KR101778753B1 - 노보자임 33095(Novozym 33095) 효소를 이용한 메이신을 포함하는 옥수수 수염 추출물의 제조방법 - Google Patents

노보자임 33095(Novozym 33095) 효소를 이용한 메이신을 포함하는 옥수수 수염 추출물의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 옥수수 수염 추출물에 노보자임 33095(Novozym 33095) 효소를 처리하는 단계를 포함하는 메이신(maysin)의 함량이 증대된 옥수수 수염 추출물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법으로 제조된 옥수수 수염 추출물은 메이신의 함량이 증대될 뿐 아니라, 증가된 항산화능 및 미백 효과를 가진다.

Description

노보자임 33095(Novozym 33095) 효소를 이용한 메이신을 포함하는 옥수수 수염 추출물의 제조방법{Method for preparation of extracts of corn silk comprising maysin using Novozym 33095}
본 발명은 노보자임 33095(Novozym 33095) 효소를 이용한 메이신의 함량이 증대된 옥수수 수염 추출물의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 옥수수 수염 추출물 및 상기 효소를 포함하는 메이신 제조용 조성물, 미백용 화장료 조성물, 및 항산화용 화장료 조성물에 관한 것이다.
옥수수는 북미를 비롯한 전세계에서 재배되는 포이풀과의 1년생초본으로, 열대 미주지역이 원산지이며, 1~3m 크기로 자란다. 옥수수의 꽃술인 옥수수 수염은 생약명으로 옥미수라고 하며 '옥촉수(玉蜀鬚)' 또는 '옥촉서예'라고 부르기도 한다. 맛은 달고 담담하며 약리효과가 뛰어나 약용으로 널리 이용되는데, 식품 또는 식품첨가물, 향료로도 널리 활용되고 있다.
특히, 옥수수 수염은 고혈압, 강혈당, 토혈, 지혈 등에 효능이 있는 것으로 종래에 보고되어 왔으며, 특히, 이뇨작용, 당뇨 억제 효과, COX-2 저해 효과, 간보호 효과 등이 있는 것으로 보고되었다.
이러한 옥수수 수염에는 다양한 플라보노이드 및 안토시아닌이 포함된 것으로 알려져 있는데, 최근에는 옥수수 수염 유래 플로보노이드의 일종인 메이신(maysin)의 항산화 효능에 주목하여, 옥수수 수염으로부터 메이신을 고수율로 얻을 수 있는 연구가 활발하게 진행되고 있다(대한민국 공개특허 제10-2015-0057084호).
그러나, 종래의 메이신 추출을 위한 옥수수 열수 추출의 경우, 추출물에 함유된 메이신의 변형, 파괴 등으로 항산화 효과 등이 현저히 저하되는 문제점이 있었다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 생리 활성이 증진되고 메이신의 함량이 증대된 옥수수 추출물을 제조하기 위하여 예의 노력한 결과, 노보자임 33095 효소를 옥수수 수염 추출물에 처리함으로써, 상기 옥수수 수염 추출물에 포함된 메이신의 함량을 현저히 증대시키는 동시에 생리활성을 증진시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 옥수수 수염 추출물에 노보자임 33095(Novozym 33095) 효소를 처리하는 단계를 포함하는 메이신(maysin)의 함량이 증대된 옥수수 수염 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 옥수수 수염 추출물 및 노보자임 33095(Novozym 33095) 효소를 포함하는 메이신(maysin) 제조용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 옥수수 수염 추출물에 노보자임 33095(Novozym 33095) 효소를 처리하는 단계를 포함하는 메이신의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 옥수수 수염 추출물 및 노보자임 33095(Novozym 33095) 효소를 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 옥수수 수염 추출물 및 노보자임 33095(Novozym 33095) 효소를 포함하는 항산화용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 양태는 옥수수 수염 추출물에 노보자임 33095 효소를 처리하는 단계를 포함하는 메이신(maysin)의 함량이 증대된 옥수수 수염 추출물의 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 옥수수 수염 추출물은 에탄올로 추출한 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 80 내지 90 %의 에탄올 농도로, 또는 50 내지 60 ℃에서 2 내지 3 시간 동안 추출한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, “추출물”은 옥수수로부터 용매를 사용하여 수득한 추출물을 의미한다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 추출물은, 추출 처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나를 포함하는 것으로 한다. 상기 용매는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, 증류수, 알코올 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으며, 알코올을 용매로 사용하는 경우에는 보다 바람직하게는 C1 내지 C4의 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올)을 사용할 수 있으나, 구체적으로는 에탄올일 수 있다.
또한, 상기 추출물은 분획물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어. “분획물”은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다. 본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 옥수수를 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데에 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 증류수, 알코올 등의 극성 용매; 헥산(Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메탄(Dichloromethane) 등의 비극성 용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 분획 용매 중 알코올을 사용하는 경우에는 바람직하게는 C1 내지 C4의 알코올을 사용할 수 있다.
상기 추출물에 있어서, 옥수수는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 옥수수 수염 추출물을 에탄올농도 83.1%, 추출온도 52.7℃, 추출시간 2.6 시간의 조건 하에서 제조하여, 노보자임 33095 효소 처리에 의한 메이신 함량 증대 효과를 확인하였다(실시예 1).
본 발명의 용어, "노보자임 33095(Novozym 33095) 효소"는 노보자임 사의 펙틴 분해 효소 제제로서, 펙틴 리아제(pectin lyase) 활성을 지니는 것으로 알려졌으나, 상기 효소의 처리로 펙틴이 아닌 플라보노이드의 일종인 옥수수 수염 유래 메이신 함량을 증대시킬 수 있음은 아직까지 공지된 바 없다.
본 발명의 제조방법으로 제조된 옥수수 추출물은 상기 노보자임 33095 효소의 처리로 메이신의 함량이 증대되고 생리활성이 증진된 효과를 가진다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 노보자임 33095 효소를 처리한 옥수수 추출물이 상기 효소를 처리하지 않은 대조구에 비하여 총 폴리페놀 함량의 최대 179% 증대, 메이신 함량의 최대 401% 증대됨에 따라, DPPH 라디컬 소거능의 131% 향상, 및 티로시나제 활성의 최대 151% 억제 효과가 있는 것을 확인하였다(실시예 2).
본 발명의 용어, “메이신(maysin)”은 플라보노이드의 일종으로, 항산화 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 제조방법으로 제조된 옥수수 추출물은 상기 메이신의 함량이 증대될 뿐 아니라, 메이신에 의한 항산화능 및 미백 효능 향상의 효과도 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 메이신의 함량이 증대된 옥수수 추출물을 제조하기 위하여, 노보자임 33095 효소의 최적화된 처리 조건을 규명하였다(실시예 3).
구체적으로, 상기 옥수수 수염 추출물에 노보자임 33095 효소를 처리하는 단계는 노보자임 33095를 0.01 내지 0.5 mL/100 L의 농도로 처리하는 것일 수 있고, 더욱 구체적으로, 상기 효소를 0.01 내지 0.5 mL/100 L의 농도로 20 내지 60 ℃에서 60분 내지 120분 동안 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 중심합성계획을 이용한 실험 설계를 통해 노보자임 33095의 최적의 처리 조건은 0.11 mL/100g의 효소 농도, 20 ℃의 반응 온도, 2 시간의 반응 시간임을 확인하였다. 상기 조건하에서 제조된 옥수수 추출물의 총 폴리페놀 함량, 메이신 함량, DPPH 라디컬 소거능, 및 티로시나제 활성 저해 효과는 각각 5462.26 mg/100g, 3932.03 mg/100g, 3213.64 mg/100g, 87.57%, 75.78% 이었고 전반적인 만족도(overall desirability)는 0.73임을 확인하였다(실시예 4).
본 발명의 다른 양태는 옥수수 수염 추출물 및 노보자임 33095 효소를 포함하는, 메이신(maysin) 제조용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, “옥수수 수염 추출물”, “노보자임 33095(Novozym 33095) 효소”, 및 “메이신(maysin)”은 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 용어, “메이신 제조용 조성물”은 옥수수 수염 추출물 및 노보자임 33095 효소를 포함하여, 상기 효소가 상기 추출물에 처리되어 옥수수 수염 추출물에 포함된 메이신의 함량을 증대시킬 수 있다. 상기 조성물은 메이신을 분리할 수 있는 구성을 추가적으로 포함하여, 함량이 증대된 메이신을 옥수수 추출물로부터 분리하여 메이신을 제조할 수 있다. 메이신의 분리는 당업자가 용이하게 채택할 수 있는 방법에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 옥수수 수염 추출물에 노보자임 33095 효소를 처리하는 단계를 포함하는 메이신의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 용어, “옥수수 수염 추출물”, “노보자임 33095(Novozym 33095) 효소”, 및 “메이신(maysin)”은 상기에서 설명한 바와 동일하다.
구체적으로, 본 발명의 메이신의 제조방법은 크로마토그래피에 의해 메이신을 분리하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, “메이신의 분리”는 당업자가 용이하게 채택할 수 있는 방법이면 제한 없이 포함될 수 있으나, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피, 고성능 분취 액체크로마토그래피 등일 수 있다. 크로마토그래피를 위한 전개 용매는 n-헥산, 클로로포름, 메탄올, 물 또는 이의 혼합 용매 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태는 옥수수 수염 추출물 및 노보자임 33095 효소를 포함하는, 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, “옥수수 수염 추출물”, 및 “노보자임 33095 효소”는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 용어, “미백”은 멜라닌의 합성을 저해하여 멜라닌의 피부 침착을 억제하거나 방지하는 모든 작용을 의미하며, 구체적으로는 멜라닌의 생성에 관여하는 티로시나아제의 활성을 저해하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 노보자임 33095 효소를 처리한 옥수수 추출물이 상기 효소를 처리하지 않은 대조구에 비하여 티로시나아제 활성이 저해되는 것을 확인하였다.
본 발명의 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군에서 선택되는 제형을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 옥수수 수염 추출물 및 노보자임 33095 효소를 포함하는 항산화 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, “옥수수 수염 추출물”, “노보자임 33095 효소”, 및 “메이신(maysin)”은 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 용어, “항산화”는 좁은 범위로는 체내에서 생성되는 자유 라디칼, 상기 자유 라디컬로부터 생성되는 과산화수소 또는 과산화물, 상기 과산화수소로부터 생성되는 하이드록시 라디컬의 생성 또는 반응을 억제, 감소 또는 제어하는 작용을 의미하고, 넓은 범위로는 자연계에서 발생하는 산화반응의 생성을 억제, 감소 또는 제어하는 작용을 의미한다. 구체적으로는 옥수수 추출물에 포함된 메이신의 DPPH 라디컬 소거능에 의한 항산화 작용을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는 노보자임 33095 효소를 처리한 옥수수 추출물이 상기 효소를 처리하지 않은 대조구에 비하여 DDPH 라디컬 소거능이 향상되는 것을 확인하였다.
본 발명의 용어, “화장료 조성물”은 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명은 노보자임 33095 효소를 옥수수 수염 추출물에 처리함으로써, 메이신의 함량이 증대된 옥수수 추출물을 제공한다. 상기 옥수수 추출물은 메이신의 함량이 증대되어, 미백 및 항산화 효과를 가질 수 있다.
도 1은 노보자임 33095 효소 처리에 의한 총 페놀 함량(mg/100g)의 반응표면 등고선을 나타낸 것이다(반응 시간, A: 60분, B: 90분, C: 120분; 반응 온도, D: 20℃, E: 40℃, F: 60℃; 효소 농도, G: 0.05mL/100L, H: 0.15mL/100L, I: 0.25mL/100L).
도 2는 노보자임 33095 효소 처리에 의한 메이신 함량(mg/100g)의 반응표면 등고선을 나타낸 것이다 (반응 시간, A: 60분, B: 90분, C: 120분; 반응 온도, D: 20℃, E: 40℃, F: 60℃; 효소 농도, G: 0.05mL/100L, H: 0.15mL/100L, I: 0.25mL/100L).
도 3은 노보자임 33095 효소 처리에 의한 DPPH 라디컬 소거능(%)의 반응표면 등고선을 나타낸 것이다 (반응 시간, A: 60분, B: 90분, C: 120분; 반응 온도, D: 20℃, E: 40℃, F: 60℃; 효소 농도, G: 0.05mL/100L, H: 0.15mL/100L, I: 0.25mL/100L)..
도 4는 노보자임 33095 효소 처리에 의한 티로시나제 활성 저해 효과(%)의 반응표면 등고선을 나타낸 것이다 (반응 시간, A: 60분, B: 90분, C: 120분; 반응 온도, D: 20℃, E: 40℃, F: 60℃; 효소 농도, G: 0.05mL/100L, H: 0.15mL/100L, I: 0.25mL/100L)..
도 5는 옥수수 추출물의 노보자임 33095 효소 처리의 다중반응표면의 최적화를 나타낸 것이다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 옥수수 수염 추출물의 제조
본 발명자는 옥수수 수염 추출물을 에탄올농도 83.1%, 추출온도 52.7℃, 추출시간 2.6시간의 조건 하에서 제조하였고, 이를 이용하여 노보자임 33095 효소를 이용한, 메이신(maysin) 함량 증대를 위한 최적의 효소 처리 공정을 개발하였다.
상기 추출물을 진공회전농축기(BUCHI rotavapor R-124 and BUCHI water bath B-480, Flawil, Switzerland)를 이용하여 40℃에서 감압 농축하여 조출물을 제조하였다. 이후, -50℃에서 동결건조(Ilshin Biobase, KOREA)하고 10%(w/v) 에탄올에 완전히 녹여 시료로 사용하였다.
메이신의 수율 및 생리활성 향상을 도모하고자, 상기 시료에 노보자임 사(Bagsvaerd, Denmark)의 노보자임 33095 (Novozym 33095, 10,000 pectin transeliminase unit/mL) 효소 처리를 하여 4000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 상등액을 얻은 다음, 여과지(Whatman No.2)로 여과하여 이를 분석하였다.
실시예 2. 노보자임 33095 효소 처리의 효과 검증
상기 실시예 1에서 제조한 옥수수 수염 추출물의 노보자임 33095의 효소 처리 효과를 확인하고자, 효소 농도(0.05-0.25 mL/100L), 반응온도(20 - 60 ℃)와 반응시간(60 - 120 분)에 따른 옥수수 수염 추출물의 총 폴리페놀 함량, 메이신 함량, DPPH 라디컬 소거능, 티로시나제 저해 효과를 분석하였다.
2-1. 총 폴리페놀 함량
시료에 대한 총 폴리페놀 함량의 측정은 폴린-데니스(Folin-Denis)법을 변형하여 실험하였다. 추출 시료용액 0.5mL에 증류수를 이용하여 1:10으로 희석시킨 폴린&시오칼토 페놀 시약 (Folin&Ciocalteau's phenol reagent) 3mL와 0.2% Na2CO3 용액 2.5mL를 가하여 교반하고 25℃에서 30분 정치 후 750nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 실시예에서 제조된 옥수수 수염 추출물의 총 페놀 함량은 표준검량곡선을 작성하여 옥수수 수염 건물 1g에 해당하는 갈산 (Gallic acid)의 용량(㎍)으로 나타내었다.
그 결과, 효소 무처리 시의 총 폴리페놀 함량이 3120.49 mg/100g이었는데, 효소 처리의 흥미영역 구간 실험점에서의 함량은 5258.49-5575.89 mg/100g로 나타났으며, 흥미구역 내에서의 옥수수 수염 추출물의 총 폴리페놀 함량은 대조구의 169 내지 179% 수준이었다.
이로부터, 옥수수 수염 추출물에 노보자임 33095의 처리가 폴리페놀 함량 증대에 효과적인 것을 알 수 있었다.
2-2. 메이신(Maysin) 함량
시료에 대한 메이신 함량분석은 HPLC로 분석하였고 메이신 표준물질(농진청)을 사용하여 보유 시간 (retention time)을 비교하였으며 표준시료의 피크 (peak) 면적에 의해 산출된 값을 계산하여 메이신 함량을 구하였다. 메이신을 분석하기 위한 HPLC 분석 조건은 표 1과 같다.
Figure 112015105398703-pat00001
그 결과, 효소 무처리 시의 메이신 함량은 800.67 mg/100g인 반면, 효소 처리의 흥미영역 구간 실험점에서의 범위는 2801.82 - 3213.69 mg/100g 으로 나타났으며, 흥미구역 내에서의 옥수수 추출물의 메이신 함량은 대조구의 350 내지 401 % 수준이었다.
이로부터, 옥수수 수염 추출물에 노보자임 33095의 처리가 메이신 함량을 증대시키는데 효과적인 것을 확인하였다.
2-3. DPPH 라디컬 소거능
상기 실시예에서 제조된 옥수수 추출물의 항산화 활성은 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질 (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, DPPH)의 환원에 의한 자유 라디칼 소거능력을 이용하여 측정하였다.
상기 옥수수 수염 추출 시료 용액 0.2 mL에 0.2 mM DPPH 에탄올 용액 1mL를 가하여 상온에서 30분 반응시킨 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 증류수를 이용하여 동일한 방법으로 수행하였고 각 시료에 대한 자유 라디컬 소거능(%)은 다음 식을 이용하여 계산하였다.
자유 라디컬 소거능 (%) = (1-A/B) × 100
A : 시료의 흡광도, B : 대조구의 흡광도
그 결과, 효소 무처리 시의 소거능은 66.96% 인 반면, 효소 처리의 흥미영역 구간 실험점에서의 범위는 87.20-87.90%인 것을 확인하여, 효소 처리한 옥수수 추출물의 자유 라디컬 소거능이 증대되었음을 확인하였다.
이로부터, 옥수수 수염 추출물에 노보자임 33095의 처리가 자유 라디컬 소거 능력 향상에 효과적인 것을 확인하였다.
2-4. 티로시나제(Tyrosinase)의 활성 저해
멜라닌 색소의 생성에 관여하는 효소인 티로시나제의 활성 저해 효과를 측정하여 효소 처리된 옥수수 추출물의 미백효과를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 0.2M 인산 칼륨 버퍼(potassium phosphate buffer, pH 6.5) 2.3mL에 2mM L-티로신 용액 0.4mL 및 시료 추출물 0.2mL를 혼합한 후 버섯형 티로시나제(mushroom tyrosinase, 220 unit/mL) 0.1mL 첨가하여 37℃ 수조에서 20분간 반응시킨 다음 UV-가시 분광광도계(UV-visible spectrophotometer)로 470nm에서 흡광도를 측정하였다(A).
또한, 티로시나제 활성 저해 효과의 측정을 위해 효소액 대신 증류수 0.1mL를 첨가하여 흡광도를 측정한 값(B)과 추출 시료용액 대신에 증류수 0.2mL를 첨가하여 흡광도를 측정한 값(C)을 이용하여 하기 식으로부터 계산하였다.
활성 저해 효과(%) = [1-(A-B)/C] × 100
그 결과, 효소 무처리시에는 티로시나제 활성의 저해 효과가 52.90% 인 반면, 효소 처리의 흥미영역 구간 실험점에서의 범위는 62.93-80.06 %인 것을 확인하여, 효소 처리한 옥수수 추출물의 티로시나제의 활성이 저해됨을 확인하였다.
이로부터, 옥수수 수염 추출물에 노보자임 33095의 처리가 티로시나제 활성 저해에 효과적인 것을 확인하였다.
상기 총 폴리페놀 함량, 메이신 함량, DDPH 라디컬 소거능, 및 티로시나제 활성 저해 효과에 대한 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure 112015105398703-pat00002
2-5. 통계처리
통계분석은 SAS 9.3(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 프로그램을 이용하였으며 분산분석(ANOVA)한 후 p<0.05 수준에서 던컨의 중다범위검정 (Duncan's multiple range test)을 하여 처리군 간의 유의성 검정을 하였다.
실시예 3: 최적 효소 처리 공정의 실험 설계
최적 효소 처리 공정에 대한 실험설계는 중심합성계획(central composite design)을 사용하였으며, 노보자임 33095의 매뉴얼 (manual)에서 최적 활성(activity) 범위를 흥미구역으로 정하였다. 노보자임 33095에 대한 요인 세 가지로서 시료에 대한 효소농도(X1) 0.05-0.25 mL/100L, 반응온도(X2) 20-60℃, 반응시간(X3) 60-120분을 흥미구역으로 정하였으며 각 요인에 대한 수준은 표 3과 같다.
Figure 112015105398703-pat00003
각 독립 변수는 -1 내지 1 범위의 코드값(code value)을 갖도록 부호화하여 중심합성 계획에 따라 15구간으로 설정하였다(표 4).
Figure 112015105398703-pat00004
본 발명에서 반응표면분석을 위한 이차다항회귀곡선식은 아래와 같다.
Figure 112015105398703-pat00005
여기서, X는 독립변수로서 X1(효소농도), X2(반응온도), X3(반응시간)이며, Y는 종속변수(Yn)로 총 폴리페놀 함량(Y1), 총 플라보노이드 함량(Y2), 메이신 함량(Y3), DPPH 라디컬 소거능(Y4), 티로시나제 저해 효과(Y5)에 대한 값이고, Ai는 회귀계수이다.
효소처리 공정의 최적화를 위해 반응표면분석법을 사용하였으며 각 인자의 수준 변화에 따른 에탄올 추출공정의 최적화를 위하여 분산분석, 이차다항회귀곡선식 및 반응표면분석법 등의 통계방법을 이용하였고 통계분석은 SAS 9.3(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하였다.
실시예 4: 효소 처리 공정의 최적 조건 확인
4-1.이차다항회귀곡선식의 도출
상기 실시예 3에서 설정한 흥미구역 안에서 효소 농도, 반응 온도, 반응 시간에 따른 옥수수 수염 추출물의 총 폴리페놀 함량, 메이신 함량, DPPH 라디컬 소거능, 티로시나제 저해 효과에 미치는 정도를 분산 분석한 결과는 표 5와 같다.
Figure 112015105398703-pat00006
상기 표 5로부터 확인할 수 있듯이, 총 폴리페놀 함량에 미치는 요인으로는 반응 시간, 반응 온도, 효소 농도 순으로 영향이 미치는 것을 확인하였다.
또한, 메이신 함량에 미치는 요인으로는 반응 온도, 반응 시간, 효소 농도 순으로 영향이 미치는 것을 확인하였다.
DPPH 라디컬 소거능은 반응 온도, 효소 농도, 반응 시간 순으로 영향이 미치는 것을 확인하였다.
더 나아가, 티로시나제 저해 효과에서는 효소 농도, 반응 시간, 반응 온도 순으로 영향을 미치는 것을 확인하였다.
효소 농도와 반응 온도의 요인에서는 모두 5% 내에서 유의성 차이를 나타내었고, 반응 시간에서는 DPPH 라디컬 소거능을 제외한 나머지 요인에서 5% 내의 유의성 차이를 나타내었다.
더 나아가, 처리 요인의 수준에 대한 종속 변수인 총 폴리페놀 함량, 메이신 함량, DPPH 라디컬 소거능, 및 티로시나제 저해 효과를 예측하기 위하여 이차다항회귀곡선식의 회귀계수를 계산한 결과는 표 6과 같다.
Figure 112015105398703-pat00007
총 폴리페놀 함량, 메이신 함량, DPPH 라디컬 소거능, 및 티로시나제 (tyrosinase) 저해 효과에 대하여 이차다항회귀곡선식에서의 일차다항회귀(linear), 이차다항회귀(quadratic) 및 교차회귀(cross product)의 기여도를 검정하였다.
그 결과, 표 7에 나타나듯이, 총 폴리페놀 함량 및 DPPH 라디컬 소거능의 기여도는 일차다항회귀, 교차회귀, 이차다항회귀 순인 것으로 확인하였고, 메이신 함량의 기여도는 교차회귀, 이차다항회귀, 일차다항회귀 순, 티로시나제 저해 효과의 기여도는 이차다항회귀, 일차다항회귀, 교차회귀 순임을 확인하였다. 이차다항회귀곡선식 적합성 검정에서의 전회귀(total regression)는 모든 종속변수에서 5% 내의 유의성 차이를 보였다.
Figure 112015105398703-pat00008
4-2. 반응표면분석
옥수수 수염 추출물에 포함된 총 폴리페놀 함량에 미치는 노보자임 33095의 농도, 반응 온도, 및 반응시간을 반응표면분석법으로 분석한 결과는 도 1과 같다.
효소 농도 및 반응 온도에 따른 총 폴리페놀 함량변화(도 1의 A 내지 C)로부터 효소 농도가 반응 온도에 비하여 총 폴리페놀 함량변화에 더 큰 영향을 미치는 것을 확인하였다.
또한, 효소 농도와 반응 시간에 따른 총 폴리페놀 함량변화(도 1의 D 내지 F)로부터 효소 농도가 반응 시간에 비하여 총 폴리페놀 함량 변화에 더 큰 영향을 미치는 것을 확인하였다.
더 나아가, 반응 온도와 반응 시간에 따른 총 폴리페놀 함량변화(도 1의 G 내지 I)로부터 반응 온도가 반응 시간에 비하여 총 폴리페놀 함량 변화에 더 큰 영향을 미치는 것을 확인하였다.
옥수수 수염 추출물에 포함된 메이신 함량에 미치는 노보자임 33095의 농도, 반응 온도, 및 반응 시간을 반응표면분석법으로 분석한 결과는 도 2와 같다.
효소 농도와 반응 온도에 따른 메이신 함량변화(도 2의 A 내지 C)로부터 효소 농도가 반응 온도에 비하여 메이신 함량 변화에 더 큰 영향을 미치는 것을 확인하였고, 반응 시간이 60분 및 90분(도 2의 A 및 B)에서는 효소 농도가 높고 반응 온도가 낮을수록 총 메이신 함량이 높은 것을 확인하였다.
또한, 효소 농도와 반응 시간에 따른 메이신 함량 변화(도 2의 D 내지 F)로부터 효소 농도가 반응 시간에 비하여 메이신 함량변화에 더 큰 영향을 미치는 것을 확인하였다.
더 나아가, 반응 온도와 반응 시간에 따른 메이신 함량변화(도 2의 G 내지 I)로 효소 농도에 관계 없이 반응 온도가 반응 시간에 비하여 메이신 함량 변화에 더 큰 영향을 미치는 것을 확인하였다.
옥수수 수염 추출물의 DPPH 라디컬 소거능에 미치는 노보자임 33095의 농도, 반응 온도, 및 반응 시간을 반응표면분석법으로 분석한 결과는 도 3과 같다.
도 3의 A 내지 C에 나타난 효소 농도와 반응 온도에 따른 DPPH 라디컬 소거능변화로부터, 반응 시간에 관계 없이 효소 농도가 반응 온도에 비하여 DPPH 라디컬 소거능에 영향을 크게 미치는 것을 확인하였으며, 20℃ 반응 온도에서 효소 농도가 높아 질수록 DPPH 라디컬 소거능이 높게 나타났다.
도 3의 D 내지 F에 나타난 효소 농도와 반응 시간에 따른 DPPH 라디컬 소거능변화로부터, 반응 온도에 관계없이 효소 농도가 반응 시간에 비하여 DPPH 라디컬 소거능에 영향을 크게 미치는 것을 확인하였으며, 반응 온도에 관계 없이 효소 농도가 높을수록 DPPH 라디컬 소거능이 높은 것을 확인하였다.
도 3의 G 내지 I에 나타난 반응 온도와 반응 시간에 따른 DPPH 라디컬 소거능변화로부터, 효소 농도에 관계없이 반응 온도가 반응 시간에 비하여 DPPH 라디컬 소거능변화에 영향을 크게 미치는 것을 확인하였으며, 반응 온도가 낮을수록 DPPH 라디컬 소거능이 높은 것을 확인하였다.
옥수수 수염 추출물의 티로시나제 저해 효과에 미치는 노보자임 33095의 농도, 반응 온도, 및 반응 시간을 반응표면분석법으로 분석한 결과는 도 4와 같다.
도 4의 A 내지 C에 나타난 효소 농도와 반응 온도에 따른 티로시나제 활성 저해 효과로부터, 반응 시간에 관계 없이 효소 농도가 반응 온도에 비하여 티로시나제 활성 저해 효과에 영향을 크게 미치는 것을 확인하였으며, 반응 시간에 관계 없이 효소 농도와 반응 온도가 낮을수록 티로시나제 활성 저해 효과가 높은 것을 확인하였다.
도 4의 D 내지 F에 나타난 효소 농도와 반응 시간에 따른 티로시나제 활성 저해 효과로부터, 반응 온도에 관계없이 효소 농도가 반응 시간에 비해 티로시나제 활성 저해 효과에 영향을 크게 미치는 것을 확인하였다. 또한, 반응 온도에 관계없이 효소 농도가 낮을수록 티로시나제 활성 저해 효과가 높은 것을 확인하였다.
도 4의 G 내지 I에 나타난 반응 온도와 반응 시간에 따른 티로시나제 활성 저해 효과로부터, 효소 농도에 관계없이 반응 온도가 반응 시간에 비하여 티로시나제 저해 효과에 큰 영향을 미치는 것을 확인하였다.
4-3. 노보자임 33095 효소 최적 처리 조건의 결정
노보자임 33095의 효소 농도, 반응 온도, 및 반응 시간에 따른 옥수수 수염 추출물의 총 폴리페놀 함량, 메이신 함량, DPPH 라디컬 소거능, 티로시나제 저해 효과를 다중반응표면의 최적화방법으로서 만족 함수(desirability function)를 이용하여 종속변수들의 가중치를 1로 놓고 종합적으로 판단하였다(도 5).
그 결과, 노보자임 33095 효소의 최적 처리 공정 조건은 효소 농도 0.11 mL/100L, 반응 온도 20℃, 반응시간 120분의 조건이었으며, 상기 조건하에서 제조된 옥수수 추출물의 총 폴리페놀 함량, 메이신 함량, DPPH 라디컬 소거능, 및 티로시나제 활성 저해 효과는 각각 5462.26 mg/100g, 3932.03 mg/100g, 3213.64 mg/100g, 87.57%, 75.78% 임을 확인하였다. 대조구 대비 각각 전반적인 만족도(overall desirability)는 0.73이었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 옥수수 수염 추출물에 노보자임 33095(Novozym 33095) 효소를 처리하는 단계를 포함하는, 메이신(maysin)의 함량이 증대된 옥수수 수염 추출물의 제조방법으로서,
    상기 옥수수 수염 추출물은 80 내지 90 %의 에탄올 농도로, 50 내지 60 ℃에서 2 내지 3 시간 동안 추출한 것인, 옥수수 수염 추출물의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 효소를 처리하는 단계는 0.01 내지 0.5 mL/100 L의 농도로 처리하는 것인, 옥수수 수염 추출물의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 효소를 처리하는 단계는 20 내지 60 ℃에서 60 내지 120분 동안 수행하는 것인,옥수수 수염 추출물의 제조방법.
  6. 옥수수 수염 추출물 및 노보자임 33095(Novozym 33095)를 포함하는, 메이신(maysin) 제조용 조성물로서,
    상기 옥수수 수염 추출물은 80 내지 90 %의 에탄올 농도로, 50 내지 60 ℃에서 2 내지 3 시간 동안 추출한 것인, 메이신 제조용 조성물.
  7. 옥수수 수염 추출물에 노보자임 33095(Novozym 33095) 효소를 처리하는 단계를 포함하는, 메이신(maysin)의 제조방법으로서,
    상기 옥수수 수염 추출물은 80 내지 90 %의 에탄올 농도로, 50 내지 60 ℃에서 2 내지 3 시간 동안 추출한 것인, 메이신의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 크로마토그래피에 의해 메이신을 분리하는 단계를 추가적으로 포함하는, 메이신(maysin)의 제조방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
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