KR20210001110A - Nrs 단편 폴리펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 NRS 단편 폴리펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서 제공하는 특유의 NRS 단편 폴리펩타이드는 loop3 모티프를 포함하며 단리된 상태에서도 고유의 활성 효과가 현저하고 CCR3에의 결합을 통한 케모카인 활성을 나타내므로, 면역조절, CCR3을 매개로하는 질환 또는 병증의 검출, 진단, 치료, 약제 개발 등의 다양한 목적으로 활용가능하며, 특히 전장(full length) 단백질 및 도메인 단위에서의 폴리펩타이드 보다 길이가 짧아 이용 상의 현저한 우수성을 가지므로 산업상 이용가능성이 높다.

Description

NRS 단편 폴리펩타이드 및 이의 용도 {Fragmented NRS polypeptide and use thereof}

본 발명은 NRS 단편 폴리펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단리된 폴리펩타이드와 상기 폴리펩타이드의 맥락막 혈관신생 검출/영상화, CCR3-매개 질환의 진단 및 상기 질환 특이적 약물 전달 용도에 관한 것이다.

케모카인(chemokine)은 백혈구 화학주성 인자로서 신체의 다양한 조직으로 백혈구를 유인하는 필수불가결한 역할을 수행하는데, 그 과정은 염증 및 감염에 대한 신체 반응 모두에 대해서 필수적이다. 케모카인 및 이의 수용체는 면역조절, 염증성 및 감염성 질환의 병리생리학에 있어서 중심이 될 뿐만아니라, 최근 케모카인 및 이의 수용체 종류에 따라 자가면역질환을 포함하여 특정 병증에 대한 특이적 역할이 밝혀지고 있어, 특정 케모카인 또는 그의 수용체의 활성을 조절하는 치료적 접근방법이 제시되고 있다.

C-C 케모카인 수용체 3(CCR3)은 에오탁신-1, 에오탁신-2, 란테스(RANTES), MCP-2, MCP-3 및 MCP-4를 포함하는 케모카인에 대한 GPCR(G protein-coupled receptor)이고, 말초혈액 및 기도에서 호산백혈구 반응을 일으킨다. CCR3은 호산백혈구의 표면뿐만 아니라 호염기백혈구, 마스트 세포 및 타입 2 헬퍼 T 림프구 상에서도 발현된다. CCR3 mRNA 및 단백질 레벨은 기도 과민반응과 관련하여 천식환자의 기관지 점막에서 상승한다. 기도 내 호산백혈구 침윤에 CCR3 가 참여한다는 사실은 CCR3 없는 마우스(CCR3-deficient mice) 연구에서 증명되었다. 인간의 CCR3 유전자 (MIM #601268) 는 아토피성 피부염 및 천식과 연관된 염색체 3p21.3에 위치한다. 이처럼 CCR3에 케모카인 리간드의 결합은 천식, 비염 및 알레르기성 질환 및 루마티스성 관절염과 같은 자가면역 질환, 그레이브스 질환 및 동맥경화를 포함하는 염증성 및 면역조절 이상의 중요한 조절자로서 알려져있으며, US8778616B2 등의 문헌에서와 같이 CCR3에 결합하는 리간드를 통하여 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization)을 검출할 수 있는 등 CCR3의 다양한 병리적 기여가 밝혀지고 있다. 또한 ILD(interstitial lung disease, 간질성 폐질환)과 같은 질환에서도 CCR3-mediated proinflammatory signaling이 나타나는 것으로 알려졌다.

한편, 최근 몇몇의 아미노아실-tRNA 합성효소는, 번역 과정에서 이들의 관여와는 별개인 비정규적인(non-canonical) 기능을 가지는 것이 입증되고 있다. 즉, ARS 단백질의 일부 단편들에서, 단백질 번역을 넘어서 다른 종류의 경로를 조절하는 세포외 신호전달(시그날링) 활성을 보이며 아미노아실화에 연관되지 않은 예상하지 못한 활성을 보유하는 것이 규명되고 있다. 이러한 예상하지 못한 활성은 때로는 특정 질병 등에 대하여 치료적으로 이용가능한 활성일 수 도 있지만, 오히려 인간의 질병상태를 유발하는 기능을 할 우려가 큰 활성인 경우도 있다. 일례로 라이실 t-RNA 합성효소(lysyl-t-RNA synthetase, KRS)가 암 전이를 촉진하는 활성이 있음이 밝혀진 바 있다(한국 등록특허 10-1453141).

이처럼 이러한 예상하지 못한 활성은 천연의 전장 단백질 서열에서는 관찰되지 않고(또는 천연의 전장 단백질 수준일 때 유의미하지 못한 효과를 나타내나) 일부 영역이 단리되었을 때 특정 활성이 현저히 나타내는 경우도 있고, 또한 그 효과가 치료적으로 사용되기에 부적절한 특성을 보유하고 있을 때도 있다. 이러한 예측 불가능성에 따른 곤란성을 극복하고 이 ARS 계통(family) 단백질에 대한 치료적 및/또는 진단적 잠재성을 활용하기 위해서는, 다른 여러가지 아미노아실-tRNA 합성효소 단백질의 생물학적으로 관련된 형태들을 규명하는 다양한 노력이 필요한 실정이다.

한편, 제약 산업이 과거의 천연물 의약품이나 화학적 합성 의약품에서 단백질 또는 펩티드 의약품의 개발로 바뀌어가고 있는 추세이며, 세계 의약품 시장 중 단백질 또는 펩티드 약물의 시장은 2006년 437억 달러에서 2011년 885 억으로 확대되었으며, 국내 단백질 의약품 시장이 세계 시장에서 차지하는 비율은 2006년 3%에서 2021년 7%로 확대될 전망이다. 단백질 또는 펩티드 의약품은 합성 의약품에 비해 부작용이 적고 약효가 빨라 의약품의 혁신분야로 평가되고 있다.

현재 주요 제약사의 파이프라인에 있어 바이오의약품의 중요성이 점차 증가하고 있으나 펩티드(Peptides)와 같은 특정 바이오의약품이 출시되기까지 주요 기술적 문제가 존재한다. 일례로, 표적 부위까지 펩티드 의약품의 낮은 전달률, 긴(long-chain) 펩티드 합성 등이 상업화의 걸림돌로 작용하고 있다. 일반적으로 펩티드는 약 50개 이하의 아미노산으로 구성되어 있는 것을 말하며, 펩티드 약물로 성공하기 위해서는 짧은 서열이면서 활성을 나타내는 것을 발굴하는 것, 즉 전장(full length) 단백질로부터 뛰어난 생리활성을 가진 최소 단위(모티프)를 선별해내는 것이 관건인 것으로 알려져 있다. 펩티드 길이가 길면 합성 비용이 많이 들고 제조가 용이하지 않으며, 임상 적용 또는 인체 흡수상의 문제가 있는 것으로 알려져 있다.

그러나, 어떤 단백질에서 상기 단백질이 속하는 계통(family)에서 보고된 바 없는 신규한 활성이 규명된 경우에, 이러한 신규 활성을 나타내는 생리활성 모티프(motif)를 찾아내는 것은 상당한 곤란성을 동반하는 어려운 과제이다(Salma Aouled El Haj Mohamed et al., Motif Discovery in Protein Sequences, Pattern Recognition - Analysis and Applications, December 14, 2016, pp. 1-134).

이에 본 발명자들은 NRS로부터 케모카인 활성(특히, CCR3에 대한 케모카인 활성)을 보유하는 도메인(domain)과 핵심 모티프(motif)를 최초로 규명하였으며, 상기 모티프를 포함하여 제작된 특정 길이의 NRS 폴리펩타이드 단편이 전장(full length) 단백질 및 상기 도메인 단위에서의 폴리펩타이드 보다 이용 상의 현저한 우수성을 가지는 것을 확인하여 본원 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단리된 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 CCR3-매개 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 CCR3-매개 질환 특이적 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은,

(a) 상기 폴리펩타이드와 시험제제를 접촉시켜 시험제제가 상기 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 NRS 전장 단백질의 케모카인 활성을 억제하는지 여부를 측정하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 케모카인 활성을 억제하는 시험제제를 선별하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계에서 선별된 시험제제를 CCR3를 발현하는 세포에 처리하여 CCR3 활성을 억제하는지 여부를 측정하는 단계

를 포함하는 CCR3-매개 질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단리된 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization) 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 CCR3-매개 질환의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 CCR3-매개 질환 특이적 약물 전달용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 상기 폴리펩타이드와 시험제제를 접촉시켜 시험제제가 상기 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 NRS 전장 단백질의 케모카인 활성을 억제하는지 여부를 측정하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 케모카인 활성을 억제하는 시험제제를 선별하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계에서 선별된 시험제제를 CCR3를 발현하는 세포에 처리하여 CCR3 활성을 억제하는지 여부를 측정하는 단계

를 포함하는 CCR3-매개 질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 용어 ‘~을 포함하는(comprising)’이란 ‘함유하는’ 또는‘특징으로 하는’과 동일하게 사용되며, 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 ‘~로 구성되는(consisting of)’이란 ‘~로 이루어지는’과 동일하게 사용되며, 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 ‘필수적으로 구성되는(essentially consisting of)’또는‘필수적으로 이루어지는’이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에 개시된 내용 전반에 걸쳐서, 본 발명과 관련된 다양한 양상 또는 조건들이 범위 형식으로 제안될 수 있다. 본 명세서에서 범위값의 기재는, 별다른 언급이 없는 한 해당 경계값을 포함하는 것으로서 즉, 하한값 이상 내지 상한값 이하의 값을들 모두 포함하는 의미이다. 범위 형식의 서술은 단순히 편의성 및 간략성을 위한 것이며, 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한(inflexible limitation)으로서 해석되지 않아야 하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 서술은 상기 범위 내의 개별적인 수치값들뿐만 아니라 모든 가능한 하부범위(subrange)를 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 7 내지 170과 같은 범위의 서술은 상기 범위 내의 개별적 수치들, 예를 들어, 9, 27, 35, 101, 및 155 뿐만 아니라, 10 내지 127, 23 내지 35, 80 내지 100, 50 내지 169 등과 같은 하부범위들을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭과 무관하게 적용된다.

본 명세서에서 사용된 용어‘폴리펩타이드’및‘단백질’은 통상(종래)의 의미에 따라 사용되는 것으로, 즉 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 폴리펩타이드는 특정의 길이로 한정되지 않지만, 본 발명의 문맥에서는 일반적으로 전장(full length) 단백질의 단편을 나타내며, 번역후의 수식, 예를 들면 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등 및 해당 분야에 공지된 다른 수식(자연적으로 발생하는 수식 및 비자연적 발생의 수식)을 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 및 단백질은 임의의 다양한 공지의 재조합 및/또는 합성의 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp):아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라긴; O(Ply)피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르기닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 트레오닌; U(Sec):셀레노시스테인, V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 티로신.

본 명에서에서 용어‘폴리뉴클레오타이드’ 또는 ‘핵산’은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오타이드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오타이드의 공지된 아날로그도 포함된다.

본 명세서에서 용어 "발현(expression)"이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미한다.

본 발명은 아스파라기닐-tRNA 합성효소(Asparaginyl-tRNA synthase, NRS) 및 NRS 유래의 특정 폴리펩타이드가 진단적 및/또는 치료학적으로 관련된 비정규적인(non-canonical) 생물학적 활성을 보유한다는 발견으로부터 유래한다. 본 발명자들은 인간 NRS 단백질(서열번호 3)에서 케모카인 활성을 가지는 도메인(domain)으로서 4번째 내지 77번째 아미노산에 해당하는 단백질 영역을 규명하였으며(본 명세서에서 인간 UNE-N 으로 표기), 특히 CCR3에 특이적인 케모카인 활성에 핵심적인 모티프(motif)가 NRS 단백질의 47번째 내지 55번째 아미노산에 해당하는 loop3 영역(DSQKENERW, 서열번호 1)임을 최초로 규명한 바 있다. 상기 loop3 영역에 해당하는 단편 폴리펩타이드는, 단백질로부터 단리된 상태에서도 고유의 현저한 효과를 나타내는 것이 특징이다. 또한 본 발명의 단편 폴리펩타이드는 기존 전체 NRS 단백질 수준이나 도메인 수준에서 보다 매우 짧기 때문에 이용 및 산업상의 현저한 우수성을 가진다. 이러한 NRS 케모카인 활성의 핵심 모티프는 본원 발명에서 최초로 공개되는 것이다.

따라서 본 발명은, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단리된 폴리펩타이드를 제공한다.

본원 발명에서 용어‘단리된 폴리펩타이드’는 NRS 단백질의 절단형(truncated form)을 의미하는 것이다. 본 발명의 단리된 NRS 폴리펩타이드는 전장(full length)의 인간 NRS 단백질로 부터의 연속적 단편이다. 더욱 구체적인 실시예에서, 상기 NRS 폴리펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 인간 NRS 단백질 서열로 부터의 연속적 단편이다.

본원 발명의 단리된 폴리펩타이드(NRS 단편 폴리펩타이드는) 케모카인(chemokine) 활성을 가지는 것이 그 특징으로서, 케모카인 활성 모티프로서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열(본 출원 명세서에서 loop3으로도 명명)로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 상기 케모카인 활성은 본 발명의 NRS 단편이 CCR3(C-C chemokine receptor type 3)에 결합하는 것에 의해, 특히 케모카인 활성 모티프(서열번호 1)에 의한 결합에 의해 매개 된다. 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나 있다.

하나의 실시 양태에서, 바람직하게 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드를 제공한다.

본원 발명에서‘단리된 폴리펩타이드’, 즉 ’절단형 NRS 폴리펩타이드‘는 당업계에 공지된 이용가능한 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 일례로 임의의 다양한 단백질 분해효소를 이용하여 제조될 수 있다. 예시적인 프로테아제(단백질분해효소)로서는, 예를 들면, 아크로모펩티다아제(achromopeptidase), 아미노펩티다제(aminopeptidase), 안크로드(ancrod), 안지오텐신 변환 효소(angiotensin converting enzyme), 브로멜라인(bromelain), 칼파인(calpain), 칼파인 I(calpain I), 칼파인 II(calpain II), 카르복시펩티다제 A(carboxypeptidase A), 카르복시펩티다제 B(carboxypeptidase B), 카르복시펩티다제 G(carboxypeptidase G), 카르복시펩티다제 P(carboxypeptidase P), 카르복시펩티다제 W(carboxypeptidase W), 카르복시펩티다제 Y(carboxypeptidase Y), 카스파아제 1(caspase 1), 카스파아제 2(caspase 2), 카스파아제 3(caspase 3), 카스파아제 4(caspase 4), 카스파아제 5(caspase 5), 카스파아제 6(caspase 6), 카스파아제 7(caspase 7), 카스파아제 8(caspase 8), 카스파아제 9(caspase 9), 카스파아제 10 (caspase 10), 카스파아제 11(caspase 11), 카스파아제 12 (caspase 12), 카스파아제 13 (caspase 13), 카텝신 B(cathepsin B), 카텝신 C(cathepsin C), 카텝신 D(cathepsin D), 카텝신 E(cathepsin E), 카텝신 G(cathepsin G), 카텝신 H(cathepsin H), 카텝신 L(cathepsin L), 키모파파인(chymopapain), 키마아제(chymase), 키모트립신(chymotrypsin), 크로스 트리파인(clostripain), 콜라게나제(collagenase), 보체 C1r(complement C1r), 보체 C1s (complement C1s), 보체 D인자(complement Factor D), 보체 I인자(complement factor I), 쿠쿠미신(cucumisin), 디펩티딜펩티다제 IV(dipeptidyl peptidase IV), 백혈구 엘라스타제(elastase, leukocyte), 췌장 엘라스타제(elastase, pancreatic), 엔도프로테이나제 Arg-C( endoproteinase Arg-C), 엔도프로테이나제 Asp-N(endoproteinase Asp-N), 엔도프로테이나제 Glu-C(endoproteinase Glu-C), 엔도프로테이나제 Lys-C(endoproteinase Lys-C), 엔테로키나제(enterokinase), Xa 인자(factor Xa), 피신(ficin), 퓨린(furin), 그란자임 A(granzyme A), 그란자임 B(granzyme B), HIV 프로테아제(HIV Protease), IGase, 칼리크레인 조직(kallikrein tissue), 일반 류신 아미노펩티다제(leucine aminopeptidase, general), 세포기질 류신 아미노펩티다제(leucine aminopeptidase, cytosol), 마이크로솜 류신 아미노펩티다제(leucine aminopeptidase, microsomal), 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease), 메티오닌 아미노펩티다제(methionine aminopeptidase), 뉴트라제(neutrase), 파파인(papain), 펩신(pepsin), 플라스민(plasmin), 프롤리다제(prolidase), 프로나제 E(pronase E), 전립선 특이적 항원(prostate specific antigen), Streptomyces griseus 유래의 호알카리성 프로테아제(protease alkalophilic from Streptomyces griseus), Aspergillus 유래의 프로테아제(protease from Aspergillus), Aspergillus saitoi 유래의 프로테아제(protease from Aspergillus saitoi), Aspergillus sojae 유래의 프로테아제(protease from Aspergillus sojae), B. licheniformis 프로테아제(protease B. licheniformis, alkaline or alcalase), Bacillus polymyxa 유래의 프로테아제(protease from Bacillus polymyxa), Bacillus sp유래의 프로테아제(protease from Bacillus sp), Rhizopus sp.유래의 프로테아제(protease from Rhizopus sp.), 프로테아제 S(protease S), 프로테아좀류(proteasomes), Aspergillus oryzae 유래의 프로테이나제(proteinase from Aspergillus oryzae), 프로테이나제 3(proteinase 3), 프로테이나제 A(proteinase A), 프로테이나제 K(proteinase K), 프로테인 C(protein C), 피로글루타메이트 아미노펩티다제(pyroglutamate aminopeptidase), 레닌(rennin), 스트렙토키나제(streptokinase), 서브틸리신(subtilisin), 서몰리신(thermolysin), 트롬빈(thrombin), 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator), 트립신(trypsin), 트립타제(tryptase) 및 우로키나제(urokinase) 등을 들 수 있다. 당업자라면 제작하고자하는 단편의 화학적 특이성을 고려하여, 어떤 단백질분해효소가 적절할지 용이하게 결정가능하다.

본원에서 기재되는 폴리펩티드는 당분야의 숙련자에게 공지된 임의의 적합한 절차, 즉 유전공학적 방법, 예컨대 재조합 기법에 의해 제조(작제)될 수 있다. 예를 들면, 통상적인 방법에 따라 상기 폴리펩티드 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제 할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어 (operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩티드(substally pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.

본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

재조합 제조 방법에 부가하여, 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다.

하나의 실시 양태에서, 일례로 본 발명의 폴리펩티드는 고상 기법을 이용한 직접적 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다(Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)). 고체상 펩타이드 합성(SPPS) 방법은 작은 다공성의 비드(beads)에 링커(linkers)라 불리는 기능성 유닛(functional units)을 부착하여 펩타이드 사슬을 이어 나갈 수 있도록 유도함으로써 합성을 개시할 수 있다. 액체상 방법과 달리 펩타이드는 비드와 공유 결합하여 TFA(trifluoroacetic acid)와 같은 특정 반응물에 의해 절단되기 전까지 여과(filtration) 과정에 의해 떨어져 나가는 것을 방지한다. 고체상에 부착된 펩타이드의 N-말단 아민과 N-보호 아미노산 유닛(N-protected amino acid unit)이 결합하는 보호(protection) 과정, 탈보호(deprotection) 과정, 다시 드러난 아민 그룹(amine group)과 새로운 아미노산이 결합하는 커플링(coupling) 과정의 사이클(cycle, deprotection-wash-coupling-wash)이 반복되면서 합성이 이루어지게 된다. 상기 SPPS 방법은 마이크로파(microwave) 기술을 함께 이용하여 수행할 수 있으며, 마이크로파 기술은 펩타이드 합성 과정에서 열을 가해줌으로써 각 사이클의 커플링과 탈보호에 요구되는 시간을 단축시킬 수 있다. 상기 열 에너지는 확장되는 펩타이드 사슬이 접히거나(folding) 집합체를 형성하는 것(aggregation)을 방지하고 화학적 결합을 촉진시킬 수 있다.

또한 액체상 펩타이드 합성법에 의해 본 발명의 펩타이드를 제작할 수 있으며, 이의 구체적 방법은 하기의 문헌들을 참조로 한다: US 등록특허 제 5,516,891. 또한 본 발명의 펩타이드는 상기 고체상 합성법과 액체상 합성법을 혼합하는 방법 등의 다양한 방법으로 합성 가능하며, 본 명세서에 기술된 수단에 그 제조 방법이 제한되지 않는다.

단백질 합성은 수동 기법을 이용해서 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화된 합성은, 예를 들어 Applied Biosystems 431A 펩티드 합성기(Perkin Elmer)를 이용해서 달성될 수 있다. 대안적으로, 다양한 단편이 별도로 화학적으로 합성되고 화학적 방법을 이용하여 조합되어 목적 분자를 제조할 수 있다.

한편, 본 발명 폴리펩타이드의 범위에는 전술한 본 발명 폴리펩타이드의 기능적 동등물 및 그들의 염을 포함한다. 일례로 상기 "기능적 동등물"이란 전술한 본 발명의 폴리펩타이드와 적어도 80％ 이상의, 바람직하게는 90％, 더욱 바람직하게는 95％이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 것으로 예를 들면, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 것을 포함하며, 본 발명의 폴리펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. 상기에서 ‘실질적으로 동질의 생리활성’이란 케모카인 활성, 특히 CCR3(C-C chemokine receptor type 3)에 결합하는 활성을 의미한다.

하나의 실시 양태에서, 본 발명에서 기능적 동등물은 전술한 본 발명 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 삽입, 치환(비보전적 또는 보전적 치환), 결실 또는 이들의 조합에 의해 생성된 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 또한 상기 기능적 동등물에는, 본 발명 폴리펩타이드의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명에서 제공하는 폴리펩타이드의 생리활성(케모카인 활성)에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 아울러 상기 본 발명 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다.

하나의 실시 양태에서, 본 발명의 단편 폴리펩타이드는, 전술한 아미노산 서열 특징으로 구성된 폴리펩타이드의 N-말단에 2개의 아미노산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드를 포함한다.

하나의 실시 양태에서, 바람직하게 본 발명의 단편 폴리펩타이드는, 서열번호 1의 폴리펩타이드 N-말단에 2개의 아미노산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드를 포함한다.

상기 추가적인 2개의 아미노산 서열은, 본 발명에서 NRS N-terminal extension 유래 단편 폴리펩타이드(즉, 서열번호 1의 폴리펩타이드)의 과발현 및 높은 용해성 단백질을 얻기 위해 재조합 단백질을 제조하는 과정 중, protease에 의해 절단될 때 잔류하는 아미노산 서열일 수 있으며, 또한 상기 아미노산 서열은 본 발명에서 목적하는 단편 폴리펩티드의 기능에 영향을 미치지 않는 서열로, 바람직하게 상기 2개의 아미노산은 글라이신(glycine) 및 히스티딘(histidine)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 폴리펩타이드의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른 단백질과 융합으로 만들어진 융합단백질 등이 이에 포함된다.

하나의 실시 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, N-말단에 시그널(또는 리더) 서열이 부착된 형태로 제공될 수 있고, 상기 시그널 서열은 번역과 동시에 또는 번역 후에 그 폴리펩타이드의 이송을 지시한다. 상기 폴리펩타이드는, 또한 폴리펩타이드의 합성, 정제 또는 동정을 용이하게 하기 위해(예를 들면 폴리His, 친화성 태그 등), 또는 폴리펩타이드의 고체 지지체에 대한 결합을 증강하기 위해, 링커 서열 또는 다른 서열과 결합(컨쥬게이트)된 형태로 제공될 수 있다. 이들 제공 형태에서, 추가적으로 부착되는 서열은 본 발명 폴리펩타이드가 목적하는 활성에 유해한 영향을 주지 않는다.

또 다른 하나의 실시 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 경우에 따라 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

또한 본 발명은, 상기 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화(코딩)하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 한 폴리뉴클레오타이드의 염기 조합이 특별히 제한되지 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함하여 단쇄 또는 이중쇄의 형태의 핵산분자로서 제공될 수 있다. 핵산 서열은 천연에서 분리되거나 인위적으로 합성 또는 유전적 재조 합방법을 통하여 제조할 수 있으며, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다.

하나의 실시 양태에서, 일례로 상기 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산(폴리뉴클레오타이드) 서열을 이를 발현할 수 있는 벡터에 작동적으로 연결시켜 상기 본 발명의 폴리펩타이드를 제공할 수 있다. 이에, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터 또는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어 ‘발현벡터’ 또는 ‘재조합 벡터’란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

상기 용어 ‘작동가능하게 연결된(operably linked)’는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와, 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

하나의 실시 양태에서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등 과 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.

하나의 실시 양태에서, 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia spp .) 균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus spp .) 균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 즉, 본 발명은 상기 발현 벡터(재조합 벡터)로 형질전환된 형질전환체(숙주 세포)를 제공한다.

상기 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입할 수 있는 것으로 공지된 것이라면 어떤 방법이라도 사용가능하며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 열충격법 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.

상기 용어‘형질전환체’는‘숙주세포’등과 호환성 있게 사용될 수 있으며, 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다.

본 발명에서 상기 형질전환체는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 종류의 단세포 유기체, 예컨대 각종 박테리아 (예컨대, Clostridia속, 대장균, 등) 등의 원핵세포 미생물, 효모 등의 하등 진핵세포 미생물과 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로 당업자가 목적하는 바에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명의 상기 형질전환체는 바람직하게 형질전환 미생물을 의미하는 것일 수 있다. 구체적으로, 이에 제한되지 않으나, 예를들어 숙주세포로는 에스케리치아 콜라이(대장균, Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포일 수 있다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라크라사(Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 형질전환체(또는 형질전환 미생물, 숙주세포)은 바람직하게 에스케리치아 콜라이(대장균, Escherichia coli)일 수 있다. 상기 본 발명의 에스케리치아 콜라이 균주로는 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 Rosetta2(DE3), C41(DE3), SoluBL21 등이 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 폴리펩타이드(NRS 단편 폴리펩타이드)은 길이가 짧을 뿐만아니라 CCR3과 특이적으로 결합하므로, CCR3이 특이적으로 발현되는 질환 또는 병증의 검출 및 진단 목적으로 이용될 수 있다.

구체적으로, AMD(노화-관련 황반 변성)에서 대부분의 실명은 맥락막 혈관신생에 의한 망막의 침습으로부터 발생되며, CCR3은 AMD 환자의 맥락막 신생혈관 내피 세포에서 특이적으로 발현된다. 따라서 본 발명은, 상기 본 발명의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 맥락막 혈관신생( choroidal neovascularization) 검출용 조성물을 제공한다. 특히 무증상 맥락막 혈관신생(subclinical choroidal neovascularization ,“CNV”)에 있어서, 본 발명의 폴리펩타이드는 이의 검출 “G 진단에 편의를 제공할 수 있다.

본 발명에서 용어‘검출’은 ‘영상화’를 포함하는 의미이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 CCR3와 특이적으로 결합하므로, 임의의 표지수단(영상화용 수단)과 함께 적용되어 맥락막 혈관신생 환부를 포함하여 CCR3-매개 질환 환부를 in vitro 또는 in vivo 상에서 영상화 할 수 있다. CCR3-매개 질환에 대해서는 이하에서 더욱 후술된다.

본 발명의 상기 폴리펩타이드의 결합(즉, 맥락막 혈관신생 부위 및 CCR3-매개 질환 병소 등에서 CCR3에의 세포 결합) 여부 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 폴리펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제), 방사성 동위원소(예: ¹⁸F, ¹²³I, ¹²⁴I, 125I, 32P, 35S, 67Ga), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 형광단백질(GFP(Green Fluorescent Protein); EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein); DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein); CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), Cy3, Cy5 및 Cy7.5), 자기공명 영상물질(예: Gadolinium(Gd, 가도리늄), 상자성입자(super paramagnetic particles) 또는 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)) 등 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

표지에 따른 검출 방법은 당업계에 널리 알려져 있으며, 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 면역형광염색법을 이용할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 시료와 반응시키고 미결합 또는 비특이적인 결합 산물을 제거한 다음 형광현미경 하에서 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 또한 검출가능한 표지로 효소를 이용하는 경우에는 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의해 흡광도를 측정하고, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 수행할 수 있다. 아울러, 검출된 결과는 검출표지에 따른 공지된 영상화 방법에 따라 영상화될 수도 있다.

본 발명에서 상기 용어‘시료’는 생물학적 시료를 의미하는 것으로서, 일례로 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 또한 상기 시료는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료를 포함한다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를들어, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 길이가 짧을 뿐만아니라 CCR3에 특이적으로 결합 및 타겟팅하는 효과가 현저하므로, CCR3-매개 질환의 영상화 및 진단 목적으로, 또한 CCR3-매개 질환에 있어 환부에 약물을 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 CCR3 -매개 질환의 진단용 조성물; 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 CCR3 -매개 질환 특이적 약물 전달용 조성물; 및 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 CCR3 -매개 질환 부위의 영상화용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 CCR3-매개 질환은 정상인 상태와 비교하여 CCR3이 해당 질환에서 특이적으로 발현 및 활성이 증가되어 나타나는 병리현상, 즉 상기 CCR3이 질환의 주요 병 메커니즘으로 작용하여 CCR3 수용체 길항제에 의하여 치료될 수 있는 질병을 의미한다. 상기 CCR3-매개 질환은 천식, 알레르기성 비염, 과민성 폐 질환, 과민성 폐렴, 호산성 폐렴, 간질성 폐질환, 호흡기 알레르기성 질환, 염증성 장 질환, 건선, 피부염, 습진, 염증성 피부 질환, 신장암 및 전립선암 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

하나의 실시 양태에서, 상기 CCR3-매개 질환의 영상화 및 진단은, 이에 한정되지는 않으나, 질환의 초진 목적 뿐만아니라, 진행 경과, 치료에 대한 치료 경과, 치료제에 대한 반응 모니터링 등을 포괄하여 사용할 수 있다. 상기 본 발명의 폴리펩타이드는 이의 이동, 분포 또는/및 결합 여부의 확인, 검출, 정량 등을 용이하게 하기 위하여, 표지된 상태로 제공될 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 기술한 바와 같다.

하나의 실시 양태에서, 상기 본 발명의 폴리펩타이드는 약물과 연결(특히, 결합)된 상태로 제공되는 것일 수 있다. 이러한 실시 양태에서 본 발명은, 전술한 본 발명의 폴리펩타이드 및 이와 연결된 약물(즉, 폴리펩타이드-약물 복합체)을 유효성분으로 포함하는 CCR3-매개 질환 특이적 약물 전달용 약학적(약제학적) 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 CCR3 타겟팅을 이끌 수 있는 본 발명의 폴리펩타이드와 함께 약물을 제공함(특히 폴리펩타이드와 연결된 형태로)으로써, CCR3-매개 질환의 환부에 작용하여 직접적인 약리학적 활성을 나타낼 수 있는 물질(약물)을 상기 환부로 이동시켜 머물게 할 수 있다. 이는 약물의 작용 효율을 증가시키며, 전체적인 투약량(overall dosage)을 줄이고, 부작용의 가능성 및 강도를 줄일 수 있다는 강점이 있다.

상기 약물(또는 약물 제제)과 본 발명의 폴리펩타이드의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 폴리펩타이드는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다. 상기 연결은 약물과 본 발명 폴리펩타이드의 직접 결합(예를들어, 공유 결합 등에 의해) 뿐만아니라, 링커등을 사이에 포함하는 간접적 결합도 모두 포함하는 의미이다. 본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 펩타이드의 양은 결합되는 상기 치료제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있다.

하나의 실시 양태에서, 상기 약물은 약리학적으로 활성을 나타내는 화합물, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 하나의 실시 양태에서, 상기 약물은 CCR3-매개 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 약물일 수 있으며, 상기 CCR3-매개 질환에 대해서는 전술한 바를 참조로 이해되며, 당업계에는 상기 개별 질환에 사용되는 약물의 종류가 공지되어있다.

상기 본 발명의 조성물에서 본 발명의 폴리펩타이드는 표적 기관에 이동, 분포 또는/및 결합 여부 확인, 검출, 정량 등을 용이하기 하기 위하여 표지된 상태로 제공될 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 기술한 바와 같다.

한편, 본 발명에 따른 조성물은 상기 폴리펩타이드의 순수한 형태 또는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화함으로써 제공될 수 있다.

하나의 실시 양태에서, 본 발명에서 제공하는 조성물은 바람직학 약학적(약제학적) 조성물일 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 적합한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

상기 제형화된 약학적 조성물은 이의 유효량이 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 진단 또는 치료 효과의 추적을 가능하게 하는 물질량(amount of substance)을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 대상 질환 및 이의 중증정도, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다.

하나의 실시 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 할 때 1회 투여시 1 mg 내지 1000 mg의 유효용량으로 하루에 수 차례 반복 투여될 수 있다.

다른 하나의 실시 양태에서, 본 발명의 조성물이 유전자 형태로 투여되는 방식으로 사용될 때, 본 발명의 조성물은, 예를 들어 전술한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스를 1×10⁵ 내지 1×10¹⁵ pfu/㎖의 농도로 포함하며, 1회 내지 수회 투여될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.

본 발명의 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야하며 박테리아, 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.

경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 경피 투여는 본 발명의 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형 및 본원 발명에 기반하여 제형화 할 수 있는 기타 다른 제형들은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(예를들어, Remington's Pharmaceutical Science, 15^th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)들을 참조로 한다.

한편, 본 발명의 폴리펩타이드가 CCR3과 특이적으로 결합하여 케모카인 활성을 나타낸다는 사실은, 이는 인간 NRS가 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 위치(즉, N-terminal extention 부위, 특히 loop3 영역)에서 CCR3과 결합하여 과도한 면역반응(자가면역 반응 포함) 및 CCR3 매개 질병을 유발할 수 있음을 의미한다.

상기 질병에 대한 NRS의 작용을 억제하기 위하여 NRS의 발현 또는 이의 기능을 무작정 억제하는 것은, 단백질 번역과정에 있어서 필수적인 역할을 하는 인간 NRS의 순기능에도 영향을 미쳐 다른 부작용을 가져올 수 있다. 따라서, NRS 중에서도 면역반응 및 질환과 관계가 있는 부위에만 작용하여 국소적으로 활성을 억제할 수 있는 물질을 찾아내는 것은 부작용을 줄이며 목적하는 효과를 얻도록 할 수 있으며, 이처럼 선택성 및 특이성이 높은 물질을 발굴하는 것은 질병 치료에 있어 유의미한 것으로 생각되며, 이는 단순히 특정 수용체(receptor)에 대한 길항제를 찾는 것과 구별된다.

따라서, 본 발명의 폴리펩타이드를 이용하면 NRS에서 질병에 작용하는 부위의 활성을 억제하는, 좀 더 특이성이 높고 부작용이 저감된 치료제를 스크리닝 할 수 있는 장점이 있다.

따라서 본 발명은,

(a) 본 발명의 상기 폴리펩타이드와 시험제제를 접촉시켜 시험제제가 본 발명의 상기 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 NRS 전장 단백질의 케모카인 활성을 억제하는지 여부를 측정하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 케모카인 활성을 억제하는 시험제제를 선별하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계에서 선별된 시험제제를 CCR3를 발현하는 세포에 처리하여 CCR3 활성을 억제하는지 여부를 측정하는 단계

를 포함하는 CCR3-매개 질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서 "제제(agent)" 또는 "시험 제제(test agent)"라 함은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 다르게 지정되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다.

보다 구체적으로 본 발명의 스크리닝 방법으로 스크리닝 될 수 있는 시험 제제는, 폴리펩티드, 베타-턴 미메틱(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 조합을 포함한다. 어떤 시험 제제는 합성 물질일 수 있으며, 다른 시험 제제는 천연물질일 수 있다. 상기 시험 제제는 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 조합(combinatorial) 라이브러리는 스텝-바이-스텝 방식으로 합성될 수 있는 여러 종류의 화합물로 생산 될 수 있다. 다수의 조합 라이브러리의 화합물들은 ESL(encoded synthetic libraries) 방법(WO 95/12608, WO93/06121, WO 94/08051, WO 95/395503 및 WO 95/30642)에 의해 제조될 수 있다. 펩티드 라이브러리는 파지 디스플레이 방법(WO91/18980)에 의해 제조될 수 있다. 박테리아, 곰팡이, 식물 및 동물 추출물 형태의 자연 화합물의 라이브러리는 상업적인 출처로부터 얻거나 또는 필드(field)에서 수집될 수 있다. 공지된 약리학적 (pharmacological) 제제가 구조적 아날로그를 제조하기 위하여 아실화, 알킬화, 에스테르화 반응(esterification), 아미드화 반응(amidification)과 같은 지시되거나(direct) 무작위한 화학적 수식에 적용될 수 있다.

상기 시험 제제는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. 이런 시험 제제는 자연 출처(natural source), 예컨대, 세포 또는 조직 용해물로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드 제제의 라이브러리는 예컨대, 통상적인 방법에 의해 생성되거나 상업적으로 입수할 수 있는 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다.상기 시험 제제는 펩티드, 예컨대, 약 5-30개, 바람직하게는 약 5-20개, 보다 바람직하게는 약 7-15개의 아미노산을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "바이어스(biased)" 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다.

또한 상기 시험 제제는 "핵산"일 수 있다. 핵산 시험 제제는 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "바이어스(biased)" 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 위에서 기재한 바와 유사하게 사용될 수 있다.

또한 상기 시험 제제는 소분자(예: 약 1,000 이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다. 많은 어세이가 상기 스크리닝에 유용하다(Shultz, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2409-2414, 1998; Weller, Mol.Drivers., 3:61-70, 1997; Fernandes, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:597-603, 1998; and Sittampalam, Curr.Opin. Chem. Biol., 1:384-91, 1997).

본 발명의 방법에 스크리닝되는 시험 제제의 라이브러리는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 아날로그에 대한 구조 연구를 근거로 제조될 수 있다. 이런 구조 연구는 NRS의 케모카인 활성 영역(모티프)에 결합하여, 단백질 생산과 관련된 순기능은 유지한 채 질병과 관련된 부정적 활성만을 억제할 가능성이 있는 시험 제제의 규명을 가능하게 한다. 본 발명의 폴리펩타이드의 3차원적 구조는 여러 방법, 예컨대, 결정학 구조 및 분자적 모델링(crystal structure and molecular modeling)으로 연구될 수 있다. X-선 결정학(X-ray crystallography)을 이용하는 단백질 구조 연구 방법이 문헌에 잘 알려져 있다: Physical Bio-Chemistry, Van Holde, K. E.(Prentice-Hall, New Jersey 1971), pp.221-239, and Physical Chemistry with Applications to the Life Sciences, D. Eisenberg ＆ D.Crothers(Benjamin Cummings, Menlo Park 1979). 본 발명의 폴리펩타이드 구조에 대한 컴퓨터 모델링은 스크리닝하기 위해 시험 제제의 디자인을 위한 다른 수단을 제공한다. 분자적 모델링 방법은 문헌에 개시되어 있다: U.S. Pat. No. 612,894 and U.S. Pat. No. 5,583,973. 또한 단백질 구조는 중성자 회절(neutron diffraction) 및 NMR(nuclear magnetic resonance)에 의해 결정될 수 있다: Physical Chemistry, 4th Ed. Moore, W. J.(Prentice-Hall, New Jersey 1972) and NMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthrich(Wiley-Interscience, New York 1986).

상기 (a) 단계에서 카모카인 활성을 억제하는지 여부를 측정하는 방법은 당업계에서 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 이에 대한 비제한적인 예시로는 agar-plate 방법(Curr Microbiol 30 (4): 251-3), Boyden chamber 어세이법(J Exp Med 115 (3): 453-66), Bridge chamber 어세이법(J. of Cell Biology 75 (2): 606-616), 미세관 어세이법(Anal Biochem 135 (2): 466-9, Acta Protozool 34: 181-5.) 및 T-maze 어세이법(J Protozool 29 (2): 226-30)을 들 수 있다.

상기 (c) 단계에서 CCR3를 발현하는 세포는, 하나의 실시양태에서 면역세포를 의미하는 것일 수 있다. 일례로, 바람직하게 호산백혈구, 호염기백혈구, 마스트 세포, B-세포 및 T-세포(일례로, 헬퍼 T 림프구)를 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 본 발명은 상기 (c)단계 이후에 (d) 선별된 제제를 CCR3-매개 질환을 가지고 있는 동물에 투여하여 치료 효과를 나타내는지를 검사하는 단계를 추가적으로 수행할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 단편 폴리펩타이드는 CCR3에의 결합을 통한 케모카인 활성이 현저하므로, 면역조절, CCR3을 매개로하는 질환 또는 병증의 검출, 진단, 치료, 약제 개발 등의 다양한 목적으로 활용가능하며, 특히 전장(full length) 단백질 및 도메인 단위에서의 폴리펩타이드 보다 길이가 짧아 사용(이용) 및 산업상의 현저한 우수성을 가진다.

도 1은 A549, H460, WI-26, Daudi 및 Jurkat 세포 주들을 serum free media에서 6시간 동안 배양하고, 배양 배지를 회수 및 TCA(trichloroacetic acid) 처리하여 분비된 단백질을 침전시킨 후 웨스턴 블롯으로 NRS 분비 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 RAW264.7, J774A.1, U937 및 HL-60 세포 주들을 serum free media에서 6시간 동안 배양하고, 배양 배지를 회수 및 TCA 처리하여 분비된 단백질을 침전시킨 후 웨스턴 블롯으로 NRS 분비 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 대식세포인 RAW 264.7 cell에 TNF-α, IFN-γ, TGF-β의 사이토카인 각각을 10 ng/ml의 농도로 4시간동안 처리하여 활성화 시켰을 때, NRS 분비 상태를 확인한 결과를 나타낸다(Con: 사이토카인 비처리군).
도 4는 각각 인간 full length NRS, UNE-N 단편 및 CD(canonical domain) 펩타이드에 대하여, 상기 펩타이드들이 림프구(T cell, B cell)의 세포 이동을 유도하는지 확인한 결과를 나타낸다. 대조군으로 암세포가 사용되었으며, 암세포 또는 림프구 세포들을 transwell의 fibronectin이 코팅된 멤브레인이 존재하는 upper chamber에 분주하고, 상기 3종의 펩타이드들을 1nM의 농도로 lower chamber에 처리하여 4시간 배양 후에 멤브레인으로 이동한 세포들을 염색하여 현미경으로 관찰하였다(T lymphocyte: Jurkat, B lymphocyte: Daudi , Cancer cell: H460).
도 5는 인간 full length NRS, UNE-N 단편 및 CD(canonical domain) 펩타이드의 처리 농도에 따른 B lymphocyte(Daudi cell)의 세포 이동을 정량화하여 나타낸 결과이다. 각 처리군 별로 transwell을 이용한 세포 이동 에세이 후, 멤브레인에 존재하는 이동성 세포들을 카운팅 하였다. (con: 비처리군, F0.1: full length NRS 0.1nM 처리, F1: full length NRS 1nM 처리, F10: full length NRS 10nM 처리, N0.1: UNE-N 단편 0.1nM 처리, N1: UNE-N 단편 1nM 처리, N10: UNE-N 단편 10nM 처리, C0.1: NRS CD 펩타이드 0.1nM 처리, C1: NRS CD 펩타이드 1nM, C10: NRS CD 펩타이드 10nM).
도 6은 인간 full length NRS, UNE-N 단편 및 CD(canonical domain) 펩타이드에 대하여, 각 펩타이드의 처리 농도에 따른 T lymphocyte(Jurkat cll)의 세포 이동을 정량화하여 나타낸 결과이다. 각 처리군 별로 transwell을 이용한 세포 이동 에세이 후, 멤브레인에 존재하는 이동성 세포들을 카운팅 하였다. (con: 비처리군, F0.1: full length NRS 0.1nM 처리, F1: full length NRS 1nM 처리, F10: full length NRS 10nM 처리, N0.1: UNE-N 단편 0.1nM 처리, N1: UNE-N 단편 1nM 처리, N10: UNE-N 단편 10nM 처리, C0.1: NRS CD 펩타이드 0.1nM 처리, C1: NRS CD 펩타이드 1nM, C10: NRS CD 펩타이드 10nM).
도 7은 인간 full length NRS의 도메인 구성을 보여주며, 또한 본 실험에서 사용된 UNE-N (잔기 4-77) 단편 및 CD(canonical domain, 잔기 98-548) 단편의 서열 및 도메인 구성들을 비교적으로 나타낸 것이다.
도 8은 인간 NRS UNE-N(잔기 4-77)의 결정(crystal)구조를 나타낸다.
도 9는 H460, Daudi(B lymphocyte) 및 Jurkat(T lymphocyte) 세포에서의 CCR3 발현을 웨스턴블랏팅으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 NRS에 의해 유도되는 B 림프구(Daudi cell) 이동에 있어서, CCR3 넉다운(knock-down)의 영향을 정량화 하여 나타낸 결과이다. CCR3 targeting siRNA(si-CCR3)를 이용하여 CCR3-넉다운 시킨 세포를 transwell chamber를 이용한 세포 이동 에세이에 사용하였다. lower chamber에 인간 full length NRS, UNE-N 단편, CD 펩타이드 및 CCL5(양성대조군)를 처리한 후에, 멤브레인으로 이동한 세포들을 현미경으로 카운트한 결과를 보여준다.
도 11은 NRS에 의해 유도되는 T 림프구(Jurkat cell) 이동에 있어서, CCR3 넉다운(knock-down)의 영향을 정량화 하여 나타낸 결과이다. CCR3 targeting siRNA(si-CCR3)를 이용하여 CCR3-넉다운 시킨 세포를 transwell chamber를 이용한 세포 이동 에세이에 사용하였다. lower chamber에 인간 full length NRS, UNE-N 단편, CD 펩타이드 및 CCL5(양성대조군)를 처리한 후에, 멤브레인으로 이동한 세포들을 현미경으로 카운트한 결과를 보여준다.
도 12는 NRS와 CCR3 ED들 간의 상호 작용을 보여준다. in vitro 결합 분석을 위해 MBP 컨트롤(레인 '-')과 MBP와 융합된 CCR3 ED들(ED1-ED4, 레인 1-4)을 각각 인간 full length NRS와 함께 배양 한 후, maltose resin으로 침전시켰다. 공침전 된 단백질을 SDS-PAGE로 분석하고, 쿠마시블루 염색에 의해 검출 하였다.
도 13은 인간 NRS UNE-N 단편과 CCR3 ED들 간의 상호 작용을 보여준다. in vitro 결합 분석을 위해 MBP 컨트롤(레인 '-')과 MBP와 융합된 CCR3 ED들(ED1-ED4, 레인 1-4)을 각각 인간 NRS UNE-N 단편과 함께 배양 한 후, maltose resin으로 침전시켰다. 공침전 된 단백질을 SDS-PAGE로 분석하고, 쿠마시블루 염색에 의해 검출 하였다.
도 14는 인간 NRS CD(canonical domain) 단편과 CCR3 ED들 간에는 상호 작용이 나타나지 않음을 보여준다. in vitro 결합 분석을 위해 MBP 컨트롤(레인 '-')과 MBP와 융합된 CCR3 ED들(ED1-ED4, 레인 1-4)을 각각 인간 NRS CD 단편과 함께 배양 한 후, maltose resin으로 침전시켰다. 공침전 된 단백질을 SDS-PAGE로 분석하고, 쿠마시블루 염색에 의해 검출 하였다.
도 15는 인간 NRS UNE-N 단편에서 CCR3 ED3과 상호작용에 관여하는 주요 잔기를 확인한 NMR perturbation 실험 결과로, CCR3 ED3의 존재 하에서 UNE-N 잔기에 대하여 피크 강도의 비율을 플롯팅(plotting)한 결과를 나타낸다. 사용 된 UNE-N 대 MBP-fused CCR3 ED3의 몰비는 약 1:1이었다. 큰 공명 선대증폭(ratio < 0.85)을 나타내는 잔기는 붉은색 아래화살표로, 큰 화학적 시프트 섭동을 나타내는 잔기들은 파란색 아래쪽 화살표로 표시하였다. 모든 적정(titration) 실험은 150mM NaCl, 20mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ (pH 7.5) 및 10 % D₂O를 함유하는 완충액 내에서, 298 K에서 수행되었다. 중첩 또는 부적절한 신호 대 잡음(S/N)으로 인해 불분명 한 피크를 나타내는 잔기는 생략되어 * 표시되었다.
도 16은 인간 NRS UNE-N 단편에서 CCR3 ED1과 상호작용에 관여하는 주요 잔기를 확인한 NMR perturbation 실험 결과로, CCR3 ED1의 존재 하에서 UNE-N 잔기에 대하여 피크 강도의 비율을 플롯팅(plotting)한 결과를 나타낸다. 사용 된 UNE-N 대 MBP-fused CCR3 ED1의 몰비는 약 1:1이었다. 큰 공명 선대증폭(ratio < 0.85)을 나타내는 잔기는 붉은색 아래화살표로, 큰 화학적 시프트 섭동을 나타내는 잔기들은 파란색 아래쪽 화살표로 표시하였다. 모든 적정(titration) 실험은 150mM NaCl, 20mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ (pH 7.5) 및 10 % D₂O를 함유하는 완충액 내에서, 298 K에서 수행되었다. 중첩 또는 부적절한 신호 대 잡음(S/N)으로 인해 불분명 한 피크를 나타내는 잔기는 생략되어 * 표시되었다.
도 17은 인간 NRS UNE-N 단편에서 CCR3 ED2와 상호작용에 관여하는 주요 잔기를 확인한 NMR perturbation 실험 결과로, CCR3 ED2의 존재 하에서 UNE-N 잔기에 대하여 피크 강도의 비율을 플롯팅(plotting)한 결과를 나타낸다. 사용 된 UNE-N 대 MBP-fused CCR3 ED2의 몰비는 약 1:1이었다. 큰 공명 선대증폭(ratio < 0.85)을 나타내는 잔기는 붉은색 아래화살표로, 큰 화학적 시프트 섭동을 나타내는 잔기들은 파란색 아래쪽 화살표로 표시하였다. 모든 적정(titration) 실험은 150mM NaCl, 20mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ (pH 7.5) 및 10 % D₂O를 함유하는 완충액 내에서, 298 K에서 수행되었다. 중첩 또는 부적절한 신호 대 잡음(S/N)으로 인해 불분명 한 피크를 나타내는 잔기는 생략되어 * 표시되었다.
도 18은 본 발명에서 대표적으로 loop3 단편 펩타이드(DSQKENERW)의 림프구(T cell, B cell) 이동 유도 효과를 나타낸다. 대조군으로 암세포가 사용되었으며, 암세포 또는 림프구 세포들을 transwell의 fibronectin이 코팅된 멤브레인이 존재하는 upper chamber에 분주하고, 상기 3종의 펩타이드들을 1nM의 농도로 lower chamber에 처리하여 4시간 배양 후에 멤브레인으로 이동한 세포들을 염색하여 현미경으로 관찰하였다(T lymphocyte: Jurkat, B lymphocyte: Daudi , Cancer cell: H460, RANTES: CCL5)).

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

1) 클로닝 , 단백질 발현 및 정제

CD(canonical domain, 서열번호 3 기준 잔기 98-548) 및 UNE-N 변이체들(서열번호 3 기준, 잔기 1-77, 4-77 및 1-111)에 대한 NRS construct들은 XtalPred server를 이용한 2차 구조예측 및 BmNRS의 구조에 기초하여 설계되었다. NRS 또는 CD(잔기 98-548)를 pET-28a(+)의 Nde1 및 Xho1 restriction site 사이에 클로닝 하였다. 각 construct에는 N-terminal hexahistidine tag가 포함되어 있다. NRS(서열번호 3)와 CD는 각각 Escherichia coli(E. coli) 균주인 C41(DE3)과 Solu-BL21 균주에서 과발현되었다. 형질전환 된 세포를 카나마이신을 함유하는 Luria-Bertani media를 이용하여 37 ℃에서 OD600이 0.5가 될 때까지 성장 시켰고, 0.5 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside에 의해 단백질 발현이 유도되었다. 세포를 추가로 8 시간 동안 인큐베이션 한 다음, 6000×g에서 10 분간 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride를 포함하는 buffer A(500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 35 mM imidazole, pH 7.5)에 재현탁시키고, 초음파 처리로 용해시켰다. 용해된 세포를 35,000×g에서 1 시간 동안 원심분리 하였다. 상등액을 0.45-μm syringe filter device(Sartorius, Gottingen, Germany)를 이용하여 여과하고, 5-mL HiTrap chelating HP column(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)에 로딩하였다(상기 칼럼은 Ni2+로 예비 충진되고 buffer A로 평형화 된 것을 사용하였다). buffer A로 세척 한 후에, 증가되는 농도 구배로 buffer B (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 1 M imidazole, pH 7.5)를 첨가하여 단백질을 용리시켰다. 수득된 단백질을 HiPrep desalting 26/10 column(GE Healthcare)에 로딩하고, buffer C(50mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.5)로 용출시켰다. 용출액을 HiTrap 5-mL Q HP (GE Healthcare) column에 로딩(loading)하였다. 컬럼을 buffer C로 세척하고, buffer D(1 MNaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5)의 농도구배적 처리에 의해 단백질을 용출시켰다. 최종적으로 단백질은 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg (GE Healthcare) column과 적절한 버퍼를 사용하여 정제되었으며, 사용된 버퍼는 다음과 같다: 결정화를 위한 buffer E(200 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5) 및 세포이동 분석을 위한 phosphate-buffered saline (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na₂HPO₄, 1.4 mM KH₂PO₄, pH 7.4).

UNE-N construct들은 PCR 증폭된 후, pET-28a(+) (Novagen, Madison, WI, USA)의 Nde1 및 Xho1 restriction site에 클로닝 되었다. 각 construc는 N-말단에 hexahistidine tag, MBP 및 TEV(tobacco etch virus) protease cleavage site를 포함하였다. 재조합 단백질은 E. coli 균주인 Rosetta 2 (DE3)에서 과발현되었다. E. coli 생장, 단백질 발현 및 hexahistidine tag affinity chromatography까지의 정제과정은, 상기 NRS 정제 과정에서 사용된 것과 동일한 절차로 수행되었다. 상기 affinity chromatography에 의해 정제된 단백질을 HiPrep desalting 26/10 column (GE Healthcare)에 로딩하고, buffer E로 용출시켰다. 용출액을 TEV protease와 함께 4℃에서 overnight 인큐베이션하여, MBP tag를 절단 하였다. 단백질을 HiTrap 5-mL chelating HP 칼럼 (GE Healthcare)에 로딩하였다(상기 칼럼은 Ni2+로 예비 충진되고 buffer E로 평형화 된 것을 사용하였다). Flow-through 분획 내의 단백질을 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg 컬럼(GE Healthcare)에 로딩하고, 적절한 buffer로 용출시켰다: 결정화를 위한 buffer F(200 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.5); 세포 이동 분석을 위한 PBS; NMR 실험을 위한 buffer G (150 mM NaCl, 20 mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 6.5) 및 buffer H(150mM NaCl, 20mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.5).

4개의 CCR3 ED(extracellular domain)들 서열은 다음과 같다: ED1 (잔기 1-40, MTTSLDTVET FGTTSYYDDV GLLCEKADTR ALMAQFVPPL/ 서열번호 5), ED2 (잔기 94-120, VRGHNWVFGH GMCKLLSGFY HTGLYSE/ 서열번호 6), ED3 (잔기 172-203, YETEELFEET LCSALYPEDT VYSWRHFHTL RM/ 서열번호 7) 및 ED4(잔기 262-281, SSYQSILFGN DCERSKHLDL/ 서열번호 8).

MBP-융합된 CCR3 ED들 각각은 PCR 증폭된 후, pET-28a(+)(Novagen)의 Nde1 및 Xho1 restriction site에 클로닝 되었다. 각 construct들은 N-말단에 hexahistidine tag를 포함하고, MBP와 CCR3 ED 사이에 TEV protease cleavage site를 포함하였다. 재조합 단백질은 E. coli 균주인 Rosetta 2 (DE3)에서 과발현되었다. E. coli 생장, 단백질 발현 및 hexahistidine tag affinity chromatography 까지의 정제과정은, 상기 NRS 정제 과정에서 사용된 것과 동일한 절차로 수행되었다. 상기 affinity chromatography 에 의해 정제된 단백질은 HiLoad 16/600 Superdex 200pg 컬럼(GE Healthcare)에 로딩되었으며, 적절한 buffer를 사용하여 용출되었다: pull-down assay를 위한 PBS, 및 NMR 실험을 위한 buffer H.

2) Selenomethionine incorporation

selenomethionine-derived protein을 위하여, UNE-N을 E. coli 균주인 B834(DE3)에서 과발현시켰다. 균주 세포는 M9, minimal salts(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), amino acid mix(containing L-selenomethionine)를 함유하는 배지에서 배양되었다. 단백질 발현 및 정제는 상기 UNE-N 정제에서 사용한 것과 동일한 방식으로 수행 하였다.

3) Crystallography

정제된 UNE-N 및 CD 단백질은, 1μL의 단백질과 1μL의 결정화 용액(crystallization solution)을 사용하여 sitting drop vapor diffusion method로 22℃에서 결정화 되었다. 0.01M zinc sulfate, 0.1M MES(pH 6.5) 및 25%(v/v) polyethylene glycol (PEG) 550 monomethyl ether(Structure Screen 2, Molecular Dimensions, Suffolk, UK)를 이용하여 상업적 결정화 스크리닝 조건 하에서, UNE-N(residues 4-77)의 초기 결정들(initial crystals)을 성장시켰다. 상기 초기결정들은 회절 데이터 수집을 위해 더욱 최적화되었다. 상기 결정은 12.5% glycerol을 함유하는 저장 용액으로 동결보존되었고, 100K의 질소 가스 스트림 내에서 급속 동결되었다. Single-wavelength anomalous diffraction data는 synchrotron beamline 5C(Pohang Light Source, Republic of Korea)로 anomalous peak wavelength(0.9796 Å)에서 수집되었다. 수집된 데이터는 HKL2000 program suite를 사용하여 1.9Å 해상도로 처리되었다. 위상 문제는 SAD(single anomalous diffraction) 방법으로 해결되었으며, PHENIX 소프트웨어 패키지의 AutoSol 프로그램을 사용하여 초기 모델을 구축하였고 자동 모델 생성 프로그램 Resolve를 사용하여 밀도 수정(densitymodification)에 의해 개선되었다. 최종 모델을 위하여, selenomethionine-derived protein 결정으로부터 또 다른 회절데이터 세트를 수집하였고, 1.65Å 해상도로 처리하였다. SAD 방법으로부터의 초기 모델은, Phaser 프로그램을 이용한 분자 치환(molecular replacement)을 위한 템플릿으로 사용되었다.

20%(v/v) glycerol, 0.04M potassium phosphate 및 16%(w/v) PEG 8000 (Wizard Classic 4, Rigaku, Tokyo, Japan)을 이용하여 상업적 결정화 스크리닝 조건에서, CD 펩타이드의 초기 결정(Initial crystal)을 성장시켰다. 초기 결정은 회절 데이터 수집을 위해 더욱 최적화되었다. 100K의 질소 가스 스트림 내에서 결정을 급속 동결시켰다. synchrotron beamline AR-NW12A(the Photon Factory, Japan)서 회절 데이터를 수집하고, HKL2000 program suite를 이용하여 2.25Å 해상도로 처리했다. phasing model로서 BmNRS(PDB ID: 2XGT)의 결정 구조를 이용하여 MOLREP program을 이용한 분자 치환(molecular replacement)에 의해 구조가 해결되었다.

결정 구조에 대한 모델 구축, 개선 및 검증은 각각 WinCoot program , phenix.refine, MOLPROBITY를 이용하여 수행되었다. Data collection and refinement statistics는 표 1에 요약되어있다. 결정(crystal) 구조의 2차 구조는 DSSP program analysis를 이용하여 분석되었다.

4) UNE -N의 NMR 분석

M9 medium에서 세포를 배양함으로서 균일하게 ¹⁵N- 및 ¹³C-표지되거나 또는 ¹⁵N-표지된 UNE-N을 제조하였으며, 상기 배지는 99% ¹⁵NH₄Cl 및 99% [¹³C]-D-glucose(Cambridge Isotope Laboratories, Tewksbury, MA, USA)를 함유한다. 3차원 분석, hetero-nuclear NOE 및 CLEANEX-PM NMR 실험을 위하여, 10% D₂O를 포함하는 buffer G에 단백질을 대략 0.6 mM 농도로 준비했다. CCR3 EDs를 이용한 NMR titration 실험을 위하여, 10% D₂O를 포함하는 buffer F에 ¹⁵N-표지된 UNE-N을 대략 0.2-0.3 mM로, 비표지 CCR3 EDs를 대략 0.2-0.6mM로 각각 준비하였다.

cryogenic probe가 구비된 Bruker AVANCE 800 spectrometer (Billerica, MA, USA) 및 Jeol ECA 600 spectrometer (Tokyo, Japan) 상에서 298K로 NMR 실험을 수행하였다. UNE-N의 Backbone peak assignment는 일련의 triple resonance spectra [3D HNCO, HN(CA)CO, HNCACB, CBCA(CO)NH]를 이용하여 수행되었다. NMR 데이터는 프로그램 NMRPipe로 처리되었고, 프로그램 NMRViewJ(http://www.onemoonscientific.com/nmrviewj)로 분석되었다. 전반적인 2 차 구조는 프로그램 TALOS+를 사용한 화학적 이동(chemical shift)으로부터 유래되었다.

5) 세포 배양 및 사용된 실험재료

A549, H460, WI-26, Daudi, Jurkat 및 J774A.1 세포들은 10% fetal bovine serum 및 항생제(100 UI penicillin 및 100μg/mL streptomycin)를 포함하는 RPMI1640 medium(Hyclone, Logan, UT, USA)에서 배양되었다. 동일한 보충물들을 함유하는 DMEM 배지를 이용하여 RAW 264.7을 배양하였다. NRS, tubulin, 및 CCR3에 대한 항체는 각각 Abcam (Cambridge, UK), Sigma-Aldrich 및 Millipore(Billerica, MA, USA) 로부터 구입하였다.

6) Cell migration assay

Transwell plate(5μm pore size, 24-well, Corning)를 이용하는 것에 의하여 세포 이동을 확인하였다. 먼저 멤브레인을 20μg/mL fibronectin(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)으로 미리 코팅시키고, upper chamber에 세포를 분주하였다. attractant로서 사용된 NRS 단백질(full), UNE-N 펩타이드 및 CD 펩타이드는 각기 따로 lower chamber에 첨가되었으며, CCL5을 양성 대조군(CCR3의 알려진 케모카인)으로 사용하였다. 4h 인큐베이션 후에, fibronectin coated-membrane에 봉입된 세포를 고정하고 hematoxylin(Sigma-Aldrich)으로 염색하였다. 비-이동 세포들은 면봉으로 제거하였다. membrane을 일정크기로 자른 후 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 이동된 세포들을 20X 대물 렌즈를 사용하여 현미경으로 모니터링 하였다.

7) Secretion assay

세포를 분주한 후 70% 컨플루언시(confluency)로 배양 하였다. 세포를 PBS로 2회 세척 한 후, 각각 다른 조건 하에서 배양 하였다. (i) serum-free medium에서 6시간동안 배양, (ii) 각각 TNF-α, IFN-γ, TGH-β를 10 ng/ml의 농도로 첨가하여 4시간 배양.

배양된 배지를 회수 한 후, 각각 1000xg에서 10 분간, 10,000xg에서 20 분간 순차적으로 원심 분리하여 세포 및 세포 잔해들(cell debris)을 제거 하였다. 단백질을 침전시키기 위해, TCA(Sigma-Aldrich)를 최종 농도 10%까지 첨가 하였다. 12 시간 인큐베이션 후, 분비된 단백질은 20,000 × g 원심 분리에 의해 펠렛(pellet)화 되었다. 침전된 단백질을 100 mM HEPES(pH 8.0)에 재현 탁시킨 후, 면역블랏팅(immunoblotting)을 위해 SDS-PAGE로 분리하였다.

8) Immunoblotting

얼음(ice) 위에서 세포들을 M-PER mammalian protein extraction reagent(Pierce Biotechnology, Waltham, MA, USA)로 용해하였다. 원심분리로 세포 잔해들을 제거한 후, Bradford 용액(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 단백질 농도를 측정 하였다. 단백질을 SDS-PAGE로 분리 한 다음, polyvinylidene fluoride 막으로 옮기고, 목적하는 단백질에 특이적인 각각의 항체를 사용하여 면역블랏팅하였다. 1차 항체로 anti-CCR3 항체는 Millipore사(社)로부터 구입하였고, anti-tubulin 항체는 Sigma 사로부터 구입하였고, anti-NRS 항체는 Abcam 사로부터 구입하였다. 2차 항체로 NRS에 대해서는 HRP conjugated goat anti-rabbit IgG를 Thermo사로부터 구입하였고, tubulin에 대해서는 HRS conjugated goat anti-mouse IgG를 Thermo사로부터 구입하였다.

9) Pull-down assay

5% glycerol을 포함하는 PBS 내에서, 4 종류의 MBP-fused CCR3 ED들을 각각 NRS, UNE-N, CD 또는 CCL5와 함께 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 2시간 후, MBP 융합 단백질을 풀다운(Pull down) 시키기 위해, amylose-resin(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)을 첨가 하였다. 침전된 단백질을 수득하여, SDS-PAGE로 분리하였다. MBP-fused CCR3 ED와 공 침전된 단백질들은 Coomassie blue staining (Expedeon, San Diego, CA, USA).에 의해 검출되었다.

10) Statistical analysis

통계 분석은 Dunnett's multiple comparison test 및 two-tailed Student's t-test를 사용하여 수행되었다. 모든 그래프는 평균±표준 편차 (SD)로 표시되었다. 차이는 P value < 0.05에서 통계적으로 유의하다고 간주되었다.

11) Data deposition

인간 NRS의 UNE-N과 CD의 좌표(coordinate)와 구조 인자는, 각각 ID 코드 4ZYA와 5XIX로 Protein Data Bank (http://www.rcsb.org)에 기탁되었다.

실시예 1: 질환 환경에서 NRS의 분비 확인 _ Th1 사이토카인들은 대식세포로부터 NRS 분비 유도

NRS에 대한 자가항체는 자가면역, 간질성 폐질환(interstitial lung disease, ILD) 환자들에서 검출된다. NRS를 분비할 수 있는 세포를 찾기 위하여 몇 가지 세포주들을 테스트하였다. 9개의 서로 다른 세포주 (A549, H460, WI-26, Daudi, Jurkat, RAW264.7, J774A.1, U937 및 HL-60)을 serum-free medium에서 6시간동안 배양하고, 배지에 분비된 단백질들은 TCA에 의하여 침전되었다. 침전된 단백질들을 SDS PAGE로 분리한 후, anti-NRS 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 NRS의 존재를 측정하였다. 9개의 세포주 중에서, NRS는 대식세포주인 RAW 264.7및 J774A.1(도 1 및 도 2 참조)세포의 배양 배지에서만 검출되었다. 상기와 동일한 조건에서, 배지에 tubulin이 방출되는 것은 관찰하지 못하였고, 이로서 배양 후 배지에 포함되어있는 NRS가 세포 용해에 의한 것이 아니라는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 NRS가 대식세포로부터 분비된다는 것을 제시한다.

다른 자극원에 의하여 NRS 분비가 유도될 수 있는지 알아보기 위하여, RAW 264.7 cell에 TNF-α, IFN-γ 및 TGF-β와 같은 몇 가지 서로 다른 신호분자를 처리하였다. TNF-α 및 IFN-γ는 Th1 분화에 영향을 주는 것으로서 알려져 있다. 이와 대조적으로, TGF-β 는 Th2의 분화를 조절하는 것으로 알려져있다. 이들 중에 TNF-α 및 IFN-γ는 처리 후 4시간에 NRS 분비를 유도하였다(도 3참조). 이러한 결과에 기초하여, NRS는 Th1 분화 조건 하에서 특별히 대식세포로부터 분비된다는 것을 알 수 있었다.

실시예 2: NRS 단백질 및 NRS N-term 단편의 림프구 이동 효과 확인/ CCR3 상호작용에 관여하는 핵심 모티프 loop3의 신규 규명

2-1. 인간 UNE -N은 Daudi와 Jurkat 세포에서 NRS의 주화성 활동을 독점적으로 일으킨다.

인간 NRS, UNE-N(잔기 4-77) 및 CD(잔기 98-548)의 세 가지 다른 컨스트럭트(construct)들을 이용하여 세포 이동 분석(cell migration assay)을 수행했다.

Daudi, Jurkat 및 H460 세포주를 각각 대표적인 B 세포, T 세포 및 암세포로 사용하였으며, 피브로넥틴으로 코팅된 upper chamber에 상기 세포들을 분주(seeding)하였다. 그 다음, lower chamber 배지에 NRS, UNE-N 및 CD를 각각 0.1, 1 및 10nM의 농도로 처리하였다.

실험 결과, 현미경 분석은 NRS 및 UNE-N이 Daudi 및 Jurkat 세포의 이동을 유도 한 반면, CD는 어느 세포에서도 세포 이동에 영향을 미치지 않음을 보여 주었다(도 4, 도 5 및 도 6 참조). H460 세포에 대한 이동 효과는 관찰되지 않았고, 이는 NRS의 케모카인 활성이 면역세포 특이적으로 일어난 다는 것을 뒷받침해 준다 (도 4, 도 5 및 도 6 참조).

그리고 upper chamber와 lower chamber 모두에 NRS를 처리하였을 때 Jurkat 세포의 이동이 차단되는 것이 관찰 되었으며(데이터 미도시), 이는 NRS가 chemokinesis보다는 chemotaxis를 유도했다는 것을 나타낸다. 종합적으로, 상기 데이터들은 진화적으로 획득된 UNE-N이 Daudi와 Jurkat 세포의 이동을 유도하는데 있어서 충분하고 필요한 기능적 단위인 것을 뒷받침한다. 또한 이러한 결과들은 인간 UNE-N 단편이 ILD(interstitial lung disease)와 같은 CCR3 관련 질환에서 NRS-CCR3 매개 염증 신호를 촉진하는 케모카인 활동을 유발함을 의미한다.

2-2. UNE -N은 BmNRS의 주화성( chemotactic ) N-말단 도메인과 구조적 스캐폴드를 공유하지만 독특한 특징을 나타낸다.

인간 NRS는 UNE-N, 안티코돈 결합 도메인(ABD; anticodon-binding domain), 힌지 영역(HR; hinge region) 및 촉매 도메인(catalytic domain)으로 구성된다. 본 실험에서, 도 7에서 보는 바와 같이 NRS의 UNE-N(잔기 4-77)과 CD(잔기 98-548; canonical domain)의 결정 구조를 각각 1.65Å 및 2.25Å에서 규명했다. UNE-N은 β1-α1-β2-β3-α2 topology를 가진 두 개의 α-헬릭스(α1, α2)와 세 개의 β-가닥(β1, β2, β3)으로 구성되었다. 3 개의 β-가닥은 평행/역평행 혼합된 β-시트(β-sheet)를 형성하였다(도 8). 구조적 유사성 검색을 위한 DALI server analysis는 UNE-N과 가장 유사한 구조가 B.malayi의 UNE-N 도메인(PDB ID : 2KQR)인 것으로 예측하였으며, 이때 Z-score가 7.3이고 아미노산 서열 상동성이 27% 인 것으로 나타났다. 낮은 서열 상동성에도 불구하고, 인간 NRS 및 B. malayi NRS(BmNRS)의 UNE-N 구조의 중첩은 전체 접힘(ovrall fold)이 모든 Cα 원자에 대해 2.3Å의 RMSD(root-mean-square deviation)와 유사하다는 것을 보여 주었다(데이터 미도시). lysine-rich helical motif인 iSKsqLKnikK는 또한 helix α2의 N-말단에서도 관찰되었는데, 이는 B. malayi의 UNE-N 에서 볼 수 있듯이 기질 tRNA와의 상호 작용을 의미한다(데이터 미도시).

흥미롭게도, β2-loop3-β3 영역은 현저한 구조적 차이를 나타내었다. 인간 UNE-N은 Ser48-Arg54 잔기를 갖는 보다 긴 loop3을 가지며 loop3의 양말단(β2 및 β3)에서 더 짧은 β-가닥을 갖는 반면, B. malayi의 UNE-N은 type II β-turn (Lys5-Asp46-Gly47-Lys48)을 갖는 β-hairpin 구조를 포함하고 더 긴 β- 가닥을 포함한다. UNE-N에 대한 NMR 연구는 결정 구조에서 loop 3의 2차 구조 경향에 대해 일관된 결과를 보여주었다. 구조 분석에 기초하여, 본 발명자들은 인간 UNE-N의 loop3은 CCR3와의 상호 작용을위한 가장 중요한 영역인 것으로 예측하였으며, 본 발명자가 규명한 CCR3-매개 신호 전달에 대해서는 이하에서 더욱 후술된다. 또한, ¹H-¹⁵N hetero-nuclear nuclear Overhauser effect(NOE) 실험으로부터 loop3 영역은 인간 UNE-N에서 가장 동적인 부분이었고, loop3 영역과 helix α2의 N-말단 영역에 대한 amide proton exchange rate는 단백질의 다른 부분보다 높았으며, 이는 loop3 영역의 동적 특성을 더욱 지지하였다.

우리는 또한 molecular replacement method를 이용하여 인간 NRS의 CD(canonical domain) 결정 구조를 규명하였으며, 이때 BmNRS의 CD를 phasing model로서 이용하였다. DALI server를 이용하여 계산된 결과에 따르면, 인간 NRS의 CD는 B.malayi, Pyrococcus horikoshii 및 Entamoeba histolytica로 부터의 NRS와 상당한 구조적 유사성을 공유하였다. CD의 촉매 도메인은 α-helice가 측면에 위치하는 역평행 β-sheet를 갖는 뉴클레오타이드 결합 부위(nucleotide-binding site)를 특징으로하며, 이는 class 2 ARS family의 구조적 특징이다. CD의 dimeric interface는 ABD 및 3800 Ų의 촉매 도메인을 통해 널리 퍼져있으며, PISA(Protein interfaces, surfaces, and assemblies) server에 의해 계산된 결과에 의하면 이는 CD의 단량체 표면적(monomeric surface area)의 약 18 %를 차지한다.

2-3. UNE -N은 CCR3 세포외 도메인과 직접 상호 작용한다.

인간 UNE-N이 CCR3(UniProtKB/Swiss-Prot: P51677.1)을 통해 케모카인 활성을 발휘하는지 여부를 더욱 밝히기 위해, H460, Daudi 및 Jurkat 세포에서 CCR3 발현 수준을 평가했다. 도 9에서 보는 바와 같이 상기 세포들은 CCR3를 발현한다.

CCR3 발현이 si-CCR3(CCR3-targeting siRNA, AAGUUGUAUUGGCAGUGGGUGGCGU(서열번호 4))에 의해 억제되었을 때 UNE-N에 의한 Daudi 및 Jurkat 세포의 이동을 조사했다. 인간 NRS와 UNE-N의 케모카인 활성은 CCL5의 경우처럼 현저하게 감소되었으며(도 10, 도 11), 상기 CCL5는 CCR3의 확립된 케모카인으로 양성 대조군으로 사용되었다. 이러한 결과는 가능한 기능성 수용체로서 CCR3를 통해, UNE-N이 케모카인 활성을 유도한다는 것을 나타낸다.

다음으로, CCR3 ED(extracellular domain)들에 대한 UNE-N의 결합 경향성을 좁히기 위하여, 인간 NRS와 CCR3 ED들의 in vitro 상호 작용을 평가하였다. 각각의 N-말단에 MBP(maltose-binding protein) tag를 갖는 CCR3 ED1, CCR3 ED2, CCR3 ED3 및 CCR3 ED4를 정제하고, 인간 NRS, UNE-N 또는 CD와 함께 인큐베이션하였다. CCR3 ED가 없는 MBP control은 NRS, UNE-N 및 CD를 풀 다운(pull down)시키지 못했다. 인간 NRS와 UNE-N은 CCR3 ED들과 함께 침전되었지만(도 12, 도 13 참조), CD는 풀다운 되지 않았다(도 14 참조). 특히, CCR3 ED3은, CCR3 ED1 또는 CCR3 ED2 보다, 인간 NRS 또는 UNE-N과 더 강하게 결합하였으며, CCR3 ED4와 NRS/UNE-N 사이에는 비교적 약한 상호작용이 관찰되었다. 상기 결과들은 UNE-N이 CCR3-매개 케모카인 활성을 발휘하고, CCR3 ED3, ED2/ED1 및 ED4의 친화력 순서로 직접 상호작용함을 나타낸다.

2-4. UNE -N의 Loop3은 CCR3 상호 작용을 위한 이펙터 모티프( effector motif)이다.

CCR3에 대한 UNE-N의 결합 방식을 더 알아보기 위해, 4개의 개별 CCR3 ED들의 존재 및 부재 하에서 UNE-N의 ¹H-¹⁵N HSQC 스펙트럼을 비교했다. CCR3 ED3가 화학적 시프트 섭동(chemical shift perturbation)보다는 우세한 공명 선대증폭(resonance broadening)으로 가장 교란된 스펙트럼 피크(perturbed spectra peak)를 발생시키는 것을 관찰했다. UNE-N가 MBP-fused CCR3 ED들에 결합될 때, UNE-N의 transverse relaxation rate(R2)가 현저히 증가하는 것에 의해 전체 공명 선대증폭이 설명될 수 있었다. CCR3 ED1로 적정(titrate)된 UNE-N의 스펙트럼에서는 더 낮은 정도의 유사한 피크 변화가 관찰되었다. CCR3 ED2는 화학적 시프트 변화 없이 약간의 공명 선대증폭(resonance broadening)을 일으켰고, CCR3 ED4는 눈에 띄는 스펙트럼 변화를 일으키지 않았다. 이러한 결과는 UNE-N에 대한 결합 선호가 CCR3 ED3, ED1, ED2 및 ED4 순서(즉, 결합선호가 CCR3 ED3 > CCR3 ED1> CCR3 ED2 > CCR3 ED4)임을 나타내며, UNE-N이 CCR3 ED3에 가장 강력하게 결합하는 것으로 나타난 풀다운 분석 결과와 일치하였다.

공명 선대증폭(resonance broadening)의 정도는 CCR3 ED들의 부재 및 존재 하에서 스펙트럼의 피크 강도의 비율로부터 유도 될 수 있다. CCR3 ED3, CCR3 ED1 및 CCR3 ED2에 의해 유도된 이들 값을 UNE-N 잔기에 대해 플롯팅(plotting) 하였을 때, 각 플롯(plot)의 평균 비/표준 편차는 각각 0.530/0.066(ED3), 0.575/0.052(ED1) 및 0.794/0.056(ED2)였다(도 15, 도 16, 도 17 참조). UNE-N 잔기들에 대한 큰 표준편차 값은, UNE-N과 CCR3 ED의 보다 특이적인 상호 작용으로 해석 될 수 있다. UNE-N 잔기들은 CCR3 결합에 의해 특이적으로 영향을 받으며, UNE-N의 residue-by-residue analysis는 세부적인 결합방식을 밝혀줄 것이다.

각 CCR3 ED들과 상호작용하는 UNE-N의 잔기들을 확인하기 위해, 공명 선대증폭(resonance broadening)과 화학적 시프트 섭동(chemical shift perturbation)을 정량화했다. CCR3 ED3의 존재 하에서, loop3의 Glu51 및 Asn52와 helix α2의 Lys60은 가장 큰 공명 선대증폭을 나타냈다(도 15).

intermediate NMR time scale에서의 구조 변화가 해당 피크의 공명 선대증폭을 증가 시킨다는 것을 고려하면, UNE-N이 CCR3 ED3와 상호 작용할 때 Glu51 및 Asn52를 갖는 loop3이 가장 주목할 만한 구조 변화를 겪고 helix α2의 N-말단에 있는 Lys60이 영향을 받는다. CCR3 ED3에 결합시 Ala4, Tyr7, Ala16, Lys50, Ile58, Gln62, Ile66, His71, Gln74, Met75, Lys76, 및 Ser77에 대한 경미한 화학적 섭동이 관찰되었으며, 이는 fast NMR time scale 상에서 약간의 구조적 변화가 있었음을 제시한다.

CCR3 ED1으로 적정한 후에, loop3의 Gln49는 가장 큰 공명 선대증폭을 보인 반면, Glu51, Asn52 및 Lys60은 두 번째로 큰 선대증폭을 보였고, 이는 CCR3 ED1 결합에 있어서 UNE-N의 loop3이 주로 관여함을 뒷받침한다(도 16). CCR3 ED1에 대한 결합시의 화학적 시프트 섭동은 Ala4, Ala16, Lys50, Ile58, Met75, Lys76, 및 Ser77에 대해서 관찰되었으며, CCR3 ED3에 의한 값보다는 낮은 값으로 관찰되었다.

CCR3 ED1으로 적정했을 때와 유사하게, CCR3 ED2의 존재 하에서 loop3의 Gln49는 가장 큰 공명 선대증폭을 유도하였고, Glu51, Asn52, Arg54 및 Lys60은 두 번째로 큰 선대증폭을 유도하였다(도 17). 종합하여, 이러한 결과들은 UNE-N의 loop3이 CCR3에 결합하는데 주요한 역할을 하며, 수용체 인식을위한 이펙터 모티프(effector motif)임을 시사한다.

2-5. 인간 UNE -N의 Loop3 영역은, 상이한 수용체를 표적으로하는 BmNRS의 UNE -N과 구조적으로 구별된다.

표적 수용체 선택에 있어서 UNE-N loop3의 구조적 기여에 대한 이해를 위해, 대표적 진핵생물들로서 인간, 원숭이, 마우스, 새, 개구리, 물고기, 곤충 및 두 종류의 선충(nematode)으로부터 총 9개의 UNE-N 서열을 정렬시켰다(데이터 미도시). loop3 근처의 두 개 방향족 아미노산 잔기인 Tyr7 및 Trp55가 다양한 NRS들 내에서 고도로 보존되어 있음을 발견했다. 전체적인 구조가 상당히 유사하고 loop3 근처의 일부 특징적 잔기들이 고도로 보존되어있음에도 불구하고, 인간과 B. malayi에서 UNE-N 구조의 비교는 loop3 영역의 이차 구조 조성이 현저히 다르다는 것을 밝혔다.

인간 NRS의 Tyr7 및 Trp55의 방향족 측쇄는 pi-pi 상호 작용을 통해 서로 상호작용하여 단백질 접힘을 안정화시킨다. CaPTURE web server 계산에 따르면, Tyr7-Trp55 인터페이스의 반대쪽에서 Arg54(척추동물에 보존되어있음)의 측쇄 또한 cation-pi 상호작용을 통해 Trp55를 안정화시켰다. 게다가, Asp47(척추동물에 보존되어있음)의 음으로 하전된 카르복실기는, Arg54의 양전하를 띤 guanidinium group을 전기적으로 안정화시켰다. BmNRS UNE-N의 경우, Tyr4 및 Trp51은 각각 인간 NRS의 Tyr7 및 Trp55에 상응하였고, Tyr-Trp의 방향족 측쇄를 통해 pi-pi 상호 작용을 형성하였다.

BmNRS는 인간 NRS의 Arg54에 상응하는 염기성 잔기를 가지고 있지 않으나, Arg42(인간 NRS의 Asp47에 상응)의 양전하를 띠는 guanidinium group은 인간 NRS의 Arg54 위치를 대신 차지하고 있었으며, cation-pi 상호 작용을 통해 Trp51과 상호 작용한다. 인간 NRS Arg54의 안정된 형태(구조)는 Glu53-Arg54-Trp55의 펩티드 백본의 강제 굴곡(bending)을 유도하고, 해당 영역은 루프를 형성하는 반면, BmNRS는 역평행 β- 시트 구조를 취하고 있다. NMR titration 결과와 함께, loop3 영역은 인간 UNE-N의 표적 수용체(CCR3에 대한) 특이성을 설명 할 수 있다.

실시예 3: NRS N- term(인간 UNE-N)loop3 단편 펩타이드의 제작 및 케모카인 활성 평가

상기 실시예 2에서 규명한 바를 토대로 인간 UNE-N의 loop3(DSQKENERW)에 해당하는 단편 펩타이드를 제작하였다. 제작방법은 전술한 실시예와 동일하다. 특징적으로 대표적 단편 폴리펩타이드인 loop3 단편 펩타이드(DSQKENERW)는 분자량 1190 Da, 순도 98%로 정제되었으며, 물에 대해 우수한 용해성을 나타내었다(1 mg/ml soluble, Good solubility in water).

단편 펩타이드에 대하여 케모카인 활성을 평가하였으며, 상기 실시예 2에서 기술된 것과 동일하게 Daudi, Jurkat 및 H460 세포주를 이용하여 세포 이동 분석(cell migration assay)이 수행되었다. 양성대조군으로 CCL5(RNATES)를 사용하였다. 대표적 실험결과를 도 18에 도시하였다. 특징적으로 대표적 폴리펩타이드인 loop3 단편(DSQKENERW)은 Daudi 세포(B 세포) 및 Jurkat 세포(T 세포)의 이동을 유도하는 효과가 현저하였으며, 이는 면역세포 특이적으로 케모카인 활성(특히, CCR3에 대한 케모카인 활성)을 가짐을 나타낸다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 NRS 단편 폴리펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단리된 폴리펩타이드와 상기 폴리펩타이드의 맥락막 혈관신생 검출/영상화, CCR3-매개 질환의 진단 및 상기 질환 특이적 약물 전달 용도에 관한 것이다.

본 발명에서 제공하는 특유의 NRS 단편 폴리펩타이드는 CCR3에의 결합을 통한 케모카인 활성이 현저하므로, 면역조절, CCR3을 매개로하는 질환 또는 병증의 검출, 진단, 치료, 약제 개발 등의 다양한 목적으로 활용가능하며, 특히 전장(full length) 단백질 및 도메인 단위에서의 폴리펩타이드 보다 길이가 짧아 이용 상의 현저한 우수성을 가지므로 산업상 이용가능성이 높다.

<110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Fragmented NRS polypeptide and use thereof <130> NP19-0034 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide core motif of chemokine activity(loop3 peptide) <400> 1 Asp Ser Gln Lys Glu Asn Glu Arg Trp 1 5 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of loop3 peptide <400> 2 gattcacaaa aagaaaatga gaggtgg 27 <210> 3 <211> 548 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of NRS(homo sapiens, full length) <400> 3 Met Val Leu Ala Glu Leu Tyr Val Ser Asp Arg Glu Gly Ser Asp Ala 1 5 10 15 Thr Gly Asp Gly Thr Lys Glu Lys Pro Phe Lys Thr Gly Leu Lys Ala 20 25 30 Leu Met Thr Val Gly Lys Glu Pro Phe Pro Thr Ile Tyr Val Asp Ser 35 40 45 Gln Lys Glu Asn Glu Arg Trp Asn Val Ile Ser Lys Ser Gln Leu Lys 50 55 60 Asn Ile Lys Lys Met Trp His Arg Glu Gln Met Lys Ser Glu Ser Arg 65 70 75 80 Glu Lys Lys Glu Ala Glu Asp Ser Leu Arg Arg Glu Lys Asn Leu Glu 85 90 95 Glu Ala Lys Lys Ile Thr Ile Lys Asn Asp Pro Ser Leu Pro Glu Pro 100 105 110 Lys Cys Val Lys Ile Gly Ala Leu Glu Gly Tyr Arg Gly Gln Arg Val 115 120 125 Lys Val Phe Gly Trp Val His Arg Leu Arg Arg Gln Gly Lys Asn Leu 130 135 140 Met Phe Leu Val Leu Arg Asp Gly Thr Gly Tyr Leu Gln Cys Val Leu 145 150 155 160 Ala Asp Glu Leu Cys Gln Cys Tyr Asn Gly Val Leu Leu Ser Thr Glu 165 170 175 Ser Ser Val Ala Val Tyr Gly Met Leu Asn Leu Thr Pro Lys Gly Lys 180 185 190 Gln Ala Pro Gly Gly His Glu Leu Ser Cys Asp Phe Trp Glu Leu Ile 195 200 205 Gly Leu Ala Pro Ala Gly Gly Ala Asp Asn Leu Ile Asn Glu Glu Ser 210 215 220 Asp Val Asp Val Gln Leu Asn Asn Arg His Met Met Ile Arg Gly Glu 225 230 235 240 Asn Met Ser Lys Ile Leu Lys Ala Arg Ser Met Val Thr Arg Cys Phe 245 250 255 Arg Asp His Phe Phe Asp Arg Gly Tyr Tyr Glu Val Thr Pro Pro Thr 260 265 270 Leu Val Gln Thr Gln Val Glu Gly Gly Ala Thr Leu Phe Lys Leu Asp 275 280 285 Tyr Phe Gly Glu Glu Ala Phe Leu Thr Gln Ser Ser Gln Leu Tyr Leu 290 295 300 Glu Thr Cys Leu Pro Ala Leu Gly Asp Val Phe Cys Ile Ala Gln Ser 305 310 315 320 Tyr Arg Ala Glu Gln Ser Arg Thr Arg Arg His Leu Ala Glu Tyr Thr 325 330 335 His Val Glu Ala Glu Cys Pro Phe Leu Thr Phe Asp Asp Leu Leu Asn 340 345 350 Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Asp Val Val Asp Arg Ile Leu Lys Ser 355 360 365 Pro Ala Gly Ser Ile Val His Glu Leu Asn Pro Asn Phe Gln Pro Pro 370 375 380 Lys Arg Pro Phe Lys Arg Met Asn Tyr Ser Asp Ala Ile Val Trp Leu 385 390 395 400 Lys Glu His Asp Val Lys Lys Glu Asp Gly Thr Phe Tyr Glu Phe Gly 405 410 415 Glu Asp Ile Pro Glu Ala Pro Glu Arg Leu Met Thr Asp Thr Ile Asn 420 425 430 Glu Pro Ile Leu Leu Cys Arg Phe Pro Val Glu Ile Lys Ser Phe Tyr 435 440 445 Met Gln Arg Cys Pro Glu Asp Ser Arg Leu Thr Glu Ser Val Asp Val 450 455 460 Leu Met Pro Asn Val Gly Glu Ile Val Gly Gly Ser Met Arg Ile Phe 465 470 475 480 Asp Ser Glu Glu Ile Leu Ala Gly Tyr Lys Arg Glu Gly Ile Asp Pro 485 490 495 Thr Pro Tyr Tyr Trp Tyr Thr Asp Gln Arg Lys Tyr Gly Thr Cys Pro 500 505 510 His Gly Gly Tyr Gly Leu Gly Leu Glu Arg Phe Leu Thr Trp Ile Leu 515 520 525 Asn Arg Tyr His Ile Arg Asp Val Cys Leu Tyr Pro Arg Phe Val Gln 530 535 540 Arg Cys Thr Pro 545 <210> 4 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCR3-targeting siRNA <400> 4 aaguuguauu ggcagugggu ggcgu 25 <210> 5 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CCR3 ED1 <400> 5 Met Thr Thr Ser Leu Asp Thr Val Glu Thr Phe Gly Thr Thr Ser Tyr 1 5 10 15 Tyr Asp Asp Val Gly Leu Leu Cys Glu Lys Ala Asp Thr Arg Ala Leu 20 25 30 Met Ala Gln Phe Val Pro Pro Leu 35 40 <210> 6 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CCR3 ED2 <400> 6 Val Arg Gly His Asn Trp Val Phe Gly His Gly Met Cys Lys Leu Leu 1 5 10 15 Ser Gly Phe Tyr His Thr Gly Leu Tyr Ser Glu 20 25 <210> 7 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CCR3 ED3 <400> 7 Tyr Glu Thr Glu Glu Leu Phe Glu Glu Thr Leu Cys Ser Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Pro Glu Asp Thr Val Tyr Ser Trp Arg His Phe His Thr Leu Arg Met 20 25 30 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CCR3 ED4 <400> 8 Ser Ser Tyr Gln Ser Ile Leu Phe Gly Asn Asp Cys Glu Arg Ser Lys 1 5 10 15 His Leu Asp Leu 20

Claims (14)

1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단리된 폴리펩타이드.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 케모카인(chemokine) 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 케모카인 활성은 CCR3(C-C chemokine receptor type 3)에 결합하는 것에 의해 매개되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
   
4. 제1항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
   
5. 제4항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
   
6. 제5항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
   
7. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization) 검출용 조성물.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 자기공명 영상물질, 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
   
9. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 CCR3-매개 질환의 진단용 조성물.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 CCR3-매개 질환은 천식, 알레르기성 비염, 과민성 폐 질환, 과민성 폐렴, 호산성 폐렴, 간질성 폐질환, 호흡기 알레르기성 질환, 염증성 장 질환, 건선, 피부염, 습진, 염증성 피부 질환, 신장암 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택되는 CCR3-매개 질환의 진단용 조성물.
    
11. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 CCR3-매개 질환 특이적 약물 전달용 조성물.
    
12. 제11항에 있어서, 상기 CCR3-매개 질환은 천식, 알레르기성 비염, 과민성 폐 질환, 과민성 폐렴, 호산성 폐렴, 간질성 폐질환, 호흡기 알레르기성 질환, 염증성 장 질환, 건선, 피부염, 습진, 염증성 피부 질환, 신장암 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택되는 CCR3-매개 질환 특이적 약물 전달용 조성물.
    
13. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 CCR3-매개 질환 부위의 영상화용 조성물.
    
14. (a) 제1항의 폴리펩타이드와 시험제제를 접촉시켜 시험제제가 제1항의 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 NRS 전장 단백질의 케모카인 활성을 억제하는지 여부를 측정하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 케모카인 활성을 억제하는 시험제제를 선별하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 선별된 시험제제를 CCR3를 발현하는 세포에 처리하여 CCR3 활성을 억제하는지 여부를 측정하는 단계
    를 포함하는 CCR3-매개 질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법.

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