KR101743617B1

KR101743617B1 - 봉출 추출물을 포함하는 염증성 질환 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101743617B1
Application number: KR1020150166460A
Authority: KR
Inventors: 정성근; 이남혁; 김영호; 김영언; 송경모; 하수정
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2015-11-26
Filing date: 2015-11-26
Publication date: 2017-06-05

Abstract

본 발명은 봉출 (Curcuma zedoaria Rosc.)의 초음파 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 천식, 자가 면역 질환, 만성 염증, 만성 전립선염, 사구체신염, 과민증, 염증성 장 질환, 골반 염증성 질환, 재관류 손상, 류마티스 관절염, 이식거부, 여드름, 셀리악병, 사코이드증, 간질성 방광염 또는 혈관염을 예방 또는 치료하는 데에 이용될 수 있다.

Description

봉출 추출물을 포함하는 염증성 질환 치료용 약학 조성물 {Composition for treating inflammatory disease including extract of zedoary}

본 발명은 염증성 질환을 완화 또는 치료하기 위한 봉출 초음파 추출물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

봉출 (Curcuma zedoaria Rosc.)은 생강과에 속하는 여러해살이 숙근성 식물로서, 아출, 봉아무, 광무, 문출 또는 봉아출로도 불리고, 봉술의 뿌리줄기를 지칭한다. 동양 의학에서 봉출은 간 (肝) 및 비 (脾)에 작용하여 행기 (行氣, 기를 잘 돌게 함), 개위 (開胃, 위를 열어줌), 소어 (消瘀, 어혈을 삭여 없앰), 소적 (消積, 적취를 제거함), 지통 (止痛, 통증을 그치게 함), 통혈 (通穴, 혈액이 정체되지 않고 잘 흐르게 함), 파혈 (破血, 어혈을 비교적 독하고 강한 거어약을 사용하여 없앰), 해독 (解毒, 독성을 풀어줌) 및 화식 (化食, 음식물을 소화시킴)의 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

이를 통하여 경폐통경 (經閉痛經, 월경 출혈이 없으면서 나타나는 월경통), 자통 (刺痛, 몸을 찌르는 것 같은 아픔), 전간발광(癲癎發狂, 전간으로 말미암아 보이는 정신착란 상태), 황달요적(黃疸尿赤, 역독사를 받거나 음식을 조절하지 못했거나 습열이나 한습이 중초를 막아서 담즙이 제대로 돌지 못해 눈과 살갗 및 소변이 누렇게 되는 병증으로 소변이 붉게된 것) 및 흉복창통(胸腹脹痛)을 치료하는 데에 이용하였다.

본 발명은 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 봉출의 초음파 추출물을 포함하는 약학 조성물 및 이를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 봉출 (Curcuma zedoaria Rosc.) 초음파 추출물을 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 초음파 추출은 에탄올에서 추출하고, 본 발명의 다른 일 실시예에서 상기 염증성 질환은 천식, 자가 면역 질환, 만성 염증, 만성 전립선염, 사구체신염, 과민증, 염증성 장 질환, 골반 염증성 질환, 재관류 손상, 류마티스 관절염, 이식거부, 여드름, 셀리악병, 사코이드증, 간질성 방광염 또는 혈관염이며, 본 발명의 다른 일 실시예에는 상기 초음파 추출은 10 내지 50 kHz에서 수행되고, 본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 초음파 추출은주파수 20 kHz, 출력 전압 750 와트, 185 진폭(amplitude) 및 20초 진동(pulse) 주기의 조건에서 이루어지고, 본 발명의 다른 일 실시예에서 상기 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액이다.

또한 본 발명의 다른 실시예에서, 봉출 초음파 추출물을 포함하는 염증성 질환 완화용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "염증성 질환"은 혈장/체액성인자 또는 백혈구에서 면역 시스템의 오작동으로 인하여 세포가 손상을 입거나 조직 또는 세포의 기능 장애로 인해 발생되는 질병을 통칭한다. 급성단계에서 염증은 통증, 발열, 홍조, 종기 및 기능상실의 증상을 보인다. 조직학적으로는 염증은 소동맥, 모세혈관 및 정맥이 팽창되고 삼투압 및 혈류 속도가 증가하며, 혈장 단백질을 포함하는 체액의 삼출될 뿐만 아니라 염증이 발생한 곳으로 백혈구가 이동한다. 염증성 질환은 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 천식, 자가 면역 질환, 만성 염증, 만성 전립선염, 사구체신염, 과민증, 염증성 장 질환, 골반 염증성 질환, 재관류 손상, 류마티스 관절염, 이식거부, 여드름, 셀리악병, 사코이드증, 간질성 방광염 및 혈관염을 포함한다.

산화질소(nitric oxide, NO)는 생체 내에서 유도성 산화 질소 합성 효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS)에 의해 합성되는데, NO가 과량으로 생산되는 경우에는 세포 독성을 띄게 된다. 면역 자극 사이토카인 또는 세균성 병원체가 iNOS를 활성화 시켜 NFκB를 포함한 유도성 핵인자의 활성화를 통하여 높은 농도의 NO를 발생시킨다. NO는 생체 내에서 상반되는 역할을 하는데, 신경계에서 신호전달물질과 유사한 생물학적 매개체 역할을 하고, 혈관계에서 혈관 긴장도를 조절하며, 면역계에서 중요한 숙주 방어 작동체이다. 반면, NO는 반감기가 짧은 자유 라디칼 (NO·)로써 특히 염증성 반응과 같은 병리과정에서 세포 독성을 나타낼 수 있다. 특히 본 말명의 일 실시예에서 기재된 바와 같이, LPS 자극에 의해 발현된 iNOS는 많은 양의 NO를 생성하게 되며 이에 의한 세포독성은 염증반응, 세포의 돌연변이 및 종양 발생 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다.

사이클로옥시게네이즈2 (cyclooxygenase2, COX-2)는 아라키돈산 (arachidonic acid)으로부터 프로스타사이클린 (prostacyclin) 및 트롬복산 (thromboxane)과 같은 프로스타글란딘 (prostaglandin)을 포함하는 프로스타노이드 (prostanoid)의 형성에 관련된 효소이다. COX-2에 의해 프로스타노이드의 생산이 유도되면 화학주성 인자 (chemotactic factor), 프로스타노이드, 류코트리엔 및 포스포라이페이즈 및 다양한 염증성 사이토카인이 방출되어 부종이나 조직의 손상이 야기된다. 따라서 COX-2의 저해제는 염증이나 통증을 약화시키는 약으로 사용될 수 있다.

대식세포에 있어 염증성 사이토카인, COX-2 및 iNOS와 같은 매개체들의 발현은 전사수준에서 주요 전사인자인 NF-κB (nuclear factor kappa-B)에 의해 조절되는데, 평소 IκB가 NF-κB와 복합체를 이루어 NF-κB의 활성을 억제시킨다. LPS와 같은 자극이 주어지는 경우 IκB는 IκB 인산전달효소 (kinase) 에 의해 인산화 되면서 떨어져 나와 분해되고, 유리된 NF-κB는 핵으로 이동하여 다양한 염증성 매개체와 같은 표적유전자의 발현을 유도하게 된다. 이러한 과정에 있어 IκB 인산전달효소의 활성화에는 ERK (extracellular signal-regulated kinase), c-Jun JNK (N-terminal kinase), p38 인산전달효소를 포함하는 MAPKs (mitogenactivated protein kinases)에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 계면활성제의 예로는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다. 비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE(폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POE·POP (폴리옥시에틸렌·폴리옥시프로필렌) 공중합체, POE·POP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다. 음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, α-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다. 양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급암모늄염 등을 들 수 있다. 양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.2 내지 200 ㎎/kg으로, 바람직하게는 2 내지 100 ㎎/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어, "예방하다", "예방하는", 및 "예방"은 동물에서 질환의 하나 이상의 증후군의 발생의 감소를 지칭한다. 상기 예방은 완전할 수 있고, 예컨대, 대상에서의 증상이 완전히 없어질 수 있다. 상기 예방은 또한 대상에서의 증상의 발생이 본 발명이 없으면 발생했을 것보다 적거나 부분적일 수 있다.

본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 본 발명의 봉출 초음파 추출물을 포함하는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-1000 ㎎/kg 범위 내이다.

용어 "식품 첨가제"는 식품의 제조, 가공, 또는 보존을 위해 식품에 첨가, 혼합, 침윤 기타의 방법에 의해 사용되는 물질을 말한다. 식품첨가제의 종류에는 천연물과 합성품의 두 종류가 있으며, 보통 그 기능과 용도에 따라 분류한다. 주로 용도에 따라서 보존료, 살균제, 산화방지제, 착색료, 발색제, 표백제, 조미료, 감미료, 착향료, 팽창제, 강화제, 개량제, 유화제, 증점제(호료) 및 안정제, 피막제, 껌 기초제, 소포제, 용제, 이형제, 방충제, 품질 개량제와 기타 식품제조용 첨가제 등으로 분류되어 사용될 수 있다. 식품 첨가제는 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카터킨 (catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rose mary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 또한 조미제 및 향미제를 포함할 수 있다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 산화방지제로서 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 봉출 초음파 추출물을 포함하는 약학 조성물은 염증성 질환을 치료 또는 완화할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 봉출 초음파 추출 방법 및 봉출 정치 추출 방법을 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 봉출 추출물의 자외선에 의한 COX-2 발현 억제 활성을 비교한 그래프이다. UE: 봉출 초음파 추출물; IE: 봉출 정치 추출물
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 봉출 추출물의 자외선에 의한 MAPKs의 인산화 억제 활성을 웨스턴 블랏으로 확인 (a)하고 이를 수치화한 그래프 (b) 이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 봉출 추출물의 LPS에 의한 NO 억제 활성을 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른. 봉출 추출물의 LPS에 의한 COX-2 발현 억제 활성을 비교한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 봉출 추출물의 LPS에 의한 NF-κB 신호 전달을 웨스턴 블랏으로 확인 (a)하고 이를 수치화한 그래프 (b) 이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 쥐 피부조직에서 봉출 초음파 추출물의 주름 생성 억제 효능을 확인한 사진 (a) 및 생성된 주름의 양을 수치화한 그래프 (b) 이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 자외선에 의한 무모쥐의 등조직에서 봉출 초음파 추출물의 COX-2 발현 억제 활성을 웨스턴 블랏으로 확인 (a)하고 이를 수치화한 그래프 (b) 이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 봉출 초음파 추출물의 제조

봉출 ((주)자연세상, Korea)은 믹서(Wonder Blender, OSAKA CHEMICAL Co., Osaka, Japan)로 분말화 후 입자크기를 표준화시켜 상온에 보관하면서 사용하였다. 상기 봉출 분말에 10배 용량의 95% 에탄올을 가하여 상온에서 24시간동안 초음파 기기 (Ultrasonic Processor VCX 750, Sonics & Materials, Inc., Newtown, USA)를 사용하여 주파수 20 kHz, 출력 전압 750 와트, 185 진폭(amplitude) 및 20초 진동(pulse) 주기의 조건으로 초음파 추출하였다. 대조군은 상기 봉출 분말에 10배 용량의 95% 에탄올을 가하여 상온에서 24시간동안 정치 추출하였다 (도 1).

실시예 2. 세포배양

인간 각질형성세포 HaCaT (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA) 및 마우스 대식세포 Raw 264.7 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA) 는 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS), 100 U/mL의 페니실린, 100 mg/mL의 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배양액에서 37 ℃로 5 % CO₂ 배양기에서 배양하였다. 세포를 10 cm 세포 배양 플레이트 당 5×10⁵ cells/mL씩 접종하여 2일 간격으로 계대 배양 하여 실험에 사용하였다.

실시예 3. 자외선 조사

자외선 조사는 4개의 Westinghouse F520 램프 (National Biological, Twinsburg, OH)로 조사하였으며, 필터 (Kodak Kodacel K6808, Eastman, Kodak, Rochester, NY)가 장착된 UVB (Ultraviolet radiation B, 290 nm - 320 nm) 조사 챔버를 만들어 290 nm 이하의 파장을 제거하였다. UVB 조사는 UVX radiometer (UVP, CA)를 이용하여 측정하였다.

실시예 4. HaCaT 세포에서 봉출 초음파 추출물의 자외선에 의한 COX -2 발현억제

HaCaT 세포를 계수 후 6 cm 접시에 1 x 10⁵ cells/mL로 분주하고 5% CO₂, 37℃ 세포 배양기에 24시간 배양하고 페놀 레드 (phenol red) 및 혈청이 없는 DMEM 배지로 교환하여 24시간 배양하였다. 상기 배양한 세포에 봉출 초음파 추출물 및 정치 추출물을 농도 별로 처리하고 1시간 후, UVB (0.04 J/㎠)를 처리하고 6시간 후에 세포에서 단백질을 분리하여 웨스턴 블랏 (Western blot) 을 수행하였으며, 웨스턴 블랏은 하기와 같이 수행하였다.

세포를 PBS로 2회 세척 후 셀 스크래퍼 (cell scraper) 로 모은 다음 12,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 회수하였다. 상기 회수된 상층액의 단백질 양을 정량하여 SDS 시료 완충액 (SDS sample buffer) 에 동량을 섞어주었다. 5분간 가열한 후 15분간 얼음에서 냉각하고 10% SDS-PAGE 한 후, PVDF (polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켰다. 상기 막을 5% 탈지유-TBST 용액 (skim milk- Tris-buffered saline & tween 20 solution) 을 2시간 동안 처리하여 차단 (blocking) 한 후 5% 탈지유-TBST 용액에 희석된 1차 항체를 4℃에서 밤새 반응하도록 하였다. 그 후 TBST 용액에 30분간 흔들어 씻어준 후 2차 항체를 붙여주었다. ECL (enhanced chemiluminescencs) 용액을 이용하여 반응을 시켜줌으로써 웨스턴 블랏 필름에 결과를 도출하고 그 결과를 수치화 하였다.

실험 결과, 봉출 초음파 추출물을 처리한 경우, 100 μg/mL의 봉출 초음파 추출물에서 정치추출물에 비하여 자외선에 의한 COX-2의 발현을 현저하게 억제함을 확인 하였다 (도 2).

실시예 5. HaCaT 세포에서 봉출 초음파 추출물의 자외선에 의한 MAPKs의 인산화 억제

자외선으로 염증이 증가된 HaCaT 세포에서 봉출 초음파 추출물에 의한 MAPK (mitogen-activated protein kinase) 활성변화를 측정하기 위하여 ERK1/2, JNK1/2 및 p38의 인산화에 미치는 영향을 웨스턴 블랏을 이용하여 살펴보았다. HaCaT 세포를 계수 후 6 cm 접시에 1 x 10⁵ cells/mL로 분주하고 5% CO₂, 37℃ 세포 배양기에 24시간 배양하고 페놀 레드 (phenol red) 및 혈청이 없는 DMEM 배지로 교환하여 24시간 배양하였다. 상기 배양한 세포에 봉출 초음파 추출물 및 정치 추출물을 농도 별로 처리하고 1시간 후, UVB (0.04 J/㎠)를 처리하고 30분 후에 세포에서 단백질을 분리하여 웨스턴 블랏 (Western blot) 을 수행하였다.

그 결과, 자외선(0.04 J/㎠)으로 자극한 세포에서 ERK1/2, JNK1/2 및 p38의 인산화 발현이 아무것도 처리하지 않은 군에 비해 현저히 증가하였고, 봉출 초음파 추출물을 전 처리한 세포에서 정치 추출물 보다 ERK1/2, JNK1/2 및 p38의 인산화가 억제되는 것으로 나타났다 (도 3).

실시예 6. . Raw 264.7 세포에서 봉출 초음파 추출물의 LPS에 의한 NO 생성 억제

LPS (lipopolysaccharide) 에 의해 활성화된 대식세포에서 생성하는 일산화 질소 (nitric oxide, NO)에 대한 시료의 저해효과는 그리스 분석법 (Griess assay) 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 세포에 봉출 초음파 추출물 및 정치 추출물을 농도별로 처리하고 1시간 후 LPS를 가하고 흡광도를 측정 하였다. 표준검량선은 아질산 나트륨 (sodium nitrite)을 사용하여 작성하였다.

그 결과, 봉출 초음파 추출물을 처리한 군에서는 봉출 초음파 추출물의 농도가 증가함에 따라서 NO의 생성량이 감소되었다. 또한 추출 시 초음파를 처리한 시간이 증가함에 따라서 NO의 생성량이 감소되었다 (도 4).

실시예 7. Raw 264.7 세포에서 봉출 초음파 추출물의 LPS에 의한 COX -2 발현 억제

HaCaT 세포 대신 Raw 264.7 세포를 이용한 것을 제외하고는 상기 실시예 4에서와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

그 결과, 봉출 초음파 추출물이 100 μg/mL의 농도에서 정치추출물보다 LPS에 의한 COX-2의 발현을 현저하게 억제함을 확인 하였다 (도 5).

실시예 8. Raw 264.7 세포에서 봉출 초음파 추출물의 LPS에 의한 NF - κB 신호 전달

자외선으로 염증이 증가된 Raw 264.7 세포에서 봉출 초음파 추출물에 의한 NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) 신호 전달 변화를 측정하기 위하여 IKKα/β (IκB kinase α/β), IκBα, NF-κB p65 및 NF-κB p105/p50 의 인산화에 미치는 영향을 웨스턴 블랏을 이용하여 살펴보았다. Raw 264.7 세포를 계수 후 6 cm 접시에 1 x 10⁵ cells/mL로 분주하고 5% CO₂, 37℃ 세포 배양기에 24시간 배양하였다. 상기 배양한 세포에 봉출 초음파 추출물 및 정치 추출물을 농도 별로 처리하고 1시간 후, LPS (1 μg/mL)를 처리하고 10분 후에 세포에서 단백질을 분리하여 웨스턴 블랏 (Western blot) 을 수행하였다.

그 결과, IKKα/β, IκBα 및 NF-κB p65에서 모두 봉출 초음파 추출물의 농도가 높아짐에 따라 인산화 정도가 낮아지는 것으로 나타났다 (도 6).

실시예 9. 동물실험

6주령의 무모쥐(SKH-1 hairless mice)를 중앙실험동물(주)로부터 구입하여 2주 동안 적응시킨 후 사용하였다. 실험동물은 습도 50%, 온도 23±2 ℃로 유지되는 동물실험실에서 사육하였으며 물과 식이를 자유롭게 섭취할 수 있도록 공급하였다. 주 3회 아세톤에 녹인 봉출 초음파 추출물을 20과 100 mg/kg/day의 농도로 200 μL 씩 등쪽 피부에 도포하였고, 1시간 후 자외선을 등 부분에 조사하였다. 자외선 조사량은 처음 1주간은 1 MED (1 MED = 130 mJ/cm₂), 매주 1 MED씩 증가하여 4주부터 12주까지 4 MED로 조사하였다.

실시예 9.1 피부주름 측정

10주 동안 자외선 조사를 실시한 무모쥐의 피부를 실리콘 고무로 모사판을 제작하여 주름의 형성 정도를 측정하였다. 무모쥐의 등 부분에 지름이 1 cm가 되는 원모양의 구멍이 있는 디스크를 부착하고 모사판 제작용 시약을 혼합하여 무모쥐의 등 부분에 얇게 펴 바르고 완전히 말린 다음 디스크를 조심스럽게 떼어내어 모사판을 제작하였다. 모사판 제작용 실리판 고무 인상재는 Silflo silicone (Silflo Flexico Developments, Potters Bar, UK)를 사용하였다.

그 결과 자외선 대조군은 정상군에 비해 굵고 깊게 패인 주름과 함께 잔주름이 형성된 것을 관찰할 수 있었으며, 같은 세기의 자외선이 조사되었음에도 불구하고 봉출 초음파 추출물은 자외선 대조군에 비해 주름의 굵기와 깊이가 개선된 것을 볼 수 있었다 (도 7).

실시예 9.2 무모쥐의 등 조직에서 자외선에 의한 COX -2 발현억제

봉출 초음파 추출물이 자외선에 의한 주름 형성 억제의 결과가 염증조절 단백질인 COX-2 발현에 영향을 미치는지 관찰하기 위하여 12주 동안 자외선 조사를 실시한 무모쥐의 등 조직을 적출하여 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인하였다.

그 결과, 봉출 초음파 추출물의 처리 농도가 높아짐에 따라 자외선에 의한 COX-2의 발현을 현저하게 억제함을 확인 하였다 (도 8).

지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며, 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는 데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

염증성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물로서,
상기 조성물은 봉출 (Curcuma zedoaria Rosc.)을 에탄올에서 초음파 추출한 추출물을 포함하고,
상기 초음파 추출은 20 kHz에서 24시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 염증성 질환은 천식, 자가 면역 질환, 만성 염증, 만성 전립선염, 사구체신염, 과민증, 염증성 장 질환, 골반 염증성 질환, 재관류 손상, 류마티스 관절염, 이식거부, 여드름, 셀리악병, 사코이드증, 간질성 방광염 또는 혈관염인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
염증성 질환 완화용 식품 조성물로서,
상기 조성물은 봉출을 에탄올에서 초음파 추출한 추출물을 포함하고,
상기 초음파 추출은 20 kHz에서 24시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 완화용 식품 조성물.