에는 광나무 열매를 활용할 수 있다는 설명만 기재되어 있을 뿐, 실제 광나무 열매에 락토바실러스 플란타럼을 접종한 실시예는 없으며, 원료에 균주를 접종하여 발효시키는 것에 불과하다.

KR 10-1801223 (2017.11.20) KR 10-1511308 (2015.04.06) KR 10-2100345 (2020.04.07) KR 10-2014-0052576 (2014.05.07)

본 발명의 락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A 균주와 당광나무 열매 추출물을 이용한 화장료용 발효 추출물 및 그 제조 방법은 상기한 종래 기술에서 발생하는 문제점을 해소하기 위한 것으로, 당광나무 열매 추출물을 화장료에 적용함에 있어서 매화꽃으로부터 분리한 신규한 락토바실러스 플란타넘 균주를 접종하여 발효시킴으로써 염증유발인자인 사이토카인 IL-6와 염증매개인자인 COX-2의 mRNA 발현을 억제하고, Nitric Oxide의 생성이 억제되는 화장료용 발효 추출물을 제공하려는 것이다.

아울러, 특유의 이취가 있는 당광나무 열매 추출물을 활용하고, 통상적으로 발효시 퀴퀴한 냄새를 발생시키는 유산균이 적용됨에도 불구하고, 신규한 락토바실러스 플라터넘 균주를 활용함으로써 나쁜 냄새가 나지 않고 냄새를 통한 변질도 최소화된 화장료용 발효 추출물을 제공하려는 것이다.

본 발명의 락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A 균주와 당광나무 열매 추출물을 이용한 화장료용 발효 추출물 제조 방법은 상기한 과제를 해결하기 위하여, 당광나무 열매를 추출하여 추출물을 수득하고, 상기 추출물에 매화꽃으로부터 분리된 기탁번호 KCTC 14594BP의 신규한 락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A 유산균 균주를 접종하여 발효시킨 후, 침전물과 유산균체를 제거하여 발효 추출물을 제조하는 것을 특징으로 한다.

상기한 구성에 있어서, 상기 당광나무 추출물은 추출물 원료에 정제수를 혼합한 다음 85 ~ 95℃의 온도로 2 ~4시간 동안 추출하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 발효 추출물은 상기 제조 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 한다.

상기한 구성에 있어서 상기 발효 추출물은 염증유발인자인 사이토카인 IL-6와 염증매개인자인 COX-2의 mRNA 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.

상기한 구성에 있어서 상기 발효 추출물은 NO(Nitric Oxide)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의해, 당광나무 열매 추출물을 화장료에 적용함에 있어서 매화꽃으로부터 분리한 신규한 락토바실러스 플란타넘 균주를 접종하여 발효시킴으로써 염증유발인자인 사이토카인 IL-6와 염증매개인자인 COX-2의 mRNA 발현을 억제하고, Nitric Oxide의 생성이 억제되는 화장료용 발효 추출물이 제공된다.

아울러, 특유의 이취가 있는 당광나무 열매 추출물을 활용하고, 통상적으로 발효시 퀴퀴한 냄새를 발생시키는 유산균이 적용됨에도 불구하고, 신규한 락토바실러스 플라터넘 균주를 활용함으로써 나쁜 냄새가 나지 않고 냄새를 통한 변질도 최소화된 화장료용 발효 추출물이 제공된다.

도 1은 본 발명에서 실험예 1(DPPH 라디컬 소거 활성 측정 실험)의 결과를 나타낸 그래프.
도 2는 본 발명에서 실험예 2(세포 독성 실험)의 결과를 나타낸 그래프.
도 3은 본 발명에서 실험예 3(NO 생성 억제 효과 측정 실험)의 결과를 나타낸 그래프.
도 4 및 도 5는 본 발명에서 실험예 4(유전자 발현 평가)의 결과를 나타낸 그래프.
도 6은 본 발명에서 매화꽃으로부터 유래된 기탁번호 KCTC 14594BP의 락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A(Lactobacillus plantarum KOVA-21A) 동정 결과 16S rRNA 서열도.
도 7은 본 발명의 매화꽃으로부터 유래된 기탁번호 KCTC 14594BP의 락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A(Lactobacillus plantarum KOVA-21A) 균주의 기탁을 입증하는 기탁증.

본 출원의 발명자들은 인체에 유용한 미생물을 탐색하는 과정에서 매화꽃을 유래로 하는 신규 락토바실러스 플란타넘 균주를 분리 동정하게 되었으며, 이 새로운 균주를 활용하여 다양한 추출물에 접종 배양시켜본 결과 당광나무 열매 추출물에 적용할 경우 당광나무 열매 추출물 자체나, 다른 균주를 접종하여 배양시켰을 때에 비해 DPPH 라디컬 소거 활성, NO 생성 억제, 사이토카인 IL-6 및 염증매개인자인 COX-2의 mRNA 발현이 감소하는 것을 확인하여 본 발명에 이르게 되었다.

상기의 신규 균주는 2021년 06월 03일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A(Lactobacillus plantarum KOVA-21A)를 기탁하였다.(기탁번호: KCTC 14594BP)

이하에서는 본 발명의 구체적인 실시예 및 비교예들에 대해 상세히 설명하기로 한다.

<매화꽃으로부터 균주의 분리 및 발효물의 제조>

매화꽃을 유산균 분리 시료로 사용하였다. 상기 시료는 멸균 생리식염수에 현탁 및 희석하고, 이를 0.1 mL씩 취해 디프코 락토바실리 MRS 아가 (Difco Lactobacili MRS Agar) 배지에 도말하였다. 이 후, 플레이트를 35℃의 항온배양기에서 2일 동안 배양하였다. 생성된 각각의 콜로니를 MRS 아가 플레이트에 획선 접종하였고, 35℃에서 2일 동안 배양하여 백색 집락을 보이는 콜로니를 취했다.

위와 같은 방법으로 락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A를 매화꽃으로부터 분리하였다.

아울러, 당광나무 열매 100g을 90℃의 정제수 1000g에서 3시간 추출하고 냉각하여 여과한 다음, 배양을 위해 121℃에서 15분간 멸균처리하여 추출물을 제조하였다.

멸균이 끝난 추출물에 상기 락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A을 접종하여 온도 35℃, 정치배양 조건으로 3일간 배양 발효시켜 발효액을 제조하였다.

상기 발효액을 10,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 발효액으로부터 유산균체와 침전물을 제거한 발효 추출물을 수득하였다.

상기 발효 추출물을 감압농축 및 진공건조하여 분말을 얻었다.

<비교예 1> 당광나무 추출물의 제조1

당광나무 열매 100g을 90℃의 정제수 1,000g에서 3시간 추출하고 냉각하여 여과한 다음 감압 농축 및 진공 건조하여 분말상의 당광나무 추출물을 제조하였다.

<비교예 2> 발효물의 제조

비교예 1의 추출물을 준비한 후, 추출물에 락토바실러스 펜토서스 J2K-185를 접종하여 온도 35℃, 정치배양 조건으로 3일간 배양 발효시켰다.

배지 조성은 글루코스 2.5%, 효모추출물 1.5%, 황산망간 0.1%, 황산마그네슘 0.05%, 염화칼슘 0.05%를 함유한 최적화된 배지로 하며 pH 5.6로 조정한 배지에 상기 종균배양액을 1%(V/V)되게 접종한 후, 온도 35℃, 회전수 120rpm 조건으로 48시간 배양하였다.

배양 발효 후 10,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 배양액으로부터 유산균체와 침전물을 제거하고, 상등액을 여과하여 발효 추출물을 수득하였다.

<비교예 3> 발효물의 제조

비교예 2와 동일하게 진행하되 접종 균주로 락토바실러스 쿠르바투스 K2K-01을 접종하였다.

<비교예 4> 발효물의 제조

비교예 2와 동일하게 진행하되 접종 균주로 락토바실러스 브레비스 J2K-55를 접종하였다.

<비교예 5> 발효물의 제조

비교예 2와 동일하게 진행하되 접종 균주로 락토바실러스 플란타넘 J2K-27을 접종하였다.

<비교예 6> 발효물의 제조

비교예 2와 동일하게 진행하되 접종 균주로 락토바실러스 플란타넘 J-135을 접종하였다.

<비교예 7> 발효물의 제조

비교예 2와 동일하게 진행하되 접종 균주로 락토바실러스 플란타넘 JCC-27을 접종하였다.

<비교예 8> 발효물의 제조

비교예 2와 동일하게 진행하되 접종 균주로 락토바실러스 플란타넘 MB01을 접종하였다.

<비교예 9> 발효물의 제조

비교예 2와 동일하게 진행하되 접종 균주로 락토바실러스 플란타넘 5273을 접종하였다.

<비교예 10> 당광나무 추출물의 제조2

당광나무 열매 100g을 70%(v/v) 농도의 에탄올 1,000g에 침지시켜 상온에서 7일 동안 침적 추출하고 여과한 다음 감압 농축 및 진공 건조하여 분말상의 당광나무 추출물을 제조하였다.

<비교예 11> 발효물의 제조

비교예 10의 추출물을 준비한 후, 비교예 2와 동일하게 락토바실러스 펜토서스 J2K-185를 접종하여 진행하였다.

<비교예 12> 발효물의 제조

비교예 11과 동일하게 진행하되, 접종 균주로 락토바실러스 쿠르바투스 K2K-01을 접종하였다.

<비교예 13> 발효물의 제조

비교예 11과 동일하게 진행하되 접종 균주로 락토바실러스 브레비스 J2K-55를 접종하였다.

<비교예 14> 발효물의 제조

비교예 11과 동일하게 진행하되 접종 균주로 락토바실러스 플란타넘 J2K-27을 접종하였다.

<비교예 15> 발효물의 제조

비교예 11과 동일하게 진행하되 접종 균주로 락토바실러스 플란타넘 J-135을 접종하였다.

<비교예 16> 발효물의 제조

비교예 11과 동일하게 진행하되 접종 균주로 락토바실러스 플란타넘 JCC-27을 접종하였다.

<비교예 17> 발효물의 제조

비교예 11과 동일하게 진행하되 접종 균주로 락토바실러스 플란타넘 MB01을 접종하였다.

<비교예 18> 발효물의 제조

비교예 11과 동일하게 진행하되 접종 균주로 락토바실러스 플란타넘 5273을 접종하였다.

<실험예 1> DPPH 라디컬 소거 활성 측정 실험

실시예들 및 비교예들의 항산화 효과를 측정하기 위하여 DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical 소거 활성 실험을 진행하였다. 96 well plate에 시료 20 μL와 0.2 mM DPPH용액(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl radical 180 μL를 넣고 30분간 반응 후 분광광도계를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 수학식 1을 이용하여 계산하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

<수학식 1>

* DPPH radical scavenging activity (%) = (A-B)/A) X 100

A : 시료를 첨가하지 않았을 때의 흡광도

B : 시료를 첨가하였을 때의 흡광도

실험군	실험농도(단위 : ppm)
실험군	100	250	500
실시예1	22.945	40.911	63.446
비교예1	15.953	31.958	44.174
비교예2	16.425	33.241	47.351
비교예3	16.214	32.484	46.352
비교예4	17.232	34.521	47.875
비교예5	17.012	33.965	47.254
비교예6	16.489	32.891	45.591
비교예7	15.425	32.245	44.856
비교예8	17.525	34.684	44.216
비교예9	17.427	34.754	44.596
비교예10	14.563	30.584	41.356
비교예11	15.742	31.452	42.635
비교예12	15.891	31.784	42.786
비교예13	14.962	31.244	42.968
비교예14	16.254	32.965	43.562
비교예15	16.483	32.854	43.251
비교예16	15.962	31.578	42.568
비교예17	16.784	32.468	42.986
비교예18	15.892	31.549	41.597

(측정값 단위 : %, DPPH radical scavenging activity)

상기 표 1 및 도 1에 나타나 있는 바와 같이 실시예 및 비교예들 모두 항산화 효과를 가지나, 그 중에서도 실시예 1이 보다 차별화되도록 우수한 효과를 갖는 것을 확인할 수 있다.

<실험예 2> 세포 독성 실험

실시예들 및 비교예들의 세포 독성을 확인하기 위해 MTT assay를 진행하였다. 96-well plate에 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것)에 희석된 섬유아세포(fibroblast)를 1 x 10⁵ cells/mL개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 시료들을 계열 희석하여 각 웰에 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 5 mg/ml의 농도로 녹여진 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 용액을 각 웰에 20 μL를 넣은 후 2시간 동안 37℃ CO₂배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 100 uL씩 넣어주었다. 1 시간동안 차광반응시켜 생성된 formazan을 완전히 용해시킨 후 마이크로플레이트 판독기에서 590 nm 흡광도를 측정하였다. 수학식 2와 같이 세포 생존율(%)을 정하였으며, 세포의 생존에 영향을 미치지 않는 시료의 농도를 결정하였다. 결과를 표 2 와 도 2 에 나타내었다.

<수학식 2>

세포생존율(%) = (sample absorbance / control absorbance)× 100

실험군	실험농도(단위 : ppm)
실험군	100	250	500
실시예1	102.472	97.665	99.954
비교예1	103.14	100.153	105.401
비교예2	102.24	103.21	105.23
비교예3	102.41	104.23	102.24
비교예4	103.25	103.33	102.24
비교예5	102.25	105.52	99.98
비교예6	103.481	104.23	100.42
비교예7	102.334	101.23	104.53
비교예8	103.24	103.56	99.985
비교예9	102.31	102.241	105.231
비교예10	104.23	102.241	104.421
비교예11	102.24	99.98	102.24
비교예12	103.33	104.42	102.25
비교예13	104.25	99.98	102.243
비교예14	103.14	99.98	102.87
비교예15	102.21	100.58	104.65
비교예16	102.23	102.42	104.23
비교예17	104.232	104.42	100.521
비교예18	102.24	102.214	104.355
untreated	100
control	104.184
Quercetin(5 um)	101.53

(측정값 단위 : %, 세포생존율)

상기 표 2 및 도 2를 살펴보면 알 수 있듯이 실시예 및 비교예 모두 세포 독성은 확인되지 않았다.

상기 결과는 상기 시료가 인체에 무해할 뿐 아니라 인체 안전성이 우수함을 시사한다.

<실험예 3> NO 생성 억제 효과 측정 실험

실시예와 비교예들의 항염효과를 측정하기 위해 RAW264.7 세포를 96 well plate에 1.0×10⁴ cells/well로 분주하여, 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 24 시간 배양하였다. 96 well plate에 계열 희석한 sample 및 자극제를 각각 처리하였다.

이때, 자극제인 LPS의 최종 농도는 1 μg/mL 되도록 하였다. 24 시간 배양완료된 세포의 상층액을 100 μL를 취하여 새로운 96 well plate에 넣어주고, Griess A와 Griess B 시약을 1:1의 비율로 섞어 각 well에 100 μL 첨가하여 상온에서 10 분간 반응시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Control은 LPS는 1 μg/mL을 처리한 세포의 O.D 값을 이용하였다. Nitric Oxide production은 수학식 3을 이용하여 계산하였다. 결과를 표 3과 도 3에 나타내었다.

<수학식 3>

Nitric Oxide production(%) = (sample absorbance / control absorbance)× 100

실험군	실험농도(단위 : ppm)
실험군	100	250	500
실시예1	88.548	77.556	58.224
비교예1	94.517	88.446	76.221
비교예2	93.452	86.52	72.312
비교예3	93.48	87.424	73.24
비교예4	93.145	85.774	71.45
비교예5	93.452	86.541	72.43
비교예6	94.24	87.469	74.342
비교예7	93.241	87.54	73.524
비교예8	92.896	86.351	72.412
비교예9	93.36	87.487	73.24
비교예10	92.88	86.954	72.145
비교예11	94.562	87.466	74.63
비교예12	95.247	88.245	75.682
비교예13	96.85	89.45	77.524
비교예14	93.45	86.38	72.542
비교예15	93.21	85.894	71.254
비교예16	94.52	87.452	73.569
비교예17	94.882	87.45	74.85
비교예18	95.87	88.142	75.78
untreated	2.641
control	100
Quercetin( 5 um)	42.117

(측정값 단위 : %, Nitric Oxide production)

NO 생성이 억제되는 것은 항염 효과가 뛰어난 것으로 평가할 수 있다.

실시예의 시료는 비교예와 비교하여 NO 생성이 효과적으로 억제되는 것을 알 수 있다.

<실험예 4> 유전자 발현 평가

염증이 유발되면 대식세포에서 염증유발인자인 사이토카인과 염증매개인자의 발현량이 증가된다.

이에 Raw 264.7세포에서 발현되는 사이토카인 중 대표적인 물질인 IL-6 와 염증매개인자인 COX-2의 변화를 Real time PCR 분석을 시행하였다.

RAW264.7 세포를 6 well plate에 4.0×10⁵ cells/well로 분주하여, 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 24시간 배양하고, 세포독성이 없는 농도로 계열 희석한 sample 및 자극제를 각각 처리하였다.

이때, 자극제인 LPS의 최종 농도가 1 μg/mL이 되도록하여 4시간 반응시켰다. 배지 상등액을 제거하고 PBS로 세척하여 NucleoZOL(Macherey-nagel, Germany) 500 μL로 용해한 후, 멸균증류수 200 μL를 첨가하여 15 분간 원심분리한 후 상층액 500 μL을 새로운 튜브에 옮겨주고, 이소프로판올 500 μL를 넣어주어 10 분간 원심분리하고, 상층액을 제거한 후 75% 에탄올을 첨가하여 5 분간 원심분리하였다.

이어 상층액을 제거하여 상온에서 건조시킨 뒤 디에틸피로카보네이트-증류수(DEPC-DW)를 50 μL씩 분주하여 용해시켜 분광광도계를 이용하여 RNA 정량하였다.

HiSenScriptTM RH(-) RT PreMix Kit를 이용하여 정량된 RNA 1 μg과 DEPC-DW를 넣어 혼합하여 총 볼륨이 20 μL가 되도록 한 다음 42℃ 30 분, 85℃ 10 분, 4℃ ∞조건으로 cDNA 합성하였다.

합성된 상보적DNA(cDNA)는 2xReal-Time PCR Master Mix, BioFACT) 10 μL, cDNA 1 μL, Forward primer(10 pmole/μL) 1 μL, Reverse primer(10 pmole/μL) 1 μL와 DEPC-DW를 넣어 혼합하여 총 볼륨이 20 μL가 되도록 하였다.

관련 유전자 primer 정보는 표 4와 같으며, COX-2의 결과를 표 5와 도 4에 나타내었고, IL-6의 결과를 표 6과 도 6에 나타내었다.

Name	size (bp)	Forwar primer	Reverse primer
IL-6	134	5'-CCGGAGAGGAGACTTCACAGG-3'	5'-CAGAATTGCCATTGCACAAC-3'
COX-2	861	5'-GGAGAGACTATCAAGATAGT-3'	5'-ATGGTCAGTAGACTTTTACA-3'
β-actin	349	5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3'	5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'

실험군	실험농도(단위 : ppm)
실험군	100	250	500
실시예1	87.27	69.44	53.23
비교예1	93.46	79.51	69.78
비교예2	93.58	80.48	67.52
비교예3	94.52	81.24	71.25
비교예4	93.12	78.48	68.52
비교예5	93.52	79.54	69.145
비교예6	93.623	80.52	67.985
비교예7	93.214	79.56	68.524
비교예8	92.98	78.542	67.851
비교예9	93.68	80.653	70.245
비교예10	93.741	80.421	69.43
비교예11	94.25	81.63	71.241
비교예12	94.12	80.241	69.452
비교예13	93.145	80.465	69.87
비교예14	93.896	80.459	70.58
비교예15	92.98	79.426	68.97
비교예16	93.45	80.459	70.45
비교예17	93.87	80.652	69.485
비교예18	93.56	79.68	68.352
untreated	3.56
control	100
Quercetin( 20 um)	19.22

실험군	실험농도(단위 : ppm)
실험군	100	250	500
실시예1	89.55	80.17	68.56
비교예1	97.88	89.22	78.23
비교예2	97.25	88.31	76.42
비교예3	97.48	89.48	77.45
비교예4	98.25	90.12	78.04
비교예5	97.96	88.67	78.22
비교예6	98.45	90.04	80.24
비교예7	98.42	89.99	80.11
비교예8	98.46	90.14	80.59
비교예9	97.99	89.88	80.42
비교예10	97.52	88.96	79.99
비교예11	97.56	90.04	80.52
비교예12	98.55	90.45	80.11
비교예13	98.76	90.52	79.95
비교예14	98.14	90.14	79.86
비교예15	98.43	90.24	78.96
비교예16	98.42	91.45	80.24
비교예17	97.53	90.54	79.88
비교예18	97.42	90.68	80.11
untreated	7.55
control	100
Quercetin( 20 um)	24.67

상기 표 5, 6 및 도 4, 5를 보면 알 수 있듯이 사이토카인 IL-6 및 염증매개인자인 COX-2의 mRNA 발현이 실시예 1의 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다.

이와 같은 결과는 실시예 1의 조성물이 염증에 탁월한 효과를 나타낼 수 있음을 입증한다.

<실험예 5> 피부염 개선 효과 평가

상기 실시예 1에서 수득한, 매화꽃으로부터 분리한 락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A를 당광나무 열매 추출액에 접종 및 배양하고 유산균체와 침전물을 제거 및 여과하여 수득한 발효물을 원료로 하여 화장료를 제조한 후, 해당 화장료에 대하여 비교예들과 비교실험을 행하여 피부염 개선 효과를 평가하였다.

20 내지 60세의 여성 중 선정된 190명에 대하여 아래 표 7의 조성으로 제조된 화장료를 적용하고 피부염 개선 정도를 평가하였다.

유사한 피부염 증상을 나타내는 여성 190명에 대하여 10명씩 19개 조로 나누고 제형화된 화장료를 온도 24 내지 26℃, 습도 75% 조건에서 매일 2회씩 12주간 안면에 전체에 도포시켰다.

시험을 종료한 시점에 시험 대상자들로 하여금 설문지를 작성하게 하여 주관적인 효능 평가를 실시하였다. 설문에서는 피부염의 증상을 소양감, 건조함, 각질 발생, 비듬, 홍반, 부어오름, 피부균열, 진물과 습진 및 태선화본으로 나누고, 상기 증상이 있는 경우 각각의 증상에 대하여 개선 정도 를 평가한 후 이를 평균하여 피부염 증상 개선 효과를 개인별로 평가하였다.

원료	조성
정제수	잔량
글리세린	9
베타글루칸	4.5
카보머	0.1
스테아린산 콜레스테롤	2.5
스쿠알란	3
세테아릴 알코올	6
폴리옥시에틸렌알콜에스테르	3
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	8
당광나무 추출물 (실시예 또는 비교예)	1
프로필렌글리콜	5
합계	100

주)단위: 중량%

실험군	현저히 개선(명)	약간의 개선(명)	개선 없음(명)
실시예1	6	3	1
비교예1	2	2	6
비교예2	2	3	5
비교예3	3	1	6
비교예4	2	2	6
비교예5	1	3	6
비교예6	1	2	7
비교예7	2	2	6
비교예8	2	1	7
비교예9	2	2	6
비교예10	1	2	7
비교예11	0	3	7
비교예12	2	2	6
비교예13	2	3	5
비교예14	3	1	6
비교예15	0	2	8
비교예16	1	0	9
비교예17	1	2	7
비교예18	2	1	7

상기 표 8에 나타난 바와 같이 실시예의 화장료를 사용하였을 때 비교예들에 비해 피부염 개선 효과가 더욱 향상된 것을 알 수 있다.

<실험예 6> 냄새에 대한 관능 평가

상기 실험예 5에서 제조된 화장료 조성물들을 1달 동안 실온에 경과시킨 후 1달이 경과된 화장료 조성물들에 대해 연령별 5명씩 20 대 ~ 50대 여성을 선별한 후, 냄새에 관한 관능평가를 5점 평점법으로 실시하여 그 결과를 표 9에 나타냈다.

실험군	평점
실시예1	4.4
비교예1	1.1
비교예2	2.1
비교예3	2.2
비교예4	1.5
비교예5	2.4
비교예6	2.2
비교예7	2.3
비교예8	2.7
비교예9	1.5
비교예10	1.1
비교예11	2.3
비교예12	2.5
비교예13	2.2
비교예14	2.2
비교예15	2.1
비교예16	1.2
비교예17	2.4
비교예18	2.1

<0: 냄새가 나쁨, 4: 냄새가 좋음>

당광나무 열매는 특유의 냄새가 있어 그 자체로만으로는 화장료 조성물에 적합하지 않고 냄새를 억제하거나 중화시키는 다른 성분이 포함되도록 조성되는 것이 일반적이다.

뿐만 아니라 통상적으로 유산균이 포함된 화장료 조성물의 경우 제조 직후는 물론, 시간이 경과하면서 좋은 냄새가 나지 않는 문제점이 있다.

상기 표에서 비교예들의 실험 결과를 보면 당광나무 열매의 특유의 향과, 유산균 접종 및 배양에 따른 특유의 향이 처리되지 못한 것을 알 수 있다.

반면, 실시예 1의 경우 냄새가 좋게 느껴지는 것을 알 수 있는 바, 본 발명에 따른 신규 균주의 접종 배양시 냄새가 좋게 해주는 것을 알 수 있다.

<실험예 7> 냄새 변화 관찰 실험

상기 실험예 5에서 제조된 화장료 조성물들을 용기에 넣은 다음, 제조 직후의 냄새를 인지시킨 다음, 2달 간격으로 10개월 동안 샘플당 5명의 피검자에게 내용물을 육안, 후각 을 이용하여 변질 여부를 확인하여 평균을 산출하였으며, 그 결과를 표 10에 나타냈다.

실험군	경과 기일(월)
실험군	2	4	6	8	10	12
실시예1	0	0	0	0	1	1
비교예1	0	0	1	1	2	2
비교예2	0	1	2	2	2	2
비교예3	0	0	1	1	2	2
비교예4	0	0	0	1	1	2
비교예5	0	0	1	1	2	2
비교예6	0	1	1	2	2	2
비교예7	0	1	2	2	2	2
비교예8	0	0	1	2	2	2
비교예9	0	0	1	2	2	2
비교예10	1	1	2	2	2	2
비교예11	0	0	1	1	2	2
비교예12	0	1	1	2	2	2
비교예13	1	1	2	2	2	2
비교예14	0	1	1	2	2	2
비교예15	1	2	2	2	2	2
비교예16	0	1	1	1	2	2
비교예17	0	1	1	2	2	2
비교예18	0	1	1	2	2	2

<0: 냄새 변화 없음, 1: 냄새가 조금 변함, 2: 냄새가 많이 변함>

상기 실험 결과 실시예의 제품의 경우 10개월 경과 후에서야 냄새가 조금 변한 반면, 비교예들의 경우 짧게는 2개월부터, 늦게는 6개월 경과 후부터 냄새 변화가 발생한 것으로 나타나, 변질 속도가 빠른 것을 알 수 있었다.

이상 설명된 본 발명의 화장료용 발효 추출물은 상기 실험예 5외의 제조예 외에도 다음과 같은 여러 제형으로 제조될 수 있다.

제조예 1 : 본 발명의 추출물을 함유하는 침적 마스크액 제조

정제수 89.73g에 글리세린 5g, 부틸렌글라이콜 3g, 카보머 0.1g, 다이소듐이디티에이 0.02g, 트로메타민 0.15g, 피이지-60하이드로제네이티드캐스터오일 0.4g, 향료 0.1g, 페녹시에탄올 0.5g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합하였다.

실시예 1에서 수득한 본 발명의 발효 추출물 1g을 상기 혼합액에 첨가한 후 교반하여 침적 마스크액을 얻었다.

제조예 2 : 본 발명의 추출물을 함유한 유액 제조

세틸알콜1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰 부가)모노올레이트 1g을 70℃에서 가열 및 혼합하여 용해하고, 글리세린 2g, 부틸렌글라이콜 3g, 다이소듐이디티에이 0.02g, 카보머 0.1g, 정제수 78.43g을 75℃로 가열해서 용해하였다.

양자를 혼합하여 유화시킨 후 트로메타민 0.15g을 혼합하고, 냉각하면서 실시예 1에서 수득한 본 발명의 발효 추출물 0.5g, 페녹시에탄올 0.5g, 향료 0.1g을 첨가하여 수중유(O/W)형의 유액을 얻었다.

제조예 3 : 본 발명의 추출물을 함유한 미용액 제조

정제수 81.3g에 글리세린 5g, 부틸렌글라이콜 10g, 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히아루론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 페녹시에탄올 0.5g, 향료 0.1g, 실시예 1에서 수득한 본 발명의 발효 추출물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 미용액을 얻었다.

제조예 4 : 본 발명의 추출물을 함유한 하이드로겔 제조

정제수 84.78g에 글리세린 10g, 부틸렌글라이콜 2g, 카라기난 1g, 아가 0.5g, 캐롭검 0.5g, 히아루론산나트륨 0.1g, 씨트릭애씨드 0.02g, 감초산 나트륨 0.2g, 페녹시에탄올 0.5g, 향료 0.1g, 실시예 1에서 수득한 본 발명의 발효 추출물 0.3g을 혼합하여 하이드로겔을 얻었다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국생명공학연구원

KCTC14594BP

20210603

<110> J2KBIO CO., LTD. <120> Fermentation Extract for cosmetic composition using Lactobacillus plantarum KOVA-21A strain and extract of Ligustrum Lucidum fruit and manufacturing method thereof <130> KOVA-21A <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 792 <212> RNA <213> Lactobacillus plantarum <400> 1 ttacatttga gtgagtggcg aactggtgag taacacgtgg gaaacctgcc cagaagcggg 60 ggataacacc tggaaacaga tgctaatacc gcataacaac ttggaccgca tggtccgagc 120 ttgaaagatg gcttcggcta tcacttttgg atggtcccgc ggcgtattag ctagatggtg 180 gggtaacggc tcaccatggc aatgatacgt agccgacctg agagggcaat cggccacatt 240 gggactgaga cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg 300 acgaaagtct gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg gtttcggctc gtaaaactct 360 gttgttaaag aagaacatat ctgagagtaa ctgttcaggt attgacggta tttaaccaga 420 aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg 480 gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg gttttttaag tctgatgtga aagccttcgg 540 ctcaaccgaa gaagtgcatc ggaaactggg aaacttgagt gcagaagagg acagtggaac 600 tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat atggaagaac accagtggcg aaggcggctg 660 tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa agtatgggta gcaaacagga ttagataccc 720 tggtagtcca taccgtaaac gatgaatgct aagtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc 780 tgcagctaac gc 792 <210> 2 <211> 675 <212> RNA <213> Lactobacillus plantarum <400> 2 tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc agctaacgca ttaagcattc cgcctgggga 60 gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 120 tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatac tatgcaaatc 180 taagagatta gacgttccct tcggggacat ggatacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 240 tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatt atcagttgcc 300 agcattaagt tgggcactct ggtgagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 360 acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggatggtaca 420 acgagttgcg aactcgcgag agtaagctaa tctcttaaag ccattctcag ttcggattgt 480 aggctgcaac tcgcctacat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 540 gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgagagt ttgtaacacc 600 caaagtcggt ggggtaacct tttaggaacc agccgcctaa ggtgggacag atgattaggg 660 tgaagtcgta acagg 675

Claims

화장료용 발효 추출물을 제조 방법에 있어서,
당광나무 열매를 추출하여 추출물을 수득하고,
상기 추출물에 매화꽃으로부터 분리된 기탁번호 KCTC 14594BP의 신규한 락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A 유산균 균주를 접종하여 발효시킨 후, 침전물과 유산균체를 제거하여 발효 추출물을 제조하는 것을 특징으로 하는,
락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A 균주와 당광나무 열매 추출물을 이용한 화장료용 발효 추출물의 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 당광나무 추출물은 추출물 원료에 정제수를 혼합한 다음 85 ~ 95℃의 온도로 2 ~4시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는,
락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A 균주와 당광나무 열매 추출물을 이용한 화장료용 발효 추출물의 제조 방법.
화장료용 발효 추출물에 있어서,
제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항의 제조 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는,
락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A 균주와 당광나무 열매 추출물을 이용한 화장료용 발효 추출물.
제 3항에 있어서,
상기 발효 추출물은 염증유발인자인 사이토카인 IL-6와 염증매개인자인 COX-2의 mRNA 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는,
락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A 균주와 당광나무 열매 추출물을 이용한 화장료용 발효 추출물.
제 3항에 있어서,
상기 발효 추출물은 NO(Nitric Oxide)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는,
락토바실러스 플란타넘 KOVA-21A 균주와 당광나무 열매 추출물을 이용한 화장료용 발효 추출물.