KR101738406B1 - 캔디다 트로피칼리스 유래의 피루베이트 데카르복실라아제가 도입된 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 효모 및 이를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법 - Google Patents

캔디다 트로피칼리스 유래의 피루베이트 데카르복실라아제가 도입된 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 효모 및 이를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 효모 및 이를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명은 자체 보유 피루베이트 데카르복실라아제보다 활성이 낮은 캔디다 트로피칼리스 유래의 피루베이트 데카르복실라아제를 균체 내로 도입함으로써, 2,3-부탄다이올의 생산에 부산물로 작용하는 에탄올이 생성 안 되면서도 아세틸-CoA의 합성은 가능해, 균체의 성장속도 및 기질 소모 속도가 증가시킬 수 있었다. 이를 통해, 궁극적으로 2,3-부탄다이올의 생산성을 크게 향상시킬 수 있었다.

Description

캔디다 트로피칼리스 유래의 피루베이트 데카르복실라아제가 도입된 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 효모 및 이를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법 {Recombinant Saccharomyces cerevisiae for the production of 2,3-butanediol with pyruvate decarboxylase from Candida tropicalis and method for the production of 2,3-butanediol therefrom}
본 발명은 자체 보유 피루베이트 데카르복실라아제보다 활성이 낮은 캔디다 트로피칼리스 유래의 피루베이트 데카르복실라아제를 균체 내로 도입함으로써, 2,3-부탄다이올의 생산에 부산물로 작용하는 에탄올의 생성은 최소화되나, 생육에 필요한 아세틸-CoA를 생산할 수 있는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 효모 및 이를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법에 관한 것이다.
2,3-부탄다이올(2,3-butanediol)은 용매, 부동액, 가소제, 의약품, 화장품 등을 구성하는 주요 물질의 합성에 이용되는 화학 물질이며, 액체 연료 첨가제인 MEK(Methyl Ethyl Ketone)의 생산, 자동차 타이어의 원료 물질인 SBR(Stylene-butadiene Rubber)의 합성을 위한 1,3-부타디엔의 전구체로 사용되고 있는 바이오화학소재이다.
생물학적 방법을 이용하여 2,3-부탄다이올을 생산하기 위해서는 대사공학적 기술을 응용하여, 2,3-부탄다이올 균주를 개발해야 하고, 최적의 발효 공정을 개발해야 한다. 특히, 2,3-부탄다이올의 대량 생산을 위한 균주의 안전성을 확보하고, 상업화를 위하여 높은 수율과 높은 생산성을 갖는 균주의 개발이 필요하다.
한편, 2,3-부탄다이올의 생산을 위해 사용된 기존의 균주로는 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca ), 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae), 아에로박터 아에로게네스(Aerobacter aerogenes), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa ), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 등이 있었다.
그런데, 상기 균주들은 2,3-부탄다이올을 고수율/고생산성으로 생산할 수 있음에도 불구하고, 병원성 미생물로 분류되어 안전 및 산업화에 태생적인 한계가 있었다. 이에 GRAS 미생물로 잘 알려진 효모를 이용하여 2,3-부탄다이올을 생산하는 기술이 종래에 개발되었다. 하지만, 효모는 산업적으로 2,3-부탄다이올 생산 균주로 이용되기에는 다음의 한계점을 가지고 있었다.
기존 기술에서는 2,3-부탄다이올의 주요 전구체인 파이루베이트를 에탄올로 전환되는 것을 막기 위하여 핵심 유전자인 PDC (pyruvate decarboxylase) 유전자를 제거한 효모 균주를 이용하였다. 이 효모 균주는 2,3-부탄다이올 생합성 경로를 도입하여 높은 수율의 2,3-부탄다이올을 생산하는 데에는 성공하였지만, PDC 효소의 제거에 따라 세포 성장 및 기질 소모 속도가 현저히 감소하여 2,3-부탄다이올의 생산성이 현저히 낮은 문제가 있었다.
따라서, 효모를 이용하여 2,3-부탄다이올을 상업적으로 생산하기 위해서는 기존 균주의 갖는 낮은 세포 성장 속도 및 기질 소모 속도를 해결해야 하는 문제가있었던 것이다.
대한민국 특허공개번호 제10-2015-0068581호 (공개일자 2015. 06. 22)에는, 2,3-부탄다이올(2,3-Butanediol)의 생합성 경로가 대사공학적으로 조절된 재조합 효모를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법에 관한 것으로, 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarboxylase) 효소 활성이 억제되고, 2,3-부탄다이올 생합성 관련 외래 유전자와 자일로스 대사 관련 외래 유전자가 도입된 재조합 효모를 이용하여 글루코스 또는 자일로스로부터 2,3-부탄다이올을 생산할 수 있는 기술이 기재되어 있다.
본 발명에서는 기존의 2,3-부탄다이올 생산용 균주가 갖는 낮은 세포 성장 속도 및 기질 소모 속도를 해결하여 고 생산성으로 2,3-부탄다이올을 생산할 수 있는 방법을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은, 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능이 소실되도록 형질전환되며, 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환되고, 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)가 발현되도록 형질전환되며, 아세토락테이트 데카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환되고, 부탄다이올 데하이드로지나아제(butanediol dehydrogenase)가 발현되도록 형질전환된 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 제공한다. 이때, 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)는, 일 예로 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다.
본 발명의 2,3-부탄다이올 생산용 효모 균주는 자체 보유 피루베이트 데카르복실라아제 (Pdc)보다 활성이 낮은 캔디다 트로피칼리스 유래의 Pdc를 균체 내로 도입함으로써, 에탄올 생성이 안 되면서도 아세틸-CoA의 합성은 가능해 균체의 성장속도 및 기질 소모 속도가 증가시킬 수 있었고, 궁극적으로 2,3-부탄다이올의 생산성을 크게 향상시킬 수 있었다.
한편, 본 발명의 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에 있어서, 상기 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능이 소실되도록 형질전환하는 것은, 일 예로, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균체로부터, 피루베이트 데카르복실라아제 1 (pyruvate decarboxylase 1)을 암호화하는 PDC1 유전자의 일부를 파쇄하거나 전체를 제거하고, 피루베이트 데카르복실라아제 5 (pyruvate decarboxylase 5)를 암호화하는 PDC5 유전자의 일부를 파쇄하거나 전체를 제거하며, 피루베이트 데카르복실라아제 6 (pyruvate decarboxylase 6)을 암호화하는 PDC6 유전자의 일부를 파쇄하거나 전체를 제거함으로써 달성될 수 있다.
효소 활성의 소실은 해당 효소를 암호화하는 유전자를 일부 파쇄하거나 전체를 제거함으로써 달성 가능한데, 유전자의 일부 파쇄 (partial disruction) 및 전체 제거 (knock-out)는 유전공학계에 널리 알려진 기술을 이용하여 쉽게 수행 가능하므로, 이에 관한 구체적인 기재는 생략하기로 한다.
한편, 본 발명의 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에 있어서, 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환하는 것은, 일 예로 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 1 (pyruvate decarboxylase 1)을 암호화하는 PDC1 유전자를 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균체 내로 도입함으로써 달성될 수 있다. 하기 본 발명의 실험에 의할 경우, 다른 유래의 것들보다 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 1가 그 활성이 적절히 낮아 에탄올 생성은 하지 않으면서도, 아세틸-CoA는 생합성할 수 있어 세포 성장 및 글루코스 소비속도가 높게 나타났다.
한편, 상기 본 발명의 상기 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 PDC1 유전자는, 바람직하게 GPD2 (glyceraldehyde phosphate dehydrogenase 2) 프로모터에 의해 발현이 조절되는 것이 좋다. GPD2 프로모터는 일 예로 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다.
또한, 상기 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 PDC1 유전자는, 바람직하게 균체 내로 1 카피(copy) 도입되는 것이 좋다. 하기 실험에 의할 경우, GPD2 프로모터를 이용하고 균체 내로 1 카피 도입하였을 경우, 세포 성장 및 글루코스 소비속도가 높게 나타나고, 에탄올은 생성되지 않았으며, 궁극적으로 2,3-부탄다이올의 생산성이 높게 나타났다.
한편, 본 발명은 상기 본 발명의 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 배양하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법을 제공한다. 이때, 상기 배양은 바람직하게 글루코스를 함유하는 배지를 이용하여 수행되는 것이 좋다. 글루코스는 사카로마이세스 세레비지애가 선호하는 탄소원으로써, 이를 탄소원으로 사용할 경우, 균주의 생육이 극대화되어 생산성을 높일 수 있기 때문이다.
한편, 본 발명의 2,3-부탄다이올의 생산방법은, 바람직하게 산소를 공급하면서 수행하는 것이 좋은데, 산소 공급을 통해 ATP가 다량 생성됨으로써 미생물의 생육을 촉진시킬 수 있기 때문이다.
한편, 본 발명의 2,3-부탄다이올의 생산방법은, 글루코스를 지속적으로 공급하는 유가식 배양으로 수행할 수 있다. 배지를 유가식으로 계속 공급함으로써, 한 배치 (one batch)에서 2,3-부탄다이올을 최대로 생산할 수 있다.
기존의 효모를 이용한 2,3-부탄다이올 생산 기술은 2,3-부탄다이올을 낮은 생산성으로 생산할 수밖에 없었다.
하지만, 본 발명의 2,3-부탄다이올 생산용 효모 균주는 자체 보유 피루베이트 데카르복실라아제 (Pdc)보다 활성이 낮은 캔디다 트로피칼리스 유래의 Pdc를 균체 내로 도입함으로써, 에탄올 생성이 안 되면서도 아세틸-CoA의 합성은 가능해 균체의 성장속도 및 기질 소모 속도를 증가시킬 수 있었고, 궁극적으로 2,3-부탄다이올의 생산성을 크게 향상시킬 수 있었다.
즉, 종래의 Pdc 결여 균주는, Pdc 결여에 따라, 에탄올 생합성 외에 아세틸-CoA까지 생성되지 않아, 균체가 효율적으로 성장하지 못하였는데, 본 발명에서는 이와 같은 문제를 캔디다 트로피칼리스 유래의 Pdc를 균체 내로 도입함으로써 해결한 것이다. 이를 통해 본 발명에서는 고농도의 2,3-부탄다이올을 높은 생산성으로 생산할 수 있었다.
도 1(A)는 PDC를 발현하지 않는 2,3-부탄다이올 생산 균주(대조군)로 발효한 결과 그래프이다. 도 1(B)는 CtPDC1로 발현한 균주의 발효 결과 그래프이다. 도 1(C)는 KmPDC1로 발현한 균주의 발효 결과 그래프이다.
도 2는 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 유래 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarvoxylase) 발현 균주의 다양한 발현 조건 (프로모터 종류, 카피 수)에 따른 Pdc 역가 측정 결과이다.
도 3은 다양한 발현 조건을 갖는 PDC 발현 균주의 생산물 (에탄올, 글리세롤, 2,3-부탄다이올)에 대한 수율을 나타내는 그래프이다.
도 4(A)는 대조군의 2,3-부탄다이올 120시간 발효 결과 그래프이다. 도 4(B)는 BD5_G1CtPDC1 균주의 2,3-부탄다이올 120시간 발효 결과 그래프이다.
도 5는 유가식 배양을 통해 측정한 BD5_G1CtPDC1 균주의 2,3-부탄다이올 생산 결과 그래프이다.
본 발명에서는 대사공학적 기법을 이용하여 2,3-부탄다이올(2,3-Butanediol) 고생산성 재조합 효모를 개발하고, 이를 이용하여 글루코스로부터 2,3-부탄다이올을 고생산성으로 생산하고자 하였다.
피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarboxylase) 효소를 암호화하는 Pdc 활성도의 적절한 조절을 위하여 활성이 낮은 PDC 유전자를 탐색하였는데, 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 유래의 PDC1(CtPDC1)유전자-서열번호 1의 핵산 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 클로닝하여 싱글 카피 (single copy)로 발현해 2,3-부탄다이올을 고수율로 생산하기 위한 균주를 구축하였다 (하기 참고도 1 참조 요망).
[참고도 1]
Figure 112015085799761-pat00001
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 제조예 1: PDC1 , PDC5 , PDC6 유전자 파쇄 및 2,3- 부탄다이올 생합성 경로가 도입된 2,3- 부탄다이올 생산 균주의 구축]
야생 효모의 경우, 포도당 대사 산물로 생산되는 피루베이트가 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarboxylase) 및 알콜 데하이드로지나아제(alcohol dehydrogenase)에 의하여 에탄올로 대부분 전환된다. 따라서, 효모로부터 2,3-부탄다이올을 높은 수율로 생산하기 위해서는 피루베이트가 에탄올로 전환되는 것을 막을 필요가 있다.
이에 본 발명에서는, 우선 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarboxylase) 유전자인 PDC1 , PDC5 , PDC6를 파쇄하여 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarboxylase) 활성이 완전히 제거된 균주를 구축하였다. 또한, 이 균주에 2,3-부탄다이올 생합성 경로를 도입하기 위하여, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase (alsS))와 아세토락테이트 디카르복실라아제(acetolactate decarboxylase (alsD))를 사카로미세스 세레비시애(S. cerevisiae)의 TDH3 프로모터와 CYC1 터미네이터를 포함한 플라스미드를 도입하였고, 사카로미세스 세레비시애(S. cerevisiae)의 2,3-부탄디올 디하이드로제네이즈(2,3-butanediol dehydrogenase (BDH1))을 TDH3 프로모터와 CYC1 터미네이터를 포함한 플라스미드를 도입하였다 (실험방법 등에 대해서는 본 발명자들이 출원한 대한민국 특허공개공보 제10-2015-0068581호 참조 요망).
[ 실시예 1: 활성이 낮은 피루베이트 데카르복실라아제 ( pyruvate decarboxylase , PDC ) 유전자의 탐색]
(1) 개요
PDC 유전자를 제거한 효모 균주는 세포 성장 및 기질 소모 속도가 현저히 낮아 2,3-부탄다이올의 생산성이 낮았다.
따라서, 효율적인 2,3-부탄다이올 생산을 위하여 피루베이트 데카르복실라아제의 활성을 적절히 발현되도록 조절하여 2,3-부탄다이올 전구체인 파이루베이트 기질을 확보하고, 동시에 세포 성장에 필수적인 C2 컴파운드의 공급이 가능하도록 하기 위해 활성이 낮은 PDC 유전자를 탐색하고자 하였다.
(2) 재료 및 방법
가. 유전자 및 플라스미드
캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 게놈(genomic) DNA를 추출한 후, PCR 방법을 통하여 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 유래의 PDC1 (CtPDC1), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus)의 PDC1 (KmPDC1), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 PDC1 (ScPDC1), PDC5 (ScPDC5), PDC6 (ScPDC6) 유전자를 클로닝하였다.
효모용 발현 벡터로는 '2 micron plasmid'의 'origin'과 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) 유래의 TDH3 프로모터와 CYC1 터미네이터가 포함되어 있는 p426GPD 플라스미드를 이용하였다.
PCR 방법을 통하여 얻은 상기 PDC 유전자 단편을 상기 p426GPD 플라스미드의 XmaI과 XhoI의 제한효소 자리에 라이게이션하여 재조합 벡터를 구축하였다.
나. 효모 형질 전환
상기에서 구축한 재조합 벡터를 형질전환을 통해 상기 제조예 1의 PDC1 , 5, 6 제거 효모 균주에 도입하였다.
(3) 결과
상기 형질전환된 효모 균주의 'in vitro enzyme activity'를 측정하여 다양한 농도의 기질의 활성(activity) 값으로부터 'Km, Vmax'의 키네틱 상수(kinetic constant) 값을 산출하였다. 그 값은 하기 표 1에 명시하였다.
균주 CtPDC1 KmPDC1 ScPDC1 ScpPDC5 ScPDC6
Km (mM) 2.7 7.7 4.7 9.9 8.2
Vmax (mU/mg protein) 107 383 541 437 415
실험결과, CtPDC1 균주의 경우 다른 Pdc 균주에 비하여 현저히 활성이 낮았다. 활성이 낮은 CtPDC1 균주를 이용할 경우, 2,3-부탄다이올 생산을 최적화하는데 필요한 Pdc 활성 조절이 가능할 것으로 판단되었다.
[ 실시예 2: CtPDC1 과 KmPDC1 을 발현한 균주의 세포 성장, 포도당 소비 속도, 2,3-부탄다이올 생산성 측정]
(1) 개요
실시예 1에서 제조한 Pdc 발현 균주 (CtPDC1, KmPDC1)를 이용하여 세포 성장 및 포도당 소비속도를 측정하고, 2,3-부탄다이올의 생산성을 비교하였다.
(2) 재료 및 방법
가. 균주 및 플라스미드
Pdc를 발현하지 않은 2,3-부탄다이올 생산 균주, CtPDC1 발현 균주, KmPDC1 발현 균주를 이용하였다. CtPDC1과 KmPDC1은 S. cerevisiae의 TDH3 프로모터 및 CYC1 터미네이터를 이용하여 발현하였다.
나. 배지 및 배양 조건
발효시 'yeast nitrogen base w/o nitrogen base' 6.7 g/L, 'amino acid mixture' 1.4 g/L, 글루코스(glucose) 80 g/L가 포함된 배지를 사용하였다. 초기 접종 세포 농도는 0.2 g/L이었며, 발효 온도는 30℃를 유지하였고, 교반 속도는 80 rpm이었다.
(3) 결과
PDC를 발현하지 않은 대조군의 경우, 시간당 포도당 소모 속도는 0.10 g/L/h 였던 것에 반해, CtPDC1을 발현한 균주는 0.94 g/L/h, KmPDC1을 발현한 균주는 1.09 g/L/h이었다.
PDC를 발현하지 않은 균주의 경우의 최대 건조 균체 농도는 0.2 gDCW/L이었으며, CtPDC1을 발현한 균주는 2.7 gDCW/L, KmPDC1을 발현한 균주는 2.8 gDCW/L이었다.
PDC를 발현하지 않은 균주의 2,3-부탄다이올과 에탄올 수율은 0.259 g2,3- 부탄다이올/g포도당과 0 g에탄올/g포도당 이었으며, CtPDC1을 발현한 균주는 0.185 g2,3- 부탄다이올/g포도당과 0.185 g에탄올/g포도당, KmPDC1을 발현한 균주는 0.134 g2,3- 부탄다이올/g포도당과 0.275 g에탄올/g포도당 이었다.
한편, PDC를 발현하지 않은 균주의 2,3-부탄다이올 생산성은 0.026 g2,3- 부탄다 이올/L/h 이었으며, CtPDC1을 발현한 균주는 0.175 g2,3- 부탄다이올/L/h, KmPDC1을 발현한 균주는 0.147 g2,3- 부탄다이올/L/h 이었다.
이상의 실험으로부터 PDC-결여 2,3-부탄다이올 생산 균주에 PDC를 발현시킨 결과 세포 성장 및 포도당 소모 속도가 크게 증가함을 확인할 수 있었고, 생산성이 크게 증가함을 확인할 수 있었다 (도 1). 도 1(A)는 PDC를 발현하지 않는 2,3-부탄다이올 생산 균주(대조군)로 발효한 결과 그래프이고. 도 1(B)는 CtPDC1로 발현한 균주의 발효 결과 그래프이고. 도 1(C)는 KmPDC1로 발현한 균주의 발효 결과 그래프이다.
[ 실시예 3: 캔디다 트로피칼리스 ( Candida tropicalis ) 유래 피루베이트 데카르복실 라아제(pyruvate decarboxylase )의 다양한 발현 조건을 갖는 균주 구축 및 ' in vitro activity assay']
(1) 개요
PDC의 발현량은 2,3-부탄다이올의 수율 및 생산성에 직접적으로 영향을 미치므로, 최적의 CtPDC1 발현 균주를 선정하기 위하여 다양한 발현 조건을 갖는 CtPDC1 발현 균주를 구축하였다.
(2) 재료 및 방법
가. 다양한 프로모터를 갖는 플라스미드 구축
캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis) 유래의 PDC1 유전자 (CtPDC1)를 증폭하여 각각의 발현 벡터(프로모터로 각각 CYC1 프로모터, GPD2 프로모터-서열번호 3-, TDH3 프로모터 사용 및 터미네이터로 CYC1 터미네이터 공히 사용)에 삽입한 후 형질전환하여 재조합 효모 균주를 제작하였다. 형질전환에 사용할 균주는 YNB 배지에서 2일간 배양 후, OD값이 3이 되는 시점의 균체를 이용하였다.
나. 형질전환
형질전환은 LiAc 방법을 이용하였으며, 형질전환 이후에 YNB leu-his-trp-ura- 평판배지에서 균주를 선별하였다. 그 결과, CYC1 프로모터와 싱글 카피(single copy)로 발현한 균주 (BD5_C1CtPDC1), GPD2 프로모터와 싱글 카피(single copy)로 발현한 균주 (BD5_G1CtPDC1), CYC1 프로모터와 멀티 카피(multi copy)로 발현한 균주 (BD5_C2CtPDC1), TDH3 프로모터와 멀티 카피(multi copy)로 발현한 균주 (BD5_T2CtPDC1)를 구축하였다.
(3) 결과
이 균주들의 PDC 발현 정도를 확인하기 위하여 'in vitro Pdc activity assay'를 실시하였다. 그 결과, 대조군에서는 Pdc 역가가 나타나지 않았고, 구축된 균주는 여러 가지 Pdc 발현 수준을 나타내었다(도 2). 도 2는 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarvoxylase) 발현 균주의 Pdc 역가 측정 결과이다.
[ 실시예 4: 캔디다 트로피칼리스 ( Candida tropicalis ) 유래 피루베이트 데카르복실 라아제(pyruvate decarvoxylase)가 발현된 균주를 이용한 2,3-부탄다이올 생산]
(1) 개요
상기 실시예 3에서 구축된 균주들의 2,3-부탄다이올 발효 양상을 확인하기 위하여 초기 90 g/L의 포도당을 함유한 YNB 배지에서 발효 실험을 실시하였다. 대조군으로는 'CtPDC1이 들어있지 않은 p426GPD 공벡터'로 형질전환된 균주를 사용하였다.
(2) 발효 방법
초기 접종 균체 농도는 0.2 g/L이었으며, 발효 온도는 30℃로 유지하였고, 유리 플라스크에서 80 rpm의 교반속도를 유지하였다.
(3) 결과
대조군의 경우, 2,3-부탄다이올 수율은 0.292 g2,3- 부탄다이올/g포도당 이었고, 에탄올은 생성되지 않았다.
PDC 발현 균주 중 PDC가 멀티 카피(multi copy)로 발현된 BD5_C2CtPDC1과 BD5_T2CtPDC1 균주에서는 다량의 에탄올이 생산되었으며, 이와 함께 2,3-부탄다이올의 수율이 각각 0.245, 0.150 g2,3- 부탄다이올/g포도당으로 감소하였다 (도 3). 도 3은 대조군 및 PDC 발현 균주의 생산물에 대한 수율을 나타내는 그래프이다. 도 3에서 BD5_C1CtPDC1와 BD5_G1CtPDC1 균주의 2,3-부탄다이올 생산수율은 비슷한 것으로 나타났으나, BD5_C1CtPDC1는 부산물인 글리세롤의 생산 수율이 높게 나타나 바람직하지 않았다. 따라서, 2,3-부탄다이올 생산균주로는 BD5_G1CtPDC1 균주가 더 적합한 것으로 판단되었다.
한편, PDC 발현 균주는 세포 성장 및 포도당 소모 속도가 증가하였는데, 대조군의 단위시간당 포도당 소모 속도가 0.26 g포도당/L/h 인 것에 반해, BD5_G1CtPDC1 균주의 경우 0.62 g포도당/L/h로 확인되었다. BD5_G1CtPDC1 균주의 경우, 대조군과 비교하여 2,3-부탄다이올 생산수율은 비슷하였지만, 2,3-부탄다이올 생산성은 대조군의 0.076 g/L/h에서 0.181 g/L/h로 증가하였다 (도 4).
도 4(A)는 대조군의 2,3-부탄다이올 120시간 발효 결과 그래프이고, 도 4(B)는 BD5_G1CtPDC1 균주의 2,3-부탄다이올 120시간 발효 결과 그래프이다.
[ 실시예 5 :유가식 배양을 통한 2,3- 부탄다이올 생산]
(1) 개요
BD5_G1CtPDC1 균주가 2,3-부탄다이올 생산 균주로 적합한지 최종 판단하기 위하여 발효 중간에 포도당을 첨가하는 유가식 배양을 수행하였다.
(2) 재료 및 방법
배지는 YP 배지 (Yeast extract 10 g/L, peptone 20 g/L)를 사용하였으며, 초기 포도당 농도는 270 g/L이었고, 발효 중반에 800 g/L의 포도당 용액을 추가하였다. 초기 접종 세포 농도는 2 g/L이었고, 발효 온도는 30℃로 유지하였으며, 0.5 vvm의 공기를 주입하였고, 200 rpm으로 교반 속도를 유지하였다.
(3) 결과
80 시간의 배양시간 동안 121.8 g/L의 2,3-부탄다이올을 생산하였다. 이때, 2,3-부탄다이올의 수율은 0.329 g2,3- 부탄다이올/g포도당 이었으며, 생산성은 1.61 g/L/h로 높게 나타났다 (도 5). 도 5는 BD5_G1CtPDC1 균주를 이용한 유가식 배양을 통해 측정한 2,3-부탄다이올의 생산 결과 그래프이다.
이와 같은 결과로부터, 본 발명의 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase) 도입 균주는 2,3-부탄다이올 생산을 위해 적합한 것으로 판단할 수 있었다.
<110> SNU R&D FOUNDATION <120> Recombinant Saccharomyces cerevisiae for the production of 2,3-butanediol with pyruvate decarboxylase from Candida tropicalis and method for the production of 2,3-butanediol therefrom <130> AP-2015-0146 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1704 <212> DNA <213> Candida tropicalis <400> 1 atgtctgaaa ttactttggg tagattcttc tttgaaagat tgcaccaatt gcaagttgac 60 accgttttcg gtttaccagg tgattttaac ttggctttat tagataaaat ctacgaagtc 120 gatggtatga gatgggctgg taacgccaat gaattgaacg ctggttacgc tgctgatggt 180 tacgccagag ttaatccaaa tggtttggct gctttagtct ccaccttcgg tgttggtgaa 240 ttgtctttga ctaacgccat tgctggttct tactctgaac acgttggtat cattaacttg 300 gttggtgttc catcttcttc tgctcaagct aaacaattgt tgttgcacca caccttgggt 360 aacggtgatt tcactgtttt ccacagaatg ttcaagaaca tttctcaaac ttctgctttc 420 atctccgacc caaacactgc tgcttctgaa attgacagat gtatcagaga tgcttacgtt 480 taccaaagac cagtttacat tggtttgcca tctaacttgg ttgatgttaa agttccaaaa 540 tctttgttgg acaaaaaaat tgacttgtcc ttgcatccaa 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Lys Lys Ser Val Asn Pro Lys Tyr Val Pro Ala Pro Val 340 345 350 Pro Ala Thr Lys Ala Ile Thr Thr Pro Gly Asn Asn Asp Pro Val Ser 355 360 365 Gln Glu Tyr Leu Trp Arg Lys Val Ser Asp Trp Phe Gln Glu Gly Asp 370 375 380 Val Ile Ile Ser Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ile Val Gln Ser 385 390 395 400 Lys Phe Pro Lys Asn Ala Ile Gly Ile Ser Gln Val Leu Trp Gly Ser 405 410 415 Ile Gly Tyr Ala Thr Gly Ala Thr Cys Gly Ala Ala Met Ala Ala Gln 420 425 430 Glu Ile Asp Pro Lys Lys Arg Val Ile Leu Phe Thr Gly Asp Gly Ser 435 440 445 Leu Gln Leu Thr Val Gln Glu Ile Ser Thr Met Cys Lys Trp Asp Cys 450 455 460 Tyr Asn Thr Tyr Leu Tyr Val Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Ile Glu 465 470 475 480 Arg Leu Ile His Gly Glu Lys Ala Gln Tyr Asn Asp Ile Gln Pro Trp 485 490 495 Asn Asn Leu Gln Leu Leu Pro Leu Phe Asn Ala Lys Lys Tyr Glu Thr 500 505 510 Lys Arg Ile Ser Thr Val Gly Glu Leu Asn Asp Leu Phe Thr Asn Lys 515 520 525 Glu Phe Ala Val Pro Asp Arg Ile Arg Met Val Glu Ile Met Leu Pro 530 535 540 Val Met Asp Ala Pro Ala Asn Leu Val Ala Gln Ala Lys Gln Ser Ala 545 550 555 560 Ala Thr Asn Ala Ala Gln Glu 565 <210> 3 <211> 1144 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 caaaaacgac atatctatta tagtggggag agtttcgtgc aaataacaga cgcagcagca 60 agtaactgtg acgatatcaa ctcttttttt attatgtaat aagcaaacaa gcacgaatgg 120 ggaaagccta tgtgcaatca ccaaggtcgt cccttttttc ccatttgcta atttagaatt 180 taaagaaacc aaaagaatga agaaagaaaa caaatactag ccctaaccct gacttcgttt 240 ctatgataat accctgcttt aatgaacggt atgccctagg gtatatctca ctctgtacgt 300 tacaaactcc ggttatttta tcggaacatc cgagcacccg cgccttcctc aacccaggca 360 ccgcccccag gtaaccgtgc gcgatgagct aatcctgagc catcacccac cccacccgtt 420 gatgacagca attcgggagg gcgaaaaata aaaactggag caaggaatta ccatcaccgt 480 caccatcacc atcatatcgc cttagcctct agccatagcc atcatgcaag cgtgtatctt 540 ctaagattca gtcatcatca ttaccgagtt tgttttcctt cacatgatga agaaggtttg 600 agtatgctcg aaacaataag acgacgatgg ctctgccatt gttatattac gcttttgcgg 660 cgaggtgccg atgggttgct gaggggaaga gtgtttagct tacggaccta ttgccattgt 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Claims (9)

  1. 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능이 소실되도록 형질전환되며,
    캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환되고,
    아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)가 발현되도록 형질전환되며,
    아세토락테이트 데카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환되고,
    부탄다이올 데하이드로지나아제(butanediol dehydrogenase)가 발현되도록 형질전환된 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능이 소실되도록 형질전환하는 것은,
    사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균체로부터,
    피루베이트 데카르복실라아제 1 (pyruvate decarboxylase 1)을 암호화하는 PDC1 유전자의 일부를 파쇄하거나 전체를 제거하고,
    피루베이트 데카르복실라아제 5 (pyruvate decarboxylase 5)를 암호화하는 PDC5 유전자의 일부를 파쇄하거나 전체를 제거하며,
    피루베이트 데카르복실라아제 6 (pyruvate decarboxylase 6)을 암호화하는 PDC6 유전자의 일부를 파쇄하거나 전체를 제거함으로써 달성되는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae).
  3. 제1항에 있어서,
    캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환하는 것은,
    캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 1 (pyruvate decarboxylase 1)을 암호화하는 PDC1 유전자를 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균체 내로 도입함으로써 달성되는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae).
  4. 제3항에 있어서,
    상기 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 PDC1 유전자는,
    GPD2 (glyceraldehyde phosphate dehydrogenase 2) 프로모터에 의해 발현이 조절되는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae).
  5. 제3항에 있어서,
    상기 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 PDC1 유전자는,
    균체 내로 1 카피(copy) 도입되는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae).
  6. 제1항의 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 배양하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 배양은,
    글루코스를 함유하는 배지를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 배양은,
    산소를 공급하면서 수행하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 배양은,
    글루코스를 지속적으로 공급하는 유가식 배양인 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.
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