KR101755089B1

KR101755089B1 - 계수나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨용 조성물

Info

Publication number: KR101755089B1
Application number: KR1020150008747A
Authority: KR
Inventors: 배영수; 김웅진; 이승환
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2015-01-19
Filing date: 2015-01-19
Publication date: 2017-07-06
Also published as: KR20160089158A

Abstract

본 발명은 계수나무 (Cericidiphyllum japonicum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 계수나무 추출물은 당뇨 치료제인 아카보스와 유사한 정도의 α-글루코시다아제 억제 활성을 가지고 있어 당뇨 치료제의 활성성분으로 개발될 가능성이 높다. 본 발명의 계수나무 추출물은 천연물로부터 유래되었으므로 화학적으로 합성된 화합물과는 다르게 인체 적용시 부작용이 적다.

Description

계수나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨용 조성물{Composition for Treating Diabetes Comprising Extract from Katsura Tree as Active Ingredients}

본 발명은 계수나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨용 조성물에 관한 것이다.

계수나무(Cercidiphyllum japonicum Sieb. Et Zucc)는 계수나무속에 속하는 유일한 종(species)으로 화석기록에 의하면 백악기 후기와 제3기 북미와 유럽지역에 서식한 것으로 알려졌으나 지금은 동아시아에만 서식하는 것으로 보고되었다. 계수나무는 오래 사는 낙엽성 나무로 풍매수분(風媒受粉)을 하며 동종이형 나뭇잎을 가지고 있다. 다 자란 나무는 30m에서 45m까지 자라고 나뭇가지가 대칭적으로 우거져 지붕모양을 하며 어린나무일 때는 불그스레한 색을 띄다가 다 자라면 밝은 담녹색을 띈다. 낙엽은 붉은 색이 약간 섞인 화려한 노란색이다. 이러한 특성으로 인하여 계수나무는 장식용이나 경관의 배경이 되는 나무로 많이 사용되며 의학용 나무로도 사용되어 경제적으로 뿐만 아니라 생태학적으로도 가치 있는 나무이다(Zhang et al., 2009). 다발기둥 모양의 계수나무 열매는 바람에 의하여 사방으로 퍼질 수 있는 많은 수의 작은 씨앗을 품고 있어서 씨앗이 바람에 의해 날아갈 수 있는 사방 600m에서 2000m에 걸쳐 자연적 삼림을 이룬다. 계수나무로 이루어진 온화한 낙엽성 숲은 동중국과 일본에 걸쳐 퍼져있다. 하지만 계수나무는 개체수가 줄어들면 자연적으로 회복되기가 매우 어려워서 극소수의 계수나무만 서식하고 있기 때문에 중국에서는 위기종으로 보호하고 있으며 전 세계적으로 국제자연보호연맹의 기준에 따라 낮은 위기 등급으로 보호되고 있다.

당뇨는 많은 합병증을 수반하는 질병으로 죽상동맥경화증, 심장기능장애, 망막병증, 신경병증, 신장병과 같은 합병증을 일으킨다(Sowers et al., 2001). α-글루코시다아제(EC 3.2.1.20)는 탄수화물의 소화단계에서 마지막 단계를 촉매하기 때문에 α-글루코시다아제를 억제하면 소화된 탄수화물의 흡수를 지연시키고 식후 고혈당증을 억제하므로, 당뇨환자, 비만환자 또는 당뇨가 있는 비만환자를 치료하는데 유용하다. 아카보스(acarbose), 미글리톨(miglitol), 보글리보스(voglibose)와 같은 α-글루코시다아제 억제제들은 탄수화물 소화효소들의 활성을 방해하여 단당의 흡수를 억제하므로 식후고혈당증을 억제하는 것으로 알려졌다.

알도스 환원효소(Aldose reductase, E.C.1.1.1.21, AR)는 폴리올 대사계(polyol pathway)의 첫 번째 효소로 NADPH에서 NADP+의 변환이 수반되어 알데히드 형태의 D-글루코스가 D-소비톨(D-sorbitol)로 변환되는 D-글루코스 환원반응을 촉매 한다. 폴리올 대사계가 당뇨병에 수반되는 여러 퇴행성 합병증의 발병에 중요한 역할을 한다는 것은 이미 학계의 정설이며 당뇨병의 특징인 혈당의 상승이 인슐린에 의해 단당흡수가 조절되지 않는 장기인 신경, 망막, 수정체 및 신장에 존재하는 폴리올 대사계로부터 상당량의 단당이 혈액으로 공급되기 때문이라는 것이 알려졌다. 그러므로 알도스 환원효소 억제제를 당뇨합병증의 치료제로서 연구하는 것이 많은 주목을 받고 있다.

식물재료로부터 추출된 폴리페놀 화합물이 활성산소를 제거하여 산화 스트레스를 줄이며 세포를 산화적 손상으로부터 보호하는 능력이 있다는 것이 확인되었다(Fukuda et al., 2004). 그러므로, 최근 들어 식용식물의 폴리페놀 화합물이 인간의 건강에 중요한 항산화 활성을 가지고 있는 자연 항산화제로서 각광 받고 있다(Sabu et al., 2002). 식물들은 많은 생물학적 활성 화학물질의 원료로 구성되어 있으며 부작용이 없는 훌륭한 약리활성을 가지고 있기 때문에 보다 안전한 새로운 종류의 항당뇨 약물이나 당뇨합병증 치료약물로 개발에 사용될 수 있다. 또한, 당 유도체 뿐만 아니라 플라보노이드(flavonoid)들과 폴리페놀들이 α-글루코시다아제와 알도스 환원 효소를 억제하는 활성이 있다는 것이 알려지면서 당뇨치료제로서 상업적 이용이 가능한 α-글루코시다아제 억제제나 알도스 환원 효소 억제제 또는 이와 관련된 리드 화합물들을 식물로부터 생산하기 위해 많은 노력을 기울이고 있다. 최근 들어, 나무나 식물과 같은 다양한 자연재료로부터 생물학적 활성을 평가하고 이를 약제식품이나 기능성 식품 또는 화장품으로 개발하기 위하여 많은 연구가 진행되어왔다. 그러나, 계수나무를 이용한 약제품이나 기능성 식품의 연구 개발은 많지 않았다.

본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 선행문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.

A. Mahajan and N. Pai, 2010. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 2 (5), 97. Bahorun, T., et al., 2006; Internet Journal of Medical Update 1(2): 25-41. Chihiro, N.Y. 1998; Pharmacol. Rev. 50: 21-34. Fukuda, T., et al., 2004; Biofactors. 21: 251-253. Griffiths, D.W. and G. Moseley, 1980; J. Sci. Food Agric. 31: 255-259. Haraguchi, H., et al., 1996; J. Nat. Prod. 59: 443-445. Isagi Y, et al., 2005; Mol. Ecol. Notes 5:596-598. Kador, P.F., et al., 1985a; Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 25: 691-714. Kador, P.J., et al., 1985b; J. Med. Chem. 28: 841-849. Kim, H.J., et al., 2001; Arch. Pharm. Res., 24: 527-531. Lee, H.S. and M.K. Kim, 2001; Food Sci. Biotechnol. 10: 172-177. Lee, M.H., et al., 2002; Arch. Pharm. Res. 25, 842-850. Li, L. and Seeram, N. P., 2010; Journal of Agricultural and Food Chemistry 58(22): 11673-11679. Lobo, V., et al., 2010; Pharmacognosy Review 4(8): 118-126. Manchester SR, et al., 2009; J. Syst. Evol. 47:1-42. Mandal, P., et al., 2009; International Journal of Intergrative Biology 7(2):80-84. Mayne, S.T., 2003; The Journal of Nutrition 133: 93340. Sabu, M.C., et al., 2002; J. Ethnopharmacol. 83: 109-116. Schmidt, D. D., et al., 1979. Naturwis-senshaften. 66. 584-585. Sowers, J.R., et al., 2001; Hypertension 37: 1053-1105. Toeller, M., 1994; Eur. J. Clin. Invest. 24(Suppl. 3): 3l-35. Valko, M., et al., 2007; International Journal of Biochemistry and Cell Biology 39(1): 44-84. Wan, C., et al., 2012; Food Chemistry 135: 1929-1937. Williamson, J., et al., 1992; American Physiology Society. New York, pp. 107-132. Zhang XY., et al., 2009; Northern Horticulture (9):77-79. (in Chinese)

본 발명자들은 인체 부작용이 적은 천연물로부터 항당뇨 활성을 가진 활성성분을 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, 계수나무 잎의 추출물이 당뇨 치료제인 아카보스와 동등한 정도의 α-글루코시다아제 억제 활성이 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 계수나무(Cericidiphyllum japonicum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 계수나무 (Cericidiphyllum japonicum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨용 조성물을 제공한다.

본 발명의 활성성분이 유래하는 “계수나무(Cercidiphyllum japonicum)”는 계수나무속에 속하는 유일한 종(species)으로 장식용이나 경관의 배경이 되는 나무로 많이 사용되며 의학용 나무로도 사용되어 경제적으로 뿐만 아니라 생태학적으로도 가치 있는 나무이다. 계수나무는 냇가 등의 습지가 있는 양지바른 곳에서 잘 자라며 내공해성 및 내염성이 강하여 가로수로 적당하므로 쉽게 키우고 수득할 수 있는 장점이 있다. 본 발명의 계수나무는 계피(cinnamon)가 유래하는 녹나무과에 속하는 생달나무(Cinnamomum cassia)와는 명확히 다른 식물이다.

본 발명에서 사용되는 계수나무 추출물은 계수나무의 전체의 추출물, 또는 줄기, 뿌리, 잎, 꽃, 열매, 및 씨앗으로 구성된 군에서 선택된 계수나무 일부의 추출물이며, 바람직하게는 계수나무의 잎으로부터 얻은 추출물이다.

본 발명에서 계수나무 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계의 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 바람직하게는 상기 계수나무 추출물은 추출용매와 접촉시키는 공정을 통해 제조된다. 추출 단계 전에 상기 계수나무 전체 또는 일부를 건조 및/또는 분쇄할 수 있다.

본 발명의 유효성분으로 이용되는 계수나무 추출물을 얻기 위한 용매는 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 용매도 포함한다. 예를 들어, 상기 추출용매는 (a) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (b) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (c) 아세톤, (d) 에틸 아세테이트, (e) 클로로포름, (f) 1,3-부틸렌글리콜, (g) n-헥산, (h) 디에틸에테르, (i) 부틸아세테이트, (j) 디클로로메탄 또는 (h) 물을 포함하며, 바람직하게는 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 또는 물이다. 한편, 본 발명의 추출물은 상기한 추출 용매 뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 본 발명의 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다.

본 발명에서 추출공정은 추출용매를 부분적으로 또는 완전히 제거하는 단계를 통해 완성되며, 부분적 제거는 상당한 양의 유기용매가 없는 수성 농축물이 얻어질 때까지 농축하는 것을 의미하며, 완전한 제거에 의해서는 건조 잔류물을 얻을 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "추출물" 은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 상기 조추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함하는 의미이다. 즉, 본 발명의 계수나무 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것 뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 분획물도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리, 상기 설명된 추출 용매에 의한 2차 또는 3차의 추가적인 추출 분획 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 추출물은 계수나무 조추출물에 대해 상기 설명된 추출용매를 사용하여 재차 추가적인 추출 공정을 통해 얻어진 분획물을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “당뇨”은 제1형 당뇨병(인슐린 의존형 당뇨병: insulin dependent diabetes mellitus, IDDM) 및 제2형 당뇨병(인슐린 비의존형 당뇨병: Noninsulin dependent diabetes mellitus, NIDDM)을 포괄하는 의미를 갖는다.

본 명세서의 용어 “항당뇨”는 고혈당을 예방하여 당뇨병의 증세 및 당뇨병에 수반되는 합병증을 치료, 예방 또는 개선하는 것을 의미한다. 당뇨병 치료제의 치료 또는 예방 작용은 다음과 같이 분류될 수 있다: (i) 탄수화물의 흡수를 저해시켜 식후 혈당 상승을 조절, (ii) 췌장에 작용하여 인슐린 분비를 촉진; (iii) 간에 작용하여 포도당 대사를 조절, (iv) 인슐린 민감성 증가시키거나 인슐린저항성을 개선, 또는 (v) 중추신경계에 작용.

하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에 의해 입증되는 바와 같이, 본 발명의 계수나무 추출물은 α-글루코시다아제 억제 활성을 통해 식후 혈당 상승을 억제할 수 있으므로, 항당뇨 조성물의 활성성분으로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 (a) 계수나무 추출물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 당뇨의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물 형태로 제공될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “치료”는 (i) 질환 또는 질병의 발전의 억제, (ii) 질환 또는 질병의 경감, 또는 (iii) 질환 또는 질환의 제거를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001 - 1000 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 계수나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨의 예방 또는 개선용 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “개선”은 질병으로 인한 증상 또는 질병의 합병증으로 인한 증상의 경감을 의미한다.

본 발명의 조성물이 기능성 식품 조성물인 경우, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 감미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서 천연 감미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시리진 등)] 및 합성 감미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 계수나무 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 기능성 식품 조성물은 당뇨의 예방 또는 개선하는 데에 매우 유용하다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 계수나무 추출물의 항당뇨 용도에 관한 것이다.

(ii) 본 발명의 계수나무 추출물은 시판되는 당뇨 치료제인 아카보스와 유사한 정도의 α-글루코시다아제 억제 활성을 가지고 있어 당뇨 치료제의 활성성분으로 개발될 가능성이 매우 높다.

(iii) 본 발명의 계수나무 추출물은 천연물로부터 유래되었으므로 화학적으로 합성된 화합물과는 다르게 인체 적용시 부작용이 적다.

도 1은 계수나무 잎 추출물의 분획물의 DPPH 자유라디칼 제거 활성을 측정한 결과를 보여준다.
도 2는 계수나무 잎 추출물의 분획물의 α-글루코시다아제 억제 활성을 측정한 결과를 보여준다.

실시예

실험재료 및 방법

1. 식물재료

2013년 8월 강원도 화천에서 신선한 계수나무(Cercidiphyllum japonicum)의 잎을 채집하고 2주 동안 공기 중에서 건조시켰으며 추출을 위해 고운 가루가 되도록 분말화시켰다.

2. 추출 및 분획

분말화한 잎 3kg을 70% 아세톤 용액에 침지시키고 상온에 3일간 두었다. 3회에 걸쳐 추출과 여과를 반복한 후 여과된 액체를 40℃의 저압상태인 회전증발기에서 증발시켰다. 증발된 수성 조잔여물을 분리 깔때기를 통해 순차적으로 각 용매를 사용하여 분획한 후 동결건조하여, 각각 n-헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 물의 가용성 분획물을 제조하였다.

3. DPPH 자유라디칼 소거활성분석

DPPH 자유라디칼 소거활성분석은 Li 와 Seeram (2010) 과 Wan 등. (2012)이 기록한 바와 같이 수행하였다. 96-웰 마이크로 플레이트에 10 가지의 다른 농도(500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.62, 7.81, 3.9, 1.95, 및 0.97 ppm)의 시료를 100 μl씩 분주하고 양성대조군으로 α-토코페롤을 100μl 분주한 후 0.2 mM의 DPPH 100μl를 각 웰에 첨가하였다. 상기 혼합물을 30분 동안 어두운 곳에서 반응시킨 후 마이크로 플레이트 리더(Sunrise, TECAN)를 이용하여 517 mM에서 흡광도를 측정하였다. 소거능력(SC, scavenging capacity)은 SC% = [(Ao-As)/Ao] x 100의 식으로 계산하였다. 상기 수식에서 Ao는 DPPH를 첨가하지 않은 웰의 흡광도를 의미하며 As는 시료의 흡광도를 의미한다. 모든 실험은 3회에 걸쳐 반복 수행하였으며 결과는 50% 저해 농도(IC₅₀)값으로 표시하였는데, 50% 저해농도(IC₅₀)값은 50%의 DPPH 자유라디칼을 소거하는데 필요한 시료의 양을 의미한다.

4. α-글루코시다아제 억제 활성 분석

4.1. α-글루코시다아제의 제조

돼지를 도살한 후 즉시 소장을 모아 저장하였다. 소장을 절개하고 증류수로 2-3회 세척한 후 현미경 슬라이드를 이용하여 소장의 점막을 잘라 조각냈다. 조각낸 점막을 모아 점막의 무게 대비 5 배의 부피로 준비한 버퍼용액[ 0.5M NaCl, 0.5M KCl 및 5mM EDTA, pH 7.0]에 첨가하였다. 점막이 첨가된 버퍼용액을 S-10 직접구동교반기(Hana Instruments)를 통하여 5분 동안 균질화한 후 원심분리를 수행하였다. 원심분리에서 나온 침전물에 5 mM의 EDTA를 첨가하고 x 20,000g의 속도로 원심분리를 실시하였으며 상기 과정을 3회 반복하였다. 상기 원심분리로부터 수득한 침전물에 침전물의 무게 대비 5 배의 부피로 0.9% NaCl 용액을 첨가한 후 다시 균질화하고 이를 x20,000g의 속도로 30분간 원심분리 하였다. 상기 원심분리로부터 상등액을 수득하여 24시간 동안 투석하고 브래드포드(Bradford)방법을 이용하여 단백질을 정량하였다.

4.2. α-글루코시다아제의 활성 분석

α-글루코시다아제의 활성을 분석하기 위해, α-글루코시다아제 기질인 4 mM 말토오스 500 ㎕, 물 400 ㎕, 및 α-글루코시다아제 용액 100㎕을 포함하는 인큐베이터에서 37℃, 60 분간 반응시킨 후, 100℃ 항온수조에 5분간 두었다. 포도당은 포도당 분석 키트(Sigma GAGO20-1KT)를 이용하여 분석하였으며, 효소의 활성은 1 unit으로 계산하였다. 1 unit은 1분 동안 1 μM의 포도당을 생산하는 활성을 의미한다.

4.3. α-글루코시다아제 억제 활성 평가

추출물들의 각 분획은 70％ 에탄올에 0.8, 1.6, 3.2, 6.3, 12.5, 25, 50, 및 100 ppm 농도로 희석하였다. 각 희석한 시료 50 ㎕에 α-글루코시다아제(10.2 unit/ml) 100㎕을 첨가하고 37℃에서 10분간 미리 인큐베이션 하였다. 여기에 α-글루코시다아제 기질로서 4 mM의 말토오스 500 ㎕를 첨가하여, 37℃에서 60분간 반응시킨 후 100℃ 항온수조에 5분간 두었다. 포도당은 포도당 분석 키트를 사용하여 측정하고, 70% 에탄올에서 반응시킨 용액의 분석결과를 대조군으로 하여 비교하였다. 시료의 α-글루코시다아제 억제 활성은 억제 퍼센트(%)로 나타내었으며, 시료의 퍼센트 억제 = [(a_n-a_s)/a_n] x 100%의 수식을 통해 계산하였다. 상기 수식에서 a_n은 모든 블랭크(blank)와 음성대조군 사이의 흡광도 차이를 의미하여, a_s는 모든 블랭크(blank)와 시료의 흡광도 차이를 의미한다.

실험 결과

1. 추출물의 자유라디칼 소거 활성

항산화제는 세포 구조를 산화적으로 손상시키는 자유라디칼을 불활성화 시키거나 안정화시키는 능력이 있다. 자유라디칼의 소거는 자유라디칼에 수소를 제공하는 방법으로 수행되므로 자유라디칼 소거 활성의 측정을 통해 항산화 능력을 결정할 수 있다. 계수나무(Cercidiphyllum japonicum) 잎 추출물에 대한 DPPH 자유라디칼 소거 활성측정을 통하여 시료가 가지고 있는 항산화 능력을 측정하였으며, 상기 활성은 50% 저해 농도(IC₅₀)값으로 표시하였다. 50% 저해 농도(IC₅₀) 값은 50%의 DPPH 자유라디칼이 소거되는데 필요한 항산화제의 양을 말한다. 계수나무 잎 추출물의 다섯 가지 분획물들에 대한 DPPH 자유라디칼 소거활성 및 50% 저해농도(IC₅₀)값은 도 1과 표 1에 나타내었다. DPPH 자유라디칼 소거활성은 시료의 농도에 비례하여 증가하였다. 도 1에 나타낸 결과에 따르면, 계수나무 잎 추출물의 물 및 에틸아세테이트 분획물이 모든 농도에서 대조군에 비해 높은 활성을 보였으며, 조추출물(crude extract)도 62.5 ppm 보다 낮은 농도에서 대조군에 비해 좋은 활성을 보였다. 그러나, 비극성 용매인 n-헥산 및 디클로로메탄 분획물의 경우, 모든 농도에서 대조군에 비해 낮은 활성을 보였다.

아래 표 1에 나타난 바와 같이, 낮은 50%저해농도(IC₅₀)값은 자유라디칼 소거 능력이 강하다는 것을 의미한다. 조추출물(crude extract), 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물은 50% 저해 농도(IC₅₀) 값이 각각 11.78㎍/㎖, 4.29㎍/㎖ 및 9.80㎍/㎖으로 대조군의 50% 저해 농도(IC₅₀) 값인 12.08㎍/㎖에 비해 낮았으나, n-헥산 또는 디클로로메탄 분획물은 50% 저해 농도(IC₅₀)값이 300㎍/㎖와 91.85㎍/㎖로 대조군에 비해 높았다.

시료		50% 저해 농도(IC₅₀, ㎍/㎖)값
조추출물		11.78
분획물	n-헥산	300.00
	디클로로메탄(CH₂Cl₂)	91.85
	에틸아세테이트	4.29
	물	9.80
양성대조군	α-토코페롤	12.08

2. 추출물의 α-글루코시다아제 억제 활성

α-글루코시다아제는 인간의 탄수화물 소화 과정에 핵심이 되는 중요한 효소의 하나로서 탄수화물을 가수분해하여 포도당을 혈액에 방출시켜 식후 혈중 포도당 농도의 증가를 야기한다. 그러므로 α-글루코시다아제의 활성을 억제할 수 있다면 식후 혈중 포도당 농도를 효과적으로 낮출 수 있으므로 당뇨병 환자에게 특히 유용하다. 아카보스(acarbose), 보기보스(vogibose) 및 미그리톨(miglitol)와 같은 합성 의약품들은 당뇨를 예방하거나 치료하는데 효능이 있지만, 간 기능 장애나 소화기계 증상을 유발하는 부작용이 있다(Murai et al., 2002). 그러므로 천연 자원에서 유래한 α-글루코시다아제 억제제가 당뇨를 예방하거나 치료하는데 더 좋은 대안이 되고 있다.

계수나무 잎 추출물의 α-글루코시다아제 억제 활성을 평가하고 그 결과를 도 2와 표 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 결과에 의하면, α-글루코시다아제 억제 활성은 시료의 농도에 비례하여 증가하였다. 그러나, 비극성 용매인 n-헥산 및 디클로로메탄 분획물의 경우 양성 대조군인 아카보스에 비하여 낮은 억제 활성을 보였다. 에틸아세테이트 분획물은 12.5 ppm 보다 높은 농도에서 양성대조군에 비하여 거의 100%에 가까운 훌륭한 억제 활성을 보였고, 조추출물(crude extract)도 25 ppm과 50 ppm의 농도에서 대조군과 비교하여 95%와 100%의 좋은 억제 활성을 보였다. 물 분획물도 역시 대조군에 비하여 낮은 값을 보이긴 했으나, 50 ppm의 농도에서 90%의 좋은 억제 활성을 보였다.

시료		50%저해농도값(IC₅₀, ㎍/㎖)
조추출물		7.1
분획물	n-헥산	468
	디클로로메탄(CH₂Cl₂)	103.6
	에틸아세테이트	3.7
	물	13.0
양성대조군	아카보스	1.7

상기 표 2의 50%저해농도(IC₅₀) 값들은 도 2의 결과와 유사하다. 비극성 용매인 n-헥산 및 디클로로메탄 분획물의 50%저해농도(IC₅₀) 값은 각각 468 ㎍/㎖ 및 103.6 ㎍/㎖으로 나타나 양성 대조군에 비하여 낮은 50%저해농도(IC₅₀) 값을 보이는데 반하여, 극성 용매 추출물인 조추출물(crude extract), 물 분획물, 및 에틸아세테이트 분획물의 50%저해농도(IC₅₀) 값은 각각 7.1 ㎍/㎖, 3.7 ㎍/㎖ 및 13 ㎍/㎖와 같이 높은 50% 저해농도(IC₅₀)값을 보였다.

결론

계수나무 잎을 모아 공기 중에 건조한 후 70% 아세톤을 통하여 추출하여 농축하였다. 상기 농축한 추출물을 n-헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 물로 순차적으로 분획하고 동결건조한 후에 항산화 및 α-글루코시다아제 억제 활성을 확인하였다. 추출물의 항산화활성은 DPPH 자유라디칼 소거활성분석 통해 분석하였다. 상기 실험에 사용한 각 시료들의 농도와 양성대조군 물질인 α-토코페롤의 농도는 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.62, 7.81, 3.9, 1.95, 및 0.97ppm 이었다. 실험 결과, 물 분획물과 에틸아세테이트 분획물의 항산화 활성이 모든 농도에서 가장 높았으며 조추출물 또한 62.5ppm보다 낮은 농도에서 좋은 활성을 보였다. 그러나, 비극성 용매인 n-헥산과 디클로로메탄의 분획물들은 모든 농도에서 낮은 활성을 보였다. 조추출물, 에틸아세테이트 및 물 분획물의 50% 저해농도값(IC₅₀)는 각각 11.78, 4.29 및 9.80㎍/㎖이었으며 양성대조군 물질의 50% 저해농도값은 12.08㎍/㎖이었다. 추출물의 α-글루코시다아제 억제 활성은 50, 25, 12.5, 6.3, 3.1, 1.6, 및 0.8ppm의 농도에서 수행하였다. 비극성 용매인 n-헥산 및 디클로로메탄 분획물의 억제활성은 양성대조물질인 아카보스에 비하여 낮았지만 상기 분획물을 제외한 나머지 분획물들은 높은 억제활성을 보였으며 추출물의 농도와 억제활성이 비례하는 경향을 보였다. 에틸아세테이트 분획물은 12.5ppm보다 높은 농도에서 양성대조군에 대비하여 100%의 좋은 억제능력을 보였으며 조추출물 또한 25 ppm과 50ppm의 농도에서 양성 대조군에 대비하여 95%와 100%의 좋은 억제능력을 보였다. 물 분획물은 50ppm의 농도에서 좋은 억제활성을 보였지만 양성대조군에 비해 낮은 값을 보였다.

이러한 결과들에 의하면 극성용매의 분획물들이 높은 α-글루코시다아제 억제활성을 보였다. 반면, 비극성 용매인 n-헥산과 디클로로메탄 분획물의 50% 저해농도(IC₅₀)값은 468㎍/㎖와 103.6㎍/㎖로 아카보스에 비해 낮았다. 그러나, 조출물(아세톤), 에틸아세테이트 및 물과 같은 극성 용매 분획물의 50% 저해농도값은 7.1㎍/㎖, 3.7㎍/㎖ 및 13㎍/㎖이었다. 이러한 결과는 본 발명의 계수나무 추출물 및 분획물들이 당뇨병을 치료하는데 사용될 수 있으며, 화학적 합성물 기반 당뇨 치료제를 대체할 수 있는 유망한 자연 생체적합물질임을 시사한다.

본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 명백하다.

Claims

계수나무 속에 속하는 계수나무(Cericidiphyllum japonicum)의 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는α-글루코시다아제 활성 저해를 통한 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 계수나무의 잎 추출물은 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜, 디에틸에테르, 부틸아세테이트, 및 물로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 용매 추출물인 것을 특징으로 하는 α-글루코시다아제 활성 저해를 통한 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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