CN105636948B - 作为葛瑞林o‑酰基转移酶抑制剂的被取代的哌啶基‑乙基‑嘧啶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新颖的GOAT抑制剂和它们的盐及其药物组合物。

Description

作为葛瑞林O-酰基转移酶抑制剂的被取代的哌啶基-乙基- 嘧啶
本发明涉及可用于抑制葛瑞林O-酰基转移酶(GOAT)的化合物、用于治疗与GOAT活性有关的疾病的药物组合物和方法。
GOAT属于膜结合的O-酰基转移酶(MBOAT)家族的酶。它通过将脂肪酸转移至脱酰基葛瑞林肽的Ser3残基而将脱酰基-葛瑞林(也被称作未酰化的葛瑞林或UAG)转化成生物活性形式，即酰基-葛瑞林(AG)。已经证实酰基-葛瑞林会在人类中和在啮齿类动物中增加食物摄入和增加体脂肪率。还已经证实AG在人类中的输注会抑制葡萄糖诱导的胰岛素分泌。已经证实葛瑞林基因的消除会增强胰岛素释放以预防或改善高脂肪饮食饲喂的ob/ob小鼠的葡萄糖不耐受性。
肥胖和糖尿病的流行以及对肥胖和糖尿病的当前治疗的可变有效性和应答，要求患者可得到更多的治疗选择。认为GOAT抑制剂在肥胖的治疗中是一种有用的药剂。进一步认为，GOAT抑制剂也可以用于减少重量增加或重量恢复(由饮食和/或锻炼、被设计成减少重量增加或治疗肥胖的其它治疗药物试剂或程序引起)。类似地，GOAT抑制剂单独地或与II型糖尿病的其它治疗组合地可以用于治疗II型糖尿病。
本发明提供了一种化合物，其为GOAT抑制剂。具体地，本发明提供了下式的化合物或其药学上可接受的盐
。
本发明还提供了一种化合物，其为下式的GOAT抑制剂
。
本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在另一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的化合物和一种或多种其它治疗剂。
本发明的另一个方面提供了一种减少重量增加或重量恢复或治疗II型糖尿病或肥胖的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用本发明的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明也提供了用于治疗中、尤其是用于减少重量增加或重量恢复或治疗II型糖尿病或肥胖的本发明的化合物或其药学上可接受的盐。此外，本发明提供了本发明的化合物或其药学上可接受的盐在药物制备中的用途，所述药物用于减少重量增加或重量恢复或治疗II型糖尿病或肥胖。
本发明的化合物在宽剂量范围内是通常有效的。例如，每天的剂量落在约0.03至约150 mg/Kg体重的范围内。在一些情况下，低于前述范围下限的剂量水平可能已经足够，而在其它情况下，仍可以在维持有利的益处/风险比(profile)的同时使用更大剂量，且因此以上剂量范围无意以任何方式限制本发明的范围。应该理解，化合物的实际施用量将由医师考虑到有关情况来确定，所述情况包括要治疗的病症、所选择的给药途径、施用的一种或多种实际化合物、个体患者的年龄、重量和应答、以及患者的症状的严重程度。
本文中使用的术语“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示抑制、减慢、终止或逆转现有症状、病症或障碍的进展或严重程度。
本文中使用的术语“减少重量增加”表示减少患者的重量的增加。术语“减少重量恢复”表示减少在重量减轻以后经历重量反弹的患者的重量增加。重量恢复可以是由于重量减轻停止以后的反弹效应，所述重量减轻通过饮食、锻炼、行为矫正或经批准的疗法实现。为了避免疑义，本文中使用的重量增加或重量恢复表示由食物摄入或饮食习惯诱导的重量增加或重量恢复，且不表示非食品相关的重量增加诸如流体的积累，由水潴留、肌肉质量或炎症引起的重量。
本发明的化合物可以反应以形成药学上可接受的盐。药学上可接受的盐和用于制备它们的常见方法是本领域众所周知的。参见，例如，P. Stahl, 等人. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 第2次修订版(Wiley-VCH,2011); S.M. Berge, 等人, “Pharmaceutical Salts,” Journal of Pharmaceutical Sciences, 第66卷, 第1期, 1977年1月。
技术人员会明白，本发明的化合物或其药学上可接受的盐包含含有至少一个手性中心的核心：
尽管本发明预见到所有单一对映异构体、以及所述化合物的对映异构体的混合物（包括外消旋体），本发明的优选化合物由下式表示：
或其药学上可接受的盐。
本发明的化合物优选地配制为通过多种途径施用的药物组合物。这样的药物组合物和制备它们的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro等人编,第21版, Mack Publishing Co., 2005)。更特别优选的是这样的药物组合物：其包含由下式表示的本发明的化合物
或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂。
从手性试剂开始或通过立体选择性的或立体特异性的合成技术，可以制备单一对映异构体或非对映异构体。可替换地，在本发明的化合物的合成中的任何方便点，通过标准手性色谱或结晶技术可以从混合物中分离单一对映异构体或非对映异构体。本发明的化合物的单一对映异构体和非对映异构体是本发明的优选实施方案。
本领域众所周知，用于治疗糖尿病和/或肥胖的药剂可以与用于治疗糖尿病和/或肥胖的其它药剂组合。本发明的化合物或其药学上可接受的盐可以与糖尿病或肥胖的其它有效治疗(一种或多种)同时地或依次地共同施用。在经批准的医疗程序（诸如治疗肥胖症的外科手术，例如，胃分流术或可调节的胃囊带术程序）以后，可以同时地或依次地施用单独的或与其它有效治疗(一种或多种)组合的本发明的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明还包括可用于合成本发明的化合物的中间体和方法。
另外，在以下方案中描述的中间体可以含有许多氮保护基。所述可变保护基在每次出现时可以相同或不同，这取决于特定反应条件和要进行的特定转化。保护和去保护条件是技术人员众所周知的。参见，例如，Greene和Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, (T. Greene和P. Wuts编, 第2版. 1991)。
制备和实施例
下述制备和实施例进一步例证本发明，且代表本发明的化合物的典型合成。试剂和起始原料是容易得到的，或可以由本领域普通技术人员容易地合成。应当理解，所述制备和实施例作为举例说明而不是限制来阐述，并且本领域普通技术人员可以做出多种修改。
本发明的化合物的R或S构型可以通过标准技术诸如X-射线分析和与手性-HPLC保留时间的关联来确定。通常使用MDL Accelrys®Draw 4.0.NET版中的IUPAC命名性能执行下述制备和实施例的命名。
本文中使用的以下术语具有指定的含义：“ACN”表示乙腈；“BSA”表示牛血清白蛋白；“DCM”表示二氯甲烷；“DIPEA”表示N,N-二异丙基乙胺；“DMF”表示二甲基甲酰胺；“DMSO”表示二甲基亚砜；“EDTA”表示乙二胺四乙酸；“EtOAc”表示乙酸乙酯；“EtOH”表示乙醇；“FBS”表示胎牛血清；“HRP”表示辣根过氧化物酶；“IC50”表示产生最大应答的50%的药剂的浓度；“IPA”表示异丙醇；“MeOH”表示甲醇；“MTBE”表示甲基叔丁基醚；“PBS”表示磷酸盐缓冲盐水；“RT”表示室温；“TEA”表示三乙胺；“TFA”表示三氟乙酸；“TR”表示保留时间；“THF”表示四氢呋喃；且“TMB”表示3,3',5,5'- 四甲基联苯胺。
LC-MS条件(低pH)：柱：Phenomenex Gemini NX C18 2.1×50 mm 3.0 m；梯度: 5-100%B保持3 min，然后100%B保持0.75 min；柱温度: 50℃±10℃；流速: 1 mL/min；溶剂A:含有0.1%甲酸的去离子水；溶剂B: 含有0.1%甲酸的ACN。
制备1
6-氯-2-甲基嘧啶-4-胺
在室温给5 L钢压力容器(高压釜)装入4,6-二氯-2-甲基嘧啶(400 g, 2.45 mol)和氢氧化铵(2.8 L)。将反应物加热至90℃保持5 h。将反应混合物冷却至室温，然后穿过布氏漏斗过滤固体。将滤饼用水(200 mL)和己烷(200 mL)洗涤，然后在真空下干燥以得到作为白色固体的标题化合物(290 g, 82%)。LC-ES/MS m/z 144.0 (M+1)。
制备2
6-氯-5-碘-2-甲基嘧啶-4-胺
在配备机械搅拌器的20 L圆底烧瓶中组合6-氯-2-甲基嘧啶-4-胺(708 g, 4.93mol)和MeOH (7.08 L)。冷却至0-5℃。使用加料漏斗历时1 h加入溶解在MeOH (6 L)中的一氯化碘(4.806 kg, 29.6 mol)。将反应混合物温热至室温并在室温搅拌16 h。将反应混合物冷却至0-5℃并加入亚硫酸钠(46 L, 20%水溶液)。将得到的固体过滤并用水(2 L)洗涤，随后用己烷(3 L)洗涤。在真空下干燥固体，得到作为白色固体的标题化合物(1061 g,80%)。LC-ES/MS m/z 269.9 (M+1)。
制备3
4-[2-(4-氨基-6-氯-2-甲基-嘧啶-5-基)乙炔基]哌啶-1-甲酸叔丁酯
将6-氯-5-碘-2-甲基-嘧啶-4-胺(20 g, 74.22 mmol)、4-乙炔基-哌啶-1-甲酸叔丁酯(18.64 g, 89.06 mmol)和二异丙胺(10.44 mL, 74.22 mmol)溶解在3-颈烧瓶内的THF (200 mL)中。交替地，将烧瓶抽真空并充入氮气3次。将双(三苯基膦)氯化钯(II)(2.63 g, 3.71 mmol)和碘化亚铜(I) (0.713 g, 3.71 mmol)加入溶液中。将混合物加热至50-55℃之间保持16 h。将混合物冷却至室温并加入更多的双(三苯基膦)氯化钯(II)(1.31 g, 1.86 mmol)、碘化亚铜(I) (0.356 g, 1.86 mmol)和4-乙炔基-哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.55 g, 7.42 mmol)。将混合物加热至60℃保持3.5 h。将混合物冷却至室温并在减压下浓缩。将所述物质用DCM (300 mL)稀释并用饱和氯化铵水溶液(100 mL)、水(100 mL)和饱和氯化钠水溶液(100 mL)洗涤。将溶液经MgSO4干燥，过滤，并在减压下浓缩。使用硅胶色谱法(800 g硅胶柱)，用20%至100%的EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，纯化残余物。将纯化的级分浓缩，得到作为淡橙色粉末的标题化合物(22.6 g, 86%)。LC-ES/MS m/z (35Cl/37Cl) 351.2/353.1 (M+1)。
制备4
4-[2-(4-氨基-6-氯-2-甲基-嘧啶-5-基)乙基]哌啶-1-甲酸叔丁酯
在EtOH (81 mL)和EtOAc (40 mL)中组合4-[2-(4-氨基-6-氯-2-甲基-嘧啶-5-基)乙炔基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(4.30 g, 12.26 mmol)和氧化铂(IV) (0.139 g, 0.61mmol)。交替地，将烧瓶抽真空并使用氢气球充入氢气，并在室温搅拌8 h。小心地监测反应从而避免分子中氯化物的除去产生的潜在副产物。注意到所述产物比起始的炔烃更可溶于溶剂混合物中。将混合物穿过硅藻土过滤，用MeOH冲洗。在减压下浓缩溶液。在烧瓶中加入硅胶(silica)、1-丙硫醇(4 g, 载荷= 1.28 mmol/g, 得自SILICYCLE®的SILIABOND®Thiol) (为了从先前的偶联反应除去残余钯)和EtOAc (300 mL)。将所述物质在室温搅拌3天。过滤固体并在减压下浓缩滤液。如下重复对得到的残余物的氢化。给含有残余物的烧瓶装入氧化铂(IV) (0.139 g, 0.61 mmol)、EtOH (81 mL)和EtOAc (40 mL)。交替地，将烧瓶抽真空并使用氢气球装入氢气，并在室温搅拌8 h。穿过硅藻土过滤，用MeOH冲洗，并在减压下浓缩滤液。如下重复对得到的残余物的氢化。给含有残余物的烧瓶装入氧化铂(IV)(0.139 g, 0.61 mmol)、EtOH (81 mL)和EtOAc (40 mL)。交替地，将烧瓶抽真空并使用氢气球装入氢气，并在室温搅拌8 h。穿过硅藻土过滤，用MeOH冲洗。在减压下在硅胶(20 g)上浓缩滤液。使用硅胶色谱法用70%至100%EtOAc在己烷类中的溶液(120 g柱)洗脱，纯化所述物质。合并纯化的级分并在减压下浓缩。将残余物用DCM和己烷类稀释并在减压下浓缩3次。将所述物质放在真空下，得到作为白色固体的标题化合物(3.20 g, 73%)。LC-ES/MS m/z(35Cl/37Cl) 355.2/357.2 (M+1)。
制备5
6-氯-2-甲基-5-[2-(4-哌啶基)乙基]嘧啶-4-胺, 盐酸盐
将4-[2-(4-氨基-6-氯-2-甲基-嘧啶-5-基)乙基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(29.00 g,81.72 mmol)溶解在1,4-二氧杂环己烷(145 mL)中，并加入4M的氯化氢在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(204.2 mL, 817.1 mmol)。将溶液在室温搅拌18 h。在减压下浓缩混合物，在乙醚(250 mL)中制浆，过滤，并在真空下干燥得到的固体，得到作为粗制白色固体的标题化合物(29 g)。LC-ES/MS m/z (35Cl/37Cl) 255.2/257.2 (M+1)。
6-氯-2-甲基-5-[2-(4-哌啶基)乙基]嘧啶-4-胺的替代路线(制备6-10)
制备6
4-(2-甲基磺酰氧基乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
在氮气氛下在50 L反应器中组合4-(2-羟基乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(4.720 kg,20.6 mol)与DCM (40 L)和TEA (3020 mL, 21.63 mol)。将溶液冷却至约0℃，并在保持反应温度低于10℃的同时缓慢地加入甲磺酰氯(2.478 kg, 21.63 mol)在DCM (5 L)中的溶液。加入结束后，将混合物在15℃搅拌18 h，在此时，TLC (1:1, 己烷:EtOAc)显示没有起始原料剩余。将混合物用水(30 L)洗涤，并允许相分离。将有机相浓缩成固体。将固体在MTBE(6 L)中制浆，通过过滤进行收集，并在真空干燥箱中在50℃干燥，得到作为白色固体的标题化合物(5.67 kg, 91%)。
制备7
4-(3-氰基-4-乙氧基-4-氧代-丁基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
。
在氮气氛下在50 L反应器中组合4-(2-甲基磺酰氧基乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(5.26 kg, 17.1 mol)、氰基乙酸乙酯(7 kg, 62 mol)、21%的乙醇钠在EtOH中的溶液(8.25L, 24.75 mol)和EtOH (35 L)。将混合物在35 - 40℃加热18 h，在此时，NMR分析显示20%的甲磺酸酯剩余。继续将混合物在35 - 40℃加热24 h，在此时，NMR分析显示仅少量的甲磺酸酯。将反应物缓慢地冷却至室温并历时30 min加入冰醋酸(1422 mL, 22.68 mol)。使用真空蒸馏浓缩混合物，然后在水(25 L)和EtOAc (35 L)之间分配。分离各层，并将水相用EtOAc (10 L)萃取。将有机部分合并，用盐水(15 L)洗涤，并浓缩成红色油。将所述油用硅胶色谱法(75 kg硅胶, 65-250目)纯化，用己烷(40 L)、然后用20%EtOAc/己烷洗脱以提供作为30%氰基乙酸乙酯/70%期望产物的级分(7.8 kg)。将所述物质通过在100℃和210毫托真空刮膜蒸馏进行浓缩，收集非挥发性级分，得到标题化合物(4.54 kg, 82%)。
制备8
4-[2-(4-氨基-6-羟基-2-甲基-嘧啶-5-基)乙基]哌啶-1-甲酸叔丁酯
在氮气氛下在22 L反应器中组合4-(3-氰基-4-乙氧基-4-氧代-丁基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(2.18 kg, 6.73 mol)、盐酸乙脒(1.27 kg, 13.46 mol, 95%测定) [注：通过在甲苯(10 L)中制浆2次然后在真空下汽提至干燥，预干燥所述盐酸乙脒]、21%的乙醇钠在EtOH中的溶液(6.73 L, 20.19 mol)和EtOH (10 L)。将反应物回流加热42 h。将反应物用冰醋酸(1.2 L, 20.86 mol)调至约pH = 5。通过在旋转蒸发器上真空蒸馏，除去EtOH。将得到的固体在水(6 L)中制浆，然后将固体通过过滤进行收集，用另外的水(2 L)洗涤。将固体在真空干燥箱中在50℃干燥，得到标题化合物(1.72 kg, 76%)。1H NMR (500 MHz, CD3OD)δ 4.83 (s, 3H)；4.05 (d, 2H), 2.75 (bs, 2H), 2.39 (m, 2H), 2.22 (s, 3H), 1.78(d, 2H), 1.43 (m, 1H) 1.42 (s, 9H), 1.40 (m, 2H), 1.38 (m, 2H)。使用4-(3-氰基-4-乙氧基-4-氧代-丁基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(2.36 kg)基本上如所述地重复所述过程，得到标题化合物(2.01 kg, 82%)。
制备9
6-氨基-2-甲基-5-[2-(4-哌啶基)乙基]嘧啶-4-醇, 二盐酸盐
在氮气氛下在50 L反应器中组合4-[2-(4-氨基-6-羟基-2-甲基-嘧啶-5-基)乙基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(3.73 kg, 11.09 mol)和IPA。在搅拌下历时3 h加入12 N盐酸(3.05 L, 36.6 mol)。将混合物在50℃加热16 h，形成稠浆。在此时，NMR分析显示没有BOC基团剩余。将反应混合物冷却至20−25℃，用THF (12 L)稀释。将固体通过过滤进行收集。所述过滤是缓慢的，可能需要超过24 h才能完成。用IPA (2×10 L)洗涤。将所述物质在真空干燥箱中在50℃干燥，得到标题化合物(3.117 kg, 91%)。
制备10
6-氯-2-甲基-5-[2-(4-哌啶基)乙基]嘧啶-4-胺, 二盐酸盐
在氮气氛下在50 L反应器中组合6-氨基-2-甲基-5-[2-(4-哌啶基)乙基]嘧啶-4-醇, 二盐酸盐(3.167k g, 10.2 mol)和磷酰氯(30 L, 300 mol)，所述反应器通过苛性(10%NaOH)洗涤器排气。将85%磷酸(1 L, 8.5 mol)加入搅拌 的浆中。使用75℃的反应器夹套温度缓慢地加热混合物。在约55℃，当发生排气时，在冰水浴中冷却洗涤器。当排气减慢时，将混合物在90 - 95℃加热50 h，在此时，TLC和NMR分析显示反应结束。通过真空蒸馏(22在Hg真空中和60℃内部温度)除去大部分多余的磷酰氯，以在馏出液中回收20 L。将混合物冷却至20 - 25℃，然后用甲苯(10 L)稀释。将混合物进一步冷却至< 15℃，并缓慢地用水(1 L)淬灭，保持温度< 30℃。加入甲苯以后，混合物变得非常稠且难以搅拌，产物相作为粘稠的半固体保留在反应器的底部。升高搅拌器叶片以便实现任何混合。将EtOH (10 L)加入混合物中并在25℃搅拌约18 h。在此时，粘稠的半固体仍未完全消化，但是软化，使得它们可以手工地探测。剧烈搅拌另外4 - 5 h以完全消化。将得到的浆冷却至5 - 10℃并将固体通过过滤进行收集，用MTBE (8 L)洗涤，以得到湿产物(约6 kg)。
通过在40℃将湿滤饼溶解在MeOH (35 L)中，使粗产物重结晶。通过真空蒸馏浓缩溶液，除去15 L溶剂。加入IPA (35 L)并通过真空蒸馏浓缩浆以除去13 L溶剂。将浆冷却至5 - 10℃，然后过滤固体，用IPA (2 L)、然后用MTBE (8 L)洗涤。将固体在真空干燥箱中在55℃干燥，得到作为灰白色固体的标题化合物(2.77 kg, 82%)。C12H21Cl3N4的分析计算值：C, 43.98; H, 6.46; Cl, 32.46; N, 17.10。实测值：C, 43.63; H, 6.53; Cl, 32.16;N, 16.86。
制备11
N-[(1S)-2-[4-[2-(4-氨基-6-氯-2-甲基-嘧啶-5-基)乙基]-1-哌啶基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯
在两个圆底烧瓶中的每一个中，加入6-氯-2-甲基-5-[2-(4-哌啶基)乙基]嘧啶-4-胺盐酸盐(12.50 g, 42.92 mmol)、二异丙基乙胺(22.46 mL, 128.7 mmol)和DMF (100mL)。将两种混合物在冷水浴中冷却并搅拌5 min。向每种混合物中一次性加入[二甲基氨基(三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)亚甲基]-二甲基-六氟磷酸铵(17.95 g, 47.21 mmol)和(2S)-2-(叔-丁氧基羰基氨基)丙酸(8.93 g, 47.21 mmol)。将混合物在室温搅拌90 min。将混合物与水(300 mL)和EtOAc (400 mL)一起倒入单独的分液漏斗中，摇动并分配。将水层用EtOAc (3×300 mL)萃取，将各个有机层用水(4×250 mL)、饱和NaCl水溶液(200 mL)洗涤，并经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过硅胶色谱法纯化合并的物质，用70%至100%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱。将纯化的级分合并并在减压下浓缩。将残余物用EtOAc(500 mL)稀释并用饱和NH4Cl水溶液(100 mL)、饱和NaHCO3水溶液(100 mL)、水(100 mL)和饱和NaCl水溶液(100 mL)洗涤。将有机物经MgSO4干燥，过滤，并在减压下浓缩，得到作为白色固体的标题化合物(28.00 g, 76%)。LC-ES/MS m/z (35Cl/37Cl) 426.2/428.2 (M+1)。
制备12
(2S)-2-氨基-1-[4-[2-(4-氨基-6-氯-2-甲基-嘧啶-5-基)乙基]-1-哌啶基]丙烷-1-酮
将N-[(1S)-2-[4-[2-(4-氨基-6-氯-2-甲基-嘧啶-5-基)乙基]-1-哌啶基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯(15.78 g, 37.05 mmol)溶解在DCM (185 mL)中，历时3min以逐滴方式加入TFA (185 mL)并搅拌过夜。通过LCMS (低pH)分析反应物以显示完全转化。由于放热混合，缓慢地加入MeOH (400 mL)。将3个SCX柱(50 g)用水(20 mL)、然后用MeOH (20 mL)预洗涤。将反应混合物分成三等份，并相同地装载到SCX柱上。将每个柱用水(40 mL)和MeOH (40 mL)洗涤，将洗液收集进真空烧瓶中。用2 N的氨在MeOH中的溶液(60mL)从SCX柱洗脱期望的物质到清洁容器中。将含有产物的溶液合并，在减压下浓缩，与DCM-己烷类(1:1)共沸3次，并放在真空下，得到作为白色泡沫的标题化合物(10.29 g, 84%)。LC-ES/MS m/z (35Cl/37Cl) 326.2/328.2 (M+1)。
制备13
(2S)-2-氨基-1-[4-[2-(4-氨基-6-氯-2-甲基-嘧啶-5-基)乙基]-1-哌啶基]丙烷-1-酮盐酸盐
将N-[(1S)-2-[4-[2-(4-氨基-6-氯-2-甲基-嘧啶-5-基)乙基]-1-哌啶基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯(28.75 g, 67.49 mmol)加入1,4-二氧杂环己烷(143.7mL)中。然后加入4M的氯化氢在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(168.7 mL, 674.9 mmol)并搅拌10 min。加入MeOH (20 mL)并将混合物在剧烈搅拌下搅拌3 h。在减压下浓缩混合物，将固体用乙醚(200 mL)稀释，并搅拌过夜。将所述物质过滤，用乙醚(2×25 mL)冲洗。将所述物质通过抽吸干燥15 min，然后在真空下在45℃放置1 h，得到作为粗制白色粉末的标题化合物(27.7 g)。LC-ES/MS m/z (35Cl/37Cl) 326.1/328.2 (M+1)。
制备14
(2S)-2-氨基-1-[4-[2-(4-氨基-6-氯-2-甲基-嘧啶-5-基)乙基]-1-哌啶基]丙烷-1-酮, 二盐酸盐
将IPA (154 mL)加热至50℃，并由于放热反应缓慢地加入乙酰氯(19.3 mL, 271mmol)。将反应物在50℃搅拌10 min，然后加入N-[(1S)-2-[4-[2-(4-氨基-6-氯-2-甲基-嘧啶-5-基)乙基]-1-哌啶基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯(21.0 g, 45.3 mmol)。将反应物搅拌2 h，通过LCMS (低pH)监测。将反应物冷却至室温并加入乙醚(386 mL)。将浆搅拌15 min。将固体过滤，用乙醚(2×50 mL)以快速方式洗涤，因为所述物质是吸湿的。将所述物质过滤并通过过滤1 min进行干燥，然后在真空干燥箱中在50℃干燥过夜，得到作为白色粉末的标题化合物(18.4 g)。LC-ES/MS m/z (35Cl/37Cl) 326.1/328.2 (M+1)。通过离子色谱法进行的抗衡离子分析与二盐酸盐一致。
实施例1
N-[(1S)-2-[4-[2-(4-氨基-6-氯-2-甲基-嘧啶-5-基)乙基]-1-哌啶基]-1-甲基-2-氧代-乙基]环丙烷甲酰胺
将1-羟基-7-氮杂苯并三唑(281 mg, 2.03 mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(430 mg, 2.21 mmol)加入环丙烷甲酸(161µL, 2.03 mmol)、(2S)-2-氨基-1-[4-[2-(4-氨基-6-氯-2-甲基-嘧啶-5-基)乙基]-1-哌啶基]丙烷-1-酮(600 mg,1.84 mmol)在无水THF (12 mL)中的浆中。然后加入TEA (770µL, 5.52 mmol)并将得到的混合物在室温搅拌12 h。将反应混合物用EtOAc (10 mL)稀释，经硅藻土过滤，并在真空中浓缩滤液。通过质量指导的HPLC反相色谱法(Agilent®1200 LCMS和MSD质谱仪，75×30 mmPhenomenex Gemini-NX®，具有10×20 mm鞘的5µ粒度柱，12-46%的ACN在10 mM碳酸氢铵水溶液中的溶液，pH 10，梯度历时9 min)纯化得到的残余物，得到作为无色玻璃的标题化合物(572 mg, 78%)。LC-ESMS m/z (35Cl/37Cl) 394.2/396.2 (M+H)。
使用1-丙烷膦酸酸酐的替代程序
用DIPEA (128 mL, 732.59 mmol)处理(2S)-2-氨基-1-[4-[2-(4-氨基-6-氯-2-甲基-嘧啶-5-基)乙基]-1-哌啶基]丙烷-1-酮, 二盐酸盐(107.4 g, 183.15 mmol)在DCM(584 mL)中的混合物。将反应混合物在冰浴中冷却至0℃并加入环丙烷甲酸(21.8 mL,274.72 mmol)。然后加入1-丙烷膦酸酸酐的溶液(50%的在EtOAc中的溶液, 174.8 g,274.72 mmol)，随后加入另外的DIPEA (40 mL)，以使反应混合物呈碱性。在室温搅拌过夜。将反应混合物用水(1 L)洗涤并分离各层。将有机部分经MgSO4干燥并在真空中浓缩得到作为灰白色泡沫的粗产物。通过硅胶上的色谱法(800 g, 0-10%的MeOH在EtOAc中的溶液)纯化所述物质。将适当的级分与基本上按照相同程序使用(2S)-2-氨基-1-[4-[2-(4-氨基-6-氯-2-甲基-嘧啶-5-基)乙基]-1-哌啶基]丙烷-1-酮, 二盐酸盐(77.9 g, 150.42 mmol)得到的另一批产物(51 g)合并。将合并的批料在真空中浓缩以得到白色固体(114 g)。在浓缩过程中产物开始结晶。将所述物质与热EtOAc (200 mL)一起研磨，冷却，并过滤以得到标题化合物(111 g, 84%)。LC-ES/MS m/z (35Cl/37Cl) 394.0/396.0 (M+1)。手性分析(OD-H柱,25%MeOH/iPrNH2, 5.0 mL/min, 100巴，35℃, 220 nm) >99.9%ee; TR = 1.15 min。
GOAT是将UAG转化成AG的主要酶。关于GOAT和葛瑞林的作用的综述，参见：KristyM. Heppner等人, The ghrelin O-acyltransferase-ghrelin system: a novel regulator of glucose metabolism, Current Opinion in Endocrinology, Diabetes &Obesity 2011, 18:50-55; Phillip A. Cole等人, Glucose and Weight Control in Mice with a Designed Ghrelin OAcyltransferase Inhibitor, Science. 2010年12月17日; 330(6011): 1689-1692. doi:10.1126/science.1196154, Matthias H. Tschöp等人, Gastric O-acyl transferase activates hunger signal to the brain, ProcNatl Acad Sci U S A. 2008年4月29日; 105(17): 6213-6214, 和Jesus Gutierrez, 等人, Ghrelin octanoylation mediated by an orphan lipid transferase, Proc NatlAcad Sci U S A., 2008年4月29日, 105 (17): 6320-6325。
在缺少GOAT基因的小鼠中观察到的表型支持GOAT的作用。因此，预期GOAT的抑制会减少循环的AG和增加循环的UAG。结果，在GOAT抑制剂治疗以后，AG与总葛瑞林(UAG +AG)的比率下降。
体外无细胞人GOAT酶测定
将人GOAT基因(登录号: NM_001100916)亚克隆至pAN51杆状病毒表达载体中。按照卖方（Invitrogen, California, USA）提供的Bac-to-Bac方案，制备杆状病毒储备液。将5毫升人GOAT杆状病毒储备液以1×106个细胞/毫升的密度加给在2 L锥形瓶内的500 mL在HyQ SFX-InsectTM培养基(Hyclone目录号SH30278.02)中的Sf9细胞。将装有人GOAT基因感染的Sf9细胞的烧瓶放在平板振荡器上在120 rpm在28℃保持48 h。48 h温育以后，将细胞在1,000xg在4℃离心10 min。将细胞沉淀物收集并在-80℃储存在冰柜中，直到准备好用于进一步加工。
用于酶测定的GOAT酶的微粒体膜的制备：
将1克细胞沉淀物悬浮于9 mL冷冻的匀浆化缓冲液(50 mM Tris-HCl, 250 mM蔗糖，调至pH 7.5，并穿过0.2µm Millipore过滤器无菌过滤)中。将细胞混悬液转移至Dounce玻璃匀浆器。将细胞沉淀物在冰上以40次冲击进行匀浆化。将匀浆物在Beckman吊桶式转子中在4℃在3,000 rpm离心10 min以除去未破碎的细胞。将上清液收集并在40,000 xg在4℃离心1 h。将得到的膜沉淀物使用Dounce玻璃匀浆器悬浮于匀浆化缓冲液中，并在-20℃保存在冰柜中用于测定。为了人GOAT酶膜制品的长期贮存，将悬浮的膜储存在-80℃冰柜中。
人GOAT酶测定方案：
在DMSO中制备试验化合物以制作0.2 mM储备溶液。将储备溶液在96-孔圆底平板中在DMSO中系列稀释以得到10-点稀释曲线，最终化合物浓度范围为10µM至0.5 nM。在测定缓冲液(0.02%的Tween™-20在50 mM Tris, pH 7.5/250 mM蔗糖/1 mg/mL BSA/10 mMEDTA中的溶液)中制备酶和底物溶液。将稀释的化合物(1 μL)加入对应低蛋白结合384孔板的第A至N行的每个孔中。向化合物加入人GOAT底物混合物(10 μL)，其由人脱酰基-葛瑞林-生物素(CPC Scientific Inc., 6.0µM终浓度)、辛酰基-辅酶A (Sigma, 60µM终浓度)和AG特异性抗体(WO 2006/091381)(1.0µg/mL终浓度)组成。向含有底物和试验化合物的平板的每个孔加入GOAT-His/sf9酶制品（其已经在测定缓冲液(9 μL)中制备），产生0.01µg/mL的终浓度以开始反应。将混合物在轻轻地旋转的振荡器上在室温温育1 h。向所有孔加入4 M盐酸胍(20µL)，混合，并温育3 h以停止反应。
通过用2%热灭活的FBS在PBS (40µL) (Invitrogen)封闭缓冲液中的溶液封闭3h，制备ELISA平板(STREPTAVIDIN SPECTRAPLATETM 384, Perkin Elmer)。从ELISA平板抽吸封闭缓冲液，并将封闭缓冲液(23µL)加入第1-24列、第A-N行。保留第O和P行用于酰基葛瑞林标准曲线。将反应混合物(2µL)加入ELISA平板。通过从2.5 pM开始在含有0.2M盐酸胍的封闭缓冲液中系列2倍稀释，制备10点标准曲线(生物素-标记的辛酰基-葛瑞林)。将反应混合物或生物素-标记的AG标准品在ELISA平板中在4℃温育过夜。次日，将平板用洗涤缓冲液(0.1%Tween™-20/PBS, 100µL/孔，在每个洗涤循环中)洗涤3次。将AG特异性抗体(WO2006/091381) (25µL 0.5µg/mL在封闭缓冲液中)加入每个孔并在室温温育1 h。与以前步骤类似地，用洗涤缓冲液洗涤平板3次。加入在封闭缓冲液中稀释3,000倍的蛋白G-HRP (25µL)(Southern Biotech)，并在室温温育1 h。像在以前步骤中一样，将后者用洗涤缓冲液洗涤3次。将TMB试剂(25µL) (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.)加入每个孔，并放置显影20 min和用1 M磷酸(25µL/孔)停止。使用Envision Multilabel平板读数器在450nm读出平板。相对于拟合的标准曲线计算AG水平，并计算抑制百分比。使用Activity Base(7.3.2.1版)绘制10-点抑制曲线，并与4-参数逻辑斯蒂方程拟合以得到IC50值。
按照基本上如上所述的方案，实施例1的化合物显示约192 nM±73的IC50 (n =5)。数据证实，实施例1的化合物在体外会抑制纯化的GOAT酶活性。
对比化合物治疗组和媒介物治疗组的AG与总葛瑞林的比率的变化会反映体内GOAT酶抑制的程度，这是由于GOAT酶将UAG向AG的动态加工。在本文的体内药效动力学研究中，通过对这两种分析物特异性的ELISA，测量媒介物和化合物治疗组中血浆和胃中的AG和UAG的水平。通过这些ELISA测量将每个样品的总葛瑞林水平计算为AG和UAG的总和。AG与总葛瑞林的比率定义为：每个样品中的AG的水平除以相同样品中的总葛瑞林的水平。计算媒介物治疗组中AG、UAG的水平和AG与总葛瑞林的比率，并设定为100%。然后计算化合物治疗组中这些参数的相对变化，以确定试验化合物的有效性。
GOAT抑制剂的体内剂量依赖性的3天BID（每天2次）研究：
动物和治疗：
从Harlan (Indianapolis, IN)购买9周龄的雄性C57BL/6小鼠。将小鼠个别地圈养在具有12 h光照/黑暗周期(2200 h光照)的控温(24℃)设备中，并允许自由接近标准啮齿动物食物(2014年饮食, Harlan)和水。通常，使用在研究时10-13周龄的小鼠。在实验的第0天，将小鼠随机分入治疗组(N=7/组)，使得每个组具有类似的平均体重。在第1天和第2天，在上午7点和下午7点通过经口管饲法用媒介物(1%羟乙基纤维素, 0.25%吐温80,0.05%消泡剂)或不同剂量的在媒介物中制备为混悬液的试验化合物治疗动物。在第3天，给动物禁食，将它们移入清洁的笼子中，并在上午8点通过经口管饲法再次施用媒介物或试验化合物。在同一天下午1点，通过断头术处死动物以收集血液。关于血液收集和血浆处理的细节，参见下面的血液收集和从血浆提取葛瑞林部分。
血液收集：
将大约600µL血液收集进预先称重的含有600µL (定义为V 防腐剂 )新鲜制备的防腐剂(4 mM PEFABLOC®[4-(2-氨基乙基)苯磺酰基氟盐酸盐], 72 mM NaCl, 58 mM NaF,0.032 N盐酸, pH 3.0)的EDTA试管中，并立即混合。将试管再次称重，并保持在冰上。为了准确地确定使用该血液收集程序的每个样品的确切血液体积，使用下述方程式计算每只小鼠的血液的重量：
血液的重量= (含有血液+防腐剂的试管的重量)- (含有防腐剂的试管的重量)
血液体积(V 血液 ) = (血液的重量)/1.06
注意，假定啮齿动物血液的密度为1.06 g/mL。
在血液收集以后15分钟内，将样品在5000 rpm在4℃离心8 min。将血浆(650µL)移至含有1 N盐酸(65µL)的5 mL玻璃试管，混合，并保持在冰上。
通过SEP-PAK®柱提取葛瑞林：
在执行ELISA之前使用SEP-PAK®_C18柱从血浆提取AG和UAG以消除干扰。可以在真空歧管(Waters Corp)上或使用蠕动泵执行用SEP-PAK®_C18柱对AG和UAG肽的固相提取。将样品SEP-PAK®_柱提取程序独立地应用于得自每只单独小鼠的血浆样品。一般提取方案如下所述。
用于SEP-PAK®柱提取的整个方案的所有溶液应当是在冰冷的条件。用99.9%ACN/0.1%TFA (1 mL的100 mL ACN/0.1 mL TFA溶液)润湿SEP-PAK®_柱(WAT054960, WatersCorp, Milford MA)。施加压力以调节流速至约1mL/min从而从柱床除去液体，但是不允许柱在任何点干透。一旦从柱除去液体，就停止压力。用3%ACN/0.1%TFA (1 mL的97 mL水、3mL ACN、0.1 mL TFA)平衡柱。施加压力以调节流速至约1mL/min从而从柱床除去液体，但是不允许柱干透。将大约650 μL酸化的血浆(定义为V 加入柱的血浆 )稀释至1.4 mL冰冷的0.1%TFA中。将来自前一步的所有稀释的酸化的血浆加载到柱上。施加压力以调节流速至约0.5mL/min从而允许样品穿过柱和葛瑞林肽吸附到柱的树脂上。不让柱干透。用3%ACN/0.1%TFA(0.9 mL的97 mL水、3 mL ACN、0.1 mL TFA)洗涤。施加压力以调节流速至约1mL/min从而从柱床除去液体，但是不允许柱干透。重复洗涤另外2次。用60%ACN/0.1%TFA (1 mL的40 mL水、60 mL ACN、0.1 mL TFA)洗脱。将收集试管放在每个柱的下面，施加压力以调节流速至约0.5 mL/min从而推动液体穿过柱和将洗脱液收集进收集试管中。立即在干冰上冷冻样品。将样品在speed-vac (Model# SC110A, Savant)中低压冻干并在-20℃保存直到执行ELISA测定。
关于葛瑞林的ELISA测定：
用100µL的在PBS 中的1µg/mL抗体(WO 2005/026211和WO2006/019577)(Invitrogen)包被96-孔MULTI-ARRAY®MSD®平板(Meso Scale Discovery,Gaithersberg, MD, 目录号L15XA-3)，所述抗体识别酰化和未酰化形式的葛瑞林的中间结构域。轻敲平板的侧面以确保孔的覆盖，用粘性平板密封条密封，并在室温温育过夜。抛弃内容物并向每个孔加入在PBS (25µL)中的Blocker™酪蛋白(Thermo Scientific,Rockford, IL, 目录号37528)。重新密封平板并放在平板振荡器上在室温保持1 h。
于在PBS中的Blocker™酪蛋白(400µL至每个样品，将该体积定义为V 重构 )中重构低压冻干的保存的血浆样品（来自SEP-PAK®C18柱提取），用涡旋混合器混合均匀，并在冰上温育45-60 min。从平板抛弃内容物，并向每个孔加入25µL重构的血浆样品。从8000 pg/mL开始制备酰基葛瑞林和未酰化的葛瑞林标准曲线，并执行系列1:4稀释，得到共8个浓度。以每个孔25µL，将制备的标准品一式两份地加给封闭的平板。密封平板并在室温在平板振荡器上温育2 h。
抛弃平板内容物并用包含0.1%Tween™20的PBS (150µL)(PBS-T)洗涤3次。将用MSD SULFO-TAG™(Meso Scale Discovery)标记的酰基葛瑞林特异性抗体(WO 2006/091381)或未酰化的葛瑞林特异性抗体(WO 2006/055347)在含有0.05%Tween™20的0.2×Blocker酪蛋白中稀释至0.05µg/mL（命名为第二抗体溶液）。除去最终的洗液并加入特异性地识别AG或UAG的第二抗体溶液(向每个孔加入25µL)。将平板重新密封并在室温在平板振荡器上温育1 h，最后用PBS-T (150µL/孔)再洗涤3次。
抛弃最终的洗液并用1×MSD Read Buffer (150µL/孔)替换。使用MSD®SECTOR®Imager 6000分析仪(Meso Scale Discovery)读出由结合的MSD SULFO-TAG™标记的活化产生的至平板上的电极的电化学发光信号。基于由MSD®软件产生的各个标准曲线，计算酰基葛瑞林或未酰化的葛瑞林的浓度。通过将测量的酰基葛瑞林或未酰化的葛瑞林水平乘以稀释因子，确定每个样品的实际血浆浓度。用下述方程式计算每个血浆样品的稀释因子。
结果：
在0.3、1、3和10 mg/kg，将实施例2的化合物施用3天分别会使血浆AG下降-1%、5%、45%和48%和使UAG增加2.24、2.82、2.53和2.89倍(结果在下面制表)。与媒介物治疗的对照动物相比，在0.3、1、3和10 mg/kg的施用分别导致AG与总葛瑞林的比率的39%、54%、71%和77%下降。这些结果证实，实施例1的化合物会抑制AG产生和升高循环中的UAG，如在GOAT敲除的小鼠体内中所示。
治疗 AG(对照的%) UAG(媒介物对照的%) AG/总葛瑞林(媒介物对照的%)
媒介物 100 100 100
0.3 mg/kg 101±25 224±35 61±4
1 mg/kg 95±18 282±45 46±11
3 mg/kg 55±6 253±31 29±4
10 mg/kg 52±10 289±44 23±4

Claims (14)

1.下式的化合物
或其药学上可接受的盐。
2.下式的权利要求1所述的化合物
或其药学上可接受的盐。
3.下式的权利要求1或2中的任一项所述的化合物
。
4.一种药物组合物，其包含权利要求1-3中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种其它治疗剂。
6.用在治疗中的根据权利要求1-3中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
7.用于减少重量增加的根据权利要求1-3中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
8.用于减少重量恢复的根据权利要求1-3中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
9.用于治疗肥胖的根据权利要求1-3中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
10.用于治疗II型糖尿病的根据权利要求1-3中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
11.权利要求1-3中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在药物制备中的用途，所述药物用于减少重量增加。
12.权利要求1-3中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在药物制备中的用途，所述药物用于减少重量恢复。
13.权利要求1-3中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在药物制备中的用途，所述药物用于治疗II型糖尿病。
14.权利要求1-3中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在药物制备中的用途，所述药物用于治疗肥胖。
CN201480058584.6A 2013-11-14 2014-11-06 作为葛瑞林o‑酰基转移酶抑制剂的被取代的哌啶基‑乙基‑嘧啶 Active CN105636948B (zh)

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