KR20220107698A - Rspo 단백질을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 RSPO1및 RSPO2으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 골관절염 치료 또는 개선용 조성물의 유효성분인 RSPO1 또는 RSPO2는 골관절염 병증 상태에서 연골 세포 또는 조골 세포의 분화를 촉진시킬 수 있는 바, 상기 조성물을 이용하여 골관절염을 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

RSPO 단백질을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물 {A pharmaceutical composition for preventing or treating osteoarthritis comprising RSPO protein as an active ingredient}

본 발명은 RSPO1및 RSPO2으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

관절연골의 손상 및 퇴행에 의해 국소적 염증 및 통증을 수반하는 골관절염 (osteoarthritis; OA)은 노년층 삶의 질과 정상적 사회활동을 저하시키는 주요 질환으로서 보통 남자보다 여자에서 발병율이 높으며, 60세 이상 인구의 30%에서 발병된다. 환자의 수는 노령 인구의 증가에 따라 크게 증가하는 추세에 있으며 LEK 보고서에 따르면 2014~2028년 미국 내 골관절염 환자의 발생도는 매년 2.8%의 증가세를 보일 것으로 예상하고 있다. 최근에는 외상 스트레스나 여성의 경우 높은 굽 등으로 인한 젊은 연령층에서도 늘어나는 추세이다.

골관절염의 기존 치료법은 정확한 치료제가 없으며 현재까지 비약물적인 치료가 약물적인 치료보다 큰 비중을 이루고 있다. 약물로는 염증과 통증 등의 증상을 완화시키는 NSAID 계열의 진통소염제나 스테로이드 제제, 글루코사민 등이 있고 관절내 주사로 윤활작용을 통해 관절을 보호하는 히알루론산 등의 치료법이 주를 이루고 있다.

골관절염 증세가 심한 경우 비약물적 치료인 인공관절대체술 같은 수술요법을 시행하나 재활기간이 필요하고 대체관절의 수명이 제한적 (10년 이내)이며 비용 및 치환물의 부식에 의한 염증, 2차 감염등의 부작용의 이유로 임상적 측면에서 가능한 수술을 최대한 지연시키는 치료법이 요구되고 있으며, 기존 치료법의 효능 및 부작용을 고려할 때, 안전하고 관절마모 방어에 효과적인 새로운 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

J Exp Med. 2002, 21;195(2):201-9.

본원의 제 1 측면은, RSPO1 및 RSPO2으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본원의 제 2 측면은, RSPO1 및 RSPO2으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본원의 제 3 측면은, RSPO1 및 RSPO2으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본원의 제 4 측면은, RSPO1 및 RSPO2으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본원의 제 1 측면은, RSPO1(Rspondin 1) 및 RSPO2(Rspondin 2)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "R-스폰딘(R-spondins, RSPOs)"은 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및 RSPO4의 4개의 구성원을 포함하는 패밀리 단백질로서, 트롬보스폰딘 타입 1 반복(TSR-1)-함유 단배질의 슈퍼 패밀리에 속한다. 　RSPO는 전체적으로 약 40-60%의 서열 상동성 및 도메인 구성을 공유하는 소형 분비형 단백질로서, 모든 RSPO 단백질은 N-말단의 2개의 푸린-유사 시스테인-풍부 도메인에 이어지는 트롬보스폰딘 도메인 및 염기성 전하를 띠는 C-말단 꼬리를 함유하는 것으로 알려져 있다. 또한, RSPO는 척추 동물 발달 및 줄기 세포 성장에서 다면발현성(pleiotropic)의 기능을 갖는다고 알려져 있다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "골관절염(osteoarthritis, OA)"은 관절을 보호하고 있는 연골의 손상이나 퇴행성 변화로 인해 관절을 이루는 뼈와 인대 등에 손상이 생겨 염증과 통증이 발생하는 질환으로서, 퇴행성 관절염(degenerative arthritis)이라고도 불린다. 일차성(특발성) 골관절염의 확실한 원인은 밝혀져 있지 않으나 나이, 성별, 유전적 요소, 비만, 특정 관절 부위 등이 영향을 주는 것으로 생각되고 있으며, 이차성(속발성) 골관절염은 관절 연골에 손상을 줄 수 있는 외상, 질병 및 기형이 원인이 될 수 있다. 가장 흔하고 초기에 호소하는 증상은 관절염이 발생한 관절 부위의 국소적인 통증이며 대개 전신적인 증상은 없는 것이 류마티스 관절염과의 차이점 중 하나이다. 골관절염은 관절 연골의 퇴행성 변화에 의해 발생되므로 이를 완전히 정지시킬 수 있는 확실한 방법은 아직까지 알려진 바 없으며, 본 질환의 치료 목적도 환자로 하여금 질병의 성질을 이해하도록 하여 정신적인 안정을 마련해 주면서, 통증을 경감시켜 주고, 관절의 기능을 유지시키며, 변형을 방지하는데 있다. 그러나 변형이 이미 발생한 경우에는 이를 수술적으로 교정하고 재활 치료를 시행하여 관절의 손상이 빨리 진행되는 것을 예방하고, 환자가 동통을 느끼지 않는 운동 범위를 증가시킴으로써 환자의 일상 생활에 도움을 주는데 목적이 있다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "치료"는, 본원의 조성물의 투여에 의해 골관절염 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "예방"은, 본원의 조성물의 투여에 의해 골관절염 질환 또는 질환의 발병 가능성이 억제되거나 지연되는 모든 행위를 의미한다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RSPO1는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 서열번호 17의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RSPO2는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다, 구체적으로 상기 서열번호 18의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물은 RSPO1 및 RSPO2를 모두 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RSPO1는 조골 세포의 분화를 촉진시키는 것일 수 있으며, 구체적으로 조골 세포의 분화를 촉진시켜 골세포 형성을 유도하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RSPO2는 연골 세포의 분화를 촉진시키는 것일 수 있으며, 구체적으로 연골 세포의 분화를 촉진시켜 연골 조직 형성을 유도하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RSPO2는 LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled Receptor 5)와 결합하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 LGR5는 RSPO2의 수용체일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RSPO1은 LGR6(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled Receptor 6)와 결합하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 LGR6는 RSPO1의 수용체일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 약학 조성물을 제제화할 경우, 일반적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 또는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 약학 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.

상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 들 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화될 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등이 사용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본원의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본원의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본원의 약학 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 골관절염에 대한 치료 효과를 나타내는 것으로 알려진 성분과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본원의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1ng 내지 약 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 100 mg/kg로 투여할 수 있고, 본원의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량 또는 투여횟수는 어떠한 면으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다.

본원의 다른 측면에 따르면, 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골관절염의 예방 또는 치료방법이 제공되는 것일 수 있다. 상기 약학 조성물과 중복되는 내용은 상기 방법에 동일하게 적용될 수 있다.

본 명세서 전체에서 사용되는 용어 "개체"는 골관절염 또는 이의 증상이 발병되거나 발병할 위험이 있는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 개체는 인간을 제외하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 주사제, 수액제(링겔), 캡슐제, 환제, 정제, 좌제 또는 패치의 형태로 제형화되어 투여할 수 있다.

본원의 골관절염 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다.

본원의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피패치투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 제형화되지 않은 형태로도 투여할 수 있고, 위산에 의하여 상기 조성물이 변성 또는 분해될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화된 형태 또는 경구용 패치형태로 구강내에 투여할 수도 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본원의 제 2 측면은, RSPO1 및 RSPO2으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기에서 전술한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RSPO1의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제는 조골 세포의 분화를 촉진시키는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RSPO2의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제는 연골 세포의 분화를 촉진시키는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물은 RSPO1의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제 및 RSPO2의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제를 모두 포함하는 것일 수 있다.

본원의 제 3 측면은, RSPO1 및 RSPO2으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 상기에서 전술한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.

본 명세서 전체에서 사용되는 용어 "개선"은, 상기 조성물의 투여로 골관절염 및 이의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RSPO1는 조골 세포의 분화를 촉진시키는 것일 수 있으며, 구체적으로 조골 세포의 분화를 촉진시켜 골세포 형성을 유도하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RSPO2는 연골 세포의 분화를 촉진시키는 것일 수 있으며, 구체적으로 연골 세포의 분화를 촉진시켜 연골 조직 형성을 유도하는 것일 수 있다.

본 명세서 전체에서 사용되는 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

본 명세서 전체에서 사용되는 용어 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'이라 함은 영양소를 공급하는 기능 이상으로 특별히 건강에 유익한 효과를 가져오는 기능, 즉 생체 방어, 질병의 예방 및 회복, 신체 리듬의 조절 등의 기능을 가진 식품을 의미하며, 본 발명에 따른 건강 기능성 식품 조성물은 상술한 다양한 골관절염 및 이의 증상 개선에 유효한 효과를 가진다.

본 발명의 식품 조성물은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품은 골관절염 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강 보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강 식품, 건강 보조 식품의 용어는 혼용될 수 있다. 구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 본원의 조성물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.

본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 장내 환경 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.

상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신 (niacin), 비오틴 (biotin), 폴레이트 (folate), 판토텐산 (panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본원의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ?g, 구체적으로 약 0.02 ?g이 될 수 있다.

상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 식품 조성물은 골관절염 및 이의 증상을 개선할 수 있다면 본 발명의 조성물은 다양한 중량%로 포함할 수 있으며, 구체적으로 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다.

본원의 제 4 측면은, RSPO1 및 RSPO2으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 전술한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RSPO1의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제는 조골 세포의 분화를 촉진시키는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RSPO2의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제는 연골 세포의 분화를 촉진시키는 것일 수 있다.

본 발명의 골관절염 치료 또는 개선용 조성물에 따르면, 상기 조성물의 유효성분인 RSPO1 또는 RSPO2는 골관절염 병증 상태에서 연골 세포 또는 조골 세포의 분화를 촉진시킬 수 있는 바, 상기 조성물을 이용하여 골관절염을 효과적으로 치료할 수 있다.

도 1은 인간 OA 연골 샘플에서 RSPOs, LGRs 및 β-카테닌의 발현을 확인한 도면으로서, 대퇴골과 연골로부터 수득한 초기 및 경과 단계에 있는 OA 연골 조직 샘플에서 H&E 염색, 사프라닌-O 염색 및 루브리신의 면역조직화학법 결과를 나타낸다[약 10배율, 기준자: 100 μm, AS(Articular surface): 관절면, SB(Subchondral bone): 연하골, OA(Osteoarthritis): 골관절염]
도 2는 인간 OA 연골 샘플에서 RSPOs, LGRs 및 β-카테닌의 발현을 확인한 도면으로서, 면역조직화학법은 OA 연골에서 RSPOs의 발현이 초기 단계와 비교하여 경과 단계에서 유의미하게 증가하고 있음을 보여준다. 상기 도면에서 점선의 위쪽 부분은 관절 연골을 나타내고 아래쪽 부분은 연하골을 나타낸다[약 10배율, 기준자: 100 μm, AS(Articular surface): 관절면, SB(Subchondral bone): 연하골, OA(Osteoarthritis): 골관절염]
도 3은 인간 OA 연골 샘플에서 RSPOs, LGRs 및 β-카테닌의 발현을 확인한 도면으로서, 면역조직화학법은 OA 연골에서 LGRs 및 β-카테닌의 발현이 초기 단계와 비교하여 경과 단계에서 유의미하게 증가하고 있음을 보여준다. 상기 도면에서 점선의 위쪽 부분은 관절 연골을 나타내고 아래쪽 부분은 연하골을 나타낸다[약 10배율, 기준자: 100 μm, AS(Articular surface): 관절면, SB(Subchondral bone): 연하골, OA(Osteoarthritis): 골관절염]
도 4는 분화 과정 동안 인간 1차 연골 세포에서의 RSPOs의 발현을 나타낸 도면으로서, 분화를 유도하기 위해 연골 세포를 1X ITS-X 보충제로 처리했고, mRNA 수준은 분화 2, 7 및 14 일 후 qRT-PCR에 의해 측정되었으며, 결과는 GAPDH 발현수준과 비교하여 배-증가로 표시하였다. 상기 데이터는 세 개의 독립적인 실험의 평균±SD로 표시된다. *; P

0.05, **; P≤0.01, ***; P≤0.001.
도 5는 분화 과정 동안 인간 1차 연골 세포에서의 LGRs의 발현을 나타낸 도면으로서, 분화를 유도하기 위해 연골 세포를 1X ITS-X 보충제로 처리했고, mRNA 수준은 분화 2, 7 및 14 일 후 qRT-PCR에 의해 측정되었으며, 결과는 GAPDH 발현수준과 비교하여 배-증가로 표시하였다. 상기 데이터는 세 개의 독립적인 실험의 평균±SD로 표시된다. *; P

0.05, **; P≤0.01, ***; P≤0.001.
도 6은 분화 과정 동안 인간 1차 연골 세포에서의 RSPOs 및 LGRs의 발현을 나타낸 도면으로서, 단백질 수준은 분화 2, 7 및 14 일 후 웨스턴 블랏팅에 의해 측정되었으며, 단백질의 정량적 밀도 분석은 Fusion FX 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 상기 결과는 β-액틴 발현으로 표준화 하였다. 상기 데이터는 세 개의 독립적인 실험의 평균±SD로 표시된다. *; P

0.05, **; P≤0.01, ***; P≤0.001.
도 7은 분화 과정 동안 인간 1차 조골 세포에서의 RSPOs의 발현을 나타낸 도면으로서, 분화를 유도하기 위해 조골 세포를 10mM β-글리세로인산염 및 50μg/ml 아스코르브산으로 처리했고, mRNA 수준은 분화 2, 7 및 14 일 후 qRT-PCR에 의해 측정되었으며, 결과는 GAPDH 발현수준과 비교하여 배-증가로 표시하였다. 상기 데이터는 세 개의 독립적인 실험의 평균±SD로 표시된다. *; P

0.05, **; P≤0.01, ***; P≤0.001.
도 8은 분화 과정 동안 인간 1차 조골 세포에서의 LGRs의 발현을 나타낸 도면으로서, 분화를 유도하기 위해 조골 세포를 10mM β-글리세로인산염 및 50μg/ml 아스코르브산으로 처리했고, mRNA 수준은 분화 2, 7 및 14 일 후 qRT-PCR에 의해 측정되었으며, 결과는 GAPDH 발현수준과 비교하여 배-증가로 표시하였다. 상기 데이터는 세 개의 독립적인 실험의 평균±SD로 표시된다. *; P

0.05, **; P≤0.01, ***; P≤0.001.
도 9는 분화 과정 동안 인간 1차 조골 세포에서의 RSPOs 및 LGRs의 발현을 나타낸 도면으로서, 단백질 수준은 분화 2, 7 및 14 일 후 웨스턴 블랏팅에 의해 측정되었으며, 단백질의 정량적 밀도 분석은 Fusion FX 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 상기 결과는 β-액틴 발현으로 표준화 하였다. 상기 데이터는 세 개의 독립적인 실험의 평균±SD로 표시된다. *; P

0.05, **; P≤0.01, ***; P≤0.001.
도 10은 염증 조건에서 연골 세포 분화 동안 RSPO2 처리에 따른 결과를 나타낸 도면으로서, 인간 1차 연골 세포를 1X ITS-X로 처리하여 7일 동안 분화시키고, TNFα (T: 10 ng/ml), RSPO2 (R2: 100 ng/ml) 또는 이들의 조합을 처리하였다. 처리 24시간 후에 Cox-2, IkBα, Col2, Sox-9 및 β-카테닌의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. 단백질의 정량적 밀도 분석은 Fusion FX 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 상기 데이터는 세 개의 독립적인 실험의 평균±SD로 표시된다. *; P

0.05, **; P≤0.01, ***; P≤0.001.
도 11은 염증 조건에서 조골 세포 분화 동안 RSPO1 처리에 따른 결과를 나타낸 도면으로서, SaOS-2 세포를 10mM β-글리세로인산염 및 50μg/ml 아스코르브산로 처리하여 7일 동안 분화시키고, TNFα (T: 10 ng/ml), RSPO1 (R1: 100 ng/ml) 또는 이들의 조합을 처리하였다. 처리 24시간 후에 Cox-2, IkBα, Col1α, OSX 및 β-카테닌의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. 단백질의 정량적 밀도 분석은 Fusion FX 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 상기 데이터는 세 개의 독립적인 실험의 평균±SD로 표시된다. *; P

0.05, **; P≤0.01, ***; P≤0.001.
도 12는 RSPO1(A 및 B) 및 RSPO2(C 및 D)의 단백질 3D 구조를 나타낸 도면이다.

이하 본원을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 조직화학법(Histochemistry)

본 발명의 실시예 및 실험예에서는, 고관절 교체(hip replacement) 수술을 받은 건강한 환자 (약 58 ~ 80세)로부터 인간 대퇴골과(femoral condyles)로부터 연골 조직 샘플을 채취했다. 춘천 한림 대학교 성심병원 윤리위원회로부터 실험 절차에 대해 검토 및 허가받았다(2009-42). 이식된 연골 손상의 상태를 조사하기 위해 초기 및 진행된 OA 단계와 관련된 대퇴골과 연골 조직의 무작위 샘플에서 조직 화학적 염색을 수행했다. 이식된 대퇴골두(femoral head)를 멸균된 상태에서 세척하고 수득한 연골 연조직을 2% 파라포름알데히드 (PFA, Merck, USA) 용액에 24시간 동안 침지시켜 고정시켰다. 샘플을 파라핀 왁스에 포매(embedding)하기 전에 10% 에틸렌디아민테트라아세트산 용액 (EDTA, Sigma-Aldrich, USA)에서 석회화를 제거했다. 또한, 염색하기 전에 조직에서 파라핀을 제거하고 재수화했다.

실시예 2: 헤마톡실린-에오신 염색법 (Hematoxylin and eosin (H&E) staining)

파라핀에 포매된 샘플에서 파라핀을 제거하고, 재수화하고 5μm 두께의 단면 샘플로 절단했다. 형태학적 세부사항을 설명적 분석하기 위해, 모든 연골 아형 샘플로부터 대표적인 단면을 헤마톡 실린 & 에오신 (Hematoxylin and eosin, H&E)으로 염색했다. 10배 배율의 광학 현미경 (Zeiss AxioCam 디지털 카메라, Carl Zeiss, 독일)을 사용하여 염색된 부분을 시각화하고 사진을 찍었다.

실시예 3: 사프라닌-O 염색법(Safranin-O staining)

사프라닌-O(Safranin-O) 염색은 하기의 과정을 수행하였다. 구체적으로, 바이게르트철헤마톡실린(Weigert's iron hematoxylin) 수용액에 약 10분동안 담근 후, 샘플을 일반 알칼리성 수돗물로 10분동안 헹구었다. 샘플을 5분 동안 fast green solutio으로 염색하고 10초동안 1% 아세트산에 담구었다. 그 후, 0.1% 사프라닌-O 용액 (Sigma-Aldrich, USA)을 사용하여 5분 동안 샘플을 염색하고, 등급화된 일련의 알코올을 사용하여 샘플을 탈수시켰다. 다음으로, 상기 샘플을 자일렌으로 클리어하였다. 마지막으로, 상기 각 샘플은 관찰 및 이미지 획득을 위해 수지 봉입제(resinous mounting medium)를 이용하여 마운트시켰다. 상기 샘플을 현미경을 이용하여 Х10 배율로 시각화하고 Ziess AxioCam 디지털 카메라로 사진을 찍었다.

실시예 4: 면역조직화학법(Immunohistochemistry, IHC)

Lubricin, RSPO 및 LGR은 제조업체(Santa Cruz Biotechnology, USA)의 프로토콜에 따라 2단계의 면역조직화학법을 사용하여 면역 염색되었다. 구체적으로, 조직 절편은 1:500으로 희석된 lubricin (Santa Cruz Biotechnology, USA), RSPO1 (Sigma-Aldrich, USA), RSPO2 (Sigma-Aldrich, USA), LGR5 (Sigma-Aldrich, USA), LGR6. (Abcam, England) 및 β-catenin (Santa Cruz Biotechnology, USA)에 대한 토끼 폴리클로날 항체로 4℃에서 처리되었다. 상기 조직 슬라이드를 PBS (Phosphate-Buffered Saline, Wel Gene, Korea)로 세 번 세척하고 염소 항-토끼 면역글로불린 G (IgG, Santa Cruz Biotechnology, USA)를 실온에서 30분 동안 처리했다. 각 단면은 Zeiss Axio Cam 디지털 카메라로 10배 배율로 촬영되었다.

실시예 5: 1차 인간 연골세포(primary human chondrocytes)의 제작

인간 대퇴골과로부터의 연골 샘플은 멸균 환경에서 100mm 접시에서 절개했다. 상기 샘플은 샘플은 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin, P/S, Gibco, USA)이 첨가되고 10% 소태아혈청 (FBS, Gibco, USA)을 포함하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco, USA)으로 지속적으로 헹궜다. 접시에서 히알루로니다아제(Hyaluronidase)로 분해한 후, 멸균된 블레이드를 사용하여 연골 샘플을 작은 조각으로 절개했다. 무혈청 DMEM 배지에서 다진 연골 조각을 2회 세척하고 37℃ 및 5% CO₂에서 1시간 동안 프로테아제 버퍼를 처리했다. 다시, DMEM (무혈청)에서 연골 단편을 두 번 헹구고, 상기와 유사한 조건에서 약 2시간 30분동안 콜라게나아제(collagenase)를 이용하여 효소 분해를 수행했다. 효소 분해가 완료된 용액을 70μm의 세포 스트레이너를 통해 여과하고 50ml 튜브에 보관하였다. 이후, 배지를 1500rpm의 속도로 5분 동안 원심분리한 후 수득된 펠렛을 2회 헹구었다. 다음으로, 상기 세포 펠렛을 complete DMEM (20% FBS 및 1% P/S)으로 재현탁하고, 3일 후 10 % FBS 및 1 % P/S을 포함하는 DMEM 배지로 교체했다.

실시예 6: 분화를 위한 1차 인간 연골세포의 펠렛 배양

연골 세포 분화를 유도하기 위해, 5x10⁵개의 세포를 포함하는 분취액을 250g에서 5분 동안 원심 분리했다. 그런 다음, 연골 세포를 1X 인슐린-트랜스페린-셀레늄 X 보충 프리믹스(1X insulin-transferrin-selenium X supplement premix) (ITS-X, Gibco, USA)로 처리했다. 24 시간의 배양 후 각 튜브의 바닥에서 침전된 세포의 구형 응집체가 관찰되었다. 대조군으로서 1x10⁵ 세포를 60mm 접시에서 배양하였다. 1차 인간 연골 세포는 2일, 7일 및 14일동안 분화되었다. 세포는 37℃ 및 5 % CO₂의 최적 조건에서 배양되었으며, 일단 부착되면 세포를 배양하고 3일마다 배지를 교체하였다.

실시예 7: 조골세포(osteoblast)의 배양과 분화

SaOS-2 세포 (인간 골육종 세포주, ATCC, HTB-85)를 complete DMEM (10 % FBS 및 1% P/S)에서 성장시켰다. 분화를 유도하기 위해 50μg/ml 아스코르브산 (ascorbic acid, Sigma-Aldrich, USA) 및 10mM β-글리세로인산염(β-glycerophosphate, Sigma-Aldrich, USA)를 포함하는 골형성 배지에서 조골세포를 성장시켰다. 웰 당 1x10⁵ 세포를 60mm 페트리 접시에 분주하고 37℃ 및 5 % CO₂의 조건에서 성장시켰다. 골 형성 배지에서 3일 배양 후 교체 하였다. 조골세포는 2, 7, 14일 동안 분화되었다.

실시예 8: RNA 분리 및 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)

제조업체의 지침에 따라 TRIzol 시약 (Invitrogen, USA)을 사용하여 전체 RNA를 분리했다. cDNA의 첫 번째 가닥은 SuperScript Ⅱ (Invitrogen, USA) 및 2μg의 총 RNA를 사용하여 합성되었다. 각 PCR 혼합물에 대해 cDNA의 10분의 1을 각각의 qRT-PCR supermix (EXPRESS SYBR green, BioPrince, Korea)에 사용했다. qRT-PCR은 Rotor-Gene Q (Corbett RG3000, Australia)를 사용하여 수행되었다. PCR 반응은 95℃에서 20초, 60℃에서 20초, 72℃에서 25초로 50 사이클 증폭으로 수행되었다. 특정 유전자의 상대적 mRNA 발현 수준을 GAPDH로 표준화하고, 델타-델타 Ct (delta-delta Ct, △△Ct) 방법을 사용하여 정량화했다. 본 발명의 실시예 및 실험예에서 사용한 인간 PCR 프라이머 서열은 하기 표 1에 기재하였다.

유전자	프라이머 서열(5'-3')		서열번호
RSPO1	F	AGGCCTGCTTCAAGCCATAACTTCT	1
	R	GCTCATTTCACATTGCGCAGGACT	2
RSPO2	F	TGGCTCAGTGTGTGCTGAGAGAAT	3
	R	AAGGTCACGAGTGAGTAGCGCATT	4
RSPO3	F	TGCACTGTGAGGTCAGTGAATGGA	5
	R	AGGTTACCCTTTGCTGAAGGATGC	6
RSPO4	F	ACCACCAGTGACTTGAGCATCTGT	7
	R	TGATGGCAGAAGGATAGGCAGTGA	8
LGR4	F	TTGTGGGCAACTTCAAGCTG	9
	R	AACCCCAAAATGCACAGCAC	10
LGR5	F	TGTTTCAGTGGCCTGCATTC	11
	R	AAGGTCATGGCTTGCAATGC	12
LGR6	F	AACAACATCAAGGCCATCCC	13
	R	ATGCCGATCTTCCCACAAAC	14
GAPDH	F	TTCAGCTCAGGGATGACCTT	15
	R	ACCCAGAAGACTGTGGATGG	16

실시예 9: 단백질 추출 및 웨스턴 블랏팅

배지를 제거한 후 세포를 차가운 PBS로 즉시 헹구고 포스파타제(phosphatase) 및 프로테아제(protease) 억제제를 포함하는 용해 칵테일 버퍼 (Roche Diagnostics, Germany)로 15분 동안 인큐베이션하였다. 15분 동안 14,000 rpm에서 원심분리한 후, 전체 세포 용해물을 수집했다(세포 파편에서 분리). 제조업체의 프로토콜에 따라 단백질 분석 키트 (BioRad, USA)를 사용하여 샘플의 단백질 양을 결정했다. 각 샘플에 대해 동일한 양의 단백질을 10% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)-폴리아크릴아미드젤(polyacrylamide gel, PAGE)에 로딩한 다음, 젤 전기 영동을 수행했다. 그런 다음 분리된 단백질을 PVDF(polyvinylidene fluoride) 막(Millipore, USA)으로 옮겼다. 상기 블랏은 1% BSA 용액에 1:1000로 희석된 하기의 1차 항체로 인큐베이션되었다: RSPO1, RSPO2, LGR5 and LGR6, Col1α, Col2, osterix, IkBα, β-catenin, β-Actin (Santa Cruz Biotechnology, USA), Sox-9 (Abcam, USA) 및 Cox-2 (Cell Signaling Technology, USA). 블롯을 TBST (10mM Tris HCl, 50mM NaCl, 0.25 % Tween 20)로 3회 세척한 다음 HRP-결합(horseradish peroxidase-conjugated) 2차 항체 (Jackson Immunoresearch, USA)로 처리한 다음 TBST로 2회 세척했다. 마지막으로, 상기 실험들을 통해 얻은 밴드는 화학발광 (ECL) 시약 (BioNote Inc., Korea)을 사용하여 시각화하였다. β-액틴에 대한 항체는 로딩 대조군으로 간주되었다. 웨스턴 블롯의 밀도계 분석 또한 수행되었다 (Fusion FX, Vilver Lourmat, France).

실시예 10: 통계적 분석

모든 통계 데이터는 Graphpad Prism (GraphPad Software, USA)에 의해 평가되었으며, 양측 스튜던트 T 검정(two-tailed Student t test)로 평가되었다. 통계적 유의성은 P<0.05, P<0.01, P<0.001을 고려하였다.

실험예 1: 인간 OA 샘플의 초기 및 경과 단계에서 RSPO 및 LGR 단백질들의 차별적 발현 분석

인간 환자의 OA 조직 샘플에서 RSPO(R-spondin) 단백질과 그 수용체인 LGR(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled Receptors)의 발현 패턴을 확인하기 위해, 먼저, 조직 단면을 초기 또는 경과 단계 샘플로 분류하고, 상기 실시예에서 기재한 방법으로 lubricin, RSPO, LGR 및 β-catenin과 같은 단백질에 대한 면역염색을 수행하였다. 그 결과, H&E, lubricin 및 사프라닌-O 염색은 초기 OA 샘플의 경우 손상되지 않은 연골 구조를 보여준 반면, 경과 OA 샘플에서는 관절 표면 손실, lubricin 발현 감소 및 연골 너비 감소 등이 관찰되었다 (도 1). 또한, 경과 단계의 OA 샘플에서, 공간적 RSPO1 발현은 석회화된 연골의 하부 영역과 얇은 피질 뼈 조직층을 포함하는 연하골 플레이트(subchondral bone plate) 근처에서 관찰되었다 (도 2). 그러나, 초기 단계 OA 샘플에서는 RSPO1의 국소 발현이 관찰되지 않았고, LGR6의 발현은 RSPO1의 발현과 겹치는 것으로 확인되었다(즉, 연하골 플레이트 근처) (도 3). 경과 단계 조직 샘플에서 연골의 상층이 기형화된 것으로 발견되었기 때문에, RSPO2의 공간적 발현은 관절 연골의 중간 및 깊은 영역으로 매우 국한되었다. LGR5 발현은 관절 연골 영역의 중간 및 깊은 영역에 가까운 RSPO2의 발현 영역 근처에서 관찰되었다. 한편, RSPO2 또는 LGR5의 발현은 초기 OA 샘플에서 보이지 않았다. 또한, 초기 및 경과 단계 OA 샘플에서 β-catenin의 발현 수준을 분석한 결과, 경과 단계 OA 샘플에서 β-catenin의 발현 수준은 RSPO1 및 RSPO2의 중첩된 영역 주변에서 증가하는 것을 확인하였다.

실험예 2: 연골 세포 분화 과정에서 RSPO 단백질과 그 수용체의 mRNA 발현 프로파일 분석

RSPO2는 경과 단계 OA 조직 샘플에서 수용체인 LGR5와 함께 증가된 발현 수준을 보여 주었기 때문에, 분화된 연골 세포에서 RSPO 계열 단백질의 발현 패턴을 분석하고자 하였다.

먼저, 1 차 연골 세포를 펠렛 배양으로 배양하고, ITS-X(Insulin-Transferrin-Selenium-X 보충제 1X)로 처리하여 14일 동안 분화를 유도했다. 상기 연골세포 분화 과정의 2일, 7일 및 14일??에 mRNA를 수집하였으며, 상기 mRNA를 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다.

그 결과, qRT-PCR 데이터는 분화 7일 후(10배) 및 14일 후(16배)까지 RSPO2의 발현이 상당히 증가한 것으로 나타났으며, RSPO3 및 RSPO4의 발현 패턴의 경우에는 분화 14일 후 3배 정도의 작은 증가가 관찰되었다(도 4). RSPO 수용체의 경우, LGR5는 분화 7일 후(10배) 및 14일 후(15배)에 상당히 증가된 mRNA 발현 수준을 나타냈다. 또한, 다른 수용체인 LGR4 및 LGR6의 경우 mRNA 발현 수준은 큰 변화를 보이지 않았다 (도 5).

웨스턴 블롯 결과는 14일까지의 분화 과정의 2일째 인간 1차 연골세포 펠렛 배양에서 RSPO2의 단백질 발현을 입증함으로써 mRNA 발현 결과를 뒷받침했다. 반면 분화 과정동안 RSPO1 단백질의 발현은 관찰되지 않았다. 또한, LGR5의 단백질 발현은 연골세포의 분화과정동안 증가되는 것으로 관찰되었다(도 6). 연골 형성 마커와 같은 Col 2(collagen 2) 및 마스터 전사 인자인 Sox-9 (sex-determining region Y-type high mobility group box protein)의 발현 수준 증가를 통해 연골세포의 분화 과정이 유도되고 있음을 확인하였다.

상기 결과를 토대로, 연골 세포의 분화 과정에서 RSPO2의 발현 수준이 증가되며, 이의 수용체인 LGR5의 발현 수준 또한 증가하는 것을 알 수 있다.

실험예 3: 조골 세포 분화 과정에서 RSPO 단백질과 그 수용체의 mRNA 발현 프로파일 분석

조골 세포는 골 세포(osteocytes)로 분화하고 뼈 형성에 기여하는 것으로 잘 알려져 있다. 상기 과정은 RSPO와 같은 여러 조절 분자에 의해 엄격히 조절된다. 조골 세포 분화 과정 동안의 RSPO의 발현 패턴을 관찰하기 위해, β-글리세로염산염 (10 mM) 및 아스코르브산(50 μg/ml)를 처리하여 SaOS-2 세포가 분화하도록 유도하였다. 상기 조골 세포 분화 과정의 2일, 7일 및 14일??에 SaOS-2 세포로부터 mRNA를 수집하였으며, 상기 mRNA를 이용하여 RSPO1, RSPO2, RSPO3 및 RSPO4의 발현 수준과 RSPO의 수용체인 LGR4, LGR5 및 LGR6의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석했다. RSPO 중 RSPO1의 mRNA 발현 수준은 분화 과정의 7일 후 (12배) 및 14일째 후(20배)까지 유의하게 증가하는 것으로 확인되었으며, 다른 RSPO의 mRNA 발현 수준은 분화 과정의 14일 동안 유의하게 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다(도 7). 또한, RSPO에 대한 수용체 중 LGR6은 분화 7일 후(3 배)부터 14일 후까지 발현이 증가하는 것으로 확인되었고, LGR4와 LGR5는 조골 세포 분화 과정에서 mRNA 발현 수준에 유의한 변화를 보이지 않았다(도 8).

다음으로, mRNA 수준에서 RSPO와 그 수용체의 발현을 확인하기 위해, 웨스턴 블랏팅을 통해 유의미하게 발현된 유전자의 단백질 수준을 분석하였다. 그 결과, SaOS-2 세포에서 분화 과정 2일 후부터 14일 후까지 RSPO1의 단백질 발현 수준 증가를 나타냈다. LGR6의 경우에는 mRNA 발현과 유사하게, 웨스턴 블롯 결과 또한 분화 과정 7일 후부터 14일 후까지 단백질 발현이 증가된 것을 확인하였다. 또한, 상기 분화 과정의 2일부터 14일까지 Col1α 및 osterix (OSX, osteoblast-specific transcription factor)와 같은 골 형성 마커의 단백질 수준이 증가하는 것을 확인함으로서, 조골세포의 분화가 진행되는 것을 확인하였다(도 9).

상기 결과를 토대로, 조골 세포의 분화 과정에서 RSPO1의 발현 수준이 증가되며, 이의 수용체인 LGR6의 발현 수준 또한 증가하는 것을 알 수 있다.

실험예 4: 연골세포에서 TNFα 자극 조건 동안의 RSPO2 처리에 따른 효과 분석

TNFα(tumor necrosis factor alpha)는 잘 알려진 염증 마커이며 관절염과 같은 염증성 병리학적 상태동안 방출되는 주요 사이토카인이다. 생체 외(in vitro)에서 골관절염의 병증 상태를 구현하기 위해, TNFα (10 ng/ml)을 연골 세포의 분화 7일 째에 처리하였고, Cox-2와 같은 염증성 마커의 단백질 발현 수준과 IκBα의 안정성 (NFκB 신호 활성화)을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다. 또한, TNFα에 의해 유발된 염증에 대한 RSPO2의 영향을 확인하기 위해, RSPO2 (100 ng/ml)를 TNFα와 함께 처리하고 염증 마커의 발현 수준을 분석하였다.

실험 결과, TNFα만 단독으로 처리한 경우에는 Cox-2의 단백질 수준이 증가하고, IκBα 안정성이 감소하여 예상대로 TNFα에 의한 NFκB 신호 전달의 활성화되는 것을 확인하였다. 그러나, RSPO2를 처리한 경우에는 TNFα의 처리에 의한 영향을 억제하여 IκBα의 안정성을 회복시키고, Cox-2 발현을 억제하는 것을 확인하였다(도 10). 따라서, 이를 토대로 RSPO2는 연골 세포에서 β-카테닌의 안정성을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다. 그러나 TNFα는 RSPO2 처리에 의해 회복된 β-카테닌의 안정성을 억제하였다. TNFα의 영향은 분화된 연골세포 및 RSPO2 처리 후에 다시 회복된 연골세포에서 연골 형성 마커인 Col2 및 Sox-9의 발현수준을 통해 검증되었으며, 구체적으로 TNFα 처리에 의해 감소된 연골 형성 마커가 RSPO2 처리 후에 증가되는 것을 확인하였는 바, RSPO2 처리가 골관절염 상태에서 연골 형성을 유도할 수 있음을 알 수 있다.

실험예 5: 조골세포에서 TNFα 자극 조건 동안의 RSPO1 처리에 따른 효과 분석

상기 실험예 4와 유사하게, TNFα (10 ng/ml)을 조골 세포인 SaOS-2 세포의 분화 7일 째에 처리한 결과, Cox-2의 단백질 수준이 증가하고, IκBα 안정성이 감소하여 예상대로 TNFα에 의한 NFκB 신호 전달의 활성화되는 것을 확인하였다. 또한, RSPO1 (100 ng/ml) 처리에 의해 SaOS-2 세포에서 β-카테닌의 단백질 수준이 증가되는 것이 확인되었는 바, RSPO1는 WNT 신호 전달 활성을 유도하는 기능이 있음을 알 수 있다. 또한, TNFα 처리된 SaOS-2 세포에 RSPO1을 처리하면 Cox-2의 단백질 수준이 감소하는 반면 IκBα의 안정성이 회복되는 것을 확인하였으며, TNFα에 의해 억제된 β-카테닌 또한 RSPO1 처리에 의해 회복되었다(도 11).

조골 세포 분화 과정의 마커인 Col1α 및 OSX의 경우에는, 분화 과정 7일 후 SaOS-2 세포에서 단백질 수준이 증가하고, TNFα 처리한 경우에는 Col1α 및 OSX의 발현 수준이 감소되는 것을 확인하였다. 또한, TNFα 처리 후 RSPO1를 처리하면 Col1α 및 OSX의 단백질 발현 수준이 회복하는 것을 확인하였다.

골관절염은 세포 외 기질의 점진적인 손실을 수반하는 관절 연골의 지속적인 손상으로 인해 노인에게 통증과 기능 장애를 유발하는 것으로 알려져 있다. 최근 많은 연구를 통해 골관절염은 단지 관절 연골에 관한 질병이 아닌 연하골 아래 부분의 질병인 것으로 고려되고 있으며, 골연골 단위의 건강을 유지하는 데에 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다.

본 발명은 뼈와 연골의 접점(interface) 사이의 분자적 커뮤니케이션에 초점을 맞춰서 진행하였으며, 골관절염의 병태 생리학에 관련된 중요한 분자 요인과 신호 전달 경로를 조절하는 다양한 메커니즘에 대해 분석하였다.

구체적으로, 골관절염과 관련된 신호전달경로를 분석하기 위해, 인간의 초기 및 경과 단계의 골관절염의 샘플에서 RSPO 및 이의 수용체인 LGR의 발현패턴을 분석하였다. 분석 결과, RSPO의 발현수준이 다양하게 변화하는 것을 확인하였는 바, 골관절염의 발병기전이 RSPO에 의해 조절되는 것을 알 수 있다.

다음으로, 연골 세포와의 분화 과정에서 RSPO와 LGR의 발현 양상을 분석한 결과, 연골 내 골화에서 RSPO2는 연골 세포의 분화를 촉진하는 것과 관련되어 있고, 골관절염 경과 단계 샘플에서 RSPO2와 이의 수용체인 LGR5의 발현이 겹쳐져서 관절 연골의 깊은 부위에 국한되어 있으며, 연골 세포의 분화과정에서 RSPO2 및 LGR5의 발현 수준이 증가되는 것을 확인하였다. 따라서, RSPO2의 발현은 연골 세포의 분화에 중요하다는 것을 알 수 있다.

RSPO1과 관련하여, 조골 세포의 분화 과정에서 RSPO1 및 이의 수용체인 LGR6의 발현 양상을 분석한 결과, 골관절염 경과 단계의 샘플에서 LGR6의 발현이 RSPO1과 겹쳐지는 것을 확인하였으며, 조골 세포의 분화 과정에서 RSPO1 및 LGR6의 발현 수준이 증가되는 것을 확인하였다.

다음으로, 골관절염 발병 시의 병리학적 상태를 모방하기 위해, 골관절염의 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 TNFα로 연골 세포 및 조골 세포를 자극하여 염증 반응을 유도하였으며, TNFα를 처리하면서 RSPO1 또는 RSPO2을 동시에 처리하여 RSPO1 및 RSPO2의 기능을 확인하였다. 그 결과, 연골 세포 또는 조골 세포에 각각 RSPO2 또는 RSPO1를 처리할 경우, Cox-2와 같은 염증성 마커의 유도가 억제되었으며, 활성화된 NFκB 신호 전달 경로가 억제된 것을 확인하였다. 또한, TNFα 처리에 의해 억제된 연골 형성 마커 (Col2 및 Sox-9), 골 형성 마커 (Col1α 및 OSX) 및 β-카테닌이 각각 RSPO2 및 RSPO1을 처리할 경우 발현 수준이 회복되는 것을 확인하였다. 또한, 골관절염 조직 샘플에서 RSPO1 (연골하골 영역 근처) 및 RSPO2 (심부 관절 연골 영역 근처)의 국소 발현 패턴은 연골 세포와 조골 세포 사이의 상호 작용 가능성을 확인할 수 있다. 상기 RSPO2 및 RSPO1의 단백질 3D 구조는 도 12에 기재하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> A pharmaceutical composition for preventing or treating osteoarthritis comprising RSPO protein as an active ingredient <130> AAA <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSPO1_F <400> 1 aggcctgctt caagccataa cttct 25 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSPO1_R <400> 2 gctcatttca cattgcgcag gact 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSPO2_F <400> 3 tggctcagtg tgtgctgaga gaat 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSPO2_R <400> 4 aaggtcacga gtgagtagcg catt 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSPO3_F <400> 5 tgcactgtga ggtcagtgaa tgga 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSPO3_R <400> 6 aggttaccct ttgctgaagg atgc 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSPO4_F <400> 7 accaccagtg acttgagcat ctgt 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSPO4_R <400> 8 tgatggcaga aggataggca gtga 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LGR4_F <400> 9 ttgtgggcaa cttcaagctg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LGR4_R <400> 10 aaccccaaaa tgcacagcac 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LGR5_F <400> 11 tgtttcagtg gcctgcattc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LGR5_R <400> 12 aaggtcatgg cttgcaatgc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LGR6_F <400> 13 aacaacatca aggccatccc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LGR6_R <400> 14 atgccgatct tcccacaaac 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_F <400> 15 ttcagctcag ggatgacctt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_R <400> 16 acccagaaga ctgtggatgg 20 <210> 17 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSPO1 <400> 17 Gly Ser Arg Ile Ser Ala Glu Gly Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys 1 5 10 15 Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu 20 25 30 Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu 35 40 45 Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn 50 55 60 Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His 65 70 75 80 Asn Phe Cys Thr Lys Cys Lys Glu Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg 85 90 95 Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met 100 105 110 Glu Cys Ser Ser Pro Ala Ala Ala His His His His His His 115 120 125 <210> 18 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSPO2 <400> 18 Glu Thr Gly Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn Gly 1 5 10 15 Cys Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly 20 25 30 Met Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr 35 40 45 Gly His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile Glu 50 55 60 Asn Cys Asp Ser Cys Phe Ser Lys Asp Phe Cys Thr Lys Cys Lys Val 65 70 75 80 Gly Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp Gly 85 90 95 Phe Ala Pro Leu Asp Glu Thr Met Glu Cys Val Glu Gly Thr His His 100 105 110 His His His His His His His His 115 120

Claims (11)

1. RSPO1(Rspondin 1) 및 RSPO2(Rspondin 2)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 RSPO1 및 RSPO2를 포함하는 것인, 약학 조성물.
   
3. 청구항 1에 있어서, 상기 RSPO1는 조골 세포의 분화를 촉진시키는 것인, 약학 조성물.
   
4. 청구항 1에 있어서, 상기 RSPO2는 연골 세포의 분화를 촉진시키는 것인, 약학 조성물.
   
5. 청구항 1에 있어서, 상기 RSPO1는 LGR6(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled Receptor 6)와 결합하는 것인, 약학 조성물.
   
6. 청구항 1에 있어서, 상기 RSPO2는 LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled Receptor 5)와 결합하는 것인, 약학 조성물.
   
7. RSPO1 및 RSPO2으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
8. 청구항 7에 있어서, 상기 RSPO1의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제는 조골 세포의 분화를 촉진시키는 것인, 약학 조성물.
   
9. 청구항 7에 있어서, 상기 RSPO2의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제는 연골 세포의 분화를 촉진시키는 것인, 약학 조성물.
   
10. RSPO1 및 RSPO2으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
    
11. RSPO1 및 RSPO2으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.

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