JP2001029079A - 新規ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明の課題は、安価に製造可能な、ＣＣＲ３
のみに特異的に結合するアンタゴニストおよび該アンタ
ゴニストの製造法を提供することにある。 【解決手段】本発明により、配列番号２または３記載の
アミノ酸配列からなるポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得
られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形
質転換体、該形質転換体を用いた上記ポリペプチドの製
造法、該ポリペプチドを有効成分として含有する喘息ま
たはアトピーの治療薬、および該ポリペプチドを有効成
分として含有する感染の予防薬を提供することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、好酸球上のケモカ
インレセプターＣＣＲ３のみに特異的に作用すケモカイ
ンアンタゴニスト、該ＣＣＲ３に対するケモカインの活
性を促進するペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】ケモカインは、白血球走化性・活性化作
用を有する、分子量８，０００〜１０，０００の、塩基
性・ヘパリン結合性蛋白質の総称である。ケモカインに
よって活性化された白血球は、血管外へ浸潤し、異物に
対して生体防御反応の一端を担う。しかし、生体防御反
応が過剰になると、炎症が引き起こされる。

【０００３】ケモカインは、アミノ酸配列上保存された
部位に４つのシステイン残基（Cys）を持ち、最初の２
つのＣｙｓの位置関係によって分類される。主要なケモ
カインは、２つのＣｙｓが１つのアミノ酸残基で隔てら
れているＣＸＣケモカイン（aケモカイン）、および隣
り合っているＣＣケモカイン（bケモカイン）である
が、例外的に、分子内にＣｙｓを２つしか持たないリン
フォタクチン（Ｃケモカイン、gケモカイン）、最初の
２つのＣｙｓが３つのアミノ酸残基で隔てられているフ
ルクタルカイン（ＣＸ₃Ｃケモカイン）等も存在する〔N
ew England J. Med., 338, 436-445 (1998)〕。

【０００４】ケモカインレセプターに関しては、ＣＸＣ
ケモカインレセプター４種類（ＣＸＣＲ１〜４）、ＣＣ
ケモカインレセプター８種類（ＣＣＲ１〜８）、ＣＸ₃
Ｃケモカインレセプター１種類が同定されており、何れ
も７回膜貫通型であると考えられている〔New England
J. Med., 338, 436-445 (1998)〕。

【０００５】ＣＸＣケモカインレセプターのほとんどが
好中球に存在するのに対し、ＣＣケモカインレセプター
は、単球・マクロファージに多く存在し、Ｔ細胞、好酸
球、好塩基球にも存在している。ケモカインレセプター
は、複数のリガンドを認識するものが多く、また、複数
のレセプターを認識するケモカインも多い。好酸球上に
発現しているケモカインレセプターの９５〜９９％はＣ
ＣＲ３であり、１〜５％はＣＣＲ１であると考えられて
いる〔J. Clin. Invest. 97, 604-612 (1996)〕。

【０００６】ＣＣＲ３を認識するケモカインとして、Ｈ
ＶＣ００２、ｅｏｔａｘｉｎ、ｅｏｔａｘｉｎ−２、Ｒ
ＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−３およびＭＣＰ−４が知られてい
る。これらケモカインの中で、ＲＡＮＴＥＳはＣＣＲ
１、ＣＣＲ５を、ＭＣＰ−３およびＭＣＰ−４はＣＣＲ
１、ＣＣＲ２を、更に認識することが知られている〔Ne
w England J. Med., 338, 436-445 (1998)〕。

【０００７】ケモカイン活性の測定方法として、下記の
２法が知られている。 １）フィルターを介してチャンバーを上下に分け、上層
には血球（系）細胞を、下層にはケモカインを添加し、
一定温度で一定時間反応させた後、遊走した細胞を計数
する、in vitroケモタキシスアッセイ法。

【０００８】尚、細胞の計数方法としては、フィルター
を染色することによって、フィルターにトラップされた
細胞を顕微鏡で計数する方法、下層にまで遊走した細胞
を、その細胞が持つ酵素反応の活性を指標に細胞数を換
算する方法等がある。 ２）ケモカインレセプターを有する細胞にケモカインが
作用すると、細胞内にCa ²⁺が流入する。この変化を、Ca
²⁺と結合することによって蛍光強度が変化するFra-2、F
ra-3等の蛍光色素を取り込ませた細胞を使用し、イオン
測定装置を用いてモニターすることによりケモカインの
活性を測定する方法。

【０００９】ＨＶＣ００２遺伝子は、ヒトさい帯静脈血
管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）から、ＩＬ−４による刺激に
よって特異的に発現する新規ＣＣケモカイン遺伝子とし
て発見された（WO98/24817）。昆虫細胞および大腸菌を
宿主として発現させた組み換えＨＶＣ００２蛋白質は、
ヒト末梢血好酸球に対するin vitroおよびin vivoケモ
タキシス活性およびＣａ²⁺動員活性を示し、ケモカイン
レセプターＣＣＲ３を認識するｅｏｔａｘｉｎの好酸球
への結合を阻害するが、ＣＣＲ１を認識するＭＩＰ−１
aの好酸球への結合を阻害しないことより、好酸球に多
く発現しているＣＣＲ３レセプターを介して好酸球に作
用するケモカインであることが示されている（WO98/248
17）。

【００１０】ケモカインのＮ末端側のアミノ酸を欠失さ
せることによってアンタゴニストを作製した例として、
これまで、ＭＣＰ−１の第１番目のグルタミン酸から第
７番目のアラニンまでを欠失させたＭＣＰ−１（８−７
６）、第１番目のグルタミン酸から第８番目のプロリン
までを欠失させたＭＣＰ−１（９−７６）、第１番目の
グルタミン酸から第９番目のバリンまでを欠失させたＭ
ＣＰ−１（１０−７６）〔J. Exp. Med., 181, 631-640
(1995)〕およびＲＡＮＴＥＳの第１番目のセリンから
第８番目のスレオニンまでを欠失させたＲＡＮＴＥＳ
（９−６８）〔J.Exp. Med., 188, 609-614 (1998)〕が
ある。ＭＣＰ−１（８−７６）、ＭＣＰ−１（９−７
６）、ＭＣＰ−１（１０−７６）は、ＴＨＰ−１細胞に
対するＭＣＰ−１或いはＭＣＰ−３のケモタキシス活性
およびＣａ²⁺動員活性を阻害することから、ＣＣＲ１お
よびＣＣＲ２の受容体に結合すると考えられるが、ＣＣ
Ｒ３を認識するか否かに関しては明らかではない。ＲＡ
ＮＴＥＳ（９−６８）は、好酸球上のＣＣＲ３を認識し
ていることが示唆されているが、もう一方のレセプター
であるＣＣＲ１を認識しているか否かは明確ではない。

【００１１】その他、ケモカインのアミノ酸配列を改変
することによって作製したアンタゴニストとして、ＲＡ
ＮＴＥＳのＮ末端にメチオニンを付加したＭｅｔ−ＲＡ
ＮＴＥＳがある。Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳは好酸球上のケ
モカインレセプターに対するアンタゴニストであるが、
ＣＣＲ３よりもむしろＣＣＲ１に強く結合する〔Err.J.
Immune., 27, 2892-2898 (1997)〕。ＣＣＲ１は、好酸
球よりもむしろ単球／マクロファージに多く存在してい
るので、Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳの、好酸球に対する特異
性は低いと考えられる。

【００１２】ＣＣＲ３のみに特異的に結合し、ＣＣＲ３
を介するシグナルの伝達を阻害する蛋白質として、ＣＣ
Ｒ３に対する中和抗体が取得されている〔J. Cline. In
vest., 99, 178-184 (1997)〕。該抗体は、動物細胞を
宿主として生産する場合が多いため、安価に製造、供給
する事は難しい。これまでに、安価に製造可能な、ＣＣ
Ｒ３のみに特異的に結合するアンタゴニストは知られて
いない。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、安価
に製造可能な、ＣＣＲ３のみに特異的に結合するアンタ
ゴニストおよび該アンタゴニストの製造法を提供するこ
とにある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＣＣＲ３
のみに特異的に結合するアンタゴニストに関して鋭意検
討し、ＨＶＣ００２の変異体より、低濃度のＨＶＣ００
２に対してはケモタキシス促進活性を、高濃度のＨＶＣ
００２に対してはアンタゴニスト活性を有する、優れた
ポリペプチドを見いだし、本発明を完成するに至った。

【００１５】即ち、本発明は以下（１）〜（８）に関す
る。 （１） 配列番号２または３記載のアミノ酸配列からな
るポリペプチド。 （２） 上記（１）のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ。 （３） 配列番号４または５記載の塩基配列からなるＤ
ＮＡ。

【００１６】（４） 上記（２）または（３）記載のＤ
ＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。 （５） 上記（４）の組換え体ＤＮＡを保有する形質転
換体。 （６） 上記（１）のポリペプチドをコードするＤＮＡ
をベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有
する形質転換体を、培地に培養し、培養物中に該ポリペ
プチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを
採取することを特徴とする、上記（１）のポリペプチド
の製造方法。

【００１７】（７） 上記（１）のポリペプチドを有効
成分として含有する喘息またはアトピーの治療薬。 （８） 上記（１）のポリペプチドを有効成分として含
有する感染の予防薬。

【００１８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）変異ＨＶＣ００２をコードするＤＮＡの作製 変異ＨＶＣ００２をコードするＤＮＡは、野生型ＨＶＣ
００２をコードするＤＮＡを用いて、モレキュラー・ク
ローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・
モレキュラー・バイオロジー等に記載された常法により
作製することができる。

【００１９】野生型ＨＶＣ００２をコードするＤＮＡ
は、ＷＯ９８／２４８１７に記載のプラスミドｐＨＶＣ
００２（FERM BP-5585）より調製することができる。野
生型ＨＶＣ００２をコードするＤＮＡに合成ＤＮＡリン
カー、プロテアーゼ切断認識部位をコードするＤＮＡを
挿入したものを用いても良い。

【００２０】合成ＤＮＡリンカーとしては、例えば配列
番号６および配列番号７に示した塩基配列よりなる合成
ＤＮＡリンカーをあげることができる。プロテアーゼ切
断認識部位としては、Factor Xa切断認識部位〔イソロ
イシン-グルタミン酸-グリシン-アルギニン（Ｉ・Ｅ・Ｇ・
Ｒ）〕等をあげることができる。

【００２１】上記、合成ＤＮＡリンカー、Factor Xa切
断認識部位をコードするＤＮＡおよび野生型ＨＶＣ００
２をコードするＤＮＡを含むプラスミドとして、例え
ば、図１に示したｐＥＴ−ＨＶＣをあげることができ
る。各種変異ＨＶＣ００２をコードするＤＮＡは、野生
型ＨＶＣ００２をコードするＤＮＡの塩基配列情報をも
とに作製したプライマーおよび鋳型として野生型ＨＶＣ
００２をコードするＤＮＡを用い、ポリメラーゼ・チェ
イン・リアクション（ＰＣＲ）により作製することがで
きる。

【００２２】プライマーとしては、例えば、配列番号８
〜１７記載のＤＮＡ配列を有するＤＮＡをあげることが
できる。上記方法で作製した、各種変異ＨＶＣ００２を
コードするＤＮＡを含むプラスミドとして、例えば、ｐ
ＥＴ−ＨＶＣ△１、ｐＥＴ−ＨＶＣ△２、ｐＥＴ−ＨＶ
Ｃ△３、ｐＥＴ−ＨＶＣ△４、ｐＥＴ−ＨＶＣ△５、ｐ
ＥＴ−ＨＶＣ△６、ｐＥＴ−ＨＶＣ△７、ｐＥＴ−ＨＶ
Ｃ△８、ｐＥＴ−ＨＶＣ△9等をあげることができる。

【００２３】（２）変異ＨＶＣ００２ポリペプチドの製
造 変異ＨＶＣ００２ポリペプチドは、モレキュラー・クロ
ーニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モ
レキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用
い、例えば以下の方法により、上記（１）の方法で調製
したＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することが
できる。

【００２４】全長ｃＤＮＡをもとにして、必要に応じ
て、該ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さ
のＤＮＡ断片を調製する。また、必要に応じて、変異Ｈ
ＶＣ００２ポリペプチドをコードする部分の塩基配列
を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を
置換したＤＮＡを調製する。該ＤＮＡは変異ＨＶＣ００
２ポリペプチドの効率的製造に有用である。

【００２５】該組換えベクターを、該発現ベクターに適
合した宿主細胞に導入する。宿主細胞としては、細菌、
酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺
伝子を発現できるものであればいずれも用いることがで
きる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自
立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、変異Ｈ
ＶＣ００２ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写でき
る位置にプロモーターを含有しているものが用いられ
る。

【００２６】細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる
場合は、変異ＨＶＣ００２ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立
複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結
合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成され
たベクターであることが好ましい。プロモーターを制御
する遺伝子が含まれていてもよい。

【００２７】発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、
pBTac1、pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社よ
り市販）、pKK233-2（Pharmacia社製）、pSE280（Invit
rogen社製）、pGEMEX-1（Promega社製）、pQE-8（QIAGE
N社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Agri
c. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Bi
ol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript II SK
(-)（Stratagene社製）、pTrs30〔Escherichiacoli JM1
09/pTrS30 （FERM BP-5407）より調製〕、pTrs32〔Esch
erichia coli JM109/pTrS32（FERM BP-5408）より調
製〕、pGHA2〔Escherichia coli IGHA2（FERM B-400）
より調製、特開昭60-221091〕、pGKA2〔Escherichia co
li IGKA2（FERM BP-6798）より調製、特開昭60-22109
1〕、pTerm2（US4686191、US4939094、US5160735）、pS
upex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400〔J. Bacteriol.,
172, 2392 (1990)〕、pGEX（Pharmacia社製）、pETシス
テム（Novagen社製）等をあげることができる。

【００２８】プロモーターとしては、宿主細胞中で機能
するものであればいかなるものでもよい。例えば、trp
プロモーター（P_trp）、lacプロモーター、P_Lプロモー
ター、P_Rプロモーター、T7プロモーター等の、大腸菌や
ファージ等に由来するプロモーターをあげることができ
る。また_Ptrpを２つ直列させたプロモーター（P_trp×
２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプ
ロモーターのように人為的に設計改変されたプロモータ
ー等も用いることができる。

【００２９】リボソーム結合配列であるシャイン−ダル
ガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当
な距離（例えば６〜18塩基）に調節したプラスミドを用
いることが好ましい。本発明の組換えベクターにおいて
は、変異ＨＶＣ００２をコードするＤＮＡの発現には転
写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直
下に転写終結配列を配置することが好ましい。

【００３０】宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラ
チア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス
属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-B
lue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli D
H1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY32
76、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM10
9、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.4
9、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、
Escherichia coli GI698、Escherichia coli TB1、Serr
atia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefa
ciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bac
illus amyloliquefacines、Brevibacterium ammoniagen
es、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevib
acterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium
flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum A
TCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Co
rynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacteriu
m acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammon
iaphilum ATCC15354、Pseudomonas putida 、Pseudomon
as sp. D-0110等をあげることができる。

【００３１】組換えベクターの導入方法としては、上記
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、
プロトプラスト法（特開昭63-248394）、またはGene, 1
7, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168,1
11 (1979)に記載の方法等をあげることができる。

【００３２】酵母を宿主細胞として用いる場合には、発
現ベクターとして、例えば、YEP13（ATCC37115）、YEp2
4（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等
をあげることができる。プロモーターとしては、酵母菌
株中で発現できるものであればいずれのものを用いても
よく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子
のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモ
ーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ga
l 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショッ
クポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CU
P 1プロモーター等をあげることができる。

【００３３】宿主細胞としては、Saccharomyces属、Sch
izosaccharomyces属、Kluyveromyces属、Trichosporon
属、Schwanniomyces属、Pichia属、Candida属等に属す
る微生物、例えば、Saccharomyces cerevisiae、Schizo
saccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichos
poron pullulans、Schwanniomyces alluvius、Candidau
tilis等をあげることができる。

【００３４】組換えベクターの導入方法としては、酵母
にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることが
でき、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods En
zymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リ
チウム法〔J. Bacteriology, 153, 163 (1983)〕、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)記載の方法
等をあげることができる。

【００３５】動物細胞を宿主として用いる場合には、発
現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8（フナコシ
社製）、pAGE107〔特開平3-22979、Cytotechnology, 3,
133(1990)〕、pAS3-3（特開平2-227075）、pCDM8〔Nat
ure, 329, 840 (1987)〕、pcDNAI/Amp（Invitrogen社
製）、pREP4（Invitrogen社製）、pAGE103〔J. Bioche
m., 101, 1307 (1987)〕、pAGE210等をあげることがで
きる。

【００３６】プロモーターとしては、動物細胞中で機能
するものであればいずれも用いることができ、例えば、
サイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate early）
遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レト
ロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモー
ター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモータ
ー等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺
伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよ
い。

【００３７】宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマ
ルバ（Namalwa）細胞、サルの細胞であるCOS細胞、チャ
イニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637
（特開昭63-299）等をあげることができる。動物細胞へ
の組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮ
Ａを導入する方法であればいずれも用いることができ、
例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology,
3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-22707
5）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 84, 7413 (1987)〕、Virology, 52, 456 (1973)等を
あげることができる。

【００３８】昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例
えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・
バイオロジー、Baculovirus Expression Vectors, A La
boratory Manual, W. H. Freeman and Company, New Yo
rk (1992)、Bio/Technology,6, 47 (1988)等に記載され
た方法によって、ポリペプチドを発現することができ
る。

【００３９】即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバ
キュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上
清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルス
を昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させること
ができる。該方法において用いられる遺伝子導入ベクタ
ーとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII
（ともにInvitorogen社製）等をあげることができる。

【００４０】バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗
蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カ
リフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス
(Autographa californica nuclear polyhedrosis viru
s)等を用いることができる。

【００４１】昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperd
aの卵巣細胞であるSf9、Sf21〔Baculovirus Expression
Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and C
ompany, New York (1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細
胞であるHigh 5（Invitrogen社製）等を用いることがで
きる。

【００４２】組換えウイルスを調製するための、昆虫細
胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウ
イルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウ
ム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 84,7413 (1987)〕等をあげるこ
とができる。

【００４３】植物細胞を宿主細胞として用いる場合に
は、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タ
バコモザイクウイルスベクター等をあげることができ
る。プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるも
のであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリ
フラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモータ
ー、イネアクチン１プロモーター等をあげることができ
る。

【００４４】宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、
トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルフ
ァ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげるこ
とができる。組換えベクターの導入方法としては、植物
細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いるこ
とができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacteriu
m）（特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/0097
7）、エレクトロポレーション法（特開昭60-251887）、
パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第26
06856、特許第2517813）等をあげることができる。

【００４５】遺伝子の発現方法としては、直接発現以外
に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されてい
る方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を
行うことができる。酵母、動物細胞、昆虫細胞または植
物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付
加されたポリペプチドを得ることができる。

【００４６】以上のようにして得られる本発明の形質転
換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプチド
を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本
発明のポリペプチドを製造することができる。本発明の
形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用い
られる通常の方法に従って行うことができる。

【００４７】本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物
あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転
換体である場合、該形質転換体を培養する培地として、
該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等
を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地で
あれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。

【００４８】炭素源としては、該形質転換体が資化し得
るものであればよく、グルコース、フラクトース、スク
ロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデン
プン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の
有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類
等を用いることができる。

【００４９】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム
塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エ
キス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加
水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌
体およびその消化物等を用いることができる。

【００５０】無機塩としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養
は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件
下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間
は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．
０〜９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、
無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシ
ウム、アンモニアなどを用いて行う。

【００５１】また、培養中必要に応じて、アンピシリン
やテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた
組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときに
は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよ
い。例えば、lacプロモーターを用いた組換えベクター
で形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、tr pプロモー
ターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培
養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加し
てもよい。

【００５２】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI16
40培地〔The Journal of the American Medical Associ
ation, 199, 519 (1967)〕、EagleのMEM培地〔Science,
122, 501 (1952)〕、ダルベッコ改変MEM培地〔Virolog
y, 8, 396 (1959)〕、１９９培地〔Proceeding of the
Society for the Biological Medicine, 73, 1 (195
0)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等
を用いることができる。

【００５３】培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、
５％ＣＯ₂存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、
培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗
生物質を培地に添加してもよい。

【００５４】昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH
培地（Pharmingen社製）、Sf-900 II SFM培地（Life Te
chnologies社製）、ExCell400、ExCell405（いずれもJR
H Biosciences社製）、Grace's Insect Medium〔Natur
e, 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。

【００５５】培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等
の条件下で、１〜５日間行う。また、培養中必要に応じ
て、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞
として、または植物の細胞や器官に分化させて培養する
ことができる。該形質転換体を培養する培地としては、
一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)
培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオー
キシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培
地等を用いることができる。

【００５６】培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の
条件下で３〜６０日間行う。また、培養中必要に応じ
て、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培
地に添加してもよい。上記のとおり、変異ＨＶＣ００２
ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体
ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細
胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養
し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポ
リペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製
造することができる。

【００５７】遺伝子の発現方法としては、直接発現以外
に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されてい
る方法等に準じて、分泌生産、融合ポリペプチド発現等
を行うことができる。変異ＨＶＣ００２ポリペプチドの
生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主
細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生
産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる
ポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択
することができる。

【００５８】変異ＨＶＣ００２ポリペプチドが宿主細胞
内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソ
ンらの方法〔J. Biol. Chem.，264, 17619 (1989)〕、
ロウらの方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227
(1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)〕、または
特開平5-336963、特開平6-823021等に記載の方法を準用
することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的
に分泌させることができる。

【００５９】すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、
変異ＨＶＣ００２ポリペプチドの活性部位を含むポリペ
プチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現さ
せることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に
積極的に分泌させることができる。

【００６０】また、特開平2-227075に記載されている方
法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺
伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもでき
る。さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再
分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体
（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（ト
ランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用い
て変異ＨＶＣ００２ポリペプチドを製造することもでき
る。

【００６１】形質転換体が動物個体または植物個体の場
合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該ポリ
ペプチドを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体よ
り該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチ
ドを製造することができる。

【００６２】動物個体を用いて変異ＨＶＣ００２ポリペ
プチドを製造する方法としては、例えば公知の方法〔Am
erican Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S (19
96)、American Journal of Clinical Nutrition, 63, 6
27S (1996)、Bio/Technology, 9, 830 (1991)〕に準じ
て遺伝子を導入して造成した動物中に変異ＨＶＣ００２
ポリペプチドを生産する方法があげられる。

【００６３】動物個体の場合は、例えば、変異ＨＶＣ０
０２ポリペプチドをコードするＤＮＡを導入したトラン
スジェニック非ヒト動物を飼育し、該ポリペプチドを該
動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ポリペプチド
を採取することにより、該ポリペプチドを製造すること
ができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例え
ば、該動物のミルク（特開昭63-309192）、卵等をあげ
ることができる。この際に用いられるプロモーターとし
ては、動物で発現できるものであればいずれも用いるこ
とができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーター
であるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモータ
ー、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロ
テインプロモーター等が好適に用いられる。

【００６４】植物個体を用いて変異ＨＶＣ００２ポリペ
プチドを製造する方法としては、例えば本発明のポリペ
プチドをコードするＤＮＡを導入したトランスジェニッ
ク植物を公知の方法〔組織培養, 20 (1994)、組織培養,
21 (1995)、Trends in Biotechnology, 15, 45 (199
7)〕に準じて栽培し、該ポリペプチドを該植物中に生成
・蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取するこ
とにより、該ポリペプチドを生産する方法があげられ
る。

【００６５】上記形質転換体により製造されたポリペプ
チドを単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法
を用いることができる。例えば本発明のポリペプチド
が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了
後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁
後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリン
ホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無
細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離すること
により得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即
ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶
媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セフ
ァロース、DIAION HPA-75（三菱化成社製）等のレジン
を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sephar
ose FF（Pharmacia社製）等のレジンを用いた陽イオン
交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェ
ニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグ
ラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティ
ークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、
等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは
組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。

【００６６】また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を
形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕
し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペ
プチドの不溶体を回収する。回収したポリペプチドの不
溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈ま
たは透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げ
ることにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻
す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該ポリ
ペプチドの精製標品を得ることができる。

【００６７】変異ＨＶＣ００２ポリペプチド、あるいは
該ポリペプチドに糖鎖の付加されたポリペプチド等の誘
導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリ
ペプチドあるいは該ポリペプチドの誘導体を回収するこ
とができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等
の手法により処理することにより培養上清を取得し、該
培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることに
より、精製標品を得ることができる。

【００６８】このようにして取得される、変異ＨＶＣ０
０２ポリペプチドにおいて、本発明のポリペプチドとし
て用いることのできるポリペプチドとして、例えば、配
列番号２または３記載のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをあげることができる。

【００６９】また、本発明のポリペプチドは、Ｆｍｏｃ
法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏ
ｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法
によっても製造することができる。また、Advanced Che
mTech社、パーキン・エルマー社、Pharmacia社、Protei
n Technology Instrument社、Synthecell-Vega社、PerS
eptive社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化
学合成することもできる。

【００７０】精製した本発明の蛋白質の構造解析は、蛋
白質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニ
ングのための蛋白質構造解析（平野久著、東京化学同人
発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能であ
る。 （３）本発明のポリペプチドを含有する医薬製剤 本発明のポリペプチドを含有する医薬製剤は、活性成分
として該ポリペプチド単独で、あるいは任意の他の治療
のための有効成分との混合物として含有することができ
る。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許
容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、
製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法
により製造される。

【００７１】投与経路は、治療に際し最も効果的なもの
を使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内な
どの非経口をあげることができる。投与形態としては、
錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤などがある。
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製
物は、水、蔗糖、ソルビット、果糖などの糖類、ポリエ
チレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコ
ール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−
ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベ
リーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類など
を使用して製造できる。また、錠剤、散剤および顆粒剤
などは、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニットなどの賦形
剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、ステアリン
酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニールア
ルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンな
どの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセ
リンなどの可塑剤などを用いて製造できる。

【００７２】非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受
容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤か
らなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶
液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体など
を用いて注射用の溶液を調製する。

【００７３】また、これら非経口剤においても、経口剤
で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩
壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選
択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加するこ
ともできる。本発明のポリペプチドの投与量および投与
回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状
の性質もしくは重篤度により異なるが、通常経口の場
合、成人一人当り０．０１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．
０５〜５０ｍｇを一日一回ないし数回投与する。静脈内
投与などの非経口投与の場合、成人一人当り０．００１
〜１００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇを一日一
回ないし数回投与する。しかしながら、これら投与量お
よび投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動
する。

【００７４】本発明のポリペプチドは、人体において低
濃度のＨＶＣ００２が発現している正常な状況下におい
て、ＨＶＣ００２特異的にケモタキシス促進活性を示す
ため、本発明のポリペプチドを含有する医薬製剤は、寄
生虫等の感染に対する予防および治療に用いることがで
きる。

【００７５】更に、本発明のポリペプチドは、過剰な生
体防御反応により高濃度のＨＶＣ００２が発現している
状況下においては、アンタゴニスト活性を有するため、
本発明のポリペプチドを含有する医薬製剤は、喘息、ア
トピー等の治療に用いることができる。

【００７６】（４）本発明のＤＮＡを含有する医薬製剤 本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ
遺伝子治療用のベクターを患者に投与し、ターゲットと
なる細胞内で、本発明のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを発現させることにより、喘息、アトピー等の治療を
行うことができる。以下、本発明を詳細に説明する。

【実施例】

【００７７】実施例１ Ｎ末端側のアミノ酸を欠失させ
た、各種変異ＨＶＣ００２をコードするＤＮＡの作製 （１）野生型ＨＶＣ００２をコードするＤＮＡの作製 ｐＥＴ−２１ａ（＋）（Novagen社製）上のＴ７プロモ
ーターの下流（ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ部位）に、ｐＨＶＣ
００２（WO98/24817：FERM BP-5585）のＰｍａＣＩ／Ｎ
ｏｔＩ（３９０ｂｐ）断片および配列番号６および配列
番号７に示した塩基配列よりなる合成ＤＮＡリンカーを
導入し、メチオニン残基（Ｍ）、プロテアーゼFactor X
a切断認識部位〔イソロイシン-グルタミン酸-グリシン-
アルギニン（Ｉ・Ｅ・Ｇ・Ｒ）〕、および野生型ＨＶＣ０
０２をコードするＤＮＡ、ＭＩＥＧＲ−ＨＶＣ００２を
含有するプラスミドｐＥＴ−ＨＶＣを作製した（図
１）。

【００７８】（２）ｐＥＴ−ＨＶＣ△１の作製 配列番号８および配列番号９に示した塩基配列をそれぞ
れ有する合成ＤＮＡをプライマーとして用い、ｐＥＴ−
ＨＶＣを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、１０ｐ
ｍｏｌ各プライマー、１０ｎｇ ｐＥＴ−ＨＶＣ、１０
ｍＭデオキシヌククレオチド三リン酸、Ｅｘ−Ｔａｑポ
リメラーゼバッファー（宝酒造製）、および５ｕｎｉｔ
ｓ Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼよりなる反応液１００ｍ
ｌを用い、９６℃で３０秒間、４５℃で３０秒間、７２
℃で１分間の反応工程を１サイクルとして、３０サイク
ル繰り返すことにより行った。

【００７９】ＰＣＲ後、増幅したＤＮＡを回収し、Ｎｄ
ｅＩ／ＥｃｏＲＩで処理した後、１．５％アガロースゲ
ルで電気泳動を行い、９５ｂｐの断片をゲルから精製し
た。本断片を、ｐＥＴ−ＨＶＣのＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ
（５．８ｂｐ）断片に連結させ、ＭＩＥＧＲ−ＨＶＣ△
１をコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＴ−Ｈ
ＶＣ△１を作製した。

【００８０】（３）ｐＥＴ−ＨＶＣ△２の作製 配列番号１０および配列番号９に示した塩基配列を有す
る合成ＤＮＡをプライマーとして用いる以外は、上記
（２）と同じ方法により、ＭＩＥＧＲ−ＨＶＣ△２をコ
ードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＴ−ＨＶＣ△
２を作製した。

【００８１】（４）ｐＥＴ−ＨＶＣ△３の作製 配列番号１１および配列番号９に示した塩基配列を有す
る合成ＤＮＡをプライマーとして用いる以外は、上記
（２）と同じ方法により、ＭＩＥＧＲ−ＨＶＣ△３をコ
ードするプラスミドｐＥＴ−ＨＶＣ△３を作製した。

【００８２】（５）ｐＥＴ−ＨＶＣ△４の作製 配列番号１２および配列番号９に示した塩基配列を有す
る合成ＤＮＡをプライマーとして用いる以外は、上記
（２）と同じ方法により、ＭＩＥＧＲ−ＨＶＣ△４をコ
ードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＴ−ＨＶＣ△
４を作製した。

【００８３】（６）ｐＥＴ−ＨＶＣ△５の作製 配列番号１３および配列番号９に示した塩基配列を有す
る合成ＤＮＡをプライマーとして用いる以外は、上記
（２）と同じ方法により、ＭＩＥＧＲ−ＨＶＣ△５をコ
ードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＴ−ＨＶＣ△
５を作製した。

【００８４】（７）ｐＥＴ−ＨＶＣ△６の作製 配列番号１４および配列番号９に示した塩基配列を有す
る合成ＤＮＡをプライマーとして用いる以外は、上記
（２）と同じ方法により、ＭＩＥＧＲ−ＨＶＣ△６をコ
ードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＴ−ＨＶＣ△
６を作製した。

【００８５】（８）ｐＥＴ−ＨＶＣ△７の作製 配列番号１５および配列番号９に示した塩基配列をそれ
ぞれ有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いる以外
は、上記（２）と同じ方法により、Ｍ−ＨＶＣ△７をコ
ードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＴ−ＨＶＣ△
７を作製した。

【００８６】（９）ｐＥＴ−ＨＶＣ△８の作製 配列番号１６および配列番号９に示した塩基配列を有す
る合成ＤＮＡをプライマーとして用い、上記（２）と同
じ条件で、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ後、増幅したＤＮＡ
を回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩで処理し
た後、１．５％アガロースゲルで電気泳動を行い、６３
ｂｐのＤＮＡ断片をゲルから精製した。

【００８７】本ＤＮＡ断片と、ｐＥＴ−ＨＶＣのＥｃｏ
ＲＩ−ＮｄｅＩ（６ｋｂｐ）断片とを連結させ、Ｍ−Ｈ
ＶＣ△８をコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＥ
Ｔ−ＨＶＣ△８を作製した。 （１０）ｐＥＴ−ＨＶＣ△９の作製 配列番号１７およびおよび配列番号９に示した塩基配列
を有する合成ＤＮＡをプライマーとして用いる以外は、
上記（８）と同じ方法により、Ｍ−ＨＶＣ△９をコード
するＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＴ−ＨＶＣ△９を
作製した。

【００８８】実施例２ 野生型ＨＶＣ００２および各種
変異型ＨＶＣ００２蛋白質の発現 実施例１で取得した、ｐＥＴ−ＨＶＣ△１、ｐＥＴ−Ｈ
ＶＣ△２、ｐＥＴ−ＨＶＣ△３、ｐＥＴ−ＨＶＣ△４、
ｐＥＴ−ＨＶＣ△５、ｐＥＴ−ＨＶＣ△６、ｐＥＴ−Ｈ
ＶＣ△７、ｐＥＴ−ＨＶＣ△８、およびｐＥＴ−ＨＶＣ
△９を、大腸菌BL21(DE3)株にそれぞれ導入した。

【００８９】上記の形質転換株を、それぞれ５０μｇ／
ｍｌのアンピシリンを含む、５００ｍｌのＬＢ培地中、
３７℃で、ＯＤ₆₆₀が約０．７となるまで培養した後、
ＩＰＴＧを１ｍＭになるように添加し、さらに５時間培
養した。該培養により、野生型ＨＶＣ００２または各種
変異型ＨＶＣ００２蛋白質をそれぞれ発現させた。

【００９０】実施例３ 野生型ＨＶＣ００２および各種
変異型ＨＶＣ００２蛋白質の精製 野生型ＨＶＣ００２または各種変異型ＨＶＣ００２蛋白
質を発現させた大腸菌を、それぞれ回収し、２０ｍｌの
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／２５０ｍ
Ｍ Ｓｕｃｒｏｓｅ溶液中に懸濁した。

【００９１】得られたこれら懸濁液中の菌体を、フレン
チプレッシャーセル（Ａｍｉｎｃｏ社製）を用い、12,0
00ｐｓｉで破砕した後、150,000 ｘ ｇで３０分間遠心
分離し、不溶性蛋白質（顆粒）として発現した上記蛋白
質を回収した。得られた顆粒をそれぞれ、６Ｍグアニジ
ン塩酸／１ｍＭ ＤＴＴ／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）溶液７ｍｌに溶解後、150,000 ｘ ｇで
３０分間遠心分離し、上清を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）／１ｍＭ 酸化型グルタチオン／０．
１ｍＭ 還元型グルタチオン溶液で２０倍に希釈し、４
℃で１２時間攪拌し可溶化した。

【００９２】得られた各々の可溶化液を、予め５０ｍＭ
リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で平衡化させたヘパリ
ンセルロファイン（チッソ社製）カラム（２０ｍｌ）に
通塔し、該カラムを５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ
６．５）１００ｍｌで洗浄した後、カラムに吸着した上
記蛋白質を、０〜１Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配溶出液６０
ｍｌを用いて溶出させた。

【００９３】ｐＥＴ−ＨＶＣ、ｐＥＴ−ＨＶＣ△１、ｐ
ＥＴ−ＨＶＣ△２、ｐＥＴ−ＨＶＣ△３、ｐＥＴ−ＨＶ
Ｃ△４、ｐＥＴ−ＨＶＣ△５またはｐＥＴ−ＨＶＣ△６
を導入して得られた大腸菌により発現された蛋白質（以
下、それぞれの蛋白質を野生型ＨＶＣ００２、ＨＶＣ△
１、ＨＶＣ△２、ＨＶＣ△３、ＨＶＣ△４、ＨＶＣ△
５、ＨＶＣ△６と呼ぶ）由来の溶出画分については、該
画分をそれぞれ２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）／１００ｍＭ ＮａＣｌ／２ｍＭ ＣａＣｌ₂に対し
て透析した後、Factor Xaを、蛋白質：Factor Xa＝４０
０：１になるように添加し、２５℃で５時間反応させる
ことにより、各々の蛋白質のＮ末端側ペプチドＭｅｔ−
Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを切断した。

【００９４】ｐＥＴ−ＨＶＣ△７、ｐＥＴ−ＨＶＣ△８
またはｐＥＴ−ＨＶＣ△9を導入して得られた大腸菌に
より発現された蛋白質（以下、それぞれの蛋白質をＨＶ
Ｃ△７＋Ｍ、ＨＶＣ△８、ＨＶＣ△９と呼ぶ）由来の溶
出画分に関しては、該溶出画分をそれぞれＰＢＳに対し
て透析した。

【００９５】上記で得られた、Ｎ末端側ペプチド切断処
理溶液または透析処理溶液に、予め５０ｍＭリン酸ナト
リウム（ｐＨ６．５）／０．４Ｍ ＮａＣｌ溶液で平衡
化させたＳＰセファロース樹脂３ｍｌを添加し、４℃で
１２時間放置した。放置後、得られた樹脂をそれぞれカ
ラムに詰め、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）
／０．４Ｍ ＮａＣｌ溶液１０ｍｌで洗浄した後、５０
ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）／１Ｍ ＮａＣｌ
溶出溶液５ｍｌを用い、各々の蛋白質を溶出させた。

【００９６】得られた溶出液をそれぞれＰＢＳに対して
透析後、各透析処理液よりサンプリングし、１５％ ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動、クマシーブリリアント
ブルーを用いたゲル染色による解析を行った。該解析に
より、いずれの蛋白質についても９０％以上の純度に精
製されていることを確認した。野生型ＨＶＣ００２、Ｈ
ＶＣ△８およびＨＶＣ△９の精製標品の解析結果を図２
に示した。

【００９７】実施例４ 野生型ＨＶＣ００２および各種
変異型ＨＶＣ００２蛋白質の構造解析 MALDI-TOFMSスペクトルを解析することによって、実施
例３で精製した各種蛋白質の分子量を求めた。測定に
は、REFLEX装置（Bruker社製）を使用した。

【００９８】アセトニトリルと０．１％トリフルオロ酢
酸水溶液の１：１（ｖ／ｖ）混合溶液で１０ｍｇ／ｍｌ
になるようにシナピン酸を溶解し、マトリックス溶液を
調製した。実施例３で取得した各精製蛋白質溶液（２μ
ｌ）とマトリックス溶液（２μｌ）とを混合し、そのう
ちの１μｌをＴＯＦＭＳターゲット上に滴下し、風乾さ
せて結晶化させ、測定した。

【００９９】測定には窒素レーザー（３７７ｎｍ）を使
用し、加速電圧１９．０または２７．５ｋＶ、リニアモ
ードの条件で行った。窒素較正にはチトクロームｃ（Ｍ
ｗ＝１２３６０．８）を使用し、［Ｍ＋Ｈ］⁺、［Ｍ＋
２Ｈ］²⁺の二点を用いて較正した。質量較正はターゲッ
ト毎、測定毎に行った。その結果、野生型ＨＶＣ００
２、ＨＶＣ△１、ＨＶＣ△２、ＨＶＣ△３、ＨＶＣ△
４、ＨＶＣ△５、ＨＶＣ△６、ＨＶＣ△７＋Ｍ、ＨＶＣ
△８およびＨＶＣ△９の観測値は、それぞれ、８３９
３．３、８２９３．８、８１３７．２、８０７８．６、
７９９０．７、７８７６．６、７７６３．９、７８０
３．６、７５４８．８および７４４３．０であった。

【０１００】更に、以下に示した方法で、精製蛋白質の
Ｎ末端配列を決定した。即ち、精製標品を2-メルカプト
エタノール還元下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、P. M
atsudairaの方法〔J. Biol. Chem., 262, 10035-10038
(1987)〕に従いＰＶＤＦ膜（ProBlott^TM, PERKIN ELMER
社製）へ、各蛋白質を電気的に転写した。

【０１０１】該膜をクマシーブリリアントブルーで染色
し、１０ｋＤａ付近のバンドを切り出し、気相プロテイ
ンシークエンサー（ＰＰＳＱ−１０、島津製作所製）を
用いて、島津全自動蛋白質一次構造分析装置ＰＰＲＱ−
１０取り扱い説明書に従ってＮ末端アミノ酸配列を解析
した。

【０１０２】上記分子量測定およびアミノ酸配列解析よ
り、各々の蛋白質は下記のアミノ酸配列を有することが
わかった。 野生型ＨＶＣ００２：配列番号１記載のアミノ酸配列 ＨＶＣ△１：配列番号１記載の第２〜７１番目までのア
ミノ酸配列 ＨＶＣ△２：配列番号１記載の第３〜７１番目までのア
ミノ酸配列 ＨＶＣ△３：配列番号１記載の第４〜７１番目までのア
ミノ酸配列 ＨＶＣ△４：配列番号１記載の第５〜７１番目までのア
ミノ酸配列 ＨＶＣ△５：配列番号１記載の第６〜７１番目までのア
ミノ酸配列 ＨＶＣ△６：配列番号１記載の第７〜７１番目までのア
ミノ酸配列 ＨＶＣ△７＋Ｍ：配列番号１記載の第８〜７１番目まで
のアミノ酸配列のＮ末端側にメチオニンが付加されたア
ミノ酸配列 ＨＶＣ△８：配列番号１記載の第９〜７１番目までのア
ミノ酸配列 ＨＶＣ△９：配列番号１記載の第１０〜７１番目までの
アミノ酸配列

【０１０３】実施例５ 野生型ＨＶＣ００２および各種
変異型ＨＶＣ００２蛋白質の、ヒト末梢血好酸球に対す
るin vitroケモタキシスアッセイ (1)ヒト末梢血からの好酸球の調製 ヘパリンナトリウム注射液（10,000units／１０ｍｌ）
２００ｍｌを入れた注射筒を用いて血液を採取し、採取
した血液１０ｍｌに対して生理食塩水（大塚製薬製）２
０ｍｌを添加し、希釈した。

【０１０４】１．０８５ｇ／ｍｌ Percoll １２ｍｌ上
に、上記の希釈血液３８ｍｌを重層し、室温、１，５０
０ｒｐｍの条件で２５分間遠心分離した後、血漿、単核
球、および血小板を含む画分を除去した。残りの画分に
無菌氷冷水１８ｍｌを添加することにより溶血させた
後、氷冷１０×PIPES緩衝液（64.3g NaCl, 3.7g KCl, 7
6g PIPES, 42 ml 10N NaOH／1L）２ｍｌを添加して等張
に戻した。

【０１０５】得られた溶液を、４℃、1,200ｒｐｍの条
件で５分間遠心分離し、好酸球を含む沈殿画分を２ｍｌ
の１×PIPES緩衝液に懸濁させ、上記の溶血操作をさら
に２回行った。得られた溶液を、４℃、1,200ｒｐｍの
条件で５分間遠心分離した後、上清を吸引し、得られた
好酸球を1%FCS-１×PIPES緩衝液１０ｍｌで洗浄した。

【０１０６】該好酸球懸濁液を４℃、1,200ｒｐｍの条
件で５分間遠心分離し、得られた好酸球を、約２×１０
⁷ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように１０％ ＦＣＳを含むＲ
ＰＭＩ１６４０培地に懸濁後、１０⁷細胞当たり２ｍｇ
の抗ＣＤ１６抗体（Immunotech社製）を添加した。

【０１０７】該懸濁液を、氷冷下で３０分間振とう後、
FCS-PIPESを１０ｍｌ添加した。該懸濁液を遠心分離
し、好酸球を取得した。該好酸球を１ｍｌの１０％ FCS
-RPMI培地に懸濁し、該懸濁液に１０％ FCS-RPMI培地で
２回洗浄したDynabeads（anti-mouse IgG beads、Dynal
社製）を、顆粒球：Dynabeads＝１：４となるように添
加し、氷冷下で４５分間振とうした。

【０１０８】振とう後、磁石でDynabeadsを引き付け、
好酸球を含む溶液画分を分取した。該Dynabeadsに再度
２ｍｌの１０％ FCS-RPMI培地を加えて軽く振り混ぜた
後、上記同様溶液画分を回収した。回収した溶液画分を
合わせ、混入したDynabeadsを磁石を用いて完全に除去
し、ヒト抹梢血由来の好酸球を調製した。(2)活性測定 ＨＶＣ００２による、末梢血好酸球に対するin vitroケ
モタキシスアッセイを、フィルター（polycarbonate fi
lter, pore size; 5mm, Neuro Probe社製）を介して上
槽と下槽に仕切られたケモタキシスチャンバーMBA96（N
euro Probe社製）を用いて、以下のように行った。

【０１０９】下槽にあるケモタキシスアッセイ用９６穴
専用プレートに０．１、１、１０、１００、１０００ｎ
Ｍ／３５０μｌになるように野生型ＨＶＣ００２または
各種変異型ＨＶＣ００２のケモカインを添加し、上槽に
２×１０⁴細胞／２００μl／ｗｅｌｌになるように上記
（１）で調製した末梢血好酸球を添加した。

【０１１０】ケモカインおよび好酸球は、１％ ＦＣＳ
および０．２％ ＮａＨＣＯ₃（GibcoBRL社製）を含むＲ
ＰＭＩ １６４０培地（ニッスイ製）で調製した。該ケ
モタキシスチャンバーを、３７℃、ＣＯ₂インキュベー
ター中で１時間放置後、上槽中の細胞を除去し、フィル
ターおよび下槽のプレートを、４℃、1,200ｒｐｍの条
件で１０分間遠心分離した。

【０１１１】上層を除去した後、該プレートに０．３％
（ｗ／ｖ）cetyl trimethyl-ammonium bromideを５０μ
ｌ／ｗｅｌｌ添加し、３０秒間振とうした。振とう後、
該プレートに、５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ
５．０）、０．４ｍｇ／ｍｌ o-phenylenediamine dihy
drochloride (tablet)（Sigma社製）および８．８ｍＭ
過酸化水素溶液よりなる反応液を１００μｌ／ｗｅｌｌ
添加し、室温で５分間反応させた。

【０１１２】該プレートに、４Ｎ 硫酸を５０μｌ／ｗ
ｅｌｌ添加し、反応を止め、４９０ｎｍにおける吸光度
をマイクロプレートリーダー（Benchmark, Bio-Rad社
製）を用いて測定した。結果を図３に示した。

【０１１３】野生型ＨＶＣ００２、ＨＶＣ△１、ＨＶＣ
△２、ＨＶＣ△３、ＨＶＣ△４、ＨＶＣ△５、ＨＶＣ△
６、ＨＶＣ△７＋Ｍは好酸球に対するケモタキシス活性
を示したが、ＨＶＣ△８、および、ＨＶＣ△９のケモタ
キシス活性は失われていた。

【０１１４】実施例６ ＨＶＣ△8およびＨＶＣ△9によ
る、ヒト末梢血好酸球に対する、in vitroケモタキシス
阻害活性の測定 下槽のケモタキシスアッセイ用96穴専用プレート（Neur
o Probe社製）に、２５ｎＭ野生型ＨＶＣ００２、５０
ｎＭ野生型ＨＶＣ００２、１０ｎＭヒトeotaxin（Pepro
Tech社製）または１０ｎＭヒトRANTES（Pepro Tech社
製）、および、０〜１０００ｎＭの濃度のＨＶＣ△8ま
たはＨＶＣ△9を添加し、上槽に、２×１０⁴細胞／２０
０mｌ／ｗｅｌｌになるように末梢血好酸球を添加する
以外は、実施例５と同様の条件でケモタキシスアッセイ
を行った。

【０１１５】結果を図４および５に示した。ＨＶＣ△8
およびＨＶＣ△9は、添加濃度に依存して、野生型ＨＶ
Ｃ００２、ヒトeotaxin、およびヒトRANTESの活性を阻
害することが明らかとなった。

【０１１６】実施例７ ＨＶＣ△8およびＨＶＣ△9によ
る、マウス末梢血好酸球に対する、invitroケモタキシ
ス阻害活性の測定 (1)マウス好酸球の調製 IL-5トランスジェニックマウスの腹腔に４０ｍｇ／ｍｌ
の塩化カドミウム溶液（生理食塩水に溶解したもの）
０．５ｍｌを投与した。

【０１１７】翌日、マウスの頚動脈を切断し脱血を行っ
た後、背部から皮膚を剥ぎ、筋肉層を露出させ、背筋層
（背骨の脇）に注射針（１８Ｇ）を刺し、腹腔に約３ｍ
ｌの空気と５ｍｌの氷冷したＰＢＳを注射器を用いて注
入し、マウスを振とうする事により腹腔内を洗浄した。

【０１１８】洗浄後、注射器を用いて無菌的に洗浄液の
回収を行った。この操作を再度繰り返し、得られた２回
の洗浄液を合わせ、ポリプロピレン製遠心管に入れ、８
００ｒｐｍ（約１２０ ｘ ｇ）で１０分間遠心分離し、
好酸球を含む腹腔浸出細胞（peritoneal exudate cell
:ＰＥＣ）を回収した。更にＲＰＭＩ１６４０培地で細
胞を２回洗浄した後、１０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１
６４０培地（２−メルカプトエタノール及び抗生物質を
含まないもの）に懸濁した。

【０１１９】(2)活性測定 96穴プレートの下槽に１０ｎＭ マウスeotaxin（Pepro
Tech社製）、および０〜１２５０ｎＭのＨＶＣ△8また
はＨＶＣ△9を添加し、上槽に２×１０⁴細胞／２００ｍ
ｌ／ｗｅｌｌになるように上記（１）で調製した血好酸
球を添加する以外は、実施例５と同様の条件でケモタキ
シスアッセイを行った。

【０１２０】結果を図６に示した。ＨＶＣ△8、ＨＶＣ
△9は何れも、添加濃度に依存して、マウスeotaxinの活
性を阻害することが明らかとなった。

【０１２１】実施例８ ヒト末梢血好酸球と¹²⁵Ｉ−ケ
モカインとの結合阻害アッセイ 実施例５に記載の方法に準じて調製した末梢血好酸球
を、１×１０⁶細胞／ｍｌになるように緩衝液Ａ（５０
ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）／１ｍＭ Ｃ
ａＣｌ₂／５ｍＭ ＭｇＣｌ₂／０．５％ ＢＳＡ／０．０
２％ Ｎａ−Ａｚｉｄｅ）に懸濁した。

【０１２２】該懸濁液１００ｍｌに対して、 ０．４ｎＭの¹²⁵Ｉ−ヒトeotaxin（Amersham-Pharm
acia Biotech製）または０．４ｎＭの¹²⁵Ｉ-ヒトMIP-1a
（Amersham-Pharmacia Biotech製）溶液５０μｌ、およ
び 緩衝液Ａ、０．０３〜３１０ｎＭの濃度に緩衝液Ａ
で調製した非標識MIP-1a、非標識野生型ＨＶＣ００２、
または、非標識ＨＶＣ△８もしくは非標識ＨＶＣ△９を
添加し、さらに、緩衝液Ａで反応容量を２００μｌに調製
し、３７℃で１時間反応させた。

【０１２３】反応後、反応液を10,000ｒｐｍで３分間遠
心分離し、好酸球を回収した。該好酸球に、緩衝液Ｂ
（緩衝液Ａ＋０．５Ｍ ＮａＣｌ）１５０ｍｌを添加し
て細胞を洗浄後、１４，０００ｒｐｍで３分間遠心分離
し、好酸球を回収した。該好酸球を再び３００μｌの緩
衝液Ｂに懸濁後、ＲＩＡチューブに移し、γ−カウンタ
ーで¹²⁵Ｉの放射活性を測定した。

【０１２４】結果を図７に示した。ＨＶＣ△８およびＨ
ＶＣ△９は、野生型ＨＶＣ００２と同様に、好酸球と
¹²⁵Ｉ−ヒトeotaxinとの結合を阻害するが、好酸球と
¹²⁵Ｉ-ヒトMIP-1αとの結合を阻害しないことが明らか
となった。eotaxinは、ＣＣＲ３を、MIP-1αはＣＣＲ１
を認識するので、ＨＶＣ△8およびＨＶＣ△9はＣＣＲ３
を認識することが強く示唆された。

【０１２５】実施例９ ＨＶＣ△8およびＨＶＣ△9によ
る、ヒト末梢血好酸球に対する、in vitroケモタキシス
促進活性の測定 下槽に、５ｎＭ 野生型ＨＶＣ００２および０〜１００
０ｎＭのＨＶＣ△８またはＨＶＣ△９を添加し、上槽
に、２×１０⁴細胞／２００μｌ／ｗｅｌｌになるよう
に好酸球を添加する以外は、実施例５と同様の条件でケ
モタキシスアッセイを行った。

【０１２６】結果を図８に示した。ＨＶＣ００２の濃度
が５ｎＭのように低い状況下において、ＨＶＣ△8、Ｈ
ＶＣ△9はケモタキシス促進活性を示すことが明白とな
った。以上の結果より、ＨＶＣ△8およびＨＶＣ△9は、
低濃度のＨＶＣ００２が発現している正常な状況下にお
いては、ケモタキシス促進活性を示し、異常に高濃度の
ＨＶＣ００２が発現している状況下においてはアンタゴ
ニスト活性を有する優れたポリペプチドであることが分
かった。

【０１２７】

【配列表フリーテキスト】

配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ

【０１２８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. <120> Novel Chemokine Receptor Antagonist <130> H11-0411N2 <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0

【０１２９】 <210> 1 <211> 71 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Arg Gly Ser Asp Ile Ser Lys Thr Cys Cys Phe Gln Tyr Ser His 1 5 10 15 Lys Pro Leu Pro Trp Thr Trp Val Arg Ser Tyr Glu Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Ser Cys Ser Gln Arg Ala Val Ile Phe Thr Thr Lys Arg Gly Lys Lys 35 40 45 Val Cys Thr His Pro Arg Lys Lys Trp Val Gln Lys Tyr Ile Ser Leu 50 55 60 Leu Lys Thr Pro Lys Gln Leu 65 70

【０１３０】 <210> 2 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Cys Cys Phe Gln Tyr Ser His Lys Pro Leu Pro Trp Thr Trp Val 1 5 10 15 Arg Ser Tyr Glu Phe Thr Ser Asn Ser Cys Ser Gln Arg Ala Val Ile 20 25 30 Phe Thr Thr Lys Arg Gly Lys Lys Val Cys Thr His Pro Arg Lys Lys 35 40 45 Trp Val Gln Lys Tyr Ile Ser Leu Leu Lys Thr Pro Lys Gln Leu 50 55 60

【０１３１】 <210> 3 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Cys Cys Phe Gln Tyr Ser His Lys Pro Leu Pro Trp Thr Trp Val Arg 1 5 10 15 Ser Tyr Glu Phe Thr Ser Asn Ser Cys Ser Gln Arg Ala Val Ile Phe 20 25 30 Thr Thr Lys Arg Gly Lys Lys Val Cys Thr His Pro Arg Lys Lys Trp 35 40 45 Val Gln Lys Tyr Ile Ser Leu Leu Lys Thr Pro Lys Gln Leu 50 55 60

【０１３２】 <210> 4 <211> 189 <212> ＤＮＡ <213> Homo sapiens <400> 4 acctgctgct tccaatacag ccacaagccc cttccctgga cctgggtgcg aagctatgaa 60 ttcaccagta acagctgctc ccagcgggct gtgatattca ctaccaaaag aggcaagaaa 120 gtctgtaccc atccaaggaa aaaatgggtg caaaaataca tttctttact gaaaactccg 180 aaacaattg 189

【０１３３】 <210> 5 <211> 186 <212> ＤＮＡ <213> Homo sapiens <400> 5 tgctgcttcc aatacagcca caagcccctt ccctggacct gggtgcgaag ctatgaattc 60 accagtaaca gctgctccca gcgggctgtg atattcacta ccaaaagagg caagaaagtc 120 tgtacccatc caaggaaaaa atgggtgcaa aaatacattt ctttactgaa aactccgaaa 180 caattg 186

【０１３４】 <210> 6 <211> 20 <212> ＤＮＡ <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic ＤＮＡ <400> 6 tatgatcgaa ggtcgtacac 20

【０１３５】 <210> 7 <211> 18 <212> ＤＮＡ <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic ＤＮＡ <400> 7 gtgtacgacc ttcgatca 18

【０１３６】 <210> 8 <211> 49 <212> ＤＮＡ <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic ＤＮＡ <400> 8 agatatacat catatgatcg aaggtcgtcg tgggagtgac atatccaag 49

【０１３７】 <210> 9 <211> 30 <212> ＤＮＡ <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic ＤＮＡ <400> 9 cacagcccgc tgggagcagc tgttactggt 30

【０１３８】 <210> 10 <211> 49 <212> ＤＮＡ <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic ＤＮＡ <400> 10 tatagatatg catatgatcg aaggtcgtgg gagtgacata tccaagacc 49

【０１３９】 <210> 11 <211> 49 <212> ＤＮＡ <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic ＤＮＡ <400> 11 agatatgatc catatgatcg aaggtcgtag tgacatatcc aagacctgc 49

【０１４０】 <210> 12 <211> 49 <212> ＤＮＡ <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic ＤＮＡ <400> 12 tatgatcgaa catatgatcg aaggtcgtga catatccaag acctgctgc 49

【０１４１】 <210> 13 <211> 49 <212> ＤＮＡ <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic ＤＮＡ <400> 13 gatcgaaggt catatgatcg aaggtcgtat atccaagacc tgctgcttc 49

【０１４２】 <210> 14 <211> 58 <212> ＤＮＡ <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic ＤＮＡ <400> 14 tatagatata gatatacatc atatgatcga aggtcgttcc aagacctgct gcttccaa 58

【０１４３】 <210> 15 <211> 34 <212> ＤＮＡ <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic ＤＮＡ <400> 15 tgggagtgac catatgaaga cctgctgctt ccaa 34

【０１４４】 <210> 16 <211> 34 <212> ＤＮＡ <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic ＤＮＡ <400> 16 gagtgacata catatgacct gctgcttcca atac 34

【０１４５】 <210> 17 <211> 34 <212> ＤＮＡ <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic ＤＮＡ <400> 17 tgacatatcc catatgtgct gcttccaata cagc 34

【図面の簡単な説明】

【図1】 プラスミドｐＥＴ−ＨＶＣの構造を示した図
である。

【図２】 野生型ＨＶＣ００２（ＷＴ）、ＨＶＣ△８
（△８）およびＨＶＣ△９（△９）の精製標品のＳＤＳ
−ＰＡＧＥによる解析結果を示した図である。

【図３】 野生型ＨＶＣ００２（ＷＴ）、ＨＶＣ△８
（△８）およびＨＶＣ△９（△９）の、ヒト末梢血好酸
球に対するin vitroケモタキシスアッセイの結果を示し
た図である。

【図４】 ＨＶＣ△８（△８）およびＨＶＣ△９（△
９）による、ヒト末梢血好酸球に対するin vitroケモタ
キシス活性の阻害を示した図である。（Ａ）２５ｎＭ
野生型ＨＶＣ００２または（Ｂ）５０ｎＭ 野生型ＨＶ
Ｃ００２を用い、０〜１０００ｎＭのＨＶＣ△８（△
８）またはＨＶＣ△９（△９）の存在下において、in v
itroケモタキシスアッセイを行った。

【図５】 ＨＶＣ△８（△８）およびＨＶＣ△９（△
９）による、ヒト末梢血好酸球に対するin vitroケモタ
キシス活性の阻害を示した図である。（Ａ）５ｎＭ ヒ
トエオタキシンまたは（Ｂ）５ｎＭ ヒトＲＡＮＴＥＳ
を用い、０〜４００ｎＭの各濃度におけるＨＶＣ△８
（△８）またはＨＶＣ△９（△９）の存在下において、
in vitroケモタキシスアッセイを行った。

【図６】 ＨＶＣ△８（△８）およびＨＶＣ△９（△
９）による、マウス末梢血好酸球に対するin vitroケモ
タキシス活性の阻害を示した図である。１０ｎＭ マウ
スエオタキシンを用い、０〜１２５０ｎＭの各濃度にお
ける（Ａ）ＨＶＣ△８（△８）または（Ｂ）ＨＶＣ△９
（△９）の存在下において、invitroケモタキシスアッ
セイを行った。

【図７】 ＨＶＣ△８（△８）またはＨＶＣ△９（△
９）による、ヒト末梢血好酸球に対する¹²⁵Ｉ−ケモカ
イン結合の阻害を示した図である。０〜３１０ｎＭの各
濃度における野生型ＨＶＣ００２（ＷＴ）、ＨＶＣ△８
（△８）またはＨＶＣ△９（△９）またはＭＩＰ−１α
の存在下で、（Ａ）０．１ｎＭ ¹²⁵Ｉ−エオタキシン或
いは（Ｂ）０．１ｎＭ ¹²⁵Ｉ−ＭＩＰ−１αの、末梢血
好酸球に対する結合実験を行った。

【図８】 ＨＶＣ△８（△８）またはＨＶＣ△９（△
９）による、５ｎＭ野生型ＨＶＣ００２の、ヒト末梢血
好酸球に対するケモタキシス活性を促進することを示し
た図である。５ｎＭ 野生型ＨＶＣ００２を用い、０〜
１０００ｎＭのＨＶＣ△８（△８）またはＨＶＣ△９
（△９）の存在下で、in vitroケモタキシスアッセイを
行った。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 中村真子 東京都町田市旭町３丁目６番６号 協和醗 酵工業株式会社東京研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA02 DA06 EA04 GA11 GA19 GA25 HA03 HA17 4B064 AG01 AG02 CA02 CA19 CC01 CC24 CD09 CE02 CE03 CE06 CE11 CE12 CE14 CE20 DA01 DA13 4B065 AA26X AA90Y AB01 AC14 AC16 BA01 BA02 BA16 BB01 BB15 BC01 BC03 BD01 BD14 BD15 BD17 BD50 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA20 BA44 CA53 DA01 DA58 MA17 MA23 MA35 MA41 MA43 MA52 MA66 ZA592 ZB132 ZB322 4H045 AA10 AA20 AA30 CA40 DA01 EA20 EA50 FA74 GA01 GA10 GA15 GA23 GA26 GA31 HA04

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２または３記載のアミノ酸配列
   からなるポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１記載のポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号４または５記載の塩基配列から
   なるＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項２または３記載のＤＮＡをベクタ
   ーに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換え体ＤＮＡを保有す
   る形質転換体。
6. 【請求項６】 請求項１記載のポリペプチドをコードす
   るＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮ
   Ａを保有する形質転換体を、培地に培養し、培養物中に
   該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペ
   プチドを採取することを特徴とする、請求項１記載のポ
   リペプチドの製造方法。
7. 【請求項７】 請求項１記載のポリペプチドを有効成分
   として含有する喘息またはアトピーの治療薬。
8. 【請求項８】 請求項１記載のポリペプチドを有効成分
   として含有する感染の予防薬。