KR101773918B1 - 수용성 장쇄 분자를 부가한 수식 에리스로포이에틴 - Google Patents

Abstract

본 발명의 과제는, 인간 및／또는 동물에 투여함으로써, 조혈 효과가 7일이상 지속하는, 에리스로포이에틴을 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명은 수용성 장쇄 분자가 2분자 이상 부가된 에리스로포이에틴을 전(全) 에리스로포이에틴 중에 50％ 이상 함유하는 의약 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은, 수용성 장쇄 분자가 부가된 에리스로포이에틴을 함유하고 상기 수용성 장쇄 분자의 분자량이 30kDa 이상인 의약 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 수용성 장쇄 분자가 부가된 에리스로포이에틴을 함유하고 상기 수용성 장쇄 분자가 분기쇄를 갖는 의약 조성물을 제공한다.

Description

수용성 장쇄 분자를 부가한 수식 에리스로포이에틴{MODIFIED ERYTHROPOIETIN TO WHICH WATER-SOLUBLE LONG-CHAIN MOLECULE IS ADDED}

본 발명은 수용성 장쇄 분자가 부가된 에리스로포이에틴을 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다.

빈혈 개선을 위해, 조혈을 항진하는 호르몬인 에리스로포이에틴(EPO라고 기재하는 경우가 있음)이 유전자 재조합법에 의해 생산되어, 의약품으로서 빈혈증의 치료에 실적을 올리고 있다. 인간 유래 EPO에 수용성 장쇄 분자인 폴리에틸렌글리콜(PEG라고 기재하는 경우가 있음)을 부가하면, EPO의 간장에서의 대사가 저해되어 혈중 수명이 연장되는 것이 확인되고 있다(특허문헌 1). 이 혈중 체류 기간 연장 효과에 의해, 약효 지속 시간이 연장되어 투여 빈도가 적어도 된다는 이점에서, EPO에 한하지 않고 PEG 수식한 단백질 제제가 차세대의 의약품으로서 주목받고 있으며, 일부는 이미 실용화되어 있다.

단백질에 PEG 수식을 행할 경우, 부가하는 PEG의 분자량이 높을수록, 또한 부가수가 많을수록, 단백질은 대사되기 어려워지는 경향이 있다. 따라서 분자량이 큰 PEG 분자가 다수 부가된 단백질은, 체내에 투여되었을 때에 혈중 수명이 길어지는 것이 예상된다(비특허문헌 1). 한편, 수용체와 결합함으로써 생리 활성을 발현하는 EPO 등의 단백질의 경우, 부가하는 수용성 장쇄 분자의 분자량이 크고, 부가수가 많아질수록 인비트로(in vitro)에서의 생리 활성이 저하한다.

앞서 서술한 인간 유래 서열을 갖는 EPO(인간 EPO라고 기재하는 경우가 있음)를 PEG로 수식했을 경우, 52위치의 리신에 PEG가 1분자 부가한 PEG 수식 EPO(모노 PEG체라고 기재하는 경우가 있음)가, 래트(rat) 미정맥(尾靜脈) 단회 투여에 있어서의 조혈 활성(망상 적혈구의 증가를 지표)의 지속 효과가 우수하다는 보고가 있다(특허문헌 1).

한편, 현재 사용되고 있는 인간 EPO 제제는, 정맥, 피하, 근육 내 등의 경로에 투여된다. 또한 경구, 경비(經鼻) 흡수 제제 등의 고안도 이루어져 있다(특허문헌 2). 인간 EPO 제제를 혈관 내 투여하는 것은 범용성이 결여되어, 보다 간편한 투여 방법으로, 주사 후의 통증 등 환자의 부담이 적고, 게다가 약효가 지속하는 EPO 제제가 요망되고 있다.

인간에서 보고가 있는 만성 신부전 또는 화학 요법제 또는 외과 수술 등에 의해 야기되는 빈혈 증상은, 애완동물인 개나 고양이에도 보여지며, 이들 동물의 사망 원인의 대부분을 점하고 있다. 예를 들면 고양이(일본내)에서는, 1996년부터의 10년간 만성 신부전은, 0.64％에서 3.95％로 대폭 증가하고, 질병 순위도 28위에서 4위로 증가하고 있다(비특허문헌 2). 동물의 빈혈 치료에 있어서도 인간 EPO 제제가 치료에 사용되고 있다. 그러나, EPO와 같은 생리 활성 단백질은 종(種) 고유의 아미노산 서열을 가지므로, 인간 이외의 동물에게 인간 유래의 EPO 제제를 투여하면 항EPO 항체의 발현을 초래할 우려가 있다. 이 점에서, 최근 고양이나 개의 치료용으로 각각의 고유의 아미노산 서열을 갖는 EPO 제제의 실용화가 검토되고 있다.

국제공개WO02／32957 일본국 특개소62-89627

Polyethylene glycol-conjugated pharmaceutical proteins; PSTT Vol. 1, No. 8, 1998, 352-356 다마(Tama) 수의 임상 연구회 조사 보고(2006년도)

인간 및／또는 동물에 투여함으로써, 조혈 효과가 7일 이상 지속하는 것을 특징으로 하고, EPO를 유효 성분으로서 함유하는, 높은 생리 활성을 가지면서 생체 내에서의 안정성도 높은 의약 조성물을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은 EPO의 PEG에 의한 화학 수식을 상세히 검토한 결과, PEG의 부가수, 분자량 또는 구조에 의해, 조혈 효과가 7일 이상 지속하는 것을 발견하고, 본 발명에 이르렀다.

즉, 본 발명은 수용성 장쇄 분자가 2분자 이상 부가된 에리스로포이에틴을, 전(全) 에리스로포이에틴 중에 50％ 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 수용성 장쇄 분자가 부가된 에리스로포이에틴을 함유하고, 상기 수용성 장쇄 분자의 분자량이 30kDa 이상인 것을 특징으로 하는 의약 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 수용성 장쇄 분자가 부가된 에리스로포이에틴을 함유하고, 상기 수용성 장쇄 분자가 분기쇄를 갖는 것을 특징으로 하는 의약 조성물에 관한 것이다.

수용성 장쇄 분자는, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아미노산, 및 폴리프로필렌글리콜로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물인 것이 바람직하다.

인간 및／또는 동물에 있어서의 조혈 효과가 7일 이상 지속하는 것이 바람직하고, 상기 동물이 고양이과 및／또는 개과의 동물인 것이 바람직하다.

용액 또는 겔이며, 상기 용액 또는 겔의 pH가 4 이상 8 이하인 것이 바람직하다.

용액 조성이 포유 동물의 체액 침투압 및 pH와 실질적으로 동등하며, 투여시에 통증이 없는 것이 바람직하다.

에리스로포이에틴이, 인간, 고양이, 또는 개에 유래하는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 바람직하다.

에리스로포이에틴이, 이하의 (a)∼(c);

(a) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드,

(b) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 70％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드로서, BaF／EPOR 세포에 의한 세포 증식 어세이에서 에리스로포이에틴 활성을 갖는 폴리펩티드, 또는

(c) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여, 1개 또는 복수개의 아미노산을 치환, 결실, 삽입, 및／또는 부가한 폴리펩티드로서, BaF／EPOR 세포에 의한 세포 증식 어세이(assay)에서 에리스로포이에틴 활성을 갖는 폴리펩티드인 것이 바람직하다.

폴리에틸렌글리콜의 부가 부위 중 적어도 1개소는, 리신 78 잔기인 것이 바람직하다.

반복 투여해도 에리스로포이에틴에 대한 항체가 생산되지 않는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은, 상기 의약 조성물을 함유하는 빈혈 치료약, 및 조혈약에 관한 것이다.

본 발명의 의약 조성물을 인간 또는 동물에 투여함으로써, 조혈 효과가 7일 이상 지속하는 것이 가능하다. 본 발명의 의약 조성물은, 제제를 투여할 때에, 주사 후의 통증 등의 환자의 부담이 적고, 게다가 약효가 지속하는 효과를 갖는다.

도 1은 분자량 20,000의 직쇄형 PEG를 다양한 분자수 부가한 PEG 수식 고양이 EPO를 래트에 투여했을 경우의 조혈 효과의 비교.
도 2는 분자량 5,000의 직쇄형 PEG를 다양한 분자수 부가한 PEG 수식 고양이 EPO를 래트에 투여했을 경우의 조혈 효과의 비교(대조 : 분자량 20,000의 직쇄형 PEG를 1분자 부가한 모노 PEG화 고양이 EPO).
도 3은 분자량 40,000의 직쇄형 PEG를 1 및 2분자 부가한 PEG 수식 고양이 EPO를 래트에 투여했을 경우의 조혈 효과의 비교(대조 : 분자량 20,000의 직쇄형 PEG를 1분자 부가한 모노 PEG화 고양이 EPO).
도 4는 분자량 20,000의 분기형 PEG를 1 및 2분자 부가한 PEG 수식 고양이 EPO를 래트에 투여했을 경우의 조혈 효과의 비교(대조 : 분자량 20,000의 직쇄형 PEG를 1분자 부가한 모노 PEG화 고양이 EPO).

1. 본 발명은 3개의 의약 조성물에 관한 것이다.

제1 본 발명은, 수용성 장쇄 분자가 2분자 이상 부가된 에리스로포이에틴(EPO라고 기재하는 경우가 있음)을, 전 에리스로포이에틴 중에 50％ 이상 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다.

제1 본 발명에 있어서, EPO에 부가되는 수용성 장쇄 분자의 수는 2분자 이상이며, 2분자인 것이 바람직하다. 수용성 장쇄 분자가 1분자 부가된 EPO를 더 함유해도 되지만, 조혈 효과의 지속성의 관점에서, 수용성 장쇄 분자가 2분자 이상 부가된 EPO의, 전 EPO 중의 함유량은 주성분인 것이 바람직하고, 50％ 이상인 것이 보다 바람직하며, 70％ 이상인 것이 더 바람직하다.

여기에서, 수용성 장쇄 분자가 2분자 이상 부가된 EPO의, 전 EPO 중의 함유량은, SDS-PAGE로 분획 후, 형광 염색에 의해 얻어지는 밴드의 형광 강도를 측정함으로써 산출된다.

수용성 장쇄 분자가 2분자 이상 부가된 EPO가 전 EPO 중의 주성분이라는 것은, 수용성 장쇄 분자가 2분자 이상 부가된 EPO가 SDS-PAGE에 있어서 가장 짙은 밴드를 나타내는 것을 말한다. 여기에서, SDS-PAGE에 있어서 가장 짙은 밴드를 나타낸다는 것은, SDS-PAGE에 의해 전기 영동한 시료에 함유되는 단백질을 예를 들면SYPRO Ruby 등을 이용한 형광 염색법으로 검출했을 때에, 수용성 장쇄 분자가 2분자 이상 부가된 EPO에 유래하는 시그널 강도가, 다른 시그널 강도보다도 높은 것을 말한다.

수용성 장쇄 분자가 2분자 이상 부가된 EPO가 전 EPO 중의 주성분인 것은, HPLC에 의해 확인하는 것도 가능하다. 예를 들면 YMC Pack Diol-200(가부시키가이샤YMC제) 등의 칼럼을 통과하는 시료를, 흡광도 측정에 의해 검출하고, 수용성 장쇄 분자가 2분자 이상 부가된 EPO에 유래하는 시그널 강도가, 다른 시그널 강도보다도 높은 것에 의해 확인할 수 있다.

조혈 효과의 지속성의 관점에서, 수용성 장쇄 분자의 분자량은 10kDa 이상인 것이 바람직하고, 20kDa 이상인 것이 보다 바람직하다. 5kDa 미만에서는 조혈 효과가 지속하지 않게 되는 경향이 있다.

또한, 제2 본 발명은 수용성 장쇄 분자가 부가된 EPO를 함유하고, 상기 수용성 장쇄 분자의 분자량이 30kDa 이상인 의약 조성물에 관한 것이다.

제2 본 발명에 있어서, EPO에 부가되는 수용성 장쇄 분자의 수는 특별히 한정되지 않고, 1분자여도 되고, 2분자 이상이어도 된다.

조혈 효과의 지속성의 관점에서, 수용성 장쇄 분자의 분자량은 30kDa 이상인 것이 바람직하고, 40kDa 이상인 것이 보다 바람직하다. 20kDa 미만에서는 조혈 효과가 지속하지 않게 되는 경향이 있다.

또한, 제3 본 발명은 수용성 장쇄 분자가 부가된 EPO를 함유하고, 상기 수용성 장쇄 분자가 분기쇄를 갖는 의약 조성물에 관한 것이다. 수용성 장쇄 분자가 분기쇄를 갖는다는 것은, 분기의 가지의 수가 2 이상이며, 분기점의 수가 1 이상인 것을 말한다.

수용성 장쇄 분자가 분기쇄일 경우에는, EPO에 부가되는 수용성 장쇄 분자의 분자수는 특별히 한정되지 않는다. 부가되는 수용성 장쇄 분자의 분자수가 1분자여도, 의약 조성물을 투여했을 때의 조혈 효과가 7일간 이상 지속한다는 효과를 가져온다. 또한, 분기쇄를 갖는 PEG의 부가 방법은 일본국 특표평9-504299호 공보에 기재되어 있다.

이하에, 상기 의약 조성물에 있어서의 수용성 장쇄 분자, 투여 방법 및 효과, 용기 그리고 에리스로포이에틴에 대해서 설명한다.

2. 수용성 장쇄 분자

수용성 장쇄 분자는, 대사를 저해하고, 혈중 동태를 연장하는 목적으로 EPO에 부가한다. 수용성 장쇄 분자로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 PEG(폴리에틸렌글리콜), 폴리아미노산, 폴리프로필렌글리콜 등을 사용할 수 있다. 이들은 반응 전구체를 제작하고, 합성 반응에 의해 단백질에 부가할 수 있다. 유전자 재조합법으로 이들 분자가 결합한 단백질을 생산할 수도 있다. 이 중, PEG는 항원성이 없이 무독하기 때문에, 수식 단백질의 항원성을 저하시켜, 부작용으로서의 항EPO 항체의 발현을 억제하는 점에서도 유효하다.

일반적으로, PEG를 단백질에 공유 결합시키는 방법으로서는, 단백질, 또는 당쇄의 산화 활성 가능한 관능기인 폴리올, 락톨, 아민, 카르복시산 또는 카르복시산 유도체와의 화학 반응이 있다. 또한 설포네이트에스테르 활성화 폴리머, 예를 들면 설포네이트에스테르 활성화 PEG를 사용하는 방법 등이 있다. EPO에 부가할 경우에도 이들 방법으로 부가할 수 있다.

PEG화 반응 전구체로서는, 장쇄 분자의 편말단을 메톡시화한 것을 사용할 수 있다. 또한 메톡시화되어 있지 않은 말단을 숙신이미딜 지방산 에스테르화한 PEG가 개발되어 있으며, 그 중에서도 지방산이 프로피온산 혹은 부티르산인 것이 반응성의 점에서 바람직하다. 메톡시 PEG의 숙신이미딜프로피온산에스테르(SPA-PEG라고 칭함)를 인간 EPO와 반응시키면, 리신 잔기에 선택적으로 부가하는 것이 알려져 있다. EPO에는 복수의 리신 잔기가 존재하기 때문에, 반응이 진행됨에 따라 PEG의 부가수는 증가하여, 부가수가 상이한 이성체 혼합물이 된다.

인간 EPO를 래트 미정맥에 단회 투여한 결과에서는, 리신 52에 단일의 PEG(20kDa)가 부가한 모노 PEG체가 가장 양호한 조혈 지속 효과가 있는 것이 보고되어 있지만, EPO가 유래하는 동물종, 투여 경로에 따라 최적인 이성체, 혹은 그 혼합비는 상이하다. PEG의 부가수가 1인 PEG 수식 EPO, PEG의 부가수가 2 이상인 PEG 수식 EPO는, 각각 단독으로 투여할 수도 있지만, 혼합물로서 투여할 수도 있다.

또한 PEG를 EPO 단백질에 부가하는 부위로서는, EPO가 유래하는 종이나 반응 형식에 따라 상이한 것을 생각할 수 있지만, 복수개의 PEG가 부가할 경우에도, 적어도 1개소가, 인간 EPO의 리신 52에 대응하는 리신 잔기인 것이 바람직하다. 예를 들면 서열 번호 1로 이루어지는 고양이 EPO에 있어서는, 리신 78인 것이 바람직하다.

3. 투여 방법 및 효과

본원 발명의 EPO를 함유하는 의약 조성물은, 결과적으로 인간 및／또는 동물에 있어서의 조혈 효과가 7일 이상 지속한다.

조혈 효과는, 본 발명의 의약 조성물을 투여했을 때의 조혈 활성으로서, 적혈구 전구체인 망상 적혈구의 적혈구에 점하는 비율을 정량함으로써 지표로 할 수 있다. 망상 적혈구수는 색소 염색에 의한 도말(塗沫) 시험, 혹은 자동 혈구 계수기로 측정할 수 있다.

의약 조성물의 투여 대상은 특별히 한정되지 않고, 인간 및 인간 이외의 동물에도 투여 가능하다. 인간 이외의 동물로서는, 특별히 한정되지 않지만, 고양이과 및／또는 개과의 동물인 것이 바람직하다. 후술과 같이, 고양이 유래의 EPO를 사용할 경우, 고양이과 및 개과의 동물에 있어서는 EPO가 항원이 될 가능성이 낮아, 부작용의 발생을 회피할 수 있다.

의약 조성물의 투여 방법으로서는 특별히 한정되지 않지만, 정맥 내 투여, 피하 투여, 경구 투여, 근육 내 투여, 경피 투여, 경비 투여 등을 들 수 있다.

본 발명의 PEG 수식된 EPO는, 약리학적으로 허용되는 부형제, 붕괴제, 결합제에서 선택되는 제를 사용할 수 있다.

부형제란, 전분, 한천, 백당, 젖당, 포도당, 덱스트린, 소르비톨, 아라비아 검, 옥수수 전분, 만니톨, 결정 셀룰로오스, 레시틴, 인산칼슘, 황산칼슘을 예시할 수 있고, 이들 이외에도 제약(製藥)적으로 허용되는 부형제이면 사용할 수 있다.

붕괴제란, 전분, 한천, 시트르산칼슘, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨, 덱스트린, 결정 셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스, 트라간트이며, 이들 이외에도 제약적으로 허용되는 붕괴제이면 사용할 수 있다.

결합제란, 전분 및 그 유도체, 셀룰로오스 및 그 유도체, 아라비아 고무, 트라간트, 젤라틴, 당류, 에탄올, 폴리비닐알코올을 예시할 수 있고, 이들 이외에도 제약적으로 허용되는 결합제이면 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서의 PEG 수식된 EPO는, 안정화제, pH 조절제 및 침투압 조절제, 계면 활성제에서 선택되는 제를 사용할 수 있다.

안정화제로서 아미노산을 예시할 수 있다. 여기에서, 안정화제로서 사용하는 아미노산은, 결정이어도 아모퍼스여도 되고, 또한 이들 아미노산을 고율로 함유하는 식물, 동물 성분 등 불순물을 함유하는 것을 이용해도 된다. 결정으로서는 L체, D체 혹은 DL 혼합체를 사용할 수 있다.

pH 조절제로서는, 완충계에는, 예를 들면 아세트산／아세트산염, 말산／말산염, 시트르산／시트르산염, 타르타르산／타르타르산염, 젖산／젖산염, 인산／인산염, 글리신／글리시네이트, 트리스, 글루탐산／글루탐산염, 및 탄산나트륨으로 이루어지는 군에서 선택된 계가 포함된다. EPO를 함유하는 겔 또는 용액의 pH의 하한은 4가 바람직하고, 보다 바람직하게는 4.5이며, 더 바람직하게는 5이다. pH의 상한은 8이 바람직하고, 보다 바람직하게는 7.5이며, 더 바람직하게는 7이다.

침투압 조절제로서는, 염류, 당류, 알코올류, 및 아미노산류를 함유하지만, 이들에 한하지 않는다. 특히 염화나트륨, 다가 알코올류, 1가 알코올류, 단당류, 이당류, 올리고당 및 아미노산류 또한 그들 유도체 등을 호적(好適)하게 사용할 수 있다.

상기의 다가 알코올류로서는, 예를 들면 글리세린 등의 3가 알코올류, 아라비톨, 자일리톨, 아도니톨 등의 5가 알코올류, 만니톨, 소르비톨, 덜시톨 등의 6가 알코올류 등을 사용할 수 있다. 그 중에서도 6가 알코올류가 바람직하고, 특히 만니톨이 호적하다.

상기의 1가 알코올류로서는, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올 등을 들 수 있고, 이 중 에탄올이 바람직하다.

상기의 단당류로서는, 예를 들면 아라비노스, 자일로스, 리보스, 2-데옥시리보스 등의 5탄당류, 포도당, 과당, 갈락토오스, 만노스, 소르보스, 람노스, 푸코스 등의 6탄당류가 사용되고, 이 중 6탄당류가 바람직하다.

상기의 올리고당으로서는, 예를 들면 말토트리오스, 라피노스당 등의 3당류, 스타키오스 등의 4당류 등이 사용되고, 이 중 3당류가 바람직하다.

상기의 단당류, 이당류 및 올리고당의 유도체로서는, 예를 들면 글루코사민, 갈락토사민, 글루쿠론산, 갈락투론산 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 PEG 수식 EPO는, 계면 활성제를 더 함유해도 된다. 계면 활성제로서는, 음이온 계면 활성제, 비이온 계면 활성제, 양성 계면 활성제 및 양이온 계면 활성제를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것이 아니다. 음이온 계면 활성제로서는, 예를 들면 지방산계 음이온 계면 활성제, 직쇄 알킬벤젠계 음이온 계면 활성제, 고급 알코올계 음이온 계면 활성제, 알파 올레핀계 음이온 계면 활성제 및 노르말 파라핀계 음이온 계면 활성제를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것이 아니다. 비이온 계면 활성제로서는, 예를 들면 지방산계 비이온 계면 활성제, 고급 알코올계 비이온 계면 활성제, 알킬페놀계 비이온 계면 활성제를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것이 아니다. 또한 비이온 계면 활성제의 예로서는, 예를 들면 폴리소르베이트 및／또는 폴리옥시에틸렌소르비탄알킬에스테르를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것이 아니다. 양성(兩性) 계면 활성제로서는, 예를 들면 아미노산계, 베타인계 및 아민옥사이드계를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것이 아니다. 양이온 계면 활성제로서는, 예를 들면 제4급 암모늄염계를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것이 아니다.

상기의 부형제, 붕괴제, 결합제, 안정화제, pH 조절제, 침투압 조절제 및 계면 활성제는 임의로 조합할 수 있다. 또한, 부형제, 붕괴제, 결합제, 안정화제, pH 조절제, 침투압 조절제 및 계면 활성제 이외의 제약적으로 허용되는 첨가제를 첨가할 수 있다. 예를 들면 활택제(滑澤劑), 코팅제, 착색제, 응집 방지제, 흡수 촉진제, 용해 보조제, 건강 식품 소재, 영양 보조 식품 소재, 비타민, 향료, 감미제, 방부제, 보존제, 항산화제 등을 들 수 있다.

제제로서는, 용액, 겔, 또는, 분말로서 가공한 후, 용액 제제, 동결 건조 제제, 프리필드시린지, 피하 매입형 서방 제제, 미셀 제제, 겔화 제제, 리포솜 제제 등으로 할 수 있다.

EPO를 함유하는 의약 조성물을 용액으로 사용할 경우, 용액 조성이 포유 동물의 체액(침투압 : 280mOsm／KgH₂O, pH : 7.4)의 침투압, pH와 실질적으로 동등하며, 피하 투여시에 통증이 없는 것이 중요하다. EPO를 함유하는 의약 조성물을 용액으로 사용할 경우의 침투압은 400mOsm／KgH₂O 이하의 것을 본 발명에 호적하게 사용할 수 있다. 또한, 200mOsm／KgH₂O 이상의 것을 호적하게 사용할 수 있다.

4. 용기

EPO는 미량의 투여여도 생체 내에서 효과가 있기 때문에, 제제의 용기 벽에의 흡착에 의한 로스가 생체 투여시의 실효 활성에 큰 영향을 준다. 그 때문에 본제의 용기에는 단백질의 흡착이 적은 수지 제품이 바람직하다. 그러므로 용기에의 EPO 흡착량이, 용기 중 EPO 총량의 1％ 이하가 되는 소재를 선택하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 0.7％ 이하, 보다 바람직하게는 0.5％ 이하가 되는 소재를 선택하는 것이 바람직하다.

단백질 흡착이 적은 것이 알려져 있는 수지 재료로서는 특별히 한정되지 않지만, 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리카보네이트, 폴리에틸메타크릴레이트 등의 의용(醫用) 용기 재료가 포함된다. 단백질 흡착이 적은 것이 알려져 있는 수지 재료로서 바람직한 것은, 예를 들면 노르보르넨 혹은 테트라시클로도데센 또는 그들 유도체 등의 시클로올레핀류 개환 중합체 및 그 수소 첨가물, 노르보르넨 혹은 테트라시클로도데센 또는 그 유도체 등의 시클로올레핀과, 에틸렌 또는 프로필렌의 중합에 의해 분자쇄에 시클로펜틸 잔기나 치환 시클로펜틸 잔기가 삽입된 공중합체인 수지이다. 또한 테트라시클로도데센과 에틸렌 등의 올레핀을 원료로 한 공중합체인 시클로올레핀 코폴리머(COC)는 흡착이 적은 점에서 보다 바람직하고, 또한 노르보르넨을 개환 중합하고, 수소 첨가한 중합물인 시클로올레핀 폴리머(COP)도 마찬가지로 바람직하다(일본국 특개평5-300939호 혹은 일본국 특개평5-317411호를 참조).

5. EPO의 아미노산 서열

EPO의 아미노산 서열은 어떠한 생물에 유래하는 서열이어도 된다. EPO의 cDNA 클로닝은, 인간 이외에도 쥐, 래트, 개, 고양이 등에서 행해지고 있으며(벤 등 : Blood, 82, 1507(1993)), 각각이 코딩하는 아미노산 서열이 해명되어 있다. 본 발명에는, 인간 EPO뿐만 아니라, 인간 이외의 종 고유의 아미노산 서열을 갖는 EPO를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서의 EPO의 아미노산 서열은, 인간이나 식육목에 유래하는 아미노산 서열인 것이 바람직하다. 식육목으로서는, 고양이과나 개과인 것이 바람직하고, 고양이과인 것이 보다 바람직하다.

고양이 EPO는 인간 EPO와 서열 동일성이 83.4％인 것이 알려져 있다. 또한, CHO 세포에서 발현시킨 고양이 EPO는 고양이에 대하여 조혈 활성이 있다(Am. J. Vet. Res. 64, 1465-71(2003)).

빈혈의 원인에는, 대량의 출혈, 비타민 부족, 자기 면역 질환, 악성 종양, 만성 염증, 만성 신부전, 용혈 및 조혈 이상 등이 알려져 있다. 이들을 원인으로 하는 빈혈은 인간뿐만 아니라, 애완동물인 개, 고양이, 혹은 가축인 소, 말, 양, 염소, 돼지, 혹은 생태 연구용으로 동물원 등에서 사육·전시 공개되는 사자, 호랑이, 캥거루, 코끼리, 기린, 얼룩말, 코알라, 팬더 등에서도 발증하지만, 본 발명의 EPO에 의해 이들의 빈혈을 치료할 수 있다. 고양이 EPO는, 고양이, 사자, 및 호랑이 등의 고양이과 동물(Felidae)의 빈혈의 치료에 사용 가능하다. 또한, 고양이 EPO는, 개 EPO에 대한 서열 동일성도 높아, 분류학상 고양이목(식육목)인 개 및 개과동물(Canidae)에게도 유효하다.

상기의 동물은 인간과 달리, 수혈용 혈액의 뱅크 시스템을 갖지 않기 때문에, 사고, 수술시 등의 실혈에 대하여 수혈 조치를 시행하는 것은 곤란하다. 그러나, 본 발명의 조혈 효과가 장기간 지속하는 EPO 제제는, 상기 동물에 대하여, 수혈 대체 혹은 점적시에도 사용할 수 있다. 투여시에 동물이 동통을 느끼면 투여에 지장이 생기고, 또한 대형 동물의 경우에 수의사에게 위험이 미칠 가능성이 있지만, 투여 대상 동물의 체액 조성에 가까운 침투압, pH로 조제함으로써 동통을 최소로 할 수 있다.

고양이과에 유래하는 EPO의 아미노산 서열로서는, 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열인 것이 바람직하다.

또한, 서열 번호 1에 나타낸 EPO를 구성하는 아미노산 서열과 70％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드도, 본 발명의 EPO에 포함된다.

EPO 폴리펩티드의, 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열과의 서열 동일성은 70％ 이상인 것이 바람직하고, 80％ 이상인 것이 보다 바람직하며, 85％ 이상인 것이 더 바람직하고, 90％ 이상인 것이 보다 더 바람직하며, 95％ 이상인 것이 가장 바람직하다.

또한 EPO는, 조혈 활성을 손상시키지 않도록 1개 또는 복수개의 아미노산을 치환, 결실, 삽입, 및／또는 부가한 폴리펩티드여도 된다. 도입하는 변이 등의 수는 50을 초과하지 않는 것이 바람직하고, 40을 초과하지 않는 것이 보다 바람직하며, 30을 초과하지 않는 것이 더 바람직하고, 20을 초과하지 않는 것이 보다 더 바람직하며, 10을 초과하지 않는 것이 가장 바람직하다.

EPO의 제조 방법으로서는, 일반적으로 입수 가능한 동물 세포(예를 들면 CHO세포), 원핵 생물, 효모를 숙주로 하여 제조되는 재조합품 외에, 천연물로부터 취득된 것, 재조합 동물에 의해 제조된 것 등을 이용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것이 아니다. EPO를 제조하는 재조합 동물로서, 유전자 재조합 조류(鳥類)를 이용하는 것도 가능하다. 또한 정제품이어도 미정제 상태여도 되지만, 품질 관리의 점에서는 정제품이 바람직하다.

EPO의 정제를 위해서는, 일반적인 단백질의 회수 수단으로서, 염석법, 흡착 칼럼 크로마토그래프법, 이온 교환 칼럼 크로마토그래프법, 겔 여과 칼럼 크로마토그래프법, 항체 칼럼법을 단독, 혹은 조합하여 정제할 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것이 아니다. 흡착 칼럼 크로마토그래프법으로서는, 블루세파로스 크로마토그래프, 헤파린 크로마토그래프 등이 있고, 이온 교환 칼럼 크로마토그래프법으로서는, 양이온 교환 크로마토그래프나 음이온 교환 크로마토그래프법 등이 있다.

[실시예]

이하 실시예에 의해 본 발명을 상술하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다. 상품명을 기재하고 있을 경우에는 특별히 기술이 없는 한 첨부된 설명서의 지시에 따랐다.

고양이 유래 에리스로포이에틴의 합성은, 일본국 특개2007-89578에 기재된 방법에 의해 행했지만, 그 공정을 다시 이하에 기재한다.

(제조예 1) 닭 배아에의 레트로바이러스 벡터(retrovirus vector)의 마이크로 인젝션과 인공 부화

고양이 유래 에리스로포이에틴 발현용 레트로바이러스 벡터를, 닭 배아에 마이크로 인젝션하고, 고양이 유래 에리스로포이에틴을 발현하는 트랜스제닉 닭을 제작했다. 마이크로 인젝션과 인공 부화는 무균 조건 하에서 행한다. 닭 수정란(시로야마슈케이죠제)의 외측을 소독액(가부시키가이샤쇼와푸란키제) 및 에탄올로 제균한다. 부란기 P-008(B)형(가부시키가이샤쇼와푸란키제)을 38℃, 습도 50∼60％의 환경이 되도록 셋팅하고, 전원을 켠 시각을 부란 개시 시각(0시간)으로 하여, 이후 15분마다 90° 전란(轉卵)하면서 부란을 행했다.

부란 개시로부터 약 55시간 경과 후, 부란기로부터 알을 취출하여, 그 세단부를 직경 3.5㎝의 원형에 다이아몬드날(날 선경 20㎜, 샤프트경 2.35㎜)을 부착한 미니루터(프록손제)로 절취했다. 닭 이황란(시로야마슈케이죠제)의 세단부를 직경 4.5㎝로 절취하여, 내용물을 버린 알껍데기에 수정란의 내용물을 옮기고, 주사기의 내통에서 배아를 상방으로 이동시켰다. 실체 현미경 시스템 SZX12(올림퍼스가부시키가이샤제) 하에서, 펨토칩Ⅱ(에펜돌프가부시키가이샤제)에 바이러스액을 주입하고, 펨토제트(에펜돌프가부시키가이샤제)를 사용하여, 일본국 특개2007-89578에 기재된 고양이 유래 에리스로포이에틴 발현용 레트로바이러스 벡터를 함유하는 용액 약 2㎕를 마이크로 인젝션했다.

난백(卵白)을 풀로 하여 약 8×8㎠로 자른 사란랩(아사히카세이가부시키가이샤제)으로 이 구멍을 막고, 부란기에 도로넣어 부란을 계속했다. 부란기의 전란을 30분마다 30° 전란으로 변경했다. 부란 개시로부터 20일째에 사란랩에 20G의 주사 바늘로 20개 정도 구멍을 뚫고, 부란기에 60cc／min으로 산소를 공급하여 부란을 행했다. 병아리가 부리쪼기를 시작하면 알껍데기를 깨어 부화시켰다. 탄생한 병아리를 사육하여 성장시켰다. 사료로서, 요스(幼雛)SX세이프티 및 네오세이프티17(도요하시시료가부시키가이샤제)을 사용했다. 트랜스제닉 닭에 있어서의 고양이 유래 에리스로포이에틴의 혈중 및 난중의 발현을, 후술하는 BaF／EPOR에 의한 세포 증식 어세이에 의해 확인했다.

(제조예 2) 난백으로부터의 고양이 유래 에리스로포이에틴의 정제

난백 중에 고양이 유래 에리스로포이에틴 활성이 확인된 닭 개체의 알을 회수하고, 난백으로부터 고양이 유래 에리스로포이에틴을 후술하는 칼럼을 사용하여 회수·정제했다.

칼럼에 어플라이하는 샘플은 모두, 사용 직전에 공경 0.45㎛의 Millex-HV(니혼밀리포어가부시키가이샤제)로 시린지 여과를 행했다. 여과 곤란할 경우에는, 공경 2㎛의 푸라디스크(Puradisc)25(왓토만제)에 의해 미리 여과한 후, Millex에 의한 여과를 행했다.

정제 과정에서의 고양이 유래 에리스로포이에틴 함유량의 측정은, Bicore3000(GE헬스케어·쟈판가부시키가이샤·BIACORE제)로 행했다. Sensor Chip CM5 reserch grade(GE헬스케어·쟈판가부시키가이샤·BIACORE제)에 항인간 에리스로포이에틴 모노크로널(monoclonal) 항체(R＆D Systems샤제)를 아민 커플링 키트(GE헬스케어·쟈판가부시키가이샤·BIACORE제)로 NHS 고정화하여 측정용 칩으로 하고, 에포진을 표준 물질로 하고, 장치의 정량용 프로그램을 이용하여 농도를 측정했다.

난백을 칼럼에 어플라이하기 위해, 점성을 저하시키는 전(前)처리를 행했다. 냉장 보존해 둔 알을 실온으로 되돌려 할란(割卵)하고, 알의 껍데기 등을 사용하여 난황과 난백을 분리한 후, 난백만을 회수해서 중량을 측정했다. 난백을 스터러로 교반하여 농후 난백을 풀고, 5배 양의 초순수를 가해 더 교반했다. 이 시점에서 난백액의 pH는 9.0∼9.3 정도였다. 이에 1N HCl을 적절히 가하여 pH 5.0으로 조정하고, 15분간 이상 교반한 후, 9,500G×30분간, 4℃에서 원심 분리했다. 상청(上淸)에 1M NaOH를 가하여 pH 7.0으로 조정하고, 1M Tris 버퍼, pH 7.0을 종(終)농도 50mM가 되도록 가했다. 이 스텝에 있어서의 고양이 유래 에리스로포이에틴 회수율은 최대 95％였다.

이어서, 블루세파로스 크로마토그래피를 행했다. 전처리 후의 난백액 500ml(난백 2∼3개분)를, 50mM Tris, pH 7.0으로 평형화한 50ml의 Blue Sepharose 6 Fast Flow 칼럼(GE헬스케어·쟈판가부시키가이샤·아머샴제)에 어플라이했다. 칼럼을 50mM Tris, pH 7.0으로 충분히 세정한 후, 200ml의 1M NaCl, 50mM Tris, pH 7.0으로 용출했다. 용출 획분(劃分)을, 4℃의 저온실에서 20mM MES, pH 6.2에서 통상의 방법으로 하룻밤 투석하고, 버퍼 교환을 행했다. 이 스텝에 있어서의 고양이 유래 에리스로포이에틴 회수율은 최대 98％였다.

이어서, 헤파린 크로마토그래피를 행했다. 20mM MES, pH 6.2로 평형화한 HiPrep 16／10 Heparin FF 칼럼(GE헬스케어·쟈판가부시키가이샤·아머샴제)에, 블루세파로스 용출 획분(투석 후)을 2회로 나누어 어플라이하고, 각각 20mM MES, pH 6.2에서 칼럼을 충분히 세정한 후, NaCl 농도를 80mM까지 상승시키는 그라디언트 용출을 행했다. 칼럼은 매회 1M NaCl 및 0.1M NaOH로 재생했다. Biacore로 고양이 유래 에리스로포이에틴의 존재가 확인된 획분을 회수했다. 이 스텝에서의 고양이 유래 에리스로포이에틴의 회수율은 최대 80％였다.

이어서, 탈염 칼럼에 의한 버퍼 교환을 행했다. 헤파린세파로스 용출 획분을 분획 분자량 5,000의 비바스핀 20(싸토리우스·메카트로닉스·쟈판가부시키가이샤제)에 의해 총량 30∼40ml 정도로 농축하고, 25mM Tris, pH 7.0에서 평형화한 HiPrep 26／10 Desalting(GE헬스케어·쟈판가부시키가이샤·아머샴제)에 10ml씩 어플라이하고, 동(同)버퍼로 용출하고, 단백질을 함유하는 획분을 회수했다. 1M NaOH에서 pH 9.0으로 조정하고, 또한 1M NaCl로 전기전도도가 3.0∼3.2mS／㎝가 되도록 조정했다. 이 스텝에 있어서의 고양이 유래 에리스로포이에틴 회수율은 최대 95％였다.

이어서, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 행했다. 버퍼 교환 후의 샘플을, 25㎜ Tris, pH 9.0, 전기 전도도 3.0∼3.2mS／㎝로 평형화한 5ml의 HiTrap DEAE FF 칼럼(GE헬스케어·쟈판가부시키가이샤·아머샴제)에 2회로 나누어 어플라이하고, 각각 통과획분(flow-through)을 회수했다. 칼럼은 매회 1M NaCl로 재생했다. 분획분자량 5,000의 비바스핀 20에 의해, 총량 2∼3ml 정도까지 농축했다. 이 스텝에서의 고양이 유래 에리스로포이에틴 회수율은 최대 92％였다.

겔 여과 크로마토그래피를 행했다. 농축 후의 샘플을, 50mM 붕산 버퍼, pH 9.0 혹은 다른 적당한 버퍼로 평형화한 Superdex 200 10／300 GL 칼럼(GE헬스케어·쟈판가부시키가이샤·아머샴제)에 어플라이하여 동버퍼로 용출했다. Biacore로 고양이 유래 에리스로포이에틴의 존재가 확인된 획분을 회수하고, 분획 분자량 5,000의 비바스핀 6으로 총량 1∼2ml 정도에까지 농축했다. 이 스텝에서의 고양이 유래 에리스로포이에틴 회수율은 최대 93％였다.

정제 각 스텝에서의 회수 획분에 대해서, SDS-PAGE를 행했다. 샘플은 e·퍼젤 12.5％를 이용하여, 변성 조건에서 영동하고, Bio-Safe Coomassie Stain(바이오-래드 레보러토리즈 주식회사)으로 검출했다.

난백으로부터 정제한 고양이 유래 에리스로포이에틴에 대해서, 후술하는 방법에 의해, Baf／EPOR 세포 증식 어세이를 행했다. 그 결과, 비활성은 160,000∼290,000IU／㎎이었다.

고양이 유래 에리스로포이에틴에의 PEG 부가는 이하와 같이 행했다.

(실시예 1) PEG를 부가한 고양이 유래 에리스로포이에틴(PEG화 고양이 EPO)의 합성 반응

정제한 고양이 EPO 용액(20mM 인산 완충액 pH＝7.0)을 사용하여, 이하의 PEG 시약을 첨가했다.

분자량 5,000 직쇄 PEG(니치유가부시키가이샤제 : ME-050HS)

분자량 20,000 직쇄 PEG(니치유가부시키가이샤제 : ME-200HS)

분자량 40,000 직쇄 PEG(니치유가부시키가이샤제 : ME-400HS)

분자량 20,000 분기 PEG, 분기수 1(니치유가부시키가이샤제 : GL2-200GS2)

고양이 EPO와 PEG 시약을 몰비로 1:5의 비율로 혼합 후, 4℃에서 혼화하면서 반응시켰다. PEG의 부가에 의해, 우선 모노 PEG체가 생성되고, 다음으로 디 PEG체가 생성되며, 그 후 올리고 PEG체가 생성되기 때문에, HPLC(가부시키가이샤시마즈세이사쿠쇼제)에 의해 각 PEG체의 생성 상태를 모니터링하여 충분량 얻어진 단계에서 반응을 정지시켰다. 또한, 칼럼에는, YMC Pack Diol-200(순상계, 가부시키가이샤YMC제)을 사용했다.

각 PEG체가 충분량 생성된 곳에서, 반응 정지제로서, 100mM 글리신 용액을 1／10량 가하고, 4℃에서 1시간 혼화하면서 반응을 정지시키고, 반응액을 투석(50mM 아세트산 완충액, pH＝4.5)했다.

(실시예 2) PEG 반응액의 정제에 의한 PEG화 고양이 EPO의 분리 정제

PEG 반응에 의해 생성된 모노 PEG체, 디 PEG체, 올리고 PEG체 및 미반응 PEG, 미반응 EPO를 분리 회수하기 위해, 양이온 교환 칼럼에 의해 분리 정제를 행했다.

반응액을 양이온 교환 칼럼(MacroCapSP : GE헬스케어·쟈판가부시키가이샤제)에 의해 분리 정제했다(결합 : 50mM 아세트산 완충액(pH＝4.5), 용출 : 1M NaCl그라디언트). 올리고 PEG체, 디 PEG체, 모노 PEG체의 순으로 염농도에 의해 단리 용출되는 피크를 분취하고, 각각을 투석(20mM 인산 완충액(pH＝7.5), 150mM NaCl) 했다. 분산제로서, 폴리솔베이트 80(와코쥰야쿠고교가부시키가이샤제)을 0.05％(V／V) 첨가하고, 투여 샘플로 했다.

(평가 1) 고양이 EPO 및 PEG 부가 고양이 EPO의 활성 측정

실시예 2에서 합성한 각종 PEG화 고양이 EPO의 in vitro 활성 측정을 행했다.

고양이 EPO의 활성은, EPO 의존성 세포주(細胞株)인 BaF／EPOR 세포((재단법인)화학 및 혈청요법 연구소)에 의한 세포 증식 어세이(일본국 특개평10-94393)에 의해 행했다. 세포 증식 어세이는 에포진(쥬가이세이야쿠가부시키가이샤제)을 표준 에리스로포이에틴으로서, 증식의 검량선을 그려 그것을 바탕으로 미지 샘플의 EPO 활성을 측정했다. BaF／EPOR 세포용 배지로서 5％의 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)과 50units／ml의 페니실린, 및 스크렙토마이신을 함유하는 RPMI1640 리퀴드 배지(닛스이세이야쿠가부시키가이샤제)를 사용했다. 통상의 BaF／EPOR 세포의 배양시에는 종농도 1U／ml가 되도록 에포진을 가했다. 세포 증식 어세이에는 대수 증식기에 있는 세포를 사용했다.

BaF／EPOR 세포로 세포 증식 어세이를 행하기 위해, 우선 배지 중의 에포진을 제거했다. 배양한 BaF／EPOR 세포를 1000rpm으로 5분간 원심 분리했다. 상청을 제거하고, 침전에 에포진을 함유하지 않은 배지를 10ml 가하여 현탁했다. 같은 조작을 3번 행하여 배지 중의 에포진을 제거했다. 세포를 계수하고, 에포진을 함유하지 않은 배지에서 55555Cells／ml의 농도가 되도록 희석했다. 96구멍 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)의 각 웰에 90㎕씩 파종했다. 이에, 배지에서 25, 16, 10, 6.4, 4.0, 2.5, 1.6, 1.0U／mL가 되도록 희석한 에포진을 10㎕씩 가하여, 똑같아지도록 현탁했다(EPO의 종농도는 각각 2.5, 1.6, 1.0, 0.64, 0.4, 0.25, 0.16, 0.1U／mL가 된다).

어세이에 사용하는 샘플은 배지에서 2∼4배 정도씩 단계 희석하고, 검량선의 측정 범위 내에 들어가도록 하여, 파종한 세포 중에 10㎕씩 가해, 똑같아지도록 현탁했다. 표준 샘플, 미지 샘플 모두 동일한 것을 3점 측정했다. 2일간 배양하고, Cell Counting Kit-8(가부시키가이샤도닌가가쿠겐큐쇼제) 용액을 각 웰에 10㎕씩 첨가했다. 1∼4시간 정색(呈色) 반응을 행한 후, 0.1mol／L의 염산을 10㎕ 가해 반응을 정지하고, 마이크로플레이트 리더를 사용하여, 450㎚의 흡광도를 측정했다. 표준 샘플의 측정 결과를 대수 근사하여, 근사식을 구했다. 구한 근사식으로부터 샘플의 활성을 환산했다.

측정 결과를 표 1에 나타냈다.

[표 1]

(평가 2) 래트에의 피하 투여 시험

실시예 2에서 조제된 샘플을 래트에 피하 투여했다.

숫컷 래트(니혼챨스·리버가부시키가이샤제, SPF, 7주령)에 303μg／kg이 되도록 샘플 용액을 단회 피하 투여했다. 실험의 군 및 투여 샘플을 표 2에 나타냈다.

[표 2]

(평가 3) 래트 망상 적혈구수의 측정

피하 투여 전을 Day0으로 하고, 피하 투여 후, 4, 7, 10, 14일에 경시적으로 경정맥으로부터 채혈했다. 채혈한 전혈을 사용하여, 말초혈에 있어서의 망상 적혈구수를 측정했다(메틸렌 블루 염색법 : 가부시키가이샤란스). 망상 적혈구수의 변화를 도 1∼도 4에 나타냈다.

(평가 4) 수용성 장쇄 분자가 부가된 에리스로포이에틴의 함량의 측정 방법

수용성 장쇄 분자가 부가된 에리스로포이에틴 용액은, 20mM 인산 완충액(pH＝7.5)에 의해 투석을 행한다. 분광 광도계(Gene Quant pro : GE헬스케어·쟈판가부시키가이샤·아머샴제 code 80-2114-98) 및 UV셀을 사용하여 20mM 인산 완충액(pH＝7.5)을 블랭크로 하여, 280㎚의 파장에서의 흡광도가 0.1이 되도록 인산 완충액을 사용하여 조제한다.

이 용액에 등량의 Lae㎜li sample buffer(바이오-래드 레보러토리즈 주식회사 code 161-0737에 종농도 350mM가 되도록 DTT를 가함)를 첨가하고, 95℃ 5분 열변성을 행한 후, 빙상(氷上)에서 급랭한 것을 샘플로 하여 2㎕를 전기 영동한다. 전기 영동은, 겔로서 e-PAGEL(아토가부시키가이샤제 E-R12.5L)을 사용하고, 영동 장치로서는, PAGERUN(아토가부시키가이샤제 Model AE-6531)을 사용하며, 겔 1매당 20mA로 설정한 후, 80분간 전기 영동한다. 전기 영동이 종료하면, 겔판으로부터 겔을 벗겨내고, 초순수(Milli-Q : 니혼밀리포어가부시키가이샤제 MILLIPORE ZMQS7V0T1)에 30분 침지한다. 초순수를 제외하고, 고정화 용액에 30분 침지하여, 겔을 고정화 처리한다. 고정화 용액을 제외하고, 염색액을 가하여 3시간 이상 6시간 미만의 시간 침지한다. 염색액을 제외하고, 고정화 용액에 침지하여, 느긋하게 진탕하면서 60분 세정하고, 세정에 사용한 고정화 용액을 제외한다. 새로운 고정화 용액을 가해, 느긋하게 진탕하면서 60분 세정을 행한다.

2회의 세정 후, ChemiDoc XRS(바이오-래드 레보러토리즈 주식회사)에 의해, 자외선 조사(照射)를 행하면서 겔의 이미지를 도입한다. 소프트웨어로서는 Quantity One ver. 4.6(바이오-래드 레보러토리즈 주식회사)을 사용하여, 이미지 중의 밴드의 형광 강도를 측정한다. Frame Lane에 의해 레인 지정을 행한 후, Lane Background에서 표시되는 Intensity의 에어리어 비율에 의해 함유량을 산출한다. 복수의 밴드가 확인될 경우, 목적으로 하는 분자량의 밴드의 형광 강도의 전 밴드의 형광 강도에 점하는 비율을 함유율로 규정한다.

또한, 20mM 인산 완충액(pH＝7.5), 고정화 용액, 염색액은 각각 이하의 것을 사용했다.

(ⅰ) 20mM 인산 완충액(pH＝7.5)

1L의 초순수에 대하여, 이하의 시약을 용해시킨 것으로 한다.

인산 2수소 나트륨 2수화물(와코쥰야쿠고교가부시키가이샤제 192-0825) 0.59g

인산수소 2나트륨 12수화물(와코쥰야쿠고교가부시키가이샤제 196-02835) 5.8g

염화나트륨(나카라이테스크가부시키가이샤제 31320-05) 8.76g

(ⅱ) 고정화 용액

초순수를 사용하여 이하의 비율이 되도록 조제된 수용액으로 한다.

10％ 메탄올(나카라이테스크가부시키가이샤제 21915-93)

7％ 아세트산(나카라이테스크가부시키가이샤제 00212-85)

(ⅲ) 염색액

SYPRO Ruby Protein Gel Stain(Lonza cat.50564)

SEQUENCE LISTING <110> KANEKA CORPORATION <120> MODIFIED ERYTHROPOIETIN TO WHICH WATER-SOLUBLE LONG-CHAIN MOLECULE IS ADDED <130> B090354WO01 <150> JP 2009-213205 <151> 2009-09-15 <160> 1 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 192 <212> PRT <213> Felis catus <400> 1 Met Gly Ser Cys Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile 20 25 30 Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Gly Ala Arg Glu Ala 35 40 45 Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Cys Ser Phe Ser Glu Asn 50 55 60 Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Thr Trp Lys Arg Met 65 70 75 80 Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu 85 90 95 Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Ser Gln 100 105 110 Pro Ser Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu 115 120 125 Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala 130 135 140 Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Phe Thr 145 150 155 160 Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 165 170 175 Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg 180 185 190

Claims (14)

1. 분자량이 20kDa 이상인 직쇄형의 폴리에틸렌글리콜이 2분자 이상 부가된 에리스로포이에틴을, 전 에리스로포이에틴 중에 50% 이상 함유하고,
   상기 에리스로포이에틴이, 이하의 (a) 또는 (c);
   (a) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드,
   (c) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로부터, 1∼26번째의 아미노산이 결실한 폴리펩티드로서, BaF / EPOR 세포에 의한 세포 증식 어세이에서 에리스로포이에틴 활성을 갖는 폴리펩티드
   인 것을 특징으로 하는, 빈혈 치료용 또는 조혈 치료용의 의약 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   투여 대상이 고양이과 또는 개과의 동물인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   고양이과 또는 개과의 동물에 있어서의 조혈 효과가 7일 이상 지속하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 의약 조성물이 pH가 4 이상 8 이하인 용액 또는 겔인 의약 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   폴리에틸렌글리콜의 부가 부위의 적어도 1개소가, 리신 78 잔기인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   반복 투여해도 에리스로포이에틴에 대한 항체가 생산되지 않는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
7. 제1항에 있어서,
   직쇄형의 폴리에틸렌글리콜의 분자량이 40kDa 이하인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물을 함유하는 빈혈 치료약.
9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물을 함유하는 조혈약.
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