CN112933039A - 一种重组人促红细胞生成素液体制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种不含有人血白蛋白的具有长期储存稳定性的重组人促红细胞生成素液体制剂，该制剂包含重组人促红细胞生成素，甜菜碱，pH缓冲溶液，非离子表面活性剂，渗透压调节剂和水，该制剂具有良好的稳定性和生物活性，便于长期储存，工艺简单，可操作性强，辅料相对易获得且安全稳定，节约了生产成本。

Description

一种重组人促红细胞生成素液体制剂
技术领域
本发明涉及生物药品制剂领域，具体涉及一种不含人血白蛋白的具有长期储存稳定性的重组人促红细胞生成素液体制剂。
背景技术
促红细胞生成素(EPO)是一种促进红细胞生成的糖蛋白激素，其由165个氨基酸组成，分子量约为34kD。重组人促红细胞生成素(rhEPO)普遍由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达和生产，其与天然红细胞生成素有相同的结构及生理作用，是一种重组蛋白药物，常用于肾病患者的治疗。
蛋白质最常见的物理上的不稳定性就是蛋白质的聚集，很多种因素都可能诱导或影响蛋白质的聚集。蛋白质聚集体可能没有活性或活性降低，溶解度降低和免疫原性改变。用于提高液体蛋白质药物稳定性最常见的方法就是使用适当的制剂辅料，这是重组蛋白药物工艺中的关键部分。
目前EPO注射液制剂普遍添加了人血白蛋白作为稳定保护剂，但其存在病毒污染的风险，因而，需要开发辅料相对易获得且安全稳定的不含人血白蛋白的EPO配方制剂，使其既能避免血源病毒污染和过敏反应，又能保持药物长期的生物活性和稳定性。
专利CN1832754A公开了一种添加羟乙基淀粉(HES)，氨基酸，非离子表面活性剂的不含清蛋白的红细胞生成素制剂，其在40℃下储存2星期后EPO残留率可达96％。但是有报道表示HES的使用会有急性肾损伤等风险，因此HES在制剂中应避免使用。
国际专利申请WO 00/61169中公开了一种不含人血白蛋白的EPO制剂，也是美国强生公司的EPO药物Eprex的经典配方。但在CN1802171A中体现出Eprex制剂在40℃储存下易于变性和聚集，且有报道Eprex可激起的免疫反应或诱导中和抗体形成，引起的纯红细胞再生障碍性贫血(PRCA)。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种不含人血白蛋白的重组人促红细胞生成素液体制剂。该制剂具有良好的稳定性和生物活性，便于长期储存，并且工艺简单，可操作性强，辅料相对易获得且安全稳定，降低了药品的生产成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定性好、病毒污染风险低、安全稳定的重组人促红细胞生成素液体制剂。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种重组人促红细胞生成素液体制剂，其包含重组人促红细胞生成素，甜菜碱，pH缓冲溶液，非离子表面活性剂，渗透压调节剂和水。本发明所用的甜菜碱又名三甲铵乙内酯。
作为进一步优选的方案，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液。
作为进一步优选的方案，所述非离子表面活性剂选自聚山梨酯80。
作为进一步优选的方案，所述渗透压调节剂选自氯化钠、甘露醇及其混合物。
作为进一步优选的方案，所述制剂pH为6.0～8.0。
作为进一步优选的方案，所述甜菜碱的含量为0.01mg/ml-0.50mg/ml。
作为进一步优选的方案，所述制剂包含1000-40000IU/ml重组人促红细胞生成素、0.01mg/ml-0.50mg/ml甜菜碱、10mM-40mM pH缓冲溶液、0.01mg/ml～0.50mg/ml非离子表面活性剂、10mM-150mM渗透压调节剂和水，所述制剂的pH范围为6.0-8.0。
作为进一步优选的方案，所述制剂为注射剂。
本发明另一方面提供了一种上述液体制剂的方法，包括如下步骤：1)渗透压调节剂，pH缓冲溶液和甜菜碱加水混合溶解，加入非离子表面活性剂；2)混合液中加入重组人促红细胞生成素得到重组人促红细胞生成素液体制剂。
本发明的积极效果在于：
1、本发明未加入人血白蛋白作稳定保护剂，避免了血源病毒污染和过敏反应的风险。
2、本发明所述液体制剂明显提高了EPO制剂的稳定性，在多种储存条件下，本发明所述液体制剂均表现出良好的稳定性和生物活性，延长了产品货架期。
3、该制剂配方合理，工艺简单，可操作性强，辅料相对易获得且安全稳定，节约了生产成本且适合工业化大生产。
具体实施方式
以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明，不应理解为是对本发明的限制。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
SEC-HPLC采用液相色谱分析柱TSKgel G3000SWXL，高效液相色谱仪ultimate3000型。
实施例1
配制1000支10000IU/ml/支的重组人促红细胞生成素注射液：
Figure BDA0002312649010000021
分别准确称取氯化钠，磷酸氢二钠，二水合磷酸二氢钠，甜菜碱，加入700ml注射用水，充分混合溶解后，量取加聚山梨酯80母液，混合溶解；混合液中加入药用量的重组红细胞生成素原液混匀，用超纯水定容1000ml混匀。将配制好的溶液无菌过滤到灭菌容器中，然后分装至玻璃管制注射剂瓶中制成1ml/支10000单位的重组人促红细胞生成素注射液。
对照组1：不含甜菜碱的重组人促红细胞生成素注射液，与实施例一的区别在于，不含甜菜碱。
对照组2：含高浓度甜菜碱的重组人促红细胞生成素注射液，与实施例一的区别在于，甜菜碱含量为1.0mg/ml。
对照组3：不含甜菜碱含氨基酸的重组人促红细胞生成素注射液，与施例一的区别在于不含有甜菜碱，且甘氨酸浓度为5.0mg/ml。
分别对上述制剂配方进行45℃高温试验5天。通过体积排阻色谱法(SEC-HPLC)检测样品纯度，EPO峰面积相比于其初始值的EPO峰面积表示为EPO峰保留率(％)(面积/初始面积)％，实验结果见表1。
表1
Figure BDA0002312649010000031
结果表明，在45℃高温条件下，5天内实施例1与对照组的纯度无明显差异。实施例1的EPO峰保留率为95.5％，与对照组1，对照组2的峰保留率有较大差异，与对照组3有显著差异。由此可见，在45℃高温条件下，实施例1所述液体制剂明显提高了EPO制剂的稳定性，并且EPO制剂的稳定性与甜菜碱的浓度有关。
实施例2
配制1000支8000IU/ml/支的重组人促红细胞生成素注射液
Figure BDA0002312649010000032
分别准确称取氯化钠，磷酸氢二钠，二水合磷酸二氢钠，甜菜碱，加入700ml注射用水，充分混合溶解后，量取加聚山梨酯80母液，混合溶解；混合液中加入药用量的重组红细胞生成素原液混匀，用超纯水定容1000ml混匀。将配制好的溶液无菌过滤到灭菌容器中，然后分装至玻璃管制注射剂瓶中制成1ml/支8000单位的重组人促红细胞生成素注射液。
对照组4：含聚山梨酯20的重组人促红细胞生成素注射液，与实施例2的区别在于，不含聚山梨酯80，含0.20mg/ml的聚山梨酯20。
对照组5：含高浓度甜菜碱的重组人促红细胞生成素注射液，与比较例4的区别在于，甜菜碱含量为0.6mg/ml。
对实施例2、对照组4、对照组5的制剂配方进行25℃加速稳定性试验6个月，对相关指标监测项目进行检测。结果如下表2-4。
表2
Figure BDA0002312649010000041
表3
Figure BDA0002312649010000042
表4
Figure BDA0002312649010000043
结果表明，相对于对照组4和对照组5，实施例2所述制剂在25℃试验6个月仍能保持相对良好的稳定性，证明实施例2所述制剂可以长期储存，并且再次证明了EPO制剂的稳定性与甜菜碱的浓度有关。在长期储存的条件下，本发明制剂仍能保持良好的生物活性，体外活性无显著下降。
对实施例2、对照组4、对照组5的制剂配方进行40℃的高温试验，结果如下表5-7。
表1
Figure BDA0002312649010000051
表2
Figure BDA0002312649010000052
表3
Figure BDA0002312649010000053
结果表明，在40℃高温条件下，实施例2所述液体制剂仍能保持良好的稳定性。当实施例2制剂中的组分含量或种类替换为其他时，不能获得同样的稳定性结果，并且EPO制剂的稳定性与甜菜碱的浓度有关。并且在高温条件下，仍能保持相对良好的生物活性。
如上所述，本发明的溶液制剂不含人血清白蛋白，避免了人血清白蛋白相关病毒污染风险，并且本发明所述制剂稳定，便于可以长期储存，即使在高温条件下，仍能保持相对良好的稳定性和EPO活性。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制本发明，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (9)

1.一种重组人促红细胞生成素液体制剂，其特征在于，其包含重组人促红细胞生成素，甜菜碱，pH缓冲溶液，非离子表面活性剂，渗透压调节剂和水。
2.根据权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液或甘氨酸缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述非离子表面活性剂选自聚山梨酯80。
4.根据权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述渗透压调节剂选自氯化钠、甘露醇及其混合物。
5.根据权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述制剂pH为6.0～8.0。
6.根据权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述甜菜碱的含量为0.01mg/ml-0.50mg/ml。
7.根据权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述制剂包含1000-40000IU/ml重组人促红细胞生成素、0.01mg/ml-0.50mg/ml甜菜碱、10mM-40mM pH缓冲溶液、0.01mg/ml～0.50mg/ml非离子表面活性剂、10mM-150mM渗透压调节剂和水，所述制剂的pH范围为6.0-8.0。
8.根据权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述制剂为注射剂。
9.一种制备权利要求1所述的液体制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)渗透压调节剂，pH缓冲溶液和甜菜碱加水混合溶解，加入非离子表面活性剂；2)混合液中加入重组人促红细胞生成素得到重组人促红细胞生成素液体制剂。
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