UA118034C2

UA118034C2 - Заміщений піперидилетилпіримідин як інгібітор грелін-o-ацилтрансферази

Info

Publication number: UA118034C2
Application number: UAA201604765A
Authority: UA
Inventors: Марія Анхелес Мартінес-Грау
Original assignee: Елі Ліллі Енд Компані
Priority date: 2013-11-14
Filing date: 2014-06-11
Publication date: 2018-11-12
Also published as: HRP20171648T1; DOP2016000070A; JP2016537371A; ES2647790T3; EA028550B1; US9035051B1; TWI538677B; EA201690764A1; TN2016000145A1; PT3068775T; CA2926224A1; US20150133474A1; HK1222860A1; EP3068775B1; JO3302B1; ZA201602202B; CL2016001023A1; AU2014348967A1; CY1119489T1; DK3068775T3

Abstract

Винахід стосується нових заміщених піперидилетилпіримідинів як інгібіторів грелін-О-ацилтрансферази (GOAT), їх солей, фармацевтичних композицій на їх основі, а також їх застосування для зниження приросту або повторного приросту маси тіла, для лікування ожиріння або цукрового діабету.

Description

Цей винахід має відношення до сполуки, придатної для інгібування грелін-О-ацил- трансферази (СОАТ), до фармацевтичних композицій і до способів лікування захворювань, пов'язаних з активністю СОАТ.

СОАТ належить до ферментів родини мембранозв'язаних О-ацилтрансфераз (МВОАТ).

Грелін-О-ацилтрансфераза перетворює дезацилгрелін (також відомий як неацильований грелін або ПАС) на біологічно активну форму - ацилгрелін (АС) - в результаті перенесення жирної кислоти до залишку 5ег3 пептиду дезацилгреліну. Відомо, що ацилгрелін збільшує споживання їжі та збільшує ожиріння в людей і в гризунів. Відомо також, що введення АС в організм людини пригнічує індуковану глюкозою секрецію інсуліну. Відомо, що видалення гена греліну підсилює вивільнення інсуліну для запобігання або полегшення непереносності глюкози в мишей лінії ор/оБ, яким згодовують раціон з високим вмістом жирів.

Поширеність ожиріння та цукрового діабету в поєднанні з несталими ефективністю і дієвістю сучасних методів лікування ожиріння і цукрового діабету потребує наявності для пацієнтів більшої кількості варіантів лікування. Вважають, що інгібітор СОАТ може бути корисним засобом у лікуванні ожиріння. Крім того, вважають, що інгібітор ЗОАТ також може бути корисним щодо зниження приросту маси тіла або зниження повторного приросту маси тіла як доповнення до дієти та/або фізичних вправ, інших терапевтичних лікарських засобів або процедур, призначених для зниження приросту маси тіла або лікування ожиріння. Аналогічно, інгібітор СОАТ може бути корисний при лікуванні діабету 2 типу, окремо або в комбінації з іншими лікарськими засобами для лікування діабету 2 типу.

Цим винаходом запропонована сполука, яка є інгібітором СОАТ. Зокрема, цим винаходом запропонована сполука, яка має формулу о Н

М у и (в) мно ра 7

М' СІ або її фармацевтично прийнятна сіль.

Цим винаходом запропонована також сполука, яка є інгібітором СОАТ, і яка має формулу о Н

М

«у и (в) мно

Ж 7

МС

Цим винаходом запропонована фармацевтична композиція, що містить сполуку за цим винаходом або її фармацевтично прийнятну сіль і один або більше фармацевтично прийнятний(-х) носій(-їв), розріджувач(-ів) або наповнювач(-ів). У ще одному варіанті здійснення

Зо цього винаходу запропонована фармацевтична композиція, що містить сполуку за цим винаходом і один або більше інший(-х) терапевтичний(-х) агент(-ів).

За ще одним аспектом цього винаходу запропонований спосіб зниження приросту маси тіла або спосіб зниження повторного приросту маси тіла, або спосіб лікування діабету 2 типу, або спосіб лікування ожиріння, що включає введення сполуки за цим винаходом або її фармацевтично прийнятної солі пацієнту, який цього потребує.

У цьому винаході запропоноване також застосування сполуки за цим винаходом або її фармацевтично прийнятної солі в терапії, зокрема, для зниження приросту маси тіла або зниження повторного приросту маси тіла чи лікування діабету 2 типу або ожиріння. Крім того, у цьому винаході запропоноване застосування сполуки за цим винаходом або її фармацевтично прийнятної солі для виготовлення лікарського засобу для зниження приросту маси тіла або зниження повторного приросту маси тіла, або лікування діабету 2 типу, або лікування ожиріння.

Сполука за цим винаходом здебільшого є ефективною в широкому діапазоні доз.

Наприклад, щоденні дози знаходяться в діапазоні від приблизно 0,03 мг/кг до приблизно 150 мг/кг маси тіла. У деяких випадках рівні доз нижче нижньої межі вищезгаданого діапазону можуть бути більш ніж достатніми, тоді як в інших випадках можуть бути використані ще більш високі дози при одночасному збереженні сприятливого профілю користь/ризик, і, отже, вищезгаданий діапазон доз не є призначеним для обмеження обсягу цього винаходу будь-яким чином. Слід розуміти, що фактично введена кількість сполуки буде визначатись лікарем з огляду на відповідні обставини, у тому числі стан, що підлягає лікуванню, вибраний шлях введення, фактично введену сполуку або сполуки, вік пацієнта, масу тіла пацієнта і реакцію конкретного пацієнта та тяжкість симптомів у пацієнта.

У цьому описі термін "лікування" (або "лікувати", або "курс лікування") означає стримування, уповільнення, припинення або звернення прогресування або тяжкості існуючого симптому, стану або розладу.

У цьому описі термін "зниження приросту маси тіла" означає уповільнення збільшення маси тіла пацієнта. Термін "зниження повторного приросту маси тіла" означає уповільнення збільшення маси тіла пацієнта, який зазнає відновлення маси тіла після її втрати. Повторний приріст маси тіла може бути обумовлений ефектом відновлення після припинення втрати маси тіла, досягнутої за допомогою дієти, фізичних вправ, модифікації поведінки або схвалених терапевтичних заходів. Для уникнення сумнівів, терміни "приріст маси тіла" або "повторний приріст маси тіла" у цьому описі мають відношення до приросту маси тіла або повторного приросту маси тіла, спричиненого прийомом їжі або харчовими звичками, і не стосуються збільшення маси тіла, не пов'язаного з харчуванням, наприклад, збільшення маси тіла унаслідок накопичення води в організмі, збільшення маси тіла через затримку води, збільшення маси тіла унаслідок збільшення м'язової маси або збільшення маси тіла через запалення.

Сполука за цим винаходом може вступати в реакцію з утворенням фармацевтично прийнятних солей. Фармацевтично прийнятні солі та загальні методики їх одержання добре відомі в цій галузі. Див., наприклад, Р. егапйі, еї аІ., Напароок ої Рпагтасеціїйса! Зайве: Ргорепгієв5,

ЗеїІесіоп апа О5е, 2"9 Вемізед Едйоп (УМієу-МСН, 2011); 5.М. Вегоде, вї а!., "Рпагтасеціїса! Заїїв, " Уоигпа! ої Рнаптасеціїса! бсіепсевз, Мої. 66, Мо. 1, дхапиагу 1977.

Фахівцеві в цій галузі буде зрозуміло, що сполука за цим винаходом або її фармацевтично прийнятна сіль складаються з ядра, яке містить щонайменше один хіральний центр: о Н ку (6)

Мне

Ж 7

М' СІ

Зо Незважаючи на те, що цей винахід охоплює всі окремі енантіомери, а також суміші енантіомерів згаданих сполук, у тому числі й рацемати, перевагу віддають сполуці за цим винаходом, яка представлена формулою о Н

М

«у 7 (в) мно

Ж 7

М' СС або її фармацевтично прийнятним солям.

Сполука за цим винаходом переважно входить до складу фармацевтичних композицій, що вводяться різними шляхами. Такі фармацевтичні композиції та способи їх одержання добре відомі в цій галузі. Див. наприклад, Кетіпдіоп: Те Зсіепсе апа Ргасіїсе ої Рпаптасу (А.

Сеппаго, вї аї., єдв., 215ї єд., Маск Рибіїєпіпд Со., 2005). Більшу перевагу за цим винаходом віддають фармацевтичній композиції, що містить сполуку, представлену формулою о Н

М жо

Ф)

Мне

Ж 7

М' СС або її фармацевтично прийнятну сіль і один або більше фармацевтично прийнятний(-х) носій(-їв) або розріджувач(-ів).

Окремі енантіомери або діастереомери можуть бути одержані із використанням хіральних реагентів, або методами стереоселективного або стереоспецифічного синтезу. Альтернативно, окремі енантіомери або діастереомери можуть бути виділені з сумішей із застосуванням стандартних методів хіральної хроматографії або кристалізації в будь-якій на будь-якому придатному етапі в процесі синтезу сполук за цим винаходом. Окремі енантіомери і діастереомери сполук за цим винаходом являють собою варіант здійснення цього винаходу, якому віддають перевагу.

У цій галузі добре відомо, що агенти для лікування цукрового діабету та/або ожиріння можна об'єднувати з іншими агентами для лікування цукрового діабету та/або ожиріння. Сполука за цим винаходом або її фармацевтично прийнятна сіль може бути введена разом (одночасно або послідовно) з іншим(-и) ефективним(-и) лікарським(-и) засобом(-ами) для лікування цукрового діабету або ожиріння. Сполука за цим винаходом або її фармацевтично прийнятна сіль, окремо або в комбінації з іншим(-и) ефективним'(-и) лікарським(-и) засобом(-ами), може бути введена (одночасно або послідовно) після здійснення схвалених медичних процедур, таких як баріатричні операції, наприклад, операції шунтування шлунка або процедур регульованого бандажування шлунка.

Цей винахід охоплює також проміжні хімічні сполуки і процеси, придатні для синтезу сполуки за цим винаходом.

Крім того, проміжні хімічні сполуки, описані в наведених нижче схемах, можуть містити ряд азотзахисних груп. Замінна захисна група може бути однаковою або різною в кожному конкретному випадку залежно від конкретних умов реакції і конкретних перетворень, які здійснюють. Умови введення та видалення захисних груп добре відомі фахівцеві в цій галузі.

Див., наприклад, Сгеепе апа МуУці5, Ргоїесіїме Сгоир5 іп Огдапіс Зупіпевів, (Т. Стеепе апа Р.

Муців, єа5., 2а є. 1991).

Препаративні методики і Приклади

Наведені нижче Препаративні методики і Приклади додатково ілюструють цей винахід і

Зо пояснюють типовий синтез сполуки за цим винаходом. Реагенти та вихідні матеріали є легко доступними або можуть бути легко синтезовані фахівцем у цій галузі. Слід розуміти, що

Препаративні методики і Приклади наведені для ілюстрації, а не для обмеження обсягу винаходу, і що фахівцем в цій галузі можуть бути створені різні модифікації.

В- або 5-конфігурація сполуки за цим винаходом може бути визначена стандартними методами, такими як рентгеноструктурний аналіз і кореляція з часом утримування хіральної рідинної хроматографії високої ефективності. Найменування, що застосовуються в наведених нижче Препаративних методиках та Прикладах здебільшого наведені за номенклатурою

ІЮПАК, представленою в програмному забезпеченні МОЇ. Ассеїгуз? Огам/ мегзіоп 4.0.МЕТ.

Наведені нижче терміни в цьому описі мають таке значення: "АСМ" означає ацетонітрил; "ВБ5А" означає бичачий сироватковий альбумін; "ОСМ" означає дихлорметан; "ОІРЕА" означає

М, М-діїзопропілетиламін; "ОМЕ" означає диметилформамід; "оМзо" означає диметилсульфоксид; "ЕЮТА" означає етилендіамінтетраоцтову кислоту; "ЕАс" означає етилацетат; "ЕН" означає етанол; "РВ5" означає ембріональну бичачу сироватку; "НКР" означає пероксидазу хрону; "ІСвоз означає концентрацію агента, яка спричинює 50 95 максимальної реакції; "ІРА" означає ізопропіловий спирт; "МеонН" означає метанол; "МТВЕ" означає метил-трет-бутиловий простий ефір; "РВ5Б" означає забуферений фосфатом фізіологічний розчин; "КТ" означає кімнатну температуру; "ТЕА" означає триетиламін; "ТЕА" означає трифтороцтову кислоту; "Тв" означає час утримування; "ТНЕ" означає тетрагідрофуран; і "ТМВ" означає 3,3',5,5'-тетраметилбензидин.

Умови ІС-М5 (рідинна хроматографія-мас-спектроскопія) (низьке значення рН): колонка:

Рпепотепех Сетіпі МХ С18, 2,1х50 мм, 3,0 м; градієнт: 5-100 95 В протягом З хв, після чого 100 95 В протягом 0,75 хв. Температура колонки: 50--10 "С; швидкість потоку: 1 мл/хв; Розчинник

А: деіонізована вода з 0,1 95 мурашиної кислоти; Розчинник В: АСМ з 0,1 96 мурашиної кислоти.

Препаративна методика 1 б-Хлор-2-метилпіримідин-4-амін мно

М р

М СІ

У 5 л сталевий апарат високого тиску (автоклав) при кімнатній температурі вміщують 4,6- дихлор-2-метилпіримідин (400 г, 2,45 моль) і гідроксид амонію (2,8 л). Реакційну суміш нагрівають до температури 90 "С протягом 5 год. Реакційну суміш охолоджують до кімнатної температури, після чого тверду речовину відфільтровують через воронку Бюхнера.

Відфільтрований осад промивають водою (200 мл) і гексаном (200 мл), після чого сушать під вакуумом, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини білого кольору (290 г, 82 95). | СО-ЕБ/М5 п/з: 144,0 (М--1).

Препаративна методика 2 б-Хлор-5-йод-2-метилпіримідин-4-амін

МН»о

М р

М СІ

У 20 л круглодонній колбі, спорядженій механічною мішалкою, об'єднують б-хлор-2- метилпіримідин-4-амін (708 г, 4,93 моль) і МеОнН (7,08 л). Охолоджують до температури 0-5 76.

Протягом 1 год. з використанням краплинної лійки додають монохлорид йоду (4,806 кг, 29,6 моль), розчинений у МеонН (б л). Реакційну суміш нагрівають до кімнатної температури, і перемішують при кімнатній температурі протягом 16 год. Реакційну суміш охолоджують до температури 0-5 "С, і додають до сульфіту натрію (46 л, 20 95 водний розчин). Одержану тверду речовину відфільтровують, промивають водою (2 л), потім гексаном (3 л). Тверду речовину сушать під вакуумом, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини білого кольору (1061 г, 80 95). | С-ЕБ/М5 п/2 269,9 (М'-1).

Препаративна методика З трет-Бутил-4-(2-(4-аміно-б-хлор-2-метилпіримідин-5-іл)/етиніл|піперидин-1-карбоксилат с мо

МН, ру

МУ 7 ли

М С

У 3-горлій колбі б-хлор-5-йод-2-метилпіримідин-4-амін (20 г, 74,22 ммоль), трет-бутиловий складний ефір 4-етинілпіперидин-1-карбонової кислоти (18,64 г, 89,06 ммоль) та діізопропіламін (10,44 мл, 74,22 ммоль) розчиняють в ТНЕ (200 мл). Тричі почергово відкачують газ, і

Зо заповнюють колбу азотом. До цього розчину додають біс(трифенілфосфін)паладію(ії) хлорид (2,63 г, 3,71 ммоль) і йодид мідік(І) (0,713 г, 3,71 ммоль). Суміш нагрівають до температури 50- 55"С протягом 16 год. Суміш охолоджують до кімнатної температури, і додатково додають біс(трифенілфосфін)паладіюціІ) хлорид (1,31 г, 1,86 ммоль), йодид мідіс(І) (0,356 г, 1,86 ммоль) і трет-бутиловий складний ефір 4-етинілпіперидин-1-карбонової кислоти (1,55 г, 7,42 ммоль).

Суміш нагрівають до температури 60 "С протягом 3,5 год. Суміш охолоджують до кімнатної температури, і концентрують при зниженому тиску. Матеріал розбавляють ОСМ (300 мл), і промивають насиченим водним розчином хлориду амонію (100 мл), водою (100 мл) і насиченим водним розчином хлориду натрію (100 мл). Розчин сушать над Мо95оО», фільтрують, і концентрують при зниженому тиску. Залишок очищають засобами хроматографії на силікагелі (колонка з 800 г силікагелю), елююючи градієнтом 20-100 96 Е(Ас в гексанах. Очищені фракції концентрують до одержання вказаної в заголовку сполуки у вигляді порошку блідо- помаранчевого кольору (22,6 г, 86 95). І С-ЕБ/М5 т/а (3501/37СІ) 351,2/353,1 (М--1).

Препаративна методика 4 трет-Бутил-4-(2-(4-аміно-б-хлор-2-метилпіримідин-5-іллетил|піперидин-1-карбоксилат в) «бок

МНь

М

Ху

М Сі трет-Бутил-4-(2-(4-аміно-б-хлор-2-метилпіримідин-5-іл)/етиніл|піперидин-1-карбоксилат (4,30 г, 12,26 ммоль) і оксид платини(ІМ) (0,139 г, 0,61 ммоль) об'єднують у ЕН (81 мл) і ЕЮАс (40 мл). Колбу по черзі вакуумують та заповнюють воднем із застосуванням балону з воднем, і збовтують при кімнатній температурі протягом 8 год. Уважно відслідковують перебіг реакції, щоб уникнути утворення можливого побічного продукту внаслідок відщеплення від молекули атому хлору. Слід враховувати, що згаданий продукт є більш розчинним у суміші розчинників, ніж початковий алкін. Суміш фільтрують через діатомову землю, промивають Меон. Розчин концентрують при зниженому тиску. У колбу додають двоокис кремнію, з 1-пропантіолом (4 г, вміст діючої речовини 1,28 ммоль/г, 5ІШАВОМО? ТпіоЇ від ЗНІСЖСІЕУ) (для видалення залишкового паладію з попередньої реакції сполучення) і ЕТОАс (300 мл). Матеріал перемішують при кімнатній температурі протягом З днів. Тверді речовини відфільтровують, і фільтрат концентрують при зниженому тиску. Гідрогенізацію одержаного залишку повторюють, як описано нижче. У колбу, що містить залишок, вміщують оксид платини(ІМ) (0,139 г, 0,61 ммоль), ЕН (81 мл) і ЕЮАс (40 мл). Колбу по черзі вакуумують та заповнюють воднем із застосуванням балону з воднем збовтують при кімнатній температурі протягом 8 год.

Фільтрують через діатомову землю з промиванням МеонН, і фільтрат концентрують при зниженому тиску. Одержаний залишок повторно гідрогенізують, як описано нижче. У колбу, що містить залишок, вміщують оксид платини(ІМ) (0,139 г, 0,61 ммоль), ЕН (81 мл) і ЕІЮАс (40 мл). Колбу по черзі вакуумують і заповнюють воднем із застосуванням балону з воднем, і перемішують при кімнатній температурі протягом 8 год. Фільтрують через діатомову землю, і промивають Меон. Фільтрат концентрують при зниженому тиску на силікагелі (20 г). Матеріал очищають засобами хроматографії на силікагелі елююючи градієнтом 70-100 95 ЕЮАс в гексанах (120 г колонка). Очищені фракції об'єднують, і концентрують при зниженому тиску.

Залишок розбавляють ОСМ та гексанами, і тричі концентрують при зниженому тиску. Матеріал поміщають під вакуум до одержання вказаної в заголовку сполуки у вигляді твердої речовини білого кольору (3,20 г, 73 95). І С-ЕБ/М5 т/ (3501/37СІ) 355,2/357,2 (М'-1).

Препаративна методика 5

Хлористоводнева сіль б-хлор-2-метил-5-(2-(4-піперидил)етил|піримідин-4-аміну

МН тн НС

М й

ДА

М СІ трет-Бутил-4-(2-(4-аміно-б-хлор-2-метилпіримідин-5-іллетил|піперидин-1-карбоксилат (29,00 г, 81,72 ммоль) розчиняють в 1,4-діоксані (145 мл), і додають 4 М розчин хлористого водню в 1,4-діоксані (204,2 мл, 817,1 ммоль). Розчин перемішують протягом 18 год. при кімнатній температурі. Суміш концентрують при зниженому тиску, суспендують в діетиловому простому ефірі (250 мл), фільтрують, і одержану тверду речовину сушать під вакуумом до одержання вказаної в заголовку сполуки у вигляді неочищеної твердої речовини білого кольору (29 г). І С-

ЕБ/М5 ту/ (3501/87СІ) 255,2/257,2 (М'1).

Альтернативний шлях одержання б-хлор-2-метил-5-(2-(4-піперидил)етил|піримідин-4-аміну (Препаративні методики 6-10)

Препаративна методика 6 трет-Бутил-4-(2-метилсульфонілоксиетил)піперидин-1-карбоксилат

ТО р де. х/І

А8.о трет-Бутил-4-(2-гідроксіетил)піперидин-1-карбоксилат (4,720 кг, 20,6 моль) об'єднують з

ОСМ (40 л) і ТЕА (3020 мл, 21,63 моль) в 50 л реакторі в атмосфері азоту. Розчин охолоджують до температури приблизно 0 "С, і повільно додають розчин метансульфонілхлориду (2,478 кг, 21,63 моль) в ОСМ (5 л) з підтриманням температури реакції нижче 10 "С. Після завершення додавання суміш перемішують протягом 18 год. при температурі 15 "С. На цей час тонкошарова хроматографія (1:11 гексан'Є(ЮАс) не виявляє залишків початкового матеріалу. Суміш промивають водою (30 л), і залишають для відокремлення фаз. Органічну фазу концентрують до стану твердої речовини. Тверду речовину суспендують в МТВЕ (6 л), відфільтровують, сушать у вакуумній печі при температурі 50 "С, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини білого кольору (5,67 кг, 91 95).

Препаративна методика 7 трет-Бутил-4-(3-ціано-4-етокси-4-оксобутил)піперидин-1-карбоксилат

ХЛ

Мо

М ва

І» трет-Бутил-4-(2-метилсульфонілоксиетил)піперидин-і-карбоксилат (5,26 кг, 17,1 моль), етилціаноацетат (7 кг, 62 моль), 21 95 розчин етоксиду натрію в ЕІЮН (8,25 л, 24,75 моль) і ЕЮН (35 л) об'єднують в 50 л реакторі в атмосфері азоту. Суміш гріють при температурі 35-40 7С протягом 18 год., по збіганні яких дослідження засобами ЯМР виявляє 20 95 залишок мезилату.

Суміш продовжують гріти при температурі 35-40 "С протягом 24 год., по збіганні яких дослідження засобами ЯМР виявляє лише невелику кількість мезилату. Реакційну суміш повільно охолоджують до кімнатної температури, і протягом 30 хв додають льодяну оцтову кислоту (1422 мл, 22,68 моль). Суміш концентрують вакуумним дистилюванням, після чого розподіляють між водою (25 л) і ЕІОАс (35 л). Шари відокремлюють, і водну фазу екстрагують

ЕОАс (10 л). Органічні частини об'єднують, промивають розсолом (15 л), та концентрують до утворення масла червоного кольору. Масло очищають засобами хроматографії на силікагелі (75 кг силікагелю, 65-250 меш (0,211-0,066 мм)) з елююванням спочатку гексаном (40 л), потім сумішшю 2095 ЕОАс/гексан, і одержують фракцію (7,8 кг), яка на 3095 складається з етилціаноацетату і на 7095 з необхідного продукту. Матеріал концентрують перегонкою в тонкому шарі при температурі 100 "С і вакуумі 210 мілітор (27,998 Па), збираючи нелетку

Зо фракцію, і одержують вказану в заголовку сполуку (4,54 кг, 82 95).

Препаративна методика 8 трет-Бутил-4-(2-(4-аміно-б6-гідрокси-2-метилпіримідин-5-іллетил|піперидин-1-карбоксилат (в) Іс «Х,

МН»

М р он трет-Бутил-4-(3-ціано-4-етокси-4-оксобутил)піперидин-1-карбоксилат (2,18 кг, 6,73 моль), ацетамідину гідрохлорид (1,27 кг, 13,46 моль, аналітичний вихід 95 95) Примітка: гідрохлорид ацетамідину попередньо висушують дворазовим суспендуванням у толуолі (10 л) з подальшою відгонкою насухо в вакуумії, 21 95 розчин етоксиду натрію в ЕН (6,73 л, 20,19 моль) і ЕЮН (10 л) об'єднують в 22 л реакторі в атмосфері азоту. Реакційну суміш нагрівають до кипіння, та кип'ятять зі зворотним холодильником протягом 42 год. Льодяною оцтовою кислотою (1,2 л, 20,86 моль) значення рН реакційної суміші доводять до приблизно 5. ЕН видаляють вакуумною перегонкою на роторному випарнику. Одержані тверді речовини суспендують у воді (6 л), після чого їх відфільтровують, і промивають додатковою кількістю води (2 л). Тверді речовини сушать у вакуумній печі при температурі 50 "С, і одержують вказану в заголовку сполуку (1,72 кг, 76 95). "Н ЯМР (500 МГц, СОзОбБ) 5 4,83 (5, ЗН); 4,05 (й, 2Н), 2,75 (ре, 2Н), 2,39 (т, 2Н), 2,22 (5, ЗН), 1,78 (й, 2Н), 1,43 (т, 1Н) 1,42 (5, 9Н), 1,40 (т, 2Н), 1,38 (т, 2Н). Для одержання вказаної в заголовку сполуки (2,01 кг, 82 95) цей процес повторюють, по суті як описано, з використанням трет-бутил-4-(3-ціано-4-етокси-4-оксобутил)піперидин-1-карбоксилату (2,36 кг).

Препаративна методика 9

Дигідрохлоридна сіль 6б-аміно-2-метил-5-(2-(4-піперидил)етил|піримідин-4-олу,

МН

Неї

М ди

М он трет-Бутил-4-(2-(4-аміно-б6-гідрокси-2-метилпіримідин-5-іллетил|піперидин-1-карбоксилат (3,73 кг, 11,09 моль) та ІРА об'єднують в 50 л реакторі в атмосфері азоту. З перемішуванням протягом З год. додають 12н хлористоводневу кислоту (3,05 л, 36,6 моль). Суміш гріють при температурі 50 "С протягом 16 год., і одержують густу суспензію. На цей час дослідження засобами ЯМР показує відсутність трет-бутоксикарбонільної (ВОС) групи. Реакційну суміш охолоджують до температури 20-25"С, розбавляючи ТНЕ (12 л). Тверді речовини відфільтровують. Відфільтровування відбувається повільно і до завершення може тривати протягом 24 год. Фільтрат промивають ІРА (2х10 л). Матеріал сушать у вакуумній печі при температурі 50 "С, і одержують вказану в заголовку сполуку (3,117 кг, 91 Об).

Препаративна методика 10

Дигідрохлоридна сіль б-хлор-2-метил-5-(2-(4-піперидил)етиліІпіримідин-4-аміну,

Мн

МН»

Неї

М ди

М СІ

Дигідрохлоридну сіль б-аміно-2-метил-5-(2-(4-піперидил)етил|піримідин-4-олу (3,167 кг, 10,2 моль) і оксихлорид фосфору (30 л, 300 моль) об'єднують в атмосфері азоту в 50 л реакторі, який вентилюється через каустичний (10 95 Маон) скрубер. До перемішуваної суспензії додають 8595 розчин фосфорної кислоти (1 л, 8,5 моль). Суміш повільно нагрівають при температурі оболонки реактора 75 "С. При температурі приблизно 55 "С, коли відбувається вивільнення відхідних газів, скрубер охолоджують на водяній бані з льодом. Коли вивільнення відхідних газів

Зо уповільнюється, суміш гріють при температурі 90-957С протягом 50 год., по збіганні яких дослідження засобами тонкошарового хроматографування, і засобами ЯМР виявляють завершення реакції. Основну частину надлишку оксихлориду фосфору видаляють вакуумною перегонкою (вакуум: 22 дюйми рт. ст. (74,5 кПа), внутрішня температура: 60 "С), і одержують 20 л дистиляту. Суміш охолоджують до температури 20-25 "С, потім розбавляють толуолом (10 л).

Суміш додатково охолоджують до температури «15"С, і повільно гасять водою (1 л),, підтримуючи температуру «30 С. Після додання толуолу суміш стає дуже густою і важко перемішуваною, причому фаза, яка містить бажаний продукт, залишається в нижній частині реактора у вигляді в'язкої напівтвердої речовини. Лопаті мішалки піднімають для забезпечення хоч якогось змішування. У суміш додають ЕН (10 л), і перемішують протягом приблизно 18 год. при температурі 25"С. На цій стадії в'язкі напівтверді речовини ще не повністю розчинились, але стали м'якими настільки, що з них можна було відібрати пробу вручну.

Енергійне перемішування здійснюють протягом ще 4-5 год. для забезпечення повного розчинення. Одержану суспензію охолоджують до температури 5-10"С, тверді речовини відфільтровують, промивають МТВЕ (8 л), і одержують вологий продукт (близько 6 кг).

Неочищений продукт перекристалізовують розчиненням вологого відфільтрованого осаду в

Меон (35 л) при температурі 40 "С. Розчин концентрують вакуумною перегонкою з видаленням 15 л розчинника. Додають ІРА (35 л), і суспензію концентрують вакуумною перегонкою для видалення 13 л розчинника. Суспензію охолоджують до температури 5-10 "С, їі потім тверді речовини відфільтровують, та промивають спочатку ІРА (2 л), а потім МТВЕ (8 л). Тверді речовини сушать у вакуумній печі при температурі 55 "С, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини не зовсім білого кольору (2,77 кг, 82 965). Аналітично обчислено для Сі2НгїСізМа: С - 43,98; Н - 6,46; СІ - 32,46; М - 17,10. Встановлено: С - 43,63; Н -6,53;5С1-32,16; М - 16,86.

Препаративна методика 11 трет-Бутил-М-(1 5)-2-(4-(2-(4-аміно-6-хлор-2-метилпіримідин-5-іл)етил|-1-піперидил|-1-метил- 2-оксоетилікарбамат 2 н бук (в)

МН»

М рез сі

У кожну з двох круглих колб вносять 6б-хлор-2-метил-5-(2-(4-піперидил)етил|піримідин-4- аміну гідрохлорид (12,50 г, 42,92 ммоль), діізопропілетиламін (22,46 мл, 128,7 ммоль) і ОМЕ (100 мл). Дві суміші охолоджують на холодній водяній бані, і перемішують протягом 5 хв. У кожну з сумішей однією порцією додають |диметиламіно(тріазоло|4,5-б|піридин-3- ілокси)уметиленідиметиламонію гексафторфосфат (17,95 г, 47,21 ммоль) і (25)-2-(трет- бутоксикарбоніламіно)пропіонову кислоту (8,93 г, 47,21 ммоль). Суміші перемішують при кімнатній температурі протягом 90 хв. Суміші виливають в окремі ділильні лійки разом з водою (300 мл) і ЕЮАс (400 мл), струшують, і розділяють. Водні шари екстрагують ЕЮАсС (3х300 мл), відповідні органічні шари промивають водою (4х250 мл), насиченим водним розчином Масі (200 мл), і сушать над Мд5О», фільтрують, і концентрують при зниженому тиску. Об'єднані матеріали очищають засобами хроматографії на силікагелі, елююючи градієнтом 700-100 95 ЕЮАс в гексанах. Очищені фракції об'єднують, і концентрують при зниженому тиску. Залишок розбавляють ЕТОАс (500 мл), і промивають насиченим водним розчином МНАаСіІ (100 мл), насиченим водним розчином МанНсоз (100 мл), водою (100 мл) і насиченим водним розчином

Масі (100 мл). Органічні речовини сушать над Мо9зО».:, фільтрують, концентрують при зниженому тиску, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини білого кольору (28,00 г, 76 95). І С-ЕБ/М5 т/2 (3501/37СІ) 4262/4282 (М-1).

Препаративна методика 12 (25)-2-аміно-1-(4-(2-(4-аміно-б6-хлор-2-метилпіримідин-5-іл)етил|- -1-піперидил|пропан-1-он о

Мн.

Мт ро

Коо) М сі трет-Бутил-М-(1 5)-2-(4-(2-(4-аміно-6-хлор-2-метилпіримідин-5-іл)етил|-1-піперидил|-1-метил- 2-оксоетилікарбамат (15,78 г, 37,05 ммоль) розчиняють в ОСМ (185 мл), краплями протягом З хв додають ТЕА (185 мл), і перемішують протягом ночі. Перебіг реакції аналізують засобами І СМ5 (низьке значення рН), щоб засвідчити повне перетворення. Повільно додають Меон (400 мл), оскільки під час змішування відбувається екзотермічна реакція. Три колонки ЗСХ (50 г) попередньо промивають водою (20 мл), потім Меон (20 мл). Реакційну суміш розділяють на три рівні частини, і порівну завантажують у колонки СХ. Кожну колонку промивають водою (40 мл), і МеОнН (40 мл), при цьому змиви збирають у вакуумну колбу. Необхідний матеріал елююють з колонок ЗСХ в чисту посудину з використанням 2 н. розчину аміаку в МеоОнН (60 мл). Продукт, що містить розчини, концентрують при зниженому тиску, тричі викип'ячують з сумішшю

ОСМ:гексанів (1:11), поміщають під вакуум, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді піни білого кольору (10,29 г, 84 95). | СО-ЕБ/М5 т/» (3501/37СІ) 326,2/328,2 (М--1).

Препаративна методика 13

Хлористоводнева сіль (25)-2-аміно-1-(4-(2-(4-аміно-6-хлор-2-метилпіримідин-5-іл)етил|-1- піперидил|пропан-1-ону ж

Мн 2 на

І

Ку

М с трет-Бутил-М-(1 5)-2-(4-(2-(4-аміно-6-хлор-2-метилпіримідин-5-іл)етил|-1-піперидил|-1-метил- 2-оксоетилікарбамат (28,75 г, 67,49 ммоль) додають в 1,4-діоксан (143,7 мл). Потім в 1,4-діоксан додають 4 М хлористий водень (168,7 мл, 674,9 ммоль), і перемішують протягом 10 хв. Додають

Меон (20 мл), і суміш інтенсивно перемішують протягом З год. Суміш концентрують при зниженому тиску, тверді речовини розбавляють діетиловим простим ефіром (200 мл), і перемішують протягом ночі. Матеріал фільтрують з промиванням діетиловим простим ефіром (2х25 мл). Матеріал сушать з розрідженням протягом 15 хв, після чого поміщають у вакуум на 1 год. при температурі 45 "С, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді неочищеного порошку білого кольору (27,7 г). ГС-ЕБ/М5 т/ (25С1/37СІ) 326,1/328,2 (МАТ).

Препаративна методика 14

Дигідрохлоридна сіль (25)-2-аміно-1-(4-(2-(4-аміно-6-хлор-2-метилпіримідин-5-іл)етил|/|-1- піперидил|пропан-1-ону

Ге)

МН ке 2

МН» гне

М ре

М СІ

ІРА (154 мл) нагрівають до температури 50 "С, і повільно, оскільки відбувається екзотермічна реакція, додають ацетилхлорид (19,3 мл, 271 ммоль). Реакційну суміш перемішують при температурі 50 "С протягом 10 хв, після чого додають трет-бутил-М-((1 5)-2-І(4- (2-(4-аміно-6-хлор-2-метилпіримідин-5-іл)/етил|-1-піперидил/|-1-метил-2-оксоетиліІкарбамат (21,0 г, 45,3 ммоль). Реакційну суміш перемішують протягом 2 год. з моніторингом засобами Ї/СМ5 (низьке значення рН). Реакційну суміш охолоджують до кімнатної температури, і додають діетиловий простий ефір (386 мл). Суспензію перемішують протягом 15 хв. Тверді речовини відфільтровують, і швидко промивають діетиловим простим ефіром (2х50 мл), оскільки матеріал є гігроскопічним. Матеріал фільтрують, і сушать фільтруванням протягом 1 хв, після чого сушать у вакуумній сушильній печі при температурі 50 "С протягом ночі, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді порошку білого кольору (18,4 г). ГС-ЕБ/М5 т/2 (2521/8701) 326,1/328,2 (М--1). Результати аналізу протиіїонів засобами іонної хроматографії відповідають дигідрохлоридній солі.

Приклад 1

М-(1 5)-2-І4-(2-(4-аміно-6-хлор-2-метилпіримідин-5-іл)етил|-1-піперидил/)|-1-метил-2-

Зо оксоетил|циклопропанкарбоксамід

Ї С

М і)

Мн.

Мт

Ай

М СІ

1-гідрокси-7-азабензотриазол (281 мг, 2,03 ммоль) і 1-(З-диметиламінопропіл)-3- етілкарбодіїміду гідрохлорид (430 мг, 2,21 ммоль) додають до суспензії циклопропанкарбонової кислоти (161 мкл, 2,03 ммоль), (25)-2-аміно-1-(4-(2-(4-аміно-б6-хлор-2-метилпіримідин-5-іл)етил|- 1-піперидил|пропан-1-ону (600 мг, 1,84 ммоль) в безводному ТНЕ (12 мл). Потім додають ТЕА (770 мкл, 5,52 ммоль), і перемішують одержану суміш при кімнатній температурі протягом 12 год. Реакційну суміш розбавляють ЕЮАс (10 мл), фільтрують через діатомову землю, і фільтрат концентрують іп масо. Одержаний залишок очищають засобами високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою з мас-спектрометрією (Адіїепі? 1200 | СМ5 і мас-спектрометр

М5О, колонка Рпепотепех Сетіпі-МХУ, 75х30 мм, розмір частинок 5 мкм, із запобіжним пристроєм 10х20 мм, 12-46 95 АСМ у 10 мм водному розчині бікарбонату амонію, рН 10, градієнт протягом 9 хв), і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді безбарвного скла (572 мг, 78 965). І С-ЕБМ5 т/л (3501/37СІ) 394,2/396,2 (МАН).

Альтернативна методика з 1-пропанфосфоновим ангідридом

Розчин (25)-2-аміно-1-І(4-(2-(4-аміно-6-хлор-2-метилпіримідин-5-іл)етил|-1-піперидил|пропан- 1-ону, дигідрохлоридної солі (107,4 г, 183,15 ммоль) в ОСМ (584 мл) обробляють ОІРЕА (128 мл, 732,59 ммоль). Реакційну суміш охолоджують до температури 0 "С на льодяній бані, і додають циклопропанкарбонову кислоту (21,8 мл, 274,72 ммоль). Після цього додають спочатку розчин 1-пропанфосфонового ангідриду (50 95 розчин в ЕІОАСс, 174,8 г, 274,72 ммоль) з наступним доданням додаткової кількості ОІРЕА (40 мл) для доведення реакційної суміші до лужного значення рН. Суміш перемішують при кімнатній температурі протягом ночі. Реакційну суміш промивають водою (1 л), і шари розділяють. Органічну частину сушать над Маоаз5ох, концентрують іп масио, і одержують неочищений продукт у вигляді піни не зовсім білого кольору. Матеріал очищають засобами хроматографії на силікагелі (800 г, 0-10 95 розчин Меон в ЕІЮАс). Відповідні фракції об'єднують з іншою партією продукту (51 г), яка була одержана по суті за тією ж самою процедурою з використанням (25)-2-аміно-1-І4-(2-(4-аміно-б-хлор-2- метилпіримідин-5-іл)етил|-1-піперидил|пропан-1-ону, дигідрохлоридної солі (77,9 г, 150,42 ммоль). Об'єднані партії концентрують іп масио, і одержують тверду речовину білого кольору (114 г). Продукт починає кристалізуватися під час концентрації. Матеріал розтирають з гарячим

ЕОАс (200 мл), охолоджують, фільтрують, і одержують вказану в заголовку сполуку (111 г, 84 96). Ї0-ЕБ/М5 т/2 (3501/37СІ) 394,0/396,0 (МА-1). Хіральний аналіз (колонка О0-Н, 25 95

МеонН/РІМН», 5,0 мл/хв, 100 бар, 35 "С, 220 нм) показав енантіомерний надлишок »99,9 95;

Тв-1,15 хв.

СОАТ являє собою основний фермент, який перетворює САС на Ас. Огляди ролі СОАТ і греліну дивись: Кгізїу М. Неррпег еї аї., Те дпгеїїп О-асупгапвіегазе-днгєїїп вубзівет: а поме геашайг ої діисозе теїабоїїзт, Сцтепі Оріпіоп іп Епдосгіпоіоду, Оіабеїез 45 Обезйпу 2011, 18:50- 55; РПїййр А. Соїє еї аїЇ., Сіисозе апа МУ/еідні СопігоЇ іп Місе м/йй а Оевзідпей ангеїїп

ОАсуйгапвієгаве Іппірйог, Зсіепсе. 2010 Оесетрег 17; 330(6011): 1689-1692. дої:10.1126/5сіепсе.1196154, Манніав Н. Т5спцур еї аї., Савігіс О-асу! іапвітегазе асіїмаїез пПипдег відпа! ю Ше Бгаїп, Ргос Маї! Асай 5сі ОБА. 2008 Арії 29; 105(17): 6213-6214, та девив Ссішіе!телг, еї а!., СНгеїїп остапоуїайоп теадіаїеа Бу ап огрНап Ііріа ігапеіегазе, Ргос Маї! Асай 5сі О5А., 2008

З5 Арії 29, 105 (17): 6320-6325.

На підтвердження ролі СОАТ свідчать фенотипи, що спостерігали у мишей, позбавлених гена СОАТ. Таким чином, очікується, що інгібування СОАТ знизить рівень циркулюючого Ас і підвищить рівень циркулюючого АС. Отже, відношення АС до загального греліну (ШАСТАС) знижується після обробки інгібітором СОАТ.

Іп міго безклітинний ферментативний аналіз людського ЗОАТ

Ген людської СООАТ (номер депонування: ММ 001100916) субклонують у бакуловірусний експресійний вектор рАМ51. Стоковий розчин бакуловірусу одержують відповідно до протоколу

Вас-ю-Вас, який надається постачальником, компанією Іпмігодеп, Каліфорнія, США. П'ять мілілітрів стокового розчину бакуловірусу з люодською ЗОАТ додають до 500 мл клітин 509 у середовищі Нус 5ЕХ-Іпзесі"М (номер за каталогом компанії НуСіопе 5НЗ30278.02) при густині 1х106 клітин на мілілітр в 2 л колбі Ерленмейера. Колбу з клітинами 509, інфікованими геном людської СОАТ, поміщають на 48 год. на планшетний шейкер при 120 об/хв і при температурі 28 "С. Після 48 год. інкубування клітини центрифугують при 10009 протягом 10 хв при температурі 4 "С. Дебріс збирають, і зберігають при температурі -80 "С в морозильній камері до

БО готовності для подальшої обробки.

Одержання мікросомної мембрани ферменту СОАТ для ферментативного аналізу:

Один грам дебрісу суспендують в 9У мл охолодженого гомогенізаційного буфера (50 мМ розчин Тріс-НСІ, 250 мМ розчин сахарози, відрегульований до рН 7,5 і відфільтрований за стерильних умов через 0,2 мкм фільтр Мійроге). Суспензію клітин переносять в скляний гомогенізатор Даунса. Дебріс гомогенізують 40 ударами на льоду. Гомогенат центрифугують при 3000 об/хв в бакет-роторі компанії Весктап при температурі 4 "С протягом 10 хв для видалення незруйнованих клітин. Супернатант збирають, і центрифугують при 400009 протягом 1 год. при температурі 4 "С. Одержаний осад мембран суспендують в гомогенізаційному буфері з використанням скляного гомогенізатора Даунса, і зберігають при температурі -207С в бо морозильній камері для аналізу. Для тривалого зберігання препарату мембран людського ферменту СОАТ, суспендовані мембрани зберігають в морозильній камері при температурі - 80 с.

Протокол ферментативного аналізу людської ЗОАТ:

Досліджувані сполуки готують в ОМ5О для одержання 0,2 мМ маточного розчину. Маточний розчин послідовно розбавляють в ОМ5О для одержання десятиточкової кривої розведення з кінцевими концентраціями сполук в межах від 10 мкМ до 0,5 нМ в 96-лунковому круглодонному планшеті. Розчини ферменту і субстрату готують в аналітичному буфері (0,02 95 Тмеєп"М-20 в 50 мМ Тріс-буфері, рН 7,5; 250 мМ розчин цукрози; 1 мг/мл В5А; 10 мм розчин ЕОТА). У кожну лунку рядків А-М відповідного 384-лункового планшету з низьким зв'язуванням білку додають розбавлену сполуку (1 мкл). До цих сполук додають суміш субстрату людської СОАТ (10 мкл), що складається з людського дезацил-греліну-біотину (компанія СРС бсіепійіс Іпс., кінцева концентрація 6,0 мкМ), октаноїл-СоОА (компанія 5ідта, кінцева концентрація 6О мкМ) і Ас- специфічного антитіла (М/О 2006/091381) (кінцева концентрація 1,0 мкг/мл). Для запуску реакції в кожну лунку планшета, що містить субстрат і досліджувані сполуки, додають препарат ферменту СОАТ-НІіз/519, який був підготовлений у буфері для аналізу (9 мкл), і одержують кінцеву концентрацію 0,01 мкг/мл. Суміш інкубують протягом 1 год. при кімнатній температурі на осціляторі, що обертається з невеликою швидкістю. У всі лунки додають 4 М розчин гідрохлориду гуанідину (20 мкл), перемішують, та інкубують протягом З год. для зупинення реакції.

Планшети для проведення ЕГІЗА (ЗТЕЕРТАМІСІМ 5РЕСТЕАРІ АТЕ"М 384, компанія Регкіп

ЕІтег) готують блокуванням протягом З год. блокувальним буфером (2 95 розчин інактивованої нагріванням ЕВ5 в РВ5 (40 мкл) (компанія Іпмігодеп)). Блокувальний буфер з планшету для проведення ЕГІ5А відсмоктують, і додають цей блокувальний буфер (23 мкл) у стовпчики 1-24, рядки А-М. Рядки О і Р зберігають для стандартної кривої ацилгреліну. На планшети для проведення ЕГІЗА додають реакційну суміш (2 мкл). Послідовним 2х розведенням в блокувальному буфері, що містить 0,2 М розчин гуанідину гідрохлориду, розпочинаючи з 2,5 пМ, одержують 10-точкову стандартну криву (мічений біотином октаноїл-грелін). Реакційну суміш або мічений біотином стандарт АС інкубують на планшеті для проведення ЕГІЗА протягом ночі при температурі 4 "С. Наступного дня планшети промивають Зх буфером для промивання

Зо (0,1 96 Тмееп"М-20/РВ5, 100 мкл на лунку в кожному циклі промивання). У кожну лунку додають

Асі-специфічне антитіло (МО 2006/091381) (25 мкл розчину 0,5 мкг/мл в блокувальному буфері), та інкубують при кімнатній температурі протягом 1 год. Планшет промивають Зх буфером для промивання, аналогічно попередній стадії. Додають суміш протеїну С-НЕР (пероксидаза хрону) (25 мкл) (компанія ЗошПНеїт Віоїесі), розбавлену в 3000х у блокувальному буфері, та інкубують протягом 1 год. при кімнатній температурі. Востаннє промивають Зх буфером для промивання, аналогічно попередній стадії. У кожну лунку додають реагент ТМВ (25 мкл) (компанія КігКедаага 5 Реїту І арогайогієб5, Іпс.), витримують для проявлення протягом 20 хв, і зупиняють 1 М розчином фосфорної кислоти (25 мкл на лунку)ї Планшети зчитують при 450 нм із використанням планшет-рідера Епмізіоп Мийі ареї. Рівні АС розраховують у порівнянні з підігнаною стандартною кривою, і обчислюють відсоток інгібування. Будують 10-точкову криву інгібування, і підганяють із застосуванням чотирипараметричного логістичного рівняння для одержання значень ІСво, використовуючи програмне забезпечення Асіїміу Вазе (версія 7.3.2.1).

У результаті виконання протоколу, по суті як описано вище, виявляють, що сполука

Прикладу 1 має ІСво приблизно 192573 нм, (п-5). Ці дані свідчать, що сполука Прикладу 1 пригнічує активність очищеного ферменту СОАТ іп міїго.

Порівняння зміни відношення АС до загального греліну в пацієнтів групи, яка одержувала сполуку, і того самого показника в пацієнтів групи, яка одержувала носій, відображає ступінь інгібування ферменту СОАТ іп мімо внаслідок динамічної обробки ШАС до АС ферментом

СОАТ. У наведених у цьому описі фармакодинамічних дослідженнях іп мімо рівні АС і АС у плазмі та в шлунку пацієнтів груп, які одержували носій і сполуку, визначають із застосуванням

ЕГІЗА спеціально для цих двох досліджуваних речовин. Загальний рівень греліну кожного зразка обчислюють як суму визначених Ас і АС із застосуванням ЕГІЗА. Відношення АС до загального греліну визначається рівнем Ас у кожному зразку, поділеному на рівень загального греліну в тому ж зразку. Рівні АС, ОА і відношення Ас до загального греліну в пацієнтів групи, яка одержувала носій, обчислюють, і приймають за 100 95. Далі обчислюють відносну зміну цих параметрів у пацієнтів групи, яка одержувала сполуку, для визначення ефективності досліджуваної сполуки.

Іп мімо дозозалежне З3-денне (двічі на день) дослідження інгібітора СОАТ:

Тварини і обробка: бо Мишей-самців лінії С57ВІ /6 закуповують від компанії Напап (Іпаіапароїї5, штат Індіана) в 9-

тижневому віці Мишей розміщують індивідуально в приміщенні з контрольованою температурою (242) та з 12 год. циклом чергування світла/темряви (світло вмикають о 22.00), а також забезпечують вільний доступ до стандартного корму для гризунів (раціон 2014, компанія

Напап) і води. Мишей використовують здебільшого у віці 10-13 тижнів на момент проведення дослідження. У день 0 експерименту мишей довільно розподіляють на експериментальні групи (М-7 мишей на групу) так, щоб середня маса тіла мишей у кожній згаданій групі була однаковою. У день 1 і день 2 тваринам о 7 год. ранку і о 7 год. вечора із використанням шлункового зонда в різних дозах вводять носій (1 95 гідроксіетилцелюлоза, 0,25 95 Тмжеєп 80, 0,05 95 піногасник) або досліджувану сполуку, яка представляє собою суспензію в носії. На 3-й день тварин не годують, пересаджують їх у чисті клітки, і о 8 год. ранку знову із використанням шлункового зонда вводять носій або досліджувану сполуку. Того ж дня о 13.00 тварин забивають шляхом обезголовлювання для збору крові. Детально про збирання крові і обробку плазми див. у наведених нижче розділах Збирання крові і Екстрагування греліну з плазми.

Збирання крові:

У попередньо зважену пробірку з ЕОТА, що містить 600 мкл (цей об'єм позначають як

Мконсерванту (Мргезегаїмеу) СсВІЖОпПриготовленого консерванту (4 мМ розчин РЕРАВГОС-, |4-(2- аміноетил)бензолсульфонілфториду гідрохлориді, 72 мМ розчин Масі, 58 мМ розчин Мак, 0,032

М розчин хлористоводневої кислоти, рН 3,0), збирають приблизно 600 мкл крові, і відразу ж перемішують. Пробірку знову зважують, і тримають на льоду. Для правильного визначення точного об'єму крові кожного зразка з використанням цієї процедури для збирання крові масу крові для кожної миші обчислюють з використанням такого рівняння:

Маса крові-(маса пробірки, що містить кровжконсервант)-(маса пробірки, що містить консервант)

Об'єм крові (Мкрові)/Мьооа) 7 (Маса крові)/1,06.

Слід зауважити, що щільність крові гризуна приймається 1,06 г/мл.

Протягом 15 хв після збору крові зразки центрифугують при 5000 об/хв і при температурі 4 "С протягом 8 хв. Плазму (650 мкл) видаляють до 5 мл скляної пробірки, що містить 1 н. розчин хлористоводневої кислоти (65 мкл), перемішують, і тримають на льоду.

Екстрагування греліну на колонці ЗЕР-РАКО:

Зо АС і ПАС екстрагують з плазми з використанням колонки ЗЕР-РАК? С18 для для усунення взаємного впливу перед проведенням ЕГІЗА. Твердофазне екстрагування пептидів АС і АОС з використанням колонки ЗЕР-РАК? С18 може здійснюватись на вакуумному колекторі (компанія

Умаїег5 Согр.) або з використанням перистальтичного насоса. Процедурі екстрагування зразку з використанням колонки ЗХЕР-РАКО незалежно піддають зразки плазми, одержані від кожної окремої миші. Загальний протокол екстрагування описаний нижче.

Необхідно, щоб усі розчини, що використовуються для всього протоколу екстрагування з використанням колонки ЗЕР-РАК?О, мали температуру танення льоду. Колонки ЗЕР-РАК? (ММАТО54960, компанія Умаїег5 Согр, Мійога, штат Массачусетс) зволожують сумішшю 99,9 95

АСМ/О,1 95 ТРА (1 мл суміші, що складається зі 100 мл АСМ/0,1 мл ТЕА). Швидкість потоку із застосуванням тиску доводять до приблизно 1 мл/хв для видалення рідини з шару колонки, але висихання колонки на будь-якій стадії не допускають. Після видалення рідини з колонки тиск знімають. Колонки врівноважують сумішшю З 95 АСМ/О,1 95 ТЕА (1 мл суміші, що складається з 97 мл води, З мл АСМ, 0,1 мл ТЕА). Швидкість потоку із застосуванням тиску доводять до приблизно 1 мл/хв для видалення рідини з шару колонки, але висихання колонки не допускають.

Приблизно 650 мкл підкисленої плазми (визначається як Мплазми, завантаженої в колонку (Мріаєта Іоадес їо соїшти)) розбавляють в 1,4 мл 0,195 ТЕА, що має температуру танення льоду. У колонки завантажують усю розбавлену підкислену плазму з попередньої стадії. Для доведення швидкості потоку до приблизно 0,5 мл/хв для проходження зразку через колонку і абсорбування пептидів греліну смолою колонки застосовують тиск. Висихання колонки не допускають.

Промивають сумішшю З 95 АСМ/О,1 95 ТЕА (0,9 мл суміші, що містить 97 мл води, З мл АСМ, 0,1 мл ТЕА). Швидкість потоку із застосуванням тиску доводять до приблизно 1 мл/хв для видалення рідини з шару колонки, але висихання колонки не допускають. Промивання повторюють ще два рази. Елююють сумішшю 60 95 АСМ/О,1 95 ТЕА (1 мл суміші, що містить 40 мл води, 60 мл АСМ, 0,1 мл ТЕА). Під кожну колонку поміщають пробірку для збирання, і для проштовхування рідини через колонку прикладають тиск для доведення швидкості потоку до приблизно 0,5 мл/хв, і збирають елюент у пробірку для збирання. Зразки негайно заморожують на сухому льоду. Зразки ліофілізують на швидкісній вакуумній сушарці (модель Мо 5С110А, компанія ЗамапО), і зберігають при температурі -20 "С до проведення дослідження методом (510) ЕПЗА.

Визначення греліну методом ЕГІЗА: 9б-лункові планшети МОЇ ТІ-АВВАМУ? М50? (компанія Мезо Бсаїе Оізсомегу, Сайпегебрегод, штат Меріленд, Мо за каталогом: Ї15ХА-3) сенсибілізують 100 мкл (1 мкг/мл) антитіла (МИО2005/026211 та УМО2006/019577), яке розпізнає середину домену як ацильованої, так і неацильованої форми греліну в РВЗ5 (компанія Іпмйгодеп). Легсими ударами обстукують бічні сторони планшетів для забезпечення повного вкривання лунок, герметизують засобом для заклеювання планшетів, та інкубують протягом ночі при кімнатній температурі. Вміст планшета видаляють, і в кожну лунку додають розчин ВіосКег"М Сазеїп в РВ5 (25 мкл) (компанія Тпегто зсіепійіс, Косктога, штат Іллінойс, Мо за каталогом: 37528). Планшети повторно герметизують, і встановлюють на 1 год. на планшетний шейкер при кімнатній температурі.

Ліофілізовані зразки плазми, збережені після екстрагування на колонці ЗЕР-РАК? С18 в

ВіосКе! М Сазеїп, відновлюють в РВ5 (400 мкл до кожного зразка, цей об'єм визначається як

Мвідновлення (М гесопеійшіоп)), Добре перемішують із використанням вібраційного змішувача, та інкубують на льоду протягом 45-60 хв. Вміст згаданих планшетів видаляють, і в кожну лунку додають відновлені зразки плазми по 25 мкл. Для побудови стандартних кривих готують розчини ацилгреліну і неацильованого греліну, починаючи з 8000 пг/мл, і здійснюючи послідовні розведення 1:4, загалом 8 концентрацій. У кожні дві лунки блокованих планшетів додають по 25 мкл підготовлених стандартів. Планшети герметизують, та інкубують при кімнатній температурі на планшетному шейкері протягом 2 год.

Вміст планшетів видаляють, і тричі промивають планшети РВ5, що містить 0,1 95 Тмееп'"м 20 (150 мкл) (РВ5-Т). Антитіло, специфічне до ацилгреліну (М/О 2006/091381), або антитіло, специфічне до неацильованого греліну (МО 2006/055347), мічене М5О БИ! РО-ТАСМ (компанія

Мезо Зсаїіе Рібсомегу), розбавляють до 0,05 мкг/мл в 0,2хВіосКег Сазеїп, що містить 0,05 95

Тмееп'"М 20, і помічають цей розчин як розчин другого антитіла. Кінцевий змив видаляють, і додають розчин другого антитіла (25 мкл в кожну лунку), яке специфічно розпізнає АС або ОАО.

Планшети знову герметизують, та інкубують протягом 1 год. при кімнатній температурі на планшетному шейкері перед кінцевим промиванням Зх, яке знову здійснюють за допомогою

РВ5-Т (150 мкл на лунку).

Кінцевий змив видаляють, і замінюють на зчитувальний буфер 1хМ50О (150 мкл на лунку).

Аналізатором М5О? 5ЕСТОВ? Ітадег 6000 (компанія Мезо бБсаІєе Оізсомегу) зчитують електрохемілюмінесцентний сигнал, що генерується активацією мітки МО ИЙ РО-ТАдат, зв'язаної з електродами на планшетах. Концентрації ацилгреліну або неацильованого греліну обраховують на основі відповідної стандартної кривої, одержаної з використанням програмного забезпечення компанії М5О?. Фактичну концентрацію в плазмі для кожного зразка визначають множенням визначеного рівня ацилгреліну або неацильованого греліну на коефіцієнт розбавлення (ОіїшіопРасіог). Коефіцієнт розбавлення для кожного зразка плазми обчислюється за наведеним нижче рівнянням:

Мова У ;

РіишіопЕасіок - (ет ниних й пен х рннанн-

Мова М іазта Івсадей го соїнтп

Результати:

Введення сполуки Прикладу 1 протягом З днів у концентрації 0,3 мг/кг, 1,3 мг/кг і 10 мг/кг, відповідно, зменшує рівні АС у плазмі на -1 Фо, 5 Фо, 45 905 і 48 9о, і підвищує рівні ОАО в 2,24, 2,82, 2,53 і 2,89 рази (результати представлені в наведеній нижче таблиці). Наслідком введення 0,3 мг/кг, 1 мг/кг З мг/кг і 10 мг/кг згаданої сполуки відповідно є 39 95, 54 У, 71 9о і 77 96 зниження відношення Ас до загального греліну в порівнянні з контрольними тваринами, які одержували носій. Ці результати свідчать, що сполука Прикладу 1 пригнічує продукування Ас і підвищує рівень АС в системі кровообігу, як показано іп мімо на мишах з нокаутованим геном соОАТ. осяте | сдшрик Мр (внери СТ ноя

Обробка (відсоток від (відсоток від . й й . (відсоток від контрольного носія) контролю) контрольного носія)

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Сполука, що має формулу (в) Н М и 7 (в) МН, ех Ж, М СІ або її фармацевтично прийнятна сіль.

2. Сполука за п. 1, що має формулу (в) Н М ке 7 (в)

МН. ех Ж с4 М СІ або її фармацевтично прийнятна сіль.

3. Сполука за будь-яким з пп. 1 або 2, що має формулу (в) Н М ке 7 (в) МН, ех Ж, М СІ

4. Фармацевтична композиція, що містить сполуку за будь-яким з пп. 1-3 або її фармацевтично прийнятну сіль і один або більше фармацевтично прийнятних носіїв, розріджувачів або наповнювачів.

5. Фармацевтична композиція за п. 4, що містить один або більше інших терапевтичних агентів.

6. Спосіб зниження приросту маси тіла, що включає введення сполуки за будь-яким з пп. 1-3 або її фармацевтично прийнятної солі пацієнту, який цього потребує.

7. Спосіб зниження повторного приросту маси тіла, що включає введення сполуки за будь-яким з пп. 1-3 або її фармацевтично прийнятної солі пацієнту, який цього потребує.

8. Спосіб лікування ожиріння, що включає введення сполуки за будь-яким з пп. 1-3 або її фармацевтично прийнятної солі пацієнту, який цього потребує.

9. Спосіб лікування цукрового діабету 2 типу, що включає введення сполуки за будь-яким з пп. 1-3 або її фармацевтично прийнятної солі пацієнту, який цього потребує.

10. Сполука за будь-яким з пп. 1-3 або її фармацевтично прийнятна сіль для застосування в терапії.

11. Сполука за будь-яким з пп. 1-3 або її фармацевтично прийнятна сіль для застосування в зниженні приросту маси тіла.

12. Сполука за будь-яким з пп. 1-3 або її фармацевтично прийнятна сіль для застосування в зниженні повторного приросту маси тіла.

13. Сполука за будь-яким з пп. 1-3 або її фармацевтично прийнятна сіль для застосування в лікуванні ожиріння.

14. Сполука за будь-яким з пп. 1-3 або її фармацевтично прийнятна сіль для застосування при лікуванні діабету 2 типу.

15. Застосування сполуки за будь-яким з пп. 1-3 або її фармацевтично прийнятної солі при виготовленні лікарського засобу для зниження приросту маси тіла.

16. Застосування сполуки за будь-яким з пп. 1-3 або її фармацевтично прийнятної солі при виготовленні лікарського засобу для зниження повторного приросту маси тіла.

17. Застосування сполуки за будь-яким з пп. 1-3 або її фармацевтично прийнятної солі при виготовленні лікарського засобу для лікування діабету 2 типу.

18. Застосування сполуки за будь-яким з пп. 1-3 або її фармацевтично прийнятної солі при виготовленні лікарського засобу для лікування ожиріння.