KR101739243B1 - 그렐린 o-아실 트랜스퍼라제 억제제로서의 치환된 피페리딜-에틸-피리미딘 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 GOAT 억제제 및 그의 염 및 그의 제약 조성물을 제공한다.

Description

그렐린 O-아실 트랜스퍼라제 억제제로서의 치환된 피페리딜-에틸-피리미딘 {SUBSTITUTED PIPERIDYL-ETHYL-PYRIMIDINE AS GHRELIN O-ACYL TRANSFERASE INHIBITOR}

본 발명은 그렐린 O-아실 트랜스퍼라제 (GOAT)를 억제하는데 유용한 화합물, 제약 조성물 및 GOAT 활성에 관련된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

GOAT는 효소의 막-결합 O-아실 트랜스퍼라제 (MBOAT) 패밀리에 속한다. 이는 지방산을 데스아실그렐린 펩티드의 Ser3 잔기에 전달함으로써, 데스아실-그렐린 (비아실화 그렐린 또는 UAG로도 알려짐)을 생물학상 활성 형태인 아실-그렐린 (AG)으로 전환시킨다. 아실-그렐린은 인간 및 설치류에서 식품 섭취를 증가시키고 지방축적을 증가시키는 것으로 나타났다. 인간에서 AG의 주입은 또한 글루코스-유도 인슐린 분비를 억제하는 것으로 나타났다. 그렐린 유전자의 제거는 인슐린 방출을 증진시켜 고지방 식이가 급식된 ob/ob 마우스에서 글루코스 불내성을 예방 또는 개선시키는 것으로 나타났다.

비만과 당뇨병을 위한 현행 치료에 대한 가변적인 유효성 및 반응과 결부된 비만과 당뇨병의 유병률은 더 많은 치료의 선택을 환자가 이용할 수 있을 것을 필요로 한다. GOAT 억제제는 비만의 치료에서 유용한 작용제인 것으로 여겨진다. 추가로 GOAT 억제제는 또한, 식이요법 및/또는 운동, 체중 증가를 감소시키거나 비만을 치료하도록 설계된 다른 치료 약물 또는 절차의 보조물로서 체중 증가 또는 체중의 재증가를 감소시키는데 유용할 수 있는 것으로 여겨진다. 유사하게, GOAT 억제제는 단독으로 또는 2형 당뇨병용 다른 치료와 조합하여, 2형 당뇨병 치료에서 유용할 수 있다.

본 발명은 GOAT 억제제인 화합물을 제공한다. 특히, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명은 추가로 하기 화학식의 GOAT 억제제인 화합물을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 및 1종 이상의 다른 치료제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가 측면은 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 체중 증가 또는 체중의 재증가의 감소 또는 2형 당뇨병 또는 비만의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 체중 증가 또는 체중의 재증가를 감소시키거나 2형 당뇨병 또는 비만을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 치료에 사용하기 위한, 특히 체중 증가 또는 체중의 재증가를 감소시키거나 2형 당뇨병 또는 비만을 치료하기 위한, 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 체중 증가 또는 체중의 재증가를 감소시키거나 2형 당뇨병 또는 비만을 치료하기 위한 의약의 제조에서 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 화합물은 일반적으로 광범위한 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 예를 들어, 하루 투여량은 약 0.03 내지 약 150 mg/Kg의 체중의 범위 내에 포함된다. 일부 경우에 상기 범위의 하한 미만의 투여량 수준이 충분하고도 남을 수 있으며, 한편 다른 경우에 바람직한 이익/위험 프로파일을 유지하면서 훨씬 더 많은 용량이 사용될 수 있고, 따라서 상기 투여량 범위는 본 발명의 범주를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다. 실제로 투여되는 화합물의 양은 치료될 병태, 선택된 투여 경로, 투여되는 실제 화합물 또는 화합물들, 개별 환자의 연령, 체중, 및 반응, 및 환자 증상의 중증도를 포함한, 관련 상황의 견지에서, 의사에 의해 결정될 것임을 이해할 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하는" (또는 "치료하다" 또는 "치료")은 기존 증상, 병태 또는 장애의 진행 또는 중증도를 저지, 둔화, 중단, 또는 반전시키는 것을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "체중 증가를 감소시키는"은 환자의 체중에서의 증가를 감소시키는 것을 지칭한다. 용어 "체중의 재증가를 감소시키는"은 체중 감량 후 체중에서 리바운드(rebound)를 경험하는 환자의 체중에서의 증가를 감소시키는 것을 지칭한다. 체중의 재증가는 식이요법, 운동, 행동 수정, 또는 승인된 요법을 통해 달성된 체중 감량의 중단 후에 리바운드 효과로 인한 것일 수 있다. 의심을 피하기 위해 본원에 사용된 바와 같은 체중 증가 또는 체중의 재증가는 식품 섭취 또는 식습관에 의해 유도된 체중 증가 또는 체중의 재증가를 지칭하고 비식품 관련 체중 증가, 예컨대 수분 보유, 근육량, 또는 염증으로 인한 체중, 유체의 축적을 지칭하지 않는다.

본 발명의 화합물은 반응하여 제약상 허용되는 염을 형성할 수 있다. 제약상 허용되는 염 및 이들을 제조하는 통상의 방법론은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, [P. Stahl, et al. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties , Selection and Use, 2^nd Revised Edition (Wiley-VCH, 2011)]; [S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977] 참조.

통상의 기술자는 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염이, 1개 이상의 키랄 중심을 함유하는 코어를 포함한다는 것을 알 것이다:

비록 본 발명은 모든 개별 거울상 이성질체뿐만 아니라, 라세미체를 포함한 상기 화합물의 거울상 이성질체의 혼합물을 고려하지만, 본 발명의 바람직한 화합물은 하기 화학식 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 표시된다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 여러가지의 경로에 의해 투여되는 제약 조성물로서 제제화된다. 그러한 제약 조성물 및 이를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, [Remington : The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al., eds., 21st ed., Mack Publishing Co., 2005)] 참조. 하기 화학식으로 표시되는 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물이 보다 특히 바람직하다.

단일 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체는 키랄 시약으로 시작하거나 입체 선택적 또는 입체 특이적 합성 기술에 의해 제조될 수 있다. 대안으로, 단일 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체는 본 발명의 화합물의 합성에서 임의의 편리한 시점에서 표준 키랄 크로마토그래피 또는 결정화 기술에 의해 혼합물로부터 단리될 수 있다. 본 발명의 화합물의 단일 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체는 본 발명의 바람직한 실시양태이다.

당뇨병 및/또는 비만의 치료용 작용제가 당뇨병 및/또는 비만의 치료용 다른 작용제와 조합될 수 있다는 점은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은, 당뇨병 또는 비만을 위한 다른 효과적인 치료 (들)와 함께, 동시에 또는 순차적으로 공동 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은, 단독으로 또는 다른 효과적인 치료 (들)와 조합하여, 승인된 의료 절차, 예컨대 비만치료 수술, 예를 들어, 위장 접합술 또는 위 조절 밴드술 절차 후에, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 합성에 유용한 중간체 및 방법을 포함한다.

게다가, 하기 반응식에 기재된 중간체는 다수의 질소 보호 기를 함유할 수 있다. 가변 보호기는 수행되는 특정 반응 조건 및 특정 변환에 따라 각각의 경우에 동일하거나 상이할 수 있다. 보호 및 탈보호 조건은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, (T. Greene and P. Wuts, eds., 2d ed. 1991)] 참조.

제조예 및 실시예

하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 추가로 예시하며 본 발명의 화합물의 전형적인 합성을 나타낸다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 입수가능하거나 용이하게 합성될 수 있다. 제조예 및 실시예는 제한이 아니라 예시로서 제시되며, 다양한 변형이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이루어질 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

본 발명의 화합물의 R 또는 S 배위는 표준 기술, 예컨대 X-선 분석 및 키랄-HPLC 체류 시간과의 상관 관계에 의해 측정될 수 있다. 하기 제조예 및 실시예의 명칭 부여는 MDL 엑설리스(Accelrys)? 드로우 버전(Draw version) 4.0.NET에서 IUPAC 명명 특징을 사용하여 일반적으로 수행된다.

본원에 사용된 바와 같이, 하기 용어는 명시된 의미를 갖는다: "ACN"은 아세토니트릴을 지칭하고; "BSA"는 소 혈청 알부민을 지칭하고; "DCM"은 디클로로메탄을 지칭하고; "DIPEA"는 N,N-디이소프로필에틸아민을 지칭하고; "DMF"는 디메틸포름아미드를 지칭하고; "DMSO"는 디메틸술폭시드를 지칭하고; "EDTA"는 에틸렌디아민테트라아세트산을 지칭하고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 지칭하고; "EtOH"는 에탄올을 지칭하고; "FBS"는 소 태아 혈청을 지칭하고; "HRP"는 호스라디시 퍼옥시다제를 지칭하고; "IC50"은 최대 반응의 50%를 생성하는 작용제의 농도를 지칭하고; "IPA"는 이소프로필 알콜을 지칭하고; "MeOH"는 메탄올을 지칭하고; "MTBE"는 메틸 tert-부틸 에테르를 지칭하고; "PBS"는 인산염 완충 생리식염수를 지칭하고; "RT"는 실온을 지칭하고; "TEA"는 트리에틸아민을 지칭하고; "TFA"는 트리플루오로아세트산을 지칭하고; "T_R"은 체류 시간을 지칭하고; "THF"는 테트라히드로푸란을 지칭하고; "TMB"는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 지칭한다.

LC-MS 조건 (낮은 pH): 칼럼: 페노메넥스 제미니(Phenomenex Gemini) NX C18 2.1 × 50 mm 3.0 m; 구배: 3분 내에 5-100% B, 그 다음에 0.75분 동안 100% B; 칼럼 온도: 50℃ +/-10℃; 유량: 1 mL/분; 용매 A: 0.1% 포름산을 갖는 탈이온수; 용매 B: 0.1% 포름산을 갖는 ACN.

제조예 1

6-클로로-2-메틸피리미딘-4-아민

5 L 강철 압력 용기 (오토클레이브)를 실온에서 4,6-디클로로-2-메틸피리미딘 (400 g, 2.45 mol) 및 수산화암모늄 (2.8 L)으로 충전하였다. 반응물을 5시간 동안 90℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 다음에 부흐너(Buchner) 깔때기를 통해 고체를 여과하였다. 필터 케이크를 물 (200 mL) 및 헥산 (200 mL)으로 세척한 다음에 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (290 g, 82%)로서 수득하였다. LC-ES/MS m/z 144.0 (M+1).

제조예 2

6-클로로-5-아이오도-2-메틸피리미딘-4-아민

6-클로로-2-메틸피리미딘-4-아민 (708 g, 4.93 mol) 및 MeOH (7.08 L)를 기계적 교반기가 장착된 20 L 환저 플라스크에서 합하였다. 0-5℃로 냉각하였다. 1시간의 기간에 걸쳐 첨가 깔때기를 사용하여 MeOH (6 L)에 용해된 아이오딘 모노클로라이드 (4.806 kg, 29.6 mol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 16시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 0-5℃로 냉각하고 아황산나트륨 (46 L, 20% 수용액)을 첨가하였다. 생성된 고체를 여과하고 물 (2 L)에 이어서 헥산 (3 L)으로 세척하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (1061 g, 80%)로서 수득하였다. LC-ES/MS m/z 269.9 (M+1).

제조예 3

tert-부틸 4-[2-(4-아미노-6-클로로-2-메틸-피리미딘-5-일)에티닐]피페리딘-1-카르복실레이트

3구 플라스크에서 6-클로로-5-아이오도-2-메틸-피리미딘-4-아민 (20 g, 74.22 mmol), 4-에티닐-피페리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (18.64 g, 89.06 mmol), 및 디이소프로필아민 (10.44 mL, 74.22 mmol)을 THF (200 mL)에 용해시켰다. 대안으로 플라스크를 비우고 질소로 3회 충전하였다. 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 클로라이드 (2.63 g, 3.71 mmol) 및 아이오딘화구리(I) (0.713 g, 3.71 mmol)를 용액에 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 50 내지 55℃로 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각하고 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 클로라이드 (1.31 g, 1.86 mmol), 아이오딘화구리(I) (0.356 g, 1.86 mmol) 및 4-에티닐-피페리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (1.55 g, 7.42 mmol)를 더 첨가하였다. 혼합물을 3.5시간 동안 60℃로 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각하고 감압하에 농축하였다. 물질을 DCM (300 mL)으로 희석하고 포화 염화암모늄 수용액 (100 mL), 물 (100 mL), 및 포화 수성 염화나트륨 (100 mL)으로 세척하였다. 용액을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 헥산 중 20% 내지 100% EtOAc로 용리시키면서 실리카겔 크로마토그래피 (800 g 실리카겔 칼럼)를 사용하여 잔류물을 정제하였다. 정제된 분획을 농축하여 표제 화합물을 옅은 오렌지색 분말 (22.6 g, 86%)로서 수득하였다. LC-ES/MS m/z (³⁵Cl/³⁷Cl) 351.2/353.1 (M+1).

제조예 4

tert-부틸 4-[2-(4-아미노-6-클로로-2-메틸-피리미딘-5-일)에틸]피페리딘-1-카르복실레이트

EtOH (81 mL) 및 EtOAc (40 mL) 중 tert-부틸 4-[2-(4-아미노-6-클로로-2-메틸-피리미딘-5-일)에티닐]피페리딘-1-카르복실레이트 (4.30 g, 12.26 mmol) 및 산화백금(IV) (0.139 g, 0.61 mmol)을 합하였다. 대안으로 플라스크를 비우고 수소 벌룬을 사용하여 수소로 충전하고 8시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응을 주의 깊게 모니터링하여 분자 중 염화물의 제거로부터 생긴 잠재적인 부산물을 피하도록 하였다. 생성물이 출발 알킨보다 용매 혼합물에 보다 가용성이라는 점을 유념한다. 혼합물을 규조토를 통해 여과하고, MeOH로 세정하였다. 용액을 감압하에 농축하였다. 플라스크에 실리카, 1-프로판티올 (4 g, 로딩 = 1.28 mmol/g, 실리사이클(SILICYCLE)?로부터의 실리아본드(SILIABOND)? 티올) (이전 커플링 반응으로부터 잔존 팔라듐을 제거하기 위해) 및 EtOAc (300 mL)를 첨가하였다. 물질을 3일 실온에서 교반하였다. 고체를 여과하고 여액을 감압하에 농축하였다. 생성된 잔류물에 대해 수소화를 다음과 같이 반복하였다. 잔류물을 함유하는 플라스크를 산화백금(IV) (0.139 g, 0.61 mmol), EtOH (81 mL) 및 EtOAc (40 mL)로 충전하였다. 대안으로 플라스크를 비우고 수소 벌룬을 사용하여 수소로 충전하고 8시간 동안 실온에서 교반하였다. 규조토를 통해 여과하고, MeOH로 세정하고, 여액을 감압하에 농축하였다. 생성된 잔류물에 대해 수소화를 다음과 같이 반복하였다. 잔류물을 함유하는 플라스크를 산화백금(IV) (0.139 g, 0.61 mmol), EtOH (81 mL) 및 EtOAc (40 mL)로 충전하였다. 대안으로 플라스크를 비우고 수소 벌룬을 사용하여 수소로 충전하고 8시간 동안 실온에서 교반하였다. 규조토를 통해 여과하고, MeOH로 세정하고, 여액을 실리카겔 (20 g) 상으로 감압하에 농축하였다. 물질을 헥산 중 70% 내지 100% EtOAc로 용리시키면서 (120 g 칼럼) 실리카겔 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 정제된 분획을 합하고 감압하에 농축하였다. 잔류물을 DCM 및 헥산으로 희석하고 감압하에 3회 농축하였다. 물질을 진공 하에 배치하여 표제 화합물을 백색 고체 (3.20 g, 73%)로서 수득하였다. LC-ES/MS m/z (³⁵Cl/³⁷Cl) 355.2/357.2 (M+1).

제조예 5

6-클로로-2-메틸-5-[2-(4-피페리딜)에틸]피리미딘-4-아민, 히드로클로라이드 염

tert-부틸 4-[2-(4-아미노-6-클로로-2-메틸-피리미딘-5-일)에틸]피페리딘-1-카르복실레이트 (29.00 g, 81.72 mmol)를 1,4-디옥산 (145 mL)에 용해시키고 1,4-디옥산 (204.2 mL, 817.1 mmol) 중 4M 염화수소를 첨가하였다. 용액을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압하에 농축하고, 디에틸 에테르 (250 mL) 중에서 슬러리화하고, 여과하고, 생성된 고체를 진공하에 건조시켜 표제 화합물을조 백색 고체 (29 g)로서 수득하였다. LC-ES/MS m/z (³⁵Cl/³⁷Cl) 255.2/257.2 (M+1).

6- 클로로 -2- 메틸 -5-[2-(4- 피페리딜 )에틸]피리미딘-4- 아민 ( 제조예 6 - 10)에 대한 대안적 경로

제조예 6

tert-부틸 4-(2-메틸술포닐옥시에틸)피페리딘-1-카르복실레이트

질소 분위기 하에 50 L 반응기에서 tert-부틸 4-(2-히드록시에틸)피페리딘-1-카르복실레이트 (4.720 kg, 20.6 mol)를 DCM (40 L) 및 TEA (3020 mL, 21.63 mol)와 합하였다. 용액을 약 0℃로 냉각하고 반응 온도를 10℃ 미만으로 유지하면서 DCM (5 L) 중 메탄 술포닐 클로라이드 (2.478 kg, 21.63 mol)를 서서히 첨가하였다. 첨가가 완료된 후 혼합물을 15℃에서 18시간 동안 교반하고 이때 TLC (1:1, 헥산:EtOAc)에 의하면 어떤 출발 물질도 잔류하지 않은 것으로 나타났다. 혼합물을 물 (30 L)로 세척하고 상을 분리시켰다. 유기 상을 고체로 농축하였다. 고체를 MTBE (6 L) 중에서 슬러리화하고, 여과에 의해 수집하고, 50℃에서 진공 오븐에서 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (5.67 kg, 91%)로서 수득하였다.

제조예 7

tert-부틸 4-(3-시아노-4-에톡시-4-옥소-부틸)피페리딘-1-카르복실레이트

질소 분위기 하에 50 L 반응기 중에서 tert-부틸 4-(2-메틸술포닐옥시에틸)피페리딘-1-카르복실레이트 (5.26 kg, 17.1 mol), 에틸 시아노아세테이트 (7 kg, 62 mol), EtOH 중 21% 소듐 에톡시드 (8.25 L, 24.75 mol) 및 EtOH (35 L)를 합하였다. 혼합물을 18시간 동안 35 - 40℃에서 가열하고 이때 NMR 분석에 의하면 20%의 메실레이트가 잔류한 것으로 나타났다. 혼합물을 24시간 동안 35 - 40℃에서 계속 가열하였고 이때 NMR 분석에 의하면 단지 소량의 메실레이트를 나타냈다. 반응물을 실온으로 서서히 냉각하고 30분에 걸쳐 빙초산 (1422 mL, 22.68 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 진공 증류를 사용하여 농축한 다음에 물 (25 L)과 EtOAc (35 L)에 분배하였다. 층을 분리하고 수성상을 EtOAc (10 L)로 추출하였다. 유기 부분을 합하고, 염수 (15 L)로 세척하고, 적색 오일로 농축하였다. 오일을 헥산 (40 L) 및 그 다음에 20% EtOAc/헥산으로 용리시키면서, 실리카겔 크로마토그래피 (75 kg 실리카겔, 65-250 메시)를 사용하여 정제하여 30% 에틸 시아노아세테이트/70% 목적 생성물인 분획 (7.8 kg)을 수득하였다. 물질을 100℃ 및 210 mtorr 진공에서 와이프(wipe) 필름 증류에 의해 농축하여, 비-휘발성 분획을 수집하여 표제 화합물 (4.54 kg, 82%)을 수득하였다.

제조예 8

tert-부틸 4-[2-(4-아미노-6-히드록시-2-메틸-피리미딘-5-일)에틸]피페리딘-1-카르복실레이트

질소 분위기 하에 22 L 반응기 중에서 tert-부틸 4-(3-시아노-4-에톡시-4-옥소-부틸)피페리딘-1-카르복실레이트 (2.18 kg, 6.73 mol), 아세트아미딘 히드로클로라이드 (1.27 kg, 13.46 mol, 95% 검정) [주: 아세트아미딘 히드로클로라이드를 톨루엔 (10 L) 중에서 2회 슬러리화한 다음에 스트립핑하여 진공하에 건조시킴으로써 미리-건조시킴], EtOH 중 21% 소듐 에톡시드 (6.73 L, 20.19 mol) 및 EtOH (10 L)를 합하였다. 반응물을 42시간 동안 환류 하에 가열하였다. 빙초산 (1.2 L, 20.86 mol)을 이용하여 반응물을 약 pH = 5로 조정하였다. 회전식 증발기 상에서 진공 증류에 의해 EtOH를 제거하였다. 생성된 고체를 물 (6 L) 중에서 슬러리화한 다음에, 여과에 의해 고체를 수집하고, 추가적 물 (2 L)로 세척하였다. 50℃에서 진공 오븐에서 고체를 건조시켜 표제 화합물 (1.72 kg, 76%)을 수득하였다. ¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) δ 4.83 (s, 3H); 4.05 (d, 2H), 2.75 (bs, 2H), 2.39 (m, 2H), 2.22 (s, 3H), 1.78 (d, 2H), 1.43 ( m, 1H) 1.42 (s, 9H), 1.40 (m, 2H), 1.38 (m, 2H). tert-부틸 4-(3-시아노-4-에톡시-4-옥소-부틸)피페리딘-1-카르복실레이트 (2.36 kg)를 사용하여, 본질적으로 기재된 바와 같이, 공정을 반복하여 표제 화합물 (2.01 kg, 82%)을 수득하였다.

제조예 9

6-아미노-2-메틸-5-[2-(4-피페리딜)에틸]피리미딘-4-올, 디히드로클로라이드 염

질소 분위기 하에 50 L 반응기 중에서 tert-부틸 4-[2-(4-아미노-6-히드록시-2-메틸-피리미딘-5-일)에틸]피페리딘-1-카르복실레이트 (3.73 kg, 11.09 mol) 및 IPA를 합하였다. 12 N 염산 (3.05 L, 36.6 mol)을 3시간에 걸쳐 교반하면서 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 50℃에서 가열하여, 농후한 슬러리를 형성시켰다. 그때 NMR 분석에 의하면 어떤 BOC 기도 잔류하지 않은 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 20 - 25℃로 냉각하고, THF (12 L)로 희석하였다. 여과에 의해 고체를 수집하였다. 여과는 느리고 완료하는데 24시간 이상 걸릴 수 있었다. IPA (2 × 10 L)로 세척하였다. 50℃에서 진공 오븐에서 물질을 건조시켜 표제 화합물 (3.117 kg, 91%)을 수득하였다.

제조예 10

6-클로로-2-메틸-5-[2-(4-피페리딜)에틸]피리미딘-4-아민, 디히드로클로라이드 염

6-아미노-2-메틸-5-[2-(4-피페리딜)에틸]피리미딘-4-올, 디히드로클로라이드 염 (3.167 kg, 10.2 mol) 및 옥시염화인 (30 L, 300 mol)을 가성 (10% NaOH) 스크러버를 통해 통기되는 50 L 반응기 중에서 질소 분위기 하에 합하였다. 85% 인산 (1 L, 8.5 mol)을 교반된 슬러리에 첨가하였다. 혼합물을 75℃의 반응기 자켓 온도를 사용하여 서서히 가열하였다. 약 55℃에서, 가스 배출이 발생하는 경우, 스크러버를 빙수조에서 냉각하였다. 가스 배출이 둔화되면, 혼합물을 50시간 동안 90 - 95℃에서 가열하고 이때 TLC 및 NMR 분석에 의하면 반응이 완료된 것으로 나타났다. 과잉 옥시염화인의 대부분을 진공 증류 (22 in Hg 진공 및 60℃ 내부 온도)에 의해 제거하여 증류액 중 20 L를 회수하였다. 혼합물을 20 - 25℃로 냉각한 다음에 톨루엔 (10 L)으로 희석하였다. 추가로 혼합물을 < 15℃로 냉각하고 온도를 < 30℃로 유지하면서 물 (1 L)로 서서히 켄칭하였다. 톨루엔 첨가 후 혼합물이 매우 농후해져서 교반하기 어려웠고 여기서 생성물 상은 점성 반고체로서 반응기의 바닥에 잔류하였다. 임의의 혼합을 달성하기 위해 교반기 블레이드를 상승시켰다. EtOH (10 L)를 혼합물에 첨가하고 25℃에서 약 18시간 동안 교반하였다. 이 시점에서 점성 반고체는 아직 완전히 분해되지 않았지만, 수동으로 탐침될 수 있도록 연화되었다. 또 다른 4 - 5시간 동안 격렬하게 교반하여 완전히 분해시켰다. 생성된 슬러리를 5 - 10℃로 냉각하고 여과에 의해 고체를 여과하고, MTBE (8 L)로 세척하여 습윤 생성물 (약 6 kg)을 수득하였다.

40℃에서 습윤 케이크를 MeOH (35 L)에서 용해시킴으로써 조 생성물을 재결정화하였다. 진공 증류에 의해 용액을 농축하고, 15 L의 용매를 제거하였다. IPA (35 L)를 첨가하고 진공 증류에 의해 슬러리를 농축하여 13 L의 용매를 제거하였다. 슬러리를 5 - 10℃로 냉각한 다음에 고체를 여과하고, IPA (2 L), 및 그 다음에 MTBE (8 L)로 세척하였다. 55℃에서 진공 오븐에서 고체를 건조시켜 표제 화합물을 회백색 고체 (2.77 kg, 82%)로서 수득하였다. C₁₂H₂₁Cl₃N₄에 대한 분석 계산치: C, 43.98; H, 6.46; Cl, 32.46; N, 17.10. 실측치: C, 43.63; H, 6.53; Cl, 32.16; N, 16.86.

제조예 11

tert-부틸 N-[(1S)-2-[4-[2-(4-아미노-6-클로로-2-메틸-피리미딘-5-일)에틸]-1-피페리딜]-1-메틸-2-옥소-에틸]카르바메이트

2개의 환저 플라스크 각각에 6-클로로-2-메틸-5-[2-(4-피페리딜)에틸]피리미딘-4-아민 히드로클로라이드 (12.50 g, 42.92 mmol), 디이소프로필에틸아민 (22.46 mL, 128.7 mmol) 및 DMF (100 mL)를 첨가하였다. 두 혼합물을 냉수조에서 냉각하고 5분 동안 교반하였다. 혼합물 각각에 [디메틸아미노(트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시)메틸렌]-디메틸-암모늄 헥사플루오로포스페이트 (17.95 g, 47.21 mmol) 및 (2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로판산 (8.93 g, 47.21 mmol)을 한 번에 첨가하였다. 혼합물을 90분 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 별개의 분별 깔때기에 물 (300 mL) 및 EtOAc (400 mL)와 함께 붓고, 진탕하고 분배하였다. 수성층을 EtOAc (3 × 300 mL)로 추출하고, 각각의 유기 층을 물 (4 × 250 mL), 포화 수성 NaCl (200 mL)로 세척하고 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고 감압하에 농축하였다. 합한 물질을 헥산 중 70% 내지 100% EtOAc로 용리시키면서 실리카겔 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 정제된 분획을 합하고 감압하에 농축하였다. 잔류물을 EtOAc (500 mL)로 희석하고 포화 수성 NH₄Cl (100 mL), 포화 수성 NaHCO₃ (100 mL), 물 (100 mL) 및 포화 수성 NaCl (100 mL)로 세척하였다. 유기물을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하여 표제 화합물을 백색 고체 (28.00 g, 76%)로서 수득하였다. LC-ES/MS m/z (³⁵Cl/³⁷Cl) 426.2/428.2 (M+1).

제조예 12

(2S)-2-아미노-1-[4-[2-(4-아미노-6-클로로-2-메틸-피리미딘-5-일)에틸]-1-피페리딜]프로판-1-온

tert-부틸 N-[(1S)-2-[4-[2-(4-아미노-6-클로로-2-메틸-피리미딘-5-일)에틸]-1-피페리딜]-1-메틸-2-옥소-에틸]카르바메이트 (15.78 g, 37.05 mmol)를 DCM (185 mL)에 용해시키고, 3분에 걸쳐 TFA (185 mL)를 적가 방식으로 첨가하고, 밤새 교반하였다. 반응물을 LCMS (낮은 pH)에 의해 분석하여 완전 반응을 확인하였다. 발열 혼합으로 인해 MeOH (400 mL)를 서서히 첨가하였다. 3개의 SCX 칼럼 (50 g)을 물 (20 mL) 및 그 다음에 MeOH (20 mL)로 미리세척하였다. 반응 혼합물을 세 등분으로 나누고 SCX 칼럼 상으로 균등하게 로딩하였다. 각각의 칼럼을 물 (40 mL) 및 MeOH (40 mL)로 세척하여 진공 플라스크에서 세척물을 수집하였다. SCX 칼럼으로부터의 목적 물질을 MeOH (60 mL) 중 2 N 암모니아로 청결한 용기 내로 용리시켰다. 용액을 함유하는 생성물을 합하고, 감압하에 농축하고, DCM-헥산 (1:1)으로 3회 공비혼합하고, 진공하에 배치하여 표제 화합물을 백색 발포체 (10.29 g, 84%)로서 수득하였다. LC-ES/MS m/z (³⁵Cl/³⁷Cl) 326.2/328.2 (M+1).

제조예 13

(2S)-2-아미노-1-[4-[2-(4-아미노-6-클로로-2-메틸-피리미딘-5-일)에틸]-1-피페리딜]프로판-1-온 히드로클로라이드 염

tert-부틸 N-[(1S)-2-[4-[2-(4-아미노-6-클로로-2-메틸-피리미딘-5-일)에틸]-1-피페리딜]-1-메틸-2-옥소-에틸]카르바메이트 (28.75 g, 67.49 mmol)를 1,4-디옥산 (143.7 mL)에 첨가하였다. 그 다음에 1,4-디옥산 (168.7 mL, 674.9 mmol) 중 4M 염화수소를 첨가하고, 10분 동안 교반하였다. MeOH (20 mL)를 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반하면서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압하에 농축하고, 고체를 디에틸 에테르 (200 mL)로 희석하고, 밤새 교반하였다. 물질을 여과하고, 디에틸 에테르 (2 × 25 mL)로 세정하였다. 물질을 15분 동안 흡입을 통해 건조시킨 다음에, 45℃에서 1시간 동안 진공하에 배치하여 표제 화합물을 조 백색 분말 (27.7 g)로서 수득하였다. LC-ES/MS m/z (³⁵Cl/³⁷Cl) 326.1/328.2 (M+1).

제조예 14

(2S)-2-아미노-1-[4-[2-(4-아미노-6-클로로-2-메틸-피리미딘-5-일)에틸]-1-피페리딜]프로판-1-온, 디히드로클로라이드 염

IPA (154 mL)를 50℃로 가열하고 발열 반응으로 인해 아세틸 클로라이드 (19.3 mL, 271 mmol)를 서서히 첨가하였다. 반응물을 10분 동안 50℃에서 교반한 다음에 tert-부틸 N-[(1S)-2-[4-[2-(4-아미노-6-클로로-2-메틸-피리미딘-5-일)에틸]-1-피페리딜]-1-메틸-2-옥소-에틸]카르바메이트 (21.0 g, 45.3 mmol)를 첨가하였다. LCMS (낮은 pH)를 통해 모니터링하면서 2시간 동안 반응물을 교반하였다. 반응물을 실온으로 냉각하고 디에틸 에테르 (386 mL)를 첨가하였다. 슬러리를 15분 동안 교반하였다. 고체를 여과하고, 물질이 흡습성이기 때문에 디에틸 에테르 (2 × 50 mL)로 민첩하게 세척하였다. 물질을 여과하고 1분 동안 여과를 통해, 그 다음에 밤새 50℃에서 진공 건조 오븐에서 건조시켜 표제 화합물을 백색 분말 (18.4 g)로서 수득하였다. LC-ES/MS m/z (³⁵Cl/³⁷Cl) 326.1/328.2 (M+1). 이온 크로마토그래피에 의한 반대 이온 분석은 디히드로클로라이드 염과 일치되었다.

실시예 1

N-[(1S)-2-[4-[2-(4-아미노-6-클로로-2-메틸-피리미딘-5-일)에틸]-1-피페리딜]-1-메틸-2-옥소-에틸]시클로프로판카르복스아미드

1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (281 mg, 2.03 mmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (430 mg, 2.21 mmol)를 무수 THF (12 mL) 중 시클로프로판카르복실산 (161 μL, 2.03 mmol), (2S)-2-아미노-1-[4-[2-(4-아미노-6-클로로-2-메틸-피리미딘-5-일)에틸]-1-피페리딜]프로판-1-온 (600 mg, 1.84 mmol)의 슬러리에 첨가하였다. 그 다음에 TEA (770 μL, 5.52 mmol)를 첨가하고 생성된 혼합물을 12시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (10 mL)로 희석하고, 규조토 상에서 여과하고, 여액을 진공 중에서 농축하였다. 생성된 잔류물을 질량-유도하(mass-guided) HPLC 역상 크로마토그래피 (아질런트(Agilent)^? 1200 LCMS 및 MSD 질량 분석계, 75 × 30 mm 페노메넥스 제미니-NX^?, 10 × 20 mm 가드(guard)를 갖는 5 μ 입자 크기 칼럼, 10 mM 중탄산암모늄 수용액 중 12-46% ACN, pH 10, 9분에 걸쳐 구배)에 의해 정제하여 표제 화합물을 무색 유리 (572 mg, 78%)로서 수득하였다. LC-ESMS m/z (³⁵Cl/³⁷Cl) 394.2/396.2 (M+H).

1- 프로판포스폰산 무수물을 이용한 대안적 절차

DCM (584 mL) 중 (2S)-2-아미노-1-[4-[2-(4-아미노-6-클로로-2-메틸-피리미딘-5-일)에틸]-1-피페리딜]프로판-1-온, 디히드로클로라이드 염 (107.4 g, 183.15 mmol)의 혼합물을 DIPEA (128 mL, 732.59 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 빙조에서 0℃로 냉각하고 시클로프로판카르복실산 (21.8 mL, 274.72 mmol)을 첨가하였다. 그 다음에 1-프로판포스폰산 무수물의 용액 (EtOAc 중 50% 용액, 174.8 g, 274.72 mmol)에 이어서 추가적 DIPEA (40 mL)를 첨가하여 반응 혼합물을 염기성이 되게 하였다. 밤새 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물 (1 L)로 세척하고 층을 분리하였다. 유기 부분을 MgSO₄ 상에서 건조시키고 진공 중에서 농축하여 조 생성물을 회백색 발포체로서 수득하였다. 물질을 실리카겔 (800 g, EtOAc 중 0-10% MeOH) 상에서 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 본질적으로 (2S)-2-아미노-1-[4-[2-(4-아미노-6-클로로-2-메틸-피리미딘-5-일)에틸]-1-피페리딜]프로판-1-온, 디히드로클로라이드 염 (77.9 g, 150.42 mmol)을 사용하여 동일한 절차에 따라 수득된 생성물 (51 g)의 또 다른 배치와 합하였다. 합해진 로트(lot)를 진공 중에서 농축하여 백색 고체 (114 g)를 수득하였다. 생성물은 농축 동안에 결정화하기 시작했다. 물질을 고온 EtOAc (200 mL)로 연화 처리하고, 냉각하고, 여과하여 표제 화합물 (111 g, 84%)을 수득하였다. LC-ES/MS m/z (³⁵Cl/³⁷Cl) 394.0/396.0 (M+1). 키랄 분석 (OD-H 칼럼, 25% MeOH/iPrNH₂, 5.0 mL/분, 100 bar, 35℃, 220 nm) >99.9% ee; T_R = 1.15분.

GOAT는 UAG를 AG로 전환시키는 주요한 효소이다. GOAT 및 그렐린의 역할의 검토를 위해 문헌 [Kristy M. Heppner et al, The ghrelin O- acyltransferase -ghrelin system: a novel regulator of glucose metabolism, Current Opinion in Endocrinology, Diabetes & Obesity 2011, 18:50-55]; [Phillip A. Cole et al., Glucose and Weight Control in Mice with a Designed Ghrelin OAcyltransferase Inhibitor, Science. 2010 December 17; 330(6011): 1689-1692. doi:10.1126/science.1196154], [Matthias H. Tschoep et al., Gastric O - acyl transferase activates hunger signal to the brain, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 April 29; 105(17): 6213-6214], 및 [Jesus Gutierrez, et al., Ghrelin oct anoyl ation mediated by an orphan lipid transferase, Proc Natl Acad Sci U S A., 2008 April 29, 105 (17): 6320-6325]을 참조한다.

GOAT의 역할은 GOAT 유전자가 없는 마우스에서 관찰된 표현형에 의해 지지된다. 따라서, GOAT의 억제는 순환 AG를 감소시키고 순환 UAG를 상승시키는 것으로 예상된다. 그 결과, 총 그렐린 (UAG + AG)에 대한 AG의 비가 GOAT 억제제 처리 후 감소된다.

시험관내 세포 유리 인간 GOAT 효소 검정

인간 GOAT 유전자 (수탁 번호: NM_001100916)를 pAN51 바큘로바이러스 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 바큘로바이러스 스톡을 판매회사, 인비트로겐(Invitrogen) (미국 캘리포니아주)에 의해 제공된 Bac-to-Bac 프로토콜에 따라 제조하였다. 5 mL의 인간 GOAT 바큘로바이러스 스톡을 2 L 삼각 플라스크 중 mL당 1 × 10⁶개 세포의 밀도에서 HyQ SFX-인섹트(Insect)™ 배지 (히클론(HyClone) 카탈로그 번호 SH30278.02) 중 500 mL Sf9 세포에 첨가하였다. 인간 GOAT 유전자 감염된 Sf9 세포를 갖는 플라스크를 48시간 동안 28℃에서 120 rpm에서 플레이트 셰이커 상에 놓았다. 48시간 인큐베이션 후, 세포를 4℃에서 10분 동안 1,000xg에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 수집하고 추가 가공을 위해 준비될 때까지 냉동고에서 -80℃에서 보관하였다.

효소 검정을 위한 GOAT 효소의 마이크로솜 막의 제조:

1 g 세포 펠렛을 9 mL 냉장한 균질화 완충제 (50 mM 트리스(Tris)-HCl, 250 mM 수크로스, pH 7.5로 조정되고, 0.2 ㎛ 밀리포어(Millipore) 필터를 통해 멸균 여과됨)에 현탁하였다. 세포 현탁액을 다운스(Dounce) 유리 균질화기에 옮겼다. 세포 펠렛을 얼음 상에서 40 스트로크로 균질화하였다. 균질액을 10분 동안 4℃에서 베크만(Beckman) 스윙 버킷(swing bucket) 로터에서 3,000 rpm에서 원심분리하여 비파손 세포를 제거하였다. 상청액을 수집하고 4℃에서 1시간 동안 40,000 xg에서 원심분리하였다. 생성된 막 펠렛을 다운스 유리 균질화기를 사용하여 균질화 완충제에 현탁하고 검정용으로 냉동고에서 -20℃에서 보관하였다. 인간 GOAT 효소 막 제제의 장기 보관을 위해, 현탁된 막을 -80℃ 냉동고에서 보관하였다.

인간 GOAT 효소 검정 프로토콜:

DMSO 중에서 시험 화합물을 제조하여 0.2 mM 스톡 용액을 형성시켰다. DMSO 중의 스톡 용액을 연속 희석하여 10-점 희석 곡선을 수득하였고 여기서 최종 화합물 농도는 96-웰 환저 플레이트에서 10 μM 내지 0.5 nM의 범위에 이른다. 검정 완충제 (50 mM 트리스 중 0.02% 트윈(Tween)™-20, pH 7.5/250 mM 수크로스/1 mg/mL BSA/10 mM EDTA) 중 효소 및 기질 용액을 제조하였다. 희석 화합물 (1 μL)을 상응하는 저 단백질 결합 384 웰 플레이트의 A 내지 N 열의 각각의 웰에 첨가하였다. 인간 데스아실-그렐린-비오틴 (CPC 사이언티픽 인크.(Scientific Inc.), 6.0 μM 최종), 옥타노일-CoA (시그마(Sigma), 60 μM 최종) 및 AG 특이적 항체 (WO 2006/091381) (1.0 ㎍/mL 최종)로 이루어진 인간 GOAT 기질 혼합물 (10 μL)을 화합물에 첨가하였다. 검정 완충제 (9 μL)에서 제조된 GOAT-His/sf9 효소 제제를 기질 및 시험 화합물을 함유하는 플레이트 각각의 웰에 첨가하여 결과적으로 0.01 ㎍/mL의 최종 농도를 생성시켜 반응을 개시하였다. 혼합물을 완만하게 회전하는 발진기 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 4 M 구아니딘 히드로클로라이드 (20 μL)를 모든 웰에 첨가하고, 혼합하고, 3시간 동안 인큐베이션하여 반응을 중단하였다.

3시간 동안 PBS (40 μL) (인비트로겐) 차단 완충제 중 2% 열-불활성화 FBS로 차단함으로써 ELISA 플레이트 (스트렙타비딘 스텍트라플레이트(STREPTAVIDIN SPECTRAPLATE)™ 384, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 제조하였다. ELISA 플레이트로부터 차단 완충제를 흡입하고 차단 완충제 (23 μL)를 칼럼 1-24, A-N 열에 첨가하였다. 아실그렐린 표준 곡선을 위해 O 및 P 열을 보류하였다. 반응 혼합물 (2 μL)을 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 2.5 pM에서 출발하여 0.2M 구아니딘 히드로클로라이드를 함유하는 차단 완충제 중 연속 2X 희석에 의해 10점 표준 곡선 (비오틴-표지된 옥타노일-그렐린)을 제조하였다. ELISA 플레이트 중 반응 혼합물 또는 비오틴-표지된 AG 표준을 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음 날, 플레이트를 세척 완충제 (0.1% 트윈™-20/PBS, 각각의 세척 주기에서 웰당 100 μL)로 3× 세척하였다. AG 특이적 항체 (WO 2006/091381) (차단 완충제 중 0.5 ㎍/mL의 25 μL)를 각각의 웰에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이전 단계와 유사하게, 플레이트를 세척 완충제로 3× 세척하였다. 차단 완충제 중 3,000×로 희석된 단백질 G-HRP (25 μL) (서던 바이오테크(Southern Biotech))를 첨가하고 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 이전 단계에서와 같이, 플레이트를 세척 완충제로 3× 세척하였다. TMB 시약 (25 μL) (커키가드 앤드 페리 라보라토리즈, 인크.(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.))을 각각의 웰에 첨가하고 20분 동안 방치하여 전개시키고 1 M 인산 (웰당 25 μL)으로 중단시켰다. 인비젼 멀티레이블 플레이트(Envision Multilabel Plate) 판독기를 사용하여 450 nm에서 플레이트를 판독하였다. AG 수준을 피팅된 표준 곡선에 대하여 계산하고 퍼센트 억제를 계산하였다. 10-점 억제 곡선을 플로팅하고 4-파라미터 로지스틱 방정식으로 피팅하여 액티버티 베이스(Activity Base) (ver. 7.3.2.1)를 사용하여 IC₅₀ 값을 수득하였다.

본질적으로 상기 기재된 바와 같은 프로토콜에 따라, 실시예 1의 화합물은 약 192 nM ± 73, (n = 5)의 IC₅₀을 나타냈다. 데이터는 실시예 1의 화합물이 시험관내에서 정제된 GOAT 효소 활성을 억제한다는 것을 입증하였다.

화합물 처리군에서 총 그렐린에 대한 AG의 비에서의 변화와 비히클 처리군에서의 변화를 비교하는 것은 GOAT 효소에 의해 AG로의 UAG의 동적 프로세싱에 기인하는, 생체내에서 GOAT 효소 억제의 정도를 반영한다. 본원에서의 생체내 약력학적 연구에서, 비히클 및 화합물 처리군에서 혈장 및 위에서의 AG 및 UAG의 수준을 구체적으로 이들 두 분석물에 대해 ELISA에 의해 측정하였다. 각각의 샘플의 총 그렐린 수준은 이들 ELISA 측정에 의한 AG와 UAG의 합으로서 계산되었다. 총 그렐린에 대한 AG의 비는 동일한 샘플에서 총 그렐린의 수준에 의해 나눠진 각각의 샘플 중의 AG의 수준에 의해 정의된다. 비히클 처리군에서의 총 그렐린에 대한 AG의 비, AG 및 UAG의 수준을 산출하고 이를 100%로서 설정하였다. 그 다음에 화합물 처리군에서의 이들 파라미터의 상대적 변화를 산출하여 시험 화합물의 유효성을 측정하였다.

GOAT 억제제에 관한 생체내 용량 의존성 3일 BID 연구 :

동물 및 처리:

할란(Harlan) (인디애나주 인디애나폴리스)으로부터 9주 연령의 수컷 C57BL/6 마우스를 구매하였다. 12시간 명/암 주기 (2200 시간 조명)로 온도-제어 (24℃) 설비에 마우스를 개별적으로 수용하고, 표준 설치류 급식 (식이 2014, 할란) 및 물을 자유롭게 이용하도록 하였다. 전형적으로, 마우스가 연구시 10-13주의 연령인 경우 이들을 사용하였다. 실험 0일에, 마우스를 처리군 (N=7/군)으로 무작위화하여 각각의 군이 유사한 평균 체중을 가졌다. 1일 및 2일에, 동물을 오전 7시 및 오후 7시에 경구 위관영양에 의해 다양한 투여량으로 현탁액으로서 비히클에서 제조된 시험 화합물 또는 비히클 (1% 히드록시에틸셀룰로스, 0.25% 트윈 80, 0.05% 소포제)로 처리하였다. 3일에, 동물을 금식시키고, 이들을 청결한 케이지로 옮기고 경구 위관영양에 의해 오전 8시에 다시 시험 화합물 또는 비히클을 투여하였다. 오후 1시에 그 동일한 날에, 단두에 의해 동물을 희생시켜 혈액을 수집하였다. 혈액 수집 및 혈장 처리의 세부 사항은 이하에 혈액 수집 및 혈장으로부터의 그렐린의 추출 섹션을 참조한다.

혈액 수집:

대략 600 μL 혈액을 600 μL (V _보존제로서 정의됨)의 새로-제조된 보존제 (4 mM 페파블록(PEFABLOC)? [4-(2-아미노에틸) 벤젠술포닐 플루오라이드 히드로클로라이드], 72 mM NaCl, 58 mM NaF, 0.032 N 염산, pH 3.0)를 함유하는 미리 칭량된 EDTA 관 내로 수집하고 즉시 혼합하였다. 관을 다시 칭량하고 얼음 상에서 유지하였다. 이러한 혈액 수집 절차를 사용하여 각각의 샘플의 정확한 혈액 부피를 정확히 측정하기 위해, 각각의 마우스에 대한 혈액의 중량을 하기 방정식을 사용하여 산출하였다:

혈액의 중량 = (혈액 함유 관의 중량 + 보존제) - (보존제를 함유하는 관의 중량)

혈액 부피 (V _혈액 ) = (혈액의 중량) / 1.06

설치류 혈액의 밀도는 1.06 g/mL로서 추정됨을 유념한다.

혈액 수집 후 15분 내에, 샘플을 8분 동안 4℃에서 5000 rpm에서 원심분리하였다. 혈장 (650 μL)을 1 N 염산 (65 μL)을 함유하는 5 mL 유리 관으로 제거하고, 혼합하고 얼음 상에서 유지하였다.

SEP -PAK? 칼럼에 의한 그렐린 추출:

AG 및 UAG를 SEP-PAK?_C₁₈ 칼럼을 사용하여 혈장으로부터 추출하여 ELISA를 수행하기 전에 간섭을 제거하였다. SEP-PAK?_C₁₈ 칼럼에 의한 AG 및 UAG 펩티드의 고체상 추출은 진공 매니폴드 (워터스 코포레이션(Waters Corp)) 상에서 또는 연동 펌프를 사용하여 수행할 수 있었다. 샘플 SEP-PAK? 칼럼_추출 절차를 각각의 개별 마우스로부터 수득된 혈장 샘플에 독립적으로 적용하였다. 일반적 추출 프로토콜은 다음과 같이 기재된다.

SEP-PAK? 칼럼 추출의 전체 프로토콜에 사용된 모든 용액은 빙냉 조건에 있어야 한다. SEP-PAK?_칼럼 (WAT054960, 워터스 코포레이션, 매사추세츠주 밀포드)을 99.9% ACN/0.1% TFA (100 mL ACN/0.1 mL TFA의 1 mL 용액)으로 습윤화하였다. 압력을 적용하여 유량을 약 1 mL/분으로 조정하여 칼럼 층으로부터 액체를 제거하나, 칼럼이 어떤 시점에서도 메마르게 하지 않도록 하였다. 일단 칼럼으로부터 액체가 제거되면, 압력을 중단하였다. 칼럼을 3% ACN/0.1% TFA (97 mL 물, 3 mL ACN, 0.1 mL TFA의 1 mL)로 평형화하였다. 압력을 적용하여 유량을 약 1 mL/분으로 조정하여 칼럼 층으로부터 액체를 제거하나, 칼럼이 어떤 시점에서도 메마르게 하지 않도록 하였다. 대략 650 μL 산성화 혈장 (V _{칼럼에 첨가된 혈장} 으로서 정의됨)을 1.4 mL 빙냉 0.1% TFA로 희석하였다. 이전 단계로부터의 모든 희석된 산성화 혈장을 칼럼 상에 로딩하였다. 압력을 적용하여 유량을 약 0.5 mL/분으로 조정하여 샘플이 칼럼을 통과하도록 하고 그렐린 펩티드가 칼럼의 수지 상에 흡수되도록 하였다. 칼럼을 메마르게 하지 않도록 하였다. 3% ACN/0.1% TFA (97 mL 물, 3 mL ACN, 0.1 mL TFA의 0.9 mL)로 세척하였다. 압력을 적용하여 유량을 약 1 mL/분으로 조정하여 칼럼 층으로부터 액체를 제거하나 칼럼이 메마르게 하지 않도록 하였다. 세척을 2회 더 반복하였다. 60% ACN/0.1% TFA (40 mL 물, 60 mL ACN, 0.1 mL TFA의 1 mL)로 용리시켰다. 수집관을 각각의 칼럼 밑에 놓고, 압력을 적용하여 유량을 약 0.5 mL/분으로 조정하여 액체를 강행 통과시키고 용리액을 수집관 내로 수집하였다. 샘플을 드라이아이스 상에서 즉시 동결시켰다. 샘플을 고속 진공기 (모델 번호 SC110A, 사반트(Savant))에서 동결건조시키고 ELISA 검정이 수행될 때까지 -20℃에서 보관하였다.

그렐린에 대한 ELISA 검정:

96-웰 멀티-어레이(MULTI-ARRAY)? MSD? 플레이트 (메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery), 메릴랜드주 게이더스버그, 카탈로그 번호 L15XA-3)를 PBS (인비트로겐) 중 그렐린의 아실 및 비아실화 형태 둘 다의 중간-영역을 인식하는, 1 ㎍/mL의 항체 100 μL (WO 2005/026211 및 WO2006/019577)로 코팅하였다. 플레이트의 측면을 탭핑하여 웰이 반드시 피복되게 하고, 접착 플레이트 밀봉기로 밀봉하고, 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 내용물을 폐기하고 PBS (25 μL) 중 블록커(Blocker)™ 카세인(Casein) (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 일리노이주 록퍼드, 카탈로그 번호 37528)을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 재밀봉하고 1시간 동안 실온에서 플레이트 셰이커 상에 놓았다.

PBS (각각의 샘플에 대해 400 μL, 이 부피는 V _재구성 으로서 정의된다) 중 블록커™ 카세인 중 SEP-PAK? C₁₈ 칼럼 추출로부터의 동결건조된 보존된 혈장 샘플을 재구성하고, 보텍스 혼합기에서 잘 혼합하고 45-60분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 플레이트로부터 내용물을 폐기하고 25 μL에서 재구성된 혈장 샘플을 각각의 웰에 첨가하였다. 8000 pg/mL로 시작하고 8개의 총 농도를 위해 1:4 연속 희석을 수행하여 아실그렐린 및 비아실화 그렐린 표준 곡선을 제조하였다. 이중으로 제조된 표준을 각각의 웰 중 25 μL로 차단된 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 2시간 동안 플레이트 셰이커 상에서 실온에서 인큐베이션하였다.

플레이트 내용물을 폐기하고 0.1% 트윈™ 20 (150 μL) (PBS-T)을 포함한 PBS로 3회 세척하였다. MSD 술포-태그(SULFO-TAG)^™ (메소 스케일 디스커버리)로 표지된 아실그렐린 특이적 항체 (WO 2006/091381) 또는 비아실화 그렐린 특이적 항체 (WO 2006/055347)를 2차 항체 용액으로 명명된, 0.05% 트윈™ 20을 함유하는 0.2 × 블록커 카세인 중 0.05 ㎍/mL로 희석하였다. 최종 세척액을 제거하고 AG 또는 UAG를 특이적으로 인식하는 2차 항체 용액 (각각의 웰에 25 μL)을 첨가하였다. 플레이트를 재밀봉하고 플레이트 셰이커 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 최종적으로 PBS-T (150 μL/웰)로 다시 3× 세척하였다.

최종 세척액을 폐기하고 1× MSD 리드(Read) 완충제 (150 μL/웰)로 대체하였다. MSD? 섹터(SECTOR)? 이미저(Imager) 6000 분석기 (메소 스케일 디스커버리)를 사용하여 플레이트 상에 전극에 대해 결합된 MSD 술포-태그™ 표지의 활성화에 의해 발생된 전기화학발광 신호를 판독하였다. MSD? 소프트웨어에 의해 발생된 각각의 표준 곡선을 기초로 아실그렐린 또는 비아실화 그렐린의 농도를 계산하였다. 측정된 아실그렐린 또는 비아실화 그렐린 수준에 희석률을 곱함으로써 각각의 샘플에 대한 실제 혈장 농도를 측정하였다. 각각의 혈장 샘플에 대한 희석률은 하기 방정식으로 산출하였다.

결과:

3일 동안 실시예 2의 화합물의 투여는 0.3, 1, 3, 및 10 mg/kg에서 각각, 혈장 AG를 -1%, 5%, 45%, 및 48% 감소시켰고, UAG를 2.24, 2.82, 2.53, 및 2.89배 증가시켰다 (이하에 표로 만든 결과). 0.3, 1, 3, 및 10 mg/kg에서의 투여 결과 비히클-처리 대조군 동물과 비교시 총 그렐린 비에 대한 AG가 각각 39, 54, 71 및 77% 감소되었다. 이들 결과는 실시예 1의 화합물이 생체내에서 GOAT 녹-아웃 마우스에서 나타난 바와 같이, 순환에서 AG 생성을 억제하고 UAG를 상승시킨다는 것을 입증하였다.

Claims (18)

1. 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
   

   
2. 제1항에 있어서, 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
   

   
3. 제1항에 있어서, 하기 화학식의 화합물.
   

   
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6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 체중 증가의 감소를 필요로 하는 환자에서 체중 증가를 감소시키기 위한 제약 조성물.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 체중의 재증가의 감소를 필요로 하는 환자에서 체중의 재증가를 감소시키기 위한 제약 조성물.
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 비만의 치료를 필요로 하는 환자에서 비만을 치료하기 위한 제약 조성물.
9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 2형 당뇨병의 치료를 필요로 하는 환자에서 2형 당뇨병을 치료하기 위한 제약 조성물.
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