KR101771068B1 - 케모카인 활성을 가지는 신규한 폴리펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 케모카인 활성을 가지는 신규한 폴리펩타이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 및 이의 이용에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 1로 이루어지며 CCR3에의 결합을 통한 케모카인 활성을 나타내므로, 면역 조절, CCR3을 매개로하는 질환 또는 병증의 검출, 진단, 치료, 약제 개발 등의 다양한 목적으로 활용 효과가 높다.

Description

케모카인 활성을 가지는 신규한 폴리펩타이드{Novel polypeptide with chemokine activity}
본 발명은 케모카인 활성을 가지는 신규한 폴리펩타이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 및 이의 이용에 관한 것이다.
아미노아실 tRNA 합성효소(aminoacyl-tRNA synthetase)는 특정 아미노산을 대응되는 tRNA에 정확하게 결합시키는 효소로서, 단백질 합성계에서는 꼭 필요하다. 아미노산과 tRNA을 결합시키는 과정은 크게 두 단계의 과정으로 나뉘는데, 첫 번째 과정은 하나의 ATP를 소모하여, 아미노산을 아미노아실아데닐레이트로 활성화하는 단계이고, 두 번째 과정은 활성화된 아미노산을 tRNA에 전달하는 단계이다. 포유동물의 아미노아실 tRNA 합성효소는 원핵생물의 아미노아실 tRNA 합성효소와 역할은 비슷하지만, 다른 부가적인 도메인을 가진다. 이 부가적인 도메인은 아미노아실 티알엔에이 합성효소나 다른 조절인자들과의 다양한 복합체 형성에 관여한다. 이런 구조적인 복잡성이 아미노아실 tRNA 합성효소의 기능적인 다양함과 사람의 여러 가지 질병과 관련이 있다는 것이 최근 밝혀지고 있다.
한편, 케모카인(chemokine)은 백혈구 화학주성 인자로서 신체의 다양한 조직으로 백혈구를 유인하는 필수불가결한 역할을 수행하는데, 그 과정은 염증 및 감염에 대한 신체 반응 모두에 대해서 필수적이다. 케모카인 및 이의 수용체는 면역조절, 염증성 및 감염성 질환의 병리생리학에 있어서 중심이 될 뿐만아니라, 최근 케모카인 및 이의 수용체 종류에 따라 자가면역질환을 포함하여 특정 병증에 대한 특이적 역할이 밝혀지고 있어, 특정 케모카인 또는 그의 수용체의 활성을 조절하는 치료적 접근방법이 제시되고 있다.
CC 케모카인 수용체 3(CCR3)은 에오탁신-1, 에오탁신-2, 란테스 (RANTES), MCP-2, MCP-3, 및 MCP-4를 포함하는 케모카인에 대한 GPCR(G protein-coupled receptor)이고, 말초혈액 및 기도에서 호산백혈구 반응을 일으킨다. CCR3은 호산백혈구의 표면뿐만 아니라 호염기백혈구, 마스트세포 및 타입 2 헬퍼 T 림프구 상에서도 발현된다. CCR3 mRNA 및 단백질 레벨은 기도 과민반응과 관련하여 천식환자의 기관지 점막에서 상승한다. 기도 내 호산백혈구 침윤에 CCR3 가 참여한다는 사실은 CCR3 없는 마우스(CCR3-deficient mice) 연구에서 증명되었다. 인간의 CCR3 유전자 (MIM #601268) 는 아토피성 피부염 및 천식과 연관된 염색체 3p21.3에 위치한다. 이처럼 CCR3에 케모카인 리간드의 결합은 천식, 비염 및 알레르기성 질환 및 루마티스성 관절염과 같은 자가면역 질환, 그레이브스 질환 및 동맥경화를 포함하는 염증성 및 면역조절 이상의 중요한 조절자로서 알려져있으며, US8778616B2 등의 문헌에서와 같이 CCR3에 결합하는 리간드를 통하여 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization)을 검출할 수 있는 등 CCR3의 다양한 병리적 기여가 밝혀지고 있다.
기존에는 특정 병리 현상에 관여하는 리간드와 수용체에 있어서, 수용체에 대한 길항 물질을 선별하여 해당 수용체-매개 질환을 치료하고자 하였으나, 실질적으로 무분별하게 수용체의 작용만을 차단하는 경우에는 병리적으로 환부가 적응상태로 들어가거나(즉, 다른 리셉터가 병리현상을 다시 주관함), 수용체의 순기능의 과도한 억제로 인한 부작용이 나타나게 된다. 이에 병의 원인이 되는 리간드의 해당 수용체에 대한 작용을 막는 것 또한 질병의 예방 및 치료에 있어서 중요하게 생각되고 있다.
본 발명자들은 아미노아실 tRNA 합성효소의 비-정규 생물학적 활성(non-canonical biological activity)을 탐색하던 중, 아스파라긴 tRNA 합성효소(NRS)의 N-terminal extention 단편이 케모카인 활성을 가지는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 CCR3-매개 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 CCR3-매개 질환 특이적 약물 전달용 조성물; 및 상기 폴리펩타이들 이용하여 CCR3-매개 질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 CCR3-매개 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 CCR3-매개 질환 특이적 약물 전달용 조성물; 및 상기 폴리펩타이들 이용하여 CCR3-매개 질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
정의
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다. Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker ed., 1988); 및 Hale ＆ Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY. 또한 다음의 정의는 본 발명의 실시를 위해 독자(reader)에게 도움을 주기 위해 제공된다.
본 명세서에서 용어 "폴리펩타이드(polypeptide)"는 "단백질" 또는 “펩타이드(peptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 발명에서 "폴리뉴클레오타이드" 또는 “핵산”은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오타이드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오타이드의 공지된 아날로그도 포함된다.
본 명세서에서 용어 "발현(expression)"이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미한다.
본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다:
A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp):아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라긴; O(Ply)피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르기닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 트레오닌; U(Sec):셀레노시스테인, V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 티로신.
본 명세서에서 용어“NRS”는 ‘AsnRS’또는‘Asparaginyl-tRNA synthetase(아스파라긴 tRNA 합성효소)’와 호환성 있게 사용되며, 아스파라긴(asparagine)과 tRNA와의 결합을 촉진하는 아미노아실 tRNA 합성효소의 일종을 의미한다. 본 발명에서 용어 “NRS”는 별다른 언급이 없는 한 인간 NRS(human NRS)를 의미하는 것으로, 바람직하게 하기한 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다:
MVLAELYVSDREGSDATGDGTKEKPFKTGLKALMTVGKEPFPTIYVDSQKENERWNVISKSQLKNIKKMWHREQMKSESREKKEAEDSLRREKNLEEAKKITIKNDPSLPEPKCVKIGALEGYRGQRVKVFGWVHRLRRQGKNLMFLVLRDGTGYLQCVLADELCQCYNGVLLSTESSVAVYGMLNLTPKGKQAPGGHELSCDFWELIGLAPAGGADNLINEESDVDVQLNNRHMMIRGENMSKILKARSMVTRCFRDHFFDRGYYEVTPPTLVQTQVEGGATLFKLDYFGEEAFLTQSSQLYLETCLPALGDVFCIAQSYRAEQSRTRRHLAEYTHVEAECPFLTFDDLLNRLEDLVCDVVDRILKSPAGSIVHELNPNFQPPKRPFKRMNYSDAIVWLKEHDVKKEDGTFYEFGEDIPEAPERLMTDTINEPILLCRFPVEIKSFYMQRCPEDSRLTESVDVLMPNVGEIVGGSMRIFDSEEILAGYKREGIDPTPYYWYTDQRKYGTCPHGGYGLGLERFLTWILNRYHIRDVCLYPRFVQRCTP
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 인간 NRS로부터 유래된 것으로서, 본 명세서에서 용어‘NRS 단편, ‘NRS N-term 단편’등과 호환적으로 지칭될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 인간 NRS의 N-terminal extension domain에 위치하는 서열로 이루어진 것으로서, 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 상기 서열번호 1의 NRS 단편은 케모카인(chemokine) 활성을 가지는 것이 그 특징으로서, 상기 케모카인 활성은 본 발명의 서열번호 1의 NRS 단편이 CCR3(C-C chemokine receptor type 3)에 결합하는 것에 의해 매개 된다. 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나 있다. 서열번호 1의 아미노산 서열은 다음과 같다:
MVLAELYVSDREGSDATGDGTKEKPFKTGLKALMTVGKEPFPTIYVDSQKENERWNVISKSQLKNIKKMWHREQMKS
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 천연에서 추출하거나 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 통상적인 방법에 따라 상기 폴리펩티드 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산(예를 들어, 서열번호 3)을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제 할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어 (operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩티드(substally pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).
또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 전술한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명 폴리펩타이드의 변이체란 본 발명의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산 유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 폴리펩타이드를 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
경우에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
뿐만 아니라, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 77개 내지 100개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 폴리펩타이드 N 말단에 2개의 아미노산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드를 제공한다. 바람직하게는, 상기 2개의 아미노산은 글라이신(glycine) 및 히스티딘(histidine)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 추가적인 2개의 아미노산 서열은 NRS N-terminal extension 단백질의 과발현 및 높은 용해성 단백질을 얻기 위해 재조합 단백질을 제조하는 과정 중, protease에 의해 절단될 때 잔류하는 아미노산 서열일 수 있으며, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1의 폴리펩티드의 기능에 영향을 미치지 않는 서열로, 본 발명의 일실시예에서는 글라이신 및 히스티딘이 추가로 포함된 폴리펩타이드를 생성하였다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화(코딩)하는 핵산 분자를 제공한다.
전술한바와 같은 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은, 이와 동등한 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 상기한 본발명의 서열번호 1의 의 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩된다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA) 분자일 수 있다. 서열번호 3의 염기서열은 다음과 같다:
ATGGTGCTTGCAGAGCTGTACGTCTCTGACCGAGAGGGAAGCGATGCCACGGGAGATGGAACCAAGGAGAAACCATTTAAAACAGGTCTAAAGGCTTTGATGACAGTAGGGAAAGAACCATTTCCTACCATTTACGTAGATTCACAAAAAGAAAATGAGAGGTGGAATGTTATTTCTAAATCACAGTTGAAGAACATTAAAAAGATGTGGCATAGGGAACAAATGAAGAGT
본 발명의 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 천연에서 분리되거나 인위적으로 합성 또는 유전적 재조합방법을 통하여 제조할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 이를 발현할 수 있는 벡터에 작동적으로 연결시켜 상기 본 발명의 폴리펩타이드를 제공할 수 있다.
본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어, “재조합 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
본 발명에서 용어, “작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소등을 사용한다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널서열, α-인터페론 시그널 서열,항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 열충격법 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
상기 용어‘형질전환체’는‘숙주세포’등과 호환성 있게 사용될 수 있으며, 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다.
숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로 당업자가 목적하는 바에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할수 있다. 본 발명의 상기 형질전환체는 바람직하게 형질전환 미생물을 의미하는 것일 수 있다. 구체적으로, 이에 제한되지 않으나, 예를들어 숙주세포로는 에스케리치아 콜라이(대장균, Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포일 수 있다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라크라사(Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 형질전환체(또는 형질전환 미생물)은 바람직하게 에스케리치아 콜라이(대장균, Escherichia coli)일 수 있다. 상기 본 발명의 에스케리치아 콜라이 균주로는 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 Rosetta2(DE3), C41(DE3), SoluBL21 등이 사용될수 있다.
한편, 본 발명의 폴리펩타이드(서열번호 1의 NRS 단편)은 CCR3과 특이적으로 결합하므로, CCR3이 특이적으로 발현되는 질환 또는 병증의 검출 및 진단 목적으로 이용될 수 있다. 구체적으로, AMD(노화-관련 황반 변성)에서의 대부분의 실명은 맥락막 혈관신생에 의한 망막의 침습으로부터 발생되며, CCR3은 AMD 환자의 맥락막 신생혈관 내피 세포에서 특이적으로 발현된다. 따라서 본 발명은 상기 본 발명의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization) 검출용 조성물을 제공한다. 특히 무증상 맥락막 혈관신생(subclinical choroidal neovascularization ,“CNV”)에 있어서, 본 발명의 폴리펩타이드는 이의 검출 “G 진단에 편의를 제공할 수 있다.
본 발명의 상기 폴리펩타이드의 맥락막 혈관신생 부위에의 세포 결합(즉, CCR3에의 세포 결합) 여부 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 폴리펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제), 방사성 동위원소(예: 18F, 123I, 124I, 125I, 32P, 35S, 67Ga), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 형광단백질(GFP(Green Fluorescent Protein); EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein); DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein); CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), Cy3, Cy5 및 Cy7.5), 자기공명 영상물질(예: Gadolinium(Gd, 가도리늄), 상자성입자(super paramagnetic particles) 또는 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles))일 수 있다.
표지에 따른 검출 방법은 당업계에 널리 알려져 있으나, 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 면역형광염색법을 이용할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 시료와 반응시키고 미결합 또는 비특이적인 결합 산물을 제거한 다음 형광현미경 하에서 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 또한 검출가능한 표지로 효소를 이용하는 경우에는 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의해 흡광도를 측정하고, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 수행할 수 있다. 아울러, 검출된 결과는 검출표지에 따른 공지된 영상화 방법에 따라 영상화될 수도 있다.
본 발명에서 상기 용어‘시료’는 생물학적 시료를 의미하는 것으로서, 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 CCR3과 특이적으로 결합하는 효과가 뛰어나므로, CCR3-매개 질환의 진단 목적으로, 또한 CCR3-매개 질환에 있어 환부에 약물을 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 CCR3-매개 질환의 진단용 조성물; 및 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 CCR3-매개 질환 특이적 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 CCR3-매개 질환은 정상인 상태와 비교하여 CCR3이 해당 질환에서 특이적으로 발현 및 활성이 증가되어 나타나는 병리현상, 즉 상기 CCR3이 질환의 주요 병 메커니즘으로 작용하여 CCR3 수용체 길항제에 의하여 치료될 수 있는 질병을 의미한다. 상기 CCR3-매개 질환은 예를 들어, 천식, 알레르기성 비염, 과민성 폐 질환, 과민성 폐렴, 호산성 폐렴, 호흡기 알레르기성 질환, 염증성 장 질환, 건선, 피부염, 습진, 염증성 피부 질환, 신장암 및 전립선암 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 폴리펩타이드가 CCR3과 특이적으로 결합하여 케모카인 활성을 나타낸다는 사실은, 이는 인간 NRS가 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 위치(즉, N-terminal extention 부위)에서 CCR3과 결합하여 과도한 면역반응(자가면역 반응 포함) 및 CCR3 매개 질병을 유발할 수 있음을 의미한다.
상기 질병에 대한 NRS의 작용을 억제하기 위하여 NRS의 발현 또는 이의 기능을 무작정 억제하는 것은, 단백질 번역과정에 있어서 필수적인 역할을 하는 인간 NRS의 순기능에도 영향을 미쳐 다른 부작용을 가져올 수 있다. 따라서, NRS 중에서도 면역반응 및 질환과 관계가 있는 부위에만 작용하여 국소적으로 활성을 억제할 수 있는 물질을 찾아내는 것은 부작용을 줄이며 목적하는 효과를 얻도록 할 수 있으며, 이처럼 선택성 및 특이성이 높은 물질을 발굴하는 것은 질병 치료에 있어 유의미한 것으로 생각되며, 이는 단순히 특정 수용체(receptor)에 대한 길항제를 찾는 것과 구별된다.
따라서, 본 발명의 폴리펩타이드를 이용하면 NRS에서 질병에 작용하는 부위의 활성을 억제하는, 좀 더 특이성이 높고 부작용이 저감된 치료제를 스크리닝 할 수 있는 장점이 있다.
따라서 본 발명은
(a) 본 발명의 상기 폴리펩타이드(서열번호 1의 NRS 단편)와 시험제제를 접촉시켜 시험제제가 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 NRS 전장의 케모카인 활성을 억제하는지 여부를 측정하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 케모카인 활성을 억제하는 시험제제를 선별하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 선별된 시험제제를 CCR3를 발현하는 세포에 처리하여 CCR3 활성을 억제하는지 여부를 측정하는 단계
를 포함하는 CCR3-매개 질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 "제제(agent)" 또는 "시험 제제(test agent)"라 함은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 다르게 지정되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다.
보다 구체적으로 본 발명의 스크리닝 방법으로 스크리닝 될 수 있는 시험 제제는, 폴리펩티드, 베타-턴 미메틱(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 조합을 포함한다. 어떤 시험 제제는 합성 물질일 수 있으며, 다른 시험 제제는 천연물질일 수 있다. 상기 시험 제제는 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 조합(combinatorial) 라이브러리는 스텝-바이-스텝 방식으로 합성될 수 있는 여러 종류의 화합물로 생산 될 수 있다. 다수의 조합 라이브러리의 화합물들은 ESL(encoded synthetic libraries) 방법(WO 95/12608, WO93/06121, WO 94/08051, WO 95/395503 및 WO 95/30642)에 의해 제조될 수 있다. 펩티드 라이브러리는 파지 디스플레이 방법(WO91/18980)에 의해 제조될 수 있다. 박테리아, 곰팡이, 식물 및 동물 추출물 형태의 자연 화합물의 라이브러리는 상업적인 출처로부터 얻거나 또는 필드(field)에서 수집될 수 있다. 공지된 약리학적(pharmacological) 제제가 구조적 아날로그를 제조하기 위하여 아실화, 알킬화, 에스테르화 반응(esterification), 아미드화 반응(amidification)과 같은 지시되거나(direct) 무작위한 화학적 수식에 적용될 수 있다.
상기 시험 제제는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. 이런 시험 제제는 자연 출처(natural source), 예컨대, 세포 또는 조직 용해물로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드 제제의 라이브러리는 예컨대, 통상적인 방법에 의해 생성되거나 상업적으로 입수할 수 있는 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다.상기 시험 제제는 펩티드, 예컨대, 약 5-30개, 바람직하게는 약 5-20개, 보다 바람직하게는 약 7-15개의 아미노산을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "바이어스(biased)" 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다.
또한 상기 시험 제제는 "핵산"일 수 있다. 핵산 시험 제제는 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "바이어스(biased)" 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 위에서 기재한 바와 유사하게 사용될 수 있다.
또한 상기 시험 제제는 소분자(예: 약 1,000 이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다. 많은 어세이가 상기 스크리닝에 유용하다(Shultz, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2409-2414, 1998; Weller, Mol.Drivers., 3:61-70, 1997; Fernandes, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:597-603, 1998; and Sittampalam, Curr.Opin. Chem. Biol., 1:384-91, 1997).
본 발명의 방법에 스크리닝되는 시험 제제의 라이브러리는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 아날로그에 대한 구조 연구를 근거로 제조될 수 있다. 이런 구조 연구는 NRS의 케모카인 활성 영역에 결합하여, 단백질 생산과 관련된 순기능은 유지한 채 질병과 관련된 부정적 활성만을 억제할 가능성이 있는 시험 제제의 규명을 가능하게 한다. 본 발명의 폴리펩타이드의 3차원적 구조는 여러 방법, 예컨대, 결정학 구조 및 분자적 모델링(crystal structure and molecular modeling)으로 연구될 수 있다. X-선 결정학(X-ray crystallography)을 이용하는 단백질 구조 연구 방법이 문헌에 잘 알려져 있다: Physical Bio-Chemistry, Van Holde, K. E.(Prentice-Hall, New Jersey 1971), pp.221-239, and Physical Chemistry with Applications to the Life Sciences, D. Eisenberg ＆ D.Crothers(Benjamin Cummings, Menlo Park 1979). 본 발명의 폴리펩타이드 구조에 대한 컴퓨터 모델링은 스크리닝하기 위해 시험 제제의 디자인을 위한 다른 수단을 제공한다. 분자적 모델링 방법은 문헌에 개시되어 있다: U.S. Pat. No. 612,894 and U.S. Pat. No. 5,583,973. 또한 단백질 구조는 중성자 회절(neutron diffraction) 및 NMR(nuclear magnetic resonance)에 의해 결정될 수 있다: Physical Chemistry, 4th Ed. Moore, W. J.(Prentice-Hall, New Jersey 1972) and NMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthrich(Wiley-Interscience, New York 1986).
상기 (a) 단계에서 카모카인 활성을 억제하는지 여부를 측정하는 방법은 당업계에서 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 이에 대한 비제한적인 예시로는 agar-plate 방법(Curr Microbiol 30 (4): 251-3), Boyden chamber 어세이법(J Exp Med 115 (3): 453-66), Bridge chamber 어세이법(J. of Cell Biology 75 (2): 606-616), 미세관 어세이법(Anal Biochem 135 (2): 466-9, Acta Protozool 34: 181-5.) 및 T-maze 어세이법(J Protozool 29 (2): 226-30)을 들 수 있다.
상기 (c)단계에서 CCR3를 발현하는 세포란 호산백혈구,호염기백혈구, 마스트세포 및 헬퍼 T 림프구를 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명은 상기 (C)단계 이후에 (d) 선별된 제제를 CCR3-매개 질환을 가지고 있는 동물에 투여하여 치료효과를 나타내는지를 검사하는 단계를 추가적으로 수행할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 1로 이루어지며 CCR3에의 결합을 통한 케모카인 활성을 나타내므로, 면역 조절, CCR3을 매개로하는 질환 또는 병증의 검출, 진단, 치료, 약제 개발 등의 다양한 목적으로 활용 효과가 높다.
도 1은 A549, H460, WI-26, Daudi 및 Jurkat 세포 주들을 serum free media에서 6시간 동안 배양하고, 배양 배지를 회수 및 TCA 처리하여 분비된 단백질을 침전시킨 후 웨스턴 블롯으로 NRS 분비 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 RAW264.7, J774A.1, U937 및 HL-60 세포 주들을 serum free media에서 6시간 동안 배양하고, 배양 배지를 회수 및 TCA 처리하여 분비된 단백질을 침전시킨 후 웨스턴 블롯으로 NRS 분비 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 대식세포인 RAW 264.7 cell에 TNF-α, IFN-γ, TGH-β의 사이토카인 각각을 10 ng/ml의 농도로 4시간동안 처리하여 활성화 시켰을 때, NRS 분비 상태를 확인한 결과를 나타낸다(Con: 사이토카인 비처리군).
도 4는 각각 full length NRS, 본 발명의 NRS N-term 단편 및 NRS catalytic domain 펩타이드에 대하여, 상기 펩타이드들이 암세포 또는 림프구(T cell, B cell)의 세포 이동을 유도하는지 확인한 결과를 나타낸다. 암세포 및 림프구 세포들을 transwell의 fibronectin이 코팅된 멤브레인이 존재하는 upper chamber에 분주하고, 상기 3종의 펩타이드들을 1nM의 농도로 lower chamber에 처리하여 4시간 배양 후에 멤브레인으로 이동한 세포들을 염색하여 현미경으로 관찰하였다(T lymphocyte: Jurkat, B lymphocyte: Daudi , Cancer cell: H460).
도 5는 full length NRS, 본 발명의 NRS N-term 단편, NRS catalytic domain 펩타이드에 대하여, 각 펩타이드의 처리 농도에 따른 B lymphocyte(Daudi cell)의 세포 이동을 정량화하여 나타낸 결과이다. 각 처리군 별로 transwell을 이용한 세포 이동 에세이 후, 멤브레인에 존재하는 이동성 세포들을 카운팅 하였다. (con: 비처리군, F0.1: full length NRS 0.1nM 처리, F1: full length NRS 1nM 처리, F10: full length NRS 10nM 처리, N0.1: NRS N-term 단편 0.1nM 처리, N1: NRS N-term 단편 1nM 처리, N10: NRS N-term 단편 10nM 처리, C0.1: NRS catalytic domain 펩타이드 0.1nM 처리, C1: NRS catalytic domain 펩타이드 1nM, C10: NRS catalytic domain 펩타이드 10nM).
도 6은 full length NRS, 본 발명의 NRS N-term 단편, NRS catalytic domain 펩타이드에 대하여, 각 펩타이드의 처리 농도에 따른 T lymphocyte(Jurkat cll)의 세포 이동을 정량화하여 나타낸 결과이다. 각 처리군 별로 transwell을 이용한 세포 이동 에세이 후, 멤브레인에 존재하는 이동성 세포들을 카운팅 하였다. (con: 비처리군, F0.1: full length NRS 0.1nM 처리, F1: full length NRS 1nM 처리, F10: full length NRS 10nM 처리, N0.1: NRS N-term 단편 0.1nM 처리, N1: NRS N-term 단편 1nM 처리, N10: NRS N-term 단편 10nM 처리, C0.1: NRS catalytic domain 펩타이드 0.1nM 처리, C1: NRS catalytic domain 펩타이드 1nM, C10: NRS catalytic domain 펩타이드 10nM).
도 7은 암세포 또는 림프구(T cell, B cell) 세포주에서 CCR3의 발현을 웨스턴블롯 방법으로 측정한 결과를 나타낸다(T lymphocyte: Jurkat, B lymphocyte: Daudi , Cancer cell: H460).
도 8은 림프구 이동에 있어서 CCR3의 넉다운(knock-down)의 영향을 정량화 하여 나타낸 결과이다. CCR3 targeting siRNA(si-CCR3)를 이용하여 CCR3-넉다운 시킨 세포를 transwell chamber를 이용한 세포 이동 에세이에 사용하였다. lower chamber에 full length NRS, 본 발명의 NRS N-term 단편, NRS catalytic domain 펩타이드 및 RANTES(양성대조군)를 처리한 후에, upper chamber의 멤브레인에서 이동한 세포들을 현미경으로 카운트한 결과를 보여준다.
도 9는 CCR3 targeting siRNA(si-CCR3)를 이용하여 CCR3의 넉다운(knock-down)결과를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
재조합 NRS N-terminal extension M1-S77 단백질 생산
1) MBP-NRS N-terminal extension 융합 단백질 제작
본 발명자들은 NRS N-terminal extension 단백질의 과발현 및 높은 용해성 단백질을 얻기 위하여 pET-28a 벡터(Novagen)를 이용하여 재조합 단백질을 제작하였다. pET-28a 벡터에 Maltose binding protein(MBP)-Tobacco etch virus(TEV) protease cleavage site-NRS N-terminal extension을 융합시켰다. 다음은 Maltose binding protein과 융합시킨 단백질 서열정보이다.
MGSSHHHHHHSKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSENLYFQGHMVLAELYVSDREGSDATGDGTKEKPFKTGLKALMTVGKEPFPTIYVDSQKENERWNVISKSQLKNIKKMWHREQMKS*
TEV protease로 cleavage 시킨 뒤, NRS sequence 1-77의 N말단에 ‘GH’아미노산이 남은 채로 NRS N-term 단백질을 얻었다. Human NRS sequence를 벡터에 넣기 위해 Nde1 과 Xho1 제한 자리를 사용하였다.
2) 재조합 MBP-NRS N-terminal extension 단백질을 포함한 대장균 배양 및 단백질 과발현
상기와 같이 재조합 단백질인 MBP-NRS N-terminal extension을 발현하도록 제작한 벡터를 이용하여 대장균 Rosetta2(DE3) (Novagen)을 열충격 방법으로 형질전환하고, 카나마이신(+30 mg/L)이 포함된 LB배지에서 배양하여 저항성을 가진 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 이용하여 대량배양을 위한 종균 배양을 카나마이신(+30 mg/L)이 포함된 LB액체배지에 접종하여 37℃에서 16시간 진행하였다. 종균 배양액의 일부를 카나마이신이 포함된 본 배양 LB배지(2%)에 접종하여 37℃에서 OD600가 0.5가 되었을 때, 0.5mM IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)에 의해 재조합 단백질의 발현을 유도(induction) 하였다. 발현이 유도된 본 배양은 37℃에서 8시간정도 배양된 후, 4℃에서 6000g로 10분간 원심분리를 하여 균체 침전물을 회수하였다.
3) 재조합 NRS N-terminal extension 단백질의 정제
회수된 균체 침전물을 파쇄 용액[35mM Imidazole, 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl(pH7.5) / 균체 1g당 파쇄용액 10 mL]에 현탁하고, 100mM PMSF(Phenylmethylsulfonyl Fluoride / 균체 1g당 100mM PMSF 100 uL)를 첨가한 다음 초음파 파쇄기(SONICS)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄 후에 4℃에서 35000g로 60분간 원심분리 한 후에 상층액을 분리하여, 0.45um nitrocellulose membrane filter(Sartorius)를 사용하여 상층액을 여과한 후에 Pump P-1(GE Healthcare)을 사용하여 니켈이 충진된 HiTrap Chelating HP(GE Healthcare) 컬럼에 로딩하였다. 로딩을 한 컬럼을 FPLC(GE Healthcare)에 연결하고 용리용액[1M Imidazole, 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl(pH7.5)]을 사용하여 50% 기울기 용리방법으로 재조합 단백질을 1차 분리 정제하였다. 분리 정제된 재조합 단백질을 HiPrep 26/10 Desalting(GE Healthcare) 컬럼을 이용하여 TEV Protease 처리용액[200mM NaCl, 20mM Tris-HCl(pH7.5)]으로 교체하고, TEV protease 1 mg을 4℃에서 20시간 동안 처리하여 MBP와 NRS N-terminal extension을 서로 분리하였다. 그 뒤에, 다시 Pump P-1(GE Healthcare)을 사용하여 니켈이 충진된 HiTrap Chelating HP(GE Healthcare) 컬럼에 로딩하였다. 로딩을 한 컬럼을 FPLC(GE Healthcare)에 연결하고 용리용액[1M Imidazole, 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl(pH7.5)]을 사용하여 50% 기울기 용리방법으로 단백질을 2차 분리 정제하였다. 2차 분리된 재조합 단백질을 크기배제 크로마토그래피[HiLoad16/600 Superdex75(GE Healthcare), PBS buffer]를 이용하여 3차 단백질 분리 정제를 실시하여, 최종 NRS N-terminal extension 단편(서열번호 1)을 수득하였다. 각 단계별 정제과정에서 2D 전기영동을 통해 단백질의 순도를 확인 하였다.
<비교예 1>
full-length NRS 단백질의 생산
full-length NRS(서열번호 2) 발현 유전자를 pET-28a(NOVAGEN) 벡터의 Nde1 site 및 Xho1 site 사이에 삽입하였다. 이렇게 제조한 재조합 벡터를 이용하여 E. coli strain인 C41(DE3)를 형질전환하였다. shaking incubator를 이용하여 상기 형질전환 세포를 카나마이신이 포함된 LB 배지에서 37℃로 배양하였다. OD600nm가 0.5가 되었을 때, full-length NRS의 발현을 유도하기 위하여 상기 배양 세포에 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하였다.IPTG 처리 후 세포 배양물은 37 ℃, shaking incubator에서 8시간동안 배양되었다. 상기 배양된 E. coli 세포들은 6,000 g에서 10분동안 원심분리에 의해 수집되었다. 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 35 mM imidazole (pH 7.5) 이 포함된 완충용액에 상기 수집된 세포들을 재현탁하고, ultrasonic processor로 세포를 용해하였다.
상기 세포 용해물에서 목적 단백질의 정제 및 수득은 다음과 같이 수행되었다. 먼저, 용해된 세포 샘플은 35,000 g 으로 1시간 원심분리되었고, 0.45 μm syringe filter device (Sartorius)로 여과(filtered)되었다. 이렇게 수득된 샘플들을 peristaltic pump를 이용하여 Ni (Ⅱ) ion charged HiTrap 5 ml chelating HP (GE HEALTHCARE) column에 로딩(loading)하였다. 로딩된 샘플은 50% 기울기 용리 방법을 이용하여 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 1 M imidazole (pH 7.5)가 포함된 완충용액에 용출(elute)되었다. full length NRS를 포함하는 분획은 HiPrep desalting 26/10 (GE HEALTHCARE) column을 이용하여 50 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, (pH 7.5)가 포함된 완충용액에서 탈염되었다. 상기 탈염된 샘플은 HiTrap 5 ml Q HP (GE HEALTHCARE) column 에 로딩되었고, 50% 기울기 용리 방법을 이용하여 1 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, (pH 7.5)을 포함하는 완충용액에 용출되었다. 이렇게 수득된 분획은 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg (GE HEALTHCARE) column에 로딩된 후 PBS buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4,1.4mMKH2PO4,pH7.4)에 용출되었고, 최종 적으로 full-length NRS(서열번호 2)의 단백질 샘플을 수득하였다. 그리고 상기 단백질 샘플들은 10% glycerol과 혼합되었다. 각 단계별 정제과정에서 2D 전기영동을 통해 단백질의 순도를 확인 하였다.
<비교예 2>
NRS catalytic domain 의 고순도 준비
NRS catalytic domain (98-548) 유전자를 pET-28a (NOVAGEN) 벡터의 Nde1 site 및 Xho1 site 사이에 삽입하였다. 상기 재조합 벡터를 이용하여 E. coli strain인 Solu-BL21을 형질전환하였다. shaking incubator를 이용하여 상기 형질전환 세포를 카나마이신이 포함된 LB 배지에서 37℃로 배양하였다. OD600nm가 0.5가 되었을 때, NRS catalytic domain 단편의 발현을 유도하기 위하여 상기 배양 세포에 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하였다.IPTG 처리 후 세포 배양물은 37 ℃, shaking incubator에서 8시간동안 배양되었다. 배양된 E. coli cell 들은 6,000 g에서 10분동안 원심분리에 의해 수집되었다. 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 35 mM imidazole (pH 7.5) 이 포함된 완충용액에 상기 수집된 세포들을 재현탁하고, ultrasonic processor로 세포를 용해하였다.상기 세포 용해물로부터 NRS catalytic domain (98-548) 단편의 수득은, 상기 비교예1에서 단백질 정제 과정과 동일하게 수행되었다.
<실시예 2>
재조합 NRS N-terminal extension M1-S77 단백질의 사이토카인 활성 확인
[실험 준비]
1. 세포 배양 및 시료
A549, H460, J774A.1, WI-26, Daudi, Jurkat cell들은 10% fetal bovine serum 및 항생제(100 UI penicillin 및 100 mg/ml streptomycin)가 포함된 RPMI1640 medium(Hyclone)에서 배양되었다. RAW264.7의 배양을 위하여 10% fetal bovine serum 및 항생제(100 UI penicillin 및 100 mg/ml streptomycin)가 포함된 DMEM 배지가 사용되었다. anti-CCR3 항체는 Millipore사(社)로부터 구입하였고, anti-tubulin 항체는 Sigma 사로부터 구입하였고, anti-NRS 항체는 Abcam 사로부터 구입하였다.
2. 세포 이동성 검사(Cell Migration assay)
세포 이동(cell migration)은 Boyden Transwell plate(5 mm pore size, 24 well, Corning)를 사용하여 측정되었다. 먼저 멤브레인(membrane)을 50 ug/ml fibronectin(BD Biosciences)으로 사전 코팅(pre-coating)시키고, 세포들을 upper chamber에 분주하였다. NRS N-term extension 단편 및 RANTES는 각각 유도물질 및 양성 대조군으로서 lower chamber에 첨가되었다. 4시간의 배양 후에, 멤브레인을 PBS 로 2회 세척한 후, 70% methyl alcohol 이 포함된 PBS 를 사용하여 세포를 고정하였다. 그 후 상기 멤브레인은 hematoxylin (Sigma-Aldrich)로 염색되었다. 상부의 비-이동 세포들은 면봉에 의해 제거되었다. 멤브레인을 조각낸 후 슬라이드 글라스에 마운팅(mounting)하였다. 이동된 세포들은 20X 대물렌즈를 이용한 현미경으로 관찰 및 카운팅되었다.
3. 분비 에세이
세포들은 분주 된 후 70%의 세포 포화도(confluency)로 배양되었다. 세포들을 PBS로 2회 세척한 후 하기와 같이 다양한 조건에서 배양하였다; (i) serum-free medium에서 6시간동안 배양, (ii) 각각 TNF-α, IFN-γ, TGH-β를 10 ng/ml의 농도로 첨가하여 4시간 배양.
배양 배지를 회수한 뒤, 세포 및 잔해(debris)들을 제거하기 위하여 순차적으로 1,000 g으로 10분 및 10,000g으로 20분 원심분리하였다. 단백질을 침전시키기 위하여, trichloroacetic acid (TCA, Sigma)을 최종 10%의 농도가 되도록 첨가하였다. 12시간 배양 후에, 분비된 단백질들은 20,000 g에서의 원심분리에 의해 펠렛화되었다. 침전된 단백질들은 100 mM HEPES (pH 8.0)에 현탁되었고, 그 후 SDS-PAGE에 의하여 분리 및 웨스턴 블롯에 이용하였다.
4. 웨스턴 블롯(Western blot)
얼음(ice) 위에서 세포들을 M-PER(Pierce)으로 용해하였다. 원심분리로 세포 잔해들을 제거한 뒤, Bradford solution (Bio-rad)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 단백질 농도를 측정하였다. 그 후 단백질들을 SDS-PAGE 로 분리하였고, PVDF membrane에 트랜스퍼(transfer)한 후, 각각의 목적 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 1차 항체로 anti-CCR3 항체는 Millipore사(社)로부터 구입하였고, anti-tubulin 항체는 Sigma 사로부터 구입하였고, anti-NRS 항체는 Abcam 사로부터 구입하였다. 2차 항체로 NRS에 대해서는 HRP conjugated goat anti-rabbit IgG를 Thermo사로부터 구입하였고, tubulin에 대해서는 HRS conjugated goat anti-mouse IgG를 Thermo사로부터 구입하였다.
[실험 결과]
1. Th1 사이토카인들은 대식세포로부터 NRS의 분비를 유도한다.
NRS에 대한 자가항체는 자가면역, 간질성 폐질환(interstitial lung disease, ILD) 환자들에서 검출된다. NRS를 분비할 수 있는 세포를 찾기 위하여 몇 가지 세포주들을 테스트하였다. 9개의 서로 다른 세포주 (A549, H460, WI-26, Daudi, Jurkat, RAW264.7, J774A.1, U937 및 HL-60)을 serum-free medium에서 6시간동안 배양하고, 배지에 분비된 단백질들은 TCA에 의하여 침전되었다. 침전된 단백질들을 SDS PAGE로 분리한 후, anti-NRS 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 NRS의 존재를 측정하였다. 9개의 세포주 중에서, NRS는 대식세포주인 RAW 264.7 및 J774A.1(도 1 및 도 2 참조)세포의 배양 배지에서만 검출되었다. 상기와 동일한 조건에서, 배지에 tubulin이 방출되는 것은 관찰하지 못하였고, 이로서 배양 후 배지에 포함되어있는 NRS가 세포 용해에 의한 것이 아니라는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 NRS가 대식세포로부터 분비된다는 것을 제시한다. 다른 자극원에 의하여 NRS 분비가 유도될 수 있는지 알아보기 위하여, RAW 264.7 cell에 TNF-α, IFN-γ 및 TGF-β와 같은 몇 가지 서로 다른 신호분자를 처리하였다. TNF-α 및 IFN-γ는 Th1 분화에 영향을 주는 것으로서 알려져있다. 이와 대조적으로, TGF-β 는 Th2의 분화를 조절하는 것으로 알려져있다. 이들 중에 TNF-α 및 IFN-γ는 처리 후 4시간에 NRS 분비를 유도하였다(도 3참조). 이러한 결과에 기초하여, NRS는 Th1 분화 조건 하에서 특별히 대식세포로부터 분비된다는 것을 알 수 있었다.
2.NRS의 N-term extension domain 단편은 림프구의 세포이동을 유도한다.
transwell chamber를 이용하여 세포 이동을 모니터하였다. NRS의 catalytic domain 은 림프구의 이동에 영향을 주지 않았지만, full length NRS 및 NRS N-term extension domain은 림프구 이동을 유도함을 확인하였다(도 4 내지 도 6 참조). 이러한 결과는 N-term extension domain이 NRS의 chemokine-like activity를 가지게 하는 부분임을 제시한다. 다른 유형의 세포에서 NRS의 chemokine-like activity 를 관찰하기 위해, 암 세포에 NRS N-term extension domain 단편을 처리하였고, NRS N-term extension domain 단편이 암세포의 이동을 활성화시키지 못한다는 사실을 밝혔다(도 4). CCR3이 NRS의 functional receptor로서 보여졌기 때문에, 암세포와 림프구에서 CCR3 발현 수준을 비교하였다. CCR3 발현은 림프구에서 증가(up-regulated)된 양상을 보였으나, 암세포에서는 그렇지 않았다(도 7 참조). 림프구에서 CCR3 발현이 높았기 때문에, CCR3 넉다운(knock-down) 림프구에서 NRS 의 chemokine-like activity를 비교하였다. si-CCR3에 의하여 CCR3이 억제되었을 때(도 9), full length NRS 또는 NRS N-term extension domain 단편에 의한 세포 이동 활성은 감소하였다(도 8 참조). 이러한 결과는 NRS의 N-term extension domain이 NRS의 chemokine-like activity에 있어서 주요한 부분이며, CCR3은 이를 위한 수용체(리셉터)라는 것을 나타낸다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 케모카인 활성을 가지는 신규한 폴리펩타이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 및 이의 이용에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 1로 이루어지며 CCR3에의 결합을 통한 케모카인 활성을 나타내므로, 면역 조절, CCR3을 매개로하는 질환 또는 병증의 검출, 진단, 치료, 약제 개발 등의 다양한 목적으로 활용 가능하여 산업상 이용가능성이 높다.
<110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Novel polypeptide with chemokine activity <130> NP14-0114 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NRS N-terminal extension fragment <400> 1 Met Val Leu Ala Glu Leu Tyr Val Ser Asp Arg Glu Gly Ser Asp Ala 1 5 10 15 Thr Gly Asp Gly Thr Lys Glu Lys Pro Phe Lys Thr Gly Leu Lys Ala 20 25 30 Leu Met Thr Val Gly Lys Glu Pro Phe Pro Thr Ile Tyr Val Asp Ser 35 40 45 Gln Lys Glu Asn Glu Arg Trp Asn Val Ile Ser Lys Ser Gln Leu Lys 50 55 60 Asn Ile Lys Lys Met Trp His Arg Glu Gln Met Lys Ser 65 70 75 <210> 2 <211> 548 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NRS <400> 2 Met Val Leu Ala Glu Leu Tyr Val Ser Asp Arg Glu Gly Ser Asp Ala 1 5 10 15 Thr Gly Asp Gly Thr Lys Glu Lys Pro Phe Lys Thr Gly Leu Lys Ala 20 25 30 Leu Met Thr Val Gly Lys Glu Pro Phe Pro Thr Ile Tyr Val Asp Ser 35 40 45 Gln Lys Glu Asn Glu Arg Trp Asn Val Ile Ser Lys Ser Gln Leu Lys 50 55 60 Asn Ile Lys Lys Met Trp His Arg Glu Gln Met Lys Ser Glu Ser Arg 65 70 75 80 Glu Lys Lys Glu Ala Glu Asp Ser Leu Arg Arg Glu Lys Asn Leu Glu 85 90 95 Glu Ala Lys Lys Ile Thr Ile Lys Asn Asp Pro Ser Leu Pro Glu Pro 100 105 110 Lys Cys Val Lys Ile Gly Ala Leu Glu Gly Tyr Arg Gly Gln Arg Val 115 120 125 Lys Val Phe Gly Trp Val His Arg Leu Arg Arg Gln Gly Lys Asn Leu 130 135 140 Met Phe Leu Val Leu Arg Asp Gly Thr Gly Tyr Leu Gln Cys Val Leu 145 150 155 160 Ala Asp Glu Leu Cys Gln Cys Tyr Asn Gly Val Leu Leu Ser Thr Glu 165 170 175 Ser Ser Val Ala Val Tyr Gly Met Leu Asn Leu Thr Pro Lys Gly Lys 180 185 190 Gln Ala Pro Gly Gly His Glu Leu Ser Cys Asp Phe Trp Glu Leu Ile 195 200 205 Gly Leu Ala Pro Ala Gly Gly Ala Asp Asn Leu Ile Asn Glu Glu Ser 210 215 220 Asp Val Asp Val Gln Leu Asn Asn Arg His Met Met Ile Arg Gly Glu 225 230 235 240 Asn Met Ser Lys Ile Leu Lys Ala Arg Ser Met Val Thr Arg Cys Phe 245 250 255 Arg Asp His Phe Phe Asp Arg Gly Tyr Tyr Glu Val Thr Pro Pro Thr 260 265 270 Leu Val Gln Thr Gln Val Glu Gly Gly Ala Thr Leu Phe Lys Leu Asp 275 280 285 Tyr Phe Gly Glu Glu Ala Phe Leu Thr Gln Ser Ser Gln Leu Tyr Leu 290 295 300 Glu Thr Cys Leu Pro Ala Leu Gly Asp Val Phe Cys Ile Ala Gln Ser 305 310 315 320 Tyr Arg Ala Glu Gln Ser Arg Thr Arg Arg His Leu Ala Glu Tyr Thr 325 330 335 His Val Glu Ala Glu Cys Pro Phe Leu Thr Phe Asp Asp Leu Leu Asn 340 345 350 Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Asp Val Val Asp Arg Ile Leu Lys Ser 355 360 365 Pro Ala Gly Ser Ile Val His Glu Leu Asn Pro Asn Phe Gln Pro Pro 370 375 380 Lys Arg Pro Phe Lys Arg Met Asn Tyr Ser Asp Ala Ile Val Trp Leu 385 390 395 400 Lys Glu His Asp Val Lys Lys Glu Asp Gly Thr Phe Tyr Glu Phe Gly 405 410 415 Glu Asp Ile Pro Glu Ala Pro Glu Arg Leu Met Thr Asp Thr Ile Asn 420 425 430 Glu Pro Ile Leu Leu Cys Arg Phe Pro Val Glu Ile Lys Ser Phe Tyr 435 440 445 Met Gln Arg Cys Pro Glu Asp Ser Arg Leu Thr Glu Ser Val Asp Val 450 455 460 Leu Met Pro Asn Val Gly Glu Ile Val Gly Gly Ser Met Arg Ile Phe 465 470 475 480 Asp Ser Glu Glu Ile Leu Ala Gly Tyr Lys Arg Glu Gly Ile Asp Pro 485 490 495 Thr Pro Tyr Tyr Trp Tyr Thr Asp Gln Arg Lys Tyr Gly Thr Cys Pro 500 505 510 His Gly Gly Tyr Gly Leu Gly Leu Glu Arg Phe Leu Thr Trp Ile Leu 515 520 525 Asn Arg Tyr His Ile Arg Asp Val Cys Leu Tyr Pro Arg Phe Val Gln 530 535 540 Arg Cys Thr Pro 545 <210> 3 <211> 231 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding human NRS N-terminal extension fragment <400> 3 atggtgcttg cagagctgta cgtctctgac cgagagggaa gcgatgccac gggagatgga 60 accaaggaga aaccatttaa aacaggtcta aaggctttga tgacagtagg gaaagaacca 120 tttcctacca tttacgtaga ttcacaaaaa gaaaatgaga ggtggaatgt tatttctaaa 180 tcacagttga agaacattaa aaagatgtgg catagggaac aaatgaagag t 231

Claims (15)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 케모카인(chemokine) 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 케모카인 활성은 CCR3(C-C chemokine receptor type 3)에 결합하는 것에 의해 매개되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, N 말단에 글라이신(glycine) 및 히스티딘(histidine)인 2개의 아미노산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  5. 삭제
  6. 제1항 또는 제4항의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.
  7. 제6항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  8. 제7항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  9. 제1항 또는 제4항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization) 검출용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 자기공명 영상물질, 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항 또는 제4항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하며, 천식, 알레르기성 비염, 과민성 폐 질환, 과민성 폐렴, 호산성 폐렴, 호흡기 알레르기성 질환, 염증성 장 질환, 건선, 피부염, 습진, 염증성 피부 질환, 신장암 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택되는 CCR3-매개 질환의 진단용 조성물.
  12. 제1항 또는 제4항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하며, 천식, 알레르기성 비염, 과민성 폐 질환, 과민성 폐렴, 호산성 폐렴, 호흡기 알레르기성 질환, 염증성 장 질환, 건선, 피부염, 습진, 염증성 피부 질환, 신장암 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택되는 CCR3-매개 질환 특이적 약물 전달용 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. (a)제1항 또는 제4항의 폴리펩타이드와 시험제제를 접촉시켜 시험제제가 제1항의 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 NRS 전장의 케모카인 활성을 억제하는지 여부를 측정하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 케모카인 활성을 억제하는 시험제제를 선별하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 선별된 시험제제를 CCR3를 발현하는 세포에 처리하여 CCR3 활성을 억제하는지 여부를 측정하는 단계
    를 포함하는, 천식, 알레르기성 비염, 과민성 폐 질환, 과민성 폐렴, 호산성 폐렴, 호흡기 알레르기성 질환, 염증성 장 질환, 건선, 피부염, 습진, 염증성 피부 질환, 신장암 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택되는 CCR3-매개 질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법.
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