KR101773067B1

KR101773067B1 - 6'-시알릴락토오스 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 퇴행성관절염의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101773067B1
Application number: KR1020170067915A
Authority: KR
Inventors: 양시영; 강이중; 전지민; 조찬미
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2017-05-31
Filing date: 2017-05-31
Publication date: 2017-08-30

Abstract

본 발명은 6'-시알릴락토오스 (6'-sialyllactose) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 퇴행성관절염(Osteoarthritis)의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 6'-시알릴락토오스는 연골형성을 촉진하는 동시에 연골조직 파괴를 효과적으로 억제하므로, 퇴행성관절염 (Osteoarthritis) 예방 또는 치료를 위한 조성물로 유용하다.

Description

6'-시알릴락토오스 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 퇴행성관절염의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for Preventing or Treating Osteoarthritis Comprising 6'-Sialyllactose or Salts Thereof}

본 발명은 6'-시알릴락토오스 (6'-sialyllactose) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 퇴행성관절염(Osteoarthritis)의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

퇴행성관절염 (osteoarthritis, OA)은 주로 연골 형성 (cartilage ECM synthesis) 억제 및 연골조직 파괴 (cartilage destruction) 촉진으로 오는 퇴행성관절 질환이다. 노화와 관련된 많은 병인학적 위험 인자들과 병리생리학적 과정들이 퇴행성관절염의 진행에 기여한다. 관절 불안정성과 손상을 포함한 기계적 스트레스 및 퇴행성관절염에 걸리기 쉽게 하는 노화 관련 인자들이 잠재적인 퇴행성관절염 야기 기작들이다. 이러한 인자들은 다양한 이화 및 동화 인자들을 생산하는 독특한 세포 타입인 연골세포 내 생화학적 경로들의 활성화로 인해 Mmp (Matrix metalloproteinase)에 의한 ECM (extracellular matrix)의 분해, 그리고 연골세포의 탈분화 (dedifferentiation) 및 아팝토시스 (apoptosis)를 통한 ECM 합성의 중단을 초래한다 (pelletier JP et al., Arthritis Rheum., 44:1237-47, 2001). 특히, 관절을 이루고 있는 연골 조직은 한번 손상되게 되면 정상적으로 생체 내에서 재생이 되지 않는다. 이러한 관절의 연골조직이 손상될 경우 심한 통증과 함께 일상 활동에 제한을 받게 되며, 만성화될 경우 치명적인 퇴행성관절염을 유발하게 되어 정상적인 생활이나 직업적인 활동을 방해하게 된다.

지금까지 관절염 치료제는 개발되어 있지 않고, 일반적으로 관절염증 완화 목적으로 NSAID (non-steroidal anti-inflammatory drugs) 약물을 사용하고 있다. 하지만, NSAID 계열 약물은 관절 염증만을 일시적으로 완화시키는 효과가 주된 목적이기 때문에 연골 형성 촉진 및 연골조직 파괴 억제를 필요로 하는 비염증성 관절염인 퇴행성관절염에는 NSAID 계열의 약물 사용은 적합하지 않은 치료 방법이다 (Pritchard MH et al., Annals of the Rheumatic Diseases, 37:493-503, 1978). 이러한 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDs)은 염증성 관절염인 류마티스관절염 치료제로서 염증 기전을 차단하기 위해서는 적합하나, 오히려 연골 손상을 가속화시키거나 심혈관, 위장관, 신장, 간 등에 부작용이 문제로 지적되고 있다.

또한, 현재 연골형성을 위해 개발된 자기유래 연골세포 이식술은 환자의 정상부위에서 이미 생성되어 있는 연골과 연골하골 부분을 함께 채취하여, 손상된 연골부 위에 적당한 구멍을 파고 이식하여 초자연골을 생성하는 방법으로 일부 환자에게서 성공을 거두었지만, 연골 조직 파괴 부분이 적고 자가이식이 가능한 환자만을 대상으로 시행할 수 있어 보편적인 방법이 될 수 없다 (Peterson L et al., J Bone Joint Surg Am. 85-A Suppl:17-24, 2003).

한편, 모유 올리고당중 6'-시알릴락토오스 (6'-sialyllactose)는 장에 존재하는 세균 활성에 영향을 주는 항염증 특성을 가지고 있으며, 장내의 유용한 세균이 잘 성장할 수 있도록 도와준다는 보고가 있다 (Izquierdo-Useros N et al., Plos Biol , 2012, 10). 시알릭락토오스는 모유 내 존재하므로 복용에 대한 부작용이 이미 검증되어 다양한 기능에 관한 연구가 진행중이며, 류마티스관절염 환자에 투여하여 IgG 변화에 따른 자가면역질환 치료효과를 확인 (US 5164374)한 바는 있으나, 6'-시알릴락토오스의 퇴행성관절염에 대한 예방 및 치료효과는 아직 알려진 바가 없다.

이에 본 발명자들은 퇴행성관절염을 효율적으로 예방 및 치료할 수 있는 신규 물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 6'-시알릴락토오스 (6'-sialyllactose)에 의해 연골 형성 촉진과 동시에 연골조직 파괴가 억제되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 6'-시알릴락토오스 (6'-sialyllactose) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 퇴행성관절염(Osteoarthritis)의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물 및 식품을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 6'-시알릴락토오스 (6'-sialyllactose) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 퇴행성관절염(Osteoarthritis)의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 6'-시알릴락토오스 (6'-sialyllactose) 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 퇴행성관절염(Osteoarthritis)의 예방 또는 개선용 식품을 제공한다.

본 발명의 6'-시알릴락토오스는 연골형성을 촉진하는 동시에 연골조직 파괴를 효과적으로 억제하므로, 퇴행성관절염 (Osteoarthritis) 예방 또는 치료를 위한 조성물로 유용하다.

도 1은 다양한 이화 및 동화 인자들에 의해 퇴행성관절염 유발 기전을 나타내는 모식도이다.
도 2는 6'-시알릴락토오스 (6'-sialyllactose; 6'-SL)의 화학구조식을 나타낸 것이다.
도 3은 6'-시알릴락토오스를 각각 연골세포에 농도별로 처리하여, 6'-시알릴락토오스가 연골세포에 세포독성을 나타내지 않음을 확인한 결과이다.
도 4는 연골세포에 6'-시알릴락토오스를 각각 0, 50, 100, 250 uM로 처리하여 type II collagen (Col2a1)의 발현이 증가됨을 확인한 결과 (A)이며, IL-1β에 의해 감소된 Col2a1 발현이 6'-시알릴락토오스 각각에 의해 증가함을 확인한 결과 (B)이고, type II collagen 발현을 조절하는 전사인자 Sox-9 활성인자가 IL-1β에 의해 감소됨과 동시에 6'-시알릴락토오스에 의해 다시 증가한 것을 확인한 결과 (C)이다.
도 5는 연골세포에서 IL-1β에 의해 관절파괴를 유도하는 Mmp3 및 Mmp13의 발현이 증가하는 것을 확인한 결과 (A)이며, IL-1β에 의해 증가된 Mmp3 및 Mmp13의 발현이 6'-시알릴락토오스에 의해 감소하는 것을 확인한 결과 (B)이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

관절염은 크게 비 염증성 관절염과 염증성 관절염으로 나눌 수 있는데, 비염증성 관절염으로는 골 관절염 (퇴행성관절염, osteoarthritis, OA)을 들 수 있고, 염증성 관절염으로는 류마티스 관절염을 대표적으로 들 수 있다 (Yusuf E et al., Ann Rheum Dis , 70:60-67,2011; Berebaum F et al., Osteoarthritis Cartilage, 21:16-21, 2013).

골 관절염은 일명 퇴행성관절염이라고도 불리며, 발병원인은 아직 분명하지 않지만, 유전, 외상, 비만, 노화, 대사이상 등과 같은 다양한 유발인자들이 이에 관여한다고 알려져 있다. 이러한 인자들에 의해 연골세포에서 공격인자와 방어인자 간의 균형이 깨지게 되고, 연골조직 파괴 촉진 및 연골 마모가 심화되면서 골관절염에 특징적인 병리학적 변화로 인해 환자는 통증을 느끼게 되고, 관절운동에 제한이 생긴다고 보고되어 있다 (pelletier JP et al., Arthritis Rheum., 4:1237-47, 2001).

반면, 류마티스관절염 (rheumatoid arthritis, RA)의 경우, 연골세포 및 연골조직 파괴로 인해 유발되는 퇴행성관절염과는 달리, 자가면역반응에 의한 질환의 진행이 중요한 원인 인자로 알려져 있다. 류마티스 관절염은 활막 세포의 염증과 증식을 특징으로 하는, 만성 자가면역 질환 (autoimmune diseases)으로서, 골관절염과 달리 관절 주위 뼈의 골다공증 및 골미란 등이 발생한다. 류마티스 관절염은 활막 (synovial membrane)의 염증이 관절막 (joint capsule)과 인대 (ligament), 건 (tendon)으로 퍼지고, 뼈로 침범하여 진행되게 된다. 따라서, 골관절염과 류미티스 관절염은 그 발명 원인 및 진행단계가 전혀 상이하며, 이에 대한 치료 방법도 상이하다.

지금까지 알려진 류마티스관절염 치료제로는 염증 기전을 차단하기 위해 적당한 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDs), 페니실라민, 스테로이드성 호르몬, TNF 억제제, 인터류킨 억제제, JAK 억제제, 항-CD 관련 억제제 등이 이에 해당한다 (Pritchard MH et al., Ann Rheum Dis , 37:493-503, 1978; 2014 Frost & Sullivan report: Product and pipeline analysis of the global rheumatoid arthritis therapeutics market). 관절 통증 및 염증 완화 목적으로 NSAID 약물 및 스테로이드성 호르몬이 퇴행성관절염 환자에 사용되고 있지만, 이는 질병 자체를 치료하기 보다는 증상만을 완화시키므로 실질적인 퇴행성관절염 치료제로서의 역할은 될 수 없다 (Abramson SB et al., Osteoarthritis Cartilage, 7:380-1, 1999). 뿐만 아니라, 연골세포 및 연골조직 파괴에 의해 주로 발생하는 퇴행성관절염은 그 발병 원인과 현상이 염증성 관절염인, 류마티스관절염과는 엄연히 다르기 때문에, 퇴행성관절염 치료방법 역시 류마티스관절염 치료방법과는 다를 수밖에 없다.

예를 들면, 퇴행성관절염 치료를 위해 2014년까지 개발되고 있는 치료제 대부분들은 Col2a1과 ECM 분비가 촉진되는 중간엽 줄기세포와 여러 구조체를 결합하여 연골이 파괴된 부분에 삽입하여 연골재생을 촉진시킬 수 있는 방향으로 진행되고 있다. 반면, 류마티스관절염 치료제의 경우, TNF 억제제, 인터류킨 억제제, JAK 억제제, 항-CD 관련 억제제 등을 개발함으로써 염증성 사이토카인을 원천적으로 억제하기 위한 방향으로 치료제 개발이 진행되고 있음을 확인할 수 있다 (2014 Frost & Sullivan report: 1. A product and pipeline Analysis of the Global knee cartilage repari market, 2. Product and pipeline analysis of the global rheumatoid arthritis therapeutics market). 즉, 다양한 관절염 형태에서 비염증성 성향을 가지고 있는 퇴행성관절염과 염증성 성향을 가지고 있는 류마티스 관절염의 치료 표적은 서로 다른 형태를 취하고 있음을 알 수 있다.

이러한 결과를 바탕으로 비교해 보면, 퇴행성관절염과 류마티스 관절염의 경우, 전혀 다른 질병원인이 존재하며, 또한 현재 개발되고 있는 치료제 역시 퇴행성관절염의 경우, 연골 재생을 중심으로, 류마티스관절염의 경우, 염증 억제를 기본으로 진행되고 있음을 확인할 수 있다. 따라서, 퇴행성관절염 치료를 위한 표적고 인자와 염증성 류마티스관절염 치료를 위한 표적 인자는 서로 다르게 적용되어야 한다.

본 발명의 용어 "퇴행성관절염 (osteoarthritis, OA) 및 "골관절염"은 혼용하여 사용되며, 동일한 의미로 이해되어야 할 것이다.

본 발명에서는 6'-시알릴락토오스가 연골세포에 독성은 나타내지 않으면서, 관절 형성에 중요한 역활을 하는 타입 II 콜라겐 (Col2a1)의 발현을 촉진시키며, 동시에 연골조직 파괴를 촉진하는 Mmp3, Mmp13의 발현을 억제시키는 것을 확인하였다. 또한, Col2a1 발현에 관여하는 전사인자 Sox-9의 활성 조절에도 6'-시알릴락토오스가 직접 관여하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일관점에서 6'-시알릴락토오스 (6'-sialyllactose) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 퇴행성관절염 (Osteoarthritis)의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 6'-시알릴락토오스는 이의 유도체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 "유도체"란 상기 6'-시알릴락토오스의 작용기를 도입, 치환, 산화, 환원 등에 의해서 모체의 구조와 성질을 대폭적으로 변화시키지 않는 한도에서 변화시킨 화합물을 의미한다. 이러한 작용기의 종류에는 제한이 없으며, 예컨대 각각 독립적으로 히드록시기, 페녹시기, 티에닐기, 푸릴기, 피리딜기, 시클로헥실기, 알킬알코올기, 알킬디알코올기, 또는 치환 또는 비치환된 페닐로 치환 또는 비치환된 C1 내지 C20의비사이클릭 탄화수소기; 히드록시기, 히드록시메틸기, 메틸기, 또는 아미노기로 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 사이클릭 탄화수소기; 또는 당 잔기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "당 잔기"란 다당류 분자로부터 1개의 수소 원자가 제거된 기를 의미하며, 따라서 예를 들어 단당류 또는 올리고당으로부터 유래된 잔기를 의미할 수 있다.

본 명세서에서, “치환된”은 별도의 정의가 없는 한, 작용기 중 하나 이상의 수소 원자가 할로겐(F, Cl, Br 또는 I), 히드록시기, 니트로기, 시아노기, 이미노기(=NH, =NR, R은 C1 내지 C10의 알킬기이다), 아미노기(-NH2,-NH(R'), -N(R")(R"'), R',R",R"'은 각각 독립적으로 탄소수 C1 내지 C10의 알킬기이다), 아미디노기, 히드라진기, 히드라존기, 카르복시산기, C1 내지 C20의 알킬기, C6 내지 C30의 아릴기, C3 내지 C30의 시클로알킬기, C3 내지 C30의 헤테로아릴기, 또는 C2 내지 C30의 헤테로시클로알킬기로 치환되는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 6'-시알릴락토오스 또는 6'-시알릴락토오스 유도체가 안정성을 나타내는 pH의 범위는 pH 4 내지 pH10인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 6'-시알릴락토오스의 약학적으로 허용가능한 염은 하기 화학식 1의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

[화학식 I]

본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 염"이란, 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약학적 염은, 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 카르복실산 염에는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함된다.

본 발명에 있어서, 상기 6'-시알릴락토오스의 약학적으로 허용가능한 염은 Na일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용한 시험 단일화합물은 6'-시알릴락토오스 (6'-sialyllactose)로 화학구조식은 C₂₃H₃₈NO₁₉Na이며, 모유에 많이 함유되어 있는 천연 유래의 단일화합물(single compound)이다 (도 2).

본 발명에 있어서, 6'-시알릴락토오스를 유효성분으로 함유하는 퇴행성관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 하기 특성 중 하나 이상을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다:

1) 타입 II 콜라겐 (Col2a1)의 발현 증가;

2) 기질금속단백질분해효소3 (Mmp3) 또는 기질금속단백질분해효소13 (Mmp13)의 발현 감소; 및

3) Sox-9 활성 증가.

본 발명에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. "제약상(약학적으로) 허용되는 담체"는 제제를 제제화하거나 또는 안정화시키는 것을 돕기 위해서 활성 성분에 추가될 수 있는 물질이고, 환자에게 유의한 해로운 독성 효과를 야기하지 않는다.

상기 담체는 환자를 자극하지 않고 본 발명에 따른 6'-시알릴락토오스의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 다른 담체는 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)]에 기재되어 있다.

제약상 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액제 또는 분산액제를 즉각 투여용(extemporaneous)으로 제조하기 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 조성물은 바람직하게는 비경구 주사용으로 제제화된다. 조성물은 용액제, 마이크로에멀젼제, 리포좀제, 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 주문된 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이것들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 멸균 주사가능한 용액제는 필요한 양의 6'-시알릴락토오스를 필요에 따라 상기 기재된 성분들 중 1 종 또는 이것들의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에 멸균 마이크로여과를 수행하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액제는 활성 화합물을 기본적인 분산 매질 및 상기 기재된 것들로부터의 기타 필요한 성분을 함유하는 멸균 비히클로 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사가능한 용액제를 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 일부 제조 방법은 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 이것의 미리 멸균-여과시킨 용액으로부터 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.

또한, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 고통받는 환자의 중증도에 따라 달라질 수 있는 투여량 및 빈도로 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 조성물은 필요에 따라 볼루스로서 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 수 있다.

본 발명의 6'-시알릴락토오스를 함유하는 조성물은 관절노화에 따른 연골조직 파괴를 억제하고 연골형성을 촉진시켜, 퇴행성관절염을 치료할 수 있다.

현재까지 알려진 퇴행성관절염 치료법으로는 인공관절치환술, 연골성형술, 연골이식술, 자기유래연골세포 이식술 등이 있으나, 인공관절치환술은 관절 절개가 필요하므로 환자의 고통 및 부담이 있고, 시술 과정이 복잡하고 까다롭다. 뿐만 아니라, 자가이식이 가능한 환자만을 대상으로 시행하기 때문에 치료의 제한적인 부분이 많이 존재한다 (Peterson L et al., J Bone Joint Surg Am, 85:17-24, 2003). 자가 유래 연골세포 이식술은 환자의 정상부위에서 채취한 연골조직으로부터 연골세포를 얻어, 체외에서 필요한 수 만큼 배양하고 증식한 후, 손상된 연골 부분을 채우는 방법이다. 하지만, 이 역시 공여 조직이 제한되어 있고, 이식용 조직을 채취하기 위한 수술을 필요로 하기 때문에 시술 과정이 복잡하고 까다롭다 (Yoon et al., Jorunal of Rheumatic Diseases, 19, 2012). 이밖에 자가유래 골수, 근육, 지방 등의 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 얻고, 체외에서 분화시켜 관절연골손상 부위에 주입하는 방법이 있다. 하지만, 중간엽 줄기세포를 TGF-b를 바탕으로 연골세포 분화시 중간엽 줄기세포가 비대연골세포로 분화될 위험이 있으며, BMP로 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화 시켰을 경우에는, 골증식체로 분화될 위험이 존재한다 (1. Park et al., J of Korean Orthopaedic Research Society, 18:2, 2015; Mamidi MK et al., Osteoarthritis Cartilage, 24:1307-16, 2016). 또한, 현재까지 개발된 퇴행성관절염 의약품이나 건강식품류 대부분이 실질적으로 퇴행성관절염 치료에 중요한 연골세포 활성 및 연골 재생 효과보단, 진통완화 및 항염증 효과에만 치중하는 경향을 보이고 있다.

따라서, 종래의 퇴행성관절염 치료 의약품이나 건강식품류가 가지고 있는 부작용, 연골재생 효과 저하 및 안전성 확보 등의 문제점을 해결할 수 있으며, 인체에 부작용이 없는 모유 성분 중 하나인 6'-시알릴락토오스는 퇴행성관절염 예방, 치료 또는 개선을 위한 원료로 유용하게 사용될 것으로 기대할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서 6'-시알릴락토오스 (6'-sialyllactose) 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 퇴행성관절염(Osteoarthritis)의 예방 또는 개선용 식품에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 6'-시알릴락토오스의 식품학적으로 허용가능한 염은 하기 화학식 1의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

[화학식 I]

본 발명에 있어서, 상기 6'-시알릴락토오스의 식품적으로 허용가능한 염은 Na일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식품은, 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 6'-시알릴락토오스를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지, 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치츠 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 6'-시알릴락토오스를 첨가하여 제조할 수 있다.

상기 건강 기능식품 또한, 식품조성물로써 기능성 식품, 영양보조제, 건강식품, 식품 첨가제 등의 다양한 형태를 포함하는 것이며, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태, 예컨대, 앞서 언급한 6'-시알릴락토오스를 차, 쥬스, 드링크의 형태로 제조하거나, 과립화, 캡슐화, 분말화 하거나, 이러한 화합물 또는 추출물을 음료, 과실 및 가공식품, 어유, 육류 및 그 가공식품, 빵류, 면류, 조미료 등 각종 식품에 첨가하여 제조함으로써 제공될 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 6'-시알릴락토오스에 의한 연골세포 독성 측정

연골세포 (Chondrocyte)는 생후 5일 정상 마우스의 대퇴골두 (femoral heads), 대퇴골 관절 (femoral condyles) 및 경골 고원부 (tibial plateaus) 유래의 연골 조직으로부터 수득하였다. 수득한 연골세포는 10%(v/v) 우태아혈청(fetal bovine serum, Gibco, USA), 50μg/ml의 스트렙토마이신(Sigma-Aldrich, USA) 및 50 unit/ml 페니실린(Sigma-Aldrich, USA)이 함유된 DMEM 배지(Gibco, USA)에서 배양하였다.

6'-시알릴락토오스가 연골세포에 독성이 없다는 것을 확인하기 위하여, 연골세포를 96well 배양 용기에 9×10³ cells/well 기준으로 배양한 후, 6'-시알릴락토오스 (Genechem Inc., 대전, 대한민국)를 0, 10, 50, 100, 250μM의 농도별로 각각 처리하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 6'-시알릴락토오스의 연골세포에 대한 독성은 EZ-Cytox Cell viablity assay kit (도젠, 대한민국)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.

그 결과, 6'-시알릴락토오스는 모든 농도에서 연골세포에 대한 세포독성이 없으며, 연골세포 증식에 나쁜 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다 (도 3).

실시예 2: 6'-시알릴락토오스에 의한 연골형성 및 재생 효과 확인

2-1: 타입 II 콜라겐 (Col2a1)의 발현 증가

6'-시알릴락토오스에 의한 연골형성 및 재생 효과 확인하기 위해, 실시예 1에서 수득한 연골세포를 36시간 배양 후 6'-시알릴락토오스를 0, 10, 50, 100, 250μM의 농도별로 각각 처리하여 36시간 추가 배양하였다.

그 다음, qRT-PCR을 수행하고자 연골세포로부터 TRI 시약(Molecular Research Center Inc.)을 이용하여 RNA를 추출하고, 상기 RNA를 역전사시켜 얻은 cDNA를 서열번호 1 및 2의 프라이머를 사용하여 어닐링 온도 55℃의 조건에서 PCR로 증폭하여 연골 형성에 중요한 type II collagen (Col2a1, 173bp)의 발현을 확인하였다. 대조군으로는 서열번호 3 및 4의 프라이머로 Gapdh (450bp, 어닐링 온도 58℃)를 확인하였다.

서열번호 1: 5'-CACACTGGTAAGTGGGGCAAGA-3(Col2a1-S)

서열번호 2: 5'-GGATTGTGTTGTTTCAGGGTTCG-3(Col2a1-AS)

서열번호 3: 5'-TCACTGCCACCCAGAAGAC-3(Gapdh-S)

서열번호 4: 5'-TGTAGGCCATGAGGTCCAC-3(Gapdh-AS)

그 결과, 6'-시알릴락토오스에 의해 연골세포 내 Col2a1 발현이 증가하는 것을 확인하였고, 이로 인해 연골형성 촉진에 효과가 있다는 것을 알 수 있었다 (도 4A).

2-2: IL-1β에 의해 억제된 타입 II 콜라겐 (Col2a1)의 발현 증가

IL-1β는 연골세포에서 Col2a1의 발현을 억제시키는 대표적인 염증성 사이토카인으로, 연골세포를 36시간 배양 후 5ng/ml의 IL-1β (GeneScript, 미국)를 24시간 처리하여 IL-1β에 의해 Col2a1의 발현이 감소됨을 확인하였다.

이렇게 감소된 Col2a1의 발현이 6'-시알릴락토오스에 의해 연골세포 내에서 다시 증가하는지 확인하기 위해, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 qRT-PCR를수행하였다.

그 결과, 연골세포에서 IL-1β에 의해 억제된 Col2a1이 6'-시알릴락토오스에 의해 점차적으로 발현이 증가됨을 확인하였다 (도 4B). 즉, 6'-시알릴락토오스로 인해 연골형성 및 재생이 촉진된다는 것을 알 수 있다.

실시예 3: 6 '- 시알릴락토오스에 의한 연골형성 및 재생 신호전달 활성화

연골형성 및 재생에 중요한 Col2a1의 발현은 Sox-9이라는 전사인자에 의해 조절되므로, 6'-시알릴락토오스에 의해 Sox-9 전사인자가 조절될 수 있는지 알아보았다.

Sox-9 리포터 유전자는 SV40 프로모터의 업스트림 부위에 인간 Col2a1 유전자의 첫 번째 인트론에 해당하는 부위에 48개 유전자로 구성된 Sox9 결합 부위가 pGL3 벡터에 삽입되어 있다 (Zhou G et al., J Biol Chem 1998, 12, 14989-97).

이러한 Sox-9 리포터 유전자 1μg을 리포펙타민 2000 (Invitrogen)을 이용하여 연골세포에 각각 3시간 동안 트랜스펙션 시켰다. 트랜스펙션된 세포들에 5ng/ml 인터루킨 1 베타 (IL-1β)와 동시에 0, 10, 50, 100, 250μM 6'-시알릴락토오스를 24시간 동안 처리한 후, 연골세포를 수득하여 Sox-9 활성을 루시퍼라제 활성을 통해 확인하였다.

그 결과, IL-1β에 의해 감소된 Sox-9의 활성은 6'-시알릴락토오스에 의해 회복되는 것을 확인할 수 있었다 (도 4C). 이는 6'-시알릴락토오스가 Sox-9의 활성을 직접 조절하고, 이를 통해 연골형성에 중요한 Col2a1의 발현이 조절되는 것을 나타냄을 알 수 있다. 즉, 6'-시알릴락토오스로 인해 연골형성 및 재생이 촉진된다는 것을 나타낸다.

실시예 4: 6'-시알릴락토오스에 의한 관절 염증 억제 및 연골파괴 억제 확인

IL-1β는 연골세포에서 연골형성에 중요한 Col2a1를 감소시키면서, 동시에 관절 염증 및 연골 조직 파괴를 촉진하는 대표적인 염증성 사이토카인이다. 연골세포에 5ng/ml의 IL-1β을 시간별로 처리한 다음, 실시예 2-1의 방법으로 하기 표 1의 조건 및 프라이머를 사용하여 qRT-PCR을 수행하여, Mmp3, Mmp13의 발현 억제를 확인하였다.

서열번호	서열 (5'-3')	센스/ 안티센스	유전자	크기(bp)	어닐링 온도 (AT, ℃)
5	TCCTGATGTTGGTGGCTTCAG	S	Mmp3	102	58
6	TGTCTTGGCAAATCCGGTGTA	AS	Mmp3	102	58
7	TGATGGACCTTCTGGTCTTCTGG	S	Mmp13	473	55
8	CATCCACATGGTTGGGAAGTTCT	AS	Mmp13	473	55

Mmp3 및 Mmp13과 같은 분비 단백질은 900 ㎕의 혈청-부재 조건 배지(conditioned medium)를 100 ㎕ TCA(trichloroacetic acid)와 반응시킨 후, 0℃에서 20분간 반응시켰다. 그 다음 12,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리기를 통해 상층액을 제거하고, 차가운 100% acetone 500 ㎕와 20℃에서 한 시간 반응시켰다. 100% acetone과 반응중인 샘플을 원심분리기를 통해 상층액을 제거하고, 단백질을 최종적으로 침전시킨 후 검출하여 항-Mmp3 항체 (Abcam) 및 항-Mmp13 항체 (Abcam)를 이용한 웨스턴 블랏팅 및 웨스턴 블랏 밴드를 컴퓨터 프로그램을 활용하여 밴드의 두께 및 농도를 측정하여 그 상대적인 값을 densitometer로 나타내었다.

그 결과, IL-1β에 의해 연골세포에서 관절 염증을 유발하는 연골 조직 파괴를 유도하는 Mmp3, Mmp13의 발현이 증가함을 확인하였다 (도 5A).

이에, 연골세포에 5ng/ml IL-1β 및 6'-시알릴락토오스 0, 10, 50, 100, 250μM를 24시간 동안 처리하여 Mmp3, Mmp13의 발현 정도를 확인하였다. 상기 표 1의 조건 및 프라이머를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였으며, 연골세포에서 IL-1β에 의해 증가된 Mmp3, Mmp13의 발현이 6'-시알릴락토오스에 의해 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 5B). 이는 6'-시알릴락토오스에 의해 관절 염증 및 연골 조직 파괴가 완화 및 억제될 수 있음을 나타낸 것이다.

통계분석

본 발명의 모든 실시예의 결과들은 상대적인 배수 변화(fold changes)로 표시된 qRT-PCR 데이터는 먼저 샤피로-윌크(Shapiro-wilk) 검정을 이용하여 정규 분포(normal distribution)을 확인한 후 쌍대 비교(pair-wisecomparisons) 및 다중 비교(multi-comparisons)를 위해 각각 Student's t-검정 및 사후검정(post hoc test)을 포함하는 ANOVA(analysis of variance)를 이용하였다. 통계적으로 유의성은 0.05 레벨의 확률로 받아들여졌다 (P < 0.05).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for Preventing or Treating Osteoarthritis Comprising 6'-Sialyllactose or Salts Thereof <130> P17-B098 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col2a1-S <400> 1 cacactggta agtggggcaa ga 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col2a1-AS <400> 2 ggattgtgtt gtttcagggt tcg 23 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh-S <400> 3 tcactgccac ccagaagac 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh-AS <400> 4 tgtaggccat gaggtccac 19 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mmp3-S <400> 5 tcctgatgtt ggtggcttca g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mmp3-AS <400> 6 tgtcttggca aatccggtgt a 21 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mmp13-S <400> 7 tgatggacct tctggtcttc tgg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mmp13-AS <400> 8 catccacatg gttgggaagt tct 23

Claims

6'-시알릴락토오스 (6'-sialyllactose) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 퇴행성관절염(Osteoarthritis)의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 6'-시알릴락토오스의 염은 하기 화학식 1의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
[화학식 I]
제1항에 있어서, 하기 특성 중 하나 이상을 가지는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
1) 타입 II 콜라겐 (Col2a1)의 발현 증가;
2) 기질금속단백질분해효소3 (Mmp3) 또는 기질금속단백질분해효소13 (Mmp13)의 발현 감소; 및
3) Sox-9 활성 증가.
제1항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
6'-시알릴락토오스 (6'-sialyllactose) 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 퇴행성관절염(Osteoarthritis)의 예방 또는 개선용 식품.
제5항에 있어서, 상기 6'-시알릴락토오스의 염은 하기 화학식 1의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 식품:
[화학식 I]