CN108137666A

CN108137666A - 具有趋化因子活性的新型多肽

Info

Publication number: CN108137666A
Application number: CN201680053131.3A
Authority: CN
Inventors: 金圣勋; 朴敃哲; 韩炳*; 韩炳; 朴濬晟
Original assignee: Medicinal Bioconvergence Research Center
Current assignee: Medicinal Bioconvergence Research Center
Priority date: 2015-07-14
Filing date: 2016-07-13
Publication date: 2018-06-08
Also published as: KR101771068B1; US20180221448A1; KR20170008611A; US10646547B2; WO2017010807A1; JP2018527898A

Abstract

本发明涉及一种具有趋化因子活性的新型多肽，尤其涉及一种由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列组成的多肽及其用途。本发明所述多肽由SEQ ID NO:1组成，并且通过与CCR3结合而表现出趋化因子活性，因此，所述多肽在各方面具有较高的利用价值，比如：免疫调节，诊断，治疗，以及用于CCR3介导的疾病或疾病症状的药物开发。

Description

具有趋化因子活性的新型多肽

技术领域

本发明涉及一种具有趋化因子活性的新型多肽，尤其涉及一种由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的多肽及其用途。

技术背景

本申请要求2015年7月14日提交的韩国专利申请NO.10-2015-0099994的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

氨酰-tRNA合成酶是将特定氨基酸精确地附着到其同源tRNA上的酶，其在蛋白质合成中起着重要作用。将氨基酸连接到各自的同源tRNA的过程分为两个阶段：第一步是通过消耗一个ATP激活氨基酸为氨酰腺苷酸，第二步是将活化的氨基酸转移到tRNA上。哺乳动物的氨酰-tRNA合成酶具有与原核细胞相似的作用，但具有额外的结构域。这些额外的结构域会参与各种复合物与其他氨酰-tRNA合成酶或其他调节因子的形成是已经被人们所知道的。并且这种结构复杂性与氨酰-tRNA合成酶的功能多样性及各种人体疾病有关。

另一方面，趋化因子作为白细胞趋化因子将白细胞吸附到身体的各种组织中发挥不可缺少的作用。该过程必然导致身体出现炎症或感染反应。趋化因子及其受体是免疫调节，炎症和感染性疾病的病理生理学的核心组成部分。特别地，已经表明，某些趋化因子与其受体间的相互作用可能会引起某些病理学疾病，包括自身免疫性疾病。科学家们已经提出了调节趋化因子及其受体活性的治疗方法。

CC趋化因子受体3(CCR3)是一种包括eotaxin-1，eotaxin-2，RANTES，MCP-2，MCP-3和MCP-4趋化因子的GPCR(G蛋白偶联受体)。CCR3会引起周围血液及呼吸道的嗜酸性白细胞反应。CCR3不仅在嗜酸性白细胞表面表达，而且在嗜碱性白细胞，肥大细胞和2型辅助性T淋巴细胞表达。CCR3mRNA和蛋白质水平在哮喘患者的支气管粘膜中的提高与呼吸道高反应性相关。CCR3参与嗜酸性白细胞在呼吸道中的浸润的事实已经在CCR3缺陷的小鼠研究中得到证实。人类CCR3基因(MIM#601268)位于与特应性皮炎和哮喘相关的染色体3P21。3上。因此，趋化因子配体与CCR3的结合已经被发现是炎症和免疫调节病症的重要调节剂，包括自身免疫性疾病例如哮喘，鼻炎和过敏性疾病以及类风湿性关节炎。如在US8778616B2中所述，CCR3的各种病理学贡献例如对治疗格雷夫斯病和动脉硬化的作用已经被发现，包括通过与CCR3结合的配体来检测脉络膜新血管生成能力。

过去，通过筛选受体拮抗剂来治疗涉及特定病理现象的配体和受体的相应的受体介导的疾病。然而，在大量只是不加区分地仅仅阻断受体的作用的案例中，产生了病变进入适应状态(即其他受体调节病理)或过度抑制受体的有利功能的副作用。在疾病的预防和治疗中，抑制引起这种疾病的配体的作用也是重要的。

发明内容

技术问题

本发明人在察氨酰基-tRNA合成酶的非转化生物学活性时，发现天冬酰胺酰-tRNA合成酶(NRS)的N-末端延伸结构域具有趋化因子活性，从而完成了本发明。

因此，本发明的一个方面提供一种由序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的多肽。

本发明的另一个方面提供一种编码所述多肽的核酸分子。

本发明的另一个方面提供一种用于检测脉络膜新血管生成的组合物，其包含所述多肽作为活性成分。

本发明另一个方面提供一种用于诊断CCR3介导的疾病的组合物，其包含所述多肽作为活性成分。

本发明的另一个方面还提供一种CCR3介导的疾病特异性药物组合物，其包含所述多肽作为活性成分；并且提供一种使用所述多肽的用于预防或治疗CCR3介导的疾病筛选药剂的方法。

本发明的另一个方面还提供一种所述多肽在制备一种包含所述多肽作为一种活性成分，用于检测脉络膜新血管生成的药剂时的用途。

本发明的另一个方面还提供一种用于检测脉络膜新血管生成的方法，所述方法包括向有需要的施受者施用有效量的用于检测脉络膜新血管生成包含所述多肽作为活性成分的药剂。

本发明另一个方面还提供一种用于制备包含所述多肽作为活性成分的用于诊断CCR3介导的疾病的药剂的所述多肽的用途。

本发明另一个方面还提供一种用于诊断CCR3介导的疾病的方法，所述方法包括向有需要的施受体施用有效量的用于诊断CCR3介导的疾病包含所述多肽作为一种活性成分的药剂。

本发明的另一个方面还提供一种用于制备包含所述多肽作为一种活性成分的用于CCR3介导的疾病的物异性药物递送剂的用途。

本发明的另一个方面还提供一种CCR3介导的疾病特异性药物递送的方法，所述方法包括向有需要的施受者施用有效量的用于CCR3介导的疾病特异性药物递送的包含所述多肽作为一种活性成分的药剂。

技术方案

根据本发明的一个方面的一个实施例提供了一种由序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的多肽。

根据本发明的一个方面的另一个实施例提供了一种编码所述多肽的核酸分子。

根据本发明的一个方面的另一个实施例提供了一种包含所述核酸分子的重组载体。

根据本发明的一个方面的另一个实施例提供了一种转化所述重组载体的转化体。

根据本发明的一个方面的另一个实施例提供了一种用于检测脉络膜新血管生成包含所述多肽作为一种活性成分的组合物。

根据本发明的一个方面的另一个实施例提供了一种用于诊断CCR3介导的疾病包含所述多肽作为一种活性成分的组合物。

根据本发明的另一方面的另一个实施例提供了一种CCR3介导的疾病的包含所述多肽作为一种活性成分的特异性药物递送组合物；并且提供一种筛选预防或治疗CCR3介导的疾病药剂的方法。

根据本发明的另一方面的另一个实施例提供了一种所述多肽在制备包含所述多肽作为一种活性成分的用于检测脉络膜新血管生成的药剂时的用途。

根据本发明的另一方面的另一个实施例提供了一种用于检测脉络膜新血管生成的方法，所述方法包括向有需要的施受体施用有效量的用于检测脉络膜新血管生成的包含所述多肽作为活性成分的药剂。

根据本发明的另一方面的一个实施例提供了一种所述多肽在制备包含所述多肽作为一种活性成分的用于诊断CCR3介导的疾病时的用途。

根据本发明的另一方面的一个实施例提供了一种用于诊断CCR3介导的疾病的方法，所述方法包括向有需要的施受体施用有效量的用于诊断CCR3介导的疾病的包含所述多肽作为一种活性成分的药剂。

根据本发明的另一方面的一个实施例提供了一种所述多肽在制备包含所述多肽作为一种活性成分的用于CCR3介导的疾病特异性药物递送剂时的用途。

根据本发明的另一方面的一个实施例提供了一种CCR3介导的疾病特异性药物的递送方法，所述方法包括向有需要的施受体施用有效量的用于CCR3介导的疾病特异性药物递送的包含所述多肽作为一种活性成分的药剂。

以下将进一步地说明本发明。

定义

除非另有说明，否则本发明使用的所述技术和科学术语具有与本领域普通技术人员普通理解的意义相同的含义。以下参考文献为技术人员提供了本发明说明书中使用的各种术语的一般定义：Singleton et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY(2d ed.1994)；THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walkered.,1988)；And Hale Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY；还提供了下列定义帮助读者实施本发明。

如本文所用，术语“多肽”可以与“蛋白质”或“肽”互换使用，例如指在自然界的蛋白质中常见的氨基酸残基。

在本发明中的术语“多肽”或“核酸分子”指的是单链或双链的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。除非另有说明，它同样包括天然核苷酸的已知类似物，其以与天然存在的核苷酸类似的方式与核酸进行杂交。

如本文所用，术语“表达”指的是在细胞中蛋白质或核酸的产生。

本文所使用的氨基酸三联体指在生物化学中根据标准缩写的以下氨基酸：

A(Ala)：丙氨酸；C(Cys):半胱氨酸；D(Asp):天冬氨酸；E(Glu):谷氨酸；F(Phe)：苯丙氨酸；G(Gly)：甘氨酸；H(His)：组氨酸；I(IIe)：异亮氨酸；K(Lys)：赖氨酸；L(Leu)：亮氨酸；M(Met)：蛋氨酸；N(Asn)：天冬酰胺；O(Ply)吡咯酸；P(Pro)：脯氨酸；Q(Gln):谷氨酰胺；R(Arg):精氨酸；S(Ser)：丝氨酸；T(Thr):苏氨酸；U(Sec)：硒代半胱氨酸，V(Val)：缬氨酸；W(Trp)：色氨酸；Y(Tyr)：酷氨酸。

如本文所用，术语“NRS”可以与“AsnRS”或“Asparaginyl-rRNA-tRNA synthetase(天冬酰胺酰tRNA合成酶)”互换使用，并且是指促进天冬酰胺附着于基同源tRNA的一类氨酰基-tRNA合成酶。在本发明中，除非另有说明，术语“NRS”指的是人源RNS，并且人源RNS优先由以下序列表SEQ ID NO：2中显示的氨基酸序列组成：

MVLAELYVSDREGSDATGDGTKEKPFKTGLKALMTVGKEPFPTIYVDSQKENERWNVISKSQLKNIKKMWHREQMKSESREKKEAEDSLRREKNLEEAKKITIKNDPSLPEPKCVKIGALEGYRGQRVKVFGWVHRLRRQGKNLMFLVLRDGTGYLQCVLADELCQCYNGVLLSTESSVAVYGMLNLTPKGKQAPGGHELSCDFWELIGLAPAGGADNLINEESDVDVQLNNRHMMIRGENMSKILKARSMVTRCFRDHFFDRGYYEVTPPTLVQTQVEGGATLFKLDYFGEEAFLTQSSQLYLETCLPALGDVFCIAQSYRAEQSRTRRHLAEYTHVEAECPFLTFDDLLNRLEDLVCDVVDRILKSPAGSIVHELNPNFQPPKRPFKRMNYSDAIVWLKEHDVKKEDGTFYEFGEDIPEAPERLMTDTINEPILLCRFPVEIKSFYMQRCPEDSRLTESVDVLMPNVGEIVGGSMRIFDSEEILAGYKREGIDPTPYYWYTDQRKYGTCPHGGYGLGLERFLTWILNRYHIRDVCLYPRFVQRCTP

本发明的一个方面提供一种多肽由在序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成。

本发明所述多肽来源于人源NRS，并且在本文中可以与NRS片段，NRS N端片段等互换使用。本发明所述多肽是由一个位于人源NRS的N端延伸结构域中的一序列组成，优选由序列表SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

本发明的序列表中SEQ ID NO:1所示的所述NRS片段的特征在于它具有趋化因子活性。所述趋化因子活性通过本发明的SEQ ID NO：1的NRS片段与CCR3(C-C趋化因子受体3型)结合来介导。这将在本发明的以下实施例中更好地说明。SEQ ID NO：1的氨基酸序列如下：

MVLAELYVSDREGSDATGDGTKEKPFKTGLKALMTVGKEPFPTIYVDSQKENERWNVISKSQLKNIKKMWHREQMKS

根据本发明所述多肽可以从自然界中提取，也可以通过基因工程方法构建。例如，按照常规方法构建编码多肽或其功能等价物(例如SEQ ID NO：3)的核酸。所述核酸可以使用合适的引物通过PCR扩增来构建。或者，可以通过本领域已知的标准方法合成DNA序列，例如，使用自动DNA合成仪(可以从Biosearch或Applied Biosystems购得)。构建的核酸分子插入含有与核酸的表达有效连接的一个或多个表达控制序列(例如启动子，增强子等)的载体中，并用由其形成的重组表达载体转化宿主细胞。将得到的转化体在适于核酸表达的培养基和条件下培养。然后从培养基中提取由核酸序列编码的基本上纯多肽。多肽的提取可以使用本领已知的方法(例如色谱法)进行。这里所述的“基本上纯的多肽”是指根据本发明所述多肽基本上不含来自宿主细胞的其它任何蛋白质。用于合成本发明所述多肽的基因工程方法可以在以下参考文献中找到：Maniatis et al.,Molecular Cloning；A laboratoryManual,Cold Spring Harbor laboratory,1982；Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,Second(1998)and Third(2000)Editions；Gene Expression Technology,Method in Enzymology,Genetics andMolecular Biology,Method in Enzymology,Guthrie Fink(eds.),Academic Press,SanDiego,Calif,1991；And Hitzeman et al.,J.Biol.Chem.,255:12073-12080,1990.

此外，本发明所述多肽可以通过本领域已知的化学合成((Creighton,Proteins,Structures and Molecular Principles,W.H.Freeman and Co.,NY,1983)较容易地制备。代表性的方法包括但不限于液相或固相合成，分级缩合，F-MOC或T-BOC化学(ChemicalApproaches to the Synthesis of Peptides and Proteins,Williams et al.,Eds.,CRCPress,Boca Raton Florida,1997；A Practical Approach,Atherton Sheppard,Eds.,IRLPress,Oxford,England,1989)。

此外，本发明所述多肽不仅包含具有以上所述氨基酸序列，还包括其在本发明范围内的氨基酸序列变体。本发明所述一种多肽变体指的是在一种多肽中，至少有一种本发明所述氨基酸序列中的氨基酸残基通过缺失、插入、非保守或保守性替换，氨基酸类似物替换或其重组等形成，产生一个不同的序列号。通过氨基酸交换不会改变分子活性是在本领域中已知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。

在某些实施例中，本发明所述多肽可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化和法尼基化进行修饰。

此外，包含一种SEQ ID NO：1氨基酸序列或与其至少具有95％序列同源性的氨基酸序列的多肽，和含有77至100种氨基酸的多肽均包括在本发明的范围内。

本发明还提供一种多肽在SEQ ID NO：1的所述多肽的N端还包括两种氨基酸。优选地，这两种氨基酸可以是但不限于甘氨酸和组氨酸。

本发明所述多肽包括由SEQ ID NO：1表示的多肽功能等价物。术语“功能等价物”指的是一种多肽与本发明所述多肽的氨基酸序列具有至少有70％，优选地有80％，更优选地有90％的序列同源(或同一性)。例如，本发明所述多肽包含具有70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,和100％序列同源性的多肽，指的是一种显示与本发明所述多肽的生理学活性基本上相同的多肽。这里，术语“基本上”是指某一特性的性质达到全部或大致相同程度的状态。

在本发明中，“同源性或同一性”是指聚合物分子例如多肽分子之间的整体上结合。例如，两个多肽序列之间的同源性/同一性(％)的计算可以通过校对两个序列以进行最佳比较来进行。优选地，用于比较的序列的长度为至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或基本上100％。然后，将于相应氨基酸位点的氨基酸进行相互比较。当位于所述第一序列位点的氨基酸与第二个序列相应位点的氨基酸相同时，两个序列在该位点是相同的。两个序列的同一性(％)是具有两个序列中常见的氨基酸位点的数量的函数，同时考虑到为两个序列之间的最佳设置必须引入的缺口的数目和长度。两个序列之间的比较和同一性(％)的确定可以通过数学算法来执行。例如，ClustalW(Thompson等，1994)可以用来测量序列同一性值，通过使用下列参数：对数组参数-方法：精确，矩阵：PAM，空位开放处罚：10.00，空位延伸处罚：0.10；多个排列参数-矩阵：PAM，空位开放处罚：10.00，延迟相等(％)：30.处罚结束空位：打开，空位分离距离：0，负矩阵：否，空位延伸处罚：0.20，残基特异性空位处罚：打开，亲水性空位处罚：打开，新水性残基：GPSNDQEKR。特定残基中的序列同一性简单地包括衍生的相同残基。

本发明中的术语“基本上”是指与某一特性相同或几乎相同的性质的状态。本发明中的术语“基本上相同”用于氨基酸或核酸序列之间的比较。本领域技术人员应当理解，如果两个序列在相应位点具有相同的残基，那么两个序列是“基本上相同的”。如本领域所熟知的，可以使用多种算法来比较氨基酸或核酸序列。例如，用于比较核酸序列的BLASTN，用于比较氨基酸序列的BLASTP，空位BLAST，以及PSI-BLAST都可以作为计算机程序来使用。这样的计算机程序的例子在以下文献中有详细描述：Altschul et al.,Basic localalignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990；Altschul et al.,Methodsin Enzymology；Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997；Baxevaniset al.,Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genes andProteins,Wiley,1998；And Misener et al.,(eds.),Bioinformatics Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology,Vol.132),Humana Press,1999.除了搜索相同的序列之外，上述计算机程序通常提供一定程度的一致性。两个序列，当有至少70％，优选地至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的在相应位点的残基超过某一特定长度的残基时，被认为是“基本上相同的”。优选地，“恒定长度残基”是指至少10、15、20、25、30、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个残基或更多残基。

本文使用的术语“相应”通常用于确定给定多肽的氨基酸残基的位置/身份。作为一种常规的技术，通常使用基于参考相关多肽的规范编号系统来指定多肽中的残基。“功能等价物”可以是那些在本发明所述多肽的一些氨基酸序列的产物中，作为增加、取代或删除的结果。氨基酸的替代优选地为保守的替代。天然存在的氨基酸保守替代的实例包括脂肪族氨基酸(Gly、Ala、Pro)，疏水性氨基酸(Ile、Leu、Val)，芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp)，酸性氨基酸(Asp、Glu)，碱性氨基酸(His、Lys、Arg、Gln、Asn)和含硫氨基酸(Cys、Met)。另外，功能等价物也包括本发明所述多肽的氨基酸序列中一部分氨基酸删除的变体。氨基酸的删除或替代优选地位于与本发明所述多肽的生理学活性不直接相关的区域中。此外，氨基酸的变体优选地位于与本发明所述多肽的生理学活性相关的部分。此外，本发明所述多肽包括在氨基酸序列两端或在氨基酸序弄内添加几个氨基酸的变体。本发明的功能等价物的范围还包括蛋白质或多肽衍生物，其中蛋白质的一些化学结构被修饰，同时维持根据本发明的蛋白质的基本骨架及其生理活性。这包括例如，改变本发明所述蛋白质的稳定性，储存稳定性，挥发性或溶解性的结构修饰。

本发明还提供一种编码本发明所述多肽的核酸分子

如上所述，只要编码本发明所述多肽的核酸序列编码一种具有相同活性的多肽，就可以通过替代、删除、插入或其重组来突变一个或多个核酸碱基。上述本发明的SEQ IDNO：1的多核苷酸优选地由SEQ ID NO：3的核苷酸序列表示的核酸分子编码。这种核酸分子的序列可以是单链或双链并且可以是DNA分子或RNA(mRNA)分子。SEQ ID NO：3的核苷酸序列如下：

ATGGTGCTTGCAGAGCTGTACGTCTCTGACCGAGAGGGAAGCGATGCCACGGGAGATGGAACCAAGGAGAAACCATTTAAAACAGGTCTAAAGGCTTTGATGACAGTAGGGAAAGAACCATTTCCTACCATTTACGTAGATTCACAAAAAGAAAATGAGAGGTGGAATGTTATTTCTAAATCACAGTTGAAGAACATTAAAAAGATGTGGCATAGGGAACAAATGAAGAGT

编码本发明多肽的核酸序列可以从天然中分离，人工合成或通过基因重组方法产生。编码本发明所述多肽的核酸序列可以可操作地连接到能够表达它的载体上以提供本发明所述多肽。

本发明所述多肽可以过常规基因工程方法来构建。例如可以使用具有编码人源NRS基因的多核苷酸的适当引物作为模版，通过PRC扩增来构建多核苷酸序列。或者，可以通过本领域已知的标准方法合成DNA序列，例如使用自动DNA合成仪(可以从Biosearch或Applied Biosystems购买)。所述构建的多核苷酸序列可以可操作地连接至一个或多个表达控制序列(例如启动子、增强子等)上，以调节多核苷酸序列的表达。然后用由其构建的重组表达载体转化宿主细胞。将得到的转化体在适于表达DNA序列的增养基和条件下培养，以从培养物中提取由DNA序列编码的基本上纯的蛋白质。所述提取可以用本领域已知的方法进行。

如本文所述，“基本上纯的多肽或蛋白质”指的是根据本发明所述蛋白质基本上不含来自宿主细胞的任何其它蛋白质。本发明所述蛋白质合成的基因工程方法可以从以下参考文献中打到：:Maniatis et al.,Molecular Cloning；A laboratory Manual,ColdSpring Harbor laboratory,1982；Sambrook et al.,supra；Gene ExpressionTechnology,Method in Enzymology,Genetics and Molecular Biology,Method inEnzymology,Guthrie&Fink(eds.),Academic Press,San Diego,Calif,1991；AndHitzeman et al.,J.Biol.Chem.,255:12073-12080,1990.

此外，本发明所述多肽可以通过本领域已知的技术(Creighton,Proteins:Structures and Molecular Principles,W.H.Freeman and Co.,NY,1983)化学合成。换言之，本发明所述多肽可以使用常规的逐步液相或固相合成，分级缩合，F-MOC或T-BOC化学(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins,Williams etal.,Eds.,CRC Press,Boca Raton Florida,(1997)；A Practical Approach,AthertonSheppard,Eds.,IRL Press,Oxford,England,(1989))制备。一种优选的制备方法是使用固相合成。本发明所述多肽可以通过依照在常规固相法中从由C端开始鉴定的氨基酸序列依次进行，通过被保护的氨基酸之间的缩合反应来合成。在缩合反应之后，所述保护基团和与C端氨基酸连接的载体可以通过已知的方法如酸分解法或氨解法去除。以上所述肽的合成方法在相关书籍(Gross and Meienhofer's,The Peptides,vol 2.,Academic Press,1980)中详细描述。

由基因工程方法产生的蛋白质或化学合成的蛋白质可以通过本领域已知的提取、重结晶、各种色谱法(凝胶过滤、离子交换、沉淀、吸附、反相)，电泳和逆流分配法等各种方法被分离或纯化。

本发明提供一种包含核酸分子的重组载体

本发明所述术语“重组载体”是指基因构建体，包含可操作地连接以表达插入基因的重要调节元素，以作为一个能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白或靶RNA的载体。

本发明所述术语“可操作地连接”是指核酸表达的调控序列与编码期望的蛋白质或RNA以执行一般功能的核酸序列之间的功能性连接。例如，编码启动子和蛋白质或RNA的核酸序列是可操作地连接的，以使它们可以影响编码核酸序列的表达。可以使用本领域已知的基因重组技术生产与重组载体的可操作的连接，并且使用本领域已知的酶来进行位点特异性DNA切割和连接。

本发明所述载体包括但不限于质粒载体、粘粒载体、噬菌载体和病毒载体。合适的表达载体包括表达控制元素例如启动子、操作子、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号和增强子。另外，它们包含用于膜靶向或分泌的信号序列或前导序列，并且可以根据目的不同地制备。所述载体的启动子可以是本构型或诱导型。所述表达载体还包括用于选择含有载体的宿主细胞的选择标记，而如果表达载体是可复制载体，则其具有复制起点。

然而信号序列不限于此，当宿主是大肠杆菌时，信号序列包括PhoA信号序列，OmpA信号序列等；当宿主是芽孢杆菌时，信号序列包括α-淀粉酸信号序列，枯草杆菌蛋白酶信号序列等；当宿主是酵母时，信号序列包括MF信号序列，SUC2信号序列等；当宿主是动物细胞时，信号序列包括胰岛素信号序列，α-干扰素信号序列，抗体分子信号序列等。

本发明提供了用重组载体转化的转化体

所述转包括将核酸引入生物体，细胞，组织或器官的任何方法，并且可以通过选择本领域已知的取决于宿主细胞的合适的标准技术来进行。这些方法包括但不限于微粒轰击，电穿孔，原生质体融合，磷酸钙(CaPO₄)沉淀，氯化钙(CaCl₂)沉淀，碳化硅纤维搅拌，农杆菌介导的转化，PEG介导的融合，显微注射，脂质体介导的方法，硫酸葡聚糖，脂质体，热冲击法。

术语“转化体”可以与“宿主细胞”互换使用，并且是指含有通过任何方法(例如电穿孔，钙磷酸酶沉淀，显微注射，转化和病毒感染)引入细胞中的异源DNA的原核或真核细胞。

由于蛋白质的表达水平及修饰取决于宿主细胞，因此可以选择和使用适于本领域技术人员的目的的宿主细胞。本发明所述转化体可以优选地表示转化的微生物。具体地，例如，宿主细胞包括但不限于大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，链霉菌，假单胞菌，奇异变形杆菌或葡萄球菌如原核宿主细胞。此外，可以使用来源于真菌(例如曲霉菌)，酵母(例如巴斯德毕赤酵母，酿酒酵母，裂殖酵母，粗糙脉孢菌)等亚真核细胞的细胞，以及昆虫细胞、植物细胞等高等真核生物，以及哺乳动物均可以用作宿主细胞，但是本发明不限于此。

本发明的转化体(或转化的微生物)可以优选为大肠杆菌。本发明所述大肠杆菌菌株可以使用但不限于Rosetta2(DE3)，C41(DE3)和SoluBL21等。

同时，本发明所述多肽(SEQ ID NO：1的NRS片段)与CCR3特异性结合，因此可以用于检测和诊断CCR3特异性表达的疾病或病理。具体地，AMD(年龄相关性黄斑变性)中的失明主要是由脉络膜新血管形成的视网膜侵入引起的，而在AMD患者的脉络膜新血管内皮细胞中CCR3是特异性表达的。因此，本发明提供了含有本发明所述多肽作为活性成分的脉络膜新血管生成检测用组合物。特别地，在亚临床性脉络膜新血管生成(CNV)中，本发明所述多肽可以为检测和诊断提供便利。

本发明所述多肽可以以标记状态提供，以促进与本发明所述多肽的脉络膜新血管生成位点的细胞结合(即与CCR3的细胞结合)的确认，检测和定量。换言之，它们可以通过连接到(例如供价键或交联)可检测标记来提供。所述可检测标记物可以包括显色酶(例如过氧化物酶，碱性磷酸酶)，放射性同位素(例如18F、123I、14I、125I、32P、35S和67Ga)，发色团，发光物质或荧光物质(例如FITC，RITC和GFP(绿色荧光蛋白)；EGFP(增强型绿色荧光蛋白)；RFP(红色荧光蛋白)；DsRed(Discosoma sp，红色荧光蛋白)；CFP(青色荧光蛋白)；CFDP(青绿色荧光蛋白)；YFP(黄色荧光蛋白)；Cy3，Cy5，和Cy7.5)，磁共振成像材料(例如钆(Gd))，超顺磁性粒子或超级超顺磁性粒子。

根据所述标记的检测方法在本领域中是公知的，但是可以通过例如以下方法进行。当用荧光物质作为可检测标记时，可以使用免疫荧光染色。例如，用荧光物质标记的本发明所述肽可以与样本反应，并且可以除去未结合的或非特异性的结合产物。然后在荧光显微镜下观察肽的荧光。在使用酶作为可检测标记的情况下，可以通过酶反应底物显色反应来测量吸光，并且在放射性物质的情况下，可以测量发射的放射量。此外，检测结果可以根据检测标记根据已知的成像方法成像。

在本发明中，术语“样本”是指生物样本，包括生物来源的血液和其他液体样本，生物样本，组织培养物等实体组织样本或由其衍生的细胞。所述样本可以从动物，优选地可以从哺乳动物身上获得。所述样本可以在使用前进行预处理以进行检测。所述样本的这种预处理包括例如提取、浓缩、干扰无素失活和试剂的添加。

因为本发明所述多肽具有与CCR3特异性结合的优异效果，因此可以用于CCR3介导的疾病的诊断，或者作为用于选择性地将药物递送至CCR3介导的疾病中的病变部位的智能药物递送载体。因此，本发明提供了一种用于诊断CCR3介导的疾病的组合物，其含有作为活性成分的所述多肽；以及包含作为活性成分的该多肽的CCR3介导的疾病特异性药物递送的组合物。

在本发明中，CCR3介导的疾病是一种CCR3在疾病中的表达是特异性表达并且与正常状态相比活性增加的病理现象。因此，由于CCR3充当疾病的主要疾病机制，所以它是指可由CCR3受体拮抗剂治疗的疾病。所述CCR3介导的疾病包括但不限于哮喘，过敏性肺病，嗜酸性粒细胞性肺炎，呼吸过敏性疾病，炎性肠病，牛皮癣，皮炎，湿疹，炎症性皮肤病，肾癌和前列腺癌。

另一方面，本发明所述多肽与CCR3特异性结合以显示趋化因子活性的事实证明人源NRS与CCR3在本发明所述多肽的位点(即N端延伸位点)结合，以诱导过度的免疫应答(包括自身免疫应答)和CCR3介导的疾病。

为了抑制NRS对疾病的作用而去抑制NRS的表达或其功能，会对人源NRS的天然功能产生影响，所述NRS在蛋白质转录过程中起着至关重要的作用，还可能引起其他副作用。因此，在NRS中，如果找到仅在与免疫应答和疾病相关的位点发挥作用并且可局部抑制其活性的物质即可以减少副作用又可以获得期望的效果。因此，寻找具有高选择性和特异性的物质在治疗疾病中被认为是有意义的。因此，这不同于简单地寻找特定受体的拮抗剂。

因此，使用本发明所述多肽有利于筛选用于抑制NRS中受疾病影响的位点的活性的更具体和更高效的治疗剂。

因此，本发明提供筛选用于预防或治疗CCR3介导的疾病的方法，所述方法包括:

(1)通过使测试药剂与本发明所述多肽(SEQ ID NO：1的NRS片段)接触，测定测试药剂是否抑制SEQ ID NO：1的多肽或含有该组合物的全长NRS的趋化因子活性；

(2)在步骤(1)中选择抑制趋化因子活性的测试试剂；和

(3)通过在表达CCR3的细胞上处理步骤(2)中选择的测试试剂来确定CCR3活性是否受到抑制。

如本文所用，术语“药剂”或“测试药剂”包括任何物质、分子、元素、组合物、实体或其组合。例如：包括但不限于蛋白质、多肽、小有机分子、多糖和多核苷酸。它也可以是天然产物，合成化合物，组合物，或两种或更多种物质的组合。除非另外指出，否则所述试剂、材料和化合物可以互换使用。

更具体地，可通过本发明所述筛选方法筛选的测试药剂包括多肽、β-转角模拟物、多糖、磷脂、荷尔蒙、前列腺素、类固醇、芳香族化合物、杂环化合物、苯二氮卓类、寡聚N-取代甘氨酸，低聚氨基甲酸酯、糖类、脂肪酸、嘌呤、嘧啶，其衍生物、结构等价物或其重组。

一些试剂可能是合成的，而其它试剂可能是天然的。所述试刘可以从各种来源包括合成或天然化合物库获得。一化合物库可用多种可以逐步合成的化合物备制。可以通过编码的合成库(ESL)方法(WO95/12608，WO93/06121，WO94/08051，WO95/395503和WO95/30642)产生多个重组库的化合物。以细菌、真菌、植物和动物提取物形成的天然化合物库可以从市场上购买或现场收集。已知的药理学试刘可以用于直接或随机的化化修饰，例如酰化、烷基化、酯化和酰胺化以产生结构等价物。

所述测试药剂可以是天然存在的蛋白质或其片段。这样的测试药剂可以从天然来源获得，例如细胞或组织裂解物。多肽制备库可以用例如常规方法或从市场上购买cDNA库中得到。所述测试药剂可以是肽。例如，所述肽具有大约5-30种氨基酸，优选地，有5-20种氨基酸，更优选地，有7-15种氨基酸。所述肽可以是天然存在的蛋白质，随机肽或“有偏向”的随机肽的切割。的随机核酸

所述测试药剂可以是核酸。所述核酸测试药剂测试药剂可以是天然存在的核酸，随机核酸或“有偏向”的随机核酸。例如，原核或真核基因信得过有的片段可以以与上述相似的方式使用。

所述测试药剂还可以是小分子(例如分子重量约1000或更小的分子)。高通量测定法可以优选地用于筛选小分子调控剂的方法。许多测定法可用于筛选(Shultz,Bioorg.Med.Chem.Lett.,8:2409-2414,1998；Weller,Mol.Drivers.,3:61-70,1997；Fernandes,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:597-603,1998；and Sittampalam,Curr.Opin.Chem.Biol.,1:384-91,1997)。

可以基于本发明所述多肽或等价物的结构研究来制备用本发明所述方法进行筛选的测试药剂库。这种结构研究允许鉴定仅能抑制负性疾病相关活性的测试药剂，而测试药剂结合NRS趋化因子活性区并维持与蛋白质生产相关的先天功能。本发明所述多肽的三维结构可以用许多方法来确究，例如晶体结构和分子模型。使用X射线晶体学来研究蛋白质构的方法已经在文献中详细描述：Physical Bio-Chemistry,Van Holde,K.E.(Prentice-Hall,New Jersey 1971),pp.221-239,and Physical Chemistry with Applications tothe Life Sciences,D.Eisenberg,D.Crothers(Benjamin Cummings,Menlo Park 1979)。本发明所述多肽结构的计算机模型提供了筛选测试药剂的其它方法。在文献中描述了分子建模方法：U.S.Pat.No.612,894and U.S.Pat.No.5,583,973。此外，蛋白质结构也可以通过中子衍射和核磁共振(NMR)来确定：Physical Chemistry,4th Ed.Moore,W.J.(Prentice-Hall,New Jersey 1972)and NMR of Proteins and Nucleic Acids,K.Wuthrich(Wiley-Interscience,New York 1986)。

在步骤(1)中确定是否抑制趋化因子活性的方法可根据本领域已知的方法进行。非限制性实例包括琼脂平板法(Curr Microbiol 30(4):2513)，Boyden小室测定法(J ExpMed 115(3):45366)，桥室测定法(J.of Cell Biology 75(2):606616),微管分析方法(Anal Biochem 135 2):4669,Acta Protozool 34:1815.)和T型迷宫测定法(J Protozool29(2):22630)。

步骤(3)中的CCR3表达的细胞包括但不限于嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和辅助性T淋巴细胞。

此外，在步骤(3)之后，还可以进一步地实施步骤(4)，对含有CCR3介导的疾病的动物施用所选择的药剂，以检测其是否显示治疗效果。

本发明提供了一种多肽用于制备包含所述多肽作为活性成分的用于检测脉络膜新血管形成的药剂的用途。

本发明提供了一种用于检测脉络膜新血管生成的方法，所述方法包括向有需要的施受者施用有效量的用于检测脉络膜新血管生成的包含所述多肽作为活性成分的试剂。

本发明提供了一种多肽用于制备包护含所述多肽作为活性成分的用于诊断CCR3介导的疾病的药剂的用途。

本发明提供一种用于诊断CCR3介导的疾病的方法，所述方法包含向有需要的施受者施用有效量的用于诊断CCR3介导的疾病的包含所述多肽作为一种活性成分的药剂。

本发明提供一种多肽用于制备包含所述多肽作为活性成分的CCR3介导的疾病特异性药物递送剂的用途。

本发明提供一种CCR3介导的疾病特异性药物递送方法，所述方法饭知向有需要的施受者施用有效量的包含所述多肽作为活性成分的CCR3介导的疾病特异性药物递送剂。

如本文所述，所述有效量指的是向施受者施用时用于检测、诊断、治疗脉络膜新血管生成或CCR3介导的疾病的量。所述施受者可以是动物、优选地为哺乳动物、尤其是一种包括人体的动物，也可以是来源于动物的细胞，组织和器官。所述施受者可能是需要治疗的患者。

如本文所述，所述治疗广泛地指改善由于脉络膜新血管生成或CCR3介导的疾病引起的症状，其可包括治疗、基本上预防或改善脉络膜新血管生成或CCR3介导的疾病的状况，并且包括但不限于缓解、治愈或预防由脉络膜新血管生成或CCR3介导的疾病引起的一种或大部分症状。

发明效果

由于本发明所述多肽是由SEQ ID NO：1组成，并通过与CCR3结合而显示趋化因子活性，因此对于CCR3介导的疾病或病变的免疫调节，药物检测、诊断、治疗和开发等各种目的是有效的。

附图说明

图1显示了在无血清培养基中培养A549、J460、WI-26、Daudi和Jurkat细胞系6小时后，通过Western印迹确定NRS分泌的结果，收集培养基并通过TCA沉淀分泌蛋白治疗。

图2显示了在无血清培养基中培养RAW264.7,J774A.1,U937和HL-60细胞系6小时后，通过Western印迹确定NRS分泌的结果，收集培养基并通过TCA沉淀分泌蛋白治疗。

图3显示了当用浓度为10ng/ml的细胞因子(TNF-α，IFN-γ和TGH-β)分别处理RAW264.7细胞4小时之后的，NRS分泌水平的果(Con：未处理的细胞因子组)。

图4显示了癌细胞或淋巴细胞(T细胞、B细胞)的细胞迁移是否由全长NRS，本发明所述N端片段和NRS催化结构域肽分别诱导的结果。将肿瘤细胞和淋巴细胞铺在具有transwell纤维蛋白包被膜的上室中，并将上述三种肽在浓度1nM的下室中处理，温育4小时后，细胞转移到膜上被染色并在显微镜下观察(T lymphocyte:Jurkat,B lymphocyte:Daudi,Cancer cell:H460)。

图5显示分别根据每种肽(即全长NRS，本发明所述NRS的N端的片段和NRS催化结构域肽)的处理浓度定量B淋巴细胞(Daudi细胞)的细胞迁移的结果。对每个处理组用transwell进行细胞迁移测定后，对存在于膜中的移动细胞进行计数。(con:未处理组；F0.1:全长NRS，0.1nM处理,；F1：全长NRS，1nM处理；F10：全长NRS，10nM处理；N0.1：NRS的N端片段，0.1M处理；N1：NRS的N端片段，1nM处理：N10：NRS的N端片段，10nM处理；CO.1：NRS催化结构域肽，0.1nM处理；C1：NRS的催化结构域肽，1nM处理；C10：NRS催化结构域肽，10nM处理)

图6显示了分别根据每种肽，即全长NRS、本发明所述的NRS的N端片段、NRS催化结构域肽，的处理浓度，定量T淋巴细胞(Jurkat细胞)的细胞迁移结果。对每个处理组使用transwell进行细胞迁移测定后，对存在于膜中的移动细胞进行计数。(con:未处理组；F0.1:全长NRS，0.1nM处理,；F1：全长NRS，1nM处理；F10：全长NRS，10nM处理；N0.1：NRS的N端片段，0.1M处理；N1：NRS的N端片段，1nM处理：N10：NRS的N端片段，10nM处理；CO.1：NRS催化结构域肽，0.1nM处理；C1：NRS的催化结构域肽，1nM处理；C10：NRS催化结构域肽，10nM处理)。

图7显示了通过Western印迹(T lymphocyte:Jurkat,B lymphocyte:Daudi,Cancer cell:H460)测量癌细胞或淋巴细胞(T细胞，B细胞)中CCR3表达的结果。

图8显示了量化在淋巴细胞迁移中对CCR3进行敲除的效果的结果。使用CCR3靶向siRNA(si-CCR3)的CCR3敲除细胞用于transwell室中的细胞迁移测定。在下腔室中对全长NRS、本发明所述NRS的N端片段、NRS催化结构域肽和RANTES(阳性对照)进行处理后，在显微镜下计数从上腔室膜迁移过来的细胞。

图9显示了通过蛋白质印迹确认使用CCR3靶向siRNA(si-CCR3)敲除CCR3的结果。

具体实施方式

以下将对本发明进行详细说明。

以下实施例仅是对本发明的说明，但是本发明不限于以下实施例。

<实施例1>

重组NRS的N端延伸M1-S77蛋白的制备

(1)MBP-NRS的N端延伸的融合蛋白构建

本发明人使用pET-28a载体(Novagen)构建重组蛋白以表达NRS的N端延伸蛋白并获得高溶解性蛋白。麦芽糖结合蛋白(MBP)-烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶切割位点-NRS的N端延伸与pET-28a载体融合。以下是与麦芽糖结合蛋白融合的蛋白序列信息。

MGSSHHHHHHSKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSENLYFQGHMVLAELYVSDREGSDATGDGTKEKPFKTGLKALMTVGKEPFPTIYVDSQKENERWNVISKSQLKNIKKMWHREQMKS*

用TEV蛋白酶切割后，获得NRS的N端蛋白，其中，在NRS序列1-77的N端残留GH氨基酸。使用Nde1和Xho1限制性位点将人源NRS序列插入载体中。

(2)包含重组MBP-NPS的N端延伸蛋白的大肠杆菌培养物和过表达蛋白质

通过热休克法转化大肠杆菌Rosetta2(DE3)(Novagen)，使用构建的表达重组蛋白MBP-NRS的N端延伸的载体，并通过在含有卡那霉素的LB培养基中来选择具有卡那霉素抗性的菌浇(+30毫克/升)。将筛选出的菌落接种于含有卡那霉素(+30mg/L)的LB液体培养基中，在37℃下培育16小时以产生大量培养物。将部分种子培养物接种到含有卡那霉素的主培养基LB培养基(2％)中，当OD600在37℃达到0.5时，通过0.5mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导重组蛋白的表达。所述表达诱导的培养物在37℃培养8小时，然后在4℃以10分钟6000g的离心力提取细菌沉淀物。

(3)重组NRS的N端延伸的蛋白质纯化

将提取的细胞沉淀物悬浮于粉碎液中[35mM咪唑,500mM NaCl,20mM Tris-HCl(pH7.5)/10mL粉碎液/1g细胞]。向悬浮液中加入100mM PMSF(苯基甲基磺酰氟/100mMPMSF，100μl/1g细胞)后，用超声波破碎机(SONICS)破碎悬浮液。粉碎后，将上清液在4℃以35000g离心力分离60分钟。使用0.45–μm硝化纤维素膜过滤器(Sartorius)过滤上清液，并使用Pump P-1(GE Healthcare)将其装载到用镍填充的HiTrap螯合HP(GE Healthcare)柱上。将装载柱与FPLC(GE Healthcare)连接，然后首先使用洗脱溶液(1M咪唑，500mM NaCl，20mM Tris-HCl，PH7.5)通过50％梯度洗脱法分离和纯化重组蛋白质。使用HiPrep26/10Desalting(GE Healthcare)柱将纯化的重组蛋白质替换为TEV蛋白酶处理溶液(200mMNaCl，20mM Tris-HCl，PH7.5)，并将1mg TEV蛋白酶在4℃下处理20小时以分离MBP和NRS的N端延伸。然后用泵P-1(GE HEalthcare)再次将其装载到填充有镍的HiTrap螯合HP(GEHealthcare)柱上。将负载柱连接到FPLC(GE Healthcare)上，然后使用洗脱液(1M咪唑，500mM NaCl，20mM Tris-HCl，PH7.5)通过50％梯度洗脱法将蛋白质二次分离和纯化。使用二次分离的重组蛋白质，使用尺寸排阻色谱法[HiLoad16/600Superdex75(GEHealthcare),和PBS缓冲液]分离和纯化三级蛋白质，从而获得最终的NRS的N端延伸结构域(SEQ ID NO：1)。

<比较例1>

全长NRS蛋白质的生产

在pET-28a(NOVAGEN)载体的Nde1位点和Xho1位点之间插入全长NRS(SEQ ID NO：2)表达基因。构建的重组载体用于转化大肠杆菌菌株C41(DE3)。转化的细胞在含有卡那霉素的LB培养基中，在37℃振荡培养箱中培养。当OD600nm达到0.5时，加入IPTG(异丙基-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)到培养的细胞中以诱导NRS全长表达。在IPTG处理后，将细胞培养物在振荡培养箱中于37℃培育8小时。以10分钟6000g的离心力分离得到培养的大肠杆菌细胞。将得到的细胞重悬于含有500mM NaCl，20mM Tris-HCl和35mM咪唑(pH 7.5)的缓冲液中，并将细胞裂解用超声波处理器6000g离心收集培养的大肠杆菌细胞。将收集的细胞重悬于含有500mM NaCl，20mM Tris-HCl和35mM咪唑(pH 7.5)的缓冲液中，并用超声波处理器裂解细胞。

如下所述进行细胞裂解物中目标蛋白的纯化和获得。首先，将溶解的细胞样本以35000g离心力离心1小时，并通过0.45μm注射器过滤装置(Sartorius)过滤。使用蠕动泵将获得的样本加载到装有Ni(II)离子电荷的HiTrap 5ml螯合HP柱(GE HEALTHCARE)柱上。使用50％梯度洗脱法将加载的样本洗脱到含有500mM NaCl，20mM Tris-HCl和1M咪唑(pH7.5)的缓冲液中。使用HiPrep desalting 26/10(GE HEALTHCARE)柱，将含有全长NRS的级分在含有50mM NaCl，20mM Tris*-HCl(pH7.5)的缓冲液中脱盐。将脱盐后的样本加载到HiTrap5ml Q HP(GE Healthcare)柱上，并使用50％梯度洗脱法在含有1M NaCl，20mMTris-HCl(pH7.5)的缓冲溶液中洗脱。将得到的级分加载到HiLoad 16/600Superdex 200pg(GE HEALTHCARE)柱上，在PBS缓冲液(137mM NaCl,2.7mMKCI，4.3mM Na₂HPO₄，pH7.4)中洗脱，最终获得全长NRS(SEQ ID NO：2)的蛋白质样本。并将蛋白质样本与10％甘油混合。通过纯化的每个步骤中的2D电泳确认蛋白质纯度。

<比较例2>

NRS催化结构域的高纯度制备

将NRS催化结构域(98-548)基因插入到pET-28a(NOVAGEN)载体的Nde1位点和Xho1位点之间。用重组载体转化大肠杆菌Solu-BL21，转化后的细胞在含有卡那霉素的LB培养基，在37℃的振荡培养箱中培养。当OD600nm达到0.5时，将IPTG(异丙基-D-1-硫化吡喃半乳糖豆苷)加入到培养的细胞中以诱导NRS催化结构域片段的表达。IPTG处理后，将细胞培养物在37℃下在振荡培养箱中培育8小时。培养的大肠杆菌细胞在37℃下在振荡培养箱中培育8小时。培养的大肠杆菌细胞通过以6000g离心力离心10分钟获得。将得到的细胞重悬于含有500mM NaCl，20mM Tris-HCl和35mM咪唑(pH7.5)的缓冲液中，并用超声处理器裂解细胞。以与上述比较例1中的蛋白质纯化方法相同的方式获得来自细胞裂解物的NRS催化结构域(98-548)片段。

<实施例2>

鉴定重组NRS末端延伸M1-S77蛋白的细胞因子活性

[实验准备]

1.细胞培养和样本

将A549、H460、J774A.1、WI-26、Daudi和Jurkat细胞在含有10％胎牛血清和抗生素(100UI青霉素和100mg/ml链霉素)的RPMI1640培养基(Hyclone)中培养。使用含有10％胎牛血清和抗生素(100UI青霉素和100mg/ml链霉素)的DMEM培养基培养RAW264.47。使用抗CCR3抗体(Milipore)，抗微管蛋白抗体(Sigma)和抗-NRS抗体(Abcam)。

2.细胞迁移测定

使用Boyden Transwell板(5mm孔径，24孔，Corning)测量细胞迁移。首先，将膜用50μg/ml纤连蛋白(BD Biosciences)预包被，并将细胞置于上室中。将NRS的N端延伸结构域和RANTES分别作为诱导剂和阳性对照添加到下腔室。温育4小时后，将膜用PBS洗涤两次，用含有70％甲醇的PBS固定细胞。然后用苏木精(Sigma-Aldrich)对膜进行染色。通过拭子去除上部非迁移细胞。将膜切割并安装在载玻片上。使用20X物镜在显微镜下观察并计数转移的细胞。

3.分泌的测定

铺展后，细胞在70％融合时培养。将细胞用PBS清洗2次后，在下述各种条件下进行培养：(1)在无血清培养基中培养6小时，(2)在浓度为10ng/ml时加入TNF-α,IFN-γandTGH-β，培养4小时。

收集培养基后，依次以1000g离心力离心10分钟，10000g离心力离心20分钟，除去细胞和碎片。为了使蛋白质沉淀，加入三氯乙酸(TCA，Sigma)至最终浓度为10％。温育12小进后，通过以20000g离心力离心分泌的蛋白质使之丸粒化。将沉淀的蛋白质悬浮在100mMHEPES(pH8.0)中，然后用SDS-PAGE和Western印迹分离。

4.蛋白质印迹

用M-PER(Pierce)裂解冰上的细胞。通过离心去除细胞碎片后，按照制造商的方法，通过Bradford溶液(Bio-Rad)测量蛋白质浓度。然后通过SDS-PAGE分离蛋白质，转移至PVDF膜，然后使用对每种靶蛋白特异的抗体进行蛋白质印迹。使用初级抗CCR3抗体(Milipore)，抗微管蛋白抗体(Sigma)和抗NRS抗体(Abcam)。从Thermo购买的HRP缀合的山羊抗兔lgG作为二级抗体，HRS缀合的山羊抗小鼠lgG用于微管蛋白。

[实验结果]

1.Th1细胞因子诱导巨噬细胞分泌NRS

在自身免疫性和间质性肺病(ILD)患者中检测到NRS自身抗体。测试几种细胞系以发现能够分泌NRS的细胞。将不同的细胞系(A549,H460,WI-26,Daudi,Jurkat,RAW264.7,J774A.1,U937和HL-60)在无血清培养基中培养6小时，用TCA沉淀培养基中分泌的蛋白质。用SDS PAGE分离沉淀的蛋白质，用抗NRS抗体过蛋白质印迹检测NRS的存在。在所述9个细胞系中，仅在RAW264.7和J774A.1(参照图1和图2)细胞(其是巨噬细胞)的培养基中检测到NRS。在与上述相同的条件下，在培养基中未观察到微管蛋白的释放。结果证实，培养后培养基中所含的NRS不是由于细胞裂解。这些结果表明NRS是从巨噬细胞分泌来的。在RAW264.7细胞中处理几种不同的信号分子，如TNF-α，IFN-γ和TGF-β，以确定NRS分泌是否可以被其他刺激源诱导。已知TNF-α，IFN-γ影响Th1分化。相反，已知TGF-β调节Th2分化。其中，观察到TNF-α和IFN-γ在处理后4小时诱导NRS分泌(参见图3)。基于这些结果，证实NRS是从巨噬细胞分泌的，特别是在Th1分化条件下。

2.NRS的N端延伸结构域诱导淋巴细胞迁移。

使用transwell室监测细胞迁移。NRS催化结构域不影响淋巴细胞迁移，而全长NRS和NRS的N端延伸结构域诱导淋巴细胞迁移(参照图4到6)。这些结果表明N端延伸结构域具有趋化因子活性，为了观察NRS在其他类型的细胞中的趋化因子样活性，在癌细胞上处理NRS的N端延伸结构域，并且NRS的N端延伸结构域片段不激活癌细胞迁移(图4)。由于CCR3已被证明是NRS的功能性受体，因此在癌细胞和淋巴细胞中比较CCR3表达水平。CCR3表达在淋巴细胞中上调，但在癌细胞中不上调(参照图7)。由于CCR3在淋巴细胞中高表达，我们比较了NRS在CCR3敲低淋巴细胞中的趋化因子样活性。当CCR3被si-CCR3(图9)抑制时，全长NRS或NRS的N端延伸结构域的细胞迁移活性降低(参照图8)。这些结果表明NRS的N端延伸结构域是NRS的趋化因子样活性的主要成分，并且CCR3是NRS的趋化因子样活性的受体。

[工业上应用]

如上所述，本发明涉及一种具有趋化因子活性的新型多肽，更具体地涉及由SEQID NO：1所示的氨基酸序列组成的多月肽及其用途。由于本发明的多肽由SEQ ID NO：1组成并且通过与CCR3结合显示趋化因子活性，所以它可以用于多种目的，例如免疫调节、检测、诊断和治疗CCR3介导的疾或病状以及开发在工业上极有可能使用的治疗剂。

<110> 医药生命融合研究团

<120> 具有趋化因子活性的新型多肽

<130> OP18-0005/PCT/CN

<150> PCT/KR 10-2015-0099994

<151> 2015-07-14

<150> PCT/KR2016/007621

<151> 2016-07-13

<160> 3

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 77

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NRS N-terminal extension fragment

<400> 1

Met Val Leu Ala Glu Leu Tyr Val Ser Asp Arg Glu Gly Ser Asp Ala

1 5 10 15

Thr Gly Asp Gly Thr Lys Glu Lys Pro Phe Lys Thr Gly Leu Lys Ala

20 25 30

Leu Met Thr Val Gly Lys Glu Pro Phe Pro Thr Ile Tyr Val Asp Ser

35 40 45

Gln Lys Glu Asn Glu Arg Trp Asn Val Ile Ser Lys Ser Gln Leu Lys

50 55 60

Asn Ile Lys Lys Met Trp His Arg Glu Gln Met Lys Ser

65 70 75

<210> 2

<211> 548

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human NRS

<400> 2

Met Val Leu Ala Glu Leu Tyr Val Ser Asp Arg Glu Gly Ser Asp Ala

1 5 10 15

Thr Gly Asp Gly Thr Lys Glu Lys Pro Phe Lys Thr Gly Leu Lys Ala

20 25 30

Leu Met Thr Val Gly Lys Glu Pro Phe Pro Thr Ile Tyr Val Asp Ser

35 40 45

Gln Lys Glu Asn Glu Arg Trp Asn Val Ile Ser Lys Ser Gln Leu Lys

50 55 60

Asn Ile Lys Lys Met Trp His Arg Glu Gln Met Lys Ser Glu Ser Arg

65 70 75 80

Glu Lys Lys Glu Ala Glu Asp Ser Leu Arg Arg Glu Lys Asn Leu Glu

85 90 95

Glu Ala Lys Lys Ile Thr Ile Lys Asn Asp Pro Ser Leu Pro Glu Pro

100 105 110

Lys Cys Val Lys Ile Gly Ala Leu Glu Gly Tyr Arg Gly Gln Arg Val

115 120 125

Lys Val Phe Gly Trp Val His Arg Leu Arg Arg Gln Gly Lys Asn Leu

130 135 140

Met Phe Leu Val Leu Arg Asp Gly Thr Gly Tyr Leu Gln Cys Val Leu

145 150 155 160

Ala Asp Glu Leu Cys Gln Cys Tyr Asn Gly Val Leu Leu Ser Thr Glu

165 170 175

Ser Ser Val Ala Val Tyr Gly Met Leu Asn Leu Thr Pro Lys Gly Lys

180 185 190

Gln Ala Pro Gly Gly His Glu Leu Ser Cys Asp Phe Trp Glu Leu Ile

195 200 205

Gly Leu Ala Pro Ala Gly Gly Ala Asp Asn Leu Ile Asn Glu Glu Ser

210 215 220

Asp Val Asp Val Gln Leu Asn Asn Arg His Met Met Ile Arg Gly Glu

225 230 235 240

Asn Met Ser Lys Ile Leu Lys Ala Arg Ser Met Val Thr Arg Cys Phe

245 250 255

Arg Asp His Phe Phe Asp Arg Gly Tyr Tyr Glu Val Thr Pro Pro Thr

260 265 270

Leu Val Gln Thr Gln Val Glu Gly Gly Ala Thr Leu Phe Lys Leu Asp

275 280 285

Tyr Phe Gly Glu Glu Ala Phe Leu Thr Gln Ser Ser Gln Leu Tyr Leu

290 295 300

Glu Thr Cys Leu Pro Ala Leu Gly Asp Val Phe Cys Ile Ala Gln Ser

305 310 315 320

Tyr Arg Ala Glu Gln Ser Arg Thr Arg Arg His Leu Ala Glu Tyr Thr

325 330 335

His Val Glu Ala Glu Cys Pro Phe Leu Thr Phe Asp Asp Leu Leu Asn

340 345 350

Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Asp Val Val Asp Arg Ile Leu Lys Ser

355 360 365

Pro Ala Gly Ser Ile Val His Glu Leu Asn Pro Asn Phe Gln Pro Pro

370 375 380

Lys Arg Pro Phe Lys Arg Met Asn Tyr Ser Asp Ala Ile Val Trp Leu

385 390 395 400

Lys Glu His Asp Val Lys Lys Glu Asp Gly Thr Phe Tyr Glu Phe Gly

405 410 415

Glu Asp Ile Pro Glu Ala Pro Glu Arg Leu Met Thr Asp Thr Ile Asn

420 425 430

Glu Pro Ile Leu Leu Cys Arg Phe Pro Val Glu Ile Lys Ser Phe Tyr

435 440 445

Met Gln Arg Cys Pro Glu Asp Ser Arg Leu Thr Glu Ser Val Asp Val

450 455 460

Leu Met Pro Asn Val Gly Glu Ile Val Gly Gly Ser Met Arg Ile Phe

465 470 475 480

Asp Ser Glu Glu Ile Leu Ala Gly Tyr Lys Arg Glu Gly Ile Asp Pro

485 490 495

Thr Pro Tyr Tyr Trp Tyr Thr Asp Gln Arg Lys Tyr Gly Thr Cys Pro

500 505 510

His Gly Gly Tyr Gly Leu Gly Leu Glu Arg Phe Leu Thr Trp Ile Leu

515 520 525

Asn Arg Tyr His Ile Arg Asp Val Cys Leu Tyr Pro Arg Phe Val Gln

530 535 540

Arg Cys Thr Pro

545

<210> 3

<211> 231

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Polynucleotide encoding human NRS N-terminal extension fragment

<400> 3

atggtgcttg cagagctgta cgtctctgac cgagagggaa gcgatgccac gggagatgga 60

accaaggaga aaccatttaa aacaggtcta aaggctttga tgacagtagg gaaagaacca 120

tttcctacca tttacgtaga ttcacaaaaa gaaaatgaga ggtggaatgt tatttctaaa 180

tcacagttga agaacattaa aaagatgtgg catagggaac aaatgaagag t 231

Claims

1.一种多肽，其特征在于，由在序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述多肽，其特征在于，所述多肽具有趋化因子活性。

3.根据权利要求2所述多肽，其特征在于，所述趋化因子活性通过与CCR3(C-C趋化因子受体3型)结合来介导。

4.根据权利要求1所述多肽，其特征在于，所述多肽在其N端还包括两个氨基酸。

5.根据权利要求4所述多肽，其特征在于，所述两个氨基酸分别为甘氨酸和组氨酸。

6.一种核酸分子，其特征在于，将根据权利要求1所述多肽进行编码。

7.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含根据权利要求6所述核酸分子。

8.一种转化体，其特征在于，所述转化体由根据权利要求7所述的重组载体转化而成。

9.一种用于检测脉络膜新生血管的组合物，其特征在于，所述组合物包含作为活性成分的根据权利要求1所述的多肽。

10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述多肽由以下任一种物质进行标记：显示酶，放射性同位素，发色团，发光材料，荧光增白剂，磁共振成像材料，超顺磁性颗粒和超级超顺磁性颗料。

11.一种CCR3介导的疾病的诊断组合物，其特征在于，包含作为活性成分的根据权利要求1所述的多肽。

12.一种CCR3介导的疾病特异性药物递送组合物，其特征在于，包含作为活性成分的根据权利要求1所述的多肽。

13.根据权利要求11或12所述的多肽，其特征在于，所述CCR3介导的疾病选自：哮喘，过敏性鼻炎，过敏性肺病，过敏性肺炎，嗜酸性粒细胞性肺炎，呼吸道过敏性疾病，炎性肠病，牛皮癣，皮炎，湿疹，炎症性皮肤病，肾癌和前列腺癌。

14.一种筛选用于预防或治疗CCR3介导的疾病的药剂的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)通过使测试药剂与本发明所述多肽(SEQ ID NO:1的NRS片段)相接触，确定测试药剂是否抑制根据权利要求1所述的多肽的趋化因子活性或含有所述多肽的全长NRS的趋化因子活性；

(2)通过步骤(1)选择一种抑制趋化因子活性的测试药剂；并且

(3)通过步骤(2)选择的测试药剂进行处理，确定在表达CCR3的细胞上是否抑制了CCR3的活性。

15.一种根据权利要求1所述多肽在制备脉络膜新血管生成测试药剂中的用途，其特征在于，所述药剂包含作为活性成分的根据权利要求1所述多肽。

16.一种检测脉络膜新血管形成的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的施受者施用有效量的用于检测脉络膜新血管生成的试剂，其中，所述试剂包含作为活性成分的根据权利要求1所述的多肽。

17.一种根据权利要求1所述的多肽在制备CCR3介导的疾病的诊断试剂中的用途，其特征在于，所述试剂包含作为活性成分的根据权利要求1所述的多肽。

18.一种诊断CCCR3介导的疾病的方法，其物征在于，所述方法包括向有需要的施受者施用有效量的用于诊断CCR3介导的疾病的试剂，其中，所述试剂包含作为活性成分的根据权利要求1所述的多肽。

19.一种根据权利要求1所述的多肽在制备CCR3介导的疾病特异性药物递送试剂中的用途，其特征在于，所述试剂包含作为活性成分的根据权利要求1所述的多肽。

20.一种用于CCR3介导的疾病特异性药物递送的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的施受者施用有效量的CCR3介导的疾病特异性药物递送试剂，其中，所述试剂包含作为活性成分的根据权利要求1所述的多肽。