KR101732744B1 - 면역나노치료제를 이용한 항원 제시 세포의 표적 - Google Patents

면역나노치료제를 이용한 항원 제시 세포의 표적 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역 시스템의 세포들에 나노캐리어들의 전달을 위한 조성물 및 시스템을 제공한다. 본 발명은 T 세포 및/또는 B 세포에서 면역 반응을 자극할 수 있는 나노캐리어들을 제공한다. 본 발명은 면역특징 표면을 포함하는 나노캐리어들을 제공한다. 상기 나노캐리어들은 피검자에게 투여되는 경우 항원 제시 세포들을 표적할 수 있다. 본 발명은 나노캐리어들을 포함하는 약학적 조성물들을 제공한다. 본 발명은 나노캐리어들 및 그 약학적 조성물들의 설계방법, 제조방법 및 사용방법을 제공한다.

Description

면역나노치료제를 이용한 항원 제시 세포의 표적{TARGETING OF ANTIGEN PRESENTING CELLS WITH IMMONONANOTHERAPEUTICS}
관련출원
[0001] 본 출원은 2008년 10월 12일에 제출된 PCT 출원 계열 번호 PCT/US08/011932의 일부계속출원이며 우선권을 주장한다. 또한, 본 출원은 2009년 4월 22일에 제출된 미국 특허 출원 일련 번호 12/428,381의 우선권을 주장한다. 상기 언급된 출원의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
정부지원
[0002] 본 발명은 미국 국립 보건원이 수여한 과제번호 EB003647, AI072252 및 AI069259 하의 정부지원으로 수행되었다.
[0003] 병원 미생물에 대항하는 최근의 많은 백신들은 원인 균주의 생약독화 또는 비악성 균주들을 포함한다. 많은 백신들은 죽었거나 또는 비활성화된 미생물들을 포함한다. 다른 백신들은 표면 탄수화물 또는 재조합 병원체 유래 단백질과 같은 병원체 용해물들의 정제된 성분들을 활용한다. 생약독화 또는 비활성화된 병원체들을 활용하는 백신들은 통상적으로 맹렬한 면역 반응을 야기하지만, 그 용도는 제한되어 있다. 예를 들면, 생 백신 균주는 때때로, 특히 면역약화된 수용자에게 투여되는 경우 감염질환을 유발시킨다. 또한, 많은 병원체들, 특히 바이러스들은 자신의 게놈에서 계속적으로 급속한 돌연변이를 겪게 되는데, 이로 인하여 병원체들은 면역반응을 피하여 항원적으로 구별이 되는 백신 균주가 되게 한다.
[0004] 백신 개발의 어려움을 생각해보면, 많은 백신들은 공급이 극히 부족한 상태이다. 예를 들면, 현재 2007년 10월까지 미국에서는 인플루엔자, 수두 및 A형 간염 백신이 부족한 상태이다. 일부 경우에는 충분히 많은 제조자가 수요를 따라갈 만큼 충분한 설비를 제공하지 못하기 때문에 백신 부족현상이 발생한다. 일부 경우에는 백신 부족은 예방 효과에 도달하기 위하여 대량의 백신 생성물이 각 개인에게 투여되어야 한다는 것을 의미하는 백신의 낮은 역가에 그 원인을 돌린다. 예를 들면, 일부 백신들은 감염질환을 유발하기 때문에(약독화되거나 사멸된 상태 일지라도) 손상되지 않은 유기물로서 투여될 수 없다. 그 대신, 그러한 백신들은 주로 정제된 병원체 성분들을 포함하는데, 이는 훨씬 약한 역가의 면역 반응으로 이어진다.
[0005] 따라서, 고도의 면역성이 있는 효과적인 백신을 생산하는 시스템 및 방법에 대한 요구가 업계에 존재한다. 또한, 장기적으로 지속하는 면역 반응들을 잠재적으로 유도할 수 있는 개선된 백신 조성물에 대한 요구도 존재한다. 감염성 질병의 치료 및 예방을 위해, 고도의 면역성은 있지만, 질방을 유발하지 않는 개선된 백신 조성물에 대한 요구가 존재한다.
[0006] 본 발명은 면역 시스템을 조절하는 합성 나노캐리어(nanocarrier)를 제공한다. 상기 합성 나노캐리어는 하나 이상의 표면을 포함한다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 표면은 면역특징(immunofeature) 표면을 포함한다. 선택적으로는, 본 발명의 상기 나노캐리어는 면역조절제, 면역자극제 및 표적화제(본 명세서에서 "표적화 모이어티"로도 불림) 중 하나 이상을 함유한다. 상기 면역조절제는 B 및/또는 T 세포에서 면역 반응을 유도한다. 상기 면역자극제는(면역 반응을 궁극적으로 향상, 억제, 지시 또는 재지시할 수 있는 방식으로) 면역 시스템을 자극하는 것을 보조한다. 상기 면역특징 표면은 항원 제시 세포와 관련된 하나 이상의 표적들을 인식한다. 상기 선택적인 표적화제는 특정 기관, 조직, 세포 및/또는 세포이하 장소(subcellular locale)와 관련된 하나 이상의 표적들을 인식한다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 모이어티들에 체액성 반응을 제공하는데 효과적인 양으로 다수의 모이어티들을 포함하는 표면을 포함한다. 상기 체액성 반응은 예를 들면, 상기 합성 나노캐리어들이 환자에게 투여되는 경우 얻게 된다. 상기 나노캐리어는 면역 시스템 조절에 의한 치료에 민감한 질병, 질환 또는 상태의 예방 및/또는 치료용 약학적 제제 및 키트에 유용하다. 그러한 상태들은 면역 반응을 특이적으로 또는 비특이적으로 향상시키고, 면역 반응을 특이적으로 또는 비특이적으로 억제하거나 면역 반응을 특이적으로 또는 비특이적으로 지시/재지시하여 변형된 질병들, 질환들 또는 상태들을 포함한다.
[0007] 본 명세서에서 더 상세히 기술된 바와 같이, 면역특징 표면은 항원 제시 세포들(APCs)에 나노캐리어들이 특이적으로 표적하게 한다. 특히, 상기 면역특징 표면은 상기 나노캐리어들이 APC 표면에 높은 친화력 결합(avidity binding)을 하게 한다. 또한, 상기 높은 친화력 결합은 APC 세포들에 특이적이다. 예를 들면, 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어들은 피막하동 대식세포들(subcapsular sinus macrophages: SCS-Mphs)을 특이적으로 표적할 수 있다. 그러한 나노캐리어들은 피검자에게 투여되는 경우 림프절의 피막하동 영역에서 축적된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어들은 수지상 세포들을 특이적으로 표적하고 T-세포 반응을 도출할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 면역특징 표면은 APC 표면에 상기 나노캐리어들의 낮은 친화도 및 높은 친화력 결합을 제공한다. 일부 실시예에서, 면역특징 표면을 포함하는 나노캐리어들은 APC들에 특이적인 낮은 친화도 높은 친화력 결합을 보이며 다른 유형의 세포들에 그러한 결합을 제공하지 않는다. 면역특징 표면들의 다른 상세사항들은 본 명세서에 제공되어 있다.
[0008] 상기 면역특징 표면이 APC들을 표적하는 능력은 본 발명의 나노캐리어들을 피검자에게 투여하는 경우 B-세포 및 T-세포에 면역조절제 및 면역자극제를 전달하도록 하는 중요한 특징이다. 그러한 전달은 본 발명의 나노캐리어들이 면역 시스템 반응을 도출하게 하거나 면역 시스템 반응을 향상시키도록 한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 합성 나노캐리어들은 복수의 모이어티들에 체액성 반응을 제공하는데 유효한 양으로 상기 복수의 모이어티들을 포함하는 표면을 포함한다.
[0009] 당업자가 인식하는 바와 같이, 다른 모든 것들 중에서 면역 시스템 조절은 예를 들면, 감염성 질병, 암, 자가면역 질병(류마티스성 관절염 포함)의 예방 및/또는 치료, 이식 거부를 완화시키기 위해 이식체들과 연관된 면역 억제, 중독성 물질에 대항하는 면역화 및 생물학적 위험과 다른 독성 물질들에 대항하는 면역화와 같은 의학적 치료와의 연계에 유용하다. 또한, 면역 시스템 조절은 예를 들면, 동물을 면역화하여 항체를 생성하는 것과 같은 산업 및 학술적 연구 세팅에서 도구로서도 유용하다.
[0010] 본 발명의 일 측면은 백신의 제공이다. 본 발명에 따른 백신은 통상적으로 항원을 함유한다. 일 실시예에서, 상기 항원은 공유 또는 비공유 수단에 의하여 나노캐리어에 물리적으로 '결합'된다. 비공유적 결합은 예를 들면, 이온 결합, 소수성 결합, 물리적 인트랩먼트(physical entrapment) 등을 포함하며, 이 모두는 아래에 더 상세히 기술되어 있다. 항원을 지니는 그러한 나노캐리어들은 아래에 백신 나노캐리어들로 언급되어 있는 범주에 포함되어 있다. 다른 실시예에서, 상기 나노캐리어는 면역 반응을 향상, 억제, 지시 또는 재지시하는 나노캐리어에 결합된, 바람직하게는 항원에 결합된 면역자극제를 갖는다. 이 경우, 상기 항원은 상기 면역자극제가 결합되어 있는 작용제 결합 나노캐리어의 제제와 혼합되어 백신을 형성할 수 있다. 물론, 상기 항원도 아래에 기술된 바와 같이 상기 면역조절제가 결합되어 있는 동일한 나노캐리어를 포함하는 나노캐리어에 결합될 수 있다. 또한, 상기 항원은 상기 면역특징 표면의 모이어티일 수 있다.
[0011] 많은 경우에 본 발명의 제제는 하나 이상의 나노캐리어들을 포함할 것이다. 일부 실시예에서, 상기 제제는 나노캐리어가 모두는 아니더라도 면역조절제, 면역자극제 및 표적화제의 하나 이상과 결합되어 있는 면역특징 표면을 갖는 나노캐리어를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 제제는 상이한 나노캐리어들의 혼합물이며, 각각의 나노캐리어는 모두는 아니더라도 면역조절제, 면역자극제 및 표적화제의 하나 이상을 지닌다. 상기 제제는 유사하게는 각각의 나노캐리어가 이에 결합된 면역조절제, 면역자극제 및 표적화제 모두를 갖고 있는 나노캐리어들 중 하나일 수 있다. 이 경우에, 상기 나노캐리어들의 자체는 이들이 전달하는 작용제들은 제외하고 동일하거나 상이할 수 있다. 여기서 언급(되고 본 명세서에 더 상세히 기술되는) 표적화제들은 예를 들면, B-세포 표적화 모이어티 또는 T-세포 표적화 모이어티들이다. 본 개시물 전체를 통해, 그러한 모이어티들은 면역특징 표면상에 존재하고 APC들에 나노캐리어들을 표적하게 하는 복수의 모이어티들에 부가된다는 것을 알 것이다.
[0012] 본 발명의 나노캐리어들은 면역 시스템의 자극에 강력하다는 발견이 중요하다. 상기 나노캐리어들은 면역 시스템이 자연 상태로서나 종래 백신 기술에서 항원에 노출되는 경우 '관찰하게 되는(sees)' 것을 모방하도록 적응되고, 면역학적 관점에서 여기서 계속 개선할 수 있다는 발견이 중요하다. 이런 면에서, 보조제가 나노캐리어들에 공유적으로 결합되면 보조제의 활성이 주목할 만큼 향상될 수 있다는 것을 예상외로 발견하게 되었다. 또한, 나노캐리어들의 면역특징 표면은 특이적인 세포 표적화제가 없는 경우에도 면역조절제 또는 면역자극제가 적절한 면역 세포들에 표적하도록 보조할 수 있다는 것을 예상외로 발견하게 되었다.
[0013] 본 명세서에 기술된 시스템은 면역 조절을 향상시키는 방식으로 면역 시스템에 영향을 주는 매개변수들의 조작을 허용한다. 본 발명의 중요한 일 측면은 나노캐리어들이 크기, 작용제의 밀도, 표적화의 정도 및 위치, 분해, 작제의 방출 등의 측면에서 조절될 수 있다. 본 발명의 다양한 측면들은 아래에 상세히 기술된 하나 이상의 이러한 이득들을 달성한다. 특히, 자기조립 나노캐리어들을 수반하는 바람직한 방법을 포함하는 그러한 나노캐리어들의 제조방법뿐만 아니라 본 발명의 면역 조절 제제, 그러한 제제들의 합성 나노캐리어 성분들, 특이적이고 바람직한 나노캐리어들, 특이적이고 바람직한 면역조절제, 면역자극제 및 표적화제, 구성요소 부분들 및 빌딩 블록들이 아래에 기술되어 있다. 또한, 약한 항원 및 T 세포가 인식하지 않는 항원(에컨대, 탄수화물 및 소분자 항원)과 연계된 강한 면역 조절을 발생시키는 제제 및 시스템도 기술되어 있다. 일부 측면에서, 나노캐리어(예컨대, 특이적인 기관, 조직, 세포 또는 세포이하 장소를 표적하는 나노캐리어)를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 하나 이상의 2차 림프 조직 또는 기관을 표적한다. 일부 실시예에서, 상기 2차 림프 조직 또는 기관은 림프절, 비장(spleen), 페이어스판들(Peyer's patches), 충수(appendix) 또는 편도선이다.
[0014](본 명세서에 제공된 작용제들이 연관되거나 캡슐화될 수 있는) 나노캐리어의 골격은 폴리머 및/또는 비-폴리머 분자들로 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 나노캐리어 골격은 단백질계, 핵산계 또는 탄수화물계일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 골격은 거대분자성이다. 일부 실시예에서, 상기 골격은 아미노산 또는 핵산으로 구성되어 있다. 일부 실시예에서, 상기 골격은 핵산과 같은 분자들의 가교사슬들로 구성되어 있다. 일부 실시예에서, 상기 골격은 RNAi 가교사슬들로 구성되어 있다. 일부 실시예에서, 상기 골격은 폴리아미노계이다. 나노캐리어는 지질-폴리머 나노입자들과 같은 나노물질들의 조합을 이용하여 개발된 지질계 나노입자들, 폴리머 나노입자들, 금속성 나노입자들, 계면활성제계 에멀젼들, 덴드리머들 및/또는 나노입자들 중 하나 또는 복수개일 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다.
[0015] 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 하나 이상의 폴리머들로 구성되어 있다. 일부 실시예에서, 상기 하나 이상의 폴리머는 수용성, 비-접착성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)이다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 폴리알킬렌 글리콜 또는 폴리알킬렌 옥사이드이다. 일부 실시예에서, 상기 하나 이상의 폴리머는 생분해성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 상기 하나 이상의 폴리머는 수용성, 비-접착성 폴리머 및 생분해성 폴리머의 접합체인 생체적합성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 상기 생분해성 폴리머는 폴리락틱산(polylactic acid: PLA), 폴리(글글리콜릭산)(PGA) 또는 폴리(락틱산/글리콜릭산)(PLGA)이다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 PEG-PLGA 폴리머로 구성되어 있다.
[0016] 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 자기조립에 의하여 형성된다. 자기조립은 나노캐리어들을 예측가능하게 그리고 재현성있게 형성하는 예측가능한 방식으로 스스로를 배향시키는 성분들을 사용하여 나노캐리어를 형성하는 공정을 가리킨다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어들은 예측가능한 치수, 구성성분들 및 구성성분들의 배치를 갖는 나노캐리어들을 형성하기 위해 서로서로에 대하여 스스로 배향시키는 양친매성 생체물질을 사용하여 형성된다. 본 발명에 따르면, 상기 양친매성 생체물질들은 이들에 부착된 면역조절제들, 면역자극제들 및/또는 표적화제들을 가지고 있어서 상기 나노캐리어들이 자기 조립하는 경우, 나노캐리어 상/내에서 상기 작용제들의 국재성(localization) 및 밀도의 재현가능한 패턴이 있다.
[0017] 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 마이크로입자, 나노입자 또는 피코입자이다. 일부 실시예에서, 상기 마이크로입자, 나노입자 또는 피코입자는 자기조립한다.
[0018] 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 포지티브 제타 포텐셜(positive zeta potential)을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 중성 pH에서 네트(net) 제타 포텐셜을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 그 표면에서 하나 이상의 아민 모이어티들을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 아민 모이어티는 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민이다. 일부 실시예에서, 상기 아민 모이어티는 지방족 아민이다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 아민 함유 폴리머를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 아민 함유 지질을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 중성 pH에서 양으로 하전된 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 라텍스 입자이다. 일부 실시예에서, 그 표면상에 하나 이상의 아민 모이어티들을 갖는 나노캐리어는 중성 pH에서 네트 포지티브 전하를 갖는다.
[0019] 일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 조성물들의 나노캐리어들은 500 nm 미만인 평균 기하 직경을 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어들은 50 nm을 초과하지만 500 nm 미만인 평균 기하 직경을 갖는다. 일부 실시예에서, 일 집단의 나노캐리어들의 평균 기하 직경은 약 60 nm, 75 nm, 100 nm, 125 nm, 150 nm, 175 nm, 200 nm, 225 nm, 250 nm, 275 nm, 300 nm, 325 nm, 350 nm, 375 nm, 400 nm, 425 nm, 450 nm 또는 475 nm이다. 일부 실시예에서, 상기 평균 기하 직경은 100-400 nm, 100-300 nm, 100-250 nm 또는 100-200 nm 사이에 있다. 일부 실시예에서, 상기 평균 기하 직경은 60-400 nm, 60-350 nm, 60-300 nm, 60-250 nm 또는 60-200 nm 사이에 있다. 일부 실시예에서, 상기 평균 기하 직경은 75-250 사이에 있다. 일부 실시예에서, 일 집단의 나노캐리어들에 있는 나노캐리어들의 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상은 500 nm 미만의 직경을 갖는다. 일부 실시예에서, 일 집단의 나노캐리어들에 있는 나노캐리어들의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상은 50 nm를 초과하지만 500 nm 미만인 직경을 갖는다. 일부 실시예에서, 일 집단의 나노캐리어들에 있는 나노캐리어들의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상은 약 60 nm, 75 nm, 100 nm, 125 nm, 150 nm, 175 nm, 200 nm, 225 nm, 250 nm, 275 nm, 300 nm, 325 nm, 350 nm, 375 nm, 400 nm, 425 nm, 450 nm 또는 475 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시예에서, 일 집단의 나노캐리어들에 있는 나노캐리어들의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상은 100-400 nm, 100-300 nm, 100-250 nm 또는 100-200 nm 사이에 있는 직경을 갖는다. 일부 실시예에서, 일 집단의 나노캐리어들에 있는 나노캐리어들의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상은 60-400 nm, 60-350 nm, 60-300 nm, 60-250 nm 또는 60-200 nm 사이에 있는 직경을 갖는다. 상기 실시예들의 일부에서, 상기 나노캐리어들은 나노입자들이다.
[0020] 본 명세서에 제공된 나노캐리어는 면역 반응 조절(예컨대, 향상, 억제, 지시 또는 재지시)하는데 사용될 수 있으며 면역특징 표면을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 면역 반응은 체액성 면역 반응이다. 다른 실시예에서, 그러한 면역 반응은 세포성 면역 반응이다. 일부 실시예에서, 그러한 면역 반응은 세포성 및 체액성 면역 반응의 조합이다. 나노캐리어들은 면역조절제, 면역자극제 및 표적화제 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 B 세포 항원, T 세포 항원, 면역자극제 및 표적화제 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 B 세포 항원, T 세포 항원, 면역자극제 및 표적화제 중 적어도 둘을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 B 세포 항원, T 세포 항원, 면역자극제 및 표적화제 중 적어도 셋을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 B 세포 항원, T 세포 항원, 면역자극제 및 표적화제 모두를 포함한다.
[0021] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 B 세포 항원을 포함한다. 상기 B 세포 항원은 상기 나노캐리어의 면역특징 표면상, 상기 나노캐리어의 제 2 표면상에 있을 수 있고, 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화될 수 있거나 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 B 세포 수용체들을 활성화시키는 밀도로 상기 나노캐리어의 표면상에 있다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 상기 나노캐리어와 연관되어 있다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 상기 나노캐리어와 공유적으로 연관되어 있다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 상기 나노캐리어와 비공유적으로 연관되어 있다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 표적화 모이어티를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 낮은 면역성의 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 소분자이다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 중독성 물질이다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 독소이다. 일부 실시예에서, 나노캐리어에 포함되기 위한 독소는 완전 분자 또는 그것의 일부분이다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 T 세포 항원이 아니다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 탄수화물이다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 퇴행성 질병 항원(degenerative disease antigen), 감염성 질병 항원, 암 항원, 아토피성 질병 항원(atopic disease antigen), 자가면역 질병 항원, 동종항원(alloantigen), 이종항원(xenoantigen), 중독성 물질(addictive substance) 또는 대사성 질병 효소(metabolic disease enzyme) 또는 효소 생성물(enzymatic product)이다.
[0022] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 T 세포 항원을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 T 세포 항원은 상기 나노캐리어의 면역특징 표면상, 상기 나노캐리어의 제 2 표면상에 있고, 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화거나 이들의 조합이다. 일부 실시예에서, 상기 T 세포 항원은 상기 나노캐리어와 연관되어 있다. 일부 실시예에서, 상기 T 세포 항원은 상기 나노캐리어와 공유적으로 연관되어 있다. 일부 실시예에서, 상기 T 세포 항원은 상기 나노캐리어와 비공유적으로 연관되어 있다. 일부 실시예에서, 상기 항원은 퇴행성 질병 항원, 감염성 질병 항원, 암 항원, 아토피성 질병 항원, 자가면역 질병 항원, 동종항원, 이종항원, 중독성 물질 또는 대사성 질병 효소 또는 효소 생성물이다. 일부 실시예에서, 상기 T 세포 항원은 '보편적(universal)' T 세포(즉, T 세포 보조를 자극하기 위해 탄수화물을 포함하는 관련되지 않은 B 세포 항원과 함께 사용될 수 있는 T 세포 항원)이다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 표적화 모이어티를 더 포함한다. 또한, 여기에 언급(되고 본 명세서에 상세히 기술된) 표적화 모이어티들은 상기 면역특징 표면상에 존재하고 APC들에 상기 나노캐리어들을 표적하게 하는 복수의 모이어티들에 첨가된다.
[0023] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 B 세포 항원과 T 세포 항원을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원 및 상기 T 세포 항원은 상이한 항원들이다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원 및 상기 T 세포 항원은 동일한 항원들이다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 상기 나노캐리어의 면역특징 표면상, 상기 나노캐리어의 제 2 표면상에 있고(예컨대, 공유적으로 또는 비공유적으로 연관되고) 또는 상기 나노캐리어의 표면상에 있고(예컨대, 공유적으로 또는 비공유적으로 연관되고) 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화된다(예컨대, 공유적으로 또는 비공유적으로 연관된다), 반면에 상기 T 세포 항원은 상기 나노캐리어의 면역특징 표면상, 상기 나노캐리어의 제 2 표면상(예컨대, 공유적으로 또는 비공유적으로 연관되고), 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화되고(예컨대, 공유적으로 또는 비공유적으로 연관되고), 또는 상기 나노캐리어의 표면상에 있고(예컨대, 공유적으로 또는 비공유적으로 연관되고) 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화된다(예컨대, 공유적으로 또는 비공유적으로 연관된다).
[0024] 나노캐리어가 B 세포 항원과 T 세포 항원을 포함하고 있는 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 면역자극제를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 상기 나노캐리어의 표면상에 있고/있거나 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화된다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 상기 나노캐리어와 연관된다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 상기 나노캐리어와 공유적으로 연관된다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 상기 나노캐리어와 비공유적으로 연관된다.
[0025] 나노캐리어가 B 세포 항원과 T 세포 항원을 포함하고 있는 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 표적화제를 더 포함한다. 또한, 여기에 언급(되고 본 명세서에 상세히 기술된) 표적화제는 상기 면역특징 표면상에 존재하고 APC들에 상기 나노캐리어들을 표적하게 하는 복수의 모이어티들에 첨가된다. 일부 실시예에서, 상기 표면화제는 상기 나노캐리어의 면역특징 표면상, 상기 나노캐리어의 제 2 표면상에 있다. 일부 실시예에서, 상기 표적화제는 상기 나노캐리어와 연관된다. 일부 실시예에서, 상기 표적화제는 상기 나노캐리어와 공유적으로 연관된다. 일부 실시예에서, 상기 표적화제는 상기 나노캐리어와 비공유적으로 연관된다.
[0026] 나노캐리어가 B 세포 항원과 T 세포 항원을 포함하고 있는 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 면역자극제 및 표적화제를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 상기 나노캐리어의 표면상(예컨대, 공유적으로 또는 비공유적으로 연관되고)에 있고/있거나 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화된다(예컨대, 공유적으로 또는 비공유적으로 연관된다), 반면에 표면화제는 상기 나노캐리어의 표면상에 있다(예컨대, 공유적으로 또는 비공유적으로 연관된다).
[0027] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 면역자극제를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 상기 나노캐리어의 표면상에 있다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화된다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 상기 나노캐리어의 표면상에 있고 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화된다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어의 표면상에 있는 면역자극제는 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화된 면역자극제와는 상이하다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어의 표면상 및 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화된 면역자극제는 동일하다.
[0028] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 하나 이상의 면역자극제들로서 서로 상이한 면역자극제들을 포함한다.
[0029] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 면역특징 표면, 면역자극제 및 항원을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 항원은 B 세포 항원 또는 T 세포 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는(면역 반응을 억제하는) 면역억제제이다. 일부 실시예에서, 상기 면역억제제는 시클로스포린(cyclosporin), 스테로이드, 메토트렉세이트(methotrexate) 또는 T 세포 활성화를 간섭하는 임의의 작용제이다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 조절 T 세포(예컨대, TGF-β, 라파마이신(rapamycin) 또는 레티노산)를 유도한다. 일부 실시예에서, 조절 T 세포를 유도하는 면역조절제 또는 작용제는 항원에 대한 내성 획득을 촉진한다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 표적화제를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 피검자의 면역 시스템을 억제하고/하거나 내성을 촉진시키는데 사용될 수 있다.
[0030] 나노캐리어가 면역특징 표면 및 면역자극제를 포함하고 있는 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 B 세포 항원 및/또는 T 세포 항원을 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 낮은 면역성의 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 소분자이다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 탄수화물이다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 중독성 물질이다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 독소이다. 일부 실시예에서, 상기 T 세포 항원은 퇴행성 질병 항원, 감염성 질병 항원, 암 항원, 아토피성 질병 항원, 자가면역 질병 항원, 동종항원, 이종항원, 중독성 물질 또는 대사성 질병 효소 또는 효소 생성물이다. 일부 실시예에서, 상기 T 세포 항원은 보편적 T 세포 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 표적 항원을 더 포함한다.
[0031] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 피검자 내에서 낮은 면역성의 항원(예컨대, 소분자 또는 탄수화물)에 면역 반응을 유도하거나 향상시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 피검자 내에서 중독성 물질에 면역 반응을 유도하거나 향상시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 피검자 내에서 독소에 면역 반응을 유도하거나 향상시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 중독을 갖고 있거나 중독에 민감한 피검자를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 독소에 노출되었거나 노출될 피검자를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 감염성 질병, 암 또는 자가면역 질병(류마티스성 관절염 포함)을 치료하고/하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 나노캐리어들은 이식 거부를 완화시키기 위해 이식체들과 연관된 면역 억제를 위해 사용될 수 있다.
[0032] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 표적화 모이어티를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 표적화 모이어티는 면역특징 표면상에 있거나 상기 나노캐리어의 제 2 표면상에 있다. 일부 실시예에서, 상기 표적화 모이어티는 상기 나노캐리어와 연관된다. 일부 실시예에서, 상기 표적화 모이어티는 상기 나노캐리어와 공유적으로 연관된다. 일부 실시예에서, 상기 표적화 모이어티는 상기 나노캐리어와 비공유적으로 연관된다.
[0033] 일부 측면에서,(a) 폴리머와 면역특징 모이어티(즉, 면역특징 표면상의 복수의 모이어티들 중 하나)의 접합체,(b) 폴리머와 항원의 접합체,(c) 폴리머와 면역자극제의 접합체 및/또는(d) 폴리머와 표적화 모이어티의 접합체를 포함하는 나노캐리어를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 폴리머와 항원의 접합체 및 폴리머와 면역자극제의 접합체를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 폴리머와 항원의 접합체 및 폴리머와 표적화 모이어티의 접합체를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 폴리머와 면역자극제의 접합체 및 폴리머와 표적화 모이어티의 접합체를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 폴리머와 항원의 접합체, 폴리머와 면역자극제의 접합체 및 폴리머와 표적화 모이어티의 접합체를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 접합체 또는 접합체들은 공유 접합체/접합체들 또는 비공유 접합체/접합체들 또는 임의의 그 조합이다. 일부 실시예에서, 상기 항원은 B 세포 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 폴리머와 T 세포 항원의 접합체를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 그러한 접합체는 공유 또는 비공유 접합체이다. 일부 실시예에서, 상기 항원은 T 세포 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 폴리머와 B 세포 항원의 접합체를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 그러한 접합체는 공유 또는 비공유 접합체이다.
[0034] 일부 측면에서, 아래 식 X-L1-Y-L2-Z로서, X는 생분해성 폴리머이고, Y는 수용성 비접착성 폴리머이고, Z는 표적화 모이어티, 면역조절제, 면역자극제 또는 약제이고, L1 및 L2는 결합 또는 연결 분자이며, Y와 Z 모두는 아니지만, Y 또는 Z 중 어느 하나는 부재할 수 있는 것인 분자 또는 분자들을 포함하는 나노캐리어를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 항원, 면역자극제 또는 양쪽 모두를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 약제는 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 항원은 퇴행성 질병 항원, 감염성 질병 항원, 암 항원, 아토피성 질병 항원, 자가면역 질병 항원, 동종항원, 이종항원, 중독성 물질 또는 대사성 질병 효소 또는 효소 생성물이다. Z는 본 명세서 기술된 임의의 항원일 수 있다. 일부 실시예에서, Z는 표적화 모이어티이다. 일부 실시예에서, Z는 세포의 표면상에 발현된 수용체를 결합하는 표적화 모이어티이다. 일부 실시예에서, Z는 가용성 수용체를 결합하는 표적화 모이어티이다. 일부 실시예에서, 상기 가용성 수용체는 보체 단백질 또는 기존의 항체이다. 일부 실시예에서, 상기 표적화 모이어티는 상기 나노캐리어가 항원 제시 세포, T 세포 또는 B 세포에 전달하기 위한 것이다. 일부 실시예에서, 상기 항원 제시 세포는 수지상 세포(DCs), 소포 수지상 세포(FDCs) 또는 대식세포이다. 일부 실시예에서, 상기 대식세포는 피막하동 대식세포(SCS-Mphs)이다. 일부 실시예에서, 상기 Y는 PEG 또는 PEO이다. 일부 실시예에서, Y는 폴리알킬렌 글리콜 또는 폴리알킬렌 옥사이드이다. 일부 실시예에서, X는 PLGA, PLA 또는 PGA이다. 일부 실시예에서, Z는 부재한다.
[0035] 본 발명의 나노캐리어들은 면역특징 표면을 포함하는 표면을 포함한다. 일부 측면에서, 조성물은 아래 식: X-L1-Y-L2-I로서, X, L1, Y 및 L2는 앞서 기술한 바와 같고 I는 면역특징 모이어티(즉, 면역특징 표면상의 복수의 모이어티들 중 하나)인 분자 또는 분자들을 포함하는 나노캐리어를 포함한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 상기 면역특징 표면은(상기 면역특징 표면상의 복수의 모이어티들을 통해) APC들에 낮은 친화도, 높은 친화력 결합을 제공한다.
[0036] 일부 실시예에서, 면역특징 표면을 포함하는 나노캐리어를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 측면에서, 면역자극제를 포함하는 나노캐리어를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 항원 및/또는 표적화 모이어티를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 항원, 표적화 모이어티 및 면역자극제 중 적어도 하나는 수용성 비접착성 폴리머에 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 항원, 표적화 모이어티 및 면역자극제 중 적어도 하나는 생분해성 폴리머에 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 항원, 표적화 모이어티 및 면역자극제 중 적어도 하나는 생체적합성 폴리머에 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 생체적합성 폴리머는 생분해성 폴리머에 접합된 수용성 비접착성 폴리머의 접합체이다. 일부 실시예에서, 상기 항원은 B 세포 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 T 세포 항원이 아니다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 T 세포 항원을 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 항원은 T 세포 항원이다.
[0037] 일부 측면에서, 면역특징 표면, 소분자, 면역자극제 및 T 세포 항원을 포함하는 나노캐리어를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 소분자는 면역특징 표면상, 상기 나노캐리어의 제 2 표면상에 있거나 상기 나노캐리어의 표면상에 있고 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화된다. 일부 실시예에서, 상기 소분자는 중독성 물질이다. 일부 실시예에서, 상기 소분자는 독소이다. 일부 실시예에서, 상기 독소는 화학 무기, 세균작용제(agent of biowarfare) 또는 유해 환경 작용제(hazardous environmental agent)로부터 유래한다. 일부 실시예에서, 상기 소분자는 폴리머에 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 수용성 비접착성 폴리머, 생분해성 폴리머 또는 생체적합성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 생체적합성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 상기 나노캐리어의 표면상에 있거나 상기 나노캐리어의 표면상에 있고 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화된다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 폴리머에 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 수용성 비접착성 폴리머, 생분해성 폴리머 또는 생체적합성 폴리머 생분해성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 수용성 비접착성 폴리머 또는 생분해성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 표적화 모이어티를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 표적화 모이어티는 폴리머에 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 수용성 비접착성 폴리머, 생분해성 폴리머 또는 생체적합성 폴리머 생분해성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 PEG 또는 PEO이다. 일부 실시예에서, 상기 수용서, 비접착성 폴리머는 폴리알킬렌 글리콜 또는 폴리알킬렌 옥사이드이다. 일부 실시예에서, 상기 생분해성 폴리머는 PLGA, PLA 또는 PGA이다. 일부 실시예에서, 상기 생체적합성 폴리머는 수용성, 비접착 폴리머와 생분해성 폴리머의 접합체이다.
[0038] 일부 실시예에서, 면역특징 표면, 면역자극제, T 세포 항원 및 표적화 모이어티를 포함하는 나노캐리어를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 면역특징 표면은 APC 표면에 낮은 친화력 결합을 제공할 수 있는 복수의 모이어티들을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 TLR 7/8 효현제이다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 R848(레시퀴모드(Resiquimod)라고도 칭함) 또는 이미퀴모드(imiquimod)이다. 일부 실시예에서, 상기 면역특징 표면상의 복수의 모이어티들은 상기 나노캐리어의 표면상에 있거나 상기 나노캐리어의 표면상에 있고 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화된다. 일부 실시예에서, 상기 면역특징 표면상의 복수의 모이어티들은 폴리머에 접합되고, 바람직하게는 공유적으로 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 수용성 비접착성 폴리머, 생분해성 폴리머 또는 생체적합성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 상기 면역특징 표면상의 복수의 모이어티들은 생체적합성 폴리머에 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 상기 나노캐리어의 표면상에 있거나, 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화되거나 상기 나노캐리어의 표면상에 있고 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화된다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 폴리머에 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 수용성 비접착성 폴리머, 생분해성 폴리머 또는 생체적합성 폴리머 생분해성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 면역자극제는 생분해성 폴리머에 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 표적화 모이어티는 폴리머에 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 수용성 비접착성 폴리머, 생분해성 폴리머 또는 생체적합성 폴리머 생분해성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 표적화 모이어티는 생체적합성 폴리머에 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 수용성 비접착성 폴리머는 PEG 또는 PEO이다. 일부 실시예에서, 상기 수용성 비접착성 폴리머는 폴리알킬렌 글리콜 또는 폴리알킬렌 옥사이드이다. 일부 실시예에서, 상기 생분해성 폴리머는 PLGA, PLA 또는 PGA이다. 일부 실시예에서, 상기 생체적합성 폴리머는 수용성 비접착성 폴리머와 생분해성 폴리머의 접합체이다.
[0039] 일부 측면에서, 낮은 면역성의 항원, 면역자극제 및 T 세포 항원을 포함하는 나노캐리어를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 낮은 면역성의 항원은 상기 나노캐리어의 표면상에 있거나 상기 나노캐리어의 표면상에 있고 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화된다. 일부 실시예에서, 상기 낮은 면역원성 항원은 소분자 또는 탄수화물이다. 일부 실시예에서, 상기 낮은 면역성의 항원은 중독성 물질이다. 일부 실시예에서, 상기 낮은 면역성의 항원은 중독성 물질이다. 일부 실시예에서, 상기 낮은 면역성의 항원은 독소이다. 일부 실시예에서, 상기 낮은 면역성의 항원은 폴리머에 공유적으로 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 수용성 비접착성 폴리머, 생분해성 폴리머 또는 생체적합성 폴리머 생분해성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 상기 나노캐리어의 표면상에 있거나 상기 나노캐리어의 표면상에 있고 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화된다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 폴리머에 공유적으로 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 수용성 비접착성 폴리머, 생분해성 폴리머 또는 생체적합성 폴리머 생분해성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 표적화 모이어티를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 표적화 모이어티를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 표적화 모이어티는 폴리머에 공유적으로 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 수용성 비접착성 폴리머, 생분해성 폴리머 또는 생체적합성 폴리머 생분해성 폴리머이다.
[0040] 일부 측면에서, 특이적인 세포, 조직 또는 기관을 표적하고 B 세포들을 활성화시키는 밀도로 표면상에 있는 B 세포 항원 및 면역자극제를 포함하는 면역 반응을 조절하는 나노캐리어를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 표적화 모이어티를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 약학적 조성물이고 약학적으로 허용가능한 캐리어를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 약학적 조성물은 백신 조성물이다.
[0041] 일부 측면에서, 항원 제시 세포-표적화 모이어티와 나노캐리어를 포함하는 약학적 조성물과 같은 조성물이 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 항원 제시 세포-표적화 모이어티 및 나노캐리어는 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 접합체는 공유 접합체이다. 일부 실시예에서, 상기 접합체는 비공유 접합체이다.
[0042] 일부 측면에서, 면역자극제와 나노캐리어를 포함하는 약학적 조성물과 같은 조성물이 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제와 나노캐리어는 접합된다. 일부 실시예에서, 상기 접합체는 공유 접합체이다. 일부 실시예에서, 상기 접합체는 비공유 접합체이다.
[0043] 일부 측면에서, 식 X-L1-Y-L2-Z로서, X는 생분해성 폴리머이고, Y는 수용성 비접착성 폴리머이고, Z는 표적화 모이어티, 면역조절제, 면역자극제 또는 약제이고, L1 및 L2는 결합 또는 연결 분자이며, Y와 Z 모두는 아니지만, Y 또는 Z 중 어느 하나는 부재할 수 있는 것인 분자를 포함하는 조성물이 제공된다.
[0044] 일부 측면에서, 식 X-L1-Y-L2-I로서, I는 면역특징 모이어티이고, X는 생분해성 폴리머이고, Y는 수용성 비접착성 폴리머이고, L1 및 L2는 결합 또는 연결 분자이며, Y와 I 모두는 아니지만, Y 또는 I 중 어느 하나는 부재할 수 있는 것인 분자를 포함하는 조성물이 제공된다.
[0045] 일부 측면에서, 식 T-L1-X-L2-Y-L3-Z로서, T는 T 세포 항원이고, X는 생분해성 폴리머이고, Y는 수용성 비접착성 폴리머이고, Z는 표적화 모이어티, 면역조절제, 면역자극제 또는 약제이고, L1, L2 및 L3는 결합 또는 연결 분자이며, T, Y 및 Z의 3 가지 모두는 아니지만, T, Y 및 Z 중 어느 하나 또는 둘은 부재할 수 있는 것인 분자를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 약제는 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 항원은 B 세포 항원 또는 T 세포 항원이다.
[0046] 일부 측면에서, 식 T-L1-X-L2-Y-L3-Z로서, I는 면역특징 모이어티이고, T는 T 세포 항원이고, X는 생분해성 폴리머이고, Y는 수용성 비접착성 폴리머이고, Z는 표적화 모이어티, 면역조절제, 면역자극제 또는 약제이며, L1, L2 및 L3는 결합 또는 연결 분자이며, T, Y 및 Z의 3 가지 모두는 아니지만, T, Y 및 Z 중 어느 하나 또는 둘은 부재할 수 있는 것인 분자를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 약제는 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 항원은 B 세포 항원 또는 T 세포 항원이다.
[0047] 일부 실시예에서, Z는 퇴행성 질병 항원, 감염성 질병 항원, 암 항원, 아토피성 질병 항원, 자가면역 질병 항원, 동종항원, 이종항원, 합텐(hapten), 중독성 물질 또는 대사성 질병 효소 또는 효소 생성물이다. 일부 실시예에서, Z는 본 명세서에 기술된 B 세포 항원들 중 어느 하나이다. 일부 실시예에서, Z는 본 명세서에 제공된 T 세포 항원들 중 어느 하나이다.
[0048] 일부 실시예에서, Z는 세포의 표면상에 발현된 수용체를 결합하는 표적화 모이어티이다. 일부 실시예에서, Z는 가용성 수용체를 결합하는 표적 모이어티이다. 일부 실시예에서, 상기 가용성 수용체는 보체 또는 기존 항체이다. 일부 실시예에서, 상기 표적화 모이어티는 항원 제시 세포, T 세포 또는 B 세포를 표적하기 위한 것이다.
[0049] 일부 실시예에서, Y는 PEG 또는 PEO이다. 일부 실시예에서, Y는 폴리알킬렌 글리콜 또는 폴리알킬렌 옥사이드이다.
[0050] 일부 실시예에서, X는 PLGA, PGA 또는 PLA이다.
[0051] 일부 실시예에서, Z는 부재한다. 일부 실시예에서, Y는 부재한다.
[0052] 일부 측면에서, 면역자극제와 폴리머의 접합체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 접합체는 공유 접합체이다. 일부 실시예에서, 상기 접합체는 비공유 접합체이다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 수용성 비접착성 폴리머, 생분해성 폴리머 또는 생체적합성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 생체적합성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 생체적합성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 상기 생체적합성 폴리머는 생분해성 폴리머 또는 수용성 비접착성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 상기 생체적합성 폴리머는 수용성 비접착성 폴리머와 생분해성 폴리머의 접합체이다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 합성이다. 일부 실시예에서, 상기 약학적 조성물은 하나 이상의 나노캐리어들을 포함하며, 접합체는 상기 하나 이상의 나노캐리어들의 성분이다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 항원을 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 약학적 조성물은 항원을 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 표적화제를 더 포함한다.
[0053] 일부 측면에서, 면역조절제와 폴리머의 접합체를 포함하는 백신 조성물이 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 접합체는 공유 접합체이다. 일부 실시예에서, 상기 접합체는 비공유 접합체이다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 수용성 비접착성 폴리머, 생분해성 폴리머 또는 생체적합성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 상기 수용성 비접착성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 생체적합성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 상기 생체적합성 폴리머는 생분해성 폴리머 또는 수용성 비접착성 폴리머이다. 일부 실시예에서, 상기 생체적합성 폴리머는 수용성 비접착성 폴리머와 생분해성 폴리머의 접합체이다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 합성이다. 일부 실시예에서, 상기 약학적 조성물은 하나 이상의 나노캐리어들을 포함하며, 접합체는 상기 하나 이상의 나노캐리어들의 성분이다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 항원을 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 약학적 조성물은 항원을 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 표적화제를 더 포함한다.
[0054] 일부 실시예에서, B 세포 항원은 단백질 또는 펩티드이다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 비-단백질 항원(즉, 단백질 또는 펩티드가 아님)이다. 일부 실시예에서, 상기 단백질 또는 펩티드는 감염원으로부터 유래한다. 일부 실시예에서, 상기 감염원은 박테리움, 진균, 바이러스, 원생동물 또는 기생균이다. 일부 실시예에서, 상기 바이러스는 수두 바이러스, 천연두 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스(marburg virus), 뎅기열 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 호흡기 세포융합 바이러스, 홍역 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 인유두종 바이러스(human papillomavirus), 수두대상포진 바이러스(varicella-zoster virus), 단순포진 바이러스, 거대세포바이러스(cytomegalovirus), 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스, JC 바이러스, 랍도바이러스(rhabdovirus), 로타바이러스(rotavirus), 리노바이러스(rhinovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 유두종바이러스, 파보바이러스(parvovirus), 피코르나바이러스(picornavirus), 소아마비바이러스(poliovirus), 유행성 이하선염(mumps) 유발 바이러스, 광견병(rabies) 유발 바이러스, 레오바이러스(reovirus), 풍진바이러스(rubella virus), 토가바이러스(togavirus), 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 헤파드나바이러스(hepadnavirus), 콕사키바이러스(coxsackievirus), 마 뇌염 바이러스(equine encephalitis virus), 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스(yellow fever virus), 리프트 계곡 열 바이러스(Rift Valley fever virus), A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스 또는 E형 간염 바이러스이다.
[0055] 일부 실시예에서, B 세포 항원은 소분자이다. 일부 실시예에서, 상기 소분자는 남용 물질(abused substance), 중독성 물질 또는 독소이다.
[0056] 일부 실시예에서, B 세포 항원은 중독성 물질이다. 일부 실시예에서, 상기 중독성 물질은 마약, 환각제, 흥분제, 기침 억제제(cough suppressant), 신경안정제 또는 진정제이다. 일부 실시예에서, 상기 B 세포 항원은 아편유사제(opioid) 또는 벤조디아제핀(benzodiazepine)이다.
[0057] 일부 실시예에서, B 세포 항원은 독소이다. 일부 실시예에서, 상기 독소는 화학 무기로부터 유래한다. 일부 실시예에서, 화학 무기로부터 유래한 상기 독소는 보툴리눔 독소 또는 포스펜이다. 또한, 화학 무기로부터 유래한 독소들은 O-알킬(Alkyl)(<C10, 시클로알킬 포함)알킬(Me, Et, n-Pr 또는 i-Pr)-포스포노플루오리데이트류(예컨대, 사린(Sarin): O-이소프로필 메틸포스포노플루오리데이트(O-isopropyl methylphosphonofluoridate), 소만(Soman): O-피나콜릴 메틸포스포노플루오리데이트(O-Pinacolyl methylphosphonofluoridate), O-알킬(<C10, 사이클로알킬 포함)N,N-디알킬(Me, Et, n-Pr 또는 i-Pr)포스포라미도시아니데이트류(phosphoramidocyanidates)(예컨대, 타분(Tabun): O-에틸 N,N-디메틸포스포라미도시아니데이트), O-알킬(H 또는 <C10, 시클로알킬 포함)S-2-디알킬(Me, Et, n-Pr 또는 i-Pr)-아미노에틸 알킬(Me, Et, n-Pr 또는 i-Pr)포스포노티올레이트류(phosphonothiolates) 및 해당 알킬화(alkylated) 또는 양자화(protonated) 염류(예컨대, VX: O-에틸 S-2-디이소프로필아미노에틸 메틸포스포노티올레이트), 유황 겨자류(Sulfur mustards): 2-클로로에틸클로로메틸설파이드(Chloroethylchloromethylsulfide), 겨자 가스: 비스(2-클로로에틸)설파이드, 비스(2-클로로에틸티오)메탄, 세스퀴머스타드(Sesquimustard): 1,2-비스(2-클로로에틸티오)에탄, 1,3-비스(2-클로로에틸티오)-n-프로판, 1,4-비스(2-클로로에틸티오)-n-부탄, 1,5-비스(2-클로로에틸티오)-n-펜탄, 비스(2-클로로에틸티오메틸)에테르, O-겨자: 비스(2-클로로에틸티오에틸)에테르, 루이사이트류(Lewisites): 루이사이트 1: 2-클로로비닐디클로로아르신(2-Chlorovinyldichloroarsine), 루이사이트 2: 비스(2-클로로비닐)클로로아르신, 루이사이트 3: 트리스(2-클로로비닐)아르신, 질소 겨자류: HN1: 비스(2-클로로에틸)에틸아민, HN2: 비스(2-클로로에틸)메틸아민, HN3: 트리스(2-클로로에틸)아민, 색시톡신(Saxitoxin), 리신(Ricin), 아미톤(Amiton): O,O-디에틸 S-(2-(디에틸아미노)에틸)포스포로티올레이트 및 해당 알킬화 및 양자화 염류, PFIB: 1,1,3,3,3,-펜타플루오로-2-(트리플루오로메틸)-1-프로펜, 3-퀴누클리디닐 벤질레이트(3-Quinuclidinyl benzilate: BZ), 포스겐(Phosgene): 카르보닐 디클로라이드, 시아노겐 클로라이드, 하이드로겐 시아나이드(Hydrogen cyanide) 및 클로로피크린(Chloropicrin): 트리클로로니트로메탄을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, 나노캐리어에 포함되는 독소는 상기 화합물의 어느 하나의 완전 분자 또는 그것의 일부분이다.
[0058] 일부 실시예에서, B 세포 항원은 생물학적위험(biohazrd) 또는 유해 환경 작용제이다. 일부 실시예에서, 상기 유해 환경 작용제는 비소, 납, 수은, 비닐 클로라이드, 폴리염화 비페닐류(polychlorinated biphenyls), 벤젠, 다환 방향족 탄화수소류(polycyclic aromatic hydrocarbons), 카드뮴, 벤조(a)피렌(benzo(a)pyrene), 벤조(b)플루오란텐(benzo(b)fluoranthene), 클로로포름, 디클로르-디페닐-트리클로르에틸렌(dichlor-diphenyl-trichlorethylene: DDT), P,P'-, 아로클로르(aroclor) 1254, 아로클로르 1260, 디벤조(a,h)안트라센, 트리클로로에틸렌, 디엘드린(dieldrin), 6가 크롬 또는 p,p'-디클로로디페닐디클로로에텐(DDE, P,P')이다.
[0059] 일부 실시예에서, B 세포 항원은 탄수화물이다. 일부 실시예에서, 상기 탄수화물은 감염원으로부터 유래한다. 일부 실시예에서, 상기 감염원은 박테리움, 진균, 바이러스, 원생동물 또는 기생균이다. 일부 실시예에서, 상기 박테리움은 슈도모나스(Pseudomonas), 뉴모코커스(Pneumococcus), 대장균(E. coli), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 트레포네마(Treponema), 보렐리아(Borrelia), 클라미디아(Chlamydia), 해모필러스(Haemophilus), 클로스트리듐(Clostridium), 살모넬라(Salmonella), 레지오넬라(Legionella), 비브리오(Vibrio) 또는 엔테로코시 박테리움(Enterococci baterium) 또는 미코박테리움(Mycobacterium)이다. 일부 실시예에서, 상기 바이러스는 수두 바이러스, 천연두 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 뎅기열 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 홍역 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 인유두종 바이러스, 수두대상포진 바이러스, 단순포진 바이러스, 거대세포바이러스, 엡스타인-바 바이러스, JC 바이러스, 랍도바이러스, 로타바이러스, 리노바이러스, 아데노바이러스, 유두종바이러스, 파보바이러스, 피코르나바이러스, 소아마비바이러스, 유행성 이하선염 유발 바이러스, 광견병 유발 바이러스, 레오바이러스, 풍진바이러스, 토가바이러스, 오르토믹소바이러스, 레트로바이러스, 헤파드나바이러스, 콕사키바이러스, 마 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 리프트 계곡 열 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스 또는 E형 간염 바이러스이다.
[0060] 일부 실시예에서, B 세포 항원은 자기 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 자기항원은 단백질 또는 펩티드, 지질단백질, 지질, 탄수화물 또는 핵산이다. 일부 실시예에서, 상기 자기항원은 효소, 구조단백질, 분비단백질, 세포 표면 수용체 또는 시토카인이다. 일부 실시예에서, 상기 시토카인은 TNF, IL-1 또는 IL-6이다. 일부 실시예에서, 상기 자기 항원은 콜레스테릴 에스테르 전이 단백질(CETP), 알츠하이머병 연관 Aβ 단백질, 상기 Aβ 단백질의 병리 형태를 처리하는 단백질분해 효소, 죽상동맥경화증 연관 LDL 또는 HIV-1에 대한 보조수용체이다. 일부 실시예에서, 상기 Aβ 단백질의 병리 형태를 처리하는 단백질분해 효소는 베타-세크레타제(beta-secretase)이다. 일부 실시예에서, 상기 죽상동맥경화증 연관 LDL은 산화되거나 최소한도로 변형된다. 일부 실시예에서, 상기 HIV-1에 대한 보조수용체는 CCR5이다. 일부 실시예에서, 상기 자기항원은 자가면역 질병 항원이다.
[0061] 일부 실시예에서, B 세포 항원은 퇴행성 질병 항원, 감염성 질병 항원, 암 항원, 아토피성 질병 항원, 자가면역 질병 항원 또는 그 대사성 질병 효소 또는 효소 생성물이다.
[0062] 일부 실시예에서, 항원은 암 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 암 항원은 Melan-A/MART-1, 디펩티딜 펩티다아제(Dipeptidyl peptidase) IV(DPPIV), 아데노신 디아미나제-결합 단백질(ADAbp), 시클로필린(cyclophilin) b, 결장 연관 항원(Colorectal associated antigen: CRC)--C017-1A/GA733, 암배아 항원(CEA) 및 그 면역성 에피토프들 CAP-1 및 CAP-2, etv6, amll, 전립선특이항원(PSA) 및 그 면역성 에피토프들 PSA-1, PSA-2 및 PSA-3, 전립선특이막항원(PSMA), T-세포 수용체/CD3-제타 사슬, MAGE-종양 항원들의 계열(예컨대, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2(MAGE-B2), MAGE-Xp3(MAGE-B3), MAGE-Xp4(MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), GAGE-종양 항원들의 계열(예컨대, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, 티로시나제, p53, MUC 계열, HER2/neu, p21ras, RCAS1, α-페토단백질, E-카드헤린, α-카테닌, β-카테닌 및 γ-카테닌, p120ctn, gp100Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, 뇌 글리코겐 포스포릴라아제(brain glycogen phosphorylase), SSX-1, SSX-2(HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1, CT-7, cdc27, 선종양 폴립증 장 단백질(adenomatous polyposis coli protein), 포드린, P1A, 코넥신(Connexin) 37, Ig-유전자형(idiotype), p15, gp75, GM2 및 GD2 강글리오시드류(gangliosides), 인유두종 바이러스 단백질류와 같은 바이러스 생성물들, 종양 항원들의 Smad 계열, lmp-1, EBV-인코딩된 핵 항원(EBNA)-1 또는 c-erbB-2이다.
[0063] 일부 실시예에서, 감염성 질병 항원은 바이러스 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 바이러스 항원은 수두 바이러스, 천연두 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 뎅기열 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 홍역 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 인유두종 바이러스, 수두대상포진 바이러스, 단순포진 바이러스, 거대세포바이러스, 엡스타인-바 바이러스, JC 바이러스, 랍도바이러스, 로타바이러스, 리노바이러스, 아데노바이러스, 유두종바이러스, 파보바이러스, 피코르나바이러스, 소아마비바이러스, 유행성 이하선염 유발 바이러스, 광견병 유발 바이러스, 레오바이러스, 풍진바이러스, 토가바이러스, 오르토믹소바이러스, 레트로바이러스, 헤파드나바이러스, 콕사키바이러스, 마 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 리프트 계곡 열 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스 또는 E형 간염 바이러스로부터 유래한 항원이다.
[0064] 일부 실시예에서, B 세포 항원은 낮은 면역성의 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 낮은 면역성의 항원은 비단백질 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 낮은 면역성의 항원은 탄수화물 또는 소분자이다. 일부 실시예에서, 상기 낮은 면역성의 항원은 남용 물질, 중독성 물질, 또는 독소이다. 일부 실시예에서, 상기 독소는 화학 무기로부터 유래한다. 일부 실시예에서, 상기 낮은 면역성의 항원은 유해 환경 작용제이다. 일부 실시예에서, 상기 낮은 면역성의 항원은 자기항원이다.
[0065] 일반적으로, T 세포 항원은 단백질 또는 펩티드이다. 일부 실시예에서, 상기 T 세포 항원은 퇴행성 질병 항원, 감염성 질병 항원, 암 항원, 아토피성 질병 항원, 자가면역 질병 항원, 동종항원, 이종항원, 접촉 증감제(contact sensitizer), 합텐 또는 대사성 질병 효소 또는 효소 생성물이다.
[0066] 일부 실시예에서, T 세포 항원은 감염원으로부터 유래한다. 일부 실시예에서, 상기 감염원은 박테리움, 진균, 바이러스, 원생동물 또는 기생균이다. 일부 실시예에서, 감염성 질병 항원은 바이러스 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 바이러스 항원은 수두 바이러스, 천연두 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 뎅기열 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 홍역 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 인유두종 바이러스, 수두대상포진 바이러스, 단순포진 바이러스, 거대세포바이러스, 엡스타인-바 바이러스, JC 바이러스, 랍도바이러스, 로타바이러스, 리노바이러스, 아데노바이러스, 유두종바이러스, 파보바이러스, 피코르나바이러스, 소아마비바이러스, 유행성 이하선염 유발 바이러스, 광견병 유발 바이러스, 레오바이러스, 풍진바이러스, 토가바이러스, 오르토믹소바이러스, 레트로바이러스, 헤파드나바이러스, 콕사키바이러스, 마 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 리프트 계곡 열 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스 또는 E형 간염 바이러스로부터 유래한 항원이다.
[0067] 일부 실시예에서, T 세포 항원은 보편적 T 세포 항원이다. 일부 실시예에서, 상기 보편적 T 세포 항원은 파상풍 톡소이드, 엡스타인-바 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스로부터 유래한 하나 이상의 펩티드이다.
[0068] 일부 실시예에서, 면역자극제들은 인터류킨류, 인터페론, 시토카인류 등이다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 톨 유사 수용체(TLR) 효현제, 시토카인 수용체 효현제, CD40 효현제, Fc 수용체 효현제, CpG-함유 면역자극 핵산, 보체 수용체 효현제 또는 보조제이다. 일부 실시예에서, 상기 TLR 효현제는 TLR-1, TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7, TLR-8, TLR-9 또는 TLR-10 효현제이다. 일부 실시예에서, 상기 Fc 수용체 효현제는 Fc-감마 수용체 효현제이다. 일부 실시예에서, 상기 보체 수용체 효현제는 CD21 또는 CD35와 결합한다. 일부 실시예에서, 상기 보체 수용체 효현제는 나노캐리어의 내인성 보체 옵소닌 작용을 유도한다. 일부 실시예에서, 상기 시토카인 수용체 효현제는 시토카인이다. 일부 실시예에서, 상기 시토카인 수용체 효현제는 소분자, 항체, 융합 단백질 또는 앱타머이다. 일부 실시예에서, 상기 면역자극제는 보조제이다. 일부 실시예에서, 상기 보조제는 시토카인 생합성을 유도한다. 일부 실시예에서, 상기 보조제는 알럼, MF59, R848, 콜레라 독소, 스쿠알렌, 인산염 보조제 또는 테트라클로로데카옥사이드(tetrachlorodecaoxide)이다. 일부 실시예에서, 상기 보조제는 모노포스포릴 지질 A(MPL, SmithKline Beecham); QS21을 포함하는 사포닌류(SmithKline Beecham); 면역자극성 올리고뉴클레오티드류(예컨대, Kreig 등이 Nature 374:456-9, 1995에 최초로 기술한 CpG 면역자극 올리고뉴클레오티드류); 불완전한 Freund의 보조제, 완전한 Freund의 보조제; 몬타니드(montanide); 비타민 E 및 스쿠알렌 및/또는 토코페롤, Quil A, Ribi Detox, CRL-1005 또는 L-121과 같은 생분해성 오일로부터 제조된 다양한 유중수(water-in-oil) 에멀젼이다.
[0069] 특이적인 실시예에서, 면역자극제는 톨 유사 수용체(TLR)에 대한 천연 또는 합성 효현제 일 수 있다. 특이적인 실시예에서, 면역자극제는 I형 인터페론 생성을 유도하는 CpG와 같은 톨 유사 수용체(TLR)-7에 대한 리간드; DC 표면 분자 CD40에 대한 효현제; DC 성숙을 촉진하는 작용제; TLR-4 효현제; 시토카인; 괴사 세포들(예컨대, 요산염 결정들)로부터 방출된 전염증 자극(proinflammatory stimuli); 보체 캐스케이드의 활성화 성분들(예컨대, CD21, CD35 등) 등 일수 있다.
[0070] 일부 실시예에서, 표적화 모이어티는 세포 표면상에 발현된 수용체를 결합한다. 일부 실시예에서, 상기 표적화 모이어티는 가용성 수용체를 결합한다. 일부 실시예에서, 상기 가용성 수용체는 보체 단백질 또는 기존 항체이다. 일부 실시예에서, 상기 표적화 모이어티는 항원 제시 세포, T 세포 또는 B 세포에 나노캐리어의 전달을 위한 것이다. 일부 실시예에서, 상기 항원 제시 세포는 대식세포이다. 일부 실시예에서, 상기 대식세포는 피막하동 대식세포이다. 일부 실시예에서, 상기 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. 일부 실시예에서, 상기 항원 제시 세포는 소포 수지상 세포이다.
[0071] 일부 실시예에서, 표적화 모이어티는 CD11b, CD169, 만노스 수용체, DEC-205, CD11c, CD21/CD35, CX3CR1 또는 Fc 수용체와 결합하는 분자이다. 일부 실시예에서, 표적화 모이어티는 CD169, CX3CR1 또는 Fc 수용체와 결합하는 분자이다. 일부 실시예에서, 상기 CD169와 결합하는 분자는 항-CD169 항체이다. 일부 실시예에서, 상기 CD3CR1을 결합하는 분자는 CX3CL1(프렉탈카인)이다. 일부 실시예에서, 상기 표적화 모이어티는 면역글로불린의 Fc 부분을 포함한다. 일부 실시에에서, 상기 표적화 모이어티는 IgG의 Fc 부분을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 면역글로불린의 Fc 부분은 면역글로불린의 인간 Fc 부분이다. 일부 실시예에서, 상기 IgG의 Fc 부분은 IgG의 인간 Fc 부분이다. 일부 실시예에서, 상기 표적화 모이어티는 가용성 수용체 CRFc이다. 일부 실시예에서, CRFc는 피막하동에 있는 대식세포를 표적하는데 사용될 수 있지만, 수질의 대식세포를 표적하지는 않는다. 일부 실시예에서, 상기 표적화 모이어티는 하나 이상의 아민 모이어티이다.
[0072] 일부 측면에서, 본 명세서에 제공된 조성물들은 면역원성이다.
[0073] 일부 측면에서, 본 명세서에 제공된 조성물들 중 하나를 면역 반응을 조절하는데 효과적인 양으로 피검자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 면역 반응을 유도하거나 향상시키는데 효과적인 양이다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 면역 반응을 억제하는데 효과적인 양이다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 면역 반응을 지시하거나 재지시하는데 효과적인 양이다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 본 명세서에 확인된 상태들의 예방 및/또는 치료를 위한 것이다.
[0074] 상기 방법은 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 것인 일부 실시예에서, 피검자는 암, 전염성 질병, 비자가면역 대사성 또는 퇴행성 질병, 아토피성 질병 또는 중독을 갖거나 가지기 쉽다. 일부 실시예에서, 상기 피검자는 독소에 노출되거나 노출될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 피검자는 화학 무기로부터 유래한 독소에 노출되거나 노출될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 피검자는 유해한 환경 물질로부터 유래한 독소에 노출되거나 노출될 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 B 세포 항원, 면역자극제 및 보편적 T 세포 항원과 같은 T 세포 항원을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어는 표적화 모이어티를 더 포함한다.
[0075] 상기 방법은 중독을 치료하거나 예방하는 것(또는 독소에 노출되거나 노출될 수 있는 피검자를 치료하기 위한 것)인 일부 실시예에서, 나노캐리어는 중독성 물질 또는 독소, 보조제 및 T 세포를 포함한다. 일부 실시예에서, 상하게 하는 작용제(offending agent)가 그 효과기 부위(예컨대, 대뇌)에 도달하기 전에 이를 결합하고 중화시키는 높은 역가 항체들을 성장시킨다. 일부 실시예에서, 중독성 물질 또는 독소는 나노캐리어의 표면상에 높은 밀도로 있다.
[0076] 일부 실시예에서, 감염성 질병은 만성 바이러스 감염이다. 일부 실시예에서, 상기 만성 바이러스 감염은 HIV, HPV, HBV 또는 HCV 감염이다. 일부 실시예에서, 상기 감염성 질병은 박테리아 감염이거나 박테리아 감염에 의해 유발된다. 일부 실시예에서, 피검자는 슈도모나스 감염, 뉴모코커스 감염, 결핵, 말라리아, 레슈마니아증(leishmaniasis), 헬리코박터 파일로리(H. pylori), 스타필로코커스 감염 또는 살모넬라 감염을 갖거나 가지기 쉽다. 일부 실시예에서, 상기 감염성 질병은 진균 감염이거나 진균 감염에 의하여 유발된다. 일부 실시예에서, 상기 감염성 질병은 기생균 감염이거나 기생균 감염에 의하여 유발된다. 일부 실시예에서, 상기 감염성 질병은 원생동물 감염이거나 원생동물 감염에 의하여 유발된다. 일부 실시예에서, 상기 피검자는 인플루엔자를 갖거나 가지기 쉽다.
[0077] 일부 실시예에서, 자가면역 질병은 낭창, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 진성 1형 당뇨병, 염증성 장질환, 갑상선염 또는 셀리악병이다. 일부 실시예에서, 피검자는 이식물을 갖거나 가질 것이고, 이식 거부를 예방하거나 완화할 수 있는 방법이다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 항원 및 면역 억제제 또는 조절 T 세포를 유도하는 작용제를 포함한다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 표적화 모이어티를 더 포함한다. 일반적으로, 상기 방법이 면역 반응을 억제하는 방법인 곳에서는, 항원은 보조제 없이 제공된다.
[0078] 일부 측면에서, 면역 시스템의 세포로의 면역조절제 전달을 위한 백신 나노캐리어가 제공된다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 B 세포 및/또는 T 세포에 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 면역조절제를 포함한다. 특정 실시예에서, 나노캐리어 표면상에 제시된 면역조절제는 B 세포를 자극하고, 상기 나노캐리어 내에서 캡슐화된 면역조절제는 처리되고 T 세포에 제시된다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 특이적인 항원-제시 세포(APCs)에 백신 나노캐리어를 선택적으로 전달시키는데 유용한 적어도 하나의 표적화 모이어티를 포함한다.
[0079] 일부 실시예에서, 면역조절제는 분리되고/되거나 재조합 단백질류 또는 펩티드류, 탄수화물류, 당단백질류, 당펩티드류, 프로테오글리칸류, 비활성화 유기물들 및 바이러스들, 죽은 유기물들 및 바이러스, 유전적으로 변형된 유기물들 또는 바이러스들 및 세포 추출물들을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 핵산류, 탄수화물류, 지질류 및/또는 소분자들을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 면역 반응을 도출하는 조절제이다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 항원이다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 백신용으로 사용된다.
[0080] 일부 실시예에서, 면역조절제는 임의의 단백질 및/또는 병원체로부터 유래된 다른 항원이다. 상기 병원체는 바이러스, 박테리움, 진균, 원생동물, 기생균 등일 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 전체가 사멸된 유기물들, 펩티드류, 단백질류, 당단백질류, 당펩티드류, 프로테오글리칸류, 탄수화물류 또는 그 조합의 형태일 수 있다.
[0081] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어의 모든 면역조절제들은 서로 동일하다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어의 모든 면역조절제들은 상이하다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 정확히 구별되는 유형(즉, 종)의 면역조절제를 포함한다. 예를 들면, 상기 면역조절제가 항원인 경우, 상기 백신 나노캐리어에 있는 모든 항원들은 동일하다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 정확히 2 개의 구별되는 유형의 면역조절제들을 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 2 개를 초과하는 구별되는 유형의 면역조절제들을 포함한다.
[0082] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 B 세포에서 면역 반응을 자극하는 단일 유형의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 T 세포에서 면역 반응을 자극하는 단일 유형의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 2 가지 유형의 면역조절제들을 포함하되, 제 1 면역조절제는 B 세포를 자극하고 제 2 면역조절제는 T 세포를 자극한다. 일부 실시예에서, 상기 언급된 작용제들 중 어느 하나는 B 세포와 T 세포 모두를 자극할 수 있지만, 이것은 항상 그러한 것은 아니다. 일부 실시예에서, 상기 언급된 면역조절제들은 B 세포 또는 T 세포 중 각각 하나만 자극한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 2 개를 초과하는 유형의 면역조절제들을 포함하되, 하나 이상의 유형의 면역조절제들은 B 세포를 자극하고 하나 이상의 유형의 면역조절제들은 T 세포를 자극한다.
[0083] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 지질막(예컨대, 지질 이중층, 지질 단일층 등)을 포함한다. 적어도 하나의 면역조절제는 지질막과 연관될 수 있다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 면역조절제는 상기 지질막 내에 임베드(embedded)되고, 지질 이중층의 내강(lumen) 내에 임베드되고, 상기 지질막 의 내부 표면과 연관되고/되거나 백신 나노캐리어의 지질막과 캡슐화된다.
[0084] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 폴리머(예컨대, 폴리머 중심)을 포함한다. 면역조절제는 상기 폴리머와 연관될 수 있으며, 일부 실시예에서, 적어도 하나의 유형의 면역조절제가 상기 폴리머와 연관된다. 일부 실시예에서, 상기 면역조절제는 상기 폴리머 내에 임베드되고, 상기 폴리머의 내부 표면과 연관되고/되거나 백신 나노캐리어의 폴리머 내에 캡슐화되며, 일부 실시예에서, 적어도 하나의 유형의 면역조절제가 상기 폴리머 내에 임베드되고, 상기 폴리머의 내부 표면과 연관되고/되거나 백신 나노캐리어의 폴리머 내에 캡슐화된다.
[0085] 일부 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어는 면역조절제 중량비 90% 미만, 중량비 75% 미만, 중량비 50% 미만, 중량비 40% 미만, 중량비 30% 미만, 중량비 205 미만, 중량비 15% 미만, 중량비 10% 미만, 중량비 5% 미만, 중량비 1% 미만 또는 중량비 0.5% 미만을 포함한다.
[0086] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 면역 표면과 연관된 복수의 모이어티들(즉, APC에 나노캐리어들의 표적화를 제공하는 모이어티들)에 더하여 적어도 하나의 표적화 모이어티와 연관된다. 상기 추가적인 표적화 모이어티들은 상기 추가적인 표적화 모이어티들이 통상적으로 수용체에 높은 친화도 결합을 제공하고(그러므로 본 명세서에서 "높은 친화도 표적화 모이어티들"이라고 달리 칭해질 수 있음) 있다는 점에서 면역특징 표면상에 존재하는 복수의 모이어티들과는 구별된다. 일부 실시예에서, 표적화 모이어티는 핵산, 폴리펩티드, 펩티드, 당단백질, 당펩티드, 프로테오글리칸, 탄수화물, 지질, 소분자 등일 수 있다. 예를 들면, 표적화 모이어티는 세포 타입 특이적 마커에 결합하는 핵산 표적화 모이어티(예컨대, 앱타머, Spiegelmer
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등) 일 수 있다. 일부 실시예에서, 표적 모이어티는 예컨대, DEC-205, CD169, CD11b 등과 같은 세포 표면 단백질에 대한 자연발생적 또는 합성 리간드일 수 있다. 또한, 표적 모이어티들의 예들은 상술한 바와 같이 본 명세서 다른 곳에 제공된 것들을 포함한다.
[0087] 본 발명에 따르면, 표적화 모이어티는 특정 기관, 조직, 세포 및/또는 세포이하 장소와 연관된 하나 이상의 "수용체들", "표적들" 또는 "마커들"을 인식한다. 일부 실시예에서, 표적은 하나 또는 소수의 세포 타입들과 하나 또는 소수의 질병들과 및/또는 하나 또는 소수의 발달 단계들과 하나 또는 배타적으로 또는 주로 연관되는 마커일 수 있다. 표적되는 세포들의 예로는 수지상 세포, 소포 수지상 세포 및 대식세포와 같은 항원 제시 세포들(APCs)을 포함한다. 대식세포의 일례는 피막하동 대식세포이다. 표적되는 다른 세포들은 T 세포 및 B 세포를 포함한다. 일부 실시예에서, 표적은 단백질, 탄수화물, 지질 및/또는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 표적은 종양 마커이다. 일부 실시예에서, 표적은 APC 마커이다. 특정 실시예에서, 표적은 T 세포 마커이다. 일부 실시예에서, 표적화 모이어티들은 2차 임파성 조직 또는 기관을 표적한다. 2차 임파성 조직 또는 기관은 림프절, 비장, 페이어스판, 충수 또는 편도선을 포함한다.
[0088] 일부 실시예에서, 표적은 수지상 세포 마커이다. 일부 실시예에서, DC 마커는 DC-205, CD11c, II형 MHC, CD80, CD86, DC-SIGN, CD11b, BDCA-1, BDCA-2, BDCA-4, Siglec-H, CX3CR1 및/또는 랑게린(Langerin)을 포함한다. 그러한 마커들의 예는 본 명세서의 다른 곳에 제공되어 있다.
[0089] 일부 실시예에서, 표적은 피막하동 대식세포 마커이다. 일부 실시예에서, SCS-Mph 마커들은 CD169(즉, 시알로드헤신(sialoadhesin)), CD11b(즉, CD11b/CD18, Mac-1, CR3 또는 αMβ2 인테그린(integrin)), Fc 수용체 및/또는 만노스 수용체(즉, 다가 렉틴), SCS-Mph상에 모두 뚜렷하게 발현된 단백질류를 포함한다. 그러한 마커들의 예는 본 명세서의 다른 곳에 제공되어 있다.
[0090] 일부 실시예에서, 표적은 B 세포 마커이다. 일부 실시예에서, B 세포 마커들은 보체 수용체들, CR1(즉, CD35) 또는 CR2(즉, CD21), B 세포상에 발현된 단백질류를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, B 세포 표적화는 CD19, CD20 및/또는 CD22와 같은 B 세포 마커들에 의하여 수행될 수 있다. 일부 실시예에서, B 세포 표적화는 CD40, CD52, CD80, CXCR5, VLA-4, II형 MHC, 표면 IgM 또는 IgD, APRL 및/또는 BAFE-R과 같은 B 세포 마커들에 의하여 수행될 수 있다. 그러한 마커들의 예는 본 명세서의 다른 곳에 제공되어 있다.
[0091] 특정 실시예에서, 표적은 FDC 마커이다. 일부 실시예에서, FDC 마커들은 보체 수용체들, CR1(즉, CD35) 또는 CR2(즉, CD21), FDC들 상에 발현된 단백질류를 포함한다. 그러한 예는 본 명세서의 다른 곳에 제공되어 있다.
[0092] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 단일 세포 타입에 상기 백신 나노캐리어의 전달(예컨대, SCS-Mph에만 전달)을 지시하는 단일 유형의 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 복수의 세포 타입들에 상기 백신 나노캐리어의 전달(예컨대, SCS-Mps들 및 FDC들 양쪽 모두 또는 SCS-Mps들 및 DC들 양쪽 모두에의 전달)을 지시하는 단일 유형의 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 2 개 유형의 표적화 모이어티들을 포함하되, 제 1 유형의 표적화 모이어티는 제 1 세포 타입에 상기 나노캐리어의 전달을 지시하고 제 2 유형의 표적화 모이어티는 제 2 세포 타입에 상기 나노캐리어의 전달을 지시한다. 예를 들면, 일부 실시예에서, 제 1 유형의 표적화 모이어티는 SCS-Mph들에 전달을 지시하고, 제 2 유형의 표적화 모이어티는 DC들에 전달을 지시한다. 다른 예로서, 제 1 유형의 표적화 모이어티는 SCS-Mph들에 전달을 지시하고, 제 2 유형의 표적화 모이어티는 FDC들에 전달을 지시한다.
[0093] 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어들은 표적화 모이어티의 중량비 50% 미만, 중량비 40% 미만, 중량비 30% 미만, 중량비 20% 미만, 중량비 15% 미만, 중량비 10% 미만, 중량비 5% 미만, 중량비 1% 미만 또는 중량비 0.5% 미만을 포함한다.
[0094] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어들은 면역 반응을 자극하는데 보조할 수 있는 하나 이상의 유형의 면역자극제들을 수송할 수 있다. 일부 실시예에서, 면역자극제들은 APC들을 활성화하여 이들의 면역자극 능력을 향상시킴으로써 면역 반응을 증진시킨다. 일부 실시예에서, 면역자극제는 특이적인 항원에 림프구 반응을 증폭하여 면역 반응을 증진시킨다. 일부 실시예에서, 면역자극제는 다양한 세포 타입들로부터 유래한 시토카인류와 같은 매개물질들의 국소 방출을 유도하여 면역 반응을 증진시킨다.
[0095] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 B 세포 및 T 세포 모두를 자극하는 단일 유형의 면역자극제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 2 가지 유형의 면역자극제들을 포함하되, 제 1 유형의 면역자극제는 B 세포를 자극하고 제 2 유형의 면역자극제는 T 세포를 자극한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 2 가지 유형을 초과하는 면역자극제들을 포함하되, 하나 이상의 유형의 면역자극제들은 B 세포를 자극하고 하나 이상의 유형의 면역자극제들은 T 세포를 자극한다.
[0096] 일부 실시예에서, 면역 반응이 B 세포 또는 일단의 B 세포들에서 또는 T 세포 또는 일단의 T 세포들에서 조절되는지의 여부를 결정하기 위하여 다양한 시험을 활용할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 시험은 상기 세포 또는 일단의 세포들이 "활성화" 되었는지의 여부를 평가한다.
[0097] 일부 실시예에서, 면역 반응이 T 세포 또는 일단의 T 세포들에서 자극되었는지의 여부를 결정하기 위하여 다양한 시험을 활용할 수 있다. 일부 실시예에서, T 세포들에서 면역 반응의 자극은 T 세포들에 의한 시토카인류의 항원-유도 생성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, T 세포들에서 면역 반응의 자극은 T 세포들의 항원-유도 증식을 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, T 세포 활성화의 세포 마커들이 자극받지 않은 세포들에 비해 다른 양으로(예컨대, 더 높거나 더 낮은 양으로) 발현된다면 T 세포들에서 면역 반응이 자극되는지 결정된다.
[0098] 일부 실시예에서, 면역 반응이 B 세포 또는 일단의 B 세포들에서 자극되었는지의 여부를 결정하기 위하여 다양한 시험을 활용할 수 있다. 일부 실시예에서, B 세포들에서 면역 반응의 자극은 항체 역가들, 항체 친화도들, 중화 시험들에서 항체 성능, 클래스 스위치 재조함(class switch recombination), 항원-특이적 항체들의 친화도 성숙, 메모리 B 세포들의 발달, 장기간 높은 친화도 항체들을 대량 생성할 수 있는 장수 형질 세포들의 발달, 배중심 반응 및/또는 중화 시험들에서 항체 성능을 측정함으로써 결정될 수 있다.
[0099] 백신 나노캐리어는 면역특징 표면을 포함하는 실재(entity)이다. 또한, 상기 백신 나노캐리어는 B 세포 및/또는 T 세포에서 면역 반응을 자극할 수 있는 적어도 하나의 면역조절제를 포함할 수 있다. 임의의 백신 나노캐리어가 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
[00100] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 100 마이크론(㎛) 미만의 최대 치수(예컨대, 직경)를 갖는다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어들은 300 nm 이하의 최대 치수(예컨대, 직경)를 갖는다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어들은 250 nm 이하의 최대 치수(예컨대, 직경)를 갖는다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어들은 200 nm 이하의 최대 치수(예컨대, 직경)를 갖는다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어들은 150 nm 이하의 최대 치수(예컨대, 직경)를 갖는다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어들은 100 nm 이하의 최대 치수(예컨대, 직경)를 갖는다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어들은 25 nm에서 200 nm 사이에 이르는 최대 치수를 갖는다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어들은 20 nm에서 100 nm 사이에 이르는 최대 치수를 갖는다.
[00101] 다양한 나노캐리어들이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어들은 구체(spheres) 또는 회전타원체(spheroids)이다. 일부 실시예에서, 나노캐리어들은 평평하거나 판모양이다. 일부 실시예에서, 나노캐리어들은 정육면체(cubes) 또는 입방체(cuboids)이다. 일부 실시예에서, 나노캐리어들은 계란형(ovals) 도는 타원형(ellipses)이다. 일부 실시예에서, 나노캐리어들은 원통형(cylinders), 원뿔형(cones) 또는 피라미드형(pyramids)이다. 나노캐리어들은 하나 이상의 표면들을 포함하며, 상기 하나 이상의 표면들 중 적어도 하나는 면역특징 표면이다. 나노캐리어들은 속이 꽉 차거나 중공일 수 있으며 하나 이상의 층들을 포함한다. 일부 실시예에서, 각각의 층은 다른 층(들)에 비하여 독특한 조성 및 독특한 특성들을 갖는다. 한가지 예를 들자면, 나노캐리어들은 중심/껍질 구조를 가질 수 있으며, 중심은 제 1 층(예컨대, 폴리머 중심)이고 껍질은 제 2 층(예컨대, 지질 이중층 또는 단일층)이다. 나노캐리어들은 복수의 상이한 층들을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제 1 층은 실질적으로 교차결합될 수 있으며, 제 2 층은 실질적으로 교차결합되지 않을 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 상이한 층들 중 하나, 소수 또는 모두가 하나 이상의 면역조절제들, 표적화 모이어티들, 면역자극제들 및/또는 그 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제 1 층은 면역조절제, 표적화 모이어티 및/또는 면역자극제를 포함하고, 제 2 층은 면역조절제, 표적화 모이어티 및/또는 면역자극제 등을 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 각각의 개별 층은 상이한 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제 및/또는 그 조합을 포함한다.
[00102] 일부 실시예에서, 나노캐리어들은 선택적으로 하나 이상의 지질들을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 지질 이중층 및 복수의 지질 이중층들을 포함한다. 예를 들면, 지질 이중층은 나노캐리어의 외부 표면을 형성할 수 있는데, 이 경우 상기 지질 이중층을 포함하는 나노캐리어는 리포솜으로 칭할 수 있다. 리포솜 나노캐리어들은 비교적 성형가능한 표면을 통상적으로 가지며, 상기 나노캐리어들은 환경적 요인들에 따라 다양한 형상들(예컨대, 구형, 직사각형(oblong), 원통형 등)을 취할 수 있다. 그러므로, 그러한 나노캐리어들의 최대 직경은 상이한 환경에서 변할 수 있다는 것을 알게 될 것이다. 통상적으로, 리포솜 나노캐리어들은 인지질류를 포함한다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 지질 단일층을 포함한다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 미셀이다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 지질층(예컨대, 지질 이중층, 지질 단일층 등)에 의하여 둘러싸인 폴리머 매트릭스의 중심을 포함한다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 지질층(예컨대, 지질 이중층, 지질 단일층 등)에 의하여 둘러싸인 비폴리머 중심(예컨대, 금속 입자, 양자점, 세라믹 입자, 골입자 등)을 포함한다.
[00103] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 하나 이상의 폴리머들을 포함한다. 일부 실시예에서, 폴리머 매트릭스는 코팅층(예컨대, 리포솜, 지질 단일층, 미셀 등)에 의하여 둘러싸일 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제, 표적화 모이어티 및/또는 면역자극제는 폴리머 매트릭스와 연관될 수 있다. 그러한 실시예에서, 상기 면역조절제, 표적화 모이어티 및/또는 면역자극제는 나노캐리어 내에서 효과적으로 캡슐화된다. 그러나, 면역특징 표면상에 있는 복수의 모이어티들(즉, APC들에 표적화를 제공하는)은 나노캐리어들의 표면상에 있으며, 상기 표면은 외부 표면이고 상기 나노캐리어를 둘러싸는 환경에 노출된다는 것을 알게 될 것이다.
[00104] 일부 실시예에서, 면역조절제, 표적화 모이어티 및/또는 면역자극제는 나노캐리어와 공유적으로 연관될 수 있다. 여기에 언급되고(본 명세서에 더 상세히 기술된) 표적화 모이어티들은 예를 들면, B-세포 표적화 모이어티들 또는 B-세포 표적화 모이어티들이다. 그러한 모이어티들은 면역특징 표면상에 존재하고 APC들에 나노캐리어들을 표적화하게 하는 복수의 모이어티들에 첨가된다는 것을 알게 될 것이다. 일부 실시예에서, 공유 연관(covalent association)은 링커(linker)에 의하여 매개된다. 일부 실시예에서, 면역조절제, 표적화 모이어티 및/또는 면역자극제는 나노캐리어와 비공유적으로 연관된다. 예를 들면, 일부 실시예에서, 면역조절제, 표적화 모이어티 및/또는 면역자극제는 폴리머 매트릭스, 지질막 등 내에서 캡슐화되고, 이에 의하여 둘러싸이고/싸이거나 이들 전체에 걸쳐서 분산된다. 또한, 면역조절제, 표적화 모이어티 및/또는 면역자극제는 소수성 상호작용, 전하 상호작용, 반데르 발스 힘 등에 의하여 폴리머 매트릭스, 지질막 등과 연관 될 수 있다.
[00105] 다양한 폴리머들 및 이들로부터 폴리머 매트릭스를 형성하는 방법은 약물 전달 기술계에 공지되어 있다. 일반적으로 폴리머 매트릭스는 하나 이상의 폴리머들을 포함한다. 임의의 폴리머가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 폴리머들은 천연 또는 비천연(합성) 폴리머일 수 있다. 폴리머들은 둘 이상의 단량체들을 포함하는 호모중합체들 또는 공중합체들 일 수 있다. 서열로 보면, 공중합체들은 랜덤(random), 블럭(block)일 수 있거나 랜덤과 블럭 서열들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리머들은 유기 폴리머들일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머들은 수지상 폴리머들 또는 폴리머들의 혼합이다.
[00106] 폴리머들의 예는 폴리에틸렌류, 폴리카보네이트류(예컨대, 폴리(1,3-디옥산-2온)), 폴리안하이드라이드류(예컨대, 폴리(세바식 안하이드라이드)), 폴리히드록시산류(예컨대, 폴리(β-히드록시알카노에이트)), 폴리프로필퓨메레이트류, 폴리카프로락톤류, 폴리아미드류(예컨대, 폴리카프로락탐), 폴리아세탈류, 폴리에테르류, 폴리에스테르류(예컨대, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드), 폴리(오르토에스테르류), 폴리시아노아크릴레이트류, 폴리비닐 알코올류, 폴리우레탄류, 폴리포스파젠류, 폴리아크릴레이트류, 폴리메타크릴레이트류, 폴리우레아류, 폴리스타이렌류 및 폴리아민류를 포함한다.
[00107] 일부 실시예에서, 나노캐리어들은 역미셀 내에 임베드된 면역조절제들을 포함한다. 한가지 예를 들면, 리포솜 나노캐리어는 리포솜 막 내에 임베드된 소수성 면역조절제들 및 리포솜 나노캐리어의 내부에서 발견되는 역미셀들과 임베드된 친수성 면역조절제들을 포함할 수 있다.
[00108] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 폴리머 성분을 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 나노캐리어들은 금속 입자, 양자점, 세라믹 입자, 골입자, 바이러스 입자 등을 포함한다. 일부 실시예에서, 면역조절제, 표적화 모이어티 및/또는 면역자극제는 그러한 비폴리머성 나노캐리어의 표면과 연관된다. 일부 실시예에서, 비폴리머성 나노캐리어는 금속 원자들(예컨대, 금 원자들)의 집합체(aggregate)와 같은 비폴리머성 성분들의 집합체이다. 일부 실시예에서, 면역조절제, 표적화 모이어티 및/또는 면역자극제는 비폴리머성 성분들의 집합체의 표면과 연관되고, 비폴리머성 성분들의 집합체 내에 캡슐화되고, 비폴리머성 성분들의 집합체에 의해 둘러싸여 지고/지거나 비폴리머성 성분들의 집합체 전체에 걸쳐 분산된다.
[00109] 일부 실시예에서, 나노캐리어들은 하나 이상의 양친매성 실재들(즉, 친수성 및 소수성 특성들 양쪽 모두를 갖는 실재들)을 선택적으로 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 양친매성 실재는 향상된 안정성, 개선된 균일성 또는 증가된 점성을 갖는 나노캐리어들의 생성을 촉진할 수 있다.
[00110] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 상기 나노캐리어의 외부 표면과 연관되고/되거나 상기 나노캐리어 내에 캡슐화되는 하나 이상의 나노입자들을 포함한다.
[00111] 나노캐리어들은 기술계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 미립자 나노캐리어 제형들은 나노침전법, 유체 채널들을 이용하는 유체 집속, 스프레이 건조, 단일 및 이중 이멀젼 용매 증발(single and double emulsion solvent evaporation), 용매 추출, 상 분리, 밀링, 마이크로이멀젼 절차(microemulsion procedures), 나노프린팅, 마이크로제조(microfabrication), 나노제조(nanofabrication), 희생층, 단순 및 복합 코아세르베이션(simple and complex coacervation)과 같은 방법들뿐만 아니라 당업자에게 공지된 다른 방법들에 의하여 형성될 수 있다. 또한, 단분산 반도체, 전도성, 자기, 유기 및 다른 나노입자들을 위한 수용성 및 유기 용매 합성법들이 활용될 수 있다.
[00112] 일부 실시예에서, 면역조절제들, 표적화 모이어티들 및/또는 면역자극제들은 나노캐리어와 공유적으로 연관되지 않는다. 예를 들면, 나노캐리어들은 폴리머 매트릭스를 포함할 수 있으며, 면역조절제들, 표적화 모이어티들 및/또는 면역자극제들 등은 본 발명의 나노캐리어의 폴리머 매트릭스의 표면과 연관되고, 본 발명의 나노캐리어의 폴리머 매트릭스 내에 캡슐화되고/되거나 본 발명의 나노캐리어의 폴리머 매트릭스 전체에 걸쳐 분포된다. 면역조절제들은 확산, 상기 나노캐리어의 분해 및/또는 그 조합에 의하여 방출될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 나노캐리어의 폴리머(들)은 벌크 부식(bulk erosion)에 의하여 분해된다.
[00113] 일부 실시예에서, 면역특징 모이어티, 면역조절제들, 표적화 모이어티들 및/또는 면역자극제들은 입자와 공유적으로 연관된다. 일부 실시예에서, 공유 연관은 하나 이상의 링커들에 의하여 매개된다. 임의의 적당한 링커가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 링커는 쪼갤 수 있는 링커(예컨대, 에스테르 링크, 아미드 링크, 디설파이드 링크 등)이다.
[00114] 일부 실시예에서, 나노캐리어들은 자기 조립에 의하여 제조된다. 일례로, 지질류는 친유성(lipophilic) 면역조절제와 혼합되고 이후 고체 표면상에 박막으로 형성된다. 친수성 면역조절제는 수용액에 용해되어, 이는 상기 지질막에 첨가되어 지질류를 격렬히 교반하며 가수분해한다. 이중층 벽으로 혼입된 친유성 면역조절제들과 리포솜 내강 내의 면역조절제들을 갖는 리포솜들이 동시에 조립된다. 특정 실시예에서, 사전-제형된(pre-formulated) 폴리머 나노입자들은 작은 리포솜들과 천천히 교반되며 혼합되어 폴리머 나노입자 표면상으로 리포솜 융합을 유도한다.
[00115] 다른 예로서, 캡슐화되는 친수성 면역조절제는 휘발성의 물과 혼합될 수 있는 유기 용매에서 자연적으로 유도되고 비독성 양친매성 실재들과 혼합하여 역미셀들로 우선 혼입된다. 일부 실시예에서, 생분해성 폴리머는 역미셀 형성이 완료된 이후에 첨가된다. 이로 인해 생성된 생분해성 폴리머-역미셀 혼합물은 폴리머-불용성 친수성 비용매와 혼합되어 상기 용매의 상기 비용매로의 급속한 확산과 유기 용매의 증발에 의하여 나노입자들을 형성하게 된다.
[00116] 일부 실시예에서, 지질 단일층 안정화된 폴리머 나노캐리어들이 사용되어 하나 또는 복수의 면역조절제들을 전달한다. 특정 실시예에서, 친수성 면역조절 분자는 우선 지질의 극성 머리기(headgroup)와 화학적으로 접합된다. 접합체는 하나 이상의 물과 혼합될 수 있는 용매들을 함유하는 수용액에서 특정 비율의 접합되지 않은 지질 분자들과 혼합된다. 생분해성 폴리머 물질은 소수성 면역조절제들과 혼합되어 물과 혼합될 수 있거나 부분적으로 물과 혼합될 수 있는 유기 용매에서 캡슐화된다. 이로 인해 생성된 폴리머 용액은 접합된 지질 및 접합되지 않은 지질의 수용액에 첨가되어 유기 용액이 물로 급속히 확산되고 상기 유기 용액의 증발에 의하여 나노입자들을 수득하게 된다.
[00117] 본 명세서에 기술된 조성물들과 방법들은 다양한 감염성 질병, 질환 및/또는 이상의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 다른 질병들, 질환들 및/또는 상태들의 예들은 본 명세서의 다른 곳에 제공되어 있다. 일부 실시예에서, 본 발명에 따른 백신 나노캐리어들은 질병, 질환 및/또는 이상의 하나 이상의 증상들 또는 특징들을 치료, 완화, 개선, 경감, 이들의 발병 지연, 이들의 진행 억제, 이들의 중증도 감소 및/또는 이들의 발생을 감소시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어들은 미생물 감염(예컨대, 박테리아 감염, 진균 감염, 바이러스 감염, 기생균 감염 등)의 하나 이상의 증상들 또는 특징들을 치료, 완화, 개선, 경감, 이들의 발병 지연, 이들의 진행 억제, 이들의 중증도 감소 및/또는 이들의 발생을 감소시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 미생물 감염의 예방 및/또는 치료는 본 발명의 백신 나노캐리어들의 치료 유효량을 원하는 결과를 달성하는데 필요한 양과 시간 동안 이를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어의 "치료 유효량"은 질병, 질환 및/또는 이상의 하나 이상의 증상들 또는 특징들을 치료, 완화, 개선, 경감, 이들의 발병 지연, 이들의 진행 억제, 이들의 중증도 감소 및/또는 이들의 발생을 감소시키는데 유효한 본 명세서에 제공된 양이다.
[00118] 일부 실시예에서, 본 발명의 예방 및/또는 치료 프로토콜들은 면역 반응이 조절되도록(예컨대, T 세포 및/또는 B 세포에서 자극되도록) 피검자에게 본 발명의 하나 이상의 백신 나노캐리어들의 치료 유효량을 투여하는 단계를 수반한다.
[00119] 본 발명은 하나 이상의 백신 캐리어들의 치료 유효량 및 한 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제들을 포함하는 신규한 조성물들을 제공한다. 일부 실시예에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 본 발명의 백신 나노캐리어들을 포함하는 약학적 조성물들을 제공한다. 상기 조성물은 한 가지 유형을 초과하는 나노캐리어를 포함할 수 있는데, 각각의 유형은 상이한 구성분들(예컨대, 면역조절제들, 표적화제들, 면역자극제들, 부형제들 등)을 갖는다. 일부 실시예들에 따르면, 본 발명의 조성물들을 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 피검자(예컨대, 인간)에게 투여하는 방법이 제공된다.
[00120] 일부 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어 조성물의 치료 유효량은 질병, 질환 및/또는 이상의 진단 이전에, 진단과 동시에 및/또는 진단 이후에 환자 및/또는 동물에 전달된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어 조성물의 치료량이 질병, 질환 및/또는 이상의 증후근의 발병 이전에, 발병과 동시에 및/또는 발병 이후에 환자 및/또는 동물에 전달된다. 특정 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어 조성물의 치료량이 감염원에 노출되기 이전에 환자 및/또는 동물에 투여된다. 특정 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어 조성물의 치료량이 감염원에 노출된 이후에 환자 및/또는 동물에게 투여된다. 특정 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어 조성물의 치료량이 중독성 물질 또는 독소에 노출되기 이전에 환자 및/또는 동물에게 투여된다. 특정 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어 조성물의 치료량이 중독성 물질 또는 독소에 노출된 이후에 환자 및/또는 동물에게 투여된다.
[00121] 일부 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수내, 척수강내, 피하, 심실내(intraventricular), 경피성, 피내(interdermal), 직장, 질내, 복강내, 국소(분말, 연고, 크림 및/또는 적제에 의한 것과 같이), 경피성, 점막, 코, 볼, 경장(enteral), 설하(sublingual); 기관내 적하(intratracheal instillation), 기관지 적하(bronchial instillation) 및/또는 흡입(inhalation); 및/또는 경구 스프레이, 코 스프레이 및/또는 에어로졸을 포함하는 다양한 경로들에 의해 투여된다. 특정 실시예에서, 상기 조성물은 경구적으로 투여된다. 특정 실시예에서, 상기 조성물은 비경구적으로 투여된다. 특정 실시예에서, 상기 조성물은 근육내 주사를 통해 투여된다.
[00122] 특정 실시예에서, 질병, 질환 및/또는 이상(예컨대, 특정 미생물 감염)의 발병 및/또는 진행을 지연시키는 백신 나노캐리어들이 상기 질병, 질환 및/또는 이상의 증후근을 치료하는 하나 이상의 다른 치료제들과 병용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 백신 나노캐리어들은 항암제, 항염증제, 항생제 또는 항바이러스제의 사용과 병용될 수 있다.
[00123] 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 나노캐리어들을 함유하는 다양한 키트들을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 본 발명의 나노캐리어 및 사용 지침을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 복수의 상이한 나노캐리어들을 포함할 수 있다. 키트는 임의로 병용된 다른 복수의 성분들 또는 시약들의 어느 하나를 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 실시예에 따라, 키트는 예를 들면,(i) 적어도 하나의 면역조절제를 포함하는 나노캐리어로서, 상기 적어도 하나의 면역조절제는 T 세포 및/또는 B 세포 반응 양쪽 모두, 적어도 하나의 표적화 모이어티 및/또는 적어도 하나의 면역자극제를 자극할 수 있는 나노캐리어;(ii) 상기 나노캐리어를 이를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 지침을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 키트는 예를 들면,(i) 적어도 하나의 면역조절제로서, 상기 적어도 하나의 면역조절제는 T 세포 및/또는 B 세포 반응 양쪽 모두를 자극할 수 있는 면역조절제;(ii) 적어도 하나의 표적화 모이어티;(iii) 적어도 하나의 면역자극제;(iv) 폴리머 매트릭스 전구체;(v) 지질류 및 양친매성 실재들;(vi) 개별 성분들(i) 내지(v)로부터 본 발명의 백신 나노캐리어들을 제조하는 지침을 포함할 수 있다.
[00124] 일부 실시예에서, 상기 키트는 본 발명의 나노캐리어 및 혼합 지침을 포함한다. 일부 실시예에서, 그러한 키트들은 면역자극제 및/또는 항원도 포함한다. 그러한 키트들의 나노캐리어는 면역조절제(예컨대, 보편적 T 세포 항원과 같은 T 세포 항원) 및/또는 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 T 세포 항원 및/또는 상기 표적화 모이어티는 상기 나노캐리어의 표면상에 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 면역조절제 및 상기 항원은 동일하다. 일부 실시예에서, 이들은 상이하다.
[00125] 일부 실시예에서, 본 발명은(1) 적어도 하나의 표면을 갖는 합성 나노캐리어들로서, 상기 합성 나노캐리어들의 제 1 표면은 면역특징 표면을 포함하는 합성 나노캐리어들; 및(2) 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
[00126] 일부 실시예에서, 본 발명은(1) 적어도 하나의 표면을 갖는 합성 나노캐리어들로서, 상기 합성 나노캐리어들의 제 1 표면은 면역특징 표면을 포함하는 합성 나노캐리어들; 및(2) 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물의 적어도 하나의 용량을 피검자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
[00127] 일부 실시예에서, 본 발명은(1) 합성 나노캐리어로서,(a) 적어도 하나의 표면으로서, 상기 합성 나노캐리어의 제 1 표면은 면역특징 표면을 포함하는 적어도 하나의 표면; 및(b) 항원으로서, 상기 항원은(i) 상기 면역특징 표면;(ii) 상기 나노캐리어의 제 2 표면;상에 있거나(iii) 상기 나노캐리어의 중심 영역 내에 캡슐화되어 있는 항원을 포함하는 합성 나노캐리어; 및(2) 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
[00128] 일부 실시예에서, 본 발명은 피막하동 대식세포에 의한 항원 섭취의 증가방법을 제공한다. 상기 방법은(1) 합성 나노캐리어로서,(a) 적어도 하나의 표면으로서, 상기 합성 나노캐리어의 제 1 표면은 면역특징 표면을 포함하는 적어도 하나의 표면; 및(b) 항원으로서, 상기 항원은(i) 상기 면역특징 표면;(ii) 상기 나노캐리어의 제 2 표면;상에 있거나(iii) 상기 나노캐리어의 중심 영역 내에 캡슐화되어 있는 항원을 포함하는 합성 나노캐리어; 및(2) 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 단계를 포함한다.
[00129] 상기 발명의 일부 실시예에서, 면역특징 표면은 항원 제시 세포에 상기 면역특징 표면의 낮은 친화도 및 높은 친화력 결합을 제공하는데 효과적인 양으로 존재하는 복수의 모이어티들을 포함한다.
[00130] 아래에 더 상세히 논의되는 바와 같이, 본 명세서에 제시된 데이터는 본 명세서의 다른 곳에 정의된 바와 같은 면역특징 표면들을 포함하는 합성 나노캐리어들이 생성될 수 있다는 것의 증거를 제공한다. 합성 나노캐리어들을 피막하동 대식세포들(SCS-Mph) 및 수지상 세포들(DC)에 면역특징 표면-유도된 표적화시킨다는 증거는 마우스의 다리(footpad)에 형광 합성 나노캐리어들을 주입하고 이후 합성 나노캐리어 분포 및 배수 림프절에서 전문 항원 제시 세포들(APC)와의 연관을 분석하여 입증하였다. 예를 들면, 아래에 더 상세히 기술된 바와 같이, 도 27은 아민-변형된 합성 나노캐리어들이 카르복실레이트-변형된 합성 나노캐리어들보다 SCS-Mph에 더 효율적으로 표적된다는 것을 보여주고 있다. 따라서, 아민 변형은 면역특징 표면의 일 실시예를 창출한다. 도 38 및 40은 니코틴을 포함하는 면역특징 표면은 SCS-Mph와 DC에 표적화를 부여한다는 것을 보여주고 있다. SCS-Mph상에 향상된 합성 나노캐리어 축적을 매개하는 면역특징 표면들의 다른 예들이 도 41에 제공된다.
[00131] 아래에 기술된 바와 같이, 도 39는 니코틴 면역특징 표면이 낮은 친화도/높은 친화력 상호작용을 통해 APC와 상호작용한다는 것을 보여주고 있다. 마이크로역가(microtiter) 판은 니코틴(니코틴-PEG-PLA 사용) 또는 DC상에 특이적으로 발현된 당단백질인 CD11c에 높은 친화도 MAb를 사용하여 광범위한 농도로 표면 코팅되어 있었다. 패널 A는 상기 높은 친화도 MAb는 상기 마이크로역가 판에 첨가되어 있는 현탁된 DC를 효율적으로 결합하고 고정한다는 것을 보여주고 있다. 반면에, 니코틴 면역특징 표면 코팅된 판들은 코팅되지 않은 대조 표면들과 비교하여, 동일한 시험 조건하에서 효율적인 DC 결합을 매개하였던 MAb 밀도들보다 적어도 3 자리 크기 정도인 최대한도로 달성할 수 있는 니코틴 밀도(1015 분자/㎠)에서 조차 DC를 효율적으로 포획하지 않았다. 이는 채용된 시험 조건들에서, 니코틴 면역특징 표면의 마우스 DC에 대한 친화도가 너무 낮아서 판을 살며시 세척하는 동안에 DC 탈착을 저항할 수 있는 충분한 기계적 강도로 DC 결합을 허용할 수 없었다. 그럼에도, 본 명세서에 제시된 생체 내 표적화 결과들에 근거하여, 니코틴 면역특징 표면들은 니코틴 면역특징 표면과 합성 나노캐리어들의 탈착을 저항하는데 충분히 높은 친화력으로 APC와 결합할 수 있다고 결론짓는 것은 합당하다. 비록 다른 메커니즘들이 작동할 수 있지만, 상기 두 시험들 사이의 상이점은 상기 생체 내 시험을 진행하는 동안에 니코틴-APC 결합에 작용하는 힘들은 상기 생체 내 시험에서 판을 세척하는 동안에 DC가 경험하게 되는 힘들보다 훨씬 더 낮을 수 있다는 상황에 의하여 설명될 수 있다.
[00132] 도 36의 실험들은 니코틴을 포함하는 면역특징 표면과 같은 면역특징 표면을 포함하는 합성 나노캐리어들은 보조제들과 단백질계 항원들을 APC에 전달하여 강력한 T 보조 세포 활성화가 일어난다는 것을 더 보여주고 있다. 이는 R848과 OVA 항니코틴 IgG를 포함하는 PLA-PEG-니코틴 합성 나노캐리어들로 면역화하는 경우, 역가는 OT-II 세포를 받지 않았던 마우스들과 비교하여 나이브(naive) OT-II(즉, OVA-특이적) T 보조 세포를 받았던 마우스들에서 약 10 배 정도 향상되었다는 사실에 의해 입증된다. 이 효과는 상기 면역특징-변형된 합성 나노캐리어들 내에 함유된 보조제(R848) 및 T 세포 항원(OVA)는 T 세포들에 OVA를 제시하는 DC들에 효율적으로 표적되었다는 것을 나타내고 있다. OT-II 세포들을 받았던 동물들에게서 OVA-특이적인 T 세포들을 더 많이 이용할수록 보조 반응이 더 향상되어, 연이어서 B 세포들에 의하여 항니코틴 항체들의 생성을 증진시켰다. 따라서, 상기 기준에 따라 면역특징 표면을 형성할 수 있는 모이어티는 APC에의 그 결합 친화도가 너무 낮아서 생체 내 포획 시험에 의해 검출될 수 없을 때에도 합성 나노캐리어 면역원성을 증진시킬 수 있다.
[00133] 상술한 실시예들 중 어느 하나에 있어서, 접합된 이라는 단어는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 공유적으로 또는 비공유적으로 접합되는 것을 의미한다. 상술한 실시예들 중 어느 하나에 있어서, 캡슐화된 이라는 단어는 부가혼합에 의하여든, 중심을 둘러싸는 껍질에 의하여든, 공유 결합 등에 의하여든 상기 나노캐리어의 표면 내부 내에 물리적으로 트랩되는(trapped) 것을 의미한다.
[00134] 본 출원은 다양한 허여된 특허들, 공개된 특허 출원들, 저널 논문들 및 다른 발간물들을 가리키며, 이 모든 것들은 본 명세서에 참고로 포함되어 있다.
[00135] 도 1: 최적의 체액 및 세포질 면역 반응에 대한 결합된 백신 표적화 전략. 합성 백신은 B 세포 인식을 위한 표면 항원과 함께 DCs, FDC 및 SCS-Mph에 대한 내부 T 세포 항원, 보조제(미도시) 및 표적화 모이어티를 전달한다. 피하(s.c.) 또는 근육 내(i.m.) 주사 시, 물질은 배출 림프조를 통해 림프절에 도달하고, 각각의 APC에 축적된다(명료성을 위해, APC-특정 표적화 모이어티만이 도시되지만, 각각의 APC는 전체 복합체를 획득한다). DC는 그 복합체를 내면화하고 소화시키며, MHC 클래스 Ⅰ 및 클래스 Ⅱ 내의 항원 펩티드를 각각 CD8 및 CD4 T 세포에 제공한다. 활성화된 T 세포는 세포질 면역 반응을 중재하는 효과기/기억(TEg/Mem) 세포로 특화된다. TFH 세포는, 초기에 SCS-Mph 상의 항원에 의해 자극받고, 처리 시에는 TFH의 재자극을 위한 T 세포 항원을 회득하고 처리한 B 세포에 도움을 제공한다-TFH에 의해 제공되는 도움은 B 세포가 높은 친화력 항체를 증식시키고 생성하는 동안에 GC 반응의 개선을 허용한다.
[00136] 도 2: SCS-Mph는 림프-생성 바이러스 입자와 결합하고, 이들을 소포 B 세포에 제공한다.(A) 항-CD169로 스테이닝되고 소맥배아 응집소(wheat germ agglutinin)로 역스테이닝되는 마우스 슬와 림프절(mouse popliteal lymph node)의 코텍스의 면역 조직화학 스테이닝. 림프절은 적형광 소포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis: VSV)의 발바닥 주사 후 30분에 포획되었다. 배출 림프절의 피막하동에서, 적색 바이러스는 CD169+ 대식세포와 함께 배타적으로 공동 지역화되었다.(B) VSV 주사 후 30분에 피막하동(SCSf)의 바닥 아래의 림프절 대식세포(Mph) 및 소포성 B 세포(Bl)의 전자 현미경 사진은 표면에서 Mph의 파로리소좀(phagolysosome) 내에서 Mph와 B 세포 사이의 계면에서 VSV를 도시한다(화살촉).(C) 비처치 마우스(B6)의 발바닥 내로의 VSV 주사는 바이러스 특정 B 세포 상의 표면 발현 IgM의 신속한 하향조절, B 세포 활성화의 조짐을 가져온다. 클로드로네이트 리포솜(CLL)의 발바닥 주사의 공핍은 B 세포 활성화를 파괴하여, SCS-Mph가 B 세포에 미립자 항원을 제공하는 데 필수적이라는 것을 나타낸다.
[00137] 도 3: 피막에 통합된 친유성 면역조절제 및 리포솜 내에 캡슐화된 친수성 면역조절제를 갖는 예시적인 리포솜 나노캐리어.
[00138] 도 4: 피막 내에 통합된 친유성 면역조절제 및 리포솜 내에 캡슐화된 친수성 면역조절제를 갖는 예시적인 나노입자-안정화 리포솜 나노캐리어.
[00139] 도 5: 피막 내에 통합된 친유성 면역조절제 및 중합체 나노입자 내에 캡슐화된 소수성 면역조절제를 갖는 예시적인 리포솜-중합체 나노캐리어.
[00140] 도 6: 피막 내에 통합된 친유성 면역조절제 및 중합체 나노입자 내에 캡슐화된 소수성 면역조절제를 갖는 예시적인 나노입자 안정화 리포솜 중합체 나노캐리어.
[00141] 도 7: 피막 내에 통합된 친유성 면역조절제를 갖는 역미셀 및 그 역미셀(reverse micelles) 내에 캡슐화된 친수성 면역조절제를 포함하는 예시저인 리포솜 중합체 나노캐리어.
[00142] 도 8: 피막 내에 통합된 친유성 면역조절제 및 리포솜 내부에 캡슐화된 친수성 면역조절제를 갖는 역미셀을 포함하는 예시적인 나노입자 안정화 리포솜 중합체 나노캐리어.
[00143] 도 9: 지질단일층에 접합된 친수성 면역조절제 및 중합체 코어 내부에 캡슐화된 소수성 면역조절제를 갖는 예시적인 지질 안정화 중합체 나노캐리어.
[00144] 도 10: 지질단일층에 접합된 친수성 면역조절제 및 중합체 코어 내부에 캡슐화된 친수성 면역조절제를 갖는 역미셀을 포함하는 예시적인 지질 안정화 중합체 나노캐리어.
[00145] 도 11: SCS 대식세포에 의한 림프-생성 VSV의 포착.(A) 슬와 LN(수, 발바닥 주입 후의 분, 스케일 바, 100㎛)에서 VSV의 MP-IVM 현미경 사진.(B) 주입 후 3시간에 C57BL/6→Act(EGFP) 수용체에서의 VSV 축적(스케일 바: 50 ㎛).(C) 주입 후 5분에 LN에서 VSV의 전자 현미경 사진. 중앙 현미경사진은 개략적으로(좌측) 및 보다 높은 배율로(우측) 나타내어진다. 화살촉은 VSV 입자를 식별한다(스케일 바: 2 ㎛).(D) VSV-배출 LN(30분)의 공초점 현미경사진. 스케일 바: 100 ㎛(좌측), 15 ㎛(우측).(E) 야생의 C3-불충분하거나 CLL-공핍 마우스 내로의 주입 후 2시간에 슬와 LN에서의 VSV 타이터. ***: p <0.001(쌍방향 아노바(ANOVA), 본페로니의 사후 테스트(Bonferroni's post-test)). 화살촉은 VSV 입자를 식별한다(스케일 바: 2 ㎛).(F) DH-LMP2a 마우스에서의 VSV 포착. *: p <0.05(짝이 없는 t-테스트).(G) 비처치 및 CLL-처치된(2개의 유사한 실험 중 하나; n=3) 마우스에서 발바닥 주입 후의 VSV 타이터. ProxLN: 서혜부, 대동맥방(paraaortic) LN; 브랜치LN; 상박 LN.(H) TD 삽관 후 림프, 비장 및 혈액에서의 바이러스 타이터. *: p <0.05(짝이 없는 t-테스트).(E-H)에서 수평방향 바는 평균을 나타낸다.
[00146] 도 12: 주변 LN에서 CD169+의 특성화.(A-C) 나이브 C57BL/6 마우스의 LN으로부터 풀링(pool)된 단핵 세포의 리니지 마커 발현 분석.(A) CD169+ 준거(population) 상에서 게이트를 제어한 후(중앙 패널), 세포는 2개의 대식세포-연관 표면 마커, I-Ab(MHC 클래스 Ⅱ) 및 CD11b(바닥 패널)에 대해 분석되었다. 항-CD169에 대한 동기준표본(isotype) 제어를 이용한 스테이닝은 패널의 상측에 도시되어 있다.(B) CD169+ⅠAb+CD11b+ 세포는 CD68, F4/80, CD11c, 및 Gr-1의 발현에 대해 더 분석되었다. 게이트는 마커가 통상적인 CD11chigh 수지상 세포(중첩)를 식별하도록 배치된 CD11c 스테이닝을 제외하면 마커+ 세포를 식별하도록 유도되었다. 수는 히스토그램 게이트 하에서 CD169+ⅠAb+CD11b+ 세포의 퍼센트를 나타낸다. 데이터는 유사한 결과를 갖는 3-5 실험을 대표한다.(C) 패널(B)에서의 데이터의 정성 분석, 에러 바는 SEM을 나타낸다.(D-G) CD169+ 세포 상에서의 선택된 마커의 공동 발현을 보여 주는 나이브 C57BL/6 마우스로부터의 슬와 LN의 공초점 현미경사진(화살촉). 스케일 바: 좌측 컬럼에서 125㎛이고 그 밖의 모든 컬럼에서 20 ㎛.
[00147] 도 13: CLL 처치 다음의 슬와 NL에서의 형태학적 변화.(A) 슬와 LN(상측 3개의 행)과, 비처치된 제어 마우스(-CLL, 좌측 컬럼) 및 6-10일 더 일찍 CLL 발바닥 주입을 받은 동물의 비장(하부 행)의 공초점 현미경 사진. 비장에서가 아니라 LN(상측 행)에서의 CLL 처치 공핍된 CD169+; Lyve-1 수질 림프액 내피 세포(제 2 행) 및 피질 CD11chigh 수지상 세포(제 3 행)는 영향받지 않았다.(B) CLL 처치가 있는 경우 및 없는 경우의 슬와 LN에서 세포질 서브세트 빈도, 데이터는 n=3 마우스로부터의 것이며, 평균±SEM으로서 도시되고; *: p <0.05, **: p <0.01이며, 짝이 없는 연구자의 t-테스트.(C) 50μl CLL의 발바닥 주입 후 6-10일에 슬와 NL에서의 상이한 I-Ab+CD11b+ 백혈구 서브세트의 빈도. 각각의 심볼은 하나의 마우스로부터의 풀링된 슬와 LN을 나타낸다. 슬와 LN에서의 총 단핵 세포 중의 서브세트 빈도는 도 12a에 도시된 바와 같이 I-Ab+CD11b+ 세포 상에서 게이팅한 후에 유세포 분석에 의해 검정되었다.(D) 처치가 없는(-CLL) 또는 CLL(+CLL)의 발바닥 주입 후 7일에 슬와 NL의 면역 조직 화학(immunohistochemical) 분석. 스케일 바: 300㎜.(E) CLL 처치 후 7일 및 20㎍의 발바닥 주입 후 5분의 대표적인 슬와 LN에서 SCS의 초미세구조. SCS 대식 세포 및 바이러스 입자의 완전한 부제를 주목하라. 스케일 바: 2 ㎛.
[00148] 도 14: 슬와 LN에서의 형광성 바이러스 및 라텍스 나노입자의 체류.(A) 알렉사-568-라벨링된 아데노바이러스(AdV)의 발바닥 주입후 30분의 슬와 LN의 공초점 현미경사진. 동결 절편은 FITC-α-CD169 및 Alexa-647-α-B220로 스테이닝되어 B 세포를 식별한다. 스케일 바: 100 ㎛(좌측) 및 15 ㎛(우측).(B) SCS 대식세포에 의해 포착된 AdV 입자의 전송 전자 현미경사진. 상측 패널은 낮은 배율의 개요(중간 패널)의 주석이 달린 개략도를 도시하고 있다. 중앙 패널의 박스 영역은 아래쪽의 패널에서 확장되고, 화살쪽은 전자밀도, 구체 AdV 입자를 나타낸다. 스케일 바: 2 ㎛(상측 및 중간 패널) 및 1 ㎛(하측 패널).(C-D) 20 ㎍ Alexa-568 라벨링된 UV-비활성화된 AdV(C) 또는 VV(D)의 발바닥 주입 후 30분의 C57BL/6 마우스로부터의 슬와 LN의 공초점 현미경사진. FITC-α-B220 스테이닝에 의해 식별된 B 소포보다 위의 피질 SCS에 또한 바이러스가 CD169 대식세포에 의해 결합된 대신에 LYVE-1에 의해 결합되지 않는 수질에서도 축적되는 형광성 바이러스. 스케일바는 125 ㎛(좌측 패널) 및 25 ㎛(우측 패널)을 나타낸다.(E) Alexa-568 라벨링된 VSV 및 대략 1011 크림손 플루오스피어(Fluosphere)(200 nm 직경)의 숨겨진 발바닥 주입 후 30분에 슬와 LN의 공초점 현미경 사진. 동결 LN 파편은 FITC-α-CD169로 대비-스테이닝되었다. VSV와 같은 라텍스 비드는 배출 LN에서 불량하게 유지되었다는 것을 주목하라. 스케일 바: 125 ㎛.
[00149] 도 15: 배출 LN에서 VSV 분포에 대한 CLL 발바닥 주입의 효과. 공초점 현미경사진은 슬와 LN에서(A) CLL 처치없이 또는(B) CLL 처치 후 7일에 형광성 VSV 입자의 부위를 보여 주고 있다. B 소포는 FITC-α-B220 스테이닝에 의해 식별되었다. 수질(박스 영역)에서, VSV는 CLL 처치에 의해 영향받지 않은 LYVE-1+ 세포에 의해 결합되었다. 스케일 바: 125 ㎛(좌측 종렬) 및 25 ㎛(우측 종렬).
[00150] 도 16: SCS 대식세포는 소포 B 림프구에 림프-유도 AdV를 제공한다.(A) 슬와 LN에서 B 소포 위의 SCS에서 CD169 대식세포의 공초점 현미경 사진. 동결 절편(frozen sections)은 소맥배아 응집소(wheat germ agglutinin: WGA)로 대비-스테이닝되어 세포외 기질을 식별하고, α-B220으로 대비-스테이닝되어 B 세포를 검출한다. 일부 B 세포는 SCS에 상주하고, 하나의 B 세포는 소포와 SCS 사이에서 이동하는 것으로 보인다(화살촉). 스케일 바: 25 ㎛. AdV의 발바닥 주입 후 30분의 슬와 LN에서의 SCS 대식세포 및 주변 셀에 대한(B) 전자 현미경사진 및(C) 개략도.(C)에 도시된 박스는 패널(D) 및(E)에 도시된 보다 높은 배율의 영역을 나타낸다. 이러한 패널은 SCS 대식세포와 B 세포 사이의 계면에 있는 AdV 입자의 두 가지 예시를 보여준다(화살촉). 별표는 다른 대식세포-연관 AdV 입자를 표기한다. 스케일 바: 500 nm.
[00151] 도 17: SCS 바닥부 도처에 걸친 림프-생성 VSV의 대식세포-중재 전달은 바이러스-특정 B 세포 행동을 변경한다.(A) VSV 주입 후 30분의 슬와 NL의 SCS 바닥을 통과하는 대식세포를 보여 주는 전자 현미경 사진 및 개략도(중간). 스케일 바: 10 ㎛(좌측) 및 2 ㎛(우측). 화살표: 소화된 VSV를 갖는 액포. 화살촉: 대식세포와 B 세포 사이의 접촉 영역에 있는 비리온.(B) 슬와 LN의 다중클론성 및 VI10YEN B 세포의 MP-IVM. 스케일 바: 50 ㎛.(C) VSV 주입 뒤의 VI10YEN B 세포/제어 B 세포의 영역 비율. 결과는 3 이동/그룹으로부터의 것이다.(D, E) SCS에 대해 상대적인 슬와 LN에서의 VI10YEN B 세포의 지역화(localization). **: p < 0.01(본페로니의 효과 측정 테스트를 갖는 단방향 ANOVA).
[00152] 도 18: VSV 혈청형 및 VSV-IND-특정 VI10YEN B 세포의 특성.(A) 정제된 VSV 용해물의 SDS-PAGE 겔(12%). 상측: VSV-IND 및 VSV-NJ. N 및 P 단백질은VSV-NJ에서 공동-이동하며, 근사한 분자량이 괄호 안에 표시된다.(B) B 셀로의 Alexa-488 라벨링된 VSV-IND(중간 행) 또는 VSV-NJ(하측 행)의 C57BL/6 마우스(좌측 종렬) 또는 VI10YEN 마우스(우측 종렬)로부터의 결합. 상측 행은 VI10YEN BCR에 대한 항유전형 항체 35.61을 갖는 제어 스테이닝을 보여준다(Dang and Rock, 1991, J.Immuno., 146:3273).(C) VI10YEN 마우스(상측 행) 또는 C57BL/6 마우스(하측 행)로부터의 CD43neg 정제된 플루-LOJO 로딩 B 셀에서의 세포내 칼슘 플럭스. 이벤트는 시간에 따라 꾸준히 수집되었고, 별표는 항체 또는 바이러스가 추가되었을 때의 시점을 나타낸다. 바이러스 입자는 100/B 세포에서 사용되었고, 항-IgM-(Fab)2는 10 ㎍/106 세포에서 사용되었다.(D) 10 ㎍ UV-VSV 또는 UV-VSV-AlexaFluor-488-IND의 발바닥 주입에 의한 면역 조치 이후 4 및 10일에서 C57BL/6 마우스의 총 Ig 및 IgG에 대한 중화 검정법.(E) VSV 스톡으로부터의 상청액에 노출된 VI10YEN B 세포에서의 칼슘 플럭스. 상청액은 대략 바이러스 역가에서 10,000겹의 감소를 가져오는 슈크로스 쿠션을 통해 초원심분리에 의해 생성되었으며, 희석되지 않은(상측의 우측) 또는 1:100 희석되어(하측의 우측) B 세포 상에서 사용되었다. 제어로, VSV 스톡 용액은 동등한 바이러스 역가(MOI; 좌측 패널)로 희석되었다. 그 결과는 우리의 바리어스 준비물에서 바이러스 입자와 연관되지 않은 항원 VSV-G의 존재를 입증한다.
[0153] 도 19: ICAM-1 및 VCAM-1로의 VI110YEN B 세포의 VSV-유도 고착.(A, B) 재조합 ICAM-1-Fc(A) 또는 VCAM-1-Fc(B)의 표시 농도로 코팅된 플라스틱 플레이트로의 정제된 나이브 및 VSV-IND 활성화된(30분 노출) VI10YEN B 세포의 고착.(B) 2회의 3중 실험에 대한 풀링된 데이터가 보인다. 수평방향 바는 평균을 나타낸다.(C, D) C57BL/6 마우스의 슬와 LN에서 ICAM-1 및 VCAM-1 발현의 공초점 현미경 사진. 스케일 바: 50 ㎛.(E) UV-비활성화된 VSV-IND의 표시된 pfu-등가 농도로 코팅된 플라스틱 디쉬로의 정확된 나이브 야생형 및 VI10YEN B 세포의 고착. 데이터는 평균 ± 3개의 SEM을 나타낸다.
[0154] 도 20: SCS 대식세포는 LN에서 VSV-특정 B 세포의 조기 활성호를 위해 요구된다.(A) 공초점 현미경사진은 깊은 소포(별표)가 아니라 SCS(화살촉)에서 VI10YENxMHCII(EGFP) B 세포내의 VSV-IND(주입 후 30분)와의 MHC-II 공동 지역화를 나타낸다. 스케일 바: 25 ㎛.(B) VSV-연과 및 VSV-자유 VI10YENxMHCII(EGFP) B 세포에서 SCS까지의 거리. 수평방향 라인: 중간값. VSV-IND 발바닥 주입 후(C) VI10YEN에 대한 BCR 표현 동역학 및(D) 다중클론성 B 세포.(E) VSV-IND 주입(20 ㎍) 후 CLL-처치 또는 비처치된 슬와 LN에서 VI10YEN 세포에 대한 BCR 표현. 평균 형광성 밀도는 바이러스 자유 수치(점선)으로 표준화되었다.(G) VSV-IND 주입(0.4 ㎍) 후 6시간에 CLL-처치된 슬와 LN. 스케일 바: 125 ㎛.(H) 표시된 투여량으로 VSV-IND 주입 후 6시간에 T/B 보더에서 및 소포에서의 VI10YEN B 세포 빈도. 평균±SEM(3-5 마우스). 평균±SEM; n=3-4 소포/2마우스; *: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p <0.001(t-테스트).
[00155] 도 21: 바이러스 주입 후 배출 LN에서의 VI10YEN B 세포 운동성. VSV 발바닥 주입 후 약 5-35분에 깊은 소포 및 SCS/피상적 소포에서 야생형(삼각형) 및 VI10YEN B 세포(원형)의 중간 3D 순간속도. 수평방향 바는 평균을 나타내고, *: p < 0.05; **: p < 0.01(본페리의 사후 테스트를 갖는 단방향 ANOVA). 특정 B 세포는 준비 시에 자유 VSV-G의 결과로서 전체 소포 전반에서 느려진다는 것을 주목하라(도 18 참조). 제어 실험은 CLL-처치된 및 비처치된 popLN에서의 유사한 B 세포 운동성을 보여 주었다.
[00156] 도 22: VSV-IND의 주입 후에 바이러스-배출 및 비배출 LN 내의 VI10YEN B 세포 상에서의 활성화 마커 유도의 생육 곡선. VI10YEN B 세포는 형광성으로 CMTMR로 태그되었으며, 20 ㎍ UV-비활성화된 VSV-IND(시간 0시간)로 18시간 후에 주입된 나이브 마우스에 전달되었다. 배출 슬와 LN(popLN) 및 말단 상박 LN(brachLN)은 표시 시간 간격 후에 수확되어 산일 세포 현상액을 생성하였다. B 세포 상에서의 CD69 및 CD86 발현은(A) B220+ CMTMR+ VI10YEN 세포 또는(B) B220+ CMTMR- 내생적 제어 B 세포 상에서 게이팅 후의 유세포 분석에 의해 검정되었다.
[00157] 도 23:(우측 종렬에서) CMTMR-라벨링된 VI10YEN B 세포와 CMAC-라벨링된 다중클론성 B 세포의 혼합물의 양자 전달을 수신한 마우스의 슬와 NL의 공초점 현미경사진(좌측 및 중간 종렬) 및 MP-IVM 현미경사진(우측 종렬). 다음날,20 ㎍ UV-비활성화된 VSV-IND가 발바닥에 주입되었고, 배출 슬와 LN이 외과적으로 MP-IVM에 대해 마련되거나 표시된 시점에서 동결 파편의 공초점 분석에 대해 수확되었다. MP-IVM 이미지는 VSV-특정이지만 다중클론성인 B 세포가 바이러스 주입 후 30분정도 일찍 SCS에서 VSV와 접촉한다는 것을 보여준다. VI10YEN B 세포는 주입 후 6시간에 T/B 보더에 위지를 다시 정하였다. 스케일 바: 좌측 종렬에서 150 ㎛, 그 밖의 종렬에서 25 ㎛.
[00158] 도 24: 인간 IgG로부터 Fc 파편을 사용하는 SCS0Mph의 세포 내 표적화.(A) 좌측의 FACS 히스토그램은 형광성 PEG-PLGA 나노입자(-10nm 직경)와 림프절 대식세포의 결합을 상세히 기록한다.(B) Fc-나노입자(NP)는 SCS-Mph 및 소포 수지상 세포를 표적화한다.
[0159] 도 25: 수질내 대식세포에서가 아니라 림프절 피막하동(SCS)에서 대식세포 상에서의 화학운동성 수용체 CX3 CR1(프락토카인 수용체)의 식별. 우측의 대식세포는 녹색 형광성 단백질(RFP)이 CX3CR1에서 발현되는 반면 적색 형광성 단백질(RFP)이 다른 화학운동성 수용체 CCR2의 발현을 보고하는 이중-노크인(double-knockin) 마우스로부터의 림프절의 3D 투영이다. SCS-Mph는 그들의 현저한 녹색 형광성에 의해 용이하게 식별가능한 반면, 수질 대식세포는 주로 RFP를 발현한다.
[0160] 도 26: SCS-Mph는 화학운동성 수용체 CS3CR1을 발현한다. 그래프는 유전적으로 CX3CR1 로커스로부터의 GFP를 발현하도록 가공된 노크인 마우스의 림프절로부터의 단일 세포 현탁액의 FACS 플롯을 나타낸다. SCS-Mph는 SCS 내의 대식세포와 결합하지만 수질과는 그러하지 않는 가용성 수용체 CRFc로 스테이닝함으로써 식별된다. CRFc 네가티브 CX3CR1-발현(즉, GFP-high) 세포는 이 화학운동성 수용체를 발현시키는 통상적인 수지상 세포이다.
[00161] 도 27: 아민(좌측 및 중간 패널) 또는 카복시 모이어티(우측 패널)로 변형된 0.2 ㎛ 직경의 라텍스 비드 표면의 발바닥 주입 후 24시간의 마우스 슬와 림프절로부터의 동결 절편의 형광성 현미경사진. 양쪽 비드 세트는 Invitrogen사로부터 구매되었다(카탈로그 번호 F8763, F8805). 좌측 및 우측 절편은 항-CD169로 대조-스테이닝되었다. 이미지는 수질(항-CD169로 약한 확산 스테이닝)이 우측에 면하고 피막하동(SCS) 영역(밝은 항-CD169)이 좌측에 면하도록 방향이 정해진다. 적색 아미 변형 입자는 SCS에 두드러지게 집중하고, 청색 카복시 변형 비드는 주로 수질에서 유지된다는 것에 주목하라.
[00162] 도 28:(A) 항원-생성 표적화된 나노입자는 대단히 면역성이 있고, 높은 항체 가역을 유도한다.(B) 나노입자 백신에 의해 도출되는 유도된 면역 반응은 치사량의 VSV로부터 강력한 방어성을 제공한다.
[00163] 도 29: 면역 조절 나노입자에 의한 생체 내 T 세포 활성화.(A) CD4 세포 활성화에 대한 NP의 효과.(B) CpG 보조제(TLR9 효현제)과 혼합되는 CD8 T 세포 반응에 대한 NP의 효과.(C) CD8 T 세포 활성화에 대한 공동-캡슐화된 보조에의 효과.
[00164] 도 30: 예시적인 R848 접한 전략을 도시한다.
[00165] 도 31: 방출 프로파일 데이터를 도시한다. 나노입자에서 캡슐화된 R848을 포함하는 제조물로부터 시간에 따른 R848의 퍼센트 방출.
[00166] 도 32: 방출 프로파일 데이터를 도시한다. 나노입자에서 캡슐화된 SIINFEKL을 포함하는 제조물로부터 시간에 따른 SIINFEKL의 퍼센트 방출.
[00167] 도 33: 마우스가 여러 제조물 중 하나를 투여받은 후 마우스 림프절(LN)에서 측정된 OT-I 세포 수를 도시한다.
[00168] 도 34a: 다양한 자유 보조제로 인큐베이트된 수지성 세포의 표면 상에서 CD40, CD80 및 CD86의 발현 증가를 도시한다.
[00169] 도 34b: 그러한 세포들이 나노입자가 있거나 없는 다양한 조성물로 인큐베이트된 후에 수지상 세포에서 CD86에 대한 평균 형광성 세기(mean fluorescence intensity: MFI)를 도시한다.
[00170] 도 34c: 다양한 나노 조성물로 비교된 수지상 세포의 표면 상의 CD40, CD80 및 CD86의 발현 증가 및 리포다당류(LPS)로 인큐베이트된 CD와의 비교를 도시한다.
[00171] 도 35: T 세포 증식률을 도시하는 FACS 데이터를 나타낸다.
[00172] 도 36: 마우스가 다양한 조성물을 투여받은 후 23주까지의 마우스 항-니코틴 IgG 역가 및 농도를 도시한다.
[00173] 도 37: 마우스가 다양한 조성물을 투여받은 후 21일까지의 마우스 항-니코틴 IgG 역가 및 농도를 도시한다.
[00174] 도 38a: 제어 나노입자에 대하여, 마우스 발바닥 내로의 주입 후 4시간에 SCS에서 니코틴-변형 나노입자의 상대적인 축적률을 도시한다.
[00175] 도 38b: 제어 나노입자에 대하여, 마우스 발바닥 내로의 주입 후 24시간에 니코틴-변형 나노입자의 DC를 갖는 상대적인 공동-지역화를 도시한다.
[00176] 도 39a: 고정된 항-CD11c 항체를 갖는 표면으로의 생체 내 DC의 고착을 도시한다.
[00177] 도 39b: 고정된 니코틴을 갖는 표면으로의 생체 내 DC의 고착을 도시한다.
[00178] 도 40(a)-(b): 마우스 발바닥 내로의 주입 후 SCS에서 제어 나노입자와 비교되는 니코틴-변형 나노입자의 축적을 도시한다.
[00179] 도 41(a)-(d): 마우스 패드 내로의 나노입자 주입 후 슬와 림프절의 SCS 및 수질 영역에서 GM3-변형 나노입자의 축적을 도시한다.
[00180] 정의
[00181] 남용 물질(abused substance): 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "남용 물질"이라는 용어는 그것이 지시되는 것과는 다른 목적 또는 의사에 의해 지시된 것과는 다른 방법이나 분량으로 피검자(예컨대, 인간)에 의해 취해지는 임의의 물질이다. 일부 실시예에서, 남용 물질은 불법 약물과 같은 약물이다. 특정 실시예에서, 남용 물질은 일반의약품(over-the-counter drug)이다. 일부 실시예에서, 남용 물질은 처방의약품(prescription drug)이다. 남용 물질은, 일부 실시예에서, 중독성 약물이다. 일부 실시예에서, 남용 물질은 기분에 영향을 주는 효과(mood-altering effects)를 가지며, 그에 따라 흡입제(inhalants) 및 용매를 포함한다. 다른 실시예에서, 남용 물질은 기분에 영향을 주는 효과나 중독 특성을 갖지 않는 것이며, 그에 따라 단백 동화 스테로이드(anabolic steroid)를 포함한다. 남용 물질은, 카나비노이드(예컨대, 해시시, 마리화나), 진정제(depressant)(예컨대, 바르비투르산염, 벤조디아제핀, 플루니트라제팜(로피놀), GHB, 메타콸론(퀘일루드)), 해리성 마취제(dissociative anesthetics)(예컨대, 케타민, PCP), 환각제(예컨대, LSD, 메스칼린, 사일로사이빈), 아편유사제 및 모르핀 유도체(morphine derivatives)(예컨대, 코데인, 펜타닐, 헤로인, 모르핀, 아편), 흥분제(암페타민, 코카인, 엑스터시(MDMA), 메탐페타민, 메틸페니데이트(리탈린)), 단백 동화 스테로이드, 및 흡입제를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, 나노캐리어에 포함시키기 위한 남용 물질은 완전 분자 또는 그것의 일부분이다.
[00182] 중독성 물질: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "중독성 물질"이라는 용어는 강박관념, 강박행동 또는 신체적 의존성 또는 정신적 의존성을 야기하는 물질이다. 일부 실시예에서, 중독성 물질은 불법 약물이다. 다른 실시예에서, 중독성 물질은 일반의약품이다. 또 다른 실시예에서, 중독 물질은 처방의약품이다. 중독성 물질은 코카인, 헤로인, 마리화나 및 메탐페타민을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, 나노캐리어에 포함시키기 위한 중독성 물질은 완전 분자 또는 그것의 일부분이다.
[0183] 투여 또는 투약:(1) 본 발명의 조성물과 같은 약리적 활성 물질을 약리적으로 유용한 방법으로 피검자에게 투약하거나(2) 그러한 물질이 약리적으로 유용한 방법으로 피검자에게 투약될 것을 지시하거나(3) 그러한 물질을 약리적으로 유용한 방법으로 피검자에게 자가-투약할 것을 지시하는 것.
[00184] 아미노산: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 가장 넓은 관점에서의 "아미노산"이라는 용어는 폴리펩티드 사슬에 통합될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 실시예에서, 아미노산은 일반적인 구조 H2N-C(H)(R)-COOH를 갖는다. 일부 실시예에서, 아미노산은 자연 발생 아미노산이다. 일부 실시예에서 아미노산은 합성 아미노산이고, 일부 실시예에서 아미노산은 D-아미노산이며, 일부 실시예에서 아미노산은 L-아미노산이다. "표준 아미노산(standard amino acid)" 또는 "천연 아미노산(natural amino acid)"은 자연 발생 펩티드에서 일반적으로 발견되는 20개의 표준 아미노산 중 임의의 것을 지칭한다. "특수 아미노산(non-standard amino acid)"은 그것이 합성으로 마련되는지 자연적 발생원으로부터 얻어지는지와는 무관하게 표준 아미노산을 제외한 임의의 아미노산을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "특수 아미노산"은 소금,(아미드와 같은) 아미노산 유도체 및/또는 치환체를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 화학적으로 생성되거나 변경된 아미노산을 포함한다. 펩티드에 카르복시- 및/또는 아미노-말단 아미노산을 포함하는 아미노산은 메틸화, 아미드화, 아세틸화, 및/또는 펩티드의 활성화에 악영향을 미치는 일 없이 펩티드의 순환 반감기를 변경할 수 있는 기타 화학 그룹과의 치환에 의해 변경될 수 있다. 아미노산은 이황화 결합에 참여할 수 있다. "아미노산"이라는 용어는 "아미노산 잔기(amino acid residue)"와 상호 교환가능하게 사용되며, 자유 아미노산 및/또는 펩티드의 아미노산 잔기를 지칭할 수 있다. 자유 아미노산을 지칭하는지 펩티드의 잔기의 지칭하는지는 그 용어가 사용되는 문맥으로부터 명백할 것이다.
[00185] 동물: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "동물"이라는 용어는 동물계의 임의의 멤버를 지칭한다. 일부 실시예에서, "동물"은 임의의 진화 단계에 있는 인간을 지칭한다. 일부 실시예에서, "동물"은 임의의 진화 단계에 있는 인간 외의 동물을 지칭한다. 특정 실시예에서, 인간 외의 동물은 포유류(예컨대, 설치류, 쥐, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류, 및/또는 돼지)이다. 일부 실시예에서, 동물은 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 및/또는 벌레를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, 동물은 유전자 도입 동물(transgenic animal), 유전자변형 동물(genetically-engineered animal), 및/또는 복제생물일 수 있다.
[00186] 항체: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항체"라는 용어는 천연적으로 생성되든 전체적으로 합성에 의해 생성되든 부분적으로 합성에 의해 생성되든 임의의 면역글로블린(immunoglobulin)을 지칭한다. 특이적 결합 능력을 유지하는 그것의 모든 유도체도 그 용어에 포함된다. 그 용어는 또한 면역글로블린 도메인에 상동이거나 대체로 상동인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. 이러한 단백질은 자연적 발생원으로부터 유도될 수도 있고, 또는 부분적으로나 전체적으로 합성에 의해 생성될 수도 있다. 항체는 단일 클론 항체(monoclonal)일 수도 있고 또는 다클론성 항체(polyclonal)일 수도 있다. 항체는 인간 클래스 중 임의의 것을 포함하는 임의의 면역글로블린 클래스의 멤버, 즉 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항체 단편(antibody fragment)" 또는 "항체의 특성 부분"이라는 용어는 상호 교환가능하게 사용되며, 전장(full-length) 미만의 항체의 임의의 유도체를 지칭한다. 항체 단편은 전장 항체(full-length antibody)의 특이적 결합 능력 중 적어도 상당한 부분을 계속 유지할 수 있다. 그러한 항체 단편의 예들은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dsFv 디아바디(diabody), 및 Fd 단편을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 항체 단편은 또한 Fc 단편을 포함한다. 항체 단편은 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 손상되지 않은 항체(intact antibody)의 단편화에 의해 효소로 또는 화학적으로 생성될 수 있으며, 및/또는 부분 항체 시퀀스를 인코딩하는 유전자로부터 재조합으로 생성될 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 항체 단편은 전체적으로 또는 부분적으로 합성에 의해 생성될 수 있다. 항체 단편은 선택적으로 단일 사슬 항체 단편을 포함할 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 항체 단편은, 예를 들어 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 다중 사슬을 포함할 수 있다. 항체 단편은 선택적으로 다분자 복합체(multimolecular complex)를 포함할 수 있다. 기능적 항체 단편은 일반적으로 적어도 대략 50개의 아미노산을 포함할 것이며, 더욱 일반적으로는 적어도 대략 200개의 아미노산을 포함할 것이다.
[00187] 대략: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 수와 관련하여 "대략" 또는 "약"이라는 용어는 달리 지시되거나 문맥으로부터 달리 명백한 것이 아니면(그러한 수가 가능한 수치의 0%보다 크거나 100%를 초과하는 경우를 제외하고) 수의(더 크거나 더 작은) 어느 방향에서든 전반적으로 5%, 10%, 15%, 또는 20%의 범위 내에 있는 수를 포함하는 것으로 일반적으로 간주된다.
[00188] 연관된(associated): 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "연관된"이라는 용어는 직접적이거나 간접적인 공유 상호작용(covalent interaction) 또는 비공유 상호작용(non-covalent interaction)에 의해 연관되는 2개 이상의 실재(entities)의 상태를 지칭한다. 일부 실시예에서, 연관은 공유이다. 일부 실시예에서, 공유 결합은 링커 모이어티(linker moiety)에 의해 매개된다. 일부 실시예에서, 결합은 비공유(예컨대, 전하 상호작용, 친화력 상호작용, 금속 배위결합(metal coordination), 물리적 흡착(physical adsorption), 호스트-게스트 상호작용(host-guest interactions), 소수성 상호작용(hydrophobic interactions), TT 스택킹 상호작용(TT stacking interactions), 수소 결합 상호작용, 반데르 발스(van der Waals) 상호작용, 자기적 상호작용, 정전 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용 등)이다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 실재(예컨대, 면역조절제(immunomodulatory agent), 표적화 모이어티(targeting moiety), 면역자극제(immunostimulatory agent), 나노입자 등)는 백신 나노캐리어와 공유로 결합될 수 있다. 일부 실시예에서, 실재(예컨대, 면역조절제, 표적기, 면역자극제, 나노입자 등)는 백신 나노캐리어와 비공유로 결합될 수 있다. 예를 들어, 실재는 본 발명의 백신 나노캐리어의 지질이중층(lipid bilayer), 지질단일층(lipid monolayer), 폴리머 매트릭스(polymeric matrix) 등의 표면과 결합될 수도 있고, 그들 내에 캡슐화될 수도 있으며, 그들에 의해 둘러싸일 수도 있고, 및/또는 그들 전반에 분포될 수도 있다. 실재가 자유(즉, 비접합) 형태의 특정 명칭으로 언급될 수 있는 경우, 특정한 언급이 없다면, 실재는 또한 그 실재가 제 2 실재에 접합될 때에도 동일한 이름으로 지칭될 수 있다는 것을 알 것이다.
[00189] 생체적합성(Biocompatible): 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "생체적합성"이라는 용어는 세포에 유독하지 않은 물질을 지칭한다. 일부 실시예에서, 물질은 생체 내에서 세포에 그것을 추가하는 것이 생체 내에 염증(inflammation) 및/또는 기타의 악영향을 유도하지 않는다면 "생체적합성"인 것으로 여겨진다. 일부 실시예에서, 물질은 생체 내에서 또는 생체 밖에서 세포에 그것을 추가하여 약 50% 이하, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 또는 약 5% 이하의 세포사를 가져온다면 "생체 적합성"인 것으로 여겨진다.
[00190] 생분해성: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "생분해성"이라는 용어는 생리학적 상태(physiological conditions) 하에서 퇴화될 수 있는 물질을 지칭한다. 일부 실시예에서, 생분해성 물질은 세포질 조직(cellular machinery)에 의해 분해되는 물질이다. 일부 실시예에서, 생분해성 물질은 화학적 프로세스에 의해 분해되는 물질이다.
[00191] B 세포 항원: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "B 세포 항원"이라는 용어는 B 세포에서 인지되어 면역 반응을 트리거하는(trigger) 임의의 항원을 지칭한다. 일부 실시예에서, B 세포 항원인 항원은 T 세포 항원이기도 하다. 특정 실시예에서, B 세포 항원은 또한 T 세포 항원이 아니기도 하다. 특정 실시예에서, 본 명세서에서 제공된 바와 같은 나노캐리어가 B 세포 항원 및 T 세포 항원 양측 모두를 포함할 때, B 세포 항원 및 T 세포 항원은 동일한 항원이 아니지만, B 세포 및 T 세포 각각은 일부 실시예에서 B 세포 항원 및 T 세포 항원 양측 모두인 것일 수 있다. 다른 실시예에서, 나노캐리어의 B 세포 항원 및 T 세포 항원은 동일하다.
[0192] 세포 타입: 본 명세서에 기술되는 바와 같이, "세포 타입"이라는 용어는 세포 타입을 정의하는 형태학적, 생화학적, 및/또는 기능적 특성들의 개별 세트를 갖는 세포 형태를 지칭한다. 당업자는 세포 타입이 변화하는 레벨의 특이성을 갖는 것으로 정의될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어, T 셀 및 B 셀은 개별적인 세포 타입으로서, 서로 식별될 수 있지만 양쪽 모두가 멤버가 되는 보다 넓은 "림프구" 세포 타입의 특성인 특정 특성을 공유할 수 있다. 일반적으로, 상이한 타입의 세포는 본 기술 분야에서 특정 세포 타입 또는 타입들(예컨대, 특정 리니지의 세포 타입)의 "마커"로서 지칭되는 다양한 유전자의 차등적 표현에 기초하여 서로 식별될 수 있다. 일부 실시예에서, 상이한 타입의 세포는 그들의 차등적 기능에 기초하여 서로 식별될 수 있다. "세포 타입-특이적 마커"는 모든 또는 대부분의 기타 세포 타입에 의해서가 아니라 하나 이상의 세포 타입에 의해서 현저하게 더 큰 레벨로 발현되며 그 발현이 그 세포 타입의 특징을 나타내는 유전자 생성물 또는 이것의 변형된 버전이다. 많은 세포 타입 특이적 마커는 본 기술 분야에서 그와 같이 인지된다.
[00193] 투약 형태: 매질에서의 약물, 캐리어, 운반체(vehicle) 또는 피검자에게로의 투여에 적합한 기구. 투여 형태의 예는 본 명세서에서 제공된다.
[00194] 유해 환경 작용제(hazardous environmental agent): 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, "유해 환경 작용제"라는 용어는 주위 환경에서 발견되는 임의의 유해한 물질을 지칭한다. 이러한 물질은 일반적으로 건강상의 위험성을 지니는 것으로 여겨진다. 유해 환경 작용제는 그들이 실제로 위험성을 지니지 않을 수 있다 하더라도 건강상의 위험성을 지니는 것으로 생각되는 물질을 포함한다. 유해 환경 작용제는 비소, 납, 수은, 비닐 클로라이드, 폴리염화 바이페닐, 벤젠, 다환 방향족 탄화수소, 카드뮴, 벤조(a)피렌, 벤조(b)플로란센, 클로로폼, DDT, P,P'-, 아로크롤(aroclor) 1254, 아로크롤 1260, 디벤조(a,h)안트라센, 트리클로로에틸렌, 디엘드린, 6가 크롬, 및 DDE, P5P'를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, 나노캐리어에 포함시키기 위한 유해 환경 작용제는 완전 분자 또는 이것의 일부이다.
[00195] 생체 밖: 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, "생체 밖"이라는 용어는 유기체(예컨대, 동물, 식물 및/또는 미생물) 내에서가 아니라 인공적 환경, 예컨대 시험관이나 반응조에서, 세포 배양 시에 일어나는 이벤트를 지칭한다.
[00196] 생체 내: 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, "생체 내"이라는 용어는 유기체(예컨대, 동물, 식물, 및/또는 미생물) 내에서 일어나는 이벤트를 지칭한다.
[00197] 면역자극제: 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, "면역자극제"라는 용어는 항원에 대한 면역 반응을 조절(modulate)하지만 항원 또는 항원으로부터 유도된 것은 아닌 작용제를 지칭한다. 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, "조절"은 면역 반응을 유도, 증진, 억제, 지시 또는 전용하는 것을 지칭한다. 이러한 작용제는 항원에 대한 면역 반응을 자극(또는 증가)하지만, 위에서 정의된 바와 같이 항원 또는 항원으로부터 유도된 것이 아닌 면역자극제를 포함한다. 따라서, 면역자극제는 보조제를 포함한다. 일부 실시예에서, 면역자극제는 나노캐리어의 표면 상에 있고 및/또는 나노캐리어 내에 캡슐화된다. 일부 실시예에서, 나노캐리어의 표면 상에 있는 면역자극제는 나노캐리어 내에서 캡슐화된 면역자극제와는 상이하다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 하나 이상의 타입의 면역자극제를 포함한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 타입의 면역자극제는 상이한 경로에 작용한다. 면역자극제의 예는 본 명세서의 다른 곳에서 제공되는 것들을 포함한다. 일부 실시예에서, 합성 나노캐리어의 모든 면역자극제는 서로 동일하다. 일부 실시예에서, 합성 나노캐리어는 다수의 상이한 타입의 면역자극제를 포함한다. 일부 실시예에서, 합성 나노캐리어는 서로 동일한 다수의 개별적인 면역자극제를 포함한다. 일부 실시예에서, 합성 나노캐리어는 정확히 2개의 타입의 면역자극제를 포함한다. 일부 실시예에서, 합성 나노캐리어는 2개보다 더 많은 타입의 면역자극제를 포함한다. 일부 실시예에서, 합성 나노캐리어는 지질 피막(예컨대, 지질이중층, 지질단일층 등)을 포함하는데, 여기서 적어도 하나의 타입의 면역자극제는 지질 피막과 연관된다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 타입의 면역자극제는 지질 피막 내에 내장된다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 타입의 면역자극제는 지질이중층의 루멘(lumen) 내에 내장된다. 일부 실시예에서, 합성 나노캐리어는 지질 피막의 내부 표면과 연관되는 적어도 하나의 타입의 면역자극제를 포함한다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 타입의 면역자극제는 합성 나노캐리어의 지질 피막 내에 내에서 캡슐화된다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 타입의 면역자극제는 합성 나노캐리어의 다수의 위치에 위치할 수 있다. 당업자는 선행 예들은 다수의 면역자극제가 상이한 장소의 합성 나노캐리어와 연관될 수 있는 많은 상이한 방법들을 나타낼 뿐이라는 것을 알 것이다. 다수의 면역자극제는 합성 나노캐리어의 임의의 결합 장소들에 위치할 수 있다.
[00198] 핵산(nucleic acid): 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, 가장 넓은 관점에서의 "핵산"이라는 용어는 올리고뉴클레오티드 사슬에 통합되어 있거나 통합될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 실시예에서, 핵산은 포스포디에스테르 결합(phosphodiester linkage)을 통해 올리고클레오티드 사슬에 통합되어 있거나 통합될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질이다. 일부 실시예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기(예컨대, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭한다. 일부 실시예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, "뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 상호 교환가능하게 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, "핵산"은 단일 가닥 및/또는 이중 가닥 DNA 및/또는 cDNA뿐 아니라 RNA를 포함한다. 또한, "핵산", "DNA", "RNA"라는 용어 및/또는 유사 용어는 핵산 유사체, 즉 포스포디에스테르 주쇄 외의 것을 갖는 유사체를 포함한다. 예를 들어, 본 기술 분야에 알려져 있고 주쇄에서 포스포디에스테르 결합 대신에 펩티드 결합을 갖는 소위 "펩티드 핵산"은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주된다. "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"라는 용어는 서로의 퇴행성(degenerate) 버전이며 및/또는 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및/또는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다. 핵산은 자연적 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 발현 시스템을 사용하여 생성될 수 있으며, 선택적으로 정제될 수 있고, 화학적으로 합성될 수 있다. 예컨대 화학 합성 분자의 경우에, 적절한 곳에서, 핵산은 화학적 변형 염기 또는 당류를 갖는 유사체과 같은 뉴클레오시드 유사체, 주쇄 변형 등과 같은 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 다른 언급이 없다면 5' 내지 3' 방향으로 제시된다. "핵산 세그먼트(nucleic acid segment)"라는 용어는 본 명세서에서 보다 긴 핵산 서열의 일부분인 핵산 서열을 지칭하는 데 사용된다. 많은 실시예에서, 핵산 세그먼트는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그보다 많은 잔기를 포함한다. 일부 실시예에서, 핵산은 천연 뉴클레오시드(예컨대, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 디옥시아데노신, 디옥시티미딘, 디옥시구아노신 및 디옥시시티딘); 뉴클레오시드 유사체(예컨대, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 필로로-피리미딘, 3-메틸아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플로로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 및 2-티오시티딘); 화학적 변형 염기; 생물학적 변형 염기(예컨대, 메틸화 염기); 개재 염기(intercalated bases); 변형 당류(modified sugars)(예컨대, 2'-플로로리보스, 리보스, 2'-디옥시리보스, 아라비노오스, 및 헥소오스); 및/또는 변형 포스포페이트기(예컨대, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포라미디트 결합)이거나 이를 포함한다.
[00199] 입자: 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, "입자"는 10 마이크론(㎛) 미만의 직경을 갖는 임의의 실재를 지칭한다. 일반적으로, 입자는 1000 nm 이하의 최장 치수(예컨대, 직경)를 갖는다. 일부 실시예에서, 입자는 300 nm 이하의 직경을 갖는다. 입자는 마이크로입자, 나노입자 및 피코입자를 포함한다. 일부 실시예에서, 나노입자는 200 nm 이하의 직경을 갖는다. 일부 실시예에서, 나노입자는 100 nm 이하의 직경을 갖는다. 일부 실시예에서, 나노입자는 50 nm 이하의 직경을 갖는다. 일부 실시예에서, 나노입자는 30 nm 이하의 직경을 갖는다. 일부 실시예에서, 나노입자는 20 nm 이하의 직경을 갖는다. 일부 실시예에서, 나노입자는 10 nm 이하의 직경을 갖는다. 일부 실시예에서, 입자는 폴리머 매트릭스일 수 있다. 일부 실시예에서, 입자는 비중합체 입자(예컨대, 금속 입자, 양자점, 세라믹, 무기 물질, 골질(bone) 등)일 수 있다. 입자는 또한 리포솜 및/또는 미셀일 수 있다. 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, "나노입자"라는 용어는 1000 nm 이하의 직경을 갖는 임의의 입자를 지칭한다.
[00200] 약학적으로 허용가능한 부형제(pharmaceutically acceptable excipient): 본 발명의 조성물에 추가되어 조성물의 투약을 더 용이하게 하기 위한 약학적 비활성 물질. 약학적으로 허용가능한 부형제의 제한이 없는 예는 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스포페이트, 다양한 희석제, 다양한 당류 및 다양한 타입의 녹말, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌글리콜을 포함한다.
[00201] 낮은 면역성의 항원: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "낮은 면역성의 항원"이라는 용어는 임의의 레벨 또는 충분한 레벨의 바람직한 면역 반응을 트리거하지 않는 항원을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "충분한"은 본 명세서에서 설명된 나노캐리어를, 예컨대 나노캐리어의 부재 시에 보조제와 혼합되는 자유 항원으로서 채용하지 않는 조성물에서 투약될 때 검출가능하거나 방어적인 면역 반응을 도출하는 능력을 지칭한다. 일부 실시예에서, 바람직한 면역 반응은 질병 또는 질환을 치료하거나 예방하는 것이다. 특정 실시예에서, 바람직한 면역 반응은 질병 또는 질환의 하나 이상의 징후를 경감시키는 것이다. 낮은 면역성의 항원은 자기 항원(self antigen), 소분자(small molecules), 및 탄수화물을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다.
[00202] 자기 항원: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "자기 항원"이라는 용어는 동물 내에서 항원에 대항하는 면역 반응이 트리거될 때 자가 면역(예컨대, 자가면역 질병)이 생기는 동물의 동체의 정상적인 물질을 지칭한다. 자기 항원은 단백질 또는 펩티드, 지질단백질(lipoprotein), 지질, 탄수화물, 또는 핵산일 수 있다. 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 자기 항원은 효소, 구조단백질(structural proteins), 분비단백질(secreted proteins), 세포 표면 수용체, 및 시토카인을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, 자기 항원은 시토카인이고, 시토카인은 TNF, IL-I, 또는 IL-6이다. 일부 실시예에서, 자기 항원은 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질(cholesteryl ester transfer protein: CETP), 고밀도 리포단백질(HDL)로부터 저밀도 리포단백질 콜레스테롤(LDL)로의 콜레스테롤 전달을 담당하는 세럼 단백질, 알츠하이머와 연관된 Aβ 단백질, 병리적 형태의 Aβ 단백질을 처리하는 단백질 가수 분해 효소, 죽상동맥경화증(atherosclerosis)과 연관된 LDL, 또는 HIV-I에 대한 공수용체이다. 일부 실시예에서, 병리적 형태의 Aβ 단백질을 처리하는 단백질 가수 분해 효소는 베타-세크리타아제이다. 일부 실시예에서, 죽상동맥경화증과 연관된 LDL은 산화되거나 최소로 변형된다. 일부 실시예에서, HIV-I에 대한 공수용체는 CCR5이다.
[00203] 소분자: 일반적으로, "소분자"는 본 기술 분야에서 크기가 약 2000 g/mol 미만의 유기 분자인 것으로 이해된다. 일부 실시예에서, 소분자는 약 1500 g/mol보다 작거나 약 1000 g/mol보다 작다. 일부 실시예에서, 소분자는 약 800 g/mol보다 작거나 약 500 g/mol보다 작다. 일부 실시예에서, 소분자는 비-중합체 및/또는 비-소중합체이다. 일부 실시예에서, 소분자는 단백질, 펩티드, 또는 아미노산이 아니다. 일부 실시예에서, 소분자는 핵산 또는 뉴클레오티드가 아니다. 일부 실시예에서, 소분자는 단당류 또는 다당류가 아니다.
[00204] 특이적 결합(specific binding): 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "특이적 결합"이라는 용어는 제 1 모이어티과 제 2 모이어티의 비공유 물리적 연관성을 지칭하는데, 여기서 제 1 모이어티과 제 2 모이어티 사이의 연관성은 어느 하나의 모이어티과 결합이 발생하는 환경에 존재하는 대부분의 모이어티 또는 모든 기타 모이어티와의 연관성보다 적어도 2배, 적어도 5배, 적도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배 또는 그보다 더 강하다. 2개 이상의 실재들의 결합은 평형 해리 상수(equilibrium dissociation constant) Kd가 이용 조건 하에서, 예컨대 세포 내부에 있거나 세포 수명과 부합하는 것들과 같은 생리적 조건 하에서, 10-3 M 이하, 10-4 M 이하, 10-5 M 이하, 10-6 M 이하, 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하, 10-12 M 이하라면 특정한 것으로 간주될 수 있다. 일부 실시예에서, 특이적 결합은 복수의 보다 약한 상호작용(예컨대, 복수의 개별적인 상호작용으로서, 각각의 개별적인 상호작용은 10-3 M보다 큰 IQ에 의해 특성화됨)에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시예에서, "분자 인식"이라 지칭될 수 있는 특이적 결합은 각각의 실재에 대해 상보적인 정위(orientation)의 기능 그룹에 의존하는 2개의 실재들 사이의 포화가능 결합 상호작용이다. 특이적 결합 상호작용의 예는 앱타머-앱타머 표적 상호작용(aptamer-aptamer target interactions), 항체-항원 상호작용, 아비딘-비오틴 상호작용(avidin-biotin interactions), 리간드-수용체(ligand-receptor interactions), 금속-킬레이트 상호작용(metal-chelate interactions), 상보성 핵산들 사이의 교잡(hybridization) 등을 포함한다.
[00205] 피검자: 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, "피검자" 또는 "환자"라는 용어는 본 발명의 조성이, 예컨대 실험, 진단 및/또는 치료 목적을 위해 투여될 수 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 일반적인 피검자는 동물(예컨대, 인간이 아닌 영장류 및 인간과 같은 포유류; 고양이, 개, 양, 염소, 소, 말 및 돼지와 같은 가축; 마우스, 래트 및 기니피그와 같은 실험실용 동물; 토끼; 물고기; 파충류; 동물원 및 야생 동물) 및/또는 식물을 포함한다. 일반적으로, "피검자"는 인간 및 영장류와 같은 포유류 등이다.
[00206] 앓고 있는: 질병, 질환 및/또는 이상을 "앓고 있는" 개체는 질병, 질환 및/또는 이상(conditions)을 진단받았거나 진단받을 수 있으며, 또는 그것들의 하나 이상의 징후를 디스플레이한다.
[00207] 감염되기 쉬운: 질병, 질환 및/또는 이상에 "감염되기 쉬운" 개체는 질병, 질환 및/또는 이상을 진단받지 않았고 및/또는 그것들의 징후를 보이지 않을 수 있다. 일부 실시예에서, 질병, 질환 및/또는 이상은 미생물 감염(예컨대, 박테리아 감염, 바이러스 감염, 진균 감염, 기생체 감염 등)과 연관된다. 일부 실시예에서, 미생물 감염에 감염되기 쉬운 개체는(예컨대, 섭취, 흡입, 물리적 접촉 등에 의해) 미생물에 감염된 개체에 감염되기 쉽다. 일부 실시예에서, 미생물 감염에 감염되기 쉬운 개체는 미생물이 널리 퍼진 곳에 있는 개체(예컨대, 미생물이 널리 퍼진 곳을 여행하고 있는 개체)이다. 일부 실시예에서, 질병, 질환 및/또는 이상에 감염되기 쉬운 개체는 질병, 질환, 및/또는 이상을 발달시킬 것이다. 일부 실시예에서, 질병, 질환 및/또는 이상에 감염되기 쉬운 개체는 질병, 질환 및/또는 이상을 발달시키지 않을 것이다. 일부 실시예에서, 피검자는 암, 감염성 질병, 비자기면역성 물질대사 또는 퇴행성 질병, 또는 중독을 갖거나 갖기 쉽다. 일부 실시예에서, 피검자는 박테리아, 진균, 원생동물, 기생체, 또는 바이러스 감염을 갖거나 갖기 쉽다. 이러한 감염의 원인은 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 유기체들 중 임의의 것일 수 있다. 일부 실시예에서, 피검자는 결핵, 말라리아, 레슈마니아증, 헬리코박터 파일로리, 스타필로코커스 감염, 또는 살모넬라 감염에 감염되었거나 감염되기 쉽다. 일부 실시예에서, 피검자는 인프루엔자를 갖거나 갖기 쉽다. 일부 실시예에서, 피검자는 자가면역 질병을 갖거나 그에 감염되기 쉽다.
[00208] 합성 나노캐리어(들): "합성 나노캐리어(들)"은 자연에서 발견되지 않으며 크기 면에서 5 마이크론 이하인 최소 치수를 갖는 별개의 객체를 의미한다. 알부민 나노입자는 명백히 합성 나노캐리어로서 포함된다. 본 발명에 따른 합성 나노캐리어는 실질적인 벡터 효과를 유발하지 않으며, 바람직하게는 벡터 효과를 유발하지 않는다. 특정의 바람직한 실시예에서, 합성 나노캐리어는 벡터 효과를 감소시키거나 제거하도록 변형된다. 이것은, 예를 들어 다양한 물질(예컨대, 폴리에틸렌글리콜)을 합성 나노캐리어에 결합시켜 합성 나노캐리어의 면역 특성을 감소시킴으로써 달성될 수 있다.
[00209] 합성 나노캐리어는 하나 또는 복수의 지질성 나노입자(lipid-based nanoparticles), 중합체 나노입자, 금속성 나노입자, 계면 활성제성 유상액(surfactant-based emulsions), 덴드리머, 버키볼(buckyballs), 나노와이어, 바이러스형 입자,(알부민 나노입자와 같은) 펩티드 또는 단백질성 입자, 및/또는 지질-중합체 나노입자와 같은 나노물질들의 조합을 사용하여 개발된 나노입자를 포함할 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다. 합성 나노캐리어는 타원형(spheroidal), 입방체형(cubic), 피라미드형(pyramidal), 장방형(oblong), 실린더형(cylindrical), 환상체형(toroidal) 등을 포함하지만 여기에 한정되지 않는 다양한 여러 가지 형상일 수 있다. 본 발명에 따른 합성 나노캐리어는 하나 이상의 표면을 포함한다. 본 발명의 실행 시의 사용을 위해 개조될 수 있는 예시적인 합성 나노캐리어는(1) Gref 등에게 허여된 미국 특허 제5,543,158호에 개시된 생분해성 나노입자,(2) Saltzman 등에게 허여된 미국 특허 출원 공보 제2006/0002852호의 중합체 나노입자, 또는(4) DeSimone 등에게 허여된 미국 특허 출원 제2009/0028910호의 리소그래피 방법으로 구성된 나노입자를 포함한다. 약 100 nm 이하, 바람직하게는 약 100 nm 이하의 최소 치수를 갖는 본 발명에 따른 합성 나노캐리어는 보체를 활성화시키는 하이드록실기를 갖는 표면을 포함하지 않거나 대안으로 본질적으로 보체를 활성화시키는 하이드록실기가 아닌 모이어티들로 구성되는 표면을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 약 100 nm 이하, 바람직하게는 약 100 nm 이하의 최소 치수를 갖는 본 발명에 다른 합성 나노캐리어는 보체를 실질적으로 활성화시키는 표면을 포함하지 않거나, 대안으로 본질적으로 보체를 실질적으로 활성화시키지 않는 모이어티로 구성되는 표면을 포함한다. 더욱 바람직한 실시예에서, 약 100 nm 이하, 바람직하게는 100 nm 이하의 최소 치수를 갖는 본 발명에 따른 합성 나노캐리어는 보체를 활성화시키는 표면을 포함하지 않거나 대안으로 본질적으로 보체를 활성화시키지 않는 모이어티로 구성되는 표면을 포함한다.
[00210] "나노캐리어", "합성 나노캐리어"라는 용어 및 이들의 파생어는 전반적으로 본 명세서에서 상호 교환가능하게 사용된다.
[00211] T 세포 항원: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "T 세포 항원"이라는 용어는 T 세포에서 면역 반응에 의해 인지되고 그 면역 반응을 트리거하는 임의의 항원(예컨대, 주요 조직호환성 복합 분자(major histocompatiability complex molecule: MHC)에게 종속되는 항원 또는 이것의 일부의 제공을 통해 T 세포 상의 T 세포 수용체에 의해 구체적으로 인지되는 항원)을 지칭한다. 일부 실시예에서, T 세포 항원인 항원은 또한 B 세포 항원이다. 다른 실시예에서, T 세포 항원은 또한 B 세포 항원이 아니다. T 세포 항원은 일반적으로 단백질 또는 펩티드이다. T 세포 항원은 CD8+T 세포 반응, CD4+ T 세포 반응 또는 이들 모두를 자극하는 항원일 수 있다. 따라서, 나노캐리어는, 일부 실시예에서, 양쪽 타입의 반응을 효과적으로 자극할 수 있다.
[00212] 표적: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "표적" 또는 "마커"라는 용어는 특히 특정 타깃 모이어티에결합할 수 있는 임의의 실재를 지칭한다. 일부 실시예에서, 타깃은 특히 하나 이상의 특정 조직 타입과 연관된다. 일부 실시예에서, 타깃은 특히 하나 이상의 세포 타입과 연관된다. 예를 들어, 세포 타입 특이적 마커는 일반적으로 세포의 기준 집단(reference population)에서보다 그 세포 타입에서 적어도 2겹이 더 큰 레벨로 표현된다. 일부 실시예에서, 세포 타입 특이적 마커는 기준 집단에서 그것의 평균 표현보다 적어도 3겹, 적어도 4겹, 적어도 5겹, 적어도 6겹, 적어도 7겹, 적어도 8겹, 적어도 9겹, 적어도 10겹, 적어도 50겹, 적어도 100겹, 또는 적어도 1000겹 더 큰 레벨로 표현된다. 세포 타입 특이적 마커의 검출 또는 측정은 관심 세포 타입 또는 타입들을 많은 기타 타입, 대부분의 기타 타입 또는 모든 기타 타입의 세포와 구별되게 할 수 있다. 일부 실시예에서, 표적은 본 명세서에서 기술되는 바와 같이 단백질, 탄수화물, 지질, 및/또는 핵산을 포함할 수 있다.
[00213] 표적화: 물질은 그것이 특히 표적과 결합된다면 본 명세서에서 기술되는 목적을 위해 "표적화"되는 것으로 간주된다. 일부 실시예에서, 표적화 모이어티는 특히 엄중한 조건 하에서 표적과 결합한다. 백신 나노캐리어와 같이 표적화 모이어티를 포함하는 본 발명의 나노캐리어는 표적화 모이어티가 특히 표적과 결합하여 특정 유기체, 조직, 세포 및/또는 세포 이하의 장소에 전체 나노캐리어를 전달한다면 "표적화"되는 것으로 간주된다.
[00214] 표적화 모이어티: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "표적화 모이어티" 및 "높은 친화력 표적화 모이어티"라는 용어는 상호 교환가능하게 사용되며, 세포의 성분과 결합하는 임의의 모이어티를 지칭한다. 일반적으로, 표적화 모이어티와 세포 성분의 결합은 높은 친화력 결합 상호작용일 것이다. 면역특징(immunofeature) 표면 상에 존재하고 APC에 표적화(및 높은 결합활성 결합)를 제공하는 복수의 모이어티 외에도, 본 발명의 나노캐리어는 하나 이상의 추가 표적화 모이어티를 더 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 표적화 모이어티는 특히 세포 성분과 결합한다. 이러한 성분은 "표적" 또는 "마커"라고 지칭된다. 표적화 모이어티는 폴리펩티드, 당단백질, 핵산, 소분자, 탄수화물, 지질 등일 수 있다. 일부 실시예에서, 표적화 모이어티는 항체 또는 이것의 특성 부분이다. 일부 실시예에서, 표적화 모이어티는 수용체 또는 이것의 특성 부분이다. 일부 실시예에서, 표적화 모이어티는 리간드 또는 이것의 특성 부분이다. 일부 실시예에서, 표적화 모이어티는 세포 타입 특이적 마커와 결합하는 핵산 표적화 모이어티(예컨대, 앱타머)이다. 일부 실시예에서, 표적화 모이어티는 소분자이다. 일부 실시예에서의 표적화 모이어티는 나노캐리어의 표면 상에 있다. 다른 실시예에서, 표적화 모이어티는 나노캐리어 내에서 캡슐화된다. 또 다른 실시예에서, 표적화 모이어티는 나노캐리어와 연관된다. 일부 실시예에서, 표적화 모이어티는 나노캐리어와 공유로 연관된다. 다른 실시예에서, 표적화 모이어티는 나노캐리어와 비공유로 연관된다. 또 다른 실시예에서, 표적화 모이어티는 셀의 표면 상에 발현되는 수용체와 결합한다. 표적화 모이어티는, 일부 실시예에서, 가용성 수용체와 결합한다. 일부 실시예에서, 가용성 수용체는 보체 단백질 또는 기존의 항체이다. 다른 실시예에서, 표적화 모이어티는 항원 제시 세포, T 세포 또는 B 세포에 나노캐리어를 전달하기 위한 것이다. 일부 실시예에서, 항원 제시 세포는 대식세포이다. 다른 실시예에서, 대식세포는 피막하동 대식세포이다. 또 다른 실시예에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포(dendritic cells)이다. 일부 실시예에서 항원 제시 세포는 소포(follicular) 수지상 세포이다. 표적화 모이어티의 특정한 비한정 예시는 CD11b, CD169, 마노스 수용체(mannose receptor), DEC-205, CD11c, CD21/CD35, CX3CR1, 또는 Fc 수용체와 결합하는 분자를 포함한다. 일부 실시예에서, 전술한 것들 중의 임의의 것과 결합하는 분자는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편(예컨대, 안티-D169 항체)이다. 일부 실시예에서, Fc 수용체와 결합하는 분자는 면역글로블린(예컨대, IgG)의 Fc 부분을 포함하는 것이다. 다른 실시예에서, 면역글로블린의 Fc 부분은 인간의 Fc 부분이다. 일부 실시예에서, CX3CR1와 결합하는 분자는 CX3CL1(프랙토카인)이다. CD169와 결합하는 표적화 모이어티는 안티-CD169 항체 및 CD169의 리간드, 예컨대 시알릴레이트 CD227, CD43, CD206 또는 결합 기능을 계속 유지하는 이러한 리간드들의 일부분, 예컨대 가용성 부분을 포함한다.
[00215] 치료 유효량: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료 유효량"이라는 용어는 치료, 예방, 및/또는 질병, 질환 및/또는 이상을 앓고 있거나 감염되기 쉬운 피검자에게 투여될 때 질병, 질환 및/또는 이상을 치료하고, 완화시키며, 개선하고, 구제하며, 그의 징후를 완화시키고, 방지하며, 그의 발병을 지연시키고, 그의 진행을 억제하며, 그의 고통을 감소시키고, 및/또는 그의 발병률을 감소시키기에 충분한 진단제(예컨대, 본 발명의 백신 나노캐리어)의 양을 의미한다. 그 용어는 또한 피검자에게서 면역 반응을 변형하도록 본 명세서에서 제공되는 나노캐리어 또는 이것의 조성량을 지칭하는 데 쓰인다.
[00216] 치료제: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료제"라는 용어는 피검자에게 투여될 때, 치료, 예방, 및/또는 진단 효과를 갖고 및/또는 바람직한 생리학적 및/또는 약학적 효과를 유도하는 임의의 작용제를 지칭한다.
[00217] 치료: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료"라는 용어는 부분적으로 또는 완전히 특정 질병, 질환 및/또는 이상의 하나 이상의 징후나 특징을 완화시키고, 개선하며, 구제하고, 그의 발병을 지연시키며, 그의 진행을 억제하고, 그의 고통을 감소시키며, 및/또는 그의 발병률을 감소시키는 것을 지칭한다. 예를 들어, 미생물 감염을 "치료"하는 것은 미생물의 생존, 성장 및/또는 확산의 억제를 지칭하는 것일 수 있다. 치료는 질병, 질환 및/또는 이상의 징후를 보이지 않는 피검자에게 또한 질병, 질환 및/또는 이상과 연관된 병리를 발전시킬 위험성을 감소시킬 목적으로 질병, 질환 및/또는 이상의 조기 조짐만을 보이는 피검자에게 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 치료는 본 발명의 백신 나노캐리어를 피검자에게 전달하는 것을 포함한다.
[00218] 보편적 T 세포 항원: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "보편적 T 세포 항원"이라는 용어는 T 세포의 조력을 촉진할 수 있고 완전 무관 항원에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있는 T 세포 항원을 지칭한다. 보편적 T 세포 항원은 파상풍 톡소이드, 및 파상풍 톡소이드, 엡스테인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 또는 인플루엔자 바이러스로부터 유래되는 하나 이상의 펩티드를 포함한다. 보편적 T 세포 항원은 또한 혈구응집소(hemagglutinin), 뉴라미니다아제(neuraminidase), 또는 핵단백질(nuclear protein), 또는 이들로부터 유래되는 하나 이상의 펩티드를 포함한다.
[00219] 백신 나노캐리어: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "백신 나노캐리어"라는 용어는 적어도 하나의 면역조절제 또는 면역자극제를 포함하는 합성 나노캐리어를 지칭한다. 특정 실시예에서, 백신 나노캐리어는 적어도 두 가지 타입의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 항원이며, 백신 나노캐리어는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 보다 많은 항원을 포함한다. 상이한 항원은 완전히 상이한 항원 분자로부터 유래되거나 유래될 수 있고, 또는 상이한 항원은 동일한 항원 분자와는 상이한 항원결정부일 수 있다. 다른 실시예에서, 백신 나노캐리어는 동일한 항원 분자와는 상이한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그보다 많은 항원결정부를 포함한다. 백신 나노캐리어는 임의의 형태의 입자일 수 있다. 백신 나노캐리어는, 일부 실시예에서, T 세포 및/또는 B 세포에서 면역 응답을 자극할 수 있다. 다른 실시예에서, 백신 나노캐리어는 면역 응답을 증진, 억제, 지시 또는 전용할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 기술 분야에서 이용가능한 임의의 검정법은 T 세포 및/또는 B 세포가 자극받았는지를 판정하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, T 세포 자극은 시토카인의 항원 유도 생성, T 세포의 항원 유도 증식(proliferation), 및/또는 단백질 발현 시의 항원 유도 변화를 모니터링함으로써 분석될 수 있다. 일부 실시예에서, B 세포 자극은 항체 역가(titer), 항체 친화력, 중화 검정 시의 항체 성능, 클래스-스위치 재조합, 항원-특이적 항체의 친화력 성숙(maturation), 기억 B 세포의 발달(development), 연장된 기간 동안 다량의 높은 친화력 항체를 생성할 수 있는 장수 플라즈마 세포(long-lived plasma cells)의 발달, 배심 반응(germinal center reactions), 및/또는 중화 검정 시의 항체 성능을 모니터링함으로써 분석될 수 있다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 백신 나노캐리어를 피검자 내의 특정 표적(예컨대, 유기체, 조직, 세포 및/또는 세포 이하의 장소)에 전달하는 데 도움이 될 수 있는 적어도 하나의 표적화 모이어티를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 T 세포 및/또는 B 세포에서 면역 응답을 자극하는 데 도움이 될 수 있는 적어도 하나의 면역자극제를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 조정가능한 피막 견고성(tunable membrane rigidity) 및 제어가능한 리포솜 안정성을 허용하는 적어도 하나의 나노입자를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는, 지질, 양친매성 화합물(amphiphilic compounds), 중합체, 당류, 폴리머 매트릭스, 및/또는 비중합체 입자를 포함한다.
[00220] 벡터 효과: 적응적 면역 반응이 요망되는 항원에 대한 것이라기보다는 합성 나노캐리어에 대한 면역 반응의 확립. 벡터 효과는 합성 나노캐리어의 재료가 그것의 화학적 조성 또는 구조 때문에 강한 면역 반응을 자극할 수 있을 때 발생할 수 있다.
[00221] 수용성의 비접착성 중합체: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "수용성의 비접착성 중합체"라는 용어는 물에 녹을 수 있고 감소한 생물오손(biofouling) 특성을 부여할 수 있는 중합체를 지칭한다. 일부 실시예에서, 수용성의 비접착성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리알킬렌글리콜, 및 폴리알킬렌 옥사이드이다.
백신
[00222] 백신 접종(vaccinations)은 일반적으로 사실상 수동적이거나 능동적이다. 일반적으로, 능동적 백신 접종은, 원치 않고, 바람직하지 않으며, 및/또는 이질적인 것으로 인지되며, 항원-특정 나이브 림프구가 항체-분비 B 세포 또는 항원-특정 효과기 및 기억 T 세포 또는 양쪽의 두 세포 모두를 발생시키는 내인성 면역 반응(endogenous immune response)을 도출하는 하나 이상의 작용제에 피검자의 면역계를 노출시킨다. 이 접근법은 동일한 항원 물질로의 갱신 노출에 의해 시간에 따라 급증할 수 있는 장수 방어성 면역을 가져올 수 있다. 능동적 백신 접종에 대한 성공적인 면역 반응의 예상 수명은 이 전략을 수동적 백신 접종보다는 대부분의 임상적 환경에서 더욱 바람직하게 만들며, 이에 의해 수용체는 작용한 항체 또는 항원-특정 효과기 림프구를 주입받아 급속한 애드-혹 방어를 협의하지만 일반적으로는 지속적인 면역성을 확립시키지 않는다.
[00223] 매우 다양한 백신 제형은 인간에게 이용되고 있거나 이용되어 왔다. 인간에게 투여되는 가장 보편적인 경로는 근육 내(i.m.) 주사에 의한 것이지만, 백신은 또한 경구로, 비강으로, 피하 주사로, 흡입형으로, 또는 정맥 주사로 적용되거나 투여될 수 있다. 대부분의 경우, 백신-유래 항원은 초기에 지역적 림프절에서 나이브 림프구에 제공된다.
[00224] 예컨대, 병원미생물에 대항하는 일부 현재 백신은 미생물의 생약독화(live attenuated) 또는 비악성 균주, 또는 죽거나 이와 달리 비활성된 유기체로 구성된다. 다른 백신은, 때때로 다른 분자와 혼합되는 표면 탄수화물 또는 재조합 병원체-유도 단백질, 특히 보조제 활성화(adjuvant activity)를 부여할 수 있는 단백질과 같은 병원체 분해질(pathogen lysates)로 구성되는 다소의 정제된 성분들을 이용한다.
[00225] 생약독화되거나 비활성화된 병원체를 이용하는 백신은 일반적으로 강력한 면역 반응을 낳지만, 그들의 용도는 제한성을 갖는다. 예를 들어, 생 백신 균주(live vaccine strains)는, 특히 면역-손상 수용체에게 투여될 때 때때로 전염성 병리를 야기할 수 있다. 더욱이, 많은 병원체, 특히 바이러스는 그들이 항원과 관련하여 별개의 백신 균주에 대한 면역 반응을 벗어나게 하는 그들의 게놈에서 연속적인 급속한 돌연변이를 겪는다. 그러나, 대부분 또는 모든 병원체는 그들이 본질적인 기능과 연관되기 때문에 쉽게 돌연변이되지 않는 특정 항원 결정소를 갖는 것으로 생각된다. 더 많은 가변적이고 비본질적인 항원결정부들이 아니라 그러한 보존된 항원결정부들에 대항하도록 지시되는 항체는 고도로 돌연변이되기 쉬운 바이러스에 대비할 수 있다(Baba 등, 2000, Nat. Med., 6:200, 여기에 참고로서 포함됨). 살아 있거나 죽은 손상되지 않은 병원체에 기초한 백신은 그러한 임계적 항원결정부들의 인지를 반드시 촉진하는 것은 아니지만, 매우 가변적인 항원결정부들에 대한 그것의 급습에 중점을 두도록 면역계를 필수적으로 "혼란"시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 바이러스 입자의 고도의 면역성 입자 특성을 모방하지만, 본질적인 돌연변이성 항원결정부를 선택적으로 제시하는 가공된 백신 나노캐리어가 손상되지 않은 미생물보다 보다 더욱 강력하고 "탈출 방지" 중화 항체 및 효과기 T 세포 반응을 낳을 수 있다는 인식을 포함한다.
[00226] 백신이 배출 림프절에서 항체 반응을 자극하게 하는(또는 그렇게 하지 못하는) 정확한 메커니즘은 여전히 불완전하게 이해된다. B 및 T 세포는 초기에 별개의 해부학적 영역, 표면적으로 위치하는 B 소포 및 주위의 파라콜텍스(paracortex) 및 깊은 피질에서 각각 격리된다. 항원 공격 시, 소포 내의 항원-특정 B 세포 및 T 세포 영역 내의 CD4 세포는 활성화되고, 이어서 2개의 구획들 사이에서 더 넓은 구역을 향해 이주한다. 식세포활동된 림프 생성 항원(phagocytosed lymph-borne antigens)을 갖는 B 세포는 획득된 물질을 처리하고, 활성화된 CD4 T 세포(TFH 세포)에 의해 인지되는 MHC 클래스-Ⅱ 표면 분자에서 항원 펩티드를 제공하기 시작한다. 항원-인식은 TFH 세포가 B 세포에 도움을 제공하게 하여 강력한 생존 신호를 구성하고 B 소포 내에서의 배심(GC) 제조를 트리거한다. GC 반응은 클래스-스위치 재조합, 항원-특이적 항체의 친화력 성숙, 및 연장된 기간 동안 다량의 높은 친화력 항체를 생성할 수 있는 기억 B 세포 및 장수 플라즈마 세포의 제조를 촉진한다. 따라서, 본 발명은 항원 물질이 B 세포 및 T 세포 양쪽 모두에 의해 효율적으로 인식되게 하고 강력한 GC 반응을 유도하게 하는 성분들을 백신 나노캐리어가 가질 수 있다는 인식을 포함한다(도 1).
[00227] 본 발명은 현재 백신 기술의 전술된 제한사항을 극복할 수 있는 백신 전달용 백신 나노캐리어를 발달시키기 위한 시스템을 기술하고 있다. 본 발명은 수십 내지 수백 나노미터의 직경을 측정하고 강력한 세포질을 유도하는 림프-생성 바이러스 입자 및 항체 반응이 포착되고 배출 림프절의 피막하동에서의 대식 세포(즉, 피막하동 대식세포, 약어로 SCS-Mph)의 표면 상에서 계속 유지된다는 인식을 포함한다. 이러한 대식세포는 소포 B 세포에 손상되지 않은 바이러스 입자의 효율적인 조기 제공 시에 영향을 받는다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어는 바이러스 입자를 모방하고 SCS-Mph를 표적으로 한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 지질단일층 및 폴리에틸렌글리콜로 표면 안정화된 Cy5 캡슐화된 폴리(락틱-코글리콜릭 산)(PLGA) 나노입자(50 nm - 150 nm)의 피하 주입 시에, 주입된 나노입자가 림프액을 넣고 림프-생성 바이러스와 유사한 배출 림프절의 피막하동에 결합된다. B 세포 및/또는 T 세포를 자극하는 면역조절제(들)를 운반하는 유사한 나노캐리어는 피검자를 백신 접종하는 데 특히 유용하다.
[00228] 따라서, 본 발명은, 면역조절제를 운반하는 림프-생성 바이러스 크기 나노캐리어와 같은 나노캐리어가 그들이 바이러스였던 것처럼 인식될 수 있고, 예를 들어 입자가 B 세포 및/또는 T 세포에 의해 인식되는 면역조절제(들)를 포함할 때 강력한 면역 반응을 도출할 수 있다는 인식을 포함한다.
[00229] 표면 상에서 면역조절제를 운반하고 및/또는 내부에 유사하거나 개별적인 면역조절제를 로딩함으로써, 나노캐리어는 그러한 면역조절제를 면역계의 개별 세포에 동시에 전달하고 그들을 자극할 수 있다. 특정 실시예에서, 나노 캐리어 표면 상에 제공되는 면역조절제는 B 세포를 자극하고, 나노캐리어 내에서 캡슐화되는 면역조절제는 림프 조직에서(또한 활성화 후의 B 세포에 의해) 수지상 세포(DC)와 같은 항원 제시 세포(APC)에 의해 처리되며, T 세포에 제공된다. 일부 실시예에서, 표적화 모이어티(예컨대, 항체 또는 이것의 단편, 펩티드 또는 폴리펩티드, Affibody®, Nanobody®, AdNectin®, Avimer®, 앱타머, Spiegelmer®, 소분자, 지질, 탄수화물 등)를 갖는 나노캐리어의 표면을 변형함으로써 나노캐리어는 면역조절제를 DC, SCS-Mph, FDC, T 세포, B 세포, 및/또는 이들의 조합과 같은 특정 항원 제시 세포에 선택적으로 전달할 수 있다. 나노캐리어는, 하나 또는 복수의 지질 나노입자, 중합체 나노입자, 금속성 나노입자, 계면 활성제성 유상액, 덴드리머, 및/또는 지질-중합체 나노입자와 같은 나노물질들의 조합을 사용하여 개발된 나노입자를 포함할 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다. 백신 나노캐리어는 "백신 나노캐리어"라는 제목의 섹션에서 더욱 상세히 설명된다.
[00230] 본 발명은, 예를 들어 면역계의 세포로의 면역조절제 전달용 백신 나노캐리어를 제공한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 APC로 전달되어 면역조절제(들)를 처리하고 T 세포에 전달하는 적어도 하나의 면역조절제를 포함한다.
[00231] 전문적 APC는 식세포활동 또는 세포내섭취(endocytosis)에 의해 항원을 흡수하는 데 매우 효율적이며, 이어서 APC 피막 상에서 클래스 Ⅱ 주요 조직호환성 복합체(클래스 Ⅱ MHC) 분자 또는 클래스 1 MHC 분자에 결합되는 항원의 단편을 디스플레이한다. CD4 T 세포는 APC 피막 상의 항원-클래스 Ⅱ MHC 분자 복합체를 인지하고 그와 상호작용하지만, CD8 T 세포는 항원-클래스 Ⅰ MHC 분자 복합체를 인지하고 그와 상호작용한다. 추가 공통-자극 신호 및 변형 시토카인은 APC에 의해 생성되어, T 세포 활성화를 가져온다.
면역조절제( Immunomodulatory Agents )
[00232] 본 발명은 하나 이상의 면역조절제를 포함하는 백신 나노캐리어를 제공한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 면역조절제를 포함하는 본 발명의 나노캐리어는 백신으로서 사용된다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 분리된 및/또는 재조합 단백질 또는 펩티드, 탄수화물, 당단백질, 당펩티드, 프로테오글리칸, 비활성 유기체 및 바이러스, 죽은 유기체 및 바이러스, 유전자 변형 유기체 또는 바이러스, 및 세포 추출물을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 핵산, 탄수화물, 지질, 및/또는 소분자를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 면역 반응을 도출하는 작용제이다. 다른 실시예에서, 면역조절제는 단백질 또는 펩티드가 발현될 때 면역 반응이 도출되는 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 항원이다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 단백질 또는 펩티드이다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 백신에 사용된다.
[00233] 일부 실시예에서, 면역조절제는 임의의 단백질 및/또는 병원체로부터 유도된 다른 항원이다. 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물, 기생체 등일 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 보렐리아 종(Borrelia species), 탄저균(Bacillus anthracis), 보렐리아, 부르그도르페리(burgdorferi), 백일해균(Bordetella pertussis), 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejuni), 클라미디아 종(Chlamydia species), 클라미디아 시타시(Chlamydial psittaci), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydial trachomatis), 클로스트리듐 종(Clostridium species), 파상풍균(Clostridium tetani), 클로스트리듐 바툴리늠(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 콕시엘라 종(Coxiella species), 장구균 종(Enterococcus species), 엘리키아 종(Erlichia species), 대장균(Escherichia coli), 야토균(Francisella tularensis), 헤모필루스 종(Haemophilus species), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 헤모필루스 파라인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae), 유산균 종(Lactobacillus species), 레지오넬라 종(Legionella species), 레지오넬라 병(Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스(Leptospirosis interrogans), 리스테리아 종(Listeria species), 리스테리아모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 미코박테리움 종(Mycobacterium species), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 나병균(Mycobacterium leprae), 미코플라즈마 종(Mycoplasma species), 미코플라즈마 폐렴(Mycoplasma pneumoniae), 나이세리아 종(Neisseria species), 수막염(Neisseria meningitidis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 폐렴균 종(Pneumococcus species), 슈도모나스 종(Pseudomonas species), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 종(Salmonella species), 장티푸스 균(Salmonella typhi), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 리케차 종(Rickettsia species), 리케챠 리케츠시(Rickettsia ricketsii), 리케챠 티피(Rickettsia typhi), 시겔라 종(Shigella species), 포도상구균 종(Staphylococcus species), 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus), 연쇄상구균 종(Streptococcus species), 연쇄상구균 폐렴(Streptococccus pnuemoniae), 농화성 연쇄상구균(Streptococcus pyrogenes), 골저원성 연쇄상구균(Streptococcus mutans), 트레포네마 종(Treponema species), 매독 트레포네마(Treponema pallidum), 비브리오 시피시스(Vibrio species), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 예르시니아 페스트(Yersinia pestis)등과 같은 박테리아 유기체의 항원을 포함할 수 있다.
[00234] 일부 실시예에서, 면역조절제는 수두 바이러스, 천연두(바리올라), 에볼라 바이러스, 헤파드나바이러스(hepadnavirus), 마르부르그 바이러스(marburg virus), 뎅기열 바이러스, 인플루엔자 A 및 B, 파라인플루엔자, 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 홍역(measles)(홍역 바이러스), 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus: HIV), 인간 유두종바이러스(human papillomavirus: HPV), 수두대상포진(varicella-zoster), 단순포진(herpes simplex) 1 및 2, 거대세포바이러스(cytomegalovirus), 엡스테인-바(Epstein-Barr) 바이러스, JC 바이러스, 랍도바이러스(rhabdovirus), 로타바이러스(rotavirus), 리노바이러스(rhinovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus), 유두종바이러스, 파보바이러스(parvovirus), 피코르나바이러스(picornavirus), 소아마비바이러스(poliovirus), 유행성이하선염(mumps), 광견병(rabies), 레오바이러스(reovirus), 풍진(rubella), 토가바이러스(togavirus), 레트로바이러스(retrovirus), 콕삭키바이러스(coxsackieviruses), 마 뇌염(equine encephalitis), 일본 뇌염(Japanese encephalitis), 황열(yellow fever), 리프트 계곡 열(Rift Valley fever), A, B, C, D, E형 간염 바이러스(hepatitis A, B, C, D, E virus)등과 같은 바이러스성 유기체의 항원을 포함할 수 있다. 바이러스 유기체는 dsDNA 바이러스, ssDNA 바이러스, dsRNA 바이러스,(+) ssRNA 바이러스,(-) sRNA 바이러스, ssRNA-RT 바이러스, 및 dsDNA-RT 바이러스인 것들을 포함한다.
[00235] 일부 실시예에서, 면역조절제는 누룩곰팡이 종(Aspergillus species), 칸디다 종(Candida species), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 크립토코쿠스 종(Cryptococcus species), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 이질 아메바(Entamoeba histolytica), 스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), 레슈마니아 종(Leishmania speceis), 노카르디아 아스테로이드(Nocardia asteroides), 말라리아원충(Plasmodium falciparum), 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii), 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 톡소플라즈마 종(Toxoplasma species), 트리파노소마브루케이(Trypanosoma brucei), 만손주혈흡충(Schistosoma mansoni) 등과 같은 진균, 원생동물, 및/또는 기생에 유기체의 항원을 포함할 수 있다.
[00236] 일부 실시예에서, 면역조절제는 HCV의 E1 및/또는 E2 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 HIV의 gp120을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 혈구 응집소 및/또는 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다아제를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 폐렴구균 다당류(pneumococcal polysaccharide) 또는 폐렴(Streptococcus pneumoniae)의 패밀리 1 및/또는 2 PspA 또는 협막성 다당류 타입 5 및 8 또는 황색 포도상구균의 접착 기질 분자를 인지하는 미생물 표면 성분을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 칸디나 알비칸의 만난 또는 크립토코쿠스 네오포르만스의 크립토코쿠스 협막성 다당을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 악성 말라리아원충(Plasmodium falciparum)의 PfEMP1 또는 말리리아원충 감염 적혈 세포 상에 발현되는 기타의 기생동물 유도 항원 또는 톡소플라즈마 곤디의 GRA1을 포함할 수 있다.
[00237] 본 명세서에 기술되어 있는 항원들 중 임의의 항원은 완전히 죽은 유기체, 펩티드, 단백질, 당단백질, 당펩티드, 프로테오글리칸, 단백질이나 펩티드를 인코딩하는 핵산, 탄수화물, 소분자, 또는 이들의 조합물의 형태의 것일 수 있다.
[00238] 일부 실시예에서, 면역조절제는 적어도 하나의 백신이 이미 존재하는 미생물로부터 유도된다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 어떠한 백신도 진화되지 않은 미생물로부터 유도된다.
[00239] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 적어도 한 가지 타입의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어의 모든 면역조절제는 서로 동일하다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 다수의 상이한 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 모두가 동일한 다수의 개별적인 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 정확히 한 가지 타입의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 정확히 2개의 개별 타입의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 2개보다 많은 타입의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그보다 많은 개별 타입의 면역조절제를 포함한다.
[00240] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 단일 속의 미생물로부터 유도되는 두 가지 타입의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 단일 속 및 종의 미생물로부터 유도되는 두 가지 타입의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 단일 속, 종 및 균주의 미생물로부터 유도되는 두 가지 타입의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 단일 클론의 미생물로부터 유도되는 두 가지 타입의 면역조절제를 포함한다.
[00241] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 단일 속의 미생물로부터 유도되는 세 가지 이상의 타입의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 단일 속 및 종의 미생물로부터 유도되는 세 가지 이상의 타입의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 단일 속, 종 및 균주의 미생물로부터 유도되는 세 가지 이상의 타입의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 단일 클론의 미생물로부터 유도되는 세 가지 이상의 타입의 면역조절제를 포함한다.
[00242] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 단일 속의 미생물로부터 유도되는 두 가지 이상의 타입의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 단일 속 및 종의 미생물로부터 유도되는 두 가지 타입 이상의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 단일 속, 종 및 균주의 미생물로부터 유도되는 두 가지 타입 이상의 면역조절제를 포함한다.
[00243] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 단일 속의 미생물의 상이한 균주로부터 유도되는 두 가지 타입 이상의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 동일한 속의 미생물의 상이한 종으로부터 유도되는 두 가지 이상의 타입의 면역조절제를 포함한다. 다른 실시예에서, 백신 나노캐리어는 상이한 속의 미생물로부터 유도되는 두 가지 이상의 타입의 면역조절제를 포함ㅎ나다.
[00244] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 B 세포 및 T 세포에서 면역 응답을 자극하는 단일 타입의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 두 가지 타입의 면역조절제를 포함하는데, 여기서 제 1 면역조절제는 B 세포를 자극하고 제 2 타입의 면역조절제는 T 세포를 자극한다. 특정 실시예에서, 하나의 면역조절제 또는 양측의 면역조절제는 T 세포 및 B 세포를 자극할 수 있다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 세 가지 이상의 타입의 면역조절제를 포함하는데, 여기서 하나 이상의 타입의 면역조절제는 B 세포를 자극하는 하나 이상의 타입의 면역조절제는 T 세포를 자극한다.
[00245] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 백신 나노캐리어의 외측 표면과 연관된 적어도 하나의 타입의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 연관성은 공유성이다. 일부 실시예에서, 공유 연관성은 하나 이상의 링커에 의해 중재된다. 일부 실시예에서, 연관성은 비공유성이다. 일부 실시예에서, 연관성은 비공유성이다. 일부 실시예에서, 비공유 연관성은 전하 상호작용, 친화력 상호작용, 금속 배위, 물리적 흡착(adsorption), 호스트-게스트 상호작용, 소수성 상호작용, 겹침 상호작용, 수소 결합 상호작용, 반데르 발스(van der Waals) 상호작용, 자기적 상호작용, 정전 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 및/또는 이들의 조합이다. 면역조절제가 어떻게 백신 나노캐리어와 연관될 수 있는지에 대한 더욱 상세한 설명을 위해, "백신 나노캐리어의 생성(Production of Vaccine Nanocarriers)"이라는 제목의 아래 섹션을 참조하라.
[00246] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 지질 피막(예컨대, 지질이중층, 지질단일층 등)을 포함한다. 적어도 하나의 면역조절제는 지질 피막과 연관될 수 있다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 면역조절제는 지질 피막 내에 내장된다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 면역조절제는 지질이중층의 루멘 내에 내장된다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 지질 피막의 내측 표면과 연관되는 적어도 하나의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 면역조절제는 백신 나노캐리어의 지질 피막 내에서 캡슐화된다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 타입의 면역조절제는 백신 나노캐리어의 다수의 위치에 위치할 수 있다. 예를 들어, 제 1 타입의 면역조절제는 지질 피막 내에 내장될 수 있고, 제 2 타입의 면역조절제는 백신 나노캐리어의 지질 피막 내에 캡슐화될 수 있다. 다른 예를 제공하면, 제 1 타입의 면역조절제는 지질 피막의 외측 표면과 연관될 수 있고, 제 2 타입의 면역조절제는 백신 나노캐리어의 지질 피막의 내측 표면과 연관될 수 있다. 일부 실시예에서, 제 1 타입의 면역조절제는 백신 나노캐리어의 지질이중층의 루멘 내에 내장될 수 있고, 지질이중층은 백신 나노캐리어의 지질이중층의 푸멘 내에 내장될 수 있으며, 지질이중층은 제 2 타입의 면역조절제가 분포된 폴리머 매트릭스를 캡슐화할 수 있다. 일부 실시예에서, 제 1 타입의 면역조절제 및 제 2 타입의 면역조절제는 백신 나노캐리어의 동일 장소에 있을 수 있다(예컨대, 그들은 둘 다 백신 나노캐리어의 외측 포면과 연관될 수 있고, 백신 나노캐리어 내에 캡슐화될 수 있다.
[00247] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 중합체(예컨대, 중합체 코어)를 포함한다. 적어도 하나의 타입의 면역조절제는 중합체와 연관될 수 있다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 타입의 면역조절제는 중합체 내에 내장된다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 중합체의 내측 표면과 연관되는 적어도 하나의 타입의 면역조절제를 포함한다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 타입의 면역조절제는 백신 나노캐리어의 중합체로 캡슐화된다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 면역조절제는 백신 나노캐리어의 다수의 위치에 위치할 수 있다. 예를 들어, 제 1 타입의 면역조절제는 중합체 내에 내장될 수 있고, 제 2 타입의 면역조절제는 백신 나노캐리어의 중합체 코어를 둘러싸는 지질 피막 내에 캡슐화될 수 있다. 다른 예를 제공하자면, 제 1 타입의 면역조절제는 중합체의 외측 표면과 연관될 수 있고, 제 2 타입의 면역조절제는 백신 나노캐리어의 중합체 내애 내장될 수 있다.
[00248] 당업자는 선행 예시들이 다수의 면역조절제가 백신 나노캐리어의 다수의 장소와 연관될 수 있는 많은 여러 가지 방법들을 대표할 뿐이라는 것을 알 것이다. 다수의 면역조절제는 백신 나노캐리어의 장소들의 임의의 조합에 위치할 수 있다. 또한, 전술한 예시는 나노캐리어의 다른 작용제(예컨대, 면역조절제)에도 적용될 수 있다.
[00249] 일부 실시예에서, 면역조절제는 T 세포 항원이고, T 세포 항원은 백신이 이용되는 동일한 병원체로부터 유도된다. 이 경우, 초기의 적은 수의 나이브 T 세포는 병원체-특정 효과기 및 기억 T 세포를 생성하도록 자극된다. 일부 실시예에서, 항원은 널리 확산된 불순물이 존재하는 감염원(infectious agent)과 같은 무관한 소스(예컨대, 파상풍 톡소이드 또는 혈구응집소, 뉴라미니다아제와 같은 인플루엔자 바이러스의 공통 성분, 또는 핵단백질)로부터 취해질 수 있다. 후자의 경우, 백신은 사전 감염 또는 백신접종에 응답하여 발생한 기억 T 세포의 존재를 이용한다. 기억 세포는 일반적으로 항원 재공격(rechallenge)에 대해 더욱 신속하고 강격하게 반응하며, 그에 따라 B 세포에게 우수한 조력원을 제공할 수 있다.
[00250] 그 밖의 T 세포 항원은 퇴행성 질병 하원, 감염성 질병 항원, 암 항원, 동종 항원, 아토피성 질병 항원, 자가면역 질병 항원, 접촉 증감제, 합텐, 이종 항원, 또는 대사성 질병 효소 또는 이것의 효소 생성물을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, 감염성 질병 항원은 본 명세서에서 기술되는 바이러스들 중 임의의 것으로부터 유도되는 임의의 항원을 포함하는 바이러스 항원이다. T 세포 항원의 예시는 본 명세서의 다른 곳에서 제공되는 것들을 포함한다.
[00251] 일부 실시예에서, T 세포 항원은 손상되지 않은 단백질로서 나노캐리어 내에 통합된다. 일부 실시예에서, T 세포 항원은 변형 단백질로서 나노캐리어 내에 통합된다. 일부 실시예에서, T 세포 항원은 돌연변이 단백질로서 나노캐리어 내에 통합된다. 일부 실시예에서, T 세포 항원은 MHC 클래스 Ⅱ 화합물 내로의 항원 통합을 급증시키고 그에 따라 조력자 반응을 더욱 촉진시킬 수 있는 중첩 펩티드의 콜렉션으로서 제공된다. 일부 실시예에서, T 세포 항원은 MHC 클래스 Ⅱ 화합물 내로의 항원 통합을 급증시키고 그에 따라 조력자 반응을 더욱 촉진시킬 수 있는 비중첩 펩티드의 콜렉션으로서 제공된다. 일부 실시예에서, T 세포 항원은 항원을 인코딩하는 핵산으로서 제공된다.
[00252] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어와 같은 본 발명의 나노캐리어는 90% 미만의 질량, 75% 미만의 질량, 50% 미만의 질량, 40% 미만의 질량, 30% 미만의 질량, 20% 미만의 질량, 15% 미만의 질량, 10% 미만의 질량, 5% 미만의 질량, 1% 미만의 질량, 0.5% 미만의 질량의 면역조절제를 포함한다.
Targeting Moieties(표적화 모이어티 )
[00253] 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어는 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 나노캐리어는 하나 이상의 표적화 모이어티와 연관된다. 표적화 모이어티는 기관, 조직, 세포, 세포 밖 기질, 및/또는 세포 이하 장소에 결합되는 임의의 모이어티이다. 일부 실시예에서, 이러한 성분은 "표적" 또는 "마커"라고 지칭되며, 이들은 아래에서 더욱 상세히 설명된다.
[00254] 표적화 모이어티는 핵산, 폴리펩티드, 당단백질, 탄수화물, 지질, 소분자 등일 수 있다. 예를 들어, 표적화 모이어티는 세포 타입 특이적 마커와 결합하는 핵산 표적화 모이어티(예컨대, 앱타머, Spiegelmer® 등)일 수 있다. 일반적으로, 앱타머는 폴리펩티드와 같은 특정 표적에 결합하는 올리고뉴클레오티드(예컨대, DNA, RNA, 또는 이들의 유사체 또는 유도체)이다. 일부 실시예에서, 표적화 모이어티는 세포 표면 수용체를 위한 자연 발생 또는 합성 리간드, 예컨대 성장 인자, 호르몬, LDL, 트랜스페린(transferrin) 등일 수 있다. 표적화 모이어티는 항원 파편, 항원의 특성 부분, 단일 사슬 항체 등을 포함하는 것으로 의도되는 관계의 항체일 수 있다. Affibody®, Nanobody®, AdNectin®, Avimer® 등과 같은 합성 결합 단백질이 사용될 수 있다. 펩티드 표적화 모이어티는, 예컨대 파지 디스플레이와 같은 절차를 이용하여 식별될 수 있다. 이와 같이 널리 사용되는 기술은 다양한 여러 가지 세포 타입에 대한 세포 특정 리간드를 식별하는 데 사용되어 왔다.
[00255] 본 발명에 따르면, 표적화 모이어티는 특정 기관, 조직, 세포, 및/또는 세포이하 장소와 연관된 하나 이상의 "표적" 또는 "마커"를 인지한다. 일부 실시예에서, 표적은 하나 또는 몇 개의 세포 타입, 하나 또는 소수의 질병, 및/또는 하나 또는 소수의 진화 단계와 배타적으로 또는 주로 연관된 마커일 수 있다. 세포 타입 특이적 마커는 일반적으로, 예를 들어 대략적으로 동일한 양(예컨대, 대략적으로 동일한 수의 세포, 대략적으로 동일한 부피의 세포, 대략적으로 동일한 질량의 세포 등)의 세포를 포함하는 혼합물로 구성되는 세포 기준 집단에서보다 그 세포 타입에서 적어도 2겹이 더 큰 레벨로 발현된다. 일부 실시예에서, 세포 타입 특이적 마커는 기준 집단에서 그것의 평균 발현보다 적어도 3겹, 적어도 4겹, 적어도 5겹, 적어도 6겹, 적어도 7겹, 적어도 8겹, 적어도 9겹, 적어도 10겹, 적어도 50겹, 적어도 100겹, 적어도 500겹, 적어도 1000겹, 적어도 5000겹이 더 큰 레벨로 제공된다. 세포 타입 특이적 마커의 검출 또는 측정은 관심 세포 타입 또는 타입들을 많은 또는 대부분의 또는 모든 그 밖의 타입과 구별하게 할 수 있다.
[00256] 일부 실시예에서, 표적은 단백질, 탄수화물, 지질, 및/또는 핵산을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 표적은 단백질 및/또는 이것의 종양-마커, 인테그린(integrin), 세포 표면 수납체, 막관통 단백질(transmembrane protein), 세포간 단백질(intercellular protein), 이온 채널, 막수송 단백질(membrane transporter protein), 효소, 항체, 키메라 단백질(chimeric protein), 당단백질 등과 같은 특성 부분을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 표적은 탄수화물 및/또는 이것의 당단백질, 당류(예컨대, 단당류, 이당류(disaccharide), 다당류), 당질피질(즉, 대부분의 진핵 세포의 외측 표면 상의 탄수화물-리치 주변 지역) 등과 같은 특성 부분을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 표적은 지질 및/또는 이것은 오일, 지방산, 글리세라이드, 호르몬, 스테로이드(예컨대, 콜레스테롤, 담즙산(bile acid), 비타민(예컨대, 비타민 E), 인지질, 스핑고지질(sphingolipid), 리포단백질 등과 같은 특성 부분을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 표적은 핵산 및/또는 이것은 DNA 핵산; RNA 핵산; 변형 DAN 핵산; 변형 RNA 핵산; DNA, RNA, 변형 DNA 및 변형 RNA의 임의의 조합을 포함하는 핵산; 등과 같은 특성 부분을 포함할 수 있다.
[00257] 일부 실시예에서, 표적화 모이어티는 VSV로부터의 표면 당단백질 분자일 수 있다. VSV는 톨 유사 수용체 효현제(toll-like receptor agonist)인 단일 표면 분자 VSV-G를 포함할 수 있다. VSV는 면역계의 세포에 효율적으로 표적화되며, 따라서, 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 백신 나노캐리어를 면역계의 세포에 표적화하도록 하기 위해 VSV 표면 분자를 포함할 수 있다.
[00258] 일부 실시예에서, 표적은 종양 마커이다. 일부 실시예에서, 종양 마커는 악성 세포에 발현되지만, 건강하고 및/또는 정상적인 세포에는 발현되지 않는 항원이다. 일부 실시예에서, 종양 마커는 건강하고 및/또는 정상적인 세포에서보다 종양 세포에서 더욱 널리 퍼지는 항원이다. 예시적인 종양 마커는 gp100; 멜란-A; 티로시나제; PSMA; HER-2/neu; MUC-I; 토포이소메라제 Ⅱα; 시알릴-Tn; 발암배아성 항원(carcinoembryonic antigen); ErbB-3-결합 단백질-1; 알파-페토단백질; 및 암-테스티스 항원 MAGE-A1 , MAGE A4, 및 NY-ESO-I을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다.
[00259] 일부 실시예에서, 표적은 APC 마커이다. 일부 실시예에서, APC 표적은 APC에서 발현되지만 비-APC에서는 발현되지 않는 항원이다. 일부 실시예에서, APC 표적은 비-APC에서보다는 APC에서 더욱 널리 퍼지는항원이다. 예시적인 APC 마커는 CD11c, CD11b, CD14, CD40, CD45, CD163, CD169(시알로헤신), DEC205(CD205), MHC 클래스 II, DC-SIGN, CD21/CD35, 및 FcγRI, PD-L2를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, APC 마커는 DC 및/또는 매크로파지 마커 중 임의의 것을 포함하며, 이들의 예는 본 명세서에서 설명된다.
[00260] 특정 실시예에서, 표적은 DC 마커이다. 일부 실시예에서, DC 마커는 DC에서 발현되지만 비-DC에서는 발현되지 않는 항원이다. 일부 실시예에서, DC 표적은 비-DC에서보다 DC에서 보다 널리 퍼지는 항원이다. 예시적인 DC 마커는 "소포성 세포"라는 제목의 아래 섹션에서 설명되며, 본 명세서의 다른 곳에서 제공되는 것들을 포함한다.
[00261] 특정 실시예에서, 표적은 T 세포 마커이다. 일부 실시예에서, T 세포 표적은 T 세포에서 발현되지만 비-T 세포에서는 발현되지 않는 항원이다. 일부 실시예에서, T 세포 표적은 비-T 세포에서보다 T 세포에서 보다 널리 퍼지는 항원이다. 예시적인 T 세포 마커는 "T 세포 표적화 모이어티"라는 제목의 아래 섹션에서 설명되며 본 명세서의 다른 곳에서 제공되는 것들을 포함한다.
[00262] 일부 실시예에서, 표적은 바람직하게는 특정 세포 타입에서 발현된다. 예를 들어, APC, DC, 및/또 T 세포 내의 APC, DC, 및/또는 T 세포 표적은 기준 집단에 대해 APC, DC, 및/또는 T 세포에서 과도발현된 적어도 2겹, 적어도 3겹, 적어도 4겹, 적어도 5겹, 적어도 10겹, 적어도 20겹, 적어도 50겹, 적어도 100겹, 적어도 500겹 또는 적어도 1000겹이다. 일부 실시예에서, 기준 집단은 비-APC, FDC, 및/또는 T 세포를 포함할 수 있다.
[00263] 일부 실시예에서, 활성화된 APC, DC, 및/또는 T 세포내의 APC, DC, 및/또는 T 세포 표적의 발현은 기준 집단에 대해 활성화된 APC, DC, 및/또는 T 세포에서 적어도 2겹, 적어도 3겹, 적어도 4겹, 적어도 5겹, 적어도 10겹, 적어도 20겹, 적어도 50겹, 적어도 100겹, 적어도 500겹, 적어도 1000겹이 과도 발현된다. 일부 실시예에서, 기준 집단은 비활성화된 APC, DC, 및/또는 T 세포를 포함할 수 있다.
[00264] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어와 같은 본 발명의 나노캐리어는 50% 미만의 질량, 40% 미만의 질량, 30% 미만의 질량, 20% 미만의 질량, 15% 미만의 질량, 10% 미만의 질량, 5% 미만의 질량, 1% 미만의 질량, 0.5% 미만의 질량의 표적화 모이어티를 포함한다.
[00265] 일부 실시예에서, 표적화 모이어터는 나노캐리어와 공유로 연관된다. 일부 실시예에서, 공유 연관성은 링커에 의해 중재된다. 일부 실시예에서 표적화 모이어터는 나노캐리어와 비공유성로 연관된다. 예를 들어, 표적화 모이어티는 본 발명의 입자의 폴리머 매트릭스(polymeric matrix)의 표면과 결합될 수도 있고, 그 안에 캡슐화될 수도 있으며, 그 것에 의해 둘러싸일 수도 있고, 및/또는 그 전반에 분포될 수도 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서 표적화 모이어티는 나노캐리어의 백신 나노캐리어의 리포솜 막(liposomal membrane) 및/또는 폴리머 매트릭스(polymeric matrix) 내에 캡슐화될 수도 있으며, 그들에 의해 둘러싸일 수도 있고, 및/또는 그들 전반에 분포될 수도 있다. 대안으로 또는 추가로, 표적화 모이어티는 결합은 전하 상호작용, 친화력 상호작용, 금속 배위결합(metal coordination), 물리 흡착(physical adsorption), 호스트-게스트 상호작용(host-guest interactions), 소수성 상호작용(hydrophobic interactions), TT 스택킹 상호작용(TT stacking interactions), 수소 결합 상호작용, 반데르 발스(van der Waals) 상호작용, 자기적 상호작용, 정전 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용 및/또는 그들의 결합에 의해 나노캐리어와 연관될 수 있다. 표적화 모이어터의 연관은 "백신 나노캐리어의 생산"라는 제목의 섹션에서 더욱 상세히 설명된다.
[00266] 수지상 세포
[00267] 수지상 세포(DCS)는 일종의 골수성 백혈구로서, 이들은 가장 강한 T 백혈구 항원 제시 세포 중에 있다. 나머지 수지상 세포는 림프절과 같은 많은 조직에 미성숙한 면역관용성 상태로 살고 있는 것으로, 다시 말해, 수지상 세포는 공동촉진 분자(costimulatory molecules)가 거의 없이 또는 전혀 없이 그리고 T 세포가 주효 세포로 상이하게 변하는데 필요한 시토카인 분비없이 중간 내지 높은 레벨의 펩티드-MHC 복합체를 제공한다. 미성숙한 수지상 세포에 의해 특정 항원을 제공받는 T 세포는 며칠 내에 확산되기 시작하나, 세포소멸에 의해 죽거나 추가 활동에 반응하지 않게 된다. 특정 항원 T 세포 반응들의 이후에 따른 감소는 숙주가 선택적으로 항원에 내성을 띄게 만든다. 대조적으로, 수지상 세포는 성숙 자극(maturation stimuli)에 노출되는 동안 항원을 획득할 때 순식간에 MHC 및 공동촉진 분자를 기학급수적으로 증가시키며 여러 개의 시토카인을 분비한다. 현재의 성숙한 DC는 효과기 T 세포와 면역 기억의 강력한 유도자이다. 수지상 세포 성숙은 많은 신호, 예컨대, 염증 유발 시토카인, DC 발현 CD40의 결합, TLR 효현제,(예컨대, 박테리아 엔도톡신), 면역 복합체, 활성화된 보체, 괴사 세포, 자살 세포, 자유 요산(free urate), 요산 결정(urate crystals), 및/또는 HMGB-I 등에 의해 유도될 수 있다.
[00268] DEC-205(예컨대, CD205)는 선택적으로 수지상 세포의 표면과 림프 세포 내의 흉선 상피 세포에서 선택적으로 발현되는 표면 발현 다기능 렉틴이다. 피하 주입 키메라 α-DEC-205 단일클론성 항체를 갖는 세포내실험은 DEC-205에 결합한 리간드가 효율적인 내재화와, 마우스 및 인간 양측에서의 MHC 분자에 제공하기 위한 흡수 물질의 후속 처리를 유도한다(Hawiger 등, 2001, J. Exp. Med. 194:769; Bonifaz 등, 2002, J. Exp. Med., 196:1627; 및 Bozzacco 등, 2007, Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 104:1289; 이들은 각각 본 명세서에 참고로 포함된다). 피내 또는 상피에 주입 시, 키메라 항체는 임파관를 통해 배출 림프절에 수송되어 상주 수지상 세포와 결합하여, 수지상 세포의 성숙을 야기하는 일 없이 나머지 수지상 세포에 대한 항원을 표적화하는 수단을 제공한다. 표적화된 수지상 세포는 T 세포가 상기 제공된 항원에 면역성 대신에 내성을 갖도록 유도한다. 그러나 DEC-205가 DC 숙성을 유도하는 면역자극제와 함께 표적화될 때(예컨대, α-CD40 또는 DC가 발현된 TLR의 하나 이상의 리간드; "면역자극제"라는 제목의 섹션에서 더욱 상세히 설명된다), 백신은 우선적으로 세포 독성 및 Th1 타입 효과기 T 세포 반응을 촉진하는 강력한 면역자극제로 활동한다.
[00269] 수지상 세포 표적화는 DC-205, CD11c, class II MHC, CD80, CD86, DC-SIGN, CD11b, BDCA-I, BDCA-2, BDCA-4, Siglec-H, CX3CR1, 및/또는 랑게린을 결합하는 모이어티에 의해 수행될 수 있다.
[00270] 일부 실시예에서, DC 표적화는 DC(즉, DC 마커) 상에 현저하게 발현 및/또는 제공되는 임의의 실재(예컨대, 단백질, 지질, 탄수화물, 소분자 등)에 특정하게 결합하는 임의의 표적화 모이어티에 의해 달성될 수 있다. 예시적인 DC 마커는 CD1a(R4, T6, HTA-I); CD1b(Rl); CD1c(M241, R7); CD1d(R3); CD1e(R2); CD11b(αM 인테그린 사슬, CR3, Mo1, C3niR, Mac-1); CD111c(αX 인테그린, p150, 95, AXb2); CDw117(락토실세라미드, 락세르); CD19(B4); CD33(gp67); CD 35(CR1, C3b/C4b 수용체); CD 36(GpIIIb, GPIV, PASIV); CD39(ATP탈수소효소, NTP탈수소효소-1); CD40(Bp50); CD45(LCA, T200, B220, Ly5); CD45RA; CD45RB; CD45RC; CD45RO(UCHL-I); CD49d(VLA-4α, α4 인테그린); CD49e(VLA-5α, α5 인테그린); CD58(LF A-3); CD64(FcγRI); CD72(Ly-19.2, Ly-32.2, Lyb-2); CD73(엑토-5' 뉴클로티클라제); CD74(Ii, 불변 사슬); CD80(B7, B7-1, BB1); CD81(TAPA-I); CD83(HB15); CD85a(ILT5, LIR3, HL9); CD85d(ILT4, LIR2, MIRlO); CD85j(ILT2, LIRl, MIR7); CD85k(ILT3, LIR5, HM18); CD86(B7-2/B70); CD88(C5aB); CD97(BL-KDD/F12); CDlOl(IGSF2, P126, V7); CDl 16(GM-CSFRα); CD120a(TMFRI, p55); CD120b(TNFRII, p75, TNFR p80); CD123(IL-3Rα); CD139; CD148(HPTP-η, p260, DEP-1); CD150(SLAM, IPO-3); CD156b(TACE, ADAM17, cSVP); CD157(Mo5, BST-I); CD 167a(DDRl, trkE, cak); CD 168(RHAMM, IHABP, HMMR); CD 169(시알로드헤신, 시그렉(Signlec)-1); CD 170(시그렉-5); CD 171(LlCAM, NILE); CD 172(SIRP- lα, MyD-I); CD 172b(SIRPβ); CD 180(RP 105, Bgp95, Ly64); CD 184(CXCR4, NPY3R); CD 193(CCR3); CD 196(CCR6); CD197(CCR7(ws CDwl97)); CDwl97(CCR7, EBIl, BLR2); CD200(0X2); CD205(DEC-205); CD206(MMR); CD207(랑게린(Langerin)); CD208(DC-LAMP); CD209(DC-SIGN); CDw218a(IL18Rα); CDw218b(IL8Rβ); CD227(MUCl, PUM, PEM, EMA); CD230(Prion Protein(PrP)); CD252(OX40L, TNF(리간드) 상과(superfamily), 멤버 4); CD258(LIGHT, TNF(리간드) 상과, 멤버 14); CD265(TRANCE-R, TNF-R superfamily, 멤버 Ha); CD271(NGFR, p75, TNFR superfamily, 멤버 16); CD273(B7DC, PDL2); CD274(B7H1, PDLl); CD275(B7H2, ICOSL); CD276(B7H3); CD277(BT3.1, B7 상과: Butyrophilin 3); CD283(TLR3, 톨-유사 수용체 3); CD289(TLR9, 톨-유사 수용체 9); CD295(LEPR); CD298(ATP 1B3, Na K ATPase β3 submit); CD300a(CMRF-35H); CD300c(CMRF-35A); CD301(MGLl, CLECSF14); CD302(DCLl); CD303(BDCA2); CD304(BDCA4); CD312(EMR2); CD317(BST2); CD319(CRACC, SLAMF7); CD320(8D6); 및 CD68(gpl 10, 매크로시알린(Macrosialin)); 클래스 II MHC; BDCA-1; 시그렉-H; 를 포함하지만, 여기에 한정되지 않으며, 여기서 괄호 안에 열거된 명칭은 대안의 명칭을 나타낸다.
[00271] T 세포 표적화 모이어티(T Cell Targeting Moieties)
[00272] 일부 실시예에서, T 세포 표적화는 T 세포(즉, T 세포 마커) 상에 현저하게 발현 및/또는 제공되는 임의의 실재(예컨대, 단백질, 지질, 탄수화물, 소분자 등)에 특정하게 결합하는 임의의 표적화 모이어티에 의해 달성될 수 있다. 예시적인 T 세포 마커는 CD2(E-로세트(rosette) R, T11, LFA-2); CD3(T3); CD3α; CD3β; CD3ε; CD4(L3T4, W3/25, T4); CD5(T1, Tp67, Leu-1, LY-I); CD6(T12); CD7(gp40, Leu 9); CD8a(Leu2, T8, Lyt2,3); CD8b(CD8, Leu2, Lyt3); CD11a(LFA-lα, α 인테그린 사슬); CD11b(αM 인테그린 사슬, CR3, Mo1, C3niR, Mac-1); CD11c(αX 인테그린, p150, 95, AXb2); CD15s(시알릴 루이스 X); CD15u(3' 술포 루이스 X); CD15su(6 술포-시알릴 루이스 X); CD 16b(FcgRlllb); CDw 17(락토실세라미드, 락세르); CD 18(인테그린 β2 CD11a, b, c β-아단위); CD26(DPP IV 엑토에넴(Ectoeneyme), ADA 결합 단백질); CD27(T14, S152); CD28(Tp44, T44); CD29(혈소판 GPUa, β-1 인테그린, GP); CD31(PECAM-I, 엔도캄(Endocam)); CD35(CR1, C3b/C4b 수용체); CD37(gp52-40); CD38(ADP-리보실/시클라제, T10); CD43(시알로포린, 류코시알린); CD44(ECMRII, H-CAM, Pgp-1); CD45(LCA, T200, B220, Ly5); CD45RA(p561ck, p59fyn, Src 키나아제); CD45RB(p561ck, p59fyn, Src 키나아제); CD45RC(p561ck, p59fyn, Src 키나아제); CD46(MCP); CD47(gp42, IAP, OA3, 뉴로필린(Neurophillin)); CD47R(MEM-133); CD48(블라스트-1, 휴림(Hulym)3, BCM-I, OX- 45); CD49c(VLA-3α, α3 인테그린); CD49d(VLA-4α, α4 인테그린); CD49e(VLA-5α, α5 인테그린); CD49f(VLA-6α, α6 인테그린 gplc); CD50(ICAM-3); CD52(CAMPATH-I, HES); CD53(OX-44); CD54(ICAM-I); CD55(DAF); CD56(Leu-19, NKH-I, NCAM); CD57(HNKl, Leu-7); CD58(LFA-3); CD59(lF5Ag, H19, 방어, MACIF, MIRL, P-18); CD60a(GD3); CD60b(9-O-아세틸 GD3); CD60c(7-0 아세틸 GD3); CD62L(L-세렉틴, LAM-I, LECAM-I, MEL-14, Leu8, TQ1); CD73(엑토-5'-뉴클로티다아제); CD75(시알로-마스크 락토사민); CD75S(α2, 6 시알리레이티드 락토사민); CD81(TAPA-I); CD82(4F9, C33, IA-4, KAI1, R2); CD84(P75, GR6); CD85a(ILT5, LIR3, HL9); CD85J(ILT2, LIR1, MIR7); CD87(uPAR); CDw92(p70); CD94(Kp43); CD95(APO-I, FAS, TNFRSF6); CD98(4F2, FRP-I, RL-388); CD99(MIC2, E2); CD99R(CD99 Mab 제한); CD100(SEMA4D); CD 102(ICAM-2); CD 108(SEMA7A, JMH 혈액형 항원); CDw119(IFNγR, IFNγRa); CD120a(TNFRI, p55); CD120b(TNFRII, p75, TNFR p80); CD121a(타입 1 IL-IR); CD121b(타입 2 IL-IR); CD122(IL2Rβ); CD124(IL-4Rα); CD126(IL- 6Rα); CD 127(p90, IL-7R, IL-7Rα); CD 128a(IL-8Ra, CXCR1,(CD181으로 잠정적으로 재명명됨)); CD128b(IL-8Rb, CXCR2,(CD182로 잠정적으로 재명명됨)); CD130(gp130); CD132(공통 γ 사슬, IL-2Rγ); CD147(바시긴(Basigin), EMMPRIN, M6, 0X47); CD148(HPTP-η, p260, DEP-I); CD150(SLAM, IPO-3); CD153(CD3OL, TNSF8); CD156b(TACE, ADAM17, cSVP); CD158a(KIR2DL1, p58.1); CD158b1(KIR2DL2, p58.2); CD158b2(KIR2DL3, p58.3); CD158c(KIR2DS6, KIRX); CD158e1/e2(KIR3DLI/S1, p70); CD159F(KIR2DL5); CD158g(KIR2DS5); CD158h(KIR2DS1, p50.1); CD158i(KIR2DS4, p50.3); CD158J(KIR2DS2, p50.2); CCD158k(KIR3DL2, p140); CD159a(NKG2A); CD160(BY55, NK1, NK28); CD161(NKR, NKRP1A); CD162(PSGL-I); CD164(MGC-24, MUC-24); CD171(L1CAM, NILE); CD172g(SIRPg); CD181(CXCR1,(이전에 CD128a로 알려짐)); CD182(CXCR2,(이전에 CD128b로 알려짐)); CD183(CXCR3, GPR9); CD 184(CXCR4, NPY3R); CD 185(CXCR5); CD 186(CXCR6); CD191(CCRl); CD 192(CCR2); CD 193(CCR3); CD 195(CCR5); CD 196(CCR6); CD 197(CCR7(CDw197이었음)); CDw197(CCR7, EBIl, BLR2); CDw198(CCR8); CDw199(CCR9); CD205(DEC-205); CDw210(CK); CDw217(CK); CDw218a(IL18Rα); CDw218b(IL18Rβ); CD220(인슐린 R); CD221(IGFl R); CD222(M6P-R, IGFII-R); CD223(LAG-3); CD224(GGT); CD225(Leu 13); CD226(DNAM-I, PTAl); CD229(Ly9); CD230(프리콘 단백질(PrP)); CD244(2B4, P38, NAIL); CD245(p220/240); CD247(CD3 제타 사슬); CD261(TRAIL-R1, TNF-R 상과, member 10a); CD262(TRAIL-R2, TNF-R 상과, member 10b); CD263(TRAIL-R3, TNF-R 상과, 멤버 10c); CD264(TRAIL-R4, TNF-R 상과, 멤버 10d); CD265(TRANCE-R, TNF-R 상과, 멤버 Ha); CD268(BAFFR, TNF-R 상과, 멤버 13C); CD272(BTLA); CD275(B7H2, ICOSL); CD277(BT3.1, B7과: 부티로필린 3); CD294(CRTH2, PGRD2, G 단백질 결합 수용체 44); CD295(LEPR); CD296(ART1, ADP-리보실 전달효소(ribosyltransferase) 1); CD298(ATP1B3, Na K ATPase β3 아단위); CD300a(CMRF-35H); CD300c(CMRF-35A); CD305(LAIR1); CD314(NKG2D); CD316(EW12); CD317(BST2); CD319(CRACC, SLAMF7); CD321(JAMl); CD322(JAM2); CDw328(시그렉7); and CD68(gp 110, 매크로시알린)를 포함하지만 여기에 한정되지 않으며, 여기서 괄호 안에 열거된 명칭은 대안의 명칭을 나타낸다.
[00273] 일부 실시예에서, T 세포 조직화는 활성화 시(즉, 활성화된 T 세포 표적)에 T 세포 상에서 현저하게 발현 및/또는 제공되는 임의의 실재(예컨대, 단백질, 지질, 탄수화물, 소분자 등)에 특정하게 결합하는 것과 같이 결합하는 임의의 표적화 모이어티에 의해 달성될 수 있다. 예시적인 활성화된 T 세포 표적화 모이어티는 CD1a(RA, T6, HTA-I); CD1b(R1); Cd1c(M241.R7); CD1d(R3); CD9(p24, DRAP-I, MRP-I); CD25(Tac 항원, IL-2Rα, p55); CD30(Ber-H2, Ki-I); CD39(ATP탈수소효소, NT탈수소효소-1); CD45RO(UCHL-I); CD49a(VLA-1α, α1 인테그린); CD49b(VLA-2α, gpla, α2 인테그린); CD69(AIM, EA 1, MLR3, gp34/28, VEA); CD70(Ki-24, CD27 리간드); CD74(Ii, 불변 사슬); CD80(B7, B7-1, BB1); CD86(B7-2/B70); CD96(촉각(TACTILE)); CD97(BL-KDD/F12); CD101(IGSF2, P 126, V7); CD 103(HML-I, 인테그린 αE, ITGAE); CD 107a(LAMP-I); CD 107b(LAMP-2); CD 109(8A3, E123 7D1); CD134(OX40, TNFRSF4); CDw137(4-1BB, ILA); CD146(Muc 18, S-엔도, MCAM, Mel-CAM); CD 152(CTLA-4); CD 154(CD40L, gp39, TRAP-I, T-BAM); CD 166(ALCAM, KG-CAM, SC-I, BEN, DM-GRASP); CD 178(Fas 리간드); CD227(MUCl, PUM, PEM, EMA); CD253(TRAIL, TNF(리간드) 상과, 멤버 10); CD254(TRANCE, RANKL, TNF(리간드) 상과, 멤버 11); CD258(LIGHT, TMF(리간드) 상과, 멤버 14); CD267(TACI, TNF-R 상과, 멤버 13B); CD273(B7DC, PDL2); CD274(B7H1, PDL1); CD278(ICOS); CD279(PD1); 및 CD312(EMR2)을 포함하지만 여기에 한정되지 않으며, 여기서 괄호 안에 열거된 명칭은 대안의 명칭을 나타낸다.
[00274] 표적화 모이어티의 분자 특성( Molecular Characteristics of Targeting Moieties )
[00275] 핵산 표적화 모이어티. 본 명세서에서 사용된 "핵산 표적화 모이어티"는 표적에 선택적으로 결합된 핵산이다. 일부 실시예에서, 핵산 표적화 모이어는 핵산 앱타머이다. 앱타머는 통상적으로 특정 기관, 조직, 세포, 세포외 기질 성분, 및/또는 세포이하 장소와 연관된 특정 표적 구조에 결합된 폴리뉴클레오티드이다. 일반적으로, 앱타머의 표적 기능은 앱타머의 삼차원 구조를 기본으로 한다. 일부 실시예에서, 표적과 앱타머의 결합은 통상 앱타머와 표적 양쪽 모두의 이차원 및/또는 삼차원 구조 사이에서의 상호작용에 의해 매개된다. 일부 실시예에서, 표적과 앱타머의 결합은 앱타머의 초기 배열에만 의존하는 것이 아니라 앱타머 및/또는 표적의 삼차원 구조에 의존한다. 일부 실시예에서, 앱타머는 염기 쌍(base pairing)을 파괴하는 구조(예컨대, 머리핀 루프)에 의해 저지되는 보체 Watson-Crick 염기 쌍을 통해 그들의 표적과 결합한다.
[00276] 일부 실시예에서, 핵산 표적화 모이어티는 Spiegelmer®이다. 일반적으로, Spiegelmer®는 D-올리고뉴클레오티드와 비교하여 효소 분해(enzymatic degradation)에 높은 내성을 보이는 높은 친화력의 L-거울상체 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시예에서, Spiegelmer®는 앱타머가 설계되고 이용될 때에만 설계되고 이용될 수 있다.
[00277] 당업자는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 표적에 특정하게 결합할 수 있는 임의의 핵산이 본 발명에 따라 사용될 수 있음을 알 것이다.
[00278](아래에서 더욱 상세히 설명되는, 전달될 핵산 표적화 모이어티 및/또는 기능성 RNAs, 예컨대, RNAi 작용제, 리보자임, tRNA 등을 포함하는) 본 발명의 핵산은 화학적 합성, 효소적 합성, 보다 긴 전구체의 효소 또는 화학적 분열 등을 포함하지만 여기에 한정되니 않는 임의의 이요가능한 기술에 따라 마련될 수 있다. RNA를 합성하는 방법은 본 기술 분야에 알려져 있다(예컨대, Gait, M.J.(ed.) Oligonucleotide synthesis: a practical approach, Oxford [Oxfordshire] , Washington, DC: IRL Press, 1984; 및 Herdewijn, P.(ed.) Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in molecular biology, v. 288(Clifton, N.J.) Totowa, N.J.: Humana Press, 2000를 참조하라. 이 두 가지 문헌은 본 명세서에 참고로 포함된다).
[00279] 핵산 표적화 모이어티를 형성하는 핵산은 자연 발생 뉴클레오시드, 변형 뉴클레오시드, 하나 이상의 뉴클레오시드들 사이에 삽입되는 하이드로카본 링커(예컨대, 알킬렌) 또는 폴리에테르 링커(예컨대, PEG 링커)를 갖는 자연 발생 뉴클레오시드, 하나 이상의 뉴클레오시드들 사이에 삽입되는 하이드로카본 또는 PEG 링커를 갖는 변형 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 이부 실시예에서, 핵산 표적화 모이어티의 뉴클레오시드 또는 변형 뉴클레오시드는 핵산 표적화 모이어티의 친화력과 선택도를 결합한 것이 치환에 의해 실질적으로 감소하지 않는다(예컨대, 표적에 대한 핵산 표적화 모이어티의 해리상수는 약 1x10-3M보다 커서는 안 된다)면 하이드로카본 링커 또는 폴리에테르 링커로 대체될 수 있다.
[00280] 당업자는 본 발명에 따른 핵산이 자연 발생 핵산에서 발견되는 타입의 뉴클레오티드를 완전히 포함할 수 있고, 또는 그 대신에 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함하거나 자연 발생 핵산과는 상이한 구조를 가질 수 있다는 것을 알 것이다. 미국 특허 문헌 제6,403,779, 6,399,754, 6,225,460, 6,127,533, 6,031,086, 6,005,087, 5,977,089호는 이용될 수 있는 광범위한 특정 뉴클레오티드 유사체 및 변형물을 개시한다. 본 명세서에서 참조로서 포함되며, 내용의 참조문헌도 포함되는 Crooke, S.(ed.) Antisense Drug Technology: Principles, Strategies, and Applications(1<st> ed), Marcel Dekker; ISBN: 0824705661, 1st edition(2001) 및 이것의 참조문헌을 참조하라. 예를 들어, 2'-변형은 할로, 알콕시 및 알릴록시 그룹을 포함한다. 일부 실시예에서, 2'-OH 그룹은 H, OR, R, 할로, SH, SR1, NH2, NHR, NR2 또는 CN으로부터 선택되는 그룹에 의해 대체되는데, 여기서 R은 C1-C6 알킬, 알케닐, 또는 알키닐이고, 할로는 F, Cl, Br 또는 I이다. 변형 연결부의 예시는 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포로아미디트 연결부를 포함한다.
[00281] 다양한 여러 가지 뉴클레오티드 유사체, 변형 백본, 또는 비자연적 발생인터뉴클레오티드 연결부를 포함하는 핵산이 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 본 발명의 핵산은 천연 뉴클레오시드(즉, 아데노신, 티미딘, 구나오신, 시티딘, 우리딘, 디옥시아데노신, 디옥시티미딘, 디옥시구아노신, 및 디옥시티시티딘) 또는 변형 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 변형 뉴클레오티드의 예는 염기 변형 뉴클레오시드(예컨대, 아라시티딘, 이노신, 이소구아노신, 네불라린, 슈도우리딘, 2,6-디아미노푸린, 2-아미노푸린, 2-티오티미딘, 3-데아자-5-아자시티딘, 2'-디옥시우리딘, 3-니트로피롤, 4-메틸린돌, 4-티오우리딘, 4-티오티미딘, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 2-티오우리딘, 5-브로모시티딘, 5-요오드우리딘, 이노신, 6-아자우리딘, 6-클로로푸린, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-아자아데노신, 8-아지도아데노신, 벤지미다졸, M1-메틸아데노신, 피롤로-피리미딘, 2-아미노-6-클로로푸린, 3-메틸 아데노신, 5-프로피닐시티딘, 5-프로피닐우리딘, 5- 브로모우리딘, 5-플로로우리딘, 5-메틸시티딘, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8- 옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 및 2-티오시티딘), 화학적 또는 생물학적 변형 염기(예컨대, 메틸레이트 염기), 변형 당류(예컨대, 2'-플로로리보스, 2'-아미노리보스, 2'-아지도리보스, 2'-O-메틸리보스, L-거울상체 뉴클레오시드 아라비노스 및 육탄당), 변형 포스페이트기(예컨대, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포라미디트 연결) 및 이들의 조합을 포함한다. 핵산의 화학적 합성을 위한 천연 및 변형 뉴클레오티드 단량체가 용이하게 입수될 수 있다. 일부의 경우, 그러한 변형물을 포함하는 핵산은 자연적으로 발생한 뉴클레오티드만으로 구성되는 핵산과 관련하여 개선된 특성을 디스플레이한다. 일부 실시예에서, 본 명세서에서 기술된 핵산 변형은 뉴클레아제(예컨대, 엑소뉴클레아제, 엔도뉴클레아제 등)에 의한 소화를 감소 및/또는 방지하는 데 이용된다. 예를 들어, 핵산의 구조는 하나 또는 양쪽 가닥의 순서 중 세 번째 말단에서 뉴클레오티드 유사체를 포함하여 소화를 감소시킴으로써 안정화될 수 있다.
[00282] 변형 핵산은 분자의 전체 길이를 따라 균일하게 변형될 필요가 없다. 상이한 뉴클레오티드 변형 및/또는 백본 구조는 핵산에서 다양한 위치에 존재할 수 있다. 당업자는 뉴클레이티드 유사체 또는 기타의 변형물(들)이 핵산의 임의의 위치(들)에 위치하여 핵산의 기능이 실질적으로 영향을 받지 않도록 할 수 있다는 것을 알 것이다. 예외적인 하나의 예를 제공하면, 변형은 앱타머 표적에 특히 결합하는 앱타머의 능력이 실질적으로 영향을 받지 않도록하는 앱타머의 임의의 위치에 위치할 수 있다. 변형 영역은 하나 또는 양쪽 가닥의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치할 수 있다. 예를 들어, 양쪽 가닥 중 어느 하나의 가닥의 5' 및/또는 3' 말단에 있는 대략 1 내지 대략 5개의 잔기가 뉴클레오티드 유사체이고 및/또는 백본 변형을 갖는 변형 앱타머가 이용될 수 있다. 변형은 5' 또는 3' 말단 변형일 수 있다. 핵산 가닥은 적어도 50%, 적어도 80%, 적어도 90%의 비변형 뉴클레오티드 또는 100% 비변형 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
[00283] 본 발명에 따른 핵산은, 예를 들어 미국 특허 공개 공보 2003/0175950, 2004/0192626, 2004/0092470, 2005/0020525, 및 2005/0032733에 개시된 것들과 같은 당류, 뉴클레오시드, 또는 인터뉴클레오시드에 대한 변형을 포함할 수 있다. 본 발명은 본 명세서에서 기술된 변형 중 하나 이상을 갖는 임의의 핵산의 사용을 포함한다. 예를 들어, 다수의 단말 접합부, 예컨대 콜레스테롤, 리토콜산(lithocholic acid), 알루릭산(aluric acid) 또는 긴 알킬 브랜치 사슬과 같은 지질은 세포질 흡수(cellular uptake)를 개선하는 것으로 보고되었다. 유사체 및 변형물은, 예컨대 본 기술 분야에 알려져 있는 임의의 적절한 검정법을 이용하여, 예를 들어 치료제의 개선된 전달, 앱타머와 앱타머 표적의 개선된 특이적 결합 등을 가져오는 것들을 선택할 수 있도록 테스트될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명에 따른 핵산은 하나 이상의 비자연적 뉴클레오시드 연결부를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 앱타머의 3' 말단, 5' 말단, 또는 3' 및 5' 양쪽 모두의 말단에 있는 하나 이상의 내부 뉴클레오티드는 3'-3' 연결부 또는 5'-5' 연결부와 같은 연결부를 산출하도록 반전된다.
[00284] 일부 실시예에서, 본 발명에 따른 핵산은 합성이 아니라 그들의 자연적 환경으로부터 격리된 자연적으로 발생하는 실재이다.
[00285] 소분자 표적화 모이어티
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 표적화 모이어티는 소분자일 수 있다. 특정 실시예에서, 소분자는 크기 면에서 약 2000 g/mol보다 작을 수 있다. 일부 실시예에서, 소분자는 약 1500 g/mol보다 작거나 약 1000 g/mol보다 작다. 일부 실시예에서, 소분자는 약 800 g/mol보다 작거나 약 500 g/mol보다 작다.
[00286] 특정 실시예에서, 소분자는 소중합체이다. 특정 실시예에서, 소분자는 비-소중합체이다. 특정 실시예에서, 소분자는 천연 산물 또는 천연 산물의 전체 구조에 기초한 부분 구조(예컨대, 하위구조)를 갖는 천연 산물 유사 화합물이다. 특정 실시예에서, 소분자는 합성 산물이다. 일부 실시예에서, 소분자는 화학 라이브러리로부터의 것일 수 있다. 일부 실시예에서, 소분자는 제약회사 역사적 라이브러리로부터의 것일 수 있다. 특정 실시예에서, 소분자는 미국 연방 행정 규칙(C.F.R)에서 제공되는 미국 식약청에 의해 인증된 약물이다.
[00287] 당업자는 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, 바람직한 표적에 특정하게 결합되는 임의의 소분자가 본 발명에 따라 사용될 수 있다는 것을 알 것이다.
[00288] 단백질 표적화 모이어티
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 표적화 모이어티는 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 특정 실시예에서, 펩티드는 크기면에서 약 5개 내지 약 100개, 약 5개 내지 약 50개, 약 10개 내지 약 75개, 약 15개 내지 약 50개, 약 20개 내지 약 25개의 핵산을 범위로 한다. 일부 실시예에서, 펩티스 서열은 단백질의 서열에 기초할 수 있다. 일부 실시예에서, 펩티드 서열은 아미노산의 무작위 배열일 수 있다.
[00289] "폴리펩티드" 및 "펩티드"라는 용어는 본 명세서에서 상호 교환가능하게 사용되며, "펩티드"는 약 100개 미만의 길이의 핵산을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 양쪽 아미노산 모두를 포함할 수 있으며, 본 기술 분야에서 알려져 있는 다양한 아미노산 변형물 또는 유사체 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 유용한 변형물은, 예컨대, 말단 아세틸화, 아미드화, 지질화, 포스포릴레이트화, 글리코실레이트화, 아실레이트화, 파르네실화(farnesylation). 설폰화 등을 포함한다.
[00290] 본 발명에 따른 표적화 모이어티로서 사용될 수 있는 예시적인 단백질은, 항체, 수용체, 시토카인, 펩티드 호르몬, 당단백질, 당펩티드, 프로테오글리칸, 결합 라리브라리로부터 유도되는 단백질(예컨대, Avimers™, Affibody™ 등), 및 이들의 특성 부분을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. Nanobodies™, AdNectins™ 등과 같은 합성 결합 단백질이 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 단백질 표적화 모이어티는 펩티드일 수 있다.
[00291] 당업자는 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, 바람직한 표적에 특정하게 결합되는 임의의 단백질 및/또는 펩티드가 본 발명에 따라 사용될 수 있음을 알 것이다.
[00292] 일부 실시예에서, 표적화 모이어티는 항체 및/또는 이것의 특성 부분일 수 있다. "항체"라는 용어는 자연적이든 전체적이든 부분적이든 합성에 의해 생성된 임의의 면역글로불린과 이것의 유도체 및 이것들의 특성 부분을 지칭한다. 항체는 단일클론성 또는 다중클론성일 수 있다. 항체는 인간 클래스 중 임의의 것을 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스의 멤버, 즉 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE일 수 있다.
[00293] 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 항체 단편(즉, 항체의 특성 부분)은 전장 미만 항체의 임의의 유도체를 지칭한다. 일부 실시예에서, 항체 단편은 전장 항체의 특이적 결합 능력 중 적어도 상당한 부분을 계속 유지시킨다. 이러한 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dsFv 디아바디(diabody) 및 Fd 단편을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 항체 단편은 또한 Fc 단편을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다.
[00294] 항체 단편은 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 손상되지 않은 항체의 단편에 의해 효소학적으로 또는 화학적으로 생성될 수 있으며, 및/또는 부분 항체 서열을 인코딩하는 유전자로부터 재조합에 의해 생성될 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 항체 단편은 전체적으로 또는 부분적으로 합성에 의해 생성될 수 있다. 항체 단편은 단일 사슬 항체 단편을 선택적으로 포함할 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 항체 단편은, 예를 들어 이황화 연결부에 의해 서로 연결되는 다수의 사슬을 포함할 수 있다. 항체 단편은 다분자집합 화합물을 선택적으로 포함할 수 있다. 기능적 항체 단편은 일반적으로 적어도 약 50개 이상의 아미노산을 포함할 것이며, 보다 일반적으로는 적어도 약 200개의 아미노산을 포함할 것이다.
[00295] 일부 실시예예서, 항체는 키메라(예컨대, "인간화") 및 단일 사슬(재조합) 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 항체는 감소된 효과기 기능 및/또는 이중특이성 분자를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 항체는 Fab 방출 라이브러리에 의해 생성되는 단편을 포함할 수 있다.
[00296] 단일 사슬 Fvs(scFvs)는 가변 경쇄(variable light chain: VL) 및 폴리펩티드 링커에 의해 서로 공유로 접속되는 가변 중쇄(variable heavy chain: VH)로 구성되는 재조합 항체 단편이다. VL 또는 VH는 NH2-단말 도메인을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 링커는 2개의 가변 도메인이 상당한 입체적 간섭(steric interference) 없이 브리지되는 동안에는 가변 길이 및 조성의 것일 수 있다. 일반적으로, 링커는 주로 용해를 위해 산재되는 일부 글루타민산 또는 리신 잔기를 갖는 글리신 및 세린 잔기의 스트레치를 포함한다.
[00297] 디아바디는 수지상 scFvs이다. 디아바디는 일반적으로 대부분의 scFvs보다 더 짧은 펩티드 링커를 가지며, 그들은 흔히 이분자체(dimers)로서 연관을 위한 선호도를 보여 준다.
[00298] Fv 단편은 비공유 상호작용에 의해 서로 유지되는 하나의 VL 도메인 및 하나의 VH 도메인으로 구성되는 항체 단편이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "dsFv"라는 용어는 VH-VL 쌍을 안정화시키도록 가공된 분자간 이황화 결합을 갖는 Fv를 지칭한다.
[00299] F(ab')2 단편은 pH 4.0-4.5의 효소 펩신에 의한 소화에 의해 면역글로불린으로부터 얻어지는 것들과 본질적으로 동일한 항체 단편이다. 단편은 재조합에 의해 생성될 수 있다.
[00300] Fab' 단편은 F(ab')2 단편에서 2개의 중쇄 조각을 결합하는 이황화 브리지 또는 브리지들의 감소에 의해 얻어질 수 있는 것과 본질적으로 동일한 항체 단편이다. Fab' 단편은 재조합에 의해 생성될 수 있다.
[00301] Fab 단편은 효소(예컨대, 파파인)에 의한 소화에 의해 얻어지는 것과 본질적으로 동일한 항체 단편이다. Fab 단편은 재조합에 의해 생성될 수 있다. Fab 단편의 중쇄 세그먼트는 Fd 조각이다.
[0302] 탄수화물 표적화 모이어티
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 표적화 모이어티는 탄수화물를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 탄수화물는 본 기술 분야에서 알려져 있는 바와 같이 글리코시드 결합에 의해 연결되는 단순한 당류(또는 그들의 유도체)를 포함하는 다당류일 수 있다. 이러한 당류는 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 리보스, 락토오스, 슈크로오스, 말토오스, 트레할로오스, 셀비오스, 마노스, 자일로오스, 아라비노스, 글루쿠론산, 갈락토론산, 마누론산, 글루코사민, 갈라토사민, 및 뉴라믹산을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, 탄수화물는 풀루란, 셀룰로오스, 마이크로결정 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 하이드록시셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 덱스트란, 시클로덱스트란, 글리코겐, 녹말, 하이드록시에틸녹말, 카라기난(carageenan), 글리콘(glycon), 아밀로오스(amylose), 키토산, N,O-카복실메틸키토산, 알긴 및 알긴산, 녹말, 키틴, 헤파린, 곤약(konjac), 글루코만난(glucommannan), 푸스투란(pustulan), 헤파린, 히알루론산(hyaluronic acid), 커들란(curdlan), 및 산탄(xanthan) 중 하나 이상의 것일 수 있다.
[00303] 일부 실시예에서, 탄수화물는 아미노화, 카복실레이트화, 및/또는 술폰화될 수 있다. 일부 실시예에서, 친수성 다당류는 많은 수의 측쇄 소수성 그룹을 유도함으로써 소수성이되도록 변형될 수 있다. 일부 실시예에서, 소수성 탄수화물는 셀룰로오스 아세테이트, 풀루란 아세테이트, 곤약 아세테이트, 아밀로오스 아세테이트 및 덱스트란 아세테이트를 포함할 수 있다.
[00304] 당업자는 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, 바람직한 표적에 특정하게 결합하는 임의의 탄수화물이 본 발명에 따라 사용될 수 있다는 것을 알 것이다.
[00305] 지질 표적화 모이어티
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 표적화 모이어티는 하나 이상의 지방산 그룹 또는 이것의 염류를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 지방산 그룹은 소화할 수 있는 긴 사슬(예컨대, Cs-C50)의 치환 또는 비치환 하이드로카본을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 지방산 그룹은 C10-C20 지방산 또는 이것의 염류일 수 있다. 일부 실시예에서, 지방산 그룹은 C15-C20 지방산 또는 이것의 염류일 수 있다. 일부 실시예에서, 지방산 그룹은 C15-C20 지방산 또는 이것의 염류일 수 있다. 일부 실시예에서, 지방산 그룹은 불포화될 수 있다. 일부 실시예에서, 지방산 그룹은 단일불포화될 수 있다. 일부 실시예에서, 지방산 그룹은 고도불포화될 수 있다. 일부 실시예에서, 불포화 지방산 그룹의 이중 결합은 시스형 구조(cis conformation)일 수 있다. 일부 실시예에서, 불포화 지방산의 이중 결합은 트랜스 구조일 수 있다.
[00306] 일부 실시예에서, 지방산 그룹은 부티르산(butyric acid), 카프로산(caproic acid), 카프릴산(caprylic acid), 카프리산(capric acid), 라우르산(lauric acid), 미리스트산(myristic acid), 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 아라킨산(arachidic acid), 베헨산(behenic acid), 또는 리그노세린산(lignoceric acid) 중 하나 이상일 수 있다. 일부 실시예에서, 지방산 그룹은 팔미톨레산(palmitoleic acid), 올레산(oleic acid), 박센산(vaccenic acid), 리놀레산(linoleic acid), 알파-리놀레산(alpha-linoleic acid), 감마-리놀레산(gamma-linoleic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 가돌레산(gadoleic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic, acid), 또는 에루스산(erucic acid) 중 하나 이상일 수 있다.
[00307] 당업자는 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, 바람직한 표적에 특정하게 결합하는 임의의 지방산 그룹이 본 발명에 따라 사용될 수 있다는 것을 알 것이다.
[00308] 신규 표적화 모이어티( Novel Targeting Moieties )
[00309] 임의의 신규 표적화 모이어티가 본 발명에 따라 백신 나노캐리어에서 사용될 수 있다. 본 기술 분야에 알려져 있는 임의의 방법이 신규 표적화 모이어티를 설계, 식별, 및/또는 격리하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 분자 라이브러리 및 생체 밖 결합 검정법을 이용하는 표준 기술이 신규 표적화 모이어티를 식별하는 데 이용될 수 있다.
[00310] 핵산 표적화 모이어티(예컨대, 앱타머, Spiegelmers®)가 임의의 사용가능한 방법을 이용하여 설계 및/또는 식별될 수 있다. 일부 실시예에서, 핵산 표적화 모이어티는 핵산 표적화 모이어티를 핵산의 후보 혼합물과 식별함으로써 설계 및/또는 식별된다. 실험 첨가에 의한 리간드의 체계적 진화 또는 이것의 변형은 핵산의 후보 혼합물로부터의 표적과 결합시키는 핵산 표적화 모이어티를 식별하는 공통적으로 이용되는 방법이다(각각 본 명세서에서 참조로서 포함되는, 예컨대, 미국 특허 6,482,594; 6,458,543; 6,458,539; 6,376,190; 6,344,318; 6,242,246; 6,184,364; 6,001,577; 5,958,691; 5,874,218; 5,853,984; 5,843,732; 5,843,653; 5,817,785; 5,789,163; 5,763,177; 5,696,249; 5,660,985; 5,595,877; 5,567,588; 및 5,270,163 참조). 대안으로, 또는 추가로, 폴리플렉스 생체 내 결합 최적화(Polyplex In Vivo Combinatorial Optimization: PICO)는 생체 내 및/또는 생체 밖의 핵산의 후보 혼합물로부터의 표적을 결합시키는 핵산 표적화 모이어티(예컨대, 앱타머)를 식별하는 데 사용될 수 있는 방법이며, 본 명세서에서 참고로서 포함되며 2006년 12월 15일에 출원된 "System for Screening Particles"라는 명칭의 공동 출원 중인 PCT 출원 US06/47975에 기술되어 있다.
면역자극제( Immunostimulatorv Agents )
[00311] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 면역 응답을 자극하는 데 도움이 될 수 있는 하나 이상의 면역자극제를 운반할 수 있다. 일부 실시예에서, 면역자극제는 APC를 활성화시켜 그들의 면역자극제 능력을 증진시킴으로써 면역 반응을 급증시킨다. 일부 실시예에서, 면역자극제는 특정 항원에 대한 림프구 반응을 증폭시킴으로써 면역 반응을 급증시킨다. 일부 실시예에서, 면역자극제는 다양한 세포 타입으로부터 시토카인과 같은 중재자의 국부적 방출을 유도함으로써 면역 반응을 급증시킨다. 일부 실시예에서, 면역자극제는 면역 응답을 억제하거나 전용한다. 일부 실시예에서, 면역자극제는 조절 T 세포를 유도한다.
[00312] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어의 모든 면역자극제는 서로 동일하다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 다수의 상이한 타입의 면역자극제를 포함한다. 일부 실시예에서, 서로 동일한 다수의 개별적인 면역자극제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 정확히 한 가지 타입의 면역자극제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 정확히 두 가지 타입의 면역자극제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 세 가지 이상의 타입의 면역자극제를 포함한다.
[00313] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 B 세포 및 T 세포 모두를 자극하는 단일 타입의 면역자극제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 두 가지 타입의 면역자극제를 포함하는데, 여기서 제 1 타입의 면역자극제는 B 세포를 자극하고, 제 2 타입의 면역자극제는 T 세포를 자극한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 세 가지 이상의 타입의 면역자극제를 포함하는데, 여기서 하나 이상의 타입의 면역자극제는 B 세포를 자극하고, 하나 이상의 타입의 면역자극제는 T 세포를 자극한다.
[00314] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 백신 나노캐리어의 외측 표면과 연관되는 적어도 하나의 타입의 면역자극제를 포함한다. 일부 실시예에서, 연관성은 공유성이다. 일부 실시예에서, 공유 연관성은 하나 이상의 링커에 의해 중재된다. 일부 실시예에서, 연관성은 비공유성이다. 일부 실시예에서, 연관성은 비공유성이다. 일부 실시예에서, 비공유 연관성은 전하 상호작용, 친화력 상호작용, 금속 배위, 물리적 흡착(adsorption), 호스트-게스트 상호작용, 소수성 상호작용, 겹침 상호작용, 수소 결합 상호작용, 반데르 발스(van der Waals) 상호작용, 자기적 상호작용, 정전 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 및/또는 이들의 조합이다. 면역조절제와 백신 나노캐리어와의 연관성은 "백신 나노캐리어의 생성(Production of Vaccine Nanocarriers)"이라는 제목의 아래 섹션에서 더욱 상세히 설명된다.
[00315] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 지질 피막(예컨대, 지질이중층, 지질단일층 등)을 포함한다. 적어도 하나의 면역자극제는 지질 피막과 연관될 수 있다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 타입의 면역자극제는 지질 피막 내에서 내장된다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 타입의 면역자극제는 지질이중층의 루멘 내에 내장된다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 지질 피막의 내측 표면과 연관되는 적어도 하나의 타입의 면역자극제를 포함한다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 타입의 면역자극제는 백신 나노캐리어의 지질 피막 내에서 캡슐화된다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 타입의 면역자극제는 백신 나노캐리어의 다수의 위치에 위치할 수 있다. 예를 들어, 제 1 타입의 면역자극제는 지질 피막 내에 내장될 수 있고, 제 2 타입의 면역자극제는 백신 나노캐리어의 지질 피막 내에 캡슐화될 수 있다. 다른 예를 제공하면, 제 1 타입의 면역자극제는 지질 피막의 외측 표면과 연관될 수 있고, 제 2 타입의 면역자극제는 백신 나노캐리어의 지질 피막의 내측 표면과 연관될 수 있다. 일부 실시예에서, 제 1 타입의 면역자극제는 백신 나노캐리어의 지질이중층의 루멘 내에 내장될 수 있고, 지질이중층은 백신 나노캐리어의 지질이중층의 푸멘 내에 내장될 수 있으며, 지질이중층은 제 2 타입의 면역자극제가 분포된 폴리머 매트릭스를 캡슐화할 수 있다. 일부 실시예에서, 제 1 타입의 면역자극제 및 제 2 타입의 면역자극제는 백신 나노캐리어의 동일 장소에 있을 수 있다(예컨대, 그들은 둘 다 백신 나노캐리어의 외측 포면과 연관될 수 있고, 백신 나노캐리어 내에 캡슐화될 수 있다. 당업자는 선행하는 예들이 다수의 면역자극제가 백신 나노캐리어의 상이한 장소와 연관될 수 있는 많은 여러 가지 방법을 대표할 뿐이라는 것은 알 것이다. 다수의 면역자극제는 백신 나노캐리어의 장소의 임의의 조합에 위치할 수 있다.
[00316] 특정 실시예에서, 면역자극제는 인터류킨(interleukins), 인터페론, 시토카인 등일 수 있다. 특정 실시예에서, 면역자극제는 톨-유사 수용체(TLR)에 대한 천연 또는 합성 효현제일 수 있다. 특정 실시예에서, 백신 나노캐리어는 타입 Ⅰ 인터페론 산물을 유도하는 CpGs와 같은 톨-유사 수용체(TLR)-7에 대한 리간드를 포함한다. 특정 실시예에서, 면역자극제는 DS 표면 분자 CD40에 대한 효현제일 수 있다. 특정 실시예에서, 내성(tolerance)이 아닌 면역력을 자극하기 위해, 나노캐리어는(나이브 T 세포의 프라이밍에 필요한) DC 성숙과, 항체 반응 및 항바이러스 면역력을 촉진하는 타입 Ⅰ 인터페론과 같은 시토카인의 생성 을 촉진하는 면역자극제를 포함한다. 일부 실시예에서, 면역자극제는 박테리아 리포다당류(LPS), VSV-G, 및/또는 HMGB-Ⅰ과 같은 TLR-4 효현제일 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제는, 세포에 의해 방출되고, 셀-셀 상호작용, 통신 다른 세포의 행동에 특정 영향을 미치는(5 kD - 20 kD의 범위의) 작은 단백질 또는 생물학적 인자인 시토카인이다. 일부 실시예에서, 면역자극제는 괴저 세포(예컨대, 요산 결정)로부터 방출된 염증유발전 자극일 수 있다. 일부 실시예에서, 면역자극제는 보체 캐스케이드의 활성화된 성분(예컨대, CD21, CD35 등)일 수 있다. 일부 실시예에서, 면역자극제는 면역성 복합체의 활성화된 성분일 수 있다. 면역자극제는 TLR-I, TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7, TLR-8, TLR-9, 및 TLR-IO 효현제를 포함한다. 면역자극제는 또한 CD21 또는 CD35를 결합시키는 분자와 같은 보체 수용체 효현제를 포함한다. 일부 실시예에서, 보체 수용체 효현제는 나노캐리어의 내생 보체 옵소닌작용(opsonization)을 유도한다. 면역자극제는 또한 시토카인과 같은 시토카인 수용체 효현제를 포함한다. 일부 실시예에서, 시토카인 수용체 효현제는 소분자, 항체, 융합 단백질 또는 앱타머이다.
[00317] 일부 실시예에서, 두 가지 이상의 타입의 면역자극제가 있다. 일부 실시예에서, 상이한 면역자극제는 각각 상이한 경로에서 작용한다. 따라서, 면역자극제는 상이한 톨-유사 수용체, 톨-유사 수용체 및 CD40, 톨-유사 수용체 및 염증조절복합체(inflammasome)의 성분 등일 수 있다.
[00318] 일부 실시예에서, 면역자극제는 보조제일 수 있다. 따라서, 일부 실시예에서, 본 발명은 하나 이상의 보조제로 제조된 백신 나노캐리어를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "보조제"라는 용어는 특정 항원을 구성하지는 않지만 투여된 항원에 대한 면역 반응을 급증시키는 항원을 지칭한다.
[00319] 일부 실시예에서, 본 발명은(캡슐화된 및/또는 면 상에 있는) 보조제를 항원 제시 세포(APC)의 세포 표면과 같은 표적 위치로 전달할 수 있는 나노캐리어를 사용하는 보조제의 전달에 관한 것으로, 여기서 나노 캐리어는(i) 특정 셀을 표적화하는 표면 상의 하나 이상의 분자,(iii) 중합체에 공유로 결합되거나 나노입자 내부에 캡슐화될 때의 면역 반응을 도출할 수 있는 하나 이상의 분자를 포함한다. 본 발명의 실시예는 본 발명의 보조제의 유효 전달량의 나노입자를 투여하여 하나 이상의 항원에 대한 포유동물의 면역 반응을 증진시키는 것을 포함하여 포유동물에게서의 면역 반응의 증강을 증진시키는 것에 관한 것이다. 본 발명의 실시예는 또한 본 발명의 조성물을 사용하는 백신 접종 방법에 관한 것이다.
[00320] 예를 들어, 일부 실시예에서, 보조제는 본 발명의 나노입자 내에서 캡슐화된다. 일반적으로, 그러한 경우, 보조제는, 자유 형태로 제공되는데, 다시 말해 보조제는 나노입자를 형성하는 중합체에 접합되지 않는다. 보조제는, 본 명세서에서 예시되는 바와 같이, 통상적인 방법으로 나노입자의 마련 중에 캡슐화된다. 환자에게 투여될 때 나노입자로부터의 보조제 방출 프로파일은 나노입자의 크기,(해리가 발생하는 경우) 나노입자를 형성하는 중합체의 해리 속도, 나노입자를 형성하는 중합체의 분자 질량, 및(나노입자 내의 보조제의 위치, 확산 속도 등에 영향을 미칠) 보조제의 화학적 특성을 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다. 중합체 나노입자에서 캡슐화되는 보조제의 양은 나노입자의 제조 과정 동안에 결정될 것이다.
[00321] 예를 들어, 일부 실시예에서, 보조제는 나노입자를 형성하는 중합체에 접합된다. 일반적으로, 이러한 경우, 보조제는 나노입자의 표면 상에 또는 그 근처에 발현된다. 일부 실시예에서, 나노입자 내로 자기조립(self-assemble)할 수 있는 양극성 중합체가 사용되며, 보조제는 중합체의 하나의 종단점에 공유로 결합된다. 예를 들어, 보조제는 중합체를 형성하는 데 사용되는 중합 반응에서 초기 종으로서 사용될 수 있다. 보조제가 중합체의 종단점에 접합될 때(즉, 공유로 결합될 때), 중합체의 자가-조립 시, 보조제는 나노입자의 주변부 또는 코어에 집중된다. 예를 들어, 중합체가 소수성 코어 및 친수성 주변부를 갖는 나노입자 내에 자가-조립하도록 허용되며, 소수성 블록 및 친수성 블록을 포함하는 중합체에서, 친수성 블록의 종단점에 접합되는 보조제는 나노입자의 주변부에 집중될 것이다. 일부 바람직한 실시예에서, 보조제는 나노입자의 표면에 집중되고, 면역자극제로서 작용하도록 하는 위치에 남아 있다. 접합된 보조제를 포함하는 나노입자 제조를 위해, 나노입자의 표면 상에서 보조제의 밀도는 나노입자를 형성하는 중합체의 분자 질량, 나노입자의 밀도, 및 보조제의 화학적 특성을 포함하는 다양한 인자의 함수일 것이다.
[00322] 일부 실시예에서, 캡슐화되고 접합된 보조제의 조합이 이용된다.
[00323] 예를 들어, 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 젤-타입 보조제)예컨대, 알루미늄 하이드록시드, 알루미늄 포스페이트, 칼슘 포스페이트 등), 미생물 보조제(예컨대, CpG 모티브; 모노포스포릴 지질 A와 같은 엔도톡신; 콜레라 독소, E. 콜리 열 라빌 톡신, 및 백일해 독소(pertussis 토신)와 같은 엑소토신; 무라밀 티펩티드(muramyl dipeptide) 등을 포함하는 면역조절제 DNA 서열), 오일-유상액 및 유화제계 보조제(예컨대, 프로인트 보조제(Freund's Adjuvant), MF56[Novartis] , SAF 등), 입자상 보조제(예컨대, 리포솜, 생분해성 미세구(biodegradable microspheres), 사포닌 등), 합성 보조제(예컨대, 비이온 블록 공중합체, 무라밀 펩티드 유사체(muramyl peptide analogues), 폴리포스파젠(polyphosphazene), 합성 폴리뉴클레오티드 등), 계면 활성제계 보조제, 및/또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 보조제로 제조된다. 다른 예시적인 보조제는 일부 중합체(예컨대, 본 명세서에서 참고로서 포함되는 미국 특허 5,500,161에 기술된 폴리포스파젠), QS21, 스쿠알렌, 테트라클로로데카옥시드 등을 포함한다.
T 세포 활성화를 위한 검정법( Assays for T Cell Activation )
[00324] 일부 실시예에서, 면역 반응이 T 세포 또는 T 세포들의 그룹에서 자극되었는지의 여부(즉, T 세포 또는 T 세포들의 그룹이 "활성화"되었는지의 여부)를 판정하기 위해 다양한 검정법이 이용될 수 있다. 일부 실시예에서, T 세포에서의 면역 반응의 자극은 T 세포에 의해 시토카인의 항원 유도 산물을 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, T 세포에서의 면역 반응의 자극은 T 세포에 의한 IFNγ, IL-4, IL-2, IL-10, IL-17 및/또는 TNFα의 항원 유도 산물을 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, T 세포에 의한 시토카인의 항원 생성 산물은 세포내 시토카인 스테이닝과 그 후의 유세포 분석(flow cytometry)에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시예에서, T 세포에 의한 시토카인의 항원 유도 산물은 표면 포착 스테이닝과 그 후의 유세포 분석에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시예에서, T 세포에 의한 시토카인의 항원 유도 산물은 활성화된 T 세포 배양의 상청액(supernatants)에서 시토카인의 농도를 판정함으로써 측정될 수 있다. 일부 실시예에서, 이것은 ELISA에 의해 측정될 수 있다.
[00325] 일부 실시예에서, T 세포에 의한 시토카인의 항원 생성 산물은 ELISPOT 검정법에 의해 측정될 수 있다. 일반적으로, ELISPOT 검정법은 샌드위치 효소-결합 면역흡수 검정법(sandwich enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) 기술과 매유 유사한 기술을 이용한다. 항체(예컨대, 단일클론성 항체, 다중클론성 항체 등)는 PVDF(polyvinylidene fluoride)-후방마이크로플레이트 상에 무균성으로 코팅된다. 항체는 해당 시토카인에 대한 그들의 특이성을 위해 선택된다. 플레이트는(예컨대, 검정 시에 항체들 중 임의의 것과 반응하지 않는 세럼 단백질로) 차단된다. 관심 세포는 항원 또는 미토젠과 함께 변화하는 밀도로 플레이트되고, 이어서 특정 기간 동안 습한 37℃ CO2 인큐베이터에 놓인다. 활성화된 세포에 의해 분비되는 시토카인은 높은 표면 영역 PVDF 피막 상에서 코팅된 항체에 의해 국부적으로 포착된다. 웰을 세척하여 세포, 잔해, 및 중간 성분을 제거한 후, 시토카인에 특정적인 2차 항체(예컨대, 바이오티닐레이트된 다중 클론성 항체)가 웰에 추가된다. 이 항체는 표적 시토카인의 개별 항원결정부와 반응한다. 임의의 비결합 바이오티닐레이트된 항체를 제거하도록 세척한 다음, 검출된 시토카인은 아비딘-HRP 및 침전 기질(예컨대, AEC, BCIP/NBT)를 사용하여 시각화된다. 채색된 목적 산물(스폿, 통상적으로는 검청색)은 일반적으로 개별적인 시토카인-생성 세포를 나타낸다. 스폿은(예컨대, 해부현미경으로) 수동으로 또는 자동 판독기를 사용하여 카운팅되어, 마이크로웰 이미지를 포착하고 스폿 개수 및 크기를 분석한다. 일부 실시예에서, 각각의 스폿은 단일 시토카인-생성 세포와 상관된다.
[00326] 일부 실시예에서, T 세포에서의 면역 반응은 약 1%의 항원 특이적 T 세포와 약 100%의 항원 특이적 T 세포 사이에서 시토카인이 생성되면 자극받는 것으로 전해진다. 일부 실시예에서, T 세포에서의 면역 반응은 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%의 항원 특이적 T 세포가 시토카인을 생성한다면 자극받는 것으로 전해진다.
[00327] 일부 실시예에서, T 세포에서의 면역 반응은 면역된 피검자가 나이브 제어를 하기보다는 적어도 약 10겹, 적어도 약 50겹, 적어도 약 100겹, 적어도 약 500겹, 적어도 약 1000겹, 적어도 약 5000겹, 적어도 약 10,000겹, 적어도 약 50,000겹, 적어도 약 100,000겹, 또는 적어도 약 1000,000겹보다 많은 시토카인 생성 세포를 포함한다면 자극받는 것으로 전해진다.
[00328] 일부 실시예에서, T 세포에서의 면역 반응의 자극은 T 세포의 항원 유도 증식을 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, 항원 유도 증식은 T 세포를 분할할 때 H3-티미딘의 흡수(때때로 "림프구 변형 테스트" 또는 "LTT"라고 지칭됨 )로서 측정될 수 있다. 일부 실시예에서, 항원 유도 증식은 나이브 제어보다(γ 카운터로부터 카운트의 개수로서 주어지는) H3-티미딘 흡수가 적어도 약 10겹, 적어도 약 50겹, 적어도 약 100겹, 적어도 약 500겹, 적어도 약 1000겹, 적어도 약 5000겹, 적어도 약 10,000겹, 또는 적어도 약 10,000겹보다 더 높다면 발생한 것으로 전해진다.
[00329] 일부 실시예에서, 항원 유도 증식은 유세포 분석에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시예에서, 항원 유도 증식은 카복시플루오레세인 석시니미딜 에스테르(carboxyfluorescein succinimidyl ester: CFSE) 희석 검정법에 의해 측정될 수 있다. CFSE는 세포질 단백질들(cytoplasmic proteins)의 그룹을 그것의 석시니미딜-반응성 그룹(예컨대, T 세포 단백질)과 결합시키는 세포질 단백질의 그룹을 그것의 석시니미딜-반응성 그룹(예컨대, T 세포 단백질)과 결합시키는 무독성 형광 피막 침투 염료이다. 세포가 분할될 때, CFSE-라벨 단백질은 낭세포들(daughter cells) 사이에 동일하게 분포되어 각각의 분할로 세포 형광을 이등분한다. 그 결과, 항원 특이적 T 세포는 각각의 항원의 존재 시에 배양 후 그들의 형광성을 잃고(CFSElow), 배양 시에 다른 세포와 구별된다(CFSEhigh). 일부 실시예에서, 항원 유도 증식은(모든 CFSE+ 세포로부터 CFSElow의 백분율로서 제공되는) CFSE 희석률이 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%인 경우에 발생한 것으로 전해진다.
[00330] 일부 실시예에서, T 세포에서의 면역 반응은 T 세포 활성화의 세포질 마커가 자극받지 않은 세포에 대하여 상이한 레벨(예컨대, 더 높은 레벨 또는 더 낮은 레벨)로 발현된다면 자극받는 것으로 전해진다. 일부 실시예에서, CD11a CD27, CD25, CD40L, CD44, CD45RO, 및/또는 CD69는 자극받지 않은 T 세포보다 활성화된 T 세포에서 더욱 크게 발현된다. 일부 실시예에서, L-셀렉틴(CD62L), CD45RA, 및/또는 CCR7은 자극받지 않은 T 세포에서보다 활성화된 T 세포에서 더 적게 발현된다.
[00331] 일부 실시예에서, T 세포에서의 면역 반응은 항원-펄스 표적 세포에 대항하여 CD8+ T 세포에 의한 세포독소(cytotoxicity)를 검정함으로써 측정된다. 예를 들어, 51크롬(51Cr) 방출 검정법이 수행될 수 있다. 이 검정법에서, 효과기 CD8+ T 세포는 클래스 Ⅰ MHC 상에 바이러스 펩티드를 제공하는 감염된 세포와 결합하고, 감염된 세포에 아포토시스를 이행할 것을 신호한다. 효과기 CD8+ T 세포가 추가되기 전에 51Cr으로 세포가 라벨링된다면, 상청액 내로 방출되는 51Cr의 양은 자살 표적의 수에 비례한다.
[00332] 당업자는 위에서 설명된 검정법이 T 세포 활성화가 일어났는지를 판정하기 위해 이용될 수 있는 예시적인 방법일 뿐이라는 것을 알 것이다. T 세포 활성화가 일어났는지를 판정하는 데 사용될 수 있는 당업자에게 알려져 있는 임의의 검정법은 본 발명의 범주내에 있다. 본 명세서에서 기술되는 검정법 및 T 세포 활성화가 일어났는지를 판정하는 데 사용될 수 있는 추가 검정법은 면역학에서의 현재 프로토콜(Current Protocols in Immunology)(본 명세서에서 참조로서 포함됨, John Wiley &Sons, Hoboken, NY, 2007)에서 설명된다.
[00333] 본 발명은, 예를 들어 면역조절제에게 면역계 세포로의 전달용 백신 나노캐리어를 제공한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 B 세포(즉, B 세포 항원)에게 제공될 수 있는 적어도 하나의 면역조절제를 포함한다.
면역조절제( Immunomodulatory Agents )
[00334] B 세포 및 T 세포는 상이한 메커니즘에 의해 항원을 인식한다. 위에서 설명된 바와 같이, T 세포는(예컨대, ATC MHC 분자에 의해 T 세포 수용체에 제공되는 펩티트 단면으로서) 처리된 형태의 항원을 인식한다. B 세포는 항원을 그들의 원시 형태로 인식한다. B 세포는 B 세포 수용체(BCR) 및/또는 피막 결합 면역글로불린을 이용하는 혈액 또는 림프 내의 해리성(예컨대, 가용성) 항원을 인식한다.
[00335] 면역조절제는 B 세포 항원일 수 있다. B 세포 항원은 단백질, 펩티드, 소분자 및 탄수화물를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 비-단백질 항원이다(즉, 단백질이나 펩티드 항원이 아니다). 일부 실시예에서, B 세포 항원은 감염원과 연관된 탄수화물이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 감염원과 연관된 당단백질 또는 당펩티드이다. 감염원은 박테리아, 바이러스, 진균, 원생동물, 또는 기생체일 수 있다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 낮은 면역성의 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 남용 물질 또는 이것의 일부분이다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 중독성 물질 또는 이것의 일부분이다.
[00336] 중독성 물질은 마약, 기침 억제제(a cough suppressant), 안정제(tranquilizer), 및 진정제(sedative)를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 중독성 물질의 예는 본 명세서의 다른 곳에서 제공된 것들을 포함한다. 일부 실시예에서, B 세포 항원은 화학무기로부터의 독소와 같은 독소이다. 일부 실시예에서, 화학무기로부터의 독소는 보툴리눔 독소(botulinum 토신) 또는 안내섬광(phosphene)이다. 화학무기로부터의 독소는 O-알킬(<C10, 시클로알킬을 포함함) 알킬(Me, Et, n-Pr 또는 i-Pr)-포스포노플루오리데이트(예컨대, 사린: O-이소프로필 메틸포스포노플루오리데이트, 소만: O-피나콜릴메틸포스포노플루오리데이트), O-알킬(<C10, 시클로알킬을 포함함) N,N-디알킬(Me, Et, n-Pr 또는 i-Pr) 포스포라미도시아니데이트(phosphoramidocyanidates)(예컨대, 타분(Tabun): O-에틸 N,N-디메틸포스포라미도시아니데이트), O-알킬(H 또는 <C10, 시클로알킬을 포함함) S-2-디알킬(Me, Et, n-Pr 또는 i-Pr)-아미노에틸 알킬(Me, Et, n-Pr 또는 i-Pr) 포스포노티오레이트 및 대응하는 알킬레이티드 또는 프로토네이티드 염(예컨대, VX: O-에틸 S-2-디이소프로필아미노에틸 메틸포스포노티올레이트), 설퍼 머스타드: 2-클로로에틸클로로메틸설파이드, 겨자 가스(mustard gas): 비스(2-클로로에틸)설파이드, 비스(2-클로로에틸티오)메탄, 황겨자(Sesquimustard): l,2-비스(2-클로로에틸티오)에탄, 1,3-비스(2-클로로에틸티오)-n-프로판, 1 ,4-비스(2-클로로에틸티오)-n-부탄, 1 ,5-비스(2-클로로에틸티오)-n-펜탄, 비스(2-클로로에틸티오메틸)에테르, O-머스타드: 비스(2-클로로에틸티오에틸)에테르, 루이사이트: 루이사이트 1 : 2-클로로비닐디클로로아르신, 루이사이트 2: 비스(2- 클로로비닐)클로로아르신, 루이사이트 3: 트리스(2-클로로비닐)아르신, 질소 머스타드: HNl : 비스(2-클로로에틸)에틸아민, HN2: 비스(2-클로로에틸)메틸아민, HN3: 트리스(2-클로로에틸)아민, 삭시토신, 리신(Ricin), 아미톤(Amiton): 0,0-디에틸 S-(2-(디에틸아미노)에틸)포스포로티올레이트 및 대응하는 알킬레이티드 또는 프로토네이티드 염, PFIB: 1,1,3,3,3-펜타플루오로-2-(트리플루오로메틸)-l-프로펜, 3-퀴누클리디닐 벤질레이트(Quinuclidinyl benzilate: BZ), 포스젠(Phosgene): 카보닐 디클로라이드(Carbonyl dichloride), 시아노젠 클로라이드(Cyanogen chloride), 수소 시아니드(Hydrogen cyanide) 및 클로로피크린: 트리클로로니트로메탄을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다 .
[00337] B 세포 항원은 또한 유해 환경 작용제일 수 있다. 유해 환경 작용제은 비소, 납, 수은, 비닐클로라이드, 폴리클로리네이티드 바이페닐, 벤젠, 다륜성 아로마 하이드로카본(polycyclic aromatic hydrocarbons), 카드뮴, 벤조(a)피렌, 벤조(b)플루오란센, 클로로폼, DDT, P,P'-, aroclor 1254, aroclor 1260, 디벤조(a,h) 안트라센, 트리클로에틸렌, 디엔드린, 크롬 탄당류, 및 DDE, P,P'을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 이러한 작용제의 예는 본 명세서의 어디에서든 제공되는 것들을 포함한다.
[00338] 일부 실시예에서, B 세포 항원은 자기 항원이다. 다른 실시예에서, B 세포 항원은 자기 항원이다. 다른 실시예에서, B 세포 항원은 동종항원, 접촉 증강제, 퇴행성 질병 항원, 합텐, 감염성 질병 항원, 암 항원, 아토피성 질병 항원, 자가면역 질병 항원, 중독성 물질, 이종항원, 또는 대사성 질병 효소나 이것의 효소 산물이다. 이러한 항원의 예는 본 명세서의 어디에서나 제공되는 것들을 포함한다.
[00339] 상술한 바와 같이, 본 발명은, 예를 들어 하나 이상의 면역조절제를 포함하는 백신 나노캐리어를 제공한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 면역조절제를 포함하는 본 발명의 나노캐리어는 백신으로서 사용된다. 일부 실시예에서, B 셀로의 항원 제공은 나노캐리어의 표면 상에서 구조적으로 손상되지 않은 면역조절제를 제공함으로써 최적화될 수 있다. 일부 실시예에서, 구조적으로 손상되지 않은 면역조절제는 높은 복제 횟수 및/또는 밀도로 백신 나노캐리어의 표면 상에 제공된다.
[00340] 일부 실시예에서, 면역조절제는 격리 및/또는 재조합 단백질 또는 펩티드, 비활성화된 유기물 및 바이러스, 죽은 유기물 및 바이러스, 유전자 변형 유기물 또는 바이러스, 및 세포 추출물을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 핵산, 탄수화물, 지질, 및/또는 소분자를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 면역 반응을 유도하는 것이다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 항원이다. 일부 실시예에서, 면역조절제는 백신에 사용된다. 또한, 면역조절제의 설명은 "B 세포"라는 명칭의 이전 섹션에서 찾을 수 있다.
[00341] 위에서 설명된 바와 같이, 백신 나노캐리어는 B 세포 및 T 세포 모두를 자극하는 단일 타입의 면역조절제를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 백신 나노캐리어는 두 가지 타입의 면역조절제를 포함하는데, 여기서 제 1 타입의 면역조절제는 B 세포를 자극하고, 제 2 타입의 면역조절제는 T 세포를 자극한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 세 가지 이상의 타입의 면역조절제를 포함하는데, 여기서 하나 이상의 타입의 면역조절제는 B 세포를 자극하고, 하나 이상의 타입의 면역조절제는 T 세포를 자극한다.
표적화 모이어티
[00342] 위에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 나노캐리어는 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함한다. 본 발명에 따라 표적화 모이어티의 일반적이고 구체적인 특성에 대한 설명을 위해, "T 세포"라는 명칭의 이전 섹션에서 "표적화 모이어티"라는 부제 부분을 참조하라. 일부 실시예에서, 표적화 모이어티는 특정 세포 타입을 표적으로 한다. 특정 실시예에서, 표적은 B 세포 마커이다. 일부 실시예에서, B 세포 표적은 B 세포에서 발현되지만 비-B 세포에서는 발현되지 않는 항원이다. 일부 실시예에서, B 세포 표적은 비-B 세포에서보다 B 세포에서 보다 널리 퍼지는 항원이다.
[00343] 특정 실시예에서, 표적은 SCS-Mph 마커이다. 일부 실시예에서, SCS-Mph 표적은 SCS-Mph에서 발현되지만 비-SCS-Mph에서는 발현되지 않는 항원이다. 일부 실시예에서, SCS-Mph 표적은 비-SCS-Mph에서보다 SCS-Mph에서 더 널리 퍼지는 항원이다. 예시적인 SCS-Mph 마커는 "피막하동 대식세포(Subcapsular Sinus Macrophage Cells)"라는 제목의 섹션에서 아래에 기술되며, 본 명세서의 어디에서든 제공되는 것들을 포함한다.
[00344] 특정 실시예에서, 표적은 FDC 마커이다. 일부 실시예에서, FDC 표적은 FDC에서 발현되지만 비-FDC에서는 발현되지 않는 항원이다. 일부 실시예에서, FDC 표적은 비-FDC에서보다 FDC에서 더욱 널리 퍼지는 항원이다. 예시적인 FDC 마커는 "소포 수지상 세포(Follicular Dendritic Cells)"라는 명칭의 섹션에서 아래에 기술되며, 본 명세서의 어디에서든 제공되는 것들을 포함한다.
[00345] 일부 실시예에서, 표적은 특정 세포 타입에서 발현되는 것이 바람직하다. 예컨대, SCS-Mph, FDC, 및/또는 B 세포 내의 SCS-Mph, FDC, 및/또는 B 세포 표적은 기준 집단에 대해 SCS-Mph, FDC, 및/또는 B 세포에서 적어도 2겹, 적어도 3겹, 적어도 4겹, 적어도 5겹, 적어도 10겹, 적어도 20겹, 적어도 50겹, 적어도 100겹, 적어도 500겹, 또는 적어도 1000겹이 과도 발현된다. 일부 실시예에서, 기준 집단은 비-SCS-Mph, FDC, 및/또는 B 세포를 포함할 수 있다.
[00346] 일부 실시예에서, 활성화된 SCS-Mph, FDC, 및/또는 B 세포 내의 SCS-Mph, FDC, 및/또는 B 세포 표적의 발현은 기준 집단에 대해 적어도 2겹, 적어도 3겹, 적어도 4겹, 적어도 5겹, 적어도 10겹, 적어도 20겹, 적어도 50겹, 적어도 100겹, 적어도 500겹, 또는 적어도 1000겹이 과도 발현된다. 일부 실시예에서, 기준 집단은 비활성화된 SCS-Mph, FDC, 및/또는 B 세포를 포함할 수 있다.
[00347] 피막하동 대식세포
[00348] 본 발명은 피막하동 대식세포(SCS-Mph)에 대한 항원 표적화가, 소포성 B 세포에서 바이러스와 같은 림프-매개 병원체의 효과적인 조기 제시에 관련된다는 인식을 포함한다(도 2). 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 마우스 발바닥에 수포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 아데노바이러스(AdV)를 피하 주사한 후, 바이러스 입자들이 배수 슬와 림프절에서 CD169+ SCS-Mph에 의해 효과적으로 그리고 선택적으로 보유되었다. 이 바이러스로 시험감염시켰을 때 이들 림프절에 존재하는 VSV-특이적 B 세포 수용체(BCR) 트랜스제닉 B 세포들이 빠르게 활성화되어 대단히 높은 항체 역가가 발생되었다. 클로드로네이트(이것은 Mph에 독성이다)를 첨가한 리포솜을 주사하여 SCS-Mph를 결실시키자 조기 B 세포 활성화가 사라졌으며, 이는 SCS-Mph가 B 세포에 대한 림프-매개 미립자 항원의 제시에 필수적임을 시사한다.
[00349] B 세포는 용액에서보다는 고착된 표면에서 이들에 대해 제시되는 다가 항원들에 의해 더 강하게 활성화된다. 임의의 한 가지 이론에 결부시키려는 것은 아니지만, 본 발명은 많은 외피보유 바이러스들(VSV 등)이 자신의 외피 당단백질에 대해 강한 중화 항체 반응을 도출하는 이유를 제시한다. 이 항원성 단백질은 바이러스 입자의 표면에서 매우 고 밀도로 제시되며, 이 바이러스 입자들은 비교적 고정적 방식으로 B 세포에 제시되는데, 즉 SCS-Mph의 원형질막에 결합된다. 본 발명은 피하 주사에 의해 SCS-Mph를 표적화하여 이들의 표면에 입체형태적으로 완전한 다가 항원들을 제시함으로써 바이러스 입자를 의태하는 백신 캐리어가 강한 B 세포 반응을 자극할 수 있다는 인식을 포함한다.
[00350] 일부 실시예에서, SCS-Mph 표적화는 CD169(즉, 시알로어드히신), CD11b(즉, CD11b/CD18, Mac-1, CR3, 또는 αMβ2 인테그린), 및/또는 만노스 수용체(즉, 다가 렉틴)와 결합하는 모이어티들에 의해 달성되며, 이들은 모두 SCS-Mph에서 우세하게 발현되는 단백질들이다. 이러한 모이어티의 예들은 본 명세서의 다른 곳에서 제공된 것들을 포함한다.
[00351] 일부 실시예에서, SCS-Mph 표적화는 대식세포 상에서 우세하게 발현되고 및/또는 존재하는 임의의 존재(예컨대, 단백질, 지질, 탄수화물, 소분자 등)(즉, SCS-Mph 마커)와 특이적으로 결합하는 임의의 표적화 모이어티에 의해 달성될 수 있다. 예시적인 SCS-Mph 마커는 아래에 제시된 것들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다: CD4(L3T4, W3/25, T4); CD9(p24, DRAP-1, MRP-1); CD11a(LFA-1α, αL 인테그린 사슬); CD11b(αM 인테그린 사슬, CR3, Mol, C3niR, Mac-1); CD11c(αX 인테그린, p150, 95, AXb2); CDw12(p90-120); CD13(APN, gp150, EC 3.4.11.2); CD14(LPS-R); CD15(X-합텐, 루이스 X, SSEA-1, 3-FAL); CD15s(시알릴 루이스 X); CD15u(3' 술포 루이스 X); CD15su(6 술포-시알릴 루이스 X); CD16a(FCRIIIA); CD16b(FcgRIIIb); CDw17(락토실세라마이드, LacCer); CD18(인테그린 β2, CD11a,b,c β-서브유닛); CD26(DPP IV 엑토에넴, ADA 결합 단백질); CD29(혈소판 GPIIa, β-1 인테그린, GP); CD31(PECAM-1, 엔도캄); CD32(FCγRII); CD33(gp67); CD35(CR1, C3b/C4b 수용체); CD36(GpIIIb, GPIV, PASIV); CD37(gp52-40); CD38(ADP-리보실 고리화효소, T1O); CD39(ATP 탈수소효소, NTP 탈수소효소-1); CD40(Bp50); CD43(시알로포린, 류코시알린); CD44(EMCRII, H-CAM, Pgp-1); CD45(LCA, T200, B220, Ly5); CD45RA; CD45RB; CD45RC; CD45RO(UCHL-1); CD46(MCP); CD47(gp42, IAP, OA3, 뉴로필린); CD47R(MEM-133); CD48(Blast-1, Hulym3, BCM-1, OX-45); CD49a(VLA-1α, α1 인테그린); CD49b(VLA-2α, gpla, α2 인테그린); CD49c(VLA-3α, α3 인테그린); CD49e(VLA-5α, α5 인테그린); CD49f(VLA-6α, α6 인테그린, gplc); CD50(ICAM-3); CD51(인테그린 α, VNR-α, 비트로넥틴-Rα); CD52(CAMPATH-1, HE5); CD53(OX-44); CD54(ICAM-1); CD55(DAF); CD58(LF A-3); CD59(1F5Ag, H19, 프로텍틴, MACIF, MIRL, P-18); CD60a(GD3); CD60b(9-O-아세틸 GD3); CD61(GP IIIa, β3 인테그린); CD62L(L-셀렉틴, LAM-1, LECAM-1, MEL-14, Leu8, TQ1); CD63(LIMP, MLA1, gp55, NGA, LAMP-3, ME491); CD64(FcγRI); CD65(세라마이드, VIM-2); CD65s(시알릴화-CD65, VIM2); CD72(Ly-19.2, Ly-32.2, Lyb-2); CD74(Ii, 불변 사슬); CD75(시알로-마스크 락토사민); CD75S(α2,6-시알릴화 락토사민); CD80(B7, B7-1, BB1); CD81(TAPA-1); CD82(4F9, C33, IA4, KAI1, R2); CD84(p75, GR6); CD85a(ILT5, LIR2, HL9); CD85d(ILT4, LIR2, MIR1O); CD85J(ILT2, LIR1, MIR7); CD85k(ILT3, LIR5, HM18); CD86(B7-2/B70); CD87(uPAR); CD88(C5aR); CD89(IgA Fc 수용체, FcαR); CD91(α2M-R, LRP); CDw92(p70); CDw93(GR11); CD95(APO-1, FAS, TNFRSF6); CD97(BL-KDD/F12); CD98(4F2, FRP-1, RL-388); CD99(MIC2, E2); CD99R(CD99 Mab 제한적); CD1OO(SEMA4D); CD1O1(IGSF2, P126, V7); CD102(ICAM-2); CD111(PVRL1, HveC, PRR1, 넥틴 1, HIgR); CD112(HveB, PRR2, PVRL2, Nectin2); CD114(CSF3R, G-CSRF, HG-CSFR); CD115(c-fms, CSF-1R, M-CSFR); CD116(GM-CSFRα); CDw119(IFNγR, IFNγRA); CD120a(TNFRI, p55); CD120b(TNFRII, p75, TNFR p80); CD121b(제2형 IL-1R); CD122(IL2Rβ); CD123(IL-3Rα); CD124(IL-4Rα); CD127(p90, IL-7R, IL-7Rα); CD128a(IL-8Ra, CXCR1,(임시로 CD181로 재명명됨)); CD128b(IL-8Rb, CSCR2,(임시로 CD182로 재명명됨)); CD130(gp130); CD131(공통 β 서브유닛); CD132(공통 γ 사슬, IL-2Rγ); CDw136(MSP-R, RON, p158-ron); CDw137(4-1BB, ILA); CD139; CD141(트롬보모듈린, 페토모듈린); CD147(바시긴, EMMPRIN, M6, 0X47); CD148(HPTP-η, p260, DEP-1); CD155(PVR); CD156a(CD156, ADAM8, MS2); CD156b(TACE, ADAM17, cSVP); CDw156C(ADAM1O); CD157(Mo5, BST-1); CD162(PSGL-1); CD164(MGC-24, MUC-24); CD165(AD2, gp37); CD168(RHAMM, IHABP, HMMR); CD169(시알로어드히신), Siglec-1); CD170(Siglec 5); CD171(L1CAM, NILE); CD172(SIRP-1α, MyD-1); CD172b(SIRPβ); CD180(RP105, Bgp95, Ly64); CD181(CXCR1,(이전에는 CD128a라고 했음)); CD182(CXCR2,(이전에는 CD128b라고 했음)); CD184(CXCR4, NPY3R); CD191(CCR1); CD192(CCR2); CD195(CCR5); CDw197(CCR7(CDw197이었음)); CDw198(CCR8); CD204(MSR); CD205(DEC-25); CD206(MMR); CD207(랑게린); CDw210(CK); CD213a(CK); CDw217(CK); CD220(인슐린 R); CD221(IGF1 R); CD222(M6P-R, IGFII-R); CD224(GGT); CD226(DNAM-1, PTA1); CD230(프리온 단백질(PrP)); CD232(VESP-R); CD244(2B4, P38, NAIL); CD245(p220/240); CD256(APRIL, TALL2, TNF(리간드) 상과, 멤버 13); CD257(BLYS, TALL1, TNF(리간드) 상과, 멤버 13b); CD261(TRAIL-R1, TNF-R 상과, 멤버 10a); CD262(TRAIL-R2, TNF-R 상과, 멤버 10b); CD263(TRAIL-R3, TNBF-R 상과, 멤버 10c); CD264(TRAIL-R4, TNF-R 상과, 멤버 1Od); CD265(TRANCE-R, TNF-R 상과, 멤버 11a); CD277(BT3.1, B7 패밀리: 부티로필린 3); CD280(TEM22, ENDO180); CD281(TLR1, TOLL-유사 수용체 1); CD282(TLR2, TOLL-유사 수용체 2); CD284(TLR4, TOLL-유사 수용체 4); CD295(LEPR); CD298(ATP1B3, Na K ATPase, β3 서브유닛); CD300a(CMRF-35H); CD300c(CMRF-35A); CD300e(CMRF-35L1); CD302(DCL1); CD305(LAIR1); CD312(EMR2); CD315(CD9P1); CD317(BST2); CD321(JAM1); CD322(JAM2); CDw328(Siglec7); CDw329(Siglec9); CD68(gp110, 마크로시알린); 및/또는 만노스 수용체. 괄호에 나타낸 명칭은 또 다른 이름이다. 이러한 마커의 예들은 본 명세서의 다른 곳에서 제공된 것들을 포함한다.
[00352] 일부 실시예에서, SCS-Mph 표적화는 활성화시 대식세포 상에 우세하게 발현되고 및/또는 존재하는 임의의 존재(예컨대, 단백질, 지질, 탄수화물, 소분자 등)와 특이적으로 결합하는 임의의 표적화 모이어티에 의해 달성될 수 있다(즉, 활성화된 SCS-Mph 마커). 예시적인 활성화된 SCS-Mph 마커는 아래에 제시된 것들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다: CD1a(R4, T6, HTA-1); CD1b(R1); CD1c(M241, R7); CD44R(CD44v, CD44v9); CD49d(VLA-4α, α4 인테그린); CD69(AIM, EA1, MLR3, gp34/28, VEA); CD105(엔도글린); CD142(조직 인자, 트롬보플라스틴, F3); CD143(ACE, 펩티딜 디펩티다제 A, 키니나제 II); CD153(CD3OL, TNSF8); CD163(M130, GHI/61, RM3/1); CD166(ALCAM, KG-CAM, SC-1, BEN, DM-GRASP); CD227(MUC1, PUM, PEM, EMA); CD253(TRAIL, TNF(리간드) 상과, 멤버 10); CD273(B7DC, PDL2); CD274(B7H1, PDL1); CD275(B7H2, ICOSL); CD276(B7H3); CD297(ART4, ADP-리보실트랜스페라제 4); 및 Dombrock 혈액군 당단백질. 괄호에 나타낸 명칭은 또 다른 이름이다. 이러한 마커의 예들은 본 명세서의 다른 곳에서 제공된 것들을 포함한다.
[00353] B 세포 표적화 모이어티
[00354] 일부 실시예에서, B 세포 표적화는 B 세포 및 FDC 상에 발현되는 단백질인 보체 수용체, CRl(즉, CD35) 또는 CR2(즉, CD21)와 결합하는 모이어티에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시예에서, B 세포 표적화는 CD19, CD20, 및/또는 CD22와 같은 B 세포 마커에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시예에서, B 세포 표적화는 CD40, CD52, CD80, CXCR5, VLA-4, 제II형 MHC, 표면 IgM 또는 IgD, APRL, 및/또는 BAFF-R와 같은 B 세포 마커에 의해 달성될 수 있다. 본 발명은 보체 수용체 또는 다른 APC-관련 분자들에 특이적인 모이어티에 의한 B 세포들의 동시 표적화가 체액성 반응을 증강시킨다는 인식을 포함한다.
[00355] 일부 실시예에서, B 세포 표적화는 B 세포 상에 우세하게 발현되고 및/또는 존재하는 임의의 존재(예컨대, 단백질, 지질, 탄수화물, 소분자 등)과 특이적으로 결합하는 임의의 표적화 모이어티에 의해 달성될 수 있다(즉, B 세포 마커). 예시적인 B 세포 마커는 아래에 제시된 것들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다: CD1c(M241, R7); CD1d(R3); CD2(E-로제트 R, T11, LFA-2); CD5(T1, Tp67, Leu-1, Ly-1); CD6(T12); CD9(p24, DRAP-1, MRP-1); CD11a(LFA-1α, αL 인테그린 사슬); CD11b(αM 인테그린 사슬, CR3, Mol, C3niR, Mac-1); CD11c(αX 인테그린, P150, 95, AXb2); CDw17(락토실세라마이드, LacCer); CD18(인테그린 β2, CD11a, b, c β-서브유닛); CD19(B4); CD20(B1, Bp35); CD21(CR2, EBV-R, C3dR); CD22(BL-CAM, Lyb8, Siglec-2); CD23(FceRII, B6, BLAST-2, Leu-20); CD24(BBA-1, HSA); CD25(Tac 항원, IL-2Rα, p55); CD26(DPP IV 엑토에넴, ADA 결합 단백질); CD27(T14, S152); CD29(혈소판 GPIIa, β-1 인테그린, GP); CD31(PECAM-1, 엔도캄); CD32(FCγRII); CD35(CR1, C3b/C4b 수용체); CD37(gp52-40); CD38(ADP-리보실 고리화효소, T10); CD39(ATP 탈수소효소, NTP 탈수소효소-1); CD40(Bp50); CD44(ECMRII, H-CAM, Pgp-1); CD45(LCA, T200, B220, Ly5); CD45RA; CD45RB; CD45RC; CD45RO(UCHL-1); CD46(MCP); CD47(gp42, IAP, OA3, 뉴로필린); CD47R(MEM-133); CD48(Blast-1, Hulym3, BCM-1, OX-45); CD49b(VLA-2α, gp1a, α2 인테그린); CD49c(VLA-3α, α3 인테그린); CD49d(VLA-4α, α4 인테그린); CD50(ICAM-3); CD52(CAMPATH-1, HES); CD53(OX-44); CD54(ICAM-1); CD55(DAF); CD58(LFA-3); CD60a(GD3); CD62L(L-셀렉틴, LAM-1, LECAM-1, MEL-14, Leu8, TQ1); CD72(Ly-19.2, Ly-32.2, Lyb-2); CD73(엑토-5'-뉴시오티다제); CD74(Ii, 불변 사슬); CD75(시알로-마스크 락토사민); CD75S(α2, 6 시알릴화 락토사민); CD11(Pk 항원, BLA, CTH/Gb3); CD79a(Igα, MB1); CD79b(Igβ, B29); CD80; CD81(TAPA-1); CD82(4F9, C33, IA4, KAI1, R2); CD83(HB15); CD84(P75, GR6); CD85J(ILT2, LIR1, MIR7); CDw92(p70); CD95(APO-1, FAS, TNFRSF6); CD98(4F2, FRP-1, RL-388); CD99(MIC2, E2); CD100(SEMA4D); CD102(ICAM-2); CD108(SEMA7A, JMH 혈액군 항원); CDw119(IFNγR, IFNγRa); CD120a(TNFRI, p55); CD120b(TNFRII, p75, TNFR p80); CD121b(제2형 IL-1R); CD122(IL2Rβ); CD124(IL-4Rα); CD130(gp130); CD132(공통 γ 사슬, IL-2Rγ); CDw137(4-1BB, ILA); CD139; CD147(바시긴, EMMPRIN, M6, 0X47); CD150(SLAM, IPO-3); CD162(PSGL-1); CD164(MGC-24, MUC-24); CD166(ALCAM, KG-CAM, SC-1, BEN, DM-GRASP); CD167a(DDR1, trkE, cak); CD171(L1CMA, NILE); CD175s(시알릴-Tn(S-Tn)); CD180(RP105, Bgp95, Ly64); CD184(CXCR4, NPY3R); CD185(CXCR5); CD192(CCR2); CD196(CCR6); CD197(CCR7(CDwl97이었음)); CDwl97(CCR7, EBI1, BLR2); CD200(OX2); CD205(DEC-205); CDw210(CK); CD213a(CK); CDw217(CK); CDw218a(IL18Rα); CDw218b(IL18Rβ); CD220(인슐린 R); CD221(IGF1R); CD222(M6P-R, IGFII-R); CD224(GGT); CD225(Leu13); CD226(DNAM-I, PTA1); CD227(MUC1, PUM, PEM, EMA); CD229(Ly9); CD230(프리온 단백질(Prp)); CD232(VESP-R); CD245(p220/240); CD247(CD3 제타 사슬); CD261(TRAIL-R1, TNF-R 상과, 멤버 10a); CD262(TRAIL-R2, TNF-R 상과, 멤버 10b); CD263(TRAIL-R3, TNF-R 상과, 멤버 10c); CD264(TRAIL-R4, TNF-R 상과, 멤버 1Od); CD265(TRANCE-R, TNF-R 상과, 멤버 IIa); CD267(TACI, TNF-R 상과, 멤버 13B); CD268(BAFFR, TNF-R 상과, 멤버 13C); CD269(BCMA, TNF-R 상과, 멤버 16); CD275(B7H2, ICOSL); CD277(BT3.1.B7 패밀리: 부티로필린 3); CD295(LEPR); CD298(ATP1B3 Na K ATPase β3 서브유닛); CD300a(CMRF-35H); CD300c(CMRF-35A); CD305(LAIR1); CD307(IRTA2); CD315(CD9P1); CD316(EW12); CD317(BST2); CD319(CRACC, SLAMF7); CD321(JAM1); CD322(JAM2); CDw327(Siglec6, CD33L); CD68(gp100, 마크로시알린); CXCR5; VLA-4; 제II형 MHC; 표면 IgM; 표면 IgD; APRL; 및/또는 BAFF-R. 괄호에 나타낸 명칭은 또 다른 이름이다. 이러한 마커의 예들은 본 명세서의 다른 곳에서 제공된 것들을 포함한다.
[00356] 일부 실시예에서, B 세포 표적화는 활성화시 B 세포 상에 우세하게 발현되고 및/또는 존재하는 임의의 존재(예컨대, 단백질, 지질, 탄수화물, 소분자 등)에 특이적으로 결합하는 임의의 표적화 모이어티에 의해 달성될 수 있다(즉, 활성화된 B 세포 마커). 예시적인 활성화된 B 세포 마커는 아래에 제시된 것들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다: CD1a(R4, T6, HTA-1); CD1b(R1); CD15s(시알릴 루이스 X); CD15u(3' 술포 루이스 X); CD15su(6 술포-시알릴 루이스 X); CD30(Ber-H2, Ki-1); CD69(AIM, EA1, MLR3, gp34/28, VEA); CD70(Ki-24, CD27 리간드); CD80(B7, B7-1, BB1); CD86(B7-2/B70); CD97(BL- KDD/F12); CD125(IL-5Rα); CD126(IL-6Rα); CD138(신데칸-1, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸); CD152(CTLA-4); CD252(OX40L, TNF(리간드) 상과, 멤버 4); CD253(TRAIL, TNF(리간드) 상과, 멤버 10); CD279(PD1); CD289(TLR9, TOLL-유사 수용체 9); 및 CD312(EMR2). 괄호에 나타낸 명칭은 또 다른 이름이다. 이러한 마커의 예들은 본 명세서의 다른 곳에서 제공된 것들을 포함한다.
[00357] 소포 수지상 세포
[00358] 미지의 항원이 처음으로 검출된 B 세포는 통상적으로 해당 항원에 대해 아최적 결합 친화성을 가진 B 세포 수용체(BCR, 즉, 막관통 도메인을 가진 항체)를 발현한다. 그러나, B 세포는 생식 중심(GC) 반응으로 들어가면 이들이 만드는 항체의 친화성을 몇 배까지 증가시킬 수 있다. 이 사건은 통상적으로 몇 주간 지속되며, 활성화된 B 세포에 대한 항원성 물질을 제시하고 보유하고 축적하는 FDC에 좌우된다. 급격하게 증식하는 B 세포는 이들의 항체의 항원 결합 부위를 암호화하는 게놈 서열에 반복적으로 돌연변이를 만들고, 유형-전환 재조합이 일어나서, 대부분 IgG 동형(isotype)인 분비형 고-친화성 항체를 형성한다. GC 반응은 또한 장기간 생존하는 기억 B 세포와 원형질 세포의 생성을 자극하는데, 이들은 주로 수년 동안 높은 보호 항체 역가를 유지한다. 피하 주사시 FDC를 표적화하고, 장기간 동안 FDC 표면에 보유되는 백신 캐리어는 백신접종에 반응하여 GC 반응을 증강시키고, 원하는 체액성 면역반응의 친화성 및 수명을 개선할 것으로 예측된다.
[00359] 일부 실시예에서, FDC 표적화는 FDC 및 B 세포 상에 발현되는 단백질인 보체 수용체, CRl(즉, CD35) 또는 CR2(즉, CD21)와 결합하는 모이어티에 의해 달성될 수 있다. 모이어티의 예들은 본 명세서의 다른 곳에 제공된 것들을 포함한다.
[00360] 다중 표적화 모이어티를 포함하는 백신 나노캐리어
[00361] GC 반응과 B 세포 생존에는 FDC가 필요할 뿐 아니라, 활성화된 CD4 T 세포에 의해 제공되는 도움에도 좌우된다. CD4 T 세포가 제II형 MHC(pMHC)에서 동족 펩티드를 제시하는 DC에 의해 먼저 자극되어 소포성 헬퍼(TFH) 표현형을 이루었을 때 도움이 가장 효과적으로 제공된다. 다음에, 새로 생성된 TFH 세포가 B 소포를 향해 이동하여 B 세포에 도움을 주어 이들이 동일한 pMHC 복합체와 함께 제시되게 된다. 이를 위해, B 세포는 먼저 항원성 물질(예컨대, 바이러스 또는 바이러스-유사 백신)을 획득하고, 그것을 내재화하여 가공한 다음(즉, 제II형 MHC에 로딩될 펩티드를 추출), TFH 세포에 pMHC를 제시한다.
[00362] 따라서, 본 발명은 최적의 체액성 면역을 자극하는 백신에 다음의 몇 가지 특징들과 구성요소들이 조합될 수 있다는 인식을 포함한다(도 1):(a) DC에 표적되고 DC에 의해 제시되는 CD4 T 세포에 대한 항원성 물질;(b) SCS-Mph에 의해서 항원-특이적 소포성 B 세포에 자생 형태로 제시될 수 있는 표면 항원;(c) TFH 세포에의 제시를 위해 소포성 B 세포에 의해 획득되고 가공될 수 있는 역량(본 발명은 B 세포가 SCS-Mph로부터 미립자 물질을 쉽게 획득하여 내재화한다는 인식을 포함한다);(d) FDC에 도달하여 장기간 동안 손상되지 않은 형태로 FDC 상에 보유될 수 있는 능력; 및(e) APC를 충분히 면역원성으로 만들고 내성을 피하거나 극복할 수 있게 하는 보조제 활성.
[00363] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 적어도 하나의 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어의 표적화 모이어티들은 전부 서로 동일하다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 여러 상이한 타입의 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 다수의 개별적 표적화 모이어티를 포함하며, 이들은 전부 서로 동일하다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 정확히 한 가지 타입의 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 정확히 2가지 다른 타입의 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 2가지를 넘는 다른 타입의 표적화 모이어티를 포함한다.
[00364] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 단일 세포 타입으로 백신 나노캐리어의 송달을 이끄는 단일 타입의 표적화 모이어티를 포함한다(예컨대, SCS-Mph만으로 송달). 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 다수 세포 타입으로 백신 나노캐리어의 송달을 이끄는 단일 타입의 표적화 모이어티를 포함한다(예컨대, SCS-Mph 및 FDC로 송달). 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 2가지 타입의 표적화 모이어티를 포함하며, 이때 제 1 타입의 표적화 모이어티는 한 가지 세포 타입으로 백신 나노캐리어의 송달을 이끌고, 제 2 타입의 표적화 모이어티는 제 2 세포 타입으로 백신 나노캐리어의 송달을 이끈다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 2가지를 넘는 타입의 표적화 모이어티를 포함하며, 이때 한 가지 이상의 타입의 표적화 모이어티는 한 가지 세포 타입으로 백신 나노캐리어의 송달을 이끌고, 한 가지 이상의 타입의 표적화 모이어티는 제 2 세포 타입으로 백신 나노캐리어의 송달을 이끈다. 한 가지 예를 들자면, 백신 나노캐리어는 2가지 타입의 표적화 모이어티를 포함할 수 있고, 이때 제 1 타입의 표적화 모이어티는 DC로의 백신 나노캐리어의 송달을 이끌며, 제 2 타입의 표적화 모이어티는 SCS-Mph로의 백신 나노캐리어의 송달을 이끈다.
[00365] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 백신 나노캐리어의 외부 표면과 연관되는 적어도 하나의 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시예에서, 연관은 공유 방식이다. 일부 실시예에서, 공유 연관은 하나 이상의 링커에 의해 매개된다. 일부 실시예에서, 연관은 비-공유 방식이다. 일부 실시예에서, 비-공유 연관은 전하 상호작용, 친화성 상호작용, 금속 배위, 물리적 흡착, 호스트-게스트 상호작용, 소수성 상호작용, TT 스택킹 상호작용, 수소결합 상호작용, 반데르 발스 상호작용, 자기적 상호작용, 정전기적 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 및/또는 이들의 조합에 의해 매개된다.
[00366] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 지질막(예컨대, 지질 이중층, 지질 단일층 등)을 포함하며, 이때 적어도 하나의 표적화 모이어티가 지질막과 연관된다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 표적화 모이어티는 지질막 내에 임베드된다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 표적화 모이어티는 지질 이중층의 내강에 임베드된다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 표적화 모이어티는 백신 나노캐리어에서 여러 장소에 위치될 수 있다. 예를 들어, 제 1 표적화 모이어티는 지질막에 임베드될 수 있고, 제 2 면역자극제가 백신 나노캐리어의 외부 표면과 연관될 수 있다. 또 다른 예를 들자면, 제 1 표적화 모이어티와 제 2 표적화 모이어티가 모두 백신 나노캐리어의 외부 표면과 연관될 수 있다.
면역자극제
[00367] 상술한 바와 같이, 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 면역반응이 자극되도록 도울 수 있는 하나 이상의 면역자극제를 수송할 수 있다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 B 세포와 T 세포를 모두 자극하는 단일 타입의 면역자극제를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 2가지 타입의 면역자극제를 포함하며, 이때 제 1 타입의 면역자극제는 B 세포를 자극하고, 제 2 타입의 면역자극제는 T 세포를 자극한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 2가지를 넘는 타입의 면역자극제를 포함하며, 이때 한 가지 이상의 타입의 면역자극제는 B 세포를 자극하고, 한 가지 이상의 타입의 면역자극제는 T 세포를 자극한다. 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 면역자극제에 관한 더 상세한 설명은 상기 섹션을 참조한다.
B 세포 활성화 분석
[00368] 일부 실시예에서, 다양한 분석을 이용하여 면역반응이 B 세포 또는 B 세포군에서 자극되었는지의 여부를 결정할 수 있다(즉, B 세포 또는 B 세포군의 "활성화"되었는지의 여부). 일부 실시예에서, B 세포 면역반응의 자극은 항체 역가를 측정함으로써 결정될 수 있다. 일반적으로, "항체 역가"는 특정 희석비에서 항원과 결합하여 항원을 중화시키는 항체의 능력을 말한다. 예를 들어, 고 항체 역가는 고 희석비에서도 항원과 결합하여 항원을 중화시키는 항체의 능력을 말한다. 일부 실시예에서, 비-면역화된 개체 또는 사전-면역 혈청에 비하여 적어도 약 5-배 이상, 적어도 약 10-배 이상, 적어도 약 20-배 이상, 적어도 약 50-배 이상, 적어도 약 100-배 이상, 적어도 약 500-배 이상, 적어도 약 1000 배 이상, 또는 약 1000-배 이상을 넘는 희석비에서 항체 역가가 양성인 것으로 측정된다면 B 세포 면역반응이 자극된 것이라고 한다.
[00369] 일부 실시예에서, B 세포 면역반응의 자극은 항체 친화성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 특히, 항체가 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 10-10 M 미만, 10-11 M 미만, 10-12 M 미만, 또는 이 이하의 평형 해리상수(IQ)를 가진다면 B 세포 면역반응이 자극된 것이라고 한다.
[00370] 일부 실시예에서, 유형-전환 재조합이 일어났다면 B 세포 면역반응이 자극된 것이라고 한다. 특히, IgM에서 IgG 동형, 또는 이들 동형의 혼합물로의 전환이 B 세포에서 T 세포 의존성 면역반응의 징표이다.
[00371] 일부 실시예에서, B 세포 면역반응은 항원-특이적 항체의 친화성 성숙을 측정함으로써 결정된다. 친화성 성숙은 생식 중심 반응 동안 일어나며, 이로써 활성화된 B 세포가 항원-결합 영역을 암호화하는 면역글로불린 유전자의 영역에 반복적으로 돌연변이를 만든다. 항원에 대한 친화성이 더 높은 B 세포 생산 돌연변이 항체들은 우선적으로 생존하여 증식할 수 있다. 이와 같이, 시간이 지남에 따라, GC에서 B 세포에 의해 만들어진 항체들은 더 높은 친화성을 누적하여 획득한다. 일부 실시예에서, 고 항체 역가의 존재로 이 과정의 판독이 이루어진다(즉, 높은 희석비에서도 항원과 결합하여 항원을 중화시키는 고 친화성 IgG 항체).
[00372] 일부 실시예에서, 연장된 시간 기간 동안 고 친화성 항체를 다량으로 생산할 수 있는 기억 B 세포 및/또는 장기간 생존하는 원형질 세포가 형성되었다면 B 세포 면역반응이 자극된 것이라고 한다. 일부 실시예에서, 항체 역가는 백신접종 후 상이한 시간 간격이 지난 뒤에 측정되며(예를 들어, 2주, 1개월, 2개월, 6개월, 1년, 2년, 5년, 10년, 15년, 20년, 25년, 또는 그 이상), 이로써 연장된 시간 기간 동안 고 친화성 항체를 다량으로 생산할 수 있는 기억 B 세포 및/또는 장기간 생존하는 원형질 세포의 존재를 시험할 수 있다. 일부 실시예에서, 연장된 시간 기간 동안 고 친화성 항체를 다량으로 생산할 수 있는 기억 B 세포 및/또는 장기간 생존하는 원형질 세포는 체액성 반응을 측정함으로써 그 존재 여부를 말할 수 있다(예를 들어, 체액성 반응이 현저히 더 빨라지고, 그 결과로 초기 감작 동안에 비해 나중의 부스터 백신접종 이후 역가가 더 높아진 경우).
[00373] 일부 실시예에서, 급격한 생식 중심 반응이 일어날 때 B 세포 면역반응이 자극된 것이라고 한다. 일부 실시예에서, 급격한 생식 중심 반응은 조직학 실험을 수행함으로써 시각적으로 평가될 수 있다. 일부 실시예에서, 급격한 생식 중심 반응은 항원-함유 림프양 조직(예를 들어, 백신-배수 림프절, 비장 등)의 면역조직화학 검사를 수행함으로써 분석될 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조직화학 검사 후에 유세포분석이 이어진다.
[00374] 일부 실시예에서, B 세포 면역반응의 자극은 항체 동형(예를 들어, IgG, IgA, IgE, IgM)을 확인함으로써 결정될 수 있다. 특정 실시예에서, B 세포에 의한 IgG 동형 항체의 생산은 B 세포의 바람직한 면역반응이다.
[00375] 일부 실시예에서, B 세포 면역반응은 중화 분석에서 항체 기능을 분석함으로써 결정된다. 특히, 혈청의 부재하에 시험관내에서 감수성 셀라인을 감염시키는 미생물(예컨대, 바이러스, 박테리움, 진균, 원생동물, 기생충 등)의 능력이 면역 및 비-면역 혈청을 상이한 희석비로 세포가 성장된 배양 배지에 첨가하는 조건에서 비교된다. 특정 실시예에서, 미생물의 감염이 약 1:5, 약 1:10, 약 1:50, 약 1:100, 약 1:500, 약 1:1000, 약 1:5000, 약 1:10,000, 또는 이 이하의 희석비에서 중화된다면 B 세포 면역반응이 자극된 것이라고 한다.
[00376] 일부 실시예에서, 동물 모델에서 백신의 효능은 통상적으로 치사적인 미생물 용량으로 면역화된 마우스와 비-면역화된 마우스 그룹을 감염시킴으로써 결정될 수 있다(예컨대, 백신접종 후 3주 이상이 지난 뒤). 두 그룹에서 생존 규모와 생존 기간을 모니터한 결과, 이들은 통상적으로 Kaplan-Meier 곡선 그래프를 나타냈다. 증진된 생존이 B 세포 반응으로 인한 것인지의 여부를 평가하기 위해서, 면역 마우스에서 얻은 혈청을 "패시브 백신"으로서 전달하여 치사 감염으로부터 비-면역 마우스의 보호를 평가할 수 있다.
[00377] 당업자는 상기 설명된 분석들이 B 세포 활성화가 일어났는지의 여부를 결정하기 위해 이용될 수 있는 예시적인 방법들일 뿐임을 인정할 것이다. B 세포 활성화가 일어났는지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있는 당업자에게 공지된 임의의 분석도 본 발명의 범위에 들어간다. 본 명세서에 기술된 분석들과 B 세포 활성화가 일어났는지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있는 추가의 분석들이 Current Protocols in Immunology(John Wiley & Sons, Hoboken, NY, 2007; 본 명세서에 참고로 포함된다)에 설명된다.
나노캐리어
[00378] 본 명세서에 기술된 나노캐리어들 중 어느 것이 백신 나노캐리어일 수 있다. 본 명세서에 제공된 개시 중 일부는 구체적으로 백신 나노캐리어를 언급하지만, 달리 특정되지 않는다면 그 개시는 백신 나노캐리어에만 제한되지 않으며, 본 명세서에 기술된 나노캐리어들 중 어느 것에도 적용된다는 것을 알 것이다.
[00379] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는, 예를 들면, B 세포 및 T 세포 중 하나 또는 둘 모두에서 면역반응을 자극할 수 있는 적어도 하나의 면역조절제를 포함하는 합성 나노캐리어이다. 면역조절제는 본원에 더 상세히 설명된 바와 같이 임의의 방식으로도 나노캐리어와 연관될 수 있다.
[00380] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 생분해성이며 생체적합성이다. 일반적으로, 생체적합성 물질은 세포에 독성이 아니다. 일부 실시예에서, 임의의 물질이 세포에 첨가된 때 세포사가 특정 역치 미만으로 일어난다면(예컨대, 50%, 20%, 10%, 5%, 또는 이 이하의 세포사) 그 물질은 생체적합성인 것으로 간주된다. 일부 실시예에서, 임의의 물질이 세포에 첨가된 때 부작용을 유도하지 않는다면 그 물질은 생체적합성인 것으로 간주된다. 일반적으로, 생분해성 물질은 치료와 관련된 시간 기간(예컨대, 수주, 수개월, 또는 수년)의 과정에서 생리학적 조건하에서 파괴되는 것이다. 일부 실시예에서, 생분해성 물질은 세포 기구에 의해 파괴될 수 있는 물질이다. 일부 실시예에서, 생분해성 물질은 화학적 과정에 의해 파괴될 수 있는 물질이다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 생체적합성이면서 생분해성인 물질이다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 생체적합성이지만 생분해성은 아닌 물질이다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 생분해성이지만 생체적합성은 아닌 물질이다.
[00381] 일부 실시예에서, 본 발명에 따른 나노캐리어는 최대 치수(예컨대, 직경)이 5 마이크론(μm) 미만인 임의의 존재이다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어는 3 μm 미만의 최대 치수를 가진다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어는 1000 나노미터(nm) 미만의 최대 치수를 가진다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어는 900 nm, 800 nm, 700 nm, 600 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm, 또는 100 nm 미만의 최대 치수를 가진다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어는 300 nm 이하의 최대 치수(예컨대, 직경)을 가진다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어는 250 nm 이하의 최대 치수(예컨대, 직경)을 가진다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어는 200 nm 이하의 최대 치수(예컨대, 직경)을 가진다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어는 150 nm 이하의 최대 치수(예컨대, 직경)을 가진다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어는 100 nm 이하의 최대 치수(예컨대, 직경)을 가진다. 더 작은 나노캐리어, 예를 들어 최대 치수가 50 nm 이하인 나노캐리어가 본 발명의 일부 실시예에서 사용된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어는 25 nm 내지 200 nm 범위의 최대 치수를 가진다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어는 20 nm 내지 100 nm 범위의 최대 치수를 가진다. 일부 실시예에서, 본원에서 제공된 조성물의 나노캐리어는 500 nm 미만의 평균 기하 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 50 nm 초과 500 nm 미만의 평균 기하 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어 집단의 평균 기하 직경은 약 60 nm, 75 nm, 100 nm, 125 nm, 150 nm, 175 nm, 200 nm, 225 nm, 250 nm, 275 nm, 300 nm, 325 nm, 350 nm, 375 nm, 400 nm, 425 nm, 450 nm, 또는 475 nm이다. 일부 실시예에서, 평균 기하 직경은 100-400 nm, 100-300 nm, 100-250 nm, 또는 100-200 nm이다. 일부 실시예에서, 평균 기하 직경은 60-400 nm, 60-350 nm, 60-300 nm, 60-250 nm, 또는 60- 200 nm이다. 일부 실시예에서, 평균 기하 직경은 75-250 nm이다.
[00382] 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어의 최대 치수는 1000 나노미터(nm)를 초과한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어는 900 nm, 800 nm, 700 nm, 600 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm, 또는 100 nm를 초과하는 최대 치수를 가진다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어는 300 nm 이상의 최대 치수(예컨대, 직경)를 가진다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어는 250 nm 이상의 최대 치수(예컨대, 직경)를 가진다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어는 200 nm 이상의 최대 치수(예컨대, 직경)를 가진다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어는 150 nm 이상의 최대 치수(예컨대, 직경)를 가진다. 일부 실시예에서, 본 발명의 나노캐리어는 100 nm 이상의 최대 치수(예컨대, 직경)를 가진다. 더 작은 나노캐리어, 예를 들어 최대 치수가 50 nm 이상인 나노캐리어가 본 발명의 일부 실시예에서 사용된다.
[00383] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 1000 nm 미만의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 대략 750 nm의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 대략 500 nm의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 대략 450 nm의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 대략 400 nm의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 대략 350 nm의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 대략 300 nm의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 대략 275 nm의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 대략 250 nm의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 대략 225 nm의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 대략 200 nm의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 대략 175 nm의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 대략 150 nm의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 대략 125 nm의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 대략 100 nm의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 대략 75 nm의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 대략 50 nm의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 대략 25 nm의 직경을 가진다.
[00384] 특정 실시예에서, 나노캐리어는 신장 배설 한계보다 크기가 크다(예컨대, 나노캐리어는 6 nm를 초과하는 직경을 가진다). 특정 실시예에서, 나노캐리어는 간에 의해 혈류로부터 나노캐리어가 청소되는 것을 피할 만큼 충분히 작다(예컨대, 나노캐리어는 1000 nm 미만의 직경을 가진다. 일반적으로, 나노캐리어의 생리화학적 특징은 신장 배설 및 간 청소를 감소시킴으로써 혈장 중에서 나노캐리어가 더 오래 순환할 수 있도록 한다.
[00385] 각 나노캐리어가 유사한 특성을 가지도록 크기, 모양 및/또는 조성이 비교적 균일한 나노캐리어 집단을 사용하는 것이 주로 바람직하다. 예를 들어, 나노캐리어의 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 직경 또는 최대 치수가 평균 직경 또는 최대 치수의 5%, 10%, 또는 20% 내에 들어갈 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어 집단은 크기, 모양 및/또는 조성과 관련하여 불균질할 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어 집단의 나노캐리어들 중 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상이 500nm 미만의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어 집단의 나노캐리어들 중 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상이 50nm 초과 500nm 미만의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어 집단의 나노캐리어들 중 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상이 약 60 nm, 75 nm, 100 nm, 125 nm, 150 nm, 175 nm, 200 nm, 225 nm, 250 nm, 275 nm, 300 nm, 325 nm, 350 nm, 375 nm, 400 nm, 425 nm, 450 nm, 또는 475 nm의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어 집단의 나노캐리어들 중 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상이 100-400nm, 100-300nm, 100-250nm, 또는 100-200nm의 직경을 가진다. 일부 실시예에서, 나노캐리어 집단의 나노캐리어들 중 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상이 60-400 nm, 60-350 nm, 60-300 nm, 60-250 nm, 또는 60-200 nm의 직경을 가진다.
[00386] 여러 상이한 나노캐리어들이 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 구체 또는 구형이다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 평탄하거나 평평한 모양이다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 입방체 또는 입방형이다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 타원형 또는 타원체이다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 원통체, 원뿔체, 환상면체(즉, 도넛 모양), 또는 피라미드 모양이다. 일부 실시예에서, 입자는 리포솜이다. 일부 실시예에서, 입자는 미셀이다. 이들 모양들이 각각 일반적 범주의 "입자" 범위에 들어가며, 본 발명의 나노캐리어는 나노입자(즉, 1000nm 이하의 직경을 가진 입자), 마이크로입자(즉, 1000 마이크로입자(즉, 1000 마이크로미터 미만의 직경을 가진 입자), 또는 피코입자(즉, 1nm 미만의 직경을 가진 입자)를 포함할 수 있다는 것을 알 것이다. 또한, 일부 실시예에서(아래 더 상세히 설명된 지질-기반 나노캐리어와 같은), 나노캐리어는 단단하지 않으며, 환경에 기초하여 변화는 모양과 직경을 가질 수 있다.
[00387] "합성 나노캐리어의 최대 치수"는 합성 나노캐리어의 임의의 축을 따라서 측정된 나노캐리어의 최대 치수를 의미한다. "합성 나노캐리어의 최소 치수"는 합성 나노캐리어의 임의의 축을 따라서 측정된 나노캐리어의 최소 치수를 의미한다. 예를 들어, 구형 합성 나노캐리어에서, 합성 나노캐리어의 최대 및 최소 치수는 실질적으로 동일할 것이며, 직경의 크기일 것이다. 유사하게, 입방체 합성 나노캐리어에서, 합성 나노캐리어의 최소 치수는 높이, 너비 또는 길이 중의 최소 치수일 것이고, 합성 나노캐리어의 최대 치수는 높이, 너비 또는 길이 중의 최소 대수일 것이다. 일 구체예에서, 표본 중의 합성 나노캐리어의 총 수에 기초하여 표본 중의 합성 나노캐리어의 적어도 75%, 바람직하게 80%, 더 바람직하게 90%의 최소 치수는 100 nm를 초과한다. 한 구체예에서, 표본 중의 합성 나노캐리어의 총 수에 기초하여 표본 중의 합성 나노캐리어의 적어도 75%, 바람직하게 80%, 더 바람직하게 90%의 최대 치수는 5 μm 이하이다. 바람직하게, 표본 중의 합성 나노캐리어의 총 수에 기초하여 표본 중의 합성 나노캐리어의 적어도 75%, 바람직하게 80%, 더 바람직하게 90%의 최소 치수는 110 nm 초과, 더 바람직하게 120 nm 초과, 더 바람직하게 130 nm 초과, 그리고 더 바람직하게 150 nm를 초과한다. 바람직하게, 표본 중의 합성 나노캐리어의 총 수에 기초하여 표본 중의 합성 나노캐리어의 적어도 75%, 바람직하게 80%, 더 바람직하게 90%의 최대 치수는 3μm 이하, 더 바람직하게 2 μm 이하, 더 바람직하게 1 μm 이하, 더 바람직하게 800 nm 이하, 더 바람직하게 600nm 이하, 그리고 더 바람직하게 500 nm 이하이다. 바람직한 실시예에서, 표본 중의 합성 나노캐리어의 총 수에 기초하여 표본 중의 합성 나노캐리어의 적어도 75%, 바람직하게 80%, 더 바람직하게 90%의 최대 치수는 1OO nm 이상, 더 바람직하게 120 nm 이상, 더 바람직하게 130 nm 초과, 더 바람직하게 140 nm 초과, 그리고 더 바람직하게 150 nm를 초과한다. 합성 나노캐리어 크기의 측정은 액체(일반적으로 수성) 매질 중에 합성 나노캐리어를 현탁한 다음에, 동적 광 산란 방법(예컨대, Brookhaven ZetaPALS 기기를 사용한다)에 의해서 얻어진다. 나노캐리어는 고형체 또는 중공체일 수 있고, 하나 이상의 층을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 각 층은 다른 층(들)과 비교하여 독특한 조성과 독특한 특성을 가진다. 한 예를 들자면, 나노캐리어는 코어/쉘 구조를 가질 수 있으며, 이때 코어가 한 층(예컨대, 폴리머 중심)이고, 쉘이 제 2 층(예컨대, 지질 이중층 또는 단일층)이다. 나노캐리어는 복수의 상이한 층을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 한 층은 실질적으로 교차결합될 수 있고, 제 2 층은 실질적으로 교차결합되지 않는다(등등). 일부 실시예에서, 상이한 층들 중 하나, 몇 개 또는 전부가 하나 이상의 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 한 층은 면역조절제, 표적화 모이어티, 및/또는 면역자극제를 포함하고, 제 2 층은 면역조절제, 표적화 모이어티, 및/또는 면역자극제를 포함하지 않는다(등등). 일부 실시예에서, 각 층은 상이한 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 이들의 조합을 포함한다.
지질 나노캐리어
[00388] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 선택적으로 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 리포솜을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 지질 이중층을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 지질 단일층을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 미셀을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 지질 층(예컨대, 지질 이중층, 지질 단일층 등)으로 둘러싸인 폴리머 바탕질을 포함하는 코어를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 지질 층(예컨대, 지질 이중층, 지질 단일층 등)으로 둘러싸인 비-폴리머 중심(예를 들어, 금속 입자, 양자점, 세라믹 입자, 골입자, 바이러스 입자 등)을 포함할 수 있다.
[00389] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 나노캐리어의 내부와 외부가 친수성이고, 이질 이중층의 내강이 소수성이 되도록 배향된 지질 이중층을 포함할 수 있다. 지질 이중층을 포함하는 백신 나노캐리어의 예들이 실시예 2에 기술되고, 도 3-8에 도시된다. 일부 실시예에서, 소수성 면역조절제, 표적화 모이어티, 및/또는 면역자극제가 지질 이중층의 내강과 연관될 수 있다(예컨대, 내부에 임베드된다). 일부 실시예에서, 친수성 면역조절제, 표적화 모이어티, 및/또는 면역자극제가 나노캐리어의 내부 및/또는 외부와 연관될 수 있다(예컨대, 공유 또는 비-공유 연관, 내부 캡슐화 등). 일부 실시예에서, 친수성 면역조절제, 표적화 모이어티, 및/또는 면역자극제가 지질 이중층의 내부 및/또는 외부와 연관될 수 있다(예컨대, 공유 또는 비-공유 연관, 내부 캡슐화 등). 일부 실시예에서, 지질 이중층의 친수성 내부 표면이 양친매성 실재와 연관된다. 일부 실시예에서, 양친매성 실재는 양친매성 실재의 친수성 단부가 지질 이중층의 내부 표면과 연관되고, 양친매성 실재의 소수성 단부가 나노캐리어의 내부를 향해 배향되도록 배향되며, 이로써 나노캐리어 내부에 소수성 환경이 만들어진다.
[00390] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 나노캐리어의 내부가 소수성이고, 나노캐리어의 외부가 친수성이 되도록 배향된 지질 이중층을 포함할 수 있다. 지질 단일층을 포함하는 백신 나노캐리어의 예들이 실시예 2에 기술되고, 도 9 및 10에 도시된다. 일부 실시예에서, 소수성 면역조절제, 표적화 모이어티, 및/또는 면역자극제가 나노캐리어의 내부 및/또는 지질 단일층의 내부 표면과 연관될 수 있다(예컨대, 공유 또는 비-공유 연관, 내부 캡슐화 등). 일부 실시예에서, 친수성 면역조절제, 표적화 모이어티, 및/또는 면역자극제가 나노캐리어의 외부 및/또는 지질 단일층의 외부 표면과 연관될 수 있다(예컨대, 공유 또는 비-공유 연관, 내부 캡슐화 등). 일부 실시예에서, 지질 이중층의 소수성 내부 표면이 양친매성 실재와 연관된다. 일부 실시예에서, 양친매성 실재는 양친매성 실재의 소수성 단부가 지질 이중층의 내부 표면과 연관되고, 양친매성 실재의 친수성 단부가 나노캐리어의 내부를 향해 배향되도록 배향되며, 이로써 나노캐리어 내부에 친수성 환경이 만들어진다.
[00391] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 나노캐리어의 외부 표면과 연관된 하나 이상의 나노입자를 포함할 수 있다. 나노캐리어의 외부 표면과 연관된 나노입자를 포함하는 백신 나노캐리어의 예들이 실시예 2에 기술되고, 도 4, 6, 및 8에 도시된다.
[00392] 나노캐리어 중 지질의 퍼센트는 중량 기준으로 0% 내지 99%, 10% 내지 99%, 25% 내지 99%, 50% 내지 99%, 또는 75% 내지 99%의 범위일 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어 중 지질의 퍼센트는 중량 기준으로 0% 내지 75%, 0% 내지 50%, 0% 내지 25%, 또는 0% 내지 10%의 범위일 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어 중 지질의 퍼센트는 대략 1중량%, 대략 2중량%, 대략 3중량%, 대략 4중량%, 대략 5중량%, 대략 10중량%, 대략 15중량%, 대략 20중량%, 대략 25중량%, 또는 대략 30중량%일 수 있다.
[00393] 일부 실시예에서, 지질은 오일이다. 일반적으로, 본 분야에 알려진 임의의 오일이라도 나노캐리어에 포함될 수 있다. 일부 실시예에서, 오일은 하나 이상의 지방산 기 또는 그것의 염을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 지방산 기는 소화가능한 장쇄(예컨대, C8-C50), 치환 또는 비치환 탄화수소를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 지방산 기는 C10-C20 지방산 또는 그것의 염일 수 있다. 일부 실시예에서, 지방산 기는 C15-C20 지방산 또는 그것의 염일 수 있다. 일부 실시예에서, 지방산 기는 C15-C25 지방산 또는 그것의 염일 수 있다. 일부 실시예에서, 지방산 기는 불포화될 수 있다. 일부 실시예에서, 지방산 기는 단일 불포화될 수 있다. 일부 실시예에서, 지방산 기는 다중 불포화될 수 있다. 일부 실시예에서, 불포화 지방산 기의 이중 결합은 시스 입체형태일 수 있다. 일부 실시예에서, 불포화 지방산 기의 이중 결합은 트랜스 입체형태일 수 있다.
[00394] 일부 실시예에서, 지방산 기는 부티르산, 카프로산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 또는 리그노세르산 중 하나 이상일 수 있다. 일부 실시예에서, 지방산 기는 팔미톨레산, 올레산, 바센산, 리놀레산, 알파-리놀레산, 감마-리놀레산, 아라키돈산, 가돌레산, 아라키논산, 에이코사펜타에노산, 도코사헥사에노산, 또는 에루스산 중 하나 이상일 수 있다.
[00395] 일부 실시예에서, 오일은 액체 트리글리세리드이다.
[00396] 본 발명에서 사용하기 적합한 오일은 아래에 제시된 것들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다: 아몬드, 살구씨, 아보카도, 바바수, 베르가못, 블랙커랜드씨, 보리지, 카드, 카모마일, 카놀라, 캐러웨이, 카르나우바, 캐스톨, 시나몬, 코코아 버터, 코코넛, 간유, 커피, 옥수수, 목화씨, 에뮤, 유칼립투스, 달맞이꽃, 어류, 아마씨, 제라니올, 조롱박, 포도씨, 헤이즐넛, 히솝, 호호바, 쿠쿠이넛, 라반딘, 라벤더, 레몬, 리트시, 쿠베바, 마카다미아넛, 당아욱, 망고씨, 메도폼씨, 밍크, 육두구, 올리브, 오랜지, 오랜지 러피, 야자수, 야자인, 복숭아인, 땅콩, 양귀비씨, 호박씨, 평지씨, 쌀겨, 로즈마리, 홍화, 백단, 사스쿠아나, 세이버리, 씨벅턴, 참깨, 시어버터, 실리콘, 대두, 해바라기, 차나무, 엉겅퀴, 츠바키, 베티버, 월넛, 및 맥아 오일들, 및 이들의 조합. 본 발명에서 사용하기 적합한 오일은 부틸 스테아레이트, 트리글리세리드 카프릴산, 트리글리세리드 카프르산, 시클로메티콘, 디에틸 세바케이트, 디메티콘 360, 이소프로필 미리스테이트, 미네랄 오일, 옥틸도데칸올, 올레일 알코올, 실리콘 오일, 및 이들을 조합을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시예에서, 지질은 호르몬(예컨대, 에스트로겐, 테스토스테론), 스테로이드(예컨대, 콜레스테롤, 담즙산), 비타민(예컨대, 비타민 E), 인지질(예컨대, 포스파티딜 콜린), 스핑고지질(예컨대, 세라마이드), 또는 지질단백질(예컨대, 아포리포단백질)이다.
폴리머 바탕질을 포함하는 나노캐리어
[00397] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 하나 이상의 폴리머를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 폴리머 바탕질은 코팅층(예를 들어, 리포솜, 지질 단일층, 미셀 등)으로 둘러싸일 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제, 표적화 모이어티 및/또는 면역자극제가 폴리머 바탕질과 연관될 수 있다. 이러한 실시예에서, 면역조절제, 표적화 모이어티 및/또는 면역자극제는 나노캐리어 내에 효과적으로 캡슐화된다.
[00398] 일부 실시예에서, 면역조절제, 표적화 모이어티 및/또는 면역자극제는 폴리머 바탕질과 공유 방식으로 연관될 수 있다. 일부 실시예에서, 공유 방식 연관은 링커에 의해 매개된다. 일부 실시예에서, 면역조절제, 표적화 모이어티 및/또는 면역자극제는 폴리머 바탕질과 비-공유 방식으로 연관될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 면역조절제, 표적화 모이어티 및/또는 면역자극제는 폴리머 바탕질 내에 캡슐화되고, 둘러싸이고, 및/또는 전체에 분산될 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 면역조절제, 표적화 모이어티 및/또는 면역자극제는 소수성 상호작용, 전하 상호작용, 반데르 발스 힘 등에 의해 중합체 바탕질과 연관될 수 있다.
[00399] 중합체 바탕질을 형성하기 위한 광범한 폴리머들과 방법들이 약물 송달 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 폴리머 바탕질은 하나 이상의 폴리머를 포함한다. 임의의 폴리머도 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 폴리머는 천연 또는 비천연(합성) 폴리머일 수 있다. 폴리머는 호모폴리머 또는 둘 이상의 모노머를 포함하는 코폴리머일 수 있다. 순서에 관해서, 코폴리머는 랜덤, 블럭일 수 있거나, 또는 랜덤과 블럭의 조합을 포함할 수 있다. 통상적으로, 본 발명에 따른 폴리머는 유기 폴리머이다.
[00400] 폴리머의 예들은 폴리에틸렌, 폴리카보네이트(예컨대, 폴리(1,3-디옥산-2-온)), 폴리무수물(예컨대, 폴리(무수 세박산), 폴리히드록시산(예를 들어, 폴리(β-히드록시알카노에이트)), 폴리프로필푸머레이트, 폴리카프로락톤, 폴리아미드(예컨대, 폴리카프로락탐), 폴리아세탈, 폴리에테르, 폴리에스테르(예컨대, 폴리락티드, 폴리글리콜리드), 폴리(오르토에스테르), 폴리시아노아크릴레이트, 폴리비닐알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리우레아, 폴리스티렌, 및 폴리아민을 포함한다.
[00401] 일부 실시예에서, 본 발명에 따른 폴리머는 21 C. F. R.§177. 2600 하의 미국식약청(FDA)에 의해 인체용으로 승인된 폴리머들을 포함하며, 폴리에스테르(예를 들어, 폴리락트산, 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리카프로락톤, 폴리발레로락톤, 폴리(1,3-디옥산-2-온)); 폴리무수물(예를 들어, 폴리(무수 세박산)); 폴리에테르(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜); 폴리우레탄; 폴리메타크릴레이트; 폴리아크릴레이트; 및 폴리시아노아크릴레이트를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
[00402] 일부 실시예에서, 폴리머는 친수성일 수 있다. 폴리머는 음이온성 기(예컨대, 포스페이트 기, 설페이트 기, 카르복실레이트 기); 양이온성 기(예컨대, 4차 아민 기); 또는 극성 기(예컨대, 히드록실 기, 티올 기, 아민 기)를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 친수성 폴리머 바탕질을 포함하는 나노캐리어는 나노캐리어 내에 친수성 환경을 만든다. 일부 실시예에서, 친수성 면역조절제, 표적화 모이어티, 및/또는 면역자극제가 친수성 폴리머 바탕질과 연관될 수 있다.
[00403] 일부 실시예에서, 폴리머는 소수성일 수 있다. 일부 실시예에서, 소수성 폴리머 바탕질을 포함하는 나노캐리어는 나노캐리어 내에 소수성 환경을 만든다. 일부 실시예에서, 소수성 면역조절제, 표적화 모이어티, 및/또는 면역자극제가 소수성 폴리머 바탕질과 연관될 수 있다.
[00404] 일부 실시예에서, 폴리머는 하나 이상의 모이어티 및/또는 작용기로 변형될 수 있다. 임의의 모이어티나 작용기도 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 탄수화물, 및/또는 다당류로부터 유래된 아크릴 폴리아세탈로 변형될 수 있다(Papisov, 2001, ACS Symposium Series, 786:301; 본 명세서에 참고로 포함된다).
[00405] 일부 실시예에서, 폴리머는 지질 또는 지방산 기로 변형될 수 있으며, 이들의 특성은 아래 더 상세히 기술된다. 일부 실시예에서, 지방산 기는 부티르산, 카프로산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 또는 리그노세르산 중 하나 이상일 수 있다. 일부 실시예에서, 지방산 기는 팔미톨레산, 올레산, 바센산, 리놀레산, 알파-리놀레산, 감마-리놀레산, 아라키돈산, 가돌레산, 아라키돈산, 에이코사펜타에노산, 도코사헥사에노산, 또는 에루스산 중 하나 이상일 수 있다.
[00406] 일부 실시예에서, 폴리머는 락트산과 글리콜산 단위를 포함하는 코폴리머, 예를 들어 모두 "PLGA"라고 본원에서 언급되는 폴리(락트산-코-글리콜산) 및 폴리(락티드-코-글리콜리드); 및 본원에서 "PGA"라고 언급되는 글리콜산 단위, 및 락트산 단위를 포함하는 호모폴리머, 예를 들어 모두 "PLA"라고 본원에서 언급되는 폴리-L-락트산, 폴리-D-락트산, 폴리-D,L-락트산, 폴리-L-락티드, 폴리-D-락티드, 및 폴리-D,L-락티드를 포함하는 폴리에스테르일 수 있다. 일부 실시예에서, 예시적인 폴리에스테르는, 예를 들어 폴리히드록시산; PEG 코폴리머 및 락티드와 글리콜리드의 코폴리머(예를 들어, PLA-PEG 코폴리머, PGA-PEG 코폴리머, PLGA-PEG 코폴리머), 및 이들의 유도체들을 포함한다. 일부 실시예에서, 폴리에스테르는, 예를 들어 폴리무수물, 폴리(오르토 에스테르), 폴리(오르토 에스테르)-PEG 코폴리머, 폴리(카프로락톤), 폴리(카프로락톤)-PEG 코폴리머, 폴리리신, 폴리리신-PEG 코폴리머, 폴리(에틸렌 이민), 폴리(에틸렌 이민)-PEG 코폴리머, 폴리(L-락티드-co-L-리신), 폴리(세린 에스테르), 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르), 폴리 [α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산] , 및 이들의 유도체들을 포함한다.
[00407] 일부 실시예에서, 폴리머는 PLGA일 수 있다. PLGA는 락트산과 글리콜산의 생체적합성이면서 생분해성인 코폴리머이며, 다양한 형태의 PLGA가 락트산:글리콜산의 비율에 의해 특정된다. 락트산은 L-락트산, D- 락트산, 또는 D,L-락트산일 수 있다. PLGA의 분해율은 락트산:글리콜산 비를 변경시킴으로써 조정될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 PLGA는 대략 85:15, 대략 75:25, 대략 60:40, 대략 50:50, 대략 40:60, 대략 25:75, 또는 대략 15:85의 락트산:글리콜산 비를 특징으로 한다.
[00408] 일부 실시예에서, 폴리머는 하나 이상의 아크릴 폴리머일 수 있다. 특정 실시예에서, 아크릴 폴리머는, 예를 들어 아크릴산 및 메타크릴산 코폴리머, 메틸 메타크릴레이트 코폴리머, 에톡시에틸 메타크릴레이트, 시아노에틸 메타크릴레이트, 아미노알킬 메타크릴레이트 코폴리머, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 메타크릴산 알킬아미드 코폴리머, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(무수 메타크릴산), 메틸 메타크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트) 코폴리머, 폴리아크릴아미드, 아미노알킬 메타크릴레이트 코폴리머, 글리시딜 메타크릴레이트 코폴리머, 폴리시아노아크릴레이트, 및 전술한 폴리머들 중 하나 이상을 포함하는 조합을 포함한다. 아크릴 폴리머는 4가 암모늄 기의 함량이 낮은 아크릴산과 메타크릴산 에스테르의 완전 중합된 코폴리머를 포함할 수 있다.
[00409] 일부 실시예에서, 폴리머는 양이온성 폴리머일 수 있다. 일반적으로, 양이온성 폴리머는 핵산(예를 들어, DNA, RNA 또는 이들의 유도체)의 음으로 하전된 가닥들을 축합하고 및/또는 보호할 수 있다. 폴리(리신)(Zauner et al., 1998, Adv. Drug Del. Rev. 30:97; 및 Kabanov et al., 1995, Bioconjugate Chem., 6:7; 모두 본 명세서에 참고로 포함된다), 폴리(에틸렌이민)(PEI; Boussif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Scl, USA, 1995, 92:7297; 본 명세서에 참고로 포함된다), 및 폴리(아미도아민) 덴드리머(Kukowska-Latallo et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Scl, USA, 93:4897; Tang et al., 1996, Bioconjugate Chem., 7:703; 및 Haensler et al., 1993, Bioconjugate Chem., 4:372; 모두 본 명세서에 참고로 포함된다)과 같은 아민-함유 폴리머들은 생리학적 pH에서 양으로 하전되어 핵산과 이온 쌍을 형성하여 여러 셀라인에서 트랜스펙션을 매개한다.
[00410] 일부 실시예에서, 폴리머는 양이온성 측쇄를 지닌 분해가능한 폴리에스테르일 수 있다(Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc, 115:11010; Kwon et al., 1989, Macromolecules, 22:3250; Lim et al, 1999, J. Am. Chem. Soc, 121 :5633; 및 Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399; 모두 본 명세서에 참고로 포함된다). 이러한 폴리에스테르의 예들은 폴리(L-락티드-코-L-리신)(Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc, 115:11010; 본 명세서에 참고로 포함된다), 폴리(세린에스테르)(Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399; 본 명세서에 참고로 포함된다), 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르)(Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; 및 Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc, 121 :5633; 모두 본 명세서에 참고로 포함된다), 및 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르(Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; 및 Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc, 121 :5633; 모두 본 명세서에 참고로 포함된다)를 포함한다.
[00411] 일부 실시예에서, 본 발명에 따른 폴리머는 탄수화물일 수 있으며, 이들의 특성은 아래에 더 상세히 기술된다. 일부 실시예에서, 탄수화물은 본 분야에 공지된 대로 글리코시드 결합에 연결된 단당류들(또는 이들의 유도체들)을 포함하는 다당류일 수 있다. 일부 실시예에서, 탄수화물은 풀룰란, 셀룰로오스, 미세결정 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 히드록시셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 덱스트란, 시클로덱스트란, 글리코겐, 녹말, 히드록시에틸녹말, 카라게난, 글리콘, 아밀로오스, 키토산, N,O-카르복실메틸키토산, 알긴 및 알긴산, 녹말, 키틴, 헤파린, 곤약, 글루코만난, 푸스툴란, 헤파린, 히알루론산, 커들란, 및 크산탄 중 하나 이상일 수 있다.
[00412] 일부 실시예에서, 본 발명에 따른 폴리머는 단백질 또는 펩티드일 수 있으며, 이들의 특성은 아래 더 상세히 기술된다. 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 예시적인 단백질은 콜라겐, 폴리(아미노산)(예컨대, 폴리리신), 항체 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
[00413] 일부 실시예에서, 본 발명에 따른 폴리머는 핵산(즉, 폴리뉴클레오티드)일 수 있으며, 이들의 특성은 아래 더 상세히 기술된다. 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 예시적인 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
[00414] 일부 실시예에서, 본 발명은 항체 생산을 유도하기 위한 플랫폼으로서 나노입자-항원 생체접합체 시스템의 사용에 관한 것이다. 본원에서 사용된 것과 같은, 제어 방출 폴리머 시스템 또는 비히클 기반 시스템은 치료제, 진단제, 예후제, 또는 예방제와 같은 활성제와 조합된 폴리머이며, 이로써 활성제가 미리 설계된 방식으로 물질로부터 방출되고 및/또는 트리거된다. 폴리머-항원 생체접합체 시스템은 호모폴리머, 2블럭, 3블럭 및/또는 다중블럭 코폴리머로서 합성될 수 있다. 폴리머-항원 생체접합체 시스템의 합성은 모노머로부터의 중합과 상이한 폴리머들의 콘쥬게이션을 포함한다. 나노입자 시스템은 생물학적으로 분해가능한, 화학적으로 분해가능한, 또는 생물학적으로도 화학적으로도 분해가능한 폴리머를 포함할 수 있다. 제어 방출 폴리머 시스템에 적합한 폴리머의 예들은 폴리(락트산), 폴리(락트산)의 유도체, PEG화 폴리(락트산), 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리(락트산-코-글리콜산)의 유도체, PEG화 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리(무수물), PEG화 폴리(무수물), 폴리(오르토 에스테르), 폴리(오르토 에스테르)의 유도체, PEG화 폴리(오르토 에스테르), 폴리(카프로락톤), 폴리(카프로락톤)의 유도체, PEG화 폴리(카프로락톤), 폴리리신, 폴리리신의 유도체, PEG화 폴리리신, 폴리(에틸렌이민), 폴리(에틸렌이민)의 유도체, PEG화 폴리(에틸렌이민), 폴리(아크릴산), 폴리(아크릴산)의 유도체, PEG화 폴리(아크릴산), 폴리(우레탄), PEG화 폴리(우레탄), 폴리(우레탄)의 유도체, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
[00415] 이들 및 다른 폴리머들의 특성과 이들의 제조하는 방법들은 본 분야에 잘 공지되어 있다(예를 들어, 미국특허 Nos. 6,123,727; 5,804,178; 5,770,417; 5,736,372; 5,716,404; 6,095,148; 5,837,752; 5,902,599; 5,696,175; 5,514,378; 5,512,600; 5,399,665; 5,019,379; 5,010,167; 4,806,621; 4,638,045; 4,946,929; Wang et al, 2001, J. Am. Chem. Soc, 123:9480; Um et al, 2001, J. Am. Chem. Soc. 123:2460; Langer, 2000, Ace. Chem. Res. 33:94; Langer, 1999, J. Control. Release, 62:7; 및 Uhrich et al, 1999, Chem. Rev., 99:3181를 참조하며, 이들은 모두 본 명세서에 참고로 포함된다). 더 일반적으로, 적합한 폴리머를 합성하기 위한 여러 방법들이 Concise Encyclopedia of polymer Science and polymeric Amines and Ammonium Salts, Ed. by Goethals, Pergamon Press, 1980; Principles of polymerization by Odian, John Wiley & Sons, 4th Edition, 2004; Contemporary polymer Chemistry by Allcock et al., Prentice-Hall, 1981; Deming et al, 1997, Nature, 390:386; 및 미국특허 Nos. 6,506,577, 6,632,922, 6,686,446, 6,818,732에 기술되며, 이들은 모두 본 명세서에 참고로 포함된다.
[00416] 일부 실시예에서, 폴리머는 선형 또는 분지형 폴리머일 수 있다. 일부 실시예에서, 폴리머는 덴드리머일 수 있다. 일부 실시예에서, 폴리머는 실질적으로 서로 교차결합될 수 있다. 일부 실시예에서, 폴리머는 실질적으로 교차결합이 없을 수 있다. 일부 실시예에서, 폴리머는 교차결합 단계를 거치지 않고 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.
[00417] 또한, 본 발명의 나노캐리어가 전술한 폴리머와 다른 폴리머 중 어느 것의 블럭 코폴리머, 그래프트 코폴리머, 블렌드, 혼합물, 및/또는 애덕트를 포함할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[00418] 당업자는 본원에 기술된 폴리머들이 예시를 나타내며, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 폴리머들의 포괄적인 리스트가 아니라는 것을 알 것이다.
[00419] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 역미셀 내에 임베드된 면역조절제를 포함한다. 한 예를 들자면, 리포솜 나노캐리어는 리포솜 막 내에 임베드된 소수성 면역조절제, 및 리포솜 나노캐리어의 내부에서 발견되는 역미셀 내에 임베드된 친수성 면역조절제를 포함할 수 있다.
비- 폴리머 나노캐리어
[00420] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 폴리머 성분을 포함하지 않을 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어는 금속 입자, 양자점, 세라믹 입자, 골입자, 바이러스 입자 등을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제, 표적화 모이어티, 및/또는 면역자극제가 이러한 비-폴리머 나노캐리어의 표면과 연관될 수 있다. 일부 실시예에서, 비-폴리머 나노캐리어는 금속 원자(예를 들어, 금 원자)들의 응집체와 같은 비-폴리머 성분의 응집체이다. 일부 실시예에서, 면역조절제, 표적화 모이어티, 및/또는 면역자극제는 비-폴리머 성분의 응집체 표면과 연관되고, 응집체 내에 캡슐화되고, 응집체로 둘러싸이고, 및/또는 응집체 전체에 분산될 수 있다.
[00421] 본 발명의 특정 실시예에서, 비-폴리머 나노캐리어는 구배 또는 균질한 합금을 포함한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 나노캐리어는 광학적으로 및/또는 자기적으로 검출가능한 특성을 지닌 입자를 포함한다.
양친매성 실재를 포함하는 나노캐리어
[00422] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 선택적으로 하나 이상의 양친매성 실재를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 양친매성 실재는 안정성이 증가되거나, 균일성이 개선되거나, 또는 점도가 증가된 나노캐리어의 생성을 촉진할 수 있다. 일부 실시예에서, 양친매성 실재는 지질막(예컨대, 지질 이중층, 지질 단일층 등)의 내부 표면과 연관될 수 있다. 예를 들어, 지질막의 내부 표면이 친수성이면, 지질막 내부의 캡슐화된 공간이 친수성이 된다. 그러나, 양친매성 실재의 친수성 단부가 친수성 지질막의 내부 표면과 연관되고, 양친매성 실재의 소수성 단부가 나노캐리어의 내부와 연관되도록 양친매성 실재가 친수성 지질막의 내부 표면과 연관되면, 나노캐리어 내부의 캡슐화된 공간이 소수성이 된다.
[00423] 나노캐리어에서 양친매성 실재의 퍼센트는 0% 내지 99중량%, 10% 내지 99중량%, 25% 내지 99중량%, 50% 내지 99중량%, 또는75% 내지 99중량%의 범위일 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어에서 양친매성 실재의 퍼센트는 0% 내지 75중량%, 0% 내지 50중량%, 0% 내지 25중량%, 또는 0% 내지 10중량%의 범위일 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어에서 양친매성 실재의 퍼센트는 대략 1중량%, 대략 2중량%, 대략 3중량%, 대략 4중량%, 대략 5중량%, 대략 10중량%, 대략 15중량%, 대략 20중량%, 대략 25중량%, 또는 대략 30중량%일 수 있다.
[00424] 본 분야에 공지된 임의의 양친매성 실재도 본 발명에 따른 나노캐리어의 제조에 사용하기에 적합하다. 이러한 양친매성 실재는 포스포글리세리드; 포스파티딜콜린; 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC); 디올레일포스파티딜 에탄올아민(DOPE); 디올레일옥시프로필트리에틸암모늄(DOTMA); 디올레일포스파티딜콜린; 콜레스테롤; 콜레스테롤 에스테르; 디아실글리세롤; 디아실글리세롤숙시네이트; 디포스파티딜 글리세롤(DPPG); 헥산데칸올; 지방 알코올, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG); 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르; 표면 활성 지방산, 예를 들어 팔미트산 또는 올레산; 지방산; 지방산 모노글리세리드; 지방산 디글리세리드; 지방산 아미드; 소르비탄 트리올레에이트(Span®85) 글리코콜레이트; 소르비탄 모노라우레이트(Span®20); 폴리소르베이트 20(Tween®20); 폴리소르베이트 60(Tween®60); 폴리소르베이트 65(Tween®65); 폴리소르베이트 80(Tween®80); 폴리소르베이트 85(Tween®85); 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트; 서팩틴; 폴록소머; 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어 소르비탄 트리올레에이트; 레시틴; 리소레시틴; 포스파티딜세린; 포스파티딜이노시톨; 스핑고미엘린; 포스파티딜에탄올아민(세팔린); 카르디올리핀; 포스파티드산; 세레브로시드; 디세틸포스페이트; 디팔미토일포스파티딜글리세롤; 스테아릴아민; 도데실아민; 헥사데실아민; 아세틸 팔미테이트; 글리세롤 리신올레에이트; 헥사데실 스테레이트; 이소프로필 미리스테이트; 틸록사폴; 폴리(에틸렌 글리콜) 5000-포스파티딜에탄올아민; 폴리(에틸렌 글리콜) 400-모노스테아레이트; 인지질; 높은 계면활성제 특성을 가진 합성 및/또는 천연 세제; 데옥시콜레이트; 시클로덱스트린; 카오트로픽 염(chaotropic salts); 이온쌍 형성제; 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 양친매성 실재 성분은 상이한 양친매성 실재들의 혼합물일 수 있다. 이들 양친매성 실재는 천연 공급원으로부터 추출되어 정제될 수 있거나, 또는 실험실에서 합성하여 제조될 수 있다. 특정한 특이적인 실시예에서, 양친매성 실재는 상업적으로 입수가능하다.
[00425] 당업자는 계면활성제 활성을 가진 물질의 리스트가 예시이며, 포괄적인 리스트가 아니라는 것을 인정할 것이다. 양친매성 실재는 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 나노캐리어의 제조에서 사용될 수 있다.
탄수화물을 포함하는 백신 나노캐리어
[00426] 일부 실시예에서, 나노캐리어는 선택적으로 하나 이상의 탄수화물을 포함할 수 있다. 나노캐리어에서 탄수화물의 퍼센트는 0% 내지 99중량%, 10% 내지 99중량%, 25% 내지 99중량%, 50% 내지 99중량%, 또는 75% 내지 99중량%의 범위일 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어에서 탄수화물의 퍼센트는 0% 내지 75중량%, 0% 내지 50중량%, 0% 내지 25중량%, 또는 0% 내지 10중량%의 범위일 수 있다. 일부 실시예에서, 나노캐리어에서 탄수화물의 퍼센트는 대략 1중량%, 대략 2중량%, 대략 3중량%, 대략 4중량%, 대략 5중량%, 대략 10중량%, 대략 15중량%, 대략 20중량%, 대략 25중량%, 또는 대략 30중량%일 수 있다.
[00427] 탄수화물은 천연 또는 합성 탄수화물일 수 있다. 탄수화물은 유도체화된 천연 탄수화물일 수 있다. 특정 실시예에서, 탄수화물은 글루코오스, 프럭토오스, 갈락토오스, 리보오스, 락토오스, 수크로오스, 말토오스, 트레할로오스, 셀비오스, 만노오스, 크실로오스, 아라비노오스, 글루쿠론산, 갈락토론산, 만누론산, 글루코사민, 갈락토사민, 및 뉴람산을 포함하는 단당이지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시예에서, 탄수화물은 락토오스, 수크로오스, 말토오스, 트레할로오스 및 셀로비오스를 포함하는 이당이지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시예에서, 탄수화물은 풀룰란, 셀룰로오스, 미세결정 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC), 히드록시셀룰로오스(HC), 메틸셀룰로오스(MC), 덱스트란, 시클로덱스트란, 글리코겐, 녹말, 히드록시에틸녹말, 카라게난, 글리콘, 아밀로오스, 키토산, N,O-카르복실메틸키토산, 알긴 및 알긴산, 녹말, 키틴, 헤파린, 곤약, 글루코만난, 푸스툴란, 헤파린, 히알루론산, 커들란, 및 크산탄을 포함하는 다당이지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시예에서, 탄수화물은 만니톨, 소르비톨, 크실리톨, 에리트리톨, 말티톨 및 락티톨을 포함하는 당 알코올이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
입자들 및 백신 나노캐리어와 연관된 입자들
[00428] 일부 실시예에서, 본 발명에 따른 백신 나노캐리어는 하나 이상의 입자를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 입자는 백신 나노캐리어와 연관된다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 나노캐리어의 외부 표면과 연관된 하나 이상의 입자를 포함한다. 일부 실시예에서, 입자는 공유 결합에 의해 백신 나노캐리어와 연관될 수 있다. 일부 실시예에서, 입자는 비-공유 상호작용(예컨대, 전하 상호작용, 친화성 상호작용, 금속 배위, 물리적 흡착, 호스트-게스트 상호작용, 소수성 상호작용, TT 스택킹 상호작용, 수소결합 상호작용, 반데르 발스 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 및/또는 이들의 조합)에 의해 백신 나노캐리어와 연관될 수 있다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 나노캐리어 내에 캡슐화된 하나 이상의 입자를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 나노캐리어의 표면 내에 임베드된 하나 이상의 입자를 포함한다(예컨대, 지질 이중층 내에 임베드된다). 일부 실시예에서, 나노캐리어와 연관된 입자는 막 강성의 조정과 리포솜 안정성의 제어를 허용한다.
[00429] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어 입자 또는 백신 나노캐리어와 연관될 수 있는 입자는 상기 설명된 폴리머 바탕질을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어 입자 또는 백신 나노캐리어와 연관될 수 있는 입자는 상기 설명된 비-폴리머 성분(예컨대, 금속 입자, 양자점, 세라믹 입자, 골입자, 바이러스 입자 등)을 포함할 수 있다.
[00430] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어 입자 또는 백신 나노캐리어와 연관될 수 있는 입자는 음 전하를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어 입자 또는 백신 나노캐리어와 연관될 수 있는 입자는 양 전하를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어 입자 또는 백신 나노캐리어와 연관될 수 있는 입자는 전기적으로 중성일 수 있다.
[00431] 일부 실시예에서, 입자는 표면에 하나 이상의 아민 모이어티 가진다. 아민 모이어티는, 예를 들어 지방족 아민 모이어티일 수 있다. 특정 실시예에서, 아민은 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민이다. 특정 실시예에서, 입자는 아민-함유 폴리머를 포함한다. 특정 실시예에서, 입자는 아민-함유 지질을 포함한다. 특정 실시예에서, 입자는 중성 pH에서 양으로 하전되는 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 표면에 하나 이상의 아민 모이어티를 가진 입자는 중성 pH에서 순 양 전하를 가진다. 중성 pH에서 양 전하를 제공하는 다른 화학적 모이어티도 본 발명의 입자에 사용될 수 있다.
[00432] 일부 실시예에서, 입자는 표면에 하나 이상의 음으로 하전된(중성 pH에서) 모이어티를 가진다. 예를 들어, 입자는 표면에 하나 이상의 카르복실산 기 또는 인산 기를 가진다. 일부 실시예에서, 표면에 하나 이상의 카르복실산 또는 인산 모이어티를 가진 입자는 중성 pH에서 순 음 전하를 가진다. 중성 pH에서 음 전하를 제공하는 다른 화학적 모이어티도 본 발명의 입자에 사용될 수 있다.
[00433] 일부 실시예에서, 입자는 표면에 하나 이상의 실질적으로 중성(중성 pH에서) 모이어티를 가진다. 예를 들어, 입자는 표면에 하나 이상의 에테르 기를 가진다. 일부 실시예에서, 표면에 하나 이상의 에테르 모이어티를 가진 입자는 중성 pH에서 실질적으로 순 전하를 갖지 않는다. 중성 pH에서 중성 전하를 제공하는 다른 화학적 모이어티도 본 발명의 입자에 사용될 수 있다.
[00434] 표면에 전하를 제공하기 위해서 나노캐리어의 표면에 존재할 수 있는 화합물의 일부 비제한적 예들은 1-팔미토일-2-올레일-sn-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄프로판, 염화물 염(DOTAP), 모노시알로강글리오시드 GM3, 1,2-디헥사데칸오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린, 나트륨 염(DPPS), 모노포스포릴 지질 A, 및 N-4-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸-포스파티딜에탄올아민(NBD-PE)을 포함한다.
[00435] 제타 전위가 입자의 표면 전위의 측정치이다. 일부 실시예에서, 나노캐리어 입자 또는 나노캐리어와 연관된 입자는 양의 제타 전위를 가진다. 일부 실시예에서, 입자는 -50 mV 내지 +50 mV 범위의 제타 전위를 가진다. 일부 실시예에서, 입자는 -25 mV 내지 +25 mV 범위의 제타 전위를 가진다. 일부 실시예에서, 입자는 -10 mV 내지 +10 mV 범위의 제타 전위를 가진다. 일부 실시예에서, 입자는 -5 mV 내지 +5 mV 범위의 제타 전위를 가진다. 일부 실시예에서, 입자는 0 mV 내지 +50 mV 범위의 제타 전위를 가진다. 일부 실시예에서, 입자는 0 mV 내지 +25 mV 범위의 제타 전위를 가진다. 일부 실시예에서, 입자는 0 mV 내지 +10 mV 범위의 제타 전위를 가진다. 일부 실시예에서, 입자는 0 mV 내지 +5 mV 범위의 제타 전위를 가진다. 일부 실시예에서, 입자는 -50 mV 내지 0 mV 범위의 제타 전위를 가진다. 일부 실시예에서, 입자는 -25 mV 내지 0 mV 범위의 제타 전위를 가진다. 일부 실시예에서, 입자는 -10 mV 내지 0 mV 범위의 제타 전위를 가진다. 일부 실시예에서, 입자는 -5 mV 내지 0 mV 범위의 제타 전위를 가진다. 일부 실시예에서, 입자는 실질적으로 중성 제타 전위를 가진다(즉, 대략 0 mV).
[00436] 입자(예컨대, 나노입자, 마이크로입자)는 본 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 미립자 제제가 나노침전, 유체 채널을 이용한 플로우 포커싱, 분무 건조, 단일 및 이중 에멀젼 용매 증발, 용매 추출, 상분리, 밀링, 마이크로에멀젼 과정, 마이크로제작, 나노제작, 희생층, 단순 및 복합 코아세르베이션(coacervation), 및 당업자에게 공지된 그외 다른 방법들과 같은 방법에 의해서 형성될 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 단분산 반도체, 전도성, 자기성, 유기, 및 그외 다른 나노입자들에 대한 수성 및 유기 용매 합성도 기술되었다(Pellegrino et al, 2005, Small, 1:48; Murray et al, 2000, Ann. Rev. Mat. ScL, 30:545; 및 Trindade et al., 2001, Chem. Mat., 13:3843; 이들은 모두 본 명세서에 참고로 포함된다).
[00437] 특정 실시예에서, 입자는 나노침전 과정 또는 분무 건조에 의해 제조된다. 입자를 제조하는데 사용된 조건을 변경하여 원하는 크기나 특성(예컨대, 소수성, 친수성, 외형, "점착성", 모양 등)의 입자를 얻을 수 있다. 입자 제조 방법 및 사용된 조건(예컨대, 용매, 온도, 농도, 기류 속도 등)은 송달될 치료제 및/또는 폴리머 바탕질의 조성에 좌우될 수 있다.
[00438] 캡슐화된 제제의 송달을 위한 나노입자 제조 방법이 문헌에 기술된다(예컨대, Doubrow, Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy," CRC Press, Boca Raton, 1992; Mathiowitz et al, 1987, J. Control. Release 5:13; Mathiowitz et al, 1987, Reactive Polymers, 6:275; 및 Mathiowitz et al., 1988, J. Appl. Polymer Scl, 35:755 참조; 이들은 모두 본 명세서에 참고로 포함된다.
[00439] 상기 방법들 중 어느 것에 의해 제조된 입자가 원하는 범위를 벗어난 크기 범위를 가질 경우, 예를 들어 체를 사용하여 입자를 거를 수 있다.
면역특징 표면
[00440] 본 발명의 합성 나노캐리어는 하나 이상의 표면을 포함하며, 일부 실시예에서 적어도 하나의 표면은 면역특징 표면을 포함한다.
[00441] 면역특징 표면이란(1) 면역특징 표면에서 항체의 Fc 부분인 모이어티는 배제되고;(2) 모이어티가 포유류 항원 제시 세포와의 친화력(avidity)에 기반한 결합을 제공하기에 효과적인 양으로 존재하는 다수의 모이어티를 포함하는 표면이다.
[00442] 친화력-기반 결합은 친화력 효과에 기초한 결합이다(이 타입의 결합은 또한 "높은 친화력" 결합이라고 언급될 수 있다). 바람직한 실시예에서, 면역특징 표면의 존재는 다음과 같이 생체 내 분석 후 시험관내 분석을 수행하여 결정될 수 있다(그러나, 친화력 효과(즉, "높은 친화력" 결합)에 기초한 결합의 존재를 확인하는 다른 방법들도 본 발명의 실시에서 역시 사용될 수 있다).
[00443] 생체 내 분석에서는 두 세트의 상이한 형광 표지를 지닌 합성 나노캐리어를 사용하는데, 한 세트의 나노캐리어는 면역특징 표면을 가지고, 나머지 세트는 대조군으로서 사용한다. 면역특징 표면이 생체 내에서 항원 제시 세포에 합성 나노캐리어를 표적화할 수 있는지의 여부를 시험하기 위해, 두 세트의 합성 나노캐리어를 1:1로 혼합하여 마우스의 발바닥에 주사하였다. 수지상 세포 및 피막하동 대식세포 상에 합성 나노캐리어의 축적을 나노캐리어 주사 후 1 내지 4시간 시점과 24시간 시점에서 각각 주사된 마우스의 배수 슬와 림프절을 수거하여 측정한다. 림프절을 냉동 절편을 공초점 형광 면역조직학 분석을 위해 가공하고, 마우스-CD11c(클론 HL3, BD BIOSCIENCES®) 또는 마우스-CD169(클론 3D6.112, SEROTEC®)에 대한 형광 항체로 대조염색하고, ADOBE®, PHOTOSHOP®와 같은 적합한 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용하여 면적측정에 의해 분석한다. 면역특징 표면을 포함하는 합성 나노캐리어가 대조군 나노캐리어보다 적어도 1.2-배, 바람직하게 적어도 1.5-배, 더 바람직하게 적어도 2-배 더 자주 수지상 세포 및/또는 피막하동 대식세포와 연관할 경우 면역특징 표면에 의한 항원 제시 세포의 표적화가 확립된 것이다.
[00444] 바람직한 실시예에서, 생체 내 분석을 수반하는 시험관내 분석에서는 면역특징 표면이 포함된 모이어티, 또는 시험관내 항원 제시 세포-발현 표면 항원(사람 수지상 세포에 대해: 항-CD1c(BDCA-1) 클론 AD5-8E7, Miltenyi BIOTEC®, 마우스 수지상 세포: 항-CD11c(αX 인테그린) 클론 HL3, BD BIOSCIENCES® 또는 뮤린 피막하동 대식세포에 대해: 항-CD169 클론 3D6.112, SEROTEC®)에 특이적인 항체로 코팅된 생체적합성 표면 상에 사람 또는 뮤린 수지상 세포 또는 뮤린 피막하동 대식세포(모두 "시험관내 항원 제시 세포")의 고정화를 결정하는데,(i) 면역특징 표면이 포함된 모이어티로 코팅된 표면에 대한 시험관내 항원 제시 세포의 최대 고정화에 대응하는 최적 코팅 밀도가 검출할 수 없을 정도이거나 또는 항체 코팅된 표면에서 관찰된 값의 적어도 10%, 바람직하게 적어도 20%, 더 바람직하게 적어도 25%가 되도록 하거나,(ii) 면역특징 표면에 의한 시험관내 항원 제시 세포의 고정화가 검출될 경우에는, 시험중인 면역특징 표면이 반-최대 결합을 지원하는 항체 코팅 밀도보다 적어도 2-배, 바람직하게 적어도 3-배, 더 바람직하게 적어도 4-배 더 높은 면역특징 표면이 포함된 모이어티의 코팅 밀도에서 반-최대 결합을 지원하도록 한다.
[00445] 면역특징 표면은 pH 7.2-7.4에서 양으로 하전되거나, 음으로 하전되건, 또는 중성으로 하전될 수 있다. 면역특징 표면은 동일한 모이어티 또는 상이한 모이어티들의 혼합물로 이루어질 수 있다. 실시예에서, 면역특징 표면은 B 세포 항원을 포함할 수 있다. 면역특징 표면에 잠재적으로 유용한 모이어티의 예들은 메톡시 기, 양으로 하전된 아민 기(예를 들어, 3차 아민), 시알릴락토오스, 아비딘 및/또는 NeutrAvidin과 같은 아비딘 유도체, 및 전술된 것들 중 어느 것의 잔기를 포함한다. 한 실시예에서, 면역특징 표면이 포함된 모이어티는 본 발명의 나노캐리어의 표면과 결합된다. 다른 실시예에서, 면역특징 표면이 본 발명의 나노캐리어의 표면과 결합된다.
[00446] 면역특징 표면이 포함된 모이어티가 높은 친화력 결합을 부여한다는 것이 주지되어야 한다. 이 정의에서 구체적으로 제시된 대로, 그리고 본 명세서 전체에서 일반적으로 기술된 바와 같이, 나노캐리어 상에 존재하는 모든 모이어티가 높은 친화력 결합을 부여하는 것은 아닐 것이다. 따라서, 임의의 표면이 복수의 모이어티(때로는 "어레이"라고 언급된다)를 포함할 수 있을지라도, 이러한 표면이 본 정의와 개시에 따른 결합을 부여한다는 것을 나타내는 데이터가 부재한 상태에서 이러한 표면이 본래 면역특징 표면이라는 의미는 아니다.
[00447] 일부 실시예에서, 복수의 모이어티는 항체의 Fc 부분 이외의 다른 것들이다. 일부 실시예에서, 복수의 모이어티는 면역자극성 모이어티(본 명세서에 기술된), 면역조정성 모이어티(본 명세서에 기술된), 표적화 모이어티(본 명세서에 기술된), 소형 유기 모이어티(예컨대, 니코틴), 올리고머, 및 폴리머(PEG와 같은 합성 폴리머를 포함해서), 무기 모이어티, 핵산 및 폴리뉴클레오티드(예컨대, DNA 및 RNA 단편), 아미노산, 폴리펩티드, 당단백질, 생물학적 활성 물질(본 명세서에 기술된 대로), 강글리오시드, 지질, 인지질, 탄수화물, 다당류, 및 전술한 것들 중 어느 것의 단편으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 면역특징 표면은 B 세포 항원 또는 T 세포 항원을 포함할 수 있다. 또한, 전술한 모이어티들의 임의의 조합이 본 발명의 범위에 들어간다. 이러한 모이어티와 면역특징부의 결합은 모이어티에 있는 원자와의 결합을 표면과의 결합으로 치환하는 것과 같은 적절한 변형을 포함할 수 있다는 것을 알 것이다.
[00448] 일부 실시예에서, 복수의 모이어티와 면역특징 표면의 결합은 모이어티와 나노캐리어 성분 사이의 공유 결합을 통해 이루어진다. 예를 들어, 폴리머 물질을 포함하는 나노캐리어의 경우, 복수의 모이어티는 폴리머에 공유 결합될 수 있다. 그러나, 일부 경우, 이온결합이나 수소결합, 또는 분산력을 포함하는 비-공유 상호작용이 사용될 수 있다.
[00449] 면역특징 표면은 동일한 모이어티 또는 상이한 모이어티들의 혼합물인 복수의 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 타입의 모이어티가 면역특징 표면에 존재할 수 있다.
[00450] 면역특징 표면은 면역특징 표면이 7.2-7.4 범위의 pH에서 완충된 수성 용액 중에 존재할 때 전체적으로 양으로 하전되거나, 음으로 하전되거나, 또는 중성으로 하전될 수 있다. 상이한 모이어티들의 혼합물이 면역특징 표면에 존재할 경우, 면역특징 표면은 임의의 특정 pH에서 양으로 하전된 모이어티, 음으로 하전된 모이어티, 및/또는 중성으로 하전된 모이어티들의 조합과 연관될 수 있다는 것을 알 것이다.
[00451] 면역특징 표면은 항원 제시 세포(APC), 특히 MHC II 분자를 발현하는 APC와의 높은 친화력 결합을 제공한다. 일부 다른 실시예에서, 면역특징 표면은 대식세포, 예를 들어 피막하동 대식세포(SCS Mph)와의 높은 친화력 결합을 제공한다. 일부 실시예에서, 면역특징 표면은 B 세포와의 높은 친화력 결합을 제공한다(즉, 면역특징 표면이 B 세포 항원을 포함한다). 바람직한 실시예에서, 면역특징 표면은 DC, SCS Mph, 또는 B 세포에 대해 높은 친화력 및 낮은 친화도 결합을 제공한다.
[00452] 면역특징 표면은 복수의 모이어티를 포함하며, 복수의 모이어티는 모두 동일한 모이어티일 수 있거나, 또는 상이한 모이어티들의 혼합물일 수 있다. 복수의 모이어티는 높은 친화력으로 APC 표면과 결합할 수 있는 표면에 존재한다. 일부 실시예에서, 복수의 모이어티는 높은 친화력 및 낮은 친화도로 APC 표면과 결합할 수 있는 표면에 존재한다.
[00453] 면역특징 표면에 유용한 모이어티의 예들은 소형 유기 분자, 예를 들어 만노오스, 말레이미드, POPC, DPPS, DOPS, 모노포스포릴 지질 A, NBD-PE, 및 이들의 유도체; 메톡시, 아민, 카르복실산, 및 이들의 유사체와 같은 작용기; 다당류, 예를 들어 시알릴락토오스 및 모노시알로강글리오시드 GM3; 단백질 및 폴리펩티드, 예를 들어 아비딘, NeutrAvidin, 리소자임, 올리고머 G, 단백질 G, 및 이들의 유도체; 등을 포함한다.
[00454] 면역특징 표면에 존재하는 모이어티가 APC로 나노캐리어를 이끌 수 있는 범위는 다양할 것이다. 예를 들어, APC에 더 특이적으로 표적화되는(즉, 높은 친화력 및 낮은 친화도로 APC와 더 특이적으로 결합할 수 있는) 면역특징 표면을 제공하는 모이어티는 SCS와 같은 영역에 더 많이 축적되는 것으로 나타나는 나노캐리어 제제를 만들 것이다.
[00455] 면역특징 표면이 포함된 모이어티가 높은 친화력 결합을 부여한다는 것이 주지되어야 한다. 이 정의에서 구체적으로 제시된 대로, 그리고 일반적으로 본 명세서 전체에서, 나노캐리어 상에 존재하는 모든 모이어티가 높은 친화력 결합을 부여하는 것은 아닐 것이다. 따라서, 임의의 표면이 복수의 모이어티(때로는 "어레이"라고 언급된다)를 포함할 수 있을지라도, 이러한 표면이 본 정의와 개시에 따른 결합을 부여한다는 것을 나타내는 데이터가 부재한 상태에서 이러한 표면이 본래 면역특징 표면이라는 의미는 아니다.
[00456] 일부 실시예에서, 면역특징 표면을 포함하는 표면을 가진 나노캐리어는 피험자에 투여되었을 때 특이적인 APC를 표적화할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 면역특징 표면을 가진 나노캐리어는 DC를 표적화할 수 있다. 일부 실시예에서, 면역특징 표면을 가진 나노캐리어는 SCS-Mph와 같은 대식세포를 표적화할 수 있다. 일부 실시예에서, 면역특징 표면을 가진 나노캐리어는 B 세포를 표적화할 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "표적화"는 면역특징 표면을 가진 나노캐리어의 조성물이 피험자에 투여되었을 때 특이적인 영역에 축적되는 경향이 있다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 이러한 축적은 투여 후 수분(예컨대, 1분 미만, 5분 미만, 또는 10분 미만, 또는 30분 미만), 수 시간(예컨대, 1시간 미만, 또는 2시간 미만, 또는 5시간 미만, 또는 10시간 미만), 또는 수일(예컨대, 1일 미만, 또는 2일 미만, 또는 5일 미만) 이내에 일어날 수 있다.
[00457] 일부 실시예에서, 보체 시스템은 본 발명의 나노캐리어에 의해 실질적으로 활성화되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 나노캐리어는 전통적인 보체 경로 및/또는 대안의 보체 경로를 활성화하지 않는다. 보체를 실질적으로 활성화하지 않는 나노캐리어는 미국 특허출원 공개 2008/0031899의 실시예 9에 개시된, 동 실시예 9의 방법을 사용하여 측정된 히드록실화 나노캐리어와 비교하여 C3a 증가량의 50% 미만, 바람직하게 35% 미만, 더 바람직하게 25% 미만을 나타낸다.
나노캐리어의 생산
[00458] 이 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 나노캐리어를 생산할 수 있다. 예를 들어, 미립자 나노캐리어 제형은 나노침전(Nanoprecipitation), 유동성 채널을 이요한 유동 집속(flow-focusing), 분무 건조, 단일 그리고 이중 에멀젼 용매 건조법, 용매추출법, 상분리, 분쇄, 마이크로에멀젼 과정(Microemulsion procedure), 미세가공, 나노가공, 희생층, 단순 그리고 복합 코아세르베이션법(coacervation), 그리고 이 기술 분야에서 통상적으로 알려진 기법들을 통해 형성될 있다. 또한, 단순분산 반도체와 전도성, 자기성, 유기성 그리고 다른 특성을 띤 나노입자를 위한 액상 그리고 유기 용매 합성이 기술되었다(Pellegrino et al., 2005, Small, 1:48; Murray et al., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545; and Trindade et al., 2001, Chem. Mat., 13:3843; 이들 모두는 본 명세서에 참고로 포함된다).
[00459] 특정 실시예에서, 나노캐리어들은 나노침전 과정 또는 분무 건조를 통해 제조된다. 나노캐리어를 제조하는 과정에서 포함된 조건들은 원하는 크기 또는 특성(예컨대, 소수성, 친수성, 외부의 형태, "점착성", 모양 등)을 가지는 입자들을 얻기 위해 변형될 수 있다. 나노캐리어를 제조하는 데에 사용된 방법과 조건들(예컨대, 용매, 온도, 농도, 송풍량 등)은 나노캐리어의 구성 및/또는 결과적 구조에 의존할 수 있다.
[00460] 본 발명에 따른 합성 나노캐리어를 제조하는 데에 있어 유용한 방법들은 문헌에 기술되어 있다(예컨대, Doubrow, Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy," CRC Press, Boca Raton, 1992; Mathiowitz et al., 1987, J. Control. Release, 5:13; Mathiowitz et al., 1987, Reactive Polymers, 6:275; and Mathiowitz et al., 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755 참조; 이들 모두는 본 명세서에 참고로 포함된다).
[00461] 일부 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어들은 적어도 하나의 면역조절제를 포함하고 있으며, 부가적으로 지질막, 폴리머 매트릭스, 및/또는 비-폴리머 입자를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어들은 적어도 하나의 면역조절제를 포함하고 있으며; 지질막, 폴리머 매트릭스, 및/또는 비-폴리머 입자를 포함할 수 있으며; 그리고 적어도 하나의 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어들은 적어도 하나의 면역조절제를 포함하고 있으며; 지질막, 폴리머 매트릭스, 및/또는 비-폴리머 입자를 포함할 수 있으며; 적어도 하나의 표적화 모이어티를 포함할 수 있으며; 그리고 적어도 하나의 면역자극제를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어들은 적어도 하나의 면역조절제를 포함하고 있으며; 지질막, 폴리머 매트릭스, 및/또는 비-폴리머 입자를 포함할 수 있으며; 적어도 하나의 표적화 모이어티를 포함할 수 있으며; 적어도 하나의 면역자극제를 포함할 수 있으며; 그리고 적어도 하나의 나노입자를 포함할 수 있다.
[00462] 본 발명의 나노캐리어들은 임의의 이용가능한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 이것은 면역조절제, 표적화 모이어티, 및/또는 면역자극제의 3차원적 특성과 구조에 불리한 영향을 끼치지 않은 채로 백신 나노캐리어에 연관하는 것이 바람직하다. 백신 나노캐리어가 전신 투여 이후 단핵성 포식 체계에 의한 흡수를 피하여, 체내의 특정 세포들에 도달하는 것이 가능한 경우가 바람직하다.
[00463] 일부 실시예에서, 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들은 백신 나노캐리어와 공유적으로 연관되어 있지 않다. 예를 들어, 백신 나노캐리어들은 폴리머 매트릭스을 포함할 수 있으며, 그리고 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들은 본 발명의 백신 나노캐리어의 폴리머 매트릭스 전체에 퍼져 있거나, 내부에 캡슐화된 상태로 존재하거나, 또는 그 표면에 연관되어 있을 수 있다. 면역조절제들은 확산, 백신 나노캐리어의 분해, 및/또는 그들의 조합에 의해 방출된다. 일부 실시예에서, 폴리머들은 부피의 침식에 의해 분해된다. 실시예에서, 폴리머들은 표면의 침식에 의해 분해된다.
[00464] 일부 실시예에서, 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들은 백신 나노캐리어와 공유적으로 연관되어 있다. 그러한 백신 나노캐리어들의 경우, 면역조절제의 방출과 표적 부위로의 도달은 그 연관성을 방해함으로서 이루어진다. 예를 들어, 만약 면역조절제가 나노캐리어와 절단 가능한 링커로 연관되어 있다면, 그 면역조절제는 링커의 절단을 통해 방출되어 표적 부위에 도달한다.
[00465] 일부 실시예에서, 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들은 백신 나노캐리어와 공유적으로 연관되어 있지 않다. 예를 들어, 백신 나노캐리어들은 폴리머를 포함할 수 있으며, 그리고 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들은 본 발명의 백신 나노캐리어의 폴리머 전체에 퍼져 있거나, 내부에 캡슐화된 상태로 존재하거나, 둘러싸여 있거나, 또는 그 표면에 연관되어 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들은 백신 나노캐리어와 물리적으로 연관되어 있다.
[00466] 물리적 연관은 다양한 방법들로 달성될 수 있다. 물리적 연관은 공유결합적, 또는 비공유결합적일 수 있다. 백신 나노캐리어, 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들은 서로와 직접적으로 연관할 수 있을 수 있다(예컨대, 하나 이상의 고유결합을 통해, 또는 하나 이상의 링커를 통해). 한 실시예에서, 링커는 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들과 하나 이상의 공유결합 또는 비공유결합을 형성하며, 그리고 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들과 하나 이상의 공유결합 또는 비공유결합을 형성하여, 서로를 연결시킨다. 실시예에서, 제 1 링커는 백신 나노캐리어와 공유결합 또는 비공유결합을 형성하며, 제 2 링커는 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들과 공유결합 또는 비공유결합을 형성한다. 그 두 링커들은 서로와 하나 이상의 공유결합 또는 비공유결합을 형성한다.
[00467] 임의의 적절한 링커는 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 링커들은 아미드 결합, 에스테르 결합, 이황화 결합 등을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 링커들은 탄소 원자 또는 헤테로 원자들(예컨대, 질소, 산소, 황 등)를 포함할 수 있다. 통상적으로, 링커들은 1에서 50 원자 정도의 길이, 1에서 40 원자 정도의 길이, 1에서 25 원자 정도의 길이, 1에서 20 원자 정도의 길이, 1에서 15 원자 정도의 길이, 1에서 10 원자 정도의 길이, 또는 1에서 10 원자 정도의 길이다. 링커들은 다음을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는 다양한 치환기로 치환될 수 있다: 수소 원자, 알킬기, 알켄닐기, 알키닐기, 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬아미노기, 트리알킬아미노기, 히드록시기, 알콕시기, 할로겐기, 아릴기, 헤테로 고리기, 방향성 헤테로 고리기, 시안기, 아미드기, 카르바모일기, 카르복실산, 에스테르, 티오에테르, 알킬티오에테르, 티올, 및 우레이도기. 당업자가 이해하는 바와 같이, 이 그룹들 각각은 교대로 치환될 수 있다.
[00468] 일부 실시예에서, 링커는 지방족 또는 헤테로 지방족 링커이다. 일부 실시예에서, 링커는 폴리알킬 링커이다. 특정 실시예에서, 링커는 폴리에테르 링커이다. 특정 실시예에서, 링커는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 링커이다.
[00469] 일부 실시예에서, 링커는 절단 가능한 링커이다. 몇 가지 예시를 들자면, 절단 가능한 링커들은 단백질 분해 효소에 의해 절단 가능한 펩티드 링커, 핵산 분해 효소 민감성 핵산 링커, 지방 분해 효소 민감성 지질 링커, 글리코시드 가수분해 효소 민감성 탄수화물 링커, pH 민감성 링커, 저산소 조건 민감성 링커, 광-절단 가능한 링커, 열에 불안정한 링커, 효소 절단 가능한 링커(예를 들면 에스테르 가수 분해 효소에 의한 절단이 가능한 링커), 초음파 민감성 링커, 엑스선에 의한 절단이 가능한 링커 등이 있다. 일부 실시예에서, 링커는 절단이 가능한 링커가 아니다.
[00470] 임의의 다양한 방법들이 링커와 백신 나노캐리어를 연관되는 데에 사용될 수 있다. 일반적인 전략은 수동 흡착(예컨대, 정전기적 상호작용을 통해), 다원자성 킬레이트화 반응, 특이적 결합쌍의 구성원들 사이의 고친화성 비공유결합, 공유결합 형성 등을 포함한다(Gao et al., 2005, Curr. Op. Biotechnol., 16:63; 본 명세서에 참고로 포함된다). 일부 실시예에서, 링커를 입자와 연관짓기 위해 클릭 화학(Click Chemistry)이 사용될 수 있다.
[00471] 이작용성(bifunctional) 교차결합 시약이 사용될 수 있다. 그러한 시약들은 두 개의 반응성기를 포함하여, 두 개의 표적 그룹들을 공유적으로 연관되는 방법을 제공한다. 화학적 교차결합 시약에 존재하는 반응성기들은 통상적으로 다음과 같은 여러 종류의 작용기들에 포함된다: 숙신이미딜 에스테르, 말레이미드, 그리고 피리딜 이황화물. 예시적인 가교제(cross-linking agent)는 다음을 포함한다: 카르보디이미드, N-히드록시숙신이미딜-4-아지도살리실산(N-hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicylic acid; NHS-ASA), 디메틸 피멜리미데이트 디히드로클로라이드(dimethyl pimelimidate dihydrochloride; DMP), 디메틸수베르이미데이트(DMS), 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(3,3'-dithiobispropioinimidate; DTBP), N-숙신이미딜 3-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도(SPDP), 숙시미딜 a-메틸부타노에이트, 바이오틴아미도헥사노일-6-아미노헥사노익산 N-히드록시-숙신이미드 에스테르(SMCC), 수신이미딜-[(N-말레이미도프로피온아미도)-도데카에틸렌글리콜] 에스테르(NHS-PEO12), 등. 예를 들어, 카르보디이미드를 촉매로 하는 아미드 형성과 활성 에스테르 말레이미드를 촉매로 하는 아민과 설프히드릴기 결합은 폭넓게 사용되는 접근법들이다.
[00472] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 종종 둘, 또는 세 단계의 반응 단계를 거치는 반응인, 한 분자에 존재하는 아민기를 제 2 분자에 존재하는 티올기에 결합함으로 형성될 수 있다. 티올을 포함하는 분자는 아민을 포함하는 분자와 이형 이중기능성 교차결합 시약, 예컨대, 하나의 숙신이미딜 에스테르와 말레이미드, 피리딜디설피드, 또는 이오도아세트아미드 중 하나를 포함하는 반응물을 사용하여 반응시킬 수 있다. 아민-카르복실산과 티올-카르복실산 교차결합, 말레이미드-설프히드릴 결합 반응(예컨대, 말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS) 방법) 등이 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 리신 또는 시스테인 곁사슬에 각각 존재하는 아민 또는 티올기를 통해 편리하게 입자들에 결합할 수 있고, 또는 N-말단 아미노기를 통해서도 결합할 수 있다. 다양한 결합시약(예컨대, N-숙신이미딜 3-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도(SPDP)와 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(sulfo-SMCC))가 백신 나노캐리어의 다양한 구성물질들을 연관되는 데에 사용될 수 있다. 생체 분자와의 연관을 촉진시키기 위해 백신 나노캐리어들은 표면에서 이용가능한 예컨대, 아민이나 카르복실기와 같은 작용기들과 함께 제조될 수 있다.
[00473] 비공유성 특이적 결합 반응이 사용될 수 있다. 예를 들어, 입자 또는 생체 분자가 비오틴을 통해 기능화될 수 있으며, 다른 분자들은 스트렙타비딘을 통해 기능화될 수 있다. 이러한 두 모이어티들은 서로에게 특이적으로, 높은 특이성을 가지고 비공유적으로 결합하며, 이를 통해 입자와 생체 분자를 연관된다. 다른 특이결합적 쌍들이 비슷하게 사용될 수 있다. 또한, 히스티딘으로 표지된 생체 분자들은 니켈-니트릴로트리아세트산(nickel-nitrilotriacetic acid; Ni-NTA)에 접합된 입자들과 연관될 수 있다.
[00474] 입자, 표적화 모이어티, 및/또는 치료제와 부착되는 임의의 생체 분자. 예를 들어, 1과 10 사이의, 즉 1,2,3,4 또는 5 아미노산만큼의 길이와 같은, 짧은 펩티드 사슬, 핵산, 그리고 알킬기 사슬과 같은 것들이 스페이서(Spacer) 로 사용될 수 있다.
[00475] 연관 및/또는 접합 방법들과 가교제들에 대한 추가적인 일반 정보에 대해 알기 위해서는, American Chemical Society(주소: Columbus OH, PO Box 3337, Columbus, OH, 43210)에 의해 출간되는 학술지 Bioconjugate Chemistry의, Pierce web site에 있으며 원래는 1994-95 Pierce Catalog에 출판된 "Cross-Linking," Pierce Chemical Technical Library, 와 그 안에 인용된 참고문헌들을 참조; Wong SS, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press Publishers, Boca Raton, 1991; 그리고 Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, 1996.
[00476] 또한, 백신 나노캐리어들은 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들과 직접적 또는 간접적으로 비공유적 상호작용을 통해 부착될 수 있다. 비공유적 상호작용은 전하성 상호작용, 친화도 상호작용, 금속 배위결합, 물리적 흡착, 호스트-게스트 상호작용(host-guest interaction), 소수성 상호작용, TT 스택킹 상호작용(TT stacking interaction), 수소결합 상호작용, 반 데르 발스 상호작용, 자기성 상호작용, 정전기성 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 및/또는 이들의 조합을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
[00477] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들과 전하성 상호작용을 통해 연관될 수 있다. 예를 들어, 백신 나노캐리어는 양이온성 표면을 가질 수 있으며, 또는 폴리(리신) 또는 폴리(에틸렌 이민)과 같은 양이온성 폴리머와 반응하여 양이온성 표면을 제공할 수 있다. 백신 나노캐리어 표면은 이후 음전하를 띠는 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들과 전하성 상호작용을 통해 결합할 수 있다. 통상적으로 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들의 한 끝은, 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들의 기능을 방해하지 않으면서 양전하성 폴리머의 표면과 상호작용할 수 있는, 음전하를 띠는 폴리머(예컨대, 폴리(카르복실산)) 또는 추가적인 올리고뉴클레오티드 서열에 결합되어 있다.
[00478] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들과 친화도 상호작용을 통해 연관될 수 있다. 예를 들어, 비오틴은 백신 나노캐리어의 표면에 부착될 수 있으며 스트렙타비딘은 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들에 부착될 수 있다; 또는 반대로, 비오틴이 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들에 부착되며 스트렙타비딘이 백신 나노캐리어의 표면에 부착될 수 있다. 비오틴기와 스트렙타비딘은 알킬렌 링커 또는 폴리에테르 링커와 같은 링커를 통해 백신 나노캐리어에, 또는 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들에 부착될 수 있다. 비오틴과 스트렙타비딘은 친화도 상호작용을 통해 결합하며, 이를 통해 백신 나노캐리어에 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들을 결합한다.
[00479] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들과 금속 배위결합을 통해 연관될 수 있다. 예를 들어, 폴리히스티딘은 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들의 단부에 부착될 수 있으며, 니트릴로트리아세트산은 백신 나노캐리어의 표면에 부착될 수 있다. 니켈과 같은 금속은 폴리히스티딘과 니트릴로트리아세트산을 킬레이트 결합할 것이며, 이를 통해 백신 나노캐리어에 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들을 결합한다.
[00480] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들과 물리적 흡착을 통해 연관될 수 있다. 예를 들어, 폴리메타크릴레이트 또는 최소 10개 정도의 탄소를 지니는 알킬기와 같은, 소수성 꼬리가 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들의 단부에 부착될 수 있다. 소수성 꼬리는 소수성 백신 나노캐리어의 표면에 흡착할 것이며, 이를 통해 백신 나노캐리어에 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들을 결합한다.
[00481] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들과 호스트-게스트 상호작용을 통해 연관될 수 있다. 예를 들어, 쿠커비투릴 또는 시클로덱스트린과 같은 거대환고리 구조의 호스트가 백신 나노캐리어의 표면에 부착될 수 있으며, 알킬기, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 디아미노알킬기와 같은 게스트가 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들에 부착될 수 있다; 또는 반대로, 호스트가 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들에 결합되며 게스트가 백신 나노캐리어의 표면에 부착될 수 있다. 일부 실시예에서, 호스트 및/또는 게스트 분자는 알킬렌 링커 또는 폴리에테르 링커와 같은 링커를 통해 백신 나노캐리어에, 또는 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들에 부착될 수 있다.
[00482] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어는 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들과 수소결합 상호작용을 통해 연관될 수 있다. 예를 들어, 특정한 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드가 백신 나노캐리어의 표면에 부착될 수 있으며, 그와 필수적으로 상보적인 서열이 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들의 기능을 저하하지 않는 방향으로 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들의 한쪽 또는 양쪽 끝에 부착될 수 있다. 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들은 이후 백신 나노캐리어에 부착되어 있는 올리고뉴클레오티드와 상보적 염기쌍 형성을 통해 백신 나노캐리어에 결합한다. 두 올리고뉴클레오티드들은 한쪽 올리고뉴클레오티드에 존재하는 서열들 중 80% 정도의 핵산 염기들이 Watson-Crick 염기쌍 형성, 역-Watson-Crick 염기쌍 형성, Hoogsten 염기쌍 형성 등과 같은 올리고뉴클레오티드 염기쌍 형성을 통해 제 2 올리고뉴클레오티드에 있는 염기와 수소결합을 할 때 필수적으로 상보적이다. 통상적으로, 백신 나노캐리어에 부착되어 있는 올리고뉴클레오티드 서열은 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들에 부착되어 있는 상보적 올리고뉴클레오티드와 적어도 6쌍의 상보적 염기쌍을 형성하는 것이 바람직하다.
[00483] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어들은 자기조립을 통해 제조된다. 백신 나노캐리어의 자기조립에 대한 상세한 예시를 위해서는, 예 1과 2를 참조. 특정 실시예에서, 작은 리포솜들(10㎚-1000㎚)이 제조되어 하나 또는 여러 면역조절제들을 면역계의 세포들에 전달하기 위해 사용된다(도 3). 일반적으로, 리포솜들은 인공적으로 만들어진 구형의 지방 소낭이며, 수십에서 수천 나노미터까지 직경을 조절 가능한 그 특성은 각각의 리포솜들이 젭토리터(10-21 L)에서 펨토리터(10-15 L) 범위의 부피를 지니며, 단백질, 효소, DNA와 약물과 같은 다양한 수송물질들을 캡슐화하며 저장할 수 있는, 생체에 적합한 구획들을 포함한다는 사실을 나타낸다. 리포솜들은 양친매성, 즉 이중층의 안쪽과 바깥쪽 면은 친수성이며, 이중층 내부는 소수성인 지질 이중층을 포함할 수도 있다. 친유성 분자들은 그들 자신을 자발적으로 리포솜의 막에 임베드하여 그들의 친수성 도메인들을 바깥에 유지시킬 수 있으며, 친수성 분자들은 막의 생체기능성을 활용하여 리포솜의 외부 표면에 화학적으로 접합될 수 있다.
[00484] 특정 실시예에서, 지질들은 친유성 면역조절제와 조합된 뒤, 고체 표면 상에 얇은 필름으로 형성된다. 친수성 면역조절제는 액체 용액에 용해된 뒤, 격렬한 교반를 통해 지질들을 가수분해하기 위해 지질 필름에 첨가된다. 친유성 면역조절제가 이중층 벽에 포함되어 있으며 친수성 면역조절제가 리포솜 내강 안에 있는 리포솜들은 자발적으로 조립된다.
[00485] 특정 실시예에서, 리포솜에서 사용될 지질은 다음을 하나 또는 복수 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다: 포스파티딜콜린, 지질A, 콜레스테롤, 돌리콜, 스핑고신, 스핑고미엘린, 세라미드, 글리코실세라미드, 세레브로시드, 설파티드, 파이토스핑고신, 포스파티딜-에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 카르디올리핀, 포스파티딘산, 및 리소-포스파티드. 특정 실시예에서, 면역조절제는 리포솜의 표면에 접합될 수 있다. 일부 실시예에서, 리포솜은 내부에 동일하거나 동일하지 않은 면역조절제를 운반한다. 일부 실시예에서, 리포솜의 표면막은 특이적인 항원-발현 세포에 면역조절제를 선택적으로 운반할 수 있는 표적화 모이어티를 통해 변형될 수 있다.
[00486] 일부 실시예에서, 나노입자로 안정화된 리포솜들이 하나 또는 복수의 면역조절제를 면역계의 세포들로 운반하기 위해 사용된다(도 4). 전하를 띤 작은 나노입자들(1 nm -30 nm)로 하여금 리포솜의 표면에 흡착되게 함으로써, 리포솜-나노입자 복합체들은 앞에서 언급한 순수 리포솜들(도 3)의 장점들뿐만 아니라, 조정 가능한 막의 강도와 리포솜 안정도 또한 가지게 된다. 전하를 띤 작은 나노입자들이 반대 전하 또는 전하가 없는 상태의 리포솜의 표면에 접근할 때, 나노입자와 막 사이에서 일어나는 정전기적 또는 전하-쌍극자 상호작용은 나노입자로 하여금 부분적으로 지질막에 둘러싸여 있는 상태로 막 표면에 머물러있게 한다. 이것은 막의 국부적 구부러짐과 리포솜의 구형 표면 장력을 유도하는데, 이 둘은 막의 강도를 조정하는 것을 가능하게 만든다. 이 요소는 바이러스의 특성인, 바이러스 막 내부에 존재하는 다른 생물학적 구성 요소들의 조성에 따라 강도가 변화하는 바이러스를 모방하는 리포솜을 백신 운반에 사용하는 것에 있어서 대단히 큰 의미를 지닌다. 또한, 흡착된 나노입자들은 리포솜의 융합을 막는, 전하를 띤 껍질을 형성함으로서 리포솜의 안정도를 향상시킨다. 특정 실시예에서, 작은 나노입자들은 약한 교반을 통해 리포솜과 혼합되며, 리포솜의 표면에 자발적으로 달라붙게 된다. 특정 실시예에서, 작은 나노입자들은 폴리머 나노입자, 금속성 나노입자, 무기 또는 유기성 나노입자, 이들의 혼성체, 및/또는 이들의 조합들일 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다.
[00487] 일부 실시예에서, 리포솜-폴리머 나노캐리어들이 하나 또는 복수의 면역조절제를 면역계의 세포들로 운반하기 위해 사용된다(도 5). 리포솜의 내부를 중공 상태로 놓아두는 대신, 친수성 면역조절제가 캡슐화될 수 있다. 도 3은 이중-블럭 공중합체 나노입자들로 채워진 리포솜들이, 리포솜과 폴리머 나노입자의 장점들을 가짐과 동시에 단점들 중 일부를 없애는, 리포솜으로 코팅된 폴리머 나노캐리어를 형성하는 것을 보여준다. 일부 실시예에서, 리포솜 껍질은 친유성 면역조절제를 운반하거나 친수성 면역조절제를 접합하는 데에 사용될 수 있으며, 폴리머 중심은 소수성 면역조절제를 전달하기 위해 사용될 수 있다.
[00488] 특정 실시예에서, 폴리머 나노입자의 표면에 리포솜의 융합을 유도하기 위해 약한 교반을 통해 미리 제조된 폴리머 나노입자들(40 nm -1000 nm)이 작은 리포솜들(20 nm-100 nm)와 혼합된다. 구체적인 실시예에서, 이중-블럭 공중합체 나노입자들은 다음 중 하나 또는 복수를 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다: 폴리(D,L 젖산)-블록-폴리(에틸렌글리콜)(PLA-b-PEG), 폴리(D,L 글리콜산)-블록-폴리(에틸렌글리콜)(PLG-b-PEG), 폴리(D,L 락타이드-글리콜라이드)-블록-폴리(에틸렌글리콜)(PLGA-b-PEG), 그리고 폴리(엡실론-카프로락톤)-블록-폴리(에틸렌글리콜)(PCL-b-PEG).
[00489] 일부 실시예에서, 나노입자로 안정화된 리포솜-폴리머 나노캐리어들이 하나 또는 복수의 면역조절제를 면역계의 세포들로 운반하기 위해 사용된다(도 6). 작은 나노입자(1nm -30nm)를 리포솜-폴리머 나노캐리어의 표면에 흡착시킴으로써, 나노캐리어는 앞에서 언급한 나노입자로 안정화된 리포솜들(도 4)과 리포솜-폴리머 나노입자(도 5) 모두의 장점들을 가질 뿐만 아니라, 조정 가능한 막의 강도와 통제 가능한 리포솜의 안정도를 갖게 된다.
[00490] 일부 실시예에서, 역미셀을 포함하는 리포솜-폴리머 나노캐리어들이 하나 또는 복수의 면역조절제를 면역계의 세포들로 운반하기 위해 사용된다(도 7). 앞에서 언급한 리포솜-폴리머 나노캐리어(도 5 및 6)들은 폴리머 나노입자들 내부에 존재하는 소수성 면역조절제들만을 운반할 수 있으므로, 여기에서의 작은 역미셀들(1 nm-20 nm)은 친수성 면역조절제를 캡슐화하기 위해 제조된 뒤, 이중-블럭 공중합체들과 혼합되어 리포솜의 폴리머 중심을 제조한다.
[00491] 특정 실시예에서, 캡슐화되기 위한 친수성 면역조절제는 우선 휘발성이며 물과 혼화가 가능한 유기용매(water-miscible organic solvent)에서 자연적으로 유래된, 무독성의 양친매성 실재와 혼합함으로서 역미셀들에 포함된다. 특정 실시예에서, 양친매성 실재는 다음 중 하나 또는 복수를 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다: 포스파티딜콜린, 지질A, 콜레스테롤, 돌리콜, 스핑고신, 스핑고미엘린, 세라미드, 글리코실세라미드, 세레브로시드, 설파티드, 파이토스핑고신, 포스파티딜-에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 카르디올리핀, 포스파티딘산, 및 리소-포스파티드. 일부 실시예에서, 휘발성이며 물과 혼화가 가능한 유기용매들은 테트라히드로퓨란, 아세톤, 아세토니트릴, 또는 디메틸포름아미드일 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, 역미셀의 형성이 완료된 뒤에 이 혼합물에 생분해성 폴리머가 첨가된다. 이로 인해 생성된 생분해성 폴리머-역미셀 혼합물은 폴리머-불용성 친수성 비용매와 혼합되어 유기용매의 증발, 그리고 용매의 비용매로의 빠른 확산을 통해 나노입자들을 형성한다. 특정 실시예에서, 폴리머-불용성 친수성 비용매는 다음 중 하나 또는 복수일 수 있지만, 여기에 한정되지는 않는다: 물, 에탄올, 메탄올, 그리고 그들의 혼합물. 폴리머 나노입자들을 포함했던 역미셀들은 지질 분자들과 혼합되어 앞에서 언급했던 리포솜-폴리머 복합체 구조를 형성한다(도 5).
[00492] 일부 실시예에서, 역미셀을 포함하는 나노입자로 안정화된 리포솜-폴리머 나노캐리어들이 하나 또는 복수의 면역조절제를 전달하기 위해 사용된다(도 8). 작은 나노입자들(1 nm -30 nm)을 리포솜-폴리머 나노캐리어의 표면에 흡착시킴으로써, 나노캐리어는 앞에서 언급한 나노입자로 안정화된 리포솜들(도 4)과 역미셀을 포함했던 리포솜-폴리머 나노입자들(도 7) 모두의 장점들을 가질 뿐만 아니라, 조정 가능한 막의 강도와 통제 가능한 리포솜의 안정도를 갖게 된다.
[00493] 일부 실시예에서, 지질 단일층에 의해 안정화된 폴리머 나노캐리어들이 하나 또는 복수의 면역조절제를 전달하기 위해 사용된다(도 9). 앞에서 언급된 리포솜-폴리머 나노캐리어(도 5 내지 8)와 비교했을 때, 이 시스템은 제조 과정과 작용제 모두가 단순성을 지닌다는 이점을 가진다. 일부 실시예에서, 소수성 호모폴리머는 소수성과 친수성 분절들 모두를 지닌 도 5 내지 8에서 사용된 이중-블럭 공중합체와는 대조적으로, 폴리머 중심을 형성할 수 있다. 지질에 의해 안정화된 폴리머 나노캐리어들은 폴리머 나노입자와 리포솜을 따로 제조한 뒤에 이들을 융합하는 것이 아닌, 한번에 형성될 수 있다.
[00494] 특정 실시예에서, 친수성 면역조절 분자는 우선 지질 머리기(lipid head group)에 화학적으로 접합된다. 그 접합체는 하나 이상의 물과 혼화가 가능한 용매들을 포함하는 용액에서 특정한 비율의 연결되지 않은 지질 분자들과 혼합된다. 특정 실시예에서, 양친매성 성분은 다음 중 하나 또는 복수를 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다: 포스파티딜콜린, 지질A, 콜레스테롤, 돌리콜, 스핑고신, 스핑고미엘린, 세라미드, 글리코실세라미드, 세레브로시드, 설파티드, 파이토스핑고신, 포스파티딜-에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 카르디올리핀, 포스파티딘산, 및 리소-포스파티드. 일부 실시예에서, 물에 혼화가능한 용매는 다음을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다: 아세톤, 에탄올, 메탄올, 및 이소프로필 알코올. 생분해성 폴리머 물질이 물과 혼화가능한, 또는 부분적으로 물과 혼화가능한 유기용매에 캡슐화되기 위해 소수성 면역조절제와 혼합된다. 구체적인 실시예에서, 생분해성 폴리머는 다음 중 하나 또는 복수를 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다: 폴리(D,L 젖산), 폴리(D,L 글리콜산), 폴리(엡실론-카프로락톤), 또는 다양한 몰비에서 그들의 공중합체들. 일부 실시예에서, 물에 혼화가능한 유기 용매는 다음 중 하나 또는 복수를 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다: 아세톤, 에탄올, 메탄올, 및 이소프로필 알코올. 일부 실시예에서, 부분적으로 물과 혼화가능한 유기용매는 다음을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다: 아세토니트릴, 테트라히드로푸란, 에틸 아세테이트, 이소프로필 알코올, 이소프로필 아세테이트, 또는 디메틸포름아미드. 이로 인해 생성된 폴리머 용액은 접합된 지질과 접합되지 않은 지질로 구성된 용액에 첨가되어, 유기용매의 증발 및 유기 용매의 물로의 빠른 확산을 통해 나노입자들을 형성한다.
[00495] 일부 실시예에서, 역미셀을 포함하는 지질 단일층에 의해 안정화된 폴리머 나노입자들이 하나 또는 복수의 면역조절제를 면역계의 세포들로 전달하기 위해 사용된다(도 10). 앞에서 언급된 지질에 의해 안정화된 폴리머 나노캐리어들(도 9)이 소수성 면역조절제를 운반하는 데에만 한정되어 있기 때문에, 여기에서, 작은 역미셀들(1 nm -20 nm)은 친수성 면역조절제를 캡슐화하기 위해 제조된 뒤, 생분해성 폴리머들과 혼합되어 폴리머 나노캐리어 중심을 형성한다.
[00496] 본 발명의 조성물들은 임의의 적절한 방법을 통해서도 제조될 수 있다는 사실과, 본발명은 본 명세서에서 기술된 방법들을 이용하여 생성될 수 있는 조성물들로만 한정되지 않는다는 사실을 이해하여야 한다. 적절한 방법을 선택하는 것은 연관되어 있는 특정한 모이어티들의 특성에 대한 주의를 요구할 수도 있다.
[00497] 필요한 경우, 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들로 연결되지 않은 백신 나노캐리어들로부터, 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들로 연결된 백신 나노캐리어들을 분리하거나, 각각 다른 수의 면역조절제, 표적화 모이어티, 면역자극제, 및/또는 나노입자들로 연결된 백신 나노캐리어들을 분리하기 위해 다양한 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 크기배제 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동, 또는 여과과정을 이용하여 각각 다른 수의 실재들이 부착된 백신 나노캐리어들의 군집들을 분리하거나, 다른 실재들로부터 백신 나노캐리어들을 분리해낼 수 있다. 여기에 사용되는 몇 가지 방법들로는 크기배제 또는 음이온-교환 크로마토그래피를 포함한다.
[00498] 일부 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어들은 무균 상테에서 제조된다. 이렇게 함으로서 이로 인해 생성된 백신들이 무균이며 비감염성이라는 것을 확실히 하며, 이를 통해 생균백신과 비교했을 때 안전도를 향상시킬 수 있다. 이것은 중요한 안전 척도를 제공하는데, 특히 백신을 접종 받는 피검자들이 면역 결함을 지니고 있거나, 감염으로 인해 고통받고 있고/있거나 감염에 취약한 상태일 경우에 더욱 그러하다.
[00499] 일부 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어는 활성을 손실하지 않고 오랜 기간 동안 제형 전략에 따라, 감압하에 동결건조된 뒤에 현탁액에 저장되거나, 동결건조된 분말로 저장될 수 있다.
활용법들
[00500] 본 명세서에 기술된 조성물들과 방법들은 면역 반응을 유도, 향상, 억제, 지시, 또는 재지시하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 조성물들과 방법들은 질병의 예방 및/또는 임의의 암, 감염성 질병, 대사성 질병, 퇴행성 질병, 자가면역 질병, 염증성 질병, 면역성 질병, 또는 다른 질환 및/또는 이상을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 조성물들과 방법들은 또한 본 명세서에 기술된 임의의 종류의 중독성 물질들에 대한 중독과 같은, 중독의 치료에도 사용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 조성물들과 방법들은 독소, 유해 물질, 환경 독소, 또는 다른 해로운 작용제에 노출됨으로 인한 이상의 예방, 및/또는 치료에도 사용될 수 있다. 피검자들은 다음을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다: 인간 및/또는 다른 영장류; 소, 돼지, 말, 양, 고양이 및/또는 개와 같은 상업적으로 유용한 포유류를 포함하는 포유류들; 및/또는 닭, 오리, 거위, 및/또는 칠면조와 같은 상업적으로 유용한 조류를 포함하는 조류들.
[00501] 일부 실시예에서, 본 발명에 따른 백신 나노캐리어는 질병, 질환 및/또는 이상의 하나 이상의 증상들 또는 특징들을 치료, 완화, 개선, 경감, 이들의 발병 지연, 이들의 진행 억제, 이들의 중증도 감소 및/또는 이들의 발생을 감소시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어는 미생물성 감염(예컨대, 세균성 감염, 균류성 감염, 바이러스성 감염, 기생충성 감염 등)의 하나 이상의 증상들 또는 특징들을 치료, 완화, 개선, 경감, 이들의 발병 지연, 이들의 진행 억제, 이들의 중증도 감소 및/또는 이들의 발생을 감소시키는데 사용될 수 있다.
[00502] 본 발명의 일 측면에서, 질병, 질환 또는 이상(예컨대, 미생물성 감염)의 예방 및/또는 치료를 위한 방법이 제공된다. 일부 실시예에서, 질병, 질환 또는 이상의 예방 및/또는 치료는 원하는 결과를 달성하기 위해 필요한 만큼의 양과 기간 동안, 이를 필요로 하는 피검자에게 본 발명의 백신 나노캐리어의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어의 "치료적 유효량"은 미생물성 감염의 하나 이상의 증상들 또는 특징들을 치료, 완화, 개선, 경감, 이들의 발병 지연, 이들의 진행 억제, 이들의 중증도 감소 및/또는 이들의 발생을 감소시키는데 효과적인 양이다. 일부 실시예에서, "치료적 유효량"은 면역 시스템을 조절하는 데에 효과가 있는 양이다. 그러한 양은 면역성 분량, 즉, 예컨대, 검출 가능한 항체 반응 및/또는 검출 가능한 T 세포 반응과 같이, 피검자에게서 검출 가능한 면역 반응을 도출하기에 충분한 양이다.
[00503] 본 발명의 예방적 및/또는 치료적 프로토콜들은 건강한 피검자(예컨대, 미생물성 감염의 어떠한 증상도 보이지 않는 피검자 및/또는 미생물성 감염으로 진단받지 않은 피검자; 독소에 아직 노출되지 않은 피검자 및 남용 또는 중독성 물질을 섭취하지 않은 피검자 등) 에게 하나 이상의 본 발명의 백신 나노캐리어의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 건강한 개체들은 본 발명의 백신 나노캐리어(들)를 미생물성 감염의 발달, 독소, 남용 물질, 중독성 물질 등에 노출 및/또는 이들에 연관된 증후근들의 발병 이전에 접종될 수 있다; 위험에 놓인 개인들(예컨대, 미생물성 감염으로 병을 앓고 있고, 미생물/독소들이 만연한 장소로 여행하는 개인들에게 노출된 환자들 등)은 대체로 증상의 발병 및/또는 노출/섭취와 실질적으로 동시에(예컨대, 48시간 이내에, 24시간 이내에, 또는 12시간 이내에) 치료될 수 있다. 물론 미생물성 감염이 되었거나, 독소에 노출되었거나, 남용 또는 중독성 물질들을 섭취한 개인들은 어느 때나 치료를 받을 수 있다.
[00504] 일부 실시예에서, 본 발명의 예방적 및/또는 치료적 프로토콜들은 면역 반응이 T 세포와 B 세포 모두에서 자극될 수 있도록 피검자에게 하나 이상의 본 발명의 백신 나노캐리어의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
[00505] 일부 실시예에서, 선택된 면역조절제를 각자 다른 APC를 대상으로 하는 표적화 모이어티들과 면역자극제와 조합함으로써, 면역반응들(예컨대, 효과기 반응들)이 조어진 조건에 대해 가장 바람직한 타입의 면역 반응, 예컨대, 체액성 반응, 1형 T 세포 반응, 2형 T 세포 반응, 세포독성 T 세포, 및/또는 이러한 반응들의 조합 등을 우선적으로 도출하도록 맞춰질 수 있다. 따라서, 동일한 플랫폼이 병원체의 호스트에 대한 예방 백신뿐만 아니라 감염, 자가면역 질병 및/또는 암과 같은 기존의 질병들의 면역치료 등을 포함하는, 광범위한 상이한 임상적 응용들에 사용될 수 있다.
[00506] 암들은 다음을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다: 담도암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 융모암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 상피내암, 림프종, 간암, 폐암(예컨대, 소세포와 비소세포), 흑색종, 신경모세포종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 육종, 피부암, 고환암, 갑상선암, 및 신장암; 그 외에 다른 암종과 육종들.
[00507] 자가면역 질병들은 다음을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다: 류마티스성 관절염, 류마티스성 열, 궤양성 대장염, 셀리악병, 크론병, 염증성 장질환, 진성 인슐린-의존성 당뇨병, 진성 당뇨병, 소아당뇨병, 자발적 자가면역성 당뇨, 위염, 자가면역 위축성 위염, 자가면역성 간염, 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 자가면역성 갑상선염, 췌도염, 난소염, 고환염, 포도막염, 수정체성 포도막염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 일차성 점액수종, 갑상선 중독증, 악성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 애디슨병, 경피증, 굿패스쳐 증후군(Goodpasture's syndrome), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 그레이브스병, 사구체신염, 마른버짐, 심상성 천포창, 유천포창, 교감성 안염, 특발성 혈소판 감소 자반병, 특발성 백혈구 감소증, 쇼그렌 증후군(Siogren's syndrome), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 다발성 근염 및 피부근염, 또는 전신성 홍반증 루푸스.
[00508] 염증성 질병/질환들은 예를 들어 다음을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다: 심혈관성 질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 기관지 확장증, 만성 담낭염, 결핵, 하시모토 갑상선염, 패혈증, 유육종증, 만성 규폐증과 다른 진폐증들, 및 환부에 이식된 이물. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "패혈증"이라는 용어는 미생물성 침입에 대한 호스트의 전신적 염증 반응과 관련된, 체계가 잘 정리된 임상적 증후군들을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "패혈증"이라는 용어는 통상적으로 열 또는 저체온증, 부정맥, 빠른 호흡 등에 의해 나타나는 이상을 지칭하며, 심각한 경우 저혈압, 장기 부전 및 심지어 죽음으로 진행할 수 있다.
[00509] 일부 실시예에서, 본 발명은 면역 반응을 도출하는 데에 적합한 나노입자 조성물에 관한 것이다.
[00510] 일부 실시예에서, 본 발명은 포유류에서의 면역 반응을 증강시키는 데에 관한 것으로서, 하나 이상의 항원에 대한 포유류의 면역 반응을 향상시키기 위해 본 발명의 나노입자의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 포유류의 백신 접종 방법에 관한 것이다.
약학적 조성물들
[00511] 본 발명은 하나 이상의 백신 나노캐리어 및 약학적으로 허용가능한 부형제의 치료적 유효량을 포함하는 신규 조성물들을 제공한다. 일부 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 백신 나노캐리어 및/또는 본 명세서에 기술된 그 조성물들을 포함하는 약학적 조성물들을 제공한다. 그러한 약학적 조성물들은 하나 이상의 다른 치료적 활성 물질들을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 따르면, 본 발명의 조성물들을 포함하는 약학적 조성물들을 이를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 방법이 제공된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물들은 인간에게 투여된다. 본 발명의 목적을 위해, "활성 성분"이라는 어귀는 일반적으로 적어도 하나의 면역조절제를 포함하며, 선택적으로는 하나 이상의 표적화 모이어티, 면역자극제 및/또는 나노입자들을 포함하는 본 발명의 백신 나노캐리어를 지칭한다.
[00512] 본 명세서에 제공된 약학적 조성물들의 기술이 주로 인간에게 투여하기에 적당한 약학적 조성물들에 관한 것이지만, 당업자는 그러한 조성물들이 모든 종류의 동물에게 투여되기에 일반적으로 적당하다는 것을 이해할 것이다. 조성물들을 다양한 동물들에게 투여하기에 적당하게 하기 위하여는 인간에게 투여하기에 적당한 약학적 조성물들을 변형하는 것은 잘 이해되고 있으며, 통상적인 지식의 수의 약리학자라면 필요한 경우 진행하게 될, 통상적인 실험을 통해 그러한 변형을 설계 및/또는 수행할 수 있을 것이다. 본 발명의 약학적 조성물들을 투여할 만하다고 고려되는 피검자들은 다음을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다: 인간 및/또는 다른 영장류; 소, 돼지, 말, 양, 고양이 및/또는 개와 같은 상업적으로 유용한 포유류를 포함하는 포유류들; 및/또는 닭, 오리, 거위, 및/또는 칠면조와 같은 상업적으로 유용한 조류를 포함하는 조류들.
[00513] 본 명세서에 기술된 약학적 조성물들의 제형은 약학적 기술을 바탕으로 이후에 개발되거나 임의의 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 그러한 제조 방법들은 활성 성분을 하나 이상의 부형제들 및/또는 하나 이상의 다른 부가적인 성분들과 연관하는 단계를 포함하며, 이후 만약 필요 및/또는 원한다면, 원하는 일회 또는 다회 투여량 단위로 생성물을 형성 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.
[00514] 본 발명의 약학적 조성물은 큰 용량으로, 일회 단위 투여량 및/또는 복수의 일회 단위 투여량으로 제조, 포장되고/되거나 판매될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "단위 투여량"은 소정의 활성 성분의 양을 포함하는 약학적 조성물의 개별적 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로, 대상에게 제공될 활성 성분의 투여량 및/또는 예를 들면, 일회 투여량의 2분의 1 또는 3분의 1과 같은 투여량의 용이한 분획과 동일하다.
[00515] 활성 성분, 약학적으로 허용가능한 부형제(들) 및/또는 본 발명의 약학적 조성물에 첨가된 임의의 다른 성분들의 상대적인 양들은 피검자의 특성, 크기 및/또는 상태에 따라 달라질 것이며, 더욱 나아가서는 조성물이 투여되는 경로에 따라서도 달라질 것이다. 예를 들자면, 조성물은 0.1% 에서 100%(w/w) 사이의 활성 성분을 포함할 수 있다.
[00516] 본 발명의 약학적 제형은 원하는 특정 투여 형태에 맞추어서 본 명세서에 사용된 바와 같이 모든 용매들, 분산매, 희석제, 또는 다른 액상 운반체, 분산 또는 현탁 보조제, 계면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고체 결합제, 윤활제 등을 포함하는 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. Remington의 The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro(Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; 본 명세서에 참고로 포함된다)는 약학적 조성물들 및 그 제조를 위해 알려진 기법들을 제조하는 데에 사용된 다양한 부형제들을 개시한다. 임의의 종래 부형제가 임의의 원치 않은 생물학적 효과를 생성한다든지 약학적 조성물의 임의의 다른 구성 물질(들)과 부정적인 방식으로 상호작용하는 등, 하나의 물질 또는 그 유도체들과 양립하지 않는 양상을 보이는 경우를 제외하고, 그 사용은 본 발명의 범위 내에 존재하는 것으로서 고려된다.
[00517] 일부 실시예에서, 약학적으로 허용가능한 부형제는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 순수하다. 일부 실시예에서, 부형제는 인간에게 사용되는 것과 수의학적 사용을 위해 승인되었다. 일부 실시예에서, 부형제는 미국 식품 의약국에 의해 승인되었다. 실시예에서, 부형제는 약학적 등급이다. 일부 실시예에서, 부형제는 미국 약전(USP), 유럽 약전(EP), 영국 약전, 및/또는 국제 약전의 기준을 충족한다.
[00518] 약학적 조성물들의 제조에 사용된 약학적으로 허용가능한 부형제들은 다음을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다: 비활성 희석제, 분산 및/또는 과립제, 계면활성제 및/또는 유화제, 붕해제, 결합제, 보존제, 완충제, 윤활제, 및/또는 오일. 이러한 부형제들은 본 발명의 제형에 선택적으로 포함될 수 있다. 코코아 버터와 좌약 밀랍, 착색제, 코팅제, 감미료, 향미료 및 착향제들과 같은 부형제들은 제조자의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다.
[00519] 예시적인 희석제들은 탄산칼슘, 탄산나트륨, 인산칼슘, 제2인산칼슘, 황산칼슘, 인산수소칼슘, 인산나트륨, 젖당, 설탕, 셀룰로오스, 미결정 셀룰로오스, 고령토, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 염화나트륨, 건조 전분, 옥수수 전분, 분말 설탕 등, 및 이들의 조합을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
[00520] 예시적인 과립 및/또는 분산제들은 감자 전분, 옥수수 전분, 타피오카 전분, 전분글리콜산나트륨, 점토, 알긴산, 구아검, 시트러스 펄프, 한천, 벤토나이트, 셀룰로오스와 목재 생성물들, 자연산 스폰지, 양이온 교환 수지, 탄산칼슘, 규산염, 교차 결합 폴리(비닐-피롤리돈)(크로스포비돈), 전분카르복시메틸나트륨(전분글리콜산 나트륨), 카르복시메틸 셀룰로오스, 교차결합 카르복시메틸셀룰로오스(크로스카르멜로스), 메틸셀룰로오스, 전호화 전분(전분 1500), 미결정 전분, 비수용성 전분, 카복시메틸셀룰로오스 칼슘, 규산알루미늄마그네슘(비검, Veegum), 로릴황산나트륨, 4차 암모늄 화합물 등 및 그들의 조합을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
[00521] 예시적인 계면활성제 및/또는 유화제들은 자연산 유화제들(예컨대, 아카시아, 한천, 알긴산, 알긴산나트륨, 트래거캔스, 진두발, 콜레스테롤, 잔탄, 펙틴, 젤라틴, 달걀 흰자, 카세인, 양모지, 콜레스테롤, 왁스 및 레시틴), 콜로이드성 점토(예컨대, 벤토나이트 [규산알루미늄]과 비검 [규산알루미늄마그네슘]), 장쇄 아미노산 유도체, 고분자량 알코올류(예컨대, 스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 올레일 알코올, 트리아세틴 모노스테아레이트, 에틸렌글리콜 디스테아레이트, 글리세릴 모노스테아레이트 및 프로필렌글리콜 모노스테아레이트, 폴리비닐알코올), 카보머류(예컨대, 카르복시폴리메틸렌, 폴리아크릴산, 아크릴산 폴리머 및 카르복시비닐 폴리머), 카라기난, 셀룰로오스성 유도체들(예컨대, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 분말 셀룰로오스, 히드록시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스), 소르비탄 지방산 에스테르류(예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트 [Tween
Figure 112011035177379-pct00002
20], 폴리옥시에틸렌 소르비탄 [Tween
Figure 112011035177379-pct00003
60], 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트 [Tween
Figure 112011035177379-pct00004
80], 소르비탄 모노팔미테이트 [Span
Figure 112011035177379-pct00005
40], 소르비탄 모노스테아레이트 [Span
Figure 112011035177379-pct00006
60], 소르비탄 트리스테아레이트 [Span
Figure 112011035177379-pct00007
65], 글리세릴 모노올레이트, 소르비탄 모노올레이트 [Span
Figure 112011035177379-pct00008
80]), 폴리옥시에틸렌 에스테르류(예컨대, 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트 [Myrj
Figure 112011035177379-pct00009
45], 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자 기름, 폴리에톡실화 피마자 기름, 폴리옥시메틸렌 스테아레이트 및 솔루톨), 자당 지방산 에스테르류, 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스테르류(예컨대, Cremophor
Figure 112011035177379-pct00010
), 폴리옥시에틸렌 에테르류(예컨대, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르 [Brij
Figure 112011035177379-pct00011
30]), 폴리(비닐-피롤리돈), 디에틸렌글리콜 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트, 올레산나트륨, 올레산칼륨, 올레산에틸, 올레산, 에틸 라우레이트, 로릴황산나트륨, 플로닉 F 68, 폴록사머 188, 브로민화 세트리모늄, 염화 세틸 피리미디늄, 염화 벤잘코늄, 도큐세이트 나트륨 등 및/또는 이들의 조합을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
[00522] 예시적인 결합제들은 전분(예컨대, 옥수수 전분과 녹말풀), 젤라틴; 당류(예컨대, 자당, 포도당, 덱스트로오스, 덱스트린, 당밀, 젖당, 락티톨, 만니톨); 자연산 및 합성 껌류(예컨대, 아카시아, 알긴산나트륨, 아이리쉬 모스 추출물, 판와 껌(panwar gum), 가티 껌, Isapol 껍질의 점액, 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 미결정 셀룰로오스, 아세트산 셀룰로오스, 폴리(비닐-피롤리돈), 규산알루미늄마그네슘(비검) 및 낙엽송 아라보갈락탄); 알긴산류; 폴리에틸렌 옥사이드; 폴리에틸렌글리콜; 무기 칼슘염; 규산; 폴리메타크릴레이트류, 왁스류; 물; 알코올 등; 및 이들의 조합을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
[00523] 예시적인 보존제들은 항산화제, 킬레이트제, 항균성 보존제, 항진균성 보존제, 알코올 보존제, 산성 보존제 및 다른 보존제들을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 예시적인 항산화제들은 알파 토코페롤, 아스코르브산, 아스코르브산 팔미트산염, 뷰틸레이티드하이드록시애니졸, 뷰틸레이티드하이드록시톨루엔, 모노티오글리세롤, 메타중아황산칼륨, 프로피온산, 갈산프로필, 아스코르브산나트륨, 아황산나트륨, 메타중아황산나트륨 및 아황산나트륨을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 예시적인 킬레이트제들은 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 함수구연산, 디소디움 에데테이트(disodium edetate), 디포타슘 에데테이트(dipotassium edetate), 에데트산, 푸마르산, 말산, 인산, 소디움 에데테이트, 타타르산 및 트리소디움 에데테이트를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 예시적인 항균성 보존제들은 벤잘코늄클로라이드, 벤제토늄클로라이드, 벤질알코올, 보로노폴, 세트리미드, 염화 세틸피리디늄, 클로헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로로자이레놀, 크레졸, 에틸알코올, 글리세린, 헥세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알코올, 질산 페닐수은, 프로필렌글리콜 및 티메로살을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 예시적인 항진균성 보존제들은 뷰틸파라벤, 메틸파라벤, 에틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산, 히드록시벤조산, 벤조산칼륨, 소르빈산칼륨, 벤조산나트륨, 프로피온산나트륨 및 소르빈산을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 예시적인 알코올 보존제들은 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 페놀, 페놀성 화합물, 비스페놀, 클로로부탄올, 히드록시벤조산 및 페닐에틸알코올을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 예시적인 산성 보존제들은 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 베타-카로틴, 시트르산, 아세트산, 디히드로아세트산, 아스코르브산, 소르브산 및 피트산을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 다른 보존제들은 토코페롤, 토코페롤 아세트산, 데테록심 메실레이트(deteroxime mesylate), 세트리미드, 뷰틸레이티드하이드록시애니졸(BHA), 뷰틸레이티드하이드록시톨루엔(BHT), 에틸렌디아민, 로릴황산나트륨(SLS), 로릴에테르황산나트륨(SLES), 아황산수소나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산칼륨, 메타중아황산칼륨, Glydant Plus
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, Phenonip
Figure 112011035177379-pct00013
, 메틸파라벤, 저몰115, 저마벤2, NeoloneTM, KathonTM, 및 Euxyl
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을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 특정 실시예에서, 보존제는 항산화제다. 다른 실시예에서, 보존제는 킬레이트제이다.
[00524] 예시적인 완충제들은 구연산 버퍼 용액, 아세트산 버퍼 용액, 인산 버퍼 용액, 염화암모늄, 탄산칼슘, 염화칼슘, 구연산칼슘, 칼슘 글루비오네이트(calcium glubionate), 글루셉테이트 칼슘, 글루콘산칼슘, D-글루콘산, 글리세로인산칼슘, 젖산칼슘, 프로판산, 레불린산칼슘, 펜탄산, 이염기성 인산칼슘, 인산, 삼염기성 인산칼슘, 수산화인산칼슘, 아세트산칼륨, 염화칼륨, 글루콘산칼륨, 칼륨 혼합물, 이염기성 인산칼륨, 일염기성 인산칼륨, 인산칼륨 혼합물, 아세트산나트륨, 중탄산나트륨, 염화나트륨, 구연산나트륨, 젖산나트륨, 이염기성 인산나트륨, 일염기성 인산나트륨, 인산나트륨 혼합물, 트로메타민, 수산화마그네슘, 수산화알루미늄, 알긴산, 발열성물질제거수, 등장성 식염수, 링거액, 에틸알코올 등 및 이들의 조합을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
[00525] 예시적인 윤활제들은 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘, 스테아르산, 실리카, 활석, 맥아, 글리세릴베헤네이트, 수소화 식물성 기름, 폴리에틸렌글리콜, 벤조산나트륨, 염화나트륨, 류신, 로릴황산마그네슘, 로릴황산나트륨 등 및 이들의 조합을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
[00526] 예시적인 오일들은 아몬드, 살구 씨앗, 아보카도, 바바수, 베르가못, 블랙 커런트 씨앗, 보리지(borage), 노간주나무, 캐모마일, 캐놀라, 캐러웨이, 카나바, 피마자, 계피, 코코아 버터, 코코넛, 대구 간, 커피, 옥수수, 목화 씨앗, 에뮤, 유칼립투스, 달맞이꽃, 생선, 아마 씨앗, 게라니올, 박, 포도 씨앗, 헤이즐넛, 히솝풀, 이소프로필미리스테이트, 호호바, 쿠쿠이 넛, 라반딘, 라벤더, 레몬, 리세아 쿠베바, 마카데미아 넛, 아욱, 망고 씨앗, 메도우폼 씨앗, 밍크, 너트메그, 올리브, 오렌지, 오렌지라피, 야자, 야자 씨앗, 복숭아 씨앗, 땅콩, 양귀비 씨앗, 호박 씨앗, 평지 씨앗, 쌀겨, 로즈마리, 잇꽃, 백단, 동백, 세이보리, 산자나무, 참깨, 시어버터, 실리콘, 대두, 해바라기, 찻나무, 엉겅퀴, 츠바키, 베티베르풀, 호두 및 밀눈 기름을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 예시적인 오일들은 스테아르산부틸, 카프릭트리글리세라이드, 사이클로메치콘, 디에틸세바케이트, 디메치콘 360, 이소프로필미리스테이트, 광유, 옥틸도데칸올, 올레일알코올, 실리콘오일 및 이들의 조합을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
[00527] 경구 및 비경구적 투여를 위한 액상 투여 형태는 약학적으로 허용가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서(elixir)를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 활성 성분들에 더하여, 액상 투여 형태는 예를 들어, 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 탄산에틸, 아세트산에틸, 벤질 알코올, 벤조산 벤질, 프로필렌글리콜, 1,3-뷰틸렌글리콜, 디메틸포름아미드, 오일들(특히, 목화 씨앗, 땅콩, 옥수수, 싹, 올리브, 피마자 및 참깨 기름), 글리세롤, 테트라히드로펄퓨릴 알코올(tetrahydrofurfuryl alcohol), 폴리에틸렌글리콜과 소르비탄의 지방산 에스테르과 같은 유화제 및 이들의 혼합물과 같은 기술 분야에서 흔하게 사용되는 비활성 희석제들을 포함할 수 있다. 비활성 희석제들 외에, 경구 조성물은 습윤제, 유화제 및 분산제, 감미료, 향미료 및 착향료와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 비경구적 투여를 위한 특정 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어들은 Cremophor
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, 알코올, 오일, 가공유, 글리콜, 폴리소르베이트, 시클로덱스트린, 폴리머들 및 이들의 조합과 같은 가용화제와 혼합된다.
[00528] 주사제 제형들, 예를 들어 멸균된 주사제 수용성 또는 유성의 현탁액들은 적당한 분산제 또는 습윤제 및 분산제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균된 주사 가능한 조제는 멸균된 주사제 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로서, 예를 들면, 1,3-부탄디올에 용해된 용액과 같이, 무독성의 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매에 용해된 멸균된 주사제 용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 사용할 수 있는 허용가능한 운반체와 용매로는 물, 링거액, U.S.P. 및 등장성 식염수가 있다. 또한, 멸균된 고정유들(fixed oils)은 종래에 용매 또는 분산매로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성된 모노글리세리드 또는 디글리세리드를 포함하는 임의의 블랜드 고정유가 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산들이 주사제의 제조에 사용된다.
[00529] 주사제 제형들은 예를 들어, 세균차단필터를 통한 여과, 또는 사용 이전에 멸균된 물 또는 다른 멸균된 주사제 매질에 용해되거나 분산될 수 있는, 멸균된 고체 조성물 형태로서 멸균제들을 포함하는 것을 통해 멸균될 수 있다.
[00530] 약물의 효과를 연장하기 위해, 피하 또는 근육 내 주사로부터 약물의 흡수를 늦추는 것이 종종 바람직하다. 이것은 물에 대해 낮은 용해도를 지닌 결정형 또는 비결정형의 재료를 액상 현탁액 상태로 사용하는 것을 통해 달성될 수 있다. 약물의 흡수율은 이후에, 결정 크기와 결정의 형태에 따른 용해도에 의존하게 된다. 또한, 비경구적으로 투여되는 약물 형태의 지연된 흡수는 약물을 유성 운반체에 용해 또는 현탁함으로써 달성될 수 있다.
[00531] 직장 또는 질 투여를 위한 조성물들은 통상적으로 주변 온도에서는 고체이지만 체온에서는 액체 상태가 되어, 직장 또는 질강에서 녹아 활성 성분을 방출하는 코코아 버터, 폴리에틸렌글리콜 또는 좌약 왁스와 같은 적당한 무자극성 부형제를 본 발명의 백신 나노캐리어와 혼합하여 제조될 수 있는 좌약이다.
[00532] 경구 투여를 위한 고체 투여 형태는 캡슐, 정제, 알약, 분말 및 과립을 포함한다. 그러한 고체 투여 형태에서, 활성 성분은 시트르산나트륨이나 인산이칼슘과 같은 적어도 하나의 비활성, 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 a) 전분, 젖당, 자당, 포도당, 만니톨 및 규산과 같은 충진제 또는 증량제, b) 예를 들면, 카르복시메틸셀룰로오스, 알긴산염, 젤라틴, 폴리비닐피롤리디논, 자당 및 아카시아 등의 결합제, c) 글리세롤과 같은 보습제, d) 한천, 탄산칼슘, 감자 도는 타피오카 전분, 알긴산, 특정한 규산염 및 탄산나트륨과 같은 붕해제, e) 파라핀과 같은 용액 지연제, f) 4차 암모늄 화합물과 같은 흡수촉진제, g) 예를 들면, 세틸알코올과 글리세롤모노스테아레이트와 같은 습윤제, h) 고령토와 벤토나이트 점토와 같은 흡착제 및 i) 활석, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고체 폴리에틸렌글리콜, 로릴황산나트륨과 같은 윤활제 및 이들의 조합과 혼합된다. 캡슐, 정제 그리고 알약의 경우, 투여 형태는 완충제를 포함할 수 있다.
[00533] 유사한 타입의 고체 조성물들은 젖당이나 유당과 같은 부형제와, 고분자량 폴리에틸렌글리콜 등을 사용하여 연질과 경질 젤라틴 캡슐의 충진제로서 사용될 수 있다. 정제, 당의정, 캡슐, 알약, 및 과립의 고체 투여 형태들은 약학적 조제 기술에서 잘 알려진 장용성 제피와 다른 제피들과 같은 제피들과 껍질들을 통해 제조될 수 있다. 그들은 부수적으로 백탁제를 포함할 수 있으며, 장관의 특정 부분에서만, 또는 그 부분에 주로, 선택적으로는 지연된 방식을 통해 활성 성분들을 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 임베딩 조성물(embedding composition)의 예시로는 폴리머 물질들과 왁스들을 들 수 있다. 유사한 타입의 고체 조성물들은 젖당이나 유당과 같은 부형제와, 고분자량 폴리에틸렌글리콜 등을 사용하여 연질과 경질-충진 젤라틴 캡슐의 충진제로서 사용될 수 있다.
[00534] 활성 성분들은 앞에서 언급된 하나 이상의 부형제들과 함께 미세-캡슐화된 형태로 존재할 수 있다. 정제, 당의정, 캡슐, 알약 및 과립의 고체 투여 형태들은 약학적 조제 기술에서 잘 알려진 장용성 제피, 방출 제어 제피 및 다른 제피들과 같은 제피들과 껍질들을 통해 제조될 수 있다. 그러한 고체 투여 형태에서, 활성 성분은 자당, 젖당 또는 전분과 같은 적어도 하나의 비활성 희석제와 부가혼합될 수 있다. 그러한 투여 형태들은, 일반적인 경우에서처럼, 예컨대, 정제화 윤활제와 스테아르산마그네슘과 미결정 셀룰로오스 등의 다른 정제화 도구들과 같은, 비활성 희석제 외의 다른 물질들을 포함할 수 있다. 캡슐, 정제 및 알약들의 경우, 투여 형태는 완충제를 포함할 수 있다. 그들은 선택적으로 백탁제를 포함할 수 있으며, 장관의 특정 부분에서만, 또는 그 부분에 주로, 선택적으로는 지연된 방식을 통해 활성 성분들을 방출하는 조성물의 형태를 가질 수 있다. 사용될 수 있는 임베딩 조성물의 예시로는 폴리머 물질들과 왁스들을 포함한다.
[00535] 본 발명에 따른 백신 나노캐리어의 국부적 및/또는 경피성 투여를 위한 투여 형태들은 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제 및/또는 패치제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 활성 성분은 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 임의의 필요한 보존제 및/또는 요구되는 완충제들과 멸균 환경에서 부가혼합된다. 또한, 본 발명은 신체에 활성화된 물질의 통제된 전달을 제공한다는 추가적인 이점을 종종 가지는 경피성 패치제의 사용을 고려한다. 그러한 투여 형태들은 예를 들자면, 적당한 매질에 활성 성분을 용해하고/하거나 분산함으로써 제조될 수 있다. 또한, 그 속도는 속도 조절막을 제공하고/하거나, 폴리머 매트릭스 및/또는 젤에 활성 성분을 분산시킴으로써 조절될 수 있다.
[00536] 본 명세서에에 기술된 피내적 약학적 조성물들을 전달하기 위해 사용될 수 있는 적당한 장치들은 미국 특허 4,886,499; 5,190,521; 5,328,483; 5,527,288; 4,270,537; 5,015,235; 5,141,496; 및 5,417,662에서 기술된 것과 같은 짧은 바늘 장치들을 포함한다. 피내적 조성물들은 PCT 공개 WO 99/34850과 그와 같은 기능적 균등물들과 같은, 피부를 효과적으로 관통할 수 있는 바늘의 길이를 제한하는 장치들에 의해 투여될 수 있다. 액체 분사 주사기를 통해 및/또는 각질층을 관통해 진피층에 도달하는 분사를 만들어내는 바늘을 통해 액체 백신을 진피층에 전달하는 방식의 분사 주사 장치들이 적당하다. 분사 주사 장치들은 예를 들어, 미국 특허 5,480,381; 5,599,302; 5,334,144; 5,993,412; 5,649,912; 5,569,189; 5,704,911; 5,383,851; 5,893,397; 5,466,220; 5,339,163; 5,312,335; 5,503,627; 5,064,413; 5,520,639; 4,596,556; 4,790,824; 4,941,880; 4,940,460; 및 PCT 공개 WO 97/37705와 WO 97/13537 들에 기술되어 있다. 피부 바깥층에서 진피까지, 분말 형태의 백신을 가속하기 위해 압축 가스를 사용하는 탄도적 분말/입자 전달 장치들이 적당하다. 또한, 피내 투여와 관련된 고전적 망투 방법에는 종래의 주사기들이 사용될 수 있다.
[00537] 국부적 투여에 적당한 제형들은 투진액, 로션, 수중유 및/또는 크림, 연고 및/또는 페이스트(paste)와 같은 유성 에멀젼에 있는 물, 및/또는 용액 및/또는 현탁액과 같은 액체 및/또는 반액체 제조를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 예를 들어, 국부적 투여 가능한 제형들은 예를 들어, 약 1% 내지 약 10%(w/w)의 활성 성분들을 포함할 수 있지만, 활성 성분의 농도는 용매 내에서 활성 성분의 용해도 한계만큼이나 높을 수 있다. 국부적 투여를 위한 제형들은 본 명세서에 기술된 하나 이상의 다른 성분들을 더 포함할 수 있다.
[00538] 본 발명의 약학적 조성물은 구강을 통한 호흡계로의 투여에 적당한 제형으로 제조되고, 포장되며/되거나 판매될 수 있다. 그러한 제형은 활성 성분을 포함하며 0.5 ㎛ 내지 7 ㎛, 또는 1 ㎛ 내지 6 ㎛ 범위의 직경을 가지는 건조 입자들을 포함할 수 있다. 그러한 조성물들은 용이하게 건조된 분말의 형태로 투여되기 위해 분사제의 흐름이 분말을 확산시키기 위해 사용되는 건조 분말 보관 용기를 포함하는 기구를 사용하고/하거나, 활성 성분이 밀폐된 용기 내에서 낮은 끓는점을 지니는 분사제에 용해되고/되거나 현탁되어 있는 활성제를 포함하는 기구와 같은, 자가-분사 용매/분말 분배 용기를 사용할 수 있다. 그러한 분말은 중량비 적어도 98%의 입자들이 0.5 ㎛를 초과하는 직경을 가지며, 수량비 적어도 95%의 입자들이 7 ㎛ 미만의 직경을 갖는 입자들을 포함한다. 또한, 중량비 적어도 95%의 입자들이 1 ㎛를 초과하는 직경을 가지며 수량비 적어도 90%의 입자들이 6 ㎛ 미만의 직경을 가진다. 건조 분말 조성물들은 설탕과 같은 고체의 미세한 분말 희석제를 포함할 수 있으며 용이하게 단위 투여량 형태로 제공된다.
[00539] 낮은 온도의 끓는점을 지니는 분사제들은 일반적으로 대기압에서 65℉ 미만의 끓는점을 가지는 액체 분사제들을 포함한다. 일반적으로 분사제는 조성물의 50% 내지 99.9%(w/w)를 구성할 수 있으며, 활성 성분은 조성물의 0.1% 내지 20%(w/w)를 구성할 수 있다. 분사제는 액체 비이온성 및/또는 고체 음전하성 계면활성제 및/또는(활성 성분을 포함하는 입자들과 동일한 정도의 입자 크기를 가질 수 있는) 고체 희석제와 같은 다른 성분들을 더 포함할 수 있다.
[00540] 호흡기 전달용으로 제형된 본 발명의 약학적 조성물들은 활성 성분을 용액 및/또는 현탁액의 방울 형태로 제공할 수 있다. 그러한 제형들은 활성 성분을 포함하며 선택적으로 멸균된, 수용성 및/또는 희석된 알코올성 용액 및/또는 현탁액으로서 제조되며, 포장되고/되거나 판매될 수 있으며, 분무화 및/또는 미립화 기구를 사용하여 용이하게 투여될 수 있다. 그러한 조제들은 사카린나트륨과 같은 착향료, 휘발성 오일, 완충제, 계면활성제 및/또는 메틸히드록시벤조에이트와 같은 보존제를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 하나 이상의 다른 성분들을 더 포함할 수 있다. 이러한 투여 경로에 의해 제공되는 방울들은 약 0.1 ㎛ 내지 약 200 ㎛ 범위의 평균 직경을 가질 수 있다.
[00541] 본 명세서에 기술된 호흡기 전달에 유용한 제형들은 본 발명의 약학적 조성물의 비강 내 전달에 유용하다. 비강 내 투여에 적당한 다른 제형은 활성 성분을 포함하며 약 0.2 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 평균 입자를 갖는 거친 분말이다. 그러한 제형은 코로 들여쉬는 방식, 즉, 콧구멍에 분말이 담긴 용기를 가깝게 대어 비강 통과를 통해 신속한 흡입에 의해 투여된다.
[00542] 비강 투여에 적당한 제형들은 예를 들면, 최소 0.1%(w/w)에서 최대 100%(w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있으며, 본 명세서에 기술된 하나 이상의 다른 성분들을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여에 적당한 제형으로 제조되고, 포장되며/되거나 판매될 수 있다. 그러한 제형들은 예를 들면, 통상적인 방법을 사용해 제조된 정제 및/또는 약용 캔디 형태로 존재할 수 있으며, 예를 들면 0.1% 내지 20%(w/w) 활성 성분과 경구로 용해될 수 있고/있거나 분해 가능한 조성물 및 선택적으로는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 다른 성분들을 포함하는 균형을 포함한다. 또한, 경구 투여에 적당한 제형들은 활성 성분을 포함하는 분말 및/또는 분무화되고/되거나 미립화된 용액 및/또는 현탁액을 포함할 수 있다. 그러한 분말 및/또는 분무화되고/되거나 미립화된 제형들은 분산되었을 때 약 0.1 ㎛ 내지 200 ㎛의 범위의 평균 입자 및/또는 방울 크기를 가질 수 있으며, 본 명세서에 기술된 하나 이상의 성분들을 더 포함할 수 있다.
[00543] 본 발명의 약학적 조성물은 눈을 통한 투여에 적당한 제형으로 제조되고, 포장되며/되거나 판매될 수 있다. 그러한 제형들은 예를 들면, 수용성 또는 유성 액체 부형제에 활성 성분 0.1%/1.0%(w/w) 용액 및/또는 현탁액을 포함하는 안약의 형태로 존재할 수 있다. 그러한 방울들은 완충제, 염류 및/또는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 다른 성분들을 더 포함할 수 있다. 다른 눈을 통해 투여될 수 있는 유용한 제형들에는 미결정의 형태 및/또는 리포솜 제제로 활성 성분을 포함하는 것들이 있다. 귀약 및/또는 안약들은 본 발명의 범위 내에 존재하는 것으로서 고려된다.
[00544] 약학적 작용제들의 제형 및/또는 제조에 대한 일반적인 고려 사항들은 예를 들면, Remington : The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005에서 찾을 수 있다.
투여
[00545] 일부 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어 조제의 치료적 유효량은 환자 및/또는 동물에게 질병, 질환 및/또는 이상의 진단 이전에, 동시에 및/또는 진단 이후에 전달된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물의 치료적 양은 환자 및/또는 동물에게 질병, 질환 및/또는 이상의 발병 이전에, 또는 동시에, 및/또는 진단 이후에 전달된다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어의 양은 질병, 질환 및/또는 이상의 하나 이상의 증상들 또는 특징들을 치료, 완화, 개선, 경감, 이들의 발병 지연, 이들의 진행 억제, 이들의 중증도 감소 및/또는 이들의 발생을 감소시키는데 충분하다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어의 양은 피검자에서 검출 가능한 면역 반응을 도출하기에 충분하다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어의 양은 피검자에서 검출 가능한 T 세포 반응을 도출하기에 충분하다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어의 양은 피검자에서 검출가능한 항체 및 T 세포 반응을 도출하기에 충분하다. 일부 실시예에서, 제공된 나노캐리어의 장점은 상기 나노캐리어들이 종래의 백신에 요구되던 것보다 훨씬 낮은 농도의 항원에서도 강한 반응들을 도출할 수 있다는 것이다.
[00546] 본 발명의 방법에 따른 조성물들은, 치료에 효과적인 임의의 투여량과 어떠한 투여 경로를 사용하여 투여될 수 있다. 정확하게 요구되는 양은 피검자마다 다를 것이며, 피검자의 종(species), 연령과 일반적 상태, 감염의 중증도, 특정한 조성물, 투여 조건, 활성 조건, 등에 따른다. 본 발명의 조성물들은 통상적으로 투여의 편의성과 투여량의 일치를 위해 투여 단위 형태로 제형될 것이다. 그러나, 본 발명의 조제의 일일 총 투여량은 올바른 의료적 판단의 범위 내에서, 진료하는 의사에 의해 결정될 것이라는 것을 알 것이다. 임의의 특정한 피검자 또는 유기체에 대해 구체적인 치료적 유효 투여 레벨은 치료하고자 하는 질환과 질환의 중증도, 포함되어 있는 특이적인 활성 성분의 활성, 포함되어 있는 특이적인 조성물, 피검자의 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별 및 식이, 투여의 시간, 투여 경로 및 포함되어 있는 특이적인 활성 성분의 배설률, 치료의 기간, 포함되어 있는 특이적인 활성 성분과 병용 또는 동시에 사용된 약물, 및 의료 계통에서 잘 알려진 그와 같은 인자들을 포함하는 다양한 요소들에 의존할 것이다.
[00547] 본 발명의 약학적 조성물들은 임의의 경로로 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물들은 경구, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 수질 내, 피하, 심장 내, 경피성, 피부간, 직장, 질 내, 복막 내, 국부(분말, 연고, 크림, 및/또는 방울을 통해), 경피, 점막, 비강, 구강, 장, 설하를 포함하는 다양한 경로에 의해; 기관 내 점적 주사, 기관지의 점적 주사 및/또는 흡입; 및/또는 구강 분사, 비강 분사, 및/또는 분무에 의해 투여된다. 구체적으로 고려되는 경로들은 경구 투여, 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 및/또는 경피 주사이다. 일부 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어들은 비경구적으로 투여된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어들은 정맥 내로 투여된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어들은 경구적으로 투여된다.
[00548] 일반적으로 가장 적합한 투여 경로는 백신 나노캐리어의 특성(예컨대, 위장관 환경에서의 안정성), 피검자의 상태(예컨대, 대상이 경구적 투여를 수용할 수 있는지의 여부) 등을 포함하는 다양한 인자들에 의존할 것이다. 본 발명은 약물 전달의 발전된 기술들을 고려하는 임의의 적당한 경로에 의한 본 발명의 약학적 조성물의 전달을 포함한다.
[00549] 특정 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어는 원하는 치료 효과를 얻기 위해 하루에 일회 이상, 및 하루에 피검자 체중에 따라 약 0.001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg에 이르는 양이 투여될 수 있다. 원하는 투여량은 하루 3회, 하루 2회, 하루 1회, 이틀에 한번, 사흘에 한번, 일주일에 한번, 이주일에 한번, 삼주일에 한번, 또는 사주일에 한번 전달될 수 있다. 특정 실시예에서, 원하는 투여량은 다양한 투여들을 이용하여 전달될 수 있다(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 그 이상의 투여들).
[00550] 일부 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 백신 나노캐리어의 군집들을 포함하는 "치료적 칵테일"을 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어의 군집에 존재하는 모든 백신 나노캐리어들은 여러 표적들(예컨대, SCS-Mph와 FDCs 둘 다에 결합 가능한)에 결합 가능한 한 종류의 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어의 군집에 존재하는 상이한 백신 나노캐리어들은 상이한 표적화 모이어티들을 포함하며, 상기 모든 상이한 표적화 모이어티들은 동일한 표적에 결합할 수 있다. 일부 실시예에서, 상이한 백신 나노캐리어들은 상이한 표적화 모이어티들을 포함하며, 상기 모든 상이한 표적화 모이어티들은 상이한 표적들에 결합할 수 있다. 일부 실시예에서, 그러한 상이한 표적들은 같은 세포 타입에 연관될 수 있다. 실시예에서, 그러한 다른 표적들은 상이한 세포 타입들에 연관될 수 있다.
[00551] 적절한 경우, 본 발명의 나노입자 생체접합체는 그 자체로, 또는 약학적으로 허용가능한 염류의 형태로 투여될 수 있다. 의약품에 사용될 경우, 염류는 약학적으로 허용가능해야 하지만, 약학적으로 허용이 불가능한 염류는 그 약학적으로 허용가능한 염류를 제조하는 데에 용이하게 사용될 수도 있으며, 본 발명의 범위에서 제외되지 않는다. 그러한 약학적으로 허용가능한 염류는 다음의 산들을(acids) 통해 제조되는 것들을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다: 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 말레산, 아세트산, 살리실산, p-톨루엔술폰산, 타타르산, 시트르산, 메탄술폰산, 포름산, 말론산, 숙신산, 나프탈렌-2-술폰산 및 벤젠술폰산. 또한, 약학적으로 허용가능한 염류들은 카르복실산 작용기의 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염과 같은 알칼리금속염류 또는 알칼리토염류로 제조될 수 있다.
[00552] 장용성 경구 투여 조제의 제조를 위한 캡슐화 물질들은 셀룰로오스아세테이트프탈레이트, 폴리비닐아세테이트프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스프탈레이트, 및 메타크릴산에스테르 공중합체를 포함한다. 캡슐 또는 정제와 같은 고체 경구 투여 제형들이 바람직하다. 또한, 엘릭서제와 시럽들도 잘 알려진 경구 투여 제형들이다. 분무형 제형들의 구성 물질들은 용액형 제형들의 경우 가용성 활성 성분들, 항산화제들, 용매 혼합물들과 분사제 및 현탁액형 제형들의 경우 미립화되고 현탁된 활성 성분들, 분산제와 분사제들을 포함한다. 본 발명의 경구, 분무 및 비강 투여 제형들은 선행 기술의 주사제 제조와 구별될 수 있는데, 그 이유는 그러한 제형들은 무균성이지 않아도 되지만, 주사제 제조는 무균성이라야 하기 때문이다.
[00553] 본 발명의 일부 실시예에서, 나노캐리어의 투여는 복수의 투여를 통해 발생한다. 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 종의 투여들이 환자에게 투여될 수 있다. 과정에 따라 필요한 투여도 본 발명의 범위 내에 있으며, 규칙적인 스케줄에 따라 반복되는 투여를 포함할 수 있다. 투여는 원하는 생물학적 효과를 달성하는데 적합한 임의의 간격, 예를 들자면 1일에서 1년 사이, 또는 1일에서 1달 사이, 또는 1일에서 1주 사이를 통해서 분리될 수 있다.
[00554] 일부 실시예에서, 나노캐리어의 제 1 투여량으로 투여되는 피검자에서의 T 세포 증식을 도출한다. 일부 실시예에서, 환자에게 나노캐리어들의 제 1 투여 이후, 피검자의 혈청 중 T 세포 농도는 200 ng/ml 초과, 또는 250 ng/ml 초과, 또는 300 ng/ml 초과, 또는 400 ng/ml 초과, 또는 500 ng/ml 초과이다. 일부 실시예에서, 상기 피검자에서 그러한 혈청 중 T 세포 농도는 나노캐리어의 후속 투여 이후에 달성 및/또는 유지된다.
병용 치료법
[00555] 본 발명의 백신 나노캐리어들과 약학적 조성물들이 병용 치료법들에 사용될 수 있다는 것을 알 것이다. 병용 요법에서 사용하기 위한 치료법(치료제 또는 절차들)의 특정 조합은 원하는 치료제 및/또는 절차들의 적응성과 달성하고자 하는 원하는 치료 효과를 고려 대상으로 놓을 것이다. 사용된 치료법들이 동일한 목적(예를 들면, 특정한 타입의 미생물성 감염에 대한 예방 접종에 유용한 본 발명의 백신 나노캐리어가 동일한 미생물성 감염을 치료하는 데에 유용한 다른 작용제와 함께 투여될 수 있다)을 위해 원하는 효과를 달성할 수 있거나, 그들은 각자 다른 효과들을 달성할 수 있다(예컨대, 백신 나노캐리어에 관한 임의의 부정적인 효과들의 제어).
[00556] 일부 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물들은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료제들과 병용하여 투여될 수 있다. "병용하여"라는 뜻은, 비록 본 발명의 범위에 포함되기는 하지만, 작용제들이 같은 시간에 투여되고/되거나 같이 전달되기 위해 제형되어야만 한다는 것을 의미하는 것이 아니다. 조성물들은 하나 이상의 다른 원하는 치료적 또는 의료적 절차들과 동시에, 또는 이전에, 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 일반적으로, 각각의 작용제는 투여량 및/또는 그 작용제를 위해 결정된 시간 스케줄을 바탕으로 투여될 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물들을 그들의 생물학적 생체이용율을 향상시키거나, 그들의 대사를 감소시키고/시키거나 변형하고, 그들의 분비를 억제하고/하거나 체내에서 그들의 분산을 변형할 수 있는 약물들과 병용하여 전달되는 것을 포함한다.
[00557] 병용 요법에서 사용하기 위한 치료법(치료제 또는 절차들)의 특정 조합은 원하는 치료제 및/또는 절차들의 적응성과 달성하고자 하는 원하는 치료 효과를 고려 대상으로 놓을 것이다. 사용된 치료법들이 동일한 질환에 대한 원하는 효과를 달성할 수 있으며(예를 들면, 본 발명의 백신 나노캐리어는 동일한 질환을 치료하기 위해 사용된 다른 치료제와 동시에 투여될 수 있다)/있거나 그들이 각자 다른 효과들을 달성할 수 있다는 것(예컨대, 백신 나노캐리어에 관한 임의의 부정적인 효과들의 제어)을 알 것이다. 일부 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어들은 미국 식품의약국에 의해 승인된 이차 치료적 약물과 함께 투여된다.
[00558] 치료적 활성제들이 단일 조성물로 같이 투여되거나 각자 다른 조성물들로 투여될 수 있는 것을 더 알게 될 것이다.
[00559] 일반적으로, 병용되어 활용되는 작용제들은 각각 활용될 때의 양을 초과하지 않는 레벨로 활용될 것으로 예상된다. 일부 실시예에서, 병용되어 활용된 경우의 양은 각각 활용된 경우에서보다 더 낮을 것이다.
[00560] 일부 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어들은 예를 들면 치료제, 진단제 및/또는 예방제들을 포함하는 작용제와 병용하여 투여될 수 있다. 본 발명에 따라 전달되는 예시적인 작용제들은 소분자, 유기금속 화합물, 핵산, 단백질(다중 결합 단백질과 단백질 복합체 등을 포함), 펩티드, 지질, 탄수화물, 호르몬, 금속, 방사성 원소와 화합물, 약물, 백신, 면역제 등 및/또는 이들의 조합을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
[00561] 특정 실시예에서, 특정한 미생물성 감염의 발병 및/또는 진행을 지연시키는 백신 나노캐리어들은 미생물성 감염의 증상들을 치료하는 하나 이상의 다른 치료제들과 병용하여 투여될 수 있다. 하나의 예를 들자면, 광견병 바이러스에 노출된 경우, 광견병 바이러스의 예방 접종에 유용한 면역조절제를 포함하는 나노캐리어들은 광견병 바이러스의 증상을 치료하는 데에 유용한 하나 이상의 치료제(예컨대, 광견병 바이러스 감염의 증상인 편집증의 치료에 유용한 항정신성제)와 병용하여 투여될 수 있다.
[00562] 일부 실시예에서, 본 발명의 백신 나노캐리어를 포함하는 약학적 조성물들은 전달하고자 하는 작용제의 중량비 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만 또는 0.5% 미만을 포함한다.
[00563] 본 명세서에 제공된 약학적 조성물들은 하나 이상의 다른 생물학적 활성 물질들을 더 포함할 수 있다. 일반적으로, 그러한 물질들의 비한정 예시들은 진핵세포와 원핵세포, 바이러스, 벡터, 단백질, 펩티드, 핵산, 다당류와 탄수화물, 지질, 당단백질 및 동물에게 투약되었을 때 생물학적 효과를 일으키는 합성 유기 및 무기 약물들을 포함한다. 그러한 생물학적으로 활성화된 물질들의 조합들 또한 본 발명의 범위에 있다. 참고의 편의를 위해, 그리고 달리 지시되지 않은 이상, "활성 물질"이라는 용어는 또한 공기와 바륨, 자기성 화합물 등을 포함하는 방사선 불투과성의 물질들과 같은 검출가능한 화합물들을 포함하는데 사용된다. 다른 활성화된 물질들은 수용성 또는 비수용성일 수 있다. 생물학적으로 활성화된 물질들의 다른 예시들은 항-혈관신생 인자들, 항체, 항균제, 항말라리아제, 항아메바제, 항원생동물제, 항진균제, 항바이러스제, 항종양성 화합물들, 성장 인자 호르몬, 효소, 면역활성 및 스테로이드나 항생제와 같은 약물들을 포함한다. 생물학적으로 활성화된 물질들의 이러한 그리고 다른 종류들의 비한정 예시들은 아래에 열거되어 있으며 표적된 세포들 또는 조직들에 전달하기 위한 목적으로 나노입자 전달 시스템에 캡슐화될 수 있다.
[00564] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어들은 약학적 활성을 지닌 하나 이상의 소분자 및/또는 유기물과 병용되어 투여된다. 일부 실시예에서, 작용제는 임상적으로 사용된 약물이다. 일부 실시예에서, 약물은 항암제, 항생제, 항바이러스제, 항-HIV제, 항기생충제, 항원생동물제, 마취제, 항응고제, 효소의 억제제, 스테로이제, 스테로이드성 또는 비스테로이드성 소염제, 항히스타민, 면역억제제, 항종양제, 항원, 백신, 항체, 충혈완화제, 진정제, 오피오이드, 진통제, 해열제, 피임약, 호르몬, 프로스타글란딘, 프로게스테론제, 항녹내장제, 안약, 항콜린제, 진통제, 항우울제, 항정신성 약물, 신경독, 수면제, 정신안정제, 항경련제, 근육안정제, 항파킨슨제, 진경제, 근육수축제, 채널 차단제, 축동제, 분비억제제, 항혈전제, 항응고제, 항콜린제, 베타아드레날린 차단제, 이뇨제, 심혈관계 활성제, 혈관수축제, 혈관확장제, 항고혈압제, 혈관생성제, 세포-세포외 기질 상호작용의 조절제(예컨대, 세포 성장 억제제와 항-부착 분자들), DNA, RNA 또는 단백질 합성의 억제제 등이다.
[00565] 특정 실시예에서, 소분자 작용제는 임의의 약물일 수 있다. 일부 실시예에서, 약물은 적절한 정부 기관 또는 규제 기관에 의해 인간 또는 동물에서의 사용이 안전하고 효과가 있다고 이미 간주된 약물이다. 예를 들어, 인간에게 사용할 수 있도록 승인된 약물들은 FDA에 의해 21 C.F.R. §§ 330.5, 331 내지 361, 및 440 내지 460까지에 열거되어 있으며, 본 명세서에 참고로 포함된다; 동물에게 사용할 수 있도록 허용된 약물들은 FDA에 의해 21 C.F.R. §§ 500 내지 589까지에 열거되어 있으며, 본 명세서에 참고로 포함된다. 열거된 모든 약물들은 본 발명에 따라 사용될 수 있는 것들로 간주된다.
[00566] 본 발명에서 사용되기에 적당한 특이적인 약물들과 그 분류들의 보다 완전한 목록은 Pharmaceutical Drugs: Syntheses, Patents, Applications by Axel Kleemann and Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999, Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics. 9th ed. McGraw-Hill 1996 및 Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals, Ed. by Budavari et al., CRC Press, 1996에서 찾을 수 있다. 이러한 문헌들의 관련된 부분들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
[00567] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어들은 하나 이상의 핵산들(예컨대, 기능적 RNA, 기능적 DNA 등)과 병용되어 조직, 세포, 또는 세포 내부의 부위와 같은 특이적인 위치에 투여된다. 예를 들어, 특정한 미생물성 감염의 발병 및/또는 진행을 지연시키기 위해 사용되는 본 발명의 백신 나노캐리어들은 미생물성 단백질의 발현을 감소시키는 RNAi 작용제들과 병용 투여될 수 있다. 핵산들의 분자 특성들은 "핵산 표적화 모이어티들"이라는 제목의 영역에서 기술되어 있다.
[00568] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어들은 하나 이상의 단백질들 또는 펩티드들과 병용 투여된다. 일부 실시예에서, 전달되는 작용제는 펩티드, 호르몬, 적혈구생성소, 인슐린, 시토카인, 예방 접종을 위한 항원 등일 수 있다. 일부 실시예에서, 전달되어야 하는 작용제는 항체 및/또는 그것의 특성 부위일 수 있다. 이들의 분자 특성들은 "단백질 표적화 모이어티들"이라는 제목의 영역에서 기술되어 있다.
[00569] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어들은 단백질과 연관된 탄수화물과 같은(예를 들자면 당단백, 프로테오글리칸, 등) 하나 이상의 탄수화물과 병용 투여된다. 탄수화물은 자연산 또는 합성일 수 있다. 또한, 탄수화물은 자연산 탄수화물의 유도체일 수 있다. 특정 실시예에서, 탄수화물은 단순당 또는 복합당일 수 있다. 특정 실시예에서, 탄수화물은 포도당, 과당, 갈락토오스 및 리보오스를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 단당류이다. 특정 실시예에서, 탄수화물은 젖당, 설탕, 맥아당, 트레할로오스 및 셀로바이오스를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 이당류이다. 특정 실시예에서, 탄수화물은 셀룰로오스, 미결정 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC), 메틸셀룰로오스(MC), 덱스트로오스, 덱스트란, 글리코겐, 잔탄검, 젤란검, 전분 및 풀루란을 포함하지만, 여기에 한정되지 않은 다당류이다. 특정 실시예에서, 탄수화물은 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말리톨 및 락티톨을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 당 알코올이다. 탄수화물들의 분자 특성들은 "탄수화물을 포함하는 백신 나노캐리어들"이라는 제목의 영역에서 기술되어 있다.
[00570] 일부 실시예에서, 백신 나노캐리어들은 단백질과 연관된 지질과 같은(예컨대, 지질단백질) 하나 이상의 지질과 병용 투여된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 예시적인 지질들은 오일, 지방산, 포화지방산, 불포화지방산, 필수지방산, 시스-지방산, 트랜스-지방산, 글리세리드, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 호르몬, 스테로이드(예컨대, 콜레스테롤, 담즙), 비타민(예컨대, 비타민 E), 인지질, 스핑고지질 및 지질단백질을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 지질들의 분자 특성들은 "지질 백신 나노캐리어들"이라는 제목의 영역에서 기술되어 있다.
[00571] 치료제들의 다른 예시들은 다음을 포함한다:
[00572] 항종양성 화합물들. 예시들은 니트로소우레아(예컨대, 카무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 스트렙조토신), 메틸히드라진(예컨대, 프로카바진, 다카바진)을 포함한다.
[00573] 스테로이드 호르몬. 예시들은 당질코르티코이드, 에스트로겐, 프로게스틴, 안드로겐, 테트라히드로데옥시카리코스테론(tetrahydrodeoxycaricosterone), 시토카인과 성장 인자들, 아스파라긴 분해효소를 포함한다.
[00574] 면역활성 화합물들. 예시들은 면역억제제(예컨대, 피리메타민, 트리메토프테린, 페니실라민, 시클로스포린, 아자티오프린)과 면역자극제(예컨대, 레바미솔, 디에틸디티오카바메이트, 엔케팔린, 엔도르핀)들을 포함한다.
[00575] 항미생물성 화합물들. 예시들은 예컨대, 베타-락탐, 페니실린, 세팔로스포린, 카바페넴 및 모노박탐, 베타-락탐 분해효소 억제제, 아미노글리코시드, 마크롤리드, 테트라사이클린 및 스펙티노마이신과 같은 항생제들을 포함한다.
[00576] 항말라리아제, 항아메바제, 항원생동물제, 항바이러스제 및 항진균제. 예시들은 암포테리신 베타, 아시클로비어, 이독수리딘, 리바비린, 트리플루리딘, 비다르빈, 간시클로비르를 포함한다. 다른 항바이러스제들은 예컨대, ddI, ddC, 3TC, ddA, AZT와 같은 역전사효소 억제제와 뉴클레오시드 유사체, 예컨대, 인비라아제, ABT-538과 같은 단백질 분해효소 억제제; 예컨대, 리바비린과 같은 RNA 가공 억제제 들을 포함한다.
[00577] 항기생충제, 구충제, 방사성 의약품, 위장관 약물, 혈액학적 화합물들 및 면역글로불린들. 예컨대, 항혈우병인자와 인자 IX 복합체와 같은 혈액 응고 단백질들. 예컨대, 디쿠마롤과 헤파린 나트륨과 같은 항응고제. 트라넥사민산과 같은 섬유용해소 억제제.
[00578] 심혈관계 약물과 주변부 항아드레날린성 약물들. 예컨대, 메틸도파, 염산메틸도파(methyldopa HCl)과 같은 중추적으로 작용하는 항고혈압성 약물, 예컨대, 디아족사이드와 염산히드랄라진과 같은 항고혈압성 직접 혈관확장제. 레닌-안지오텐신 시스템에 영향을 주는 약물들. 펜톨아민과 같은 주변부 혈관확장제. 항협심증제와 강심성 배당체들. 예컨대, 암리논, 밀리논, 에녹시몬, 페녹시몬, 이마조단, 그리고 술마졸(sulmazole)과 같은 심장수축혈관확장제. 항비율동성제, 칼슘 차단제 및 예컨대, 라니티딘, 보센탄, 레줄린과 같은 혈중 지질에 영향을 미치는 약물들.
[00579] 호흡기 약물들. 예컨대, 알부테롤, 비톨테롤메실레이트, 염산도부타민, 염산도파민, 황산에페드린, 에피네프린, 염산펜플루라민, 염산이소프로테레놀, 염산메톡사민, 주석산수소노르에피네프린, 염산페닐에프린, 염산리토드린과 같은 교감신경 흥분 약물.
[00580] 예컨대, 염화아세틸콜린과 같은 콜린성 약물들. 예컨대, 염화에드로포늄과 같은 항콜린에스테라아제들. 콜린에스테라아제 리액티베이터들. 예컨대, 염산아세뷰톨롤, 아테놀롤, 염산에스몰롤, 염산라베탈롤, 메토프롤롤, 나돌롤, 펜톨아민메실레이트 및 염산프로파놀롤과 같은 아드레날린 차단 약물들. 예컨대, 안이소트로핀브롬화메틸(anisotropine methyl bromide), 아트로핀 S04, 브롬화클리니듐, 글리코피롤레이트, 브롬화이프라트로피움 및 브롬화수소산스코폴라민과 같은 항무스카린성 약물들.
[00581] 예컨대, 아세틸콜린, 아데노신, 아데노신 3인산과 같은 신경전달물질과 신경전달물질 약물들. 예컨대, 흥분성 아미노산, GABA, 글리신과 같은 아미노산 신경전달물질들. 예컨대, 도파민, 에피네프린, 히스타민, 노르에피네프린, 옥토파민, 세로토닌, 티라민과 같은 생체 아민 신경전달물질들. 신경펩티드, 산화질소 및 칼륨 채널 독소들. 항파킨슨 약물들. 예시들은 염산아말티딘 및 예컨대, 카르비도파와 같은 벤즈트로핀메실레이트를 포함한다.
[00582] 호르몬들. 예컨대, 융모선 생식선 자극 호르몬, 코신트로핀, 메노트로핀, 성장호르몬, 부신 피질 자극 호르몬, 프로티렐린, 갑상선 자극 호르몬, 바소프레신 및 리프레신과 같은 뇌하수체 호르몬들. 예컨대, 베클로메타손 디프로피오네이트, 베타메타손, 덱사메타손 및 트리암시놀론과 같은 부신 호르몬들. 예컨대, 글루카곤 및 인슐린과 같은 췌장 호르몬들. 예컨대, 디히드로타키스테롤과 같은 부갑상선 호르몬. 예컨대, 칼시토닌 디나트륨에티드로네이트, 레보티록신 나트륨, 리오티로닌 나트륨, 리오트릭스, 티로글로불린, 테리파라타이드 아세테이트와 같은 갑상선 호르몬들. 항갑상선 약물들. 에스트로겐성 호르몬들. 프로게스틴과 길항제들 및 호르몬 피임약들. 정소 호르몬들. 예컨대, 콜레시스토키닌, 엔테로글리칸, 갈라닌, 위억제 폴리펩티드, 표피 성장 인자-우로가스트론, 위억제 폴리펩티드, 가스트린 방출 펩티드, 가스트린, 펜타가스트린, 테트라가스트린, 모틸린, 펩티드 YY, 세크레틴, 혈관작용 소장펩티드, 신칼라이드(sincalide)와 같은 위장관호르몬들.
[00583] 효소들. 예시들은 히알루노니다아제, 스트렙토키나아제, 조직 플라스미노겐 활성자, 우로키나아제, PGE-아데노신 탈아미노화 효소를 포함한다.
[00584] 펩티드들과 단백질들. 나노입자 생체접합체 시스템은 펩티드들/단백질들을 캡슐화할 수 있으며/있거나 펩티드들/단백질들을 통해 기능화된 표면들을 가질 수 있다. 펩티드들과 단백질들의 예시들은 안키린, 아레스틴, 세균막 단백질, 클라스린, 코넥신, 오브알부민, HA 또는 VSVG와 같은 캡시드 또는 껍질들로부터의 바이러스 단백질들, 디스트로핀, 엔도텔린 수용체, 스펙트린, 셀렉틴, 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 인슐린, 적혈구생성소(EPO), 종양 괴사 인자(TNF), 신경펩티드, 신경펩티드 Y, 뉴로텐신, 형질전환 생장인자 알파, 형질전환 생장인자 베타, 인터페론(IFN) 및 호르몬들, 예컨대, 제니스테인, 스테로이드 등과 같은 성장 억제제들, 예컨대, ABC 운반체, 혈소판 당단백질, GPIb-IX 복합체, GPIIb-IIIa 복합체, 비트로넥틴, 트롬보모듈린, CD4, CD55, CD58, CD59, CD44, 림프구기능관련항원, 세포간 접합분자, 혈관세포 접합분자, Thy-1, 역수송체, CA-15-3 항원, 피브로넥틴, 라미닌, 미엘린 연관 당단백질, GAP, GAP-43과 같은 당단백질들을 포함한다.
[00585] 시토카인과 시토카인 수용체들. 본 발명의 나노입자 캐리어들을 통해 전달될 수 있는 시토카인들과 그들의 수용체들의 예시들은 다음을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다: 인터루킨-1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-1 수용체, IL-2 수용체, IL-3 수용체, IL-4 수용체, IL-5 수용체, IL-6 수용체, IL-7 수용체, IL-8 수용체, IL-9 수용체, IL-10 수용체, IL-11 수용체, IL-12 수용체, IL-13 수용체, IL-14 수용체, IL-15 수용체, IL-16 수용체, IL-17 수용체, IL-18 수용체, 림포카인 억제 인자, 대식세포 증식 자극인자, 혈소판 유래 성장인자, 줄기 세포 인자, 종양 성장 인자 베타, 종양 괴사 인자, 림프독소, Fas, 과립구 집락 자극인자, 과립구 대식세포 집락 자극인자, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마.
[00586] 성장인자들, 단백질 호르몬들 및 그들의 수용체들. 예시들은 적혈구생성소, 안지오제닌, 간세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 각질세포 성장인자, 신경 성장인자, 종양 성장인자 알파, 혈소판생성소, 갑상선 자극 인자, 갑상선 방출 호르몬, 뉴로트로핀, 상피세포 성장인자, 혈관내피세포 성장인자, 섬모 신경영양성 인자, 저밀도 지질단백질, 성장촉진제, 인슐린 성장인자, 인슐린-유사 성장인자 I, II 들을 포함한다.
[00587] 케모카인과 그들의 수용체들. 예시들은 다음을 포함한다: ENA-78, ELC, GRO-알파, GRO-베타, GRO-감마, HRG, LIF, IP-10, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIP-1알파, MIP-1베타, MIG, MDC, NT-3, NT-4, SCF, LIF, 렙틴, RANTES, 림포탁틴, 에오탁신-1, 에오탁신-2, TARC, TECK, WAP-1, WAP-2, GCP-1, GCP-2, 알파-케모카인 수용체들: CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7, 베타-케모카인 수용체들: CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7.
[00588] 항체들. 본 발명의 나노입자 캐리어들을 통해 표적화 리간드로써 사용될 수 있는 항체들의 예시들은 다음을 포함한다:(a) 분화 항원 CD-1 내지 CD-166과 이 분자들의 리간드들 또는 반대 수용체들로 이루어진 항-클러스터;(b) 예컨대, 항-IL-1 내지 항-IL-18까지와 이 분자들의 수용체들과 같은 항-시토카인 항체들;(c) 항-면역 수용체 항체들, T 세포 수용체들에 대한 항체들, 주조직 적합성 복합체 I과 II, B 세포 수용체들, 셀렉틴 킬러 억제성 수용체들, 킬러 활성화 수용체들, OX-40, MadCAM-1, Gly-CAM1, 인테그린, 카데린, 시알로아드헤진, Fas, CTLA-4, Fcy-수용체, Fc알파-수용체들, Fc엡실론-수용체들, Fc뮤-수용체들, 그리고 그들의 리간드들;(d) 예컨대, 콜라게나제, MMP-1 내지 MMP-8, TIMP-1, TIMP-2와 같은 항-메탈로프로테나제 항체들, 예컨대, 퍼포린, 보체 구성요소들, 프로스타노이드, 산화질소, 트롬복산과 같은 항-세포 용해 향염증성 분자들 및(e) 예컨대, 암태아성 항원들, 라민들, 피브로넥틴들과 같은 항-부착 분자들.
[00589] 본 발명의 나노입자 전달을 통해 전달될 수 있는 알려진 치료제들의 구체적인 예시들은 다음을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다:(a) 카포텐, 모노프릴, 프라바콜, 아바프로, 플라빅스, 세프질, 듀리세프/울트라세프, 아작탐, 비덱스, 제리트, 막시핌, 베페시드, 파라플라틴, 플라티놀, 탁솔, UFT, 부스파르, 세르존, 스타돌 NS, 에스트레이스, 글루코파지(Bristol-Myers Squibb);(b) 세클러, 로라비드, 다이나백, 프로작, 다르본, 페르맥스, 자이프렉사, 휴멀로그, 액시드, 젬자, 에비스타(Eli Lily);(c) 바소텍, 바세레틱, 메바코르, 조코, 프리니빌/프린자이드, 플렌딜, 코자, 하이자, 펩시드, 프릴로섹, 프리막신, 노록신, 리콤비박스 HB, 바리박스, 티모프틱-XE, 트루솝트, 프로스카, 포자맥스, 시네메트, 크릭시반, 프로페시아, 비옥스, 싱귤레어, 맥살트, 이베르메틴(Merck & Co.);(d) 디플루칸, 유나신, 설페라존, 지스로맥스,프로카디아 XL, 카두라, 노바스크, 도페틸라이드, 펠덴, 졸로프트, 젤독스, 글루코트롤 XL, 지르텍, 엘레트립탄, 비아그라, 드롤록시펜, 아리셉트, 리피토(화이자);(e) 반틴, 레스크립토, 비스티드, 제노트로핀, 마이크로나제/글린/글리뷰리드, 프라그민, 메드롤, 자낙스, 알프라졸람, 사미온, 할시온, 트리아졸람, 프리독스, 도스티넥스, 에드로낙스, 미라펙스, 파모루비신, 아드리아마이신, 캄프토자, 레미사, 데포-프로베라, 카버젝트, 디트루시톨, 에스트링, 힐론, 잘라탄, 로게인(Pharmacia & Upjohn);(f) 로피드, 아큐프릴, 다일랜틴, 코그넥스, 뉴론틴, 로에스트린, 딜젬, 펨팻치, 에스트로스텝, 레줄린, 리피토, 옴니세프, FemHRT, 수라민 및 클리나플록사신(Warner Lambert).
[00590] 당업자들은 이것이 본 발명의 백신 나노캐리어들과 병용되어 전달될 수 있는 치료제, 진단제 및/또는 예방제의 포괄적인 것이 아닌 예시적인 목록이라는 것을 알 것이다. 임의의 치료제, 진단제 및/또는 예방제도 본 발명에 따라 백신 나노캐리어들과 함께 투여될 수 있다.
키트들
[00591] 본 발명은 본 발명의 나노캐리어들을 하나 이상 포함하는 다양한 키트들을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 백신 나노캐리어와 그 사용에 대한 지침들을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 복수의 다른 백신 나노캐리어들을 포함할 수 있다. 키트는 다른 구성 요소들 또는 약물들의 임의의 조합들도 포함할 수 있다. 모든 다양한 조합들은 명백하게 드러나지 않지만, 각 조합은 본 발명의 범위 내에 포함되어 있다.
[00592] 본 발명의 특정 실시예에 따르면, 키트는 예를 들면:(i) 적어도 하나의 면역조절제를 포함하는 백신 나노캐리어로서, 상기 적어도 하나의 면역조절제는 T 세포와 B 세포 모두의 반응을 자극할 수 있는 백신 나노캐리어;(ii) 상기 백신 나노캐리어를 이를 필요로 하는 피검자에게 투여하기 위한 지침들을 포함할 수 있다.
[00593] 특정 실시예에서, 키트는 예를 들면,(i) 적어도 하나의 면역조절제를 포함하는 백신 나노캐리어로서, 상기 적어도 하나의 면역조절제는 T 세포와 B 세포 모두의 반응를 자극할 수 있는 백신 나노캐리어; (ii) 상기 백신 나노캐리어를 이를 필요로 하는 피검자에게 투여하기 위한 지침들을 포함할 수 있다.
[00594] 특정 실시예에서, 키트는 예를 들면,(i) 적어도 하나의 면역조절제로서, 상기 적어도 하나의 면역조절제는 T 세포와 B 세포 모두의 반응을 자극할 수 있는면역조절제;(ii) 적어도 하나의 표적화 모이어티;(iii) 적어도 하나의 면역자극제;(iv) 폴리머 매트릭스 전구체;(v) 지질들과 양친매성 실재들;(vi) 개별 구성 요소들(i) - (v)로부터 본 발명의 백신 나노캐리어들을 조립하는 데에 필요한 지침들을 포함할 수 있다.
[00595] 일부 실시예에서, 키트는 본 발명의 나노캐리어 및 그것을 혼합하는 데에 필요한 지침들을 포함한다. 또한, 그러한 키트들은 일부 실시예에서 면역자극제 및/또는 면역조절제를 포함한다(예컨대, B 세포 또는 T 세포 항원). 그러한 키트들의 나노캐리어는 면역조절제(예컨대, 보편적 T 세포 항원과 같은 T 세포 항원) 및/또는 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 T 세포 항원 및/또는 표적화 모이어티는 나노캐리어의 표면상에 존재할 수 있다. 일부 실시예에서, 면역조절제와 항원들은 동일하다. 일부 실시예에서, 그들은 상이하다.
[00596] 키트들은 통상적으로 본 발명의 백신 나노캐리어들을 사용하기 위한 지침들을 포함한다. 지침들은 예를 들면, 프로토콜들을 포함하며/하거나 백신 나노캐리어들의 생산과 백신 나노캐리어들을 이를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 데에 필요한 조건들 등을 기술할 수 있다. 키트들은 일반적으로 일부 또는 모든 독립적인 구성 요소들과 시약들이 분리되어 보관될 수 있도록 하나 이상의 용기들 또는 보관 공간들을 포함한다. 또한, 키트들은 상업적 판매를 위해 상대적으로 가까운 제한을 통해 독립적인 보관 공간들을 담기 위해, 지시들에 의하면 스티로폼 등의 포장재료들이 담길 수 있는, 예를 들면, 플라스틱 상자와 같은 수단을 포함할 수 있다. 예컨대, 바코드, 전파 식별(ID) 태그 등의 식별자가 키트에 포함된 용기들 또는 보관 공간들 중 하나 이상에, 또는 키트의 내부 또는 겉면에 존재할 수 있다. 식별자는 예컨대, 품질 통제, 재고 통제, 추적, 워크스테이션들 간의 이동 등의 목적으로 키트를 고유하게 식별할 수 있도록 하기 위해 사용될 수 있다.
예시
예 1: 림프절에 있는 피막하동 대식세포들은 림프를 통해 전염되는 바이러스들을 없애며 그들을 항바이러스 B 세포들에게 제시한다.
재료들 및 방법들
방법의 요약
[00597] VSV-IND 및 VSV-NJ 비리온들은 감염된 BSRT7 세포들의 배양 상층액으로부터 정제되어 변형되지 않고 사용되거나 Alexa-568(적색) 또는 Alexa-488(녹색)을 사용하여 형광으로 표지되었다. 조직 이미지 촬영을 위해 사용된 형광을 띤 바이러스들은 형광을 띠지 않은 후대를 생성하는 것을 차단하기 위해 UV를 조사하였다. 형광으로 표지하는 것 또는 UV를 VSV-IND 입자들에 조사하는 것은 그들의 항원성 또는 VI10YEN 세포들에서의 칼슘 흐름을 도출하는 능력들(미도시)에는 영향을 끼치지 않았다. 발바닥에 형광을 띤 바이러스를 주사한 뒤, 전자현미경을 통한 분석, 또는 면역염색과 공초점 현미경을 위해 동결 절편을 생성하기 위해 배수 슬와 림프절들이 수거되었다. 림프절에서 양자도입된 B 세포를 이미지 촬영하기 위해, VI10YEN과 야생형 B 세포들은 형광으로 표지된 뒤에 야생형 또는 돌연변이인 수여자 마우스에게 정맥 내 주사를 통해 동시 도입되었다. 18시간 뒤, B 세포들이 B 세포 여포로 돌아간 뒤, 마우스들은 오른쪽 발바닥에 표지되거나 표지되지 않은 VSV를 주사받았다. 이후 다른 시간 간격들에서, 배수 슬와 림프절들은 MP-IVM을 통해 관찰되거나 또는 바이러스 특이성 활성 상태를 분석하고 B 세포들을 통제하기 위한 목적에서의 공초점 현미경, 또는 유세포 분석기를 위해 수거되었다. 일부 실험들에서, 슬와림프절에 있는 대식세포들은 CLL의 피하 주사에 의해 고갈되었으며, 동물들은 7일에서 10일 이후의 실험에서 사용되었다. 다양한 마커들에 대해 MP-IVM, 전자현미경, 면역조직화학 및 유세포 분석기들이 기존에 CLL 처리를 한 뒤, 또는 하지 않은 뒤 림프절들에 행해졌다. 발바닥 주사 부위로부터 혈액과 다른 기관들로의 VSV 증식은 소정 양의 살아있는 VSV를 발바닥에 주입한 뒤에, VSV 주사 이후 2시간에서 6시간 이후 조직 수거를 통해 분석되었다. 바이러스 역가를 측정하기 위해, 조직들은 균질화되어 용균반 검사에 사용되었다. 일부 바이러스 증식 실험들은 흉관의 삽관 과정 이후에 수행되었다.
마우스들과 항체들
[00598] C57BL/6과 BALB/c 마우스들은 Taconic Farms(Germantown, NY)로부터 구입하였다. VI10YEN(Hangartner et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 100:12883; 본 명세서에 참고로 포함된다), Act-EGFP(Wright et al., 2001, Blood, 97:2278), 및 DH-LMP2A 마우스(Casola et al., 2004, Nat. Immunol., 5:317; 본 명세서에 참고로 포함된다)들은 하버드 의과 대학과 면역 질환 기관(IDI)에 있는 배리어 동물 시설들에서 사육되었다. 방사선 키메라들은 Act(EGFP)마우스들을 650 rad 방사선으로 두 번 조사한 뒤 C57BL/6 골수로 복원하여 생성되었으며, 사용하기 전에 8주 동안 복원할 수 있는 시간을 허용하였다. 일부 실험들에서, SCS 대식세포들은 실험 7-10일 이전에 30 ㎕ 클로드로네이트 리포솜(CLL)을 발바닥에 주사하여 고갈되었다.
[00599] 클로드로네이트는 Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany의 선물이었다. 리포솜의 제조 과정에 필요한 시약들은 포스파티딜콜린(LIPOID E PC, Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany)과 콜레스테롤(Sigma-Aldrich) 였다.
[00600] 마우스들은 National Institutes of Health의 지침에 따라 무특이 병원체 및 무항 바이러스항체 조건에서 수용되었다. 모든 실험동물 절차들은 하버드 의과 대학의 실험 동물 위원회와 면역 질환 기관(IDI)에 의해 승인되었다.
[00601] 항체들은 항-B220-Alexa647(Invitrogen-Caltag), 항-LYVE-1(Millipore-Upstate), 염소-항-토끼-APC(Invitrogen), 염소-항-GFP-FITC(Rockland), 항-FITC-Alexa488(Invitrogen) 및 Fab 항-IgM-FITC(Jackson Immunoresearch)를 제외하고는 모두 BD Biosciences(San Jose, CA)로부터 구입하였다. 다음의 항체들은 AbD-Serotec 으로부터 구입하였다: 항-CD68-Alexa647, 항-CD11b-Alexa647, F4/80-Alexa647, 항-CD169-FITC(3D6). VI10YEN 마우스에서 VI10 BCR을 발견하기 위한 항-동형 항체 35.61(Hangartner et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 100:12883; 본 명세서에 참고로 포함된다)은 표준 방법들에 따라 하이브리도마 상층액으로부터 생성되었다.
유세포 분석기
[00602] 혈액 표본의 유세포 분석은 마우스의 후안구 정맥절개술과 ACK 완충제(0.15 M NH4Cl, 1mM KHCO3, 0.1 mM EDTA(이나트륨염), pH 7.2)로 적혈구를 용혈한 뒤에 수행되었다. 림프절과 비장의 단세포 현탁액은 조직들을 조심스럽게 다진 후에 250 ㎍/ml 리버라아제 CI(Roche)와 50 ㎍/ml DN아제-I(Roche)의 존재하에, 37℃에서 DMEM(Invitrogen-Gibco)으로 40분 동안 분해시킴으로 생성되었다. 20분 동안 분해한 후, 표본들은 완전한 장기 분리를 확실시 하기 위해 18G 바늘에 격렬하게 관통되었다. 모든 유세포 분석들은 FACScalbur(BD Pharmingen) 위에서 PBS와 2 mM EDTA 및 2% FBS(Invitrogen-GIBCO)로 보충된 PBS를 포함하는 FACS 완충제에서 수행되었으며, FlowJo 소프트웨어(Treestar Inc., Ashland, OR)에 의해 분석되었다. 칼슘 흐름을 위해, 세포들은 10% FCS를 포함하는 DMEM에서 4 μM Fluo-LOJO(Teflabs)로 37℃에서 90분 동안 표지되었다. 세포들은 FCS를 통해 회전되었으며 즉시 사용되었다.
바이러스들과 VSV 용균반 검사
[00603] VSV 혈청형 Indiana(VSV-IND, Mudd-Summers 유도 클론, 시험관 내 배양(Whelan et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:8388; 본 명세서에 참고로 포함된다)과 용균반 정제됨) 또는 New Jersey(VSV-NJ, 프링글 분리(Pringle Isolate), 용균반 정제됨)들은 BSRT7 세포들에서 0.01 감염다중도로 번식되었다. 감염된 세포들의 상층액들은 2000 x g 에서 원심분리한 후, 0.45 ㎛ 멸균 필터를 통해 여과되어 세포 잔해로부터 분리된 뒤 40,000 x g 에서 90분 동안 초원심분리를 수행하였다. 펠렛들은 PBS에서 재부유된 뒤에 NTE(0.5 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM EDTA pH 8)에서 10% 자당의 쿠션을 통한 초원심분리(150,000 x g, 60 분)를 통해 정제되었다. 하룻밤 동안 PBS에서 재부유된 뒤, 바이러스 단백질은 BCA 검사(Pierce)에 의해 수량화되었으며, 감염도는 용균반 검사에 의해 수량화되었다. 일부 배치들(batches)은 바이러스 입자 대비 104-105 배의 Alexa 염색제 몰 과잉 조건에서 AlexaFluor-488 또는 AlexaFluor-568(Invitrogen-Molecular Probes)의 카르복실산 숙신이미딜 에스테르로 표지되었다. 접합되지 않은 염색제는 NTE에서 10% 자당 조건을 통해 초원심분리를 진행하여 제거되었으며, 펠렛들은 PBS에서 재부유되어 동결 보관 되었다. VSV 제조의 감염도는 사바나 원숭이 콩팥 세포들(Vero)에서 진행된 용균반 검사에 의해 수량화되었다. 감염된 마우스들의 기관으로부터의 VSV 역가 또한 Potter-Elvejhem 균질기를 통해 기관들을 균질화한 뒤에 유사하게 결정되었다. 필요한 경우, 바이러스 제조 동안 157,000 x g 초원심분리로부터 대략 4 ml 상층액이 수거된 뒤 10,000 MWCO Amicon Ultra(Millipore)를 통해 농축되었다. 농축된 상층액에서의 잔류성 감염도를 설명하기 위해, VSV 스톡이 농축된 상층액의 것과 동일한 정도의 감염도로 희석되었으며 VI10YEN B 세포들에 있는 칼슘 흐름이 100 배 희석된 VSV와 상층액들에서 비교되었다. UV-비활성화된, AlexaFluor-568로 표지된 아데노바이러스 5(AdV5)가 다음의 표준 절차들(Leopold et al., 1998, Human Gene Therapy, 9:367; 본 명세서에 참고로 포함된다)을 통해 생성되었다. 모든 감염 작업은 기관의 지침들에 따라 지정된 BL2+ 작업 공간에서 수행되었으며, 하버드 미생물학적 안전성 위원회에 의해 승인되었다.
VSV 중화 검사
[00604] 면역된 마우스의 혈청이 2% FCS를 포함하는 MEM에서 40배로 예비희석되었다. 연속적인 2배 희석물들이 동일한 양의 VSV(500 pfu/ml)와 혼합되었으며, 37℃, 5% CO2 농도 조건 하에 90분 동안 배양되었다. 혈청-바이러스 혼합물 100 ㎕가 Vero 세포 단일층으로 옮겨져서 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. 단일층들에 1% 메틸셀룰로오스를 포함하는 DMEM 100 ㎕를 덮어씌운 뒤, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 덮어씌웠던 것이 제거되었고 단일층은 고정된 뒤 0.5% 크리스털 바이올렛으로 염색되었다. 용균반의 수를 50% 감소시킨 가장 높은 희석도의 혈청이 역가로서 선택되었다. IgG 역가를 측정하기 위해, 희석되지 않은 혈청이 식염수에서 동일한 부피의 0.1 mM 베타-메르캅토에탄올로 예비처리되었다.
부착 검사
[00605] 96 웰 플레이트(Corning)가 하룻밤동안 재조합 마우스 VCAM-1-Fc 또는 ICAM-1-Fc(R&D Systems) 희석액, 또는 PBS에서 정제된 VSV-IND로 3벌로 코팅되었다. 음성 대조군 웰들은 4% BSA로 코팅되었으며, 양성 대조군 웰들은 1 mg/ml 폴리-L-리신으로 코팅되었다. 플레이트들은 행크스 균형 염 용액/1% BSA로 4℃ 조건에서 1-2시간 동안 블록된 뒤 세척되었다. VI10YEN 또는 C57BL/7 마우스로부터 얻은 나이브 B 세포들은 CD43 자기성 비드(Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 자기성 세포 분리를 통해 음성 선택된 뒤 37℃ 조건에서 30분 동안 UV-비활성된 VSV-IND(1000 감염다중도)의 존재 또는 부재에서, 1% BSA, 1 mM Ca2 +와 1 mM Mg2+로 보충된 HBSS에서 웰당 3 x 105 밀도로 플레이트에 첨가되었다. 부드럽게 세척한 뒤(1% BSA로 보충된 HBSS에서 3회), 플레이트들은 PBS/10% 글루타르알데히드로 10분 동안 고정된 뒤, 0.5% 크리스털 바이올렛/20% 메탄올로 45분 동안 염색된 이후, 물에 세척되었다. 염색제는 1% SDS를 첨가하여 용출된 뒤, 30분 후에 570 nm 에서의 흡광도가 분광광도계로 측정되었다(SpectraMax340PC 마이크로플레이트 리더와 SoftmaxPro 3.1.2 소프트웨어, Molecular Devices Corporation).
공초점 현미경
[00606] 일부 분석에서는, C57BL/6 마우스들의 양쪽 뒷발바닥에 20 ㎍ AlexaFluor-568 또는 AlexaFlour-488로 표지된 VSV-IND 또는 VSV-NJ를 30분 동안 주사하였다. 다른 실험들에서는, 마우스들은 VI10YEN x MHCII-EGFP 마우스로부터 1 x 107 음성 선택된 나이브 B 세포들을 실험 하루 전날에 주입받았다. 소정의 시간대에서, 슬와 림프절들이 1% 파라포름알데히드/과옥소산염(PLP)으로 보충된 인산염 완충 L-리신를 발바닥 주사를 통해 제자리에 고정되었다. 슬와림프절들의 제거와 4℃의 PLP에서 3-5시간 동안 배양한 뒤, 슬와림프절들은 0.1 M PBS, pH 7.2 조건에서 세척된 뒤, PBS에서 자당 농도를 10%, 20% 및 30%로 점차 상승시킴을 통해 동결보호되었다. 표본들은 TBS 조직 동결액(Triangle Biomedical Sciences, Durham NC)에서 순간동결된 뒤에 -80℃에서 보관되었다. 40 ㎛ 두께의 절편들이 Superfrost Plus 슬라이드들(Fisherbrand) 위에 올린 뒤에 1 ㎍/ml 항체 2.4G2(BD Pharmingen)으로 Fc 수용체를 차단하고 습한 챔버에서 형광항체로 염색되었다. 표본들은 FluorSasve 시약 용액(EMD-Calbiochem)에 올린 뒤 분석할 때까지 4℃에서 보관되었다. 이미지들은 Olympus BX50WI 현미경과 10x/0.4 또는 60x/1.2W 대물렌즈들을 사용하여 BioRad 공초점 현미경 시스템으로 수집되었다. 이미지들은 LaserSharp2000 소프트웨어(BioRad Cell Science, Hemel Hempstead, Great Britain)와 Photoshop CS(Adobe)를 사용하여 분석되었다. B220 대비염색에서 나타난 것처럼, T/B 경계에 국재된 B 세포들의 수량화는 T/B 경계의 50 ㎛ 범위 내에 있는 세포들을 계수하여 이루어졌으며, 보다 중앙 부분에 국재되어 있는 임의의 세포들은 소포성으로 간주되었다.
전자현미경
[00607] 슬와림프절들은 pH 7.4 조건에서 0.1 M 카코딜레이트나트륨 완충제의 2% 포름알데히드와 2.5% 글루타르알데히드를 발바닥에 주사하여 제자리에 고정되었다. 림프절들은 절제된 뒤 하룻밤동안 4℃에서 동일한 완충제에 담근 뒤, 카코들레이트 완충제에 세척된 뒤, 어두운 상온에서 1시간 동안 1% 오스뮴테트록사이드와 1.5% 시안화철칼륨(물에서)로 오스뮴화 되었다. 물에 세척한 뒤, 표본들은 pH 5.15 조건에서 0.05 M 말레인산염 완충제로 3-4차례 세척되었다. 표본들은 2시간 동안 말레인산염 완충제에서 1% 우라닐아세테이트로 대비염색된 뒤에 3회 물로 세척되었다. 표본들은 물로 희석된 에탄올에서 15분 동안 배양 통해 탈수된 뒤(70%-90%-100%), 프로필렌옥사이드에서 1시간 동안 배양된 뒤, 하룻밤동안 상온에서 프로필렌옥사이드와 1:1로 혼합된 에폰으로 옮겨졌다. 표본들은 새로 혼합된 에폰으로 채워진 임베딩 주형으로 옮겨진 뒤, 중합 반응을 위해 24-48시간 동안 60℃에서 가열되었다. 표본들은 Harvard Medical School EM Facility에 있는 Tecnai G2 Spirit BioTWIN 전자현미경으로 분석되었다.
슬와림프절의 생체 내 다중 광양자현미경
[00608] 나이브 B 세포들은 CD43 비드들(Miltenyi)을 사용하여 자기성 분리를 통해 음성 선택되었다. VI10YEN B 세포들은 37℃ 조건에서 10 μM 5-(및 6-)-(((4-클로로메틸)벤조일)아미노)테트라메틸로다민(CMTMR; Invitrogen)으로 20분 동안 표지되었으며, C57BL/6 B 세포들은 37℃ 조건에서 10 μM 7-아미노-4-클로로메틸쿠마린(CMAC; Invitrogen)으로 25분 동안 표지되었다. 일부 실험들에서, 비특이적인 염색제 효과를 제거하기 위해 표지들은 야생형과 VI10YEN B 세포들 사이에서 교환되었다. 각 군집의 5 - 6 x 106 B 세포들은 혼합되어 분석 하루 전날에 C57BL/6 수여자 마우스들의 꼬리 정맥에 주사를 통해 양자도입 되었다. 일부 실험들에서, 수여자 C57BL/6 마우스들은 SCS 대식세포들을 제거하기 위해 실험 7 -10일 전에 뒤쪽 발바닥에 30 ㎕ CLL을 주사받았다(Delemarre et al., 1990, J. Leukoc. Bio., 47:251; 본 명세서에 참고로 포함된다). B 세포 양자도입 18시간 후, 수여자 마우스들은 케타민(50 mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg)의 복강내 주사를 통해 마취되었다. 오른쪽 슬와림프절이 MP-IVM을 위해 미세수술되어 기술된 대로 주문 제작한 현미경 재물대 위에 올려졌다(Mempel et al., 2004, Nature, 427:154; 본 명세서에 참고로 포함된다). 혈관과 수입림프관을 남겨놓기 위해 주의를 다하였다. 노출된 림프절은 생리식염수에 담긴 뒤 덮개유리로 덮였다. 내부 온도를 모니터링 하기 위해 림프절 옆에 열전대가 놓여졌으며, 온도는 36-38℃로 유지되었다. MP-IVM이 조정 가능한 MaiTai Ti: 사파이어 레이저(Spectra Physics)로부터 유래한 800 nm의 흥분 파장 조건에서 BioRad 2100MP 시스템으로 수행되었다. 형광으로 표지된 VSV(20 ㎕에서 20 ㎍)가 수반되는 관찰의 대상인 수여자 마우스들의 오른쪽 뒷발바닥에 31G 바늘을 사용하여 주사되었다. 세포 이동의 4차원 오프라인 분석을 위해, 4 ㎛의 z 간격에서 11개의 광학 x-y 절편 무더기들이 매 15초마다 20x/0.95 수침 대물렌즈(Olympus)를 통해 1.8x -3x 전자 줌을 통해 획득되었다. 방출된 형광과 이차 조화파 신호들이 비-디스캔 디텍터와 400/40 nm, 450/80 nm, 525/50 nm 및 630/120 nm 대역 통과 필터를 통해 삼색 이미지들을 생성하기 위해 검출되었다. 이미지 무더기들의 시퀀스들은 Velocity 소프트웨어(Improvision)를 사용하여 용적 연출된 4차원 저속 촬영 동영상들로 변형되었다. 3D 순간속도들은 Matlab(Mathworks)에 의한 속도와 컴퓨터 분석을 사용한 반자동화된 세포 추적을 통해 측정되었다. SCS에서의 세포 축적은 중립적인 관찰자들에 의해 수행된 수동 동영상 분석에 의해 측정되었다. 매 2분마다, VI10YEN B 세포들과 다클론성 B 세포들은 SCS에서, 표층 소낭(SCS에서부터 50 ㎛ 미만의 거리)과 심층 소낭(SCS에서부터 50 ㎛ 초과 거리)에서 계수되었으며, 전체 30분의 동영상에서 VI10YEN/다클론성 B 세포들의 비율들은 각 구획에서 발현되었다.
흉관의 삽관 과정
[00609] 흉관의 삽관 과정에서, 마우스들은 림프관의 시각화를 촉진하기 위해 삽관 과정 30분 이전에 200 ㎕의 올리브 오일을 경구로 투여받았다. 동물들은 이후에 자일라진(10 mg/kg)과 염산케타민(50 mg/kg)으로 마취되었다. 1 U/ml 헤파린(American Pharmaceutical partners, Los Angeles, CA)을 포함하는 링거 젖산염(Abbott Laboratories, North Chicago, IL)의 지속적인 투입(2 ml/hour)을 위해 폴리에틸렌 카테터(PE-10)가 우측 경정맥으로 삽입되었다. 해부현미경을 사용하여, 흉관은 좌측 늑골하절개를 통해 노출되었다. Silastic 실리콘 배관(0.012 I.D.,Dow Corning, Midland, USA)이 헤파린화된(50 U/ml) 인산염 완충 식염수(DPBS, Mediatech, Herndon, VA)로 씻겼고, 대략 0.3 mm의 절개를 통해 가슴림프관팽대로 삽입된 뒤에 이소부틸시아노아크릴레이트 단량체(Nexaband
Figure 112011035177379-pct00016
, Abbott Laboratories)로 고정되었다. 배관의 남은 부분은 후복벽을 통해 밖으로 노출되었다. 이후, 복부 절개는 6-0 비흡수성 봉합사(Sofsilk, Tyco Healthcare Group, Norwalk, CO)를 사용하여 봉합되었다. 30분 동안의 림프 흐름 평형화 이후에, 동물들의 발바닥에 108 puf VSV-IND를 주사하고 림프 표본들이 여섯 시간 동안 얼음 위에서 수거되었다. 림프와 기관들은 6시간 동안의 흉관 림프 수집 이후에 위에서 기술된 대로 용균반되었다. 일부 실험들에서, 배수 슬와 림프절 및 대동맥곁림프절들은 수술적으로 절제되었고 둘러싸고 있는 림프관들은 림프-매개 바이러스의 혈액으로의 유입을 방지하기 위해 지졌다.
결과 및 토의
[00610] 림프절들은 예를 들면 감염의 말초 부위들로부터 인체의 표면으로 유입되는 바이러스와 같은, 병원체들의 몸 전체로의 산개를 방지한다. 또한, 그들은 병원체로부터 유도된 항원들에 대한 후천성 면역 반응이 일어나는 장소들이다(von Adrian and Mempel, 2003, Nat. Rev. Immunol., 3:867; and Karrer et al., 1997, J. Exp. Med., 185:2157; 둘 다 본 명세서에 참고로 포함된다). 바이러스 입자들이 어떻게 수입림프관으로부터 내보내어져서 항체 반응을 유도하기 위해 동족 B 세포들에게 제시되는 지는 뚜렷하지 않다. 여기에서 우리는 림프절의 수질에서와 피막하동(SCS)의 바닥면에 존재하며 피하 주사 이후 몇 분 이내로 바이러스 입자들을 포획하는 CD11b+CD169+MHCII 대식세포들의 군집을 확인한다. SCS 대식세포들은 표면 결합 바이러스 입자들을 SCS 바닥면을 가로질러 이동시켰으며 그들을 아래쪽에 있는 소낭에 존재하는 이동하는 B 세포들에게 제시하였다. 이러한 대식세포들의 선택적인 고갈은 국부적 바이러스 고정을 감소시켰으며, 호스트의 바이러스혈증을 악화시켰으며, 국부적 B 세포 활성화를 손상시켰다. 이러한 발견들은 CD169+ 대식세포들이 이중 생리학적 기능을 가지고 있다는 것을 의미한다. 그들은 림프-매개 병원체들의 전신적인 확산을 막음으로써 선천적 "파리잡이 끈끈이"로 작용하며, 미립자 항원의 B 세포 인식을 촉진하고 체액성 면역 반응을 개시하는 림프-조직 인터페이스에서 중요한 문지기로서 작용한다.
[00611] 우리는 말초적 조직들에 유입되는 바이러스 입자들이 유출 림프절 내에서 어떻게 처리되는 지를 연구하였다. 마우스들의 뒤쪽 발바닥들에 형광으로 표지된, 곤충에게 물림으로 전염 가능한 세포병변성 랍도바이러스인 UV-비활성화 수포성 구내염 바이러스(VSV)가 주사되어(Mead et al., 2000, Ann. N.Y. Acad. Sci., 916:437; 본 명세서에 참고로 포함된다) T-독립 중화 B 세포 반응들을 도출하였다(Bachmann et al., 1995, Eur. J. Immunol., 25:3445; 본 명세서에 참고로 포함된다). 다중 광양자 생체 내 현미경을 감염된 발바닥에서 유출하는 슬와림프절에서의 사용을 통해(Mempel et al., 2004, Nature, 247:154; 본 명세서에 참고로 포함된다), 우리는 피하 주사 이후 몇 분 이내로 SCS 바닥면에 독립된 영역들로 축적된 VSV를 관찰하였으며, 그와 동시에 SCS의 천정과 실질조직들에는 바이러스가 없음을 관찰하였다(도 11A). 바이러스 퇴적물은 점차적으로 고밀도가 되어, 뚜렷하게 불규칙한 그물 모양의 패턴을 형성하였으며, 그것은 수 시간 동안 자리에 고정된 채로 남아있었다.
[00612] 림프절들에서 VSV 결합이 편향적으로 일어나는 부위를 특정하기 위해, 우리는 방사선처리된 Act(EGFP) 마우스들을 야생형 골수로 재구성하였다. 이로 인해 생성된 B6 -> Act(EGFP) 키메라들은 비-조혈모세포들에서 EGFP를 발현하였으며, 그 장소는 림프내피세포의 SCS 바닥면과 천정이었을 것으로 추정된다. 형광 VSV를 C57BL/6 -> Act(EGFP) 키메라들의 발바닥에 주사한 뒤, 바이러스 입자들은 SCS를 뒤덮었다. 세 시간 뒤, 결합하지 않은 내강의 VSV는 사라졌지만, SCS 바닥면은 EGFP+ 세포들과 공-국부화 하지 않은 VSV의 현저한 영역들을 보임으로, VSV가 조혈모세포들에 의해 포획되었다는 것을 제시하였다(도 11B). VSV를 포획하는 것으로 추정되는 백혈구들을 특정하기 위해, 우리는 VSV 주사 이후 5분 뒤에 수거된 슬와림프절들을 전자현미경으로 관찰하였다. 총알 모양의, 전자밀집성 VSV 입자들은 SCS 내부에, 또는 SCS 바닥면의 바로 밑에 있는 흩어진 큰 세포들의 표면에 존재하는 독립된 영역들에 선택적으로 결합하였다. SCS 바닥면 아래에 위치한 VSV-결합 세포들은 통상적으로 SCS 내강으로 뻗어나간 돌출부를 통해 림프 구획들과 접촉하였다.
[00613] 림프절의 초미세구조 연구는 SCS가 많은 대식세포들을 포함하고 있다는 것(Clark, 1961, Am. J. Anat., 110:217; and Farr et al., 1980, Am. J. Anat., 265; 둘 다 본 명세서에 참고로 포함된다)을 보이며, 그래서 우리는 VSV를 유지하는 세포들이 이 군집에 속한다는 가설을 세웠다. 물론, 발바닥에 주사한 지 30분 뒤에 얻은 동결 림프절 절편들의 공초점 현미경 관찰은 VSV가 CD169/시알로아드헤신, 즉 대식세포 표시와 SCS에 함께 국소화되었다는 것을 보였다(도 11D). 유세포 분석기를 사용하여, 우리는 CD169를 림프절의 1% - 2% 정도의 단핵세포들에서 검출하였으며, 이것들은 균일하게 CD11b와 MHC-II를 공동으로 발현하였으며, VSV-결합 세포들이 확실히 대식세포라는 사실을 나타냈다(도 12). 또한, 대부분의 CD169+ 세포들은 CD68과 F4/80을 포함하는 다른 대식세포 마커들을 발현하였으며, 일부는 과립성백혈구/단핵구 마커 Gr-1을 발현하였다. CD169+ 세포들은 도한 CD11c를 발현하였지만, CD11chigh인 일반적인 수지상 세포보다는 낮은 정도로 발현하였다. 손상되지 않은 비리온들은 피하 증착 이후 수 분 내로 림프에 들어가며, 빠르고 선택적으로 배수 림프절의 수질과 SCS에 있는 대식세포들에 축적된다.
[00614] 바이러스 고정의 메커니즘을 알아보기 위해, 살아있는 VSV(2 x 108 pfu를 포함하는 20 ㎍)이 뒷발바닥들에 주사되었으며 배수 림프절에서의 바이러스 역가들이 2시간 이후에 측정되었다. C3 보체 결핍 마우스들의 배수 림프절에서 VSV 보존의 결함은 일어나지 않았다(도 11E). 분비된 면역글로불린들이 부족한 DH-LMP2a 마우스들은 비장에서 바이러스 역가의 감소가 일어났지만, 슬와림프절들에서는 일어나지 않았다(도 11F). 그러므로, 림프절에서의 VSV 고정은 비장 변연부 대식세포에 의해 사용된 것, 즉 혈액-매개 VSV를 포획하기 위해 C3와 자연산 항체들을 요구하는 것과는 다른 메커니즘을 통해 일어난다(Ochsenbein et al., 1999, J. Exp. Med., 190:1165; 그리고 Ochsenbein et al., 1999, Science, 286:2156; 둘 다 본 명세서에 참고로 포함된다). 생각할 수 있는 바로는, VSV 표면 당단백질(VSV-G)은 대식세포에 의해 발현된 탄수화물 결합 스캐빈저 수용체를 통해 인식될 수 있지만(Taylor et al., 2005, Ann. Rev. Immunol., 23:901; 본 명세서에 참고로 포함된다), 정확한 메커니즘은 추후 연구를 필요로 할 것이다.
[00615] 바이러스 산개와 항바이러스성 면역을 위해 대식세포에 의한 바이러스 포획이 가져오는 결과는 무엇일까? 이 문제를 다루기 위해, 우리는 클로드로네이트 리포솜들을 발바닥에 주사하여 림프절에 서식하고 있는 대식세포들을 고갈시켰다(CLL; Delemarre et al., 1990, J. Leukoc. Biol., 47:251; 본 명세서에 참고로 포함된다). 사용된 투여량에서, 피하주사된 CLL은 슬와림프절, 서혜부림프절 및 대동맥곁림프절들을 포함하는, 주사 장소를 배수하는 림프절들에 있는 대식세포들을 선택적으로 제거하였으며(Delemarre et al., 1990, J. Leukoc. Biol., 47:251; 본 명세서에 참고로 포함된다), 원위림프절들과 비장에 있는 대식세포들은 남았다(도 13 A, B). 각각 다른 림프절들에 존재하는 CD11b+ MHCII+ 식세포들 중에서, CLL은 CD169+ 부분집합을 우선적으로 제거하였으며, LYVE-1+ 세포들과 일반적인 수지상 세포들은 변화되지 않은 상태로 남았다. CLL 처리된 슬와림프절들은 처리 7일 후 증가된 B 세포 숫자들과 커진 소낭들을 가지고 있었지만, 예컨대, T/B 사이의 경계선 형성과 SCS 초미세구조와 같은 다른 형태학적 매개변수들은 변형되지 않은 채로 남았다(도 13 C-E).
[00616] 우리는 CLL 처리된 마우스들의 배수 림프절들로부터 처리되지 않은 림프절들과 비교했을 때, 대략 10 배정도 낮은 바이러스 역가들을 재발견했으며(도 11G), 이것은 대식세포 고갈이 림프 여과를 비효율적이 되도록 만들었다는 것을 제시한다. 실로, VSV 역가들은 CLL 처리된 마우스들의 혈액, 비장 및 비배수 림프절들에서 대단히 증가하였다. 주사 부위로부터 혈액으로 바이러스 산개는 림프 배수에 철저하게 의존했는데, 그 이유는 흉관에 폐색용 카테터를 지닌 마우스들의 발바닥에 바이러스가 주사되었을 때에는, 순환하는 VSV가 CLL 처리된 마우스들에서조차 검출되지 않았기 때문이다. 바이러스 역가들은 낮았지만, 처리되지 않은 마우스들의 흉관 림프액에서는 검출될 수 있었고, CLL 처리된 동물들에서는 유의하게 증가하였다(도 11H). 이것은 말초 조직들로부터의 초기 바이러스 산개에 관여하는 일차 전달자는 림프-매개 VSV의 전신 확산을 방지하는 림프절에서 발견되는, CLL-감수성 대식세포들에 의해 모니터링되는 림프라는 사실을 의미한다.
[00617] 이러한 포획 메커니즘은 VSV에만 고유하게 일어나는 것은 아니다; 또한, CD169+ SCS 대식세포들은 아데노바이러스(AdV; 도 14 A-C)와 백시니아 바이러스(VV, 도 14D)를 고정하였으며, 이것은 대식세포들이 구조적으로 다른 많은 병원체들에 대한 수호자로서 활동한다는 것을 의미한다. 이와 반대로, 바이러스 크기의 라텍스 비드들(200 nm)은 발바닥에 주사된 뒤에 SCS에 거의 고정되어 있지 않았다(도 14E). 따라서, SCS 대식세포들은 림프-매개 바이러스들과 다른 유사 크기의 입자들을 구분짓는다. 또한, 형광 VSV, AdV 및 VV는 배수 림프절의 수질에 축적되었으며, 이 곳에서 그들은 CD169low 세포들(도 11D) 뿐만 아니라 또한 CD169-LYVE-1+ 림프내피세포들에 의해 결합되었다(도 14C, D). 이것은 수질성 LYVE-1+ 세포들에만 VSV가 축적하는, CLL 처리된 림프절들에 의해 확증되었다(도 15).
[00618] 다음으로, 우리는 포획된 VSV가 어떻게 B 세포에 의해 인식되는지를 시험하였다. 슬와림프절들은 SCS 내강에 희귀한 B 세포들을 포함하지만(도 16A), 우리는 전자현미경에서 SCS를 관찰했을 때 바이러스에 결합하는 림프구들에 대한 증거를 찾을 수 없었다. 대신, 바이러스 입자들은 SCS 바닥면에 펼쳐져 있는 대식세포들에 의해 표층 소낭들 안에 있는 B 세포들에 제시되었다. VSV(도 17A) 또는 AdV(도 16B-E)의 주사 이후, 비리온들은 최소 4시간 동안 B 세포-대식세포 인터페이스에서 용이하게 검출될 수 있었다. 이것은 SCS 대식세포들이 B 세포들에 표시하기 위해 바이러스 입자들을 SCS 바닥면을 가로질러 수송한다는 것을 제시하였다. 세포투과의 가능성은 희박해 보였는데, 그 이유는 SCS 대식세포들 중 VSV를 포함하는 몇 개의 소낭들은 바이러스 분해의 증거를 보였기 때문이다. 또한, 최소한 대항량 투여 후 최초 6시간 동안, 우리는 MP-IVM에 의한 바이러스-결합 대식세포들의 운동성을 상당한 정도로는 검출할 수 없었다. 그러므로, 바이러스 입자들은 대식세포 표면을 따라 이동함으로써 림프절 실질 조직에 도달할 가능성이 가장 많았다. VSV 및 다른 항원들도 주변부로부터 이동하는 수지상 세포들에 의하여 B 세포에 제시되지만(Ludwig et al., 2000, Eur. J. Immunol., 30:185; and Qi et al., 2006, Science, 312: 1672; 양쪽 모두 본 명세서에 참고로 포함된다), 발바닥-유래 수지상 세포들은 이러한 매우 이른 이벤트 동안에는 역할을 할 것 같지 않는데, 그 이유는 이들이 슬와 림프절로 이동하는 것은 시간이 더 걸리기 때문이다. SCS 바닥면이 림프-매개 바이러스들에 대하여 극복 불가능(unsurmountable)한 것은 아니다; CD169+ 거대세포들은 문지기 및 바이러스 전이와 B 세포로의 제시의 촉진자로서 행동하는 것 같다.
[00619] 다음으로, 나이브 B 세포들이 바이러스 침입에 반응하는 방식이 Indiana(VSV-IND)와 New Jersey(VSV-NJ)라는 두 VSV 혈청형을 사용하여 탐구되었다(도 18; Roost et al., 1996, J. Immunol. Methods, 189:233; 본 명세서에 참고로 포함된다). 우리는 야생형 B 세포들을, VSV-NJ와 결합하지 않는 VSV-IND-특이적인 B 세포 수용체를 발현하는 VI10YEN 마우스들의 B 세포들과 비교하였다(Hangartner et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 100:12883; 본 명세서에 참고로 포함된다). 반대로, 야생형 B 세포의 적은 부분(2% - 5%)은 활성화되지 않고 양쪽 혈청형들과 결합하였다. 이것은 예컨대, 보체를 통한 것과 같은 간접적인 상호작용들 또는 VSV-G와의 저친화도 반응성을 반영할 수 있다(Rossbacher and Shlomchik, 2003, J. Exp. Med., 198:591; 본 명세서에 참고로 포함된다). 생체 내 반응을 평가하기 위해, 차별적으로 표지된 야생형과 VI10YEN B 세포들이 양자도입되어, 림프절 여포들에 돌아가도록 허용되었다. 형광 UV-비활성된 바이러스가 이후 발바닥에 주사되었으며 슬와 림프절들이 MP-IVM에 의해 5-35분 이후에 기록되었다. 무바이러스 림프절 내부 또는 VSV-NJ 주사 이후, VI10YEN과 대조군 B 세포들은 동일한 분포를 보였다(도 17B-C). 반대로, VSV-IND 주입 후 VI10YEN 세포들은 SCS 바닥면과 그 아래에 빠르게 축적되었다. B 세포 이동성의 한계치와 CLL-처리 및 비처리 림프절 사이의 분포에는 차이가 없었으며, 이것은 VSV-특이적 B 세포들은 SCS를 두 조건 모두에서 동일하게 탐침한다는 것을 제시한다. 그러나, CLL 처리된 림프절들에서, 형광 바이러스들은 SCS에 유지되지 않았으며 VI10YEN B 세포들은 그 영역에 모이지 않았으며, 이것은 SCS 대식세포들이 두 사건들 모두에 필수적이라는 것을 나타낸다(도 17B).
[00620] VI10YEN B 세포 분포를 엄밀하게 수량화하기 위해, 림프절들은 VSV 대항량 투여 30분 뒤에 수거되어 공초점 현미경에 의해 분석되었다. 전체 여포 VI10YEN 군집이 그 전체 분포를 유지하는 동안(도 17D), SCS 아래 있는 50 ㎛ 이하의 크기인 세포들의 부분집합은 VSV-IND에서 SCS를 향해 이동했지만, 림프절을 포함하는 VSV-NJ는 그렇지 않았다(도 17E). VI10YEN B 세포들이 화학유인물질 신호로 인해 SCS로 재분산되었을 가능성은 적었는데, 이것은 비반응성 다클론성 B 세포들이 동일한 화학유인물질 수용체를 발현하기 때문이다. 더욱이, 운동성 VI10YEN 세포들의 대식세포-결합된 VSV-IND 와의 랜덤 접촉들은 BCR-의존성 "멈춤 신호"를 트리거한다(Okada et al., 2005, PLoS Biol., 3:e150; 본 명세서에 참고로 포함된다): VSV-IND에 대한 단기 노출은 VI10YEN B 세포들에 있는 LFA-1 및/또는 알파4 인테그린들을 활성화시키며(Dang and Rock, 1991, J. Immunol., 146:3273; 본 명세서에 참고로 포함된다), SCS에서 발현되는 ICAM-1과 VCAM-1 리간드들에 각각 부착하게 된다(도 19). 또한, SCS 대식세포에 결합된 VSV-IND는 직접적으로 BCR을 통한 VI10YEN B 세포 부착에 기질을 제공할 수 있다.
[00621] 포획된 비리온들이 B 세포들에 의한 검출 이후 어떻게 처리되는 지를 알아보기 위해, 우리는 VI10YENxMHCII-EGFP 마우스들로부터의 B 세포들을 실험하였고, 이것은 우리로 하여금 B 세포 특이성부여의 표시로서 작용하는 세포 내로 흡수된 VSV와 엔도솜간 MHC-HH의 공-국재를 시각화할 수 있도록 한다(Vascotto et al., 2007, Curr., Opin., Immunol., 19:93; 본 명세서에 참고로 포함된다). 주사 한 지 30 분 이내로, 표층 세포의 VI10YENxMHCII-EGFP B 세포들은 VSV-IND를 광범위하게 내재화하였지만, VSV-NJ 입자들은 그렇지 않았다(도 20 A, B). 바이러스 매개 VSV-특이적인 B 세포들은 흔하게 존재하지는 않지만, 심층 소낭에서 검출가능하다. 이러한 세포들은 그 표면상에 VSV를 운반하는 희귀한 다클론성 B 세포들로부터 비리온들을 획득할 수 있거나 VSV-IND를 획득한 이후 SCS에서 정지하지 못하였던 VI10YEN 세포들에 대응될 수 있다.
[00622] 접촉한 비리온들이 우선적으로 검출되어 SCS와 표층 소낭에서 B 세포들에 의해 획득된다는 것을 우리의 조직학적 발견들이 입증하는 도중에, B 세포 이동성의 MP-IVM 측정은 보다 광범위한 항원 확산을 밝혀냈다. VSV-IND 주사 이후, VI10YEN 세포들은 B 여포 전체에서의 빠른 속도 감소를 보였다(도 21). 이것은 CLL 처리된 통제 림프절들에서도 동일하게 관찰되었으며, 이를 통해 바이러스 항원들이 대식세포와는 독립적으로 B 세포들에 도달하였다는 사실을 나타낸다. 이 항원성 물질은 자연적 감염의 필연적인 부산물인 자유 바이러스 단백질로 구성되었을 가능성이 가장 높다. 실로, 실험에서의 VSV 스톡의 정제된 상층액은 VI10YEN B 세포들에서 강한 칼슘 흐름을 유도하였다(도 18E). 작은 림프-매개 단백질들은 소낭들로 빠르게 확산되어 동족 B 세포들을 활성화시키는 것으로 알려져 있다(Pape et al., 2007, Immunity, 26:491; 본 명세서에 참고로 포함된다). 그에 따라, 바이러스 상층액의 주사는 소포 VI10YEN B 세포들을 SCS에서 축적되는 것을 유도하지 않은 채로 그들의 이동성을 억제하였으며, 이를 통해 자유 VSV-G가 바이러스 접종원 내부에서 활성화되었다는 것을 나타낸다. 이것은 VSV-IND 주사의 대식세포-독립적 범-여포성 효과를 설명할 수 있다.
[00623] 바이러스 접촉에 따른 VI10YEN B 세포 활성화의 역학을 결정하기 위해, 우리는 공통 활성화 마커들을 측정하였다(도 22). 공동활성 분자인 CD86은 첫째로 VSV-IND 대항량 투여 6시간 이후에 상향조절 되었다. CD69는 보다 빠르게 유도되었지만, 다면발현성 IFN-알파 신호전달로 추정되는 과정을 통해 다클론성 B 세포들에서도 유도되었다(Barchet et al., 2002, J. Exp. Med., 195:507; 및 Shiow et al., 2006, Nature, 440:540; 둘 다 본 명세서에 참고로 포함되었다). 표면 IgM(도 20 C,D)는 가장 이르면 대항량 투여 30분 이후에 하향조절되었으며, 70% 초과의 VI10YEN 세포들이 BCRlow / neg 인 경우 최대치를 2시간 이내로 도달하였다. 그러므로, BCR 내재화는 바이러스 특이적 B 세포 활성화에 대한 가장 초기의 특이적 판독을 제공하였다. 두드러지게, CLL 처리한 림프절의 VI10YEN B 세포들은 20 ㎍ VSV-IND를 피하 주사 후 최초 2시간 동안 그들의 BCR을 하향조절하는 데에 실패했으며(도 20E), 이는 SCS 대식세포들이 B 세포들에 포획한 비리온들의 효율적인 초기 제시를 위해 필수적이라는 것을 나타내고 있다.
[00624] 프라이밍된(primed) B 세포들은 궁극적으로 클래스 스위치 재조합과 배중심 형성을 위해 CD4+ T 세포들로부터 도움을 요청한다(Vascotto et al., 2007, Curr., Opin., Immunol., 19:93; 본 명세서에 참고로 포함된다). T 세포들을 접촉하기 위해, 새로 활성화된 B 세포들은 T/B 경계를 향해 이동한다(Okada et al., 2005, PLoS Biol., 3:e150; 및 Reif et al., Nature, 416:94; 둘 다 본 명세서에 참고로 포함된다). 이 메커니즘은 대식세포가 충분한 마우스들에서 효율적으로 작동하였다; 대부분의 VI10YEN B 세포들은 40 ng VSV-IND 만을 발바닥 주사한 후 6시간 이내에 T/B 경계로 재분포되었다(도 20F, H 및 23). 이와 반대로, CLL 처리된 마우스들에서는 VI10YEN B 세포들의 완전한 재분배를 도출하기 위해 100배 더 높은 바이러스 투여량이 필요하였다(도 20 G, H). 주사 12시간 이후쯤에는, 주사량에 상관없이 대부분의 VSV-특이적 세포들이 T-B 경계에 도달하였다. 따라서, SCS 대식세포 없이도, 여포 B 세포들은 VSV-유도된 항원에 의해, 약간 덜 효율적이긴 하지만 나중에는 활성화된다.
[00625] 결론으로, 우리는 림프절에 있는 CD169+ 대식세포에 대해 이중 역할을 설명한다: 그들은 림프-매개 바이러스들을 포획함으로써 그들의 전신 분산을 방지하며 그들은 효율적인 제시와 여포 B 세포들의 활성화를 위해 포획된 비리온들을 SCS 바닥면을 가로질러 인도한다.
예 2: 예시적인 지질 기반 백신 나노테크놀로지 구조들
리포솜 나노캐리어
[00626] 일부 실시예에서, 작은 리포솜들(10 nm -1000 nm)이 제조되어 하나 또는 복수의 면역조절제들을 면역 시스템의 세포들에 전달하기 위해 사용된다(도 3). 일반적으로, 리포솜들은 인공적으로 만들어진 구형의 지질 소낭이며, 수십에서 수천 나노미터까지 직경을 조절 가능한 그 특성은 각각의 리포솜들이 젭토리터(10-21 L)에서 펨토리터(10-15 L) 범위의 부피를 지니며, 단백질, 효소, DNA와 약물과 같은 다양한 수송물질들을 캡슐화하며 저장할 수 있는, 생체적합성 구획들을 포함한다는 사실을 나타낸다. 리포솜들은 양친매성, 즉 이중층의 안쪽과 바깥쪽 면은 친수성이며, 이중층 내강은 소수성인 지질 이중층을 포함할 수도 있다. 친유성 분자들은 그들 자신을 자발적으로 리포솜의 막에 임베드하여 그들의 친수성 도메인들을 바깥에 유지시킬 수 있으며, 막의 생체기능성을 활용하여 리포솜의 외부 표면에 친수성 분자들이 화학적으로 접합될 수 있다.
[00627] 특정 실시예에서, 지질들은 친유성 면역조절제와 혼합된 뒤, 고체 표면 위에 얇은 필름으로 형성된다. 친수성 면역조절제는 수용액에 용해된 뒤, 격렬한 교반를 통해 지질들을 가수분해하기 위해 지질 필름에 첨가된다. 친유성 면역조절제가 이중층 벽에 포함되어 있으며 친수성 면역조절제가 리포솜 내강 안에 있는 리포솜들은 자발적으로 조립된다.
나노입자로 안정화된 리포솜 나노캐리어
[00628] 일부 실시예에서, 나노입자로 안정화된 리포솜들이 하나 또는 복수의 면역조절제를 면역 시스템의 세포들로 전달하기 위해 사용된다(도 4). 전하를 띤 작은 나노입자들이 반대 전하 또는 전하가 없는 상태의 리포솜의 표면에 접근할 경우, 나노입자와 막 사이에서 일어나는 정전기적 또는 전하-쌍극자 상호작용은 나노입자로 하여금 부분적으로 지질막에 둘러싸여 있는 상태로 막 표면에 머물러있게 한다. 이것은 막의 국부적 구부러짐과 리포솜의 구형 표면 장력을 유도하는데, 이 둘은 막의 강도의 조정을 가능하게 한다. 이 측면은 바이러스의 특성인, 바이러스 막 내부에 존재하는 다른 생물학적 구성 요소들의 조성에 따라 강도가 의존하는 바이러스를 모방하는 리포솜을 백신 전달에 있어서 대단히 큰 의미를 지닌다. 더불어, 흡착된 나노입자들은 리포솜을 융합으로부터 보호하는, 전하를 띤 껍질을 형성함으로써 리포솜의 안정도를 향상시킨다. 특정 실시예에서, 작은 나노입자들은 약한 교반을 통해 리포솜과 혼합되며, 리포솜 표면에 자발적으로 달라붙게 된다.
리포솜- 폴리머 나노캐리어
[00629] 일부 실시예에서, 리포솜-폴리머 나노캐리어들이 하나 또는 복수의 면역조절제를 면역 시스템의 세포들로 전달하기 위해 사용된다(도 5). 리포솜 내부를 중공 상태로 유지하는 대신에, 친수성 면역조절제가 캡슐화될 수 있다. 도 3는 이중-블럭 공중합체 나노입자들로 채워진 리포솜들이, 리포솜과 폴리머 나노입자의 장점들을 가짐과 동시에 단점들 중 일부를 없애는, 리포솜으로 코팅된 폴리머 나노캐리어를 형성하는 것을 보여준다. 일부 실시예에서, 리포솜 껍질은 친유성 면역조절제를 운반하거나 친수성 면역조절제를 접합하는 데에 사용될 수 있으며, 폴리머 중심은 소수성 면역조절제를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 폴리머 나노입자의 표면에 리포솜의 융합을 유도하기 위해 약한 교반을 통해 미리 제조된 폴리머 나노입자들(40 nm - 1000 nm)이 작은 리포솜들(20 nm - 100 nm)와 혼합된다.
나노입자-안정화된 리포솜- 폴리머 나노캐리어
[00630] 일부 실시예에서, 나노입자로 안정화된 리포솜-폴리머 나노캐리어들이 하나 또는 복수의 면역조절제를 전달하기 위해 사용된다(도 6). 작은 나노입자들(1 nm - 30 nm)을 리포솜-폴리머 나노캐리어 표면에 흡착시킴으로써, 나노캐리어는 앞에서 언급한 나노입자로 안정화된 리포솜들(도 4)과 앞에서 언급한 리포솜-폴리머 나노입자들(도 5)의 장점들뿐만 아니라, 조정 가능한 막의 강도와 통제 가능한 리포솜 안정도 또한 가지게 된다.
역미셀을 포함하는 리포솜- 폴리머 나노캐리어
[00631] 일부 실시예에서, 역미셀을 포함하는 리포솜-폴리머 나노캐리어들이 하나 또는 복수의 면역조절제를 전달하기 위해 사용된다(도 7). 앞에서 언급한 리포솜-폴리머 나노캐리어들(도 5 및 6)은 폴리머 나노입자들 내부에 존재하는 소수성 면역조절제들만을 운반할 수 있으므로, 여기에서의 작은 역미셀들(1 nm -20 nm)은 친수성 면역조절제를 캡슐화하기 위해 제조된 뒤, 이중-블럭 공중합체들과 혼합되어 리포솜의 폴리머 중심을 제조한다.
[00632] 특정 실시예에서, 캡슐화되기 위한 친수성 면역조절제는 첫째로 휘발성이며 물과 혼화가 가능한 유기용매에서 자연적으로 유래되고 무독성의 양친매성 실재들과 혼합함으로써 역미셀들에 포함된다. 이로인해 생성된 생분해성 폴리머-역미셀 혼합물은 폴리머-불용성 친수성 비용매와 혼합되어 유기용매의 증발 및 용매의 비용매로의 빠른 확산을 통해 나노입자들을 형성한다. 폴리머 나노입자들을 포함했던 역미셀들은 앞에서 언급했던 리포솜-폴리머 복합체 구조를 형성하기 위해 지질 분자들과 혼합된다(도 5).
역미셀을 포함하는 나노입자로 안정화된 리포솜- 폴리머 나노캐리어들
[00633] 일부 실시예에서, 역미셀을 포함하는 나노입자로 안정화된 리포솜-폴리머 나노캐리어들이 하나 또는 복수의 면역조절제를 전달하기 위해 사용된다(도 8). 작은 나노입자들(1 nm - 30 nm)을 리포솜-폴리머 나노캐리어 표면에 흡착시킴으로써, 나노캐리어는 앞에서 언급한 나노입자로 안정화된 리포솜들(도 4)과 앞에서 언급한 역미셀을 포함했던 리포솜-폴리머 나노입자들(도 7) 모두의 장점들을 가질 뿐만 아니라, 조정 가능한 막의 강도와 통제 가능한 리포솜의 안정도를 갖게 된다.
지질 단일층에 의해 안정화된 폴리머 나노캐리어
[00634] 일부 실시예에서, 지질 단일층에 의해 안정화된 폴리머 나노캐리어들이 하나 또는 복수의 면역조절제를 전달하기 위해 사용된다(도 9). 앞에서 언급된 리포솜-폴리머 나노캐리어(도 5-8)들과 비교해봤을 때, 이 시스템은 작용제 및 제조 과정 모두가 단순성을 지닌다는 이점을 가진다. 일부 실시예에서, 소수성 호모폴리머는 소수성과 친수성 분절들 모두를 지닌, 도 5-8에서 사용된 이중-블럭 공중합체와 비교했을 때, 폴리머 중심을 형성할 수 있다. 지질에 의해 안정화된 폴리머 나노캐리어들은 폴리머 나노입자와 리포솜을 따로 제조한 뒤에 각각을 융합하는 것이 아닌, 한 단계 내로 형성될 수 있다.
[00635] 특정 실시예에서, 친수성 면역조절 분자는 첫째로 지질 머리기에 화학적으로 접합된다. 그 접합체는 하나 이상의 물과 혼화가 가능한 용매들을 포함하는 수용액에서 특정한 비율의 접합되지 않은 지질 분자들과 혼합된다. 생분해성 폴리머 물질이 물과 혼화가능하거나 부분적으로 물과 혼화가능한 유기용매에 캡슐화되기 위해 소수성 면역조절제와 혼합된다. 이로 인해 생성된 폴리머 용액은 접합지질과 비접합지질로 구성된 수용액에 첨가되어, 유기용매의 증발 및 유기 용매의 물로의 빠른 확산을 통해 나노입자들을 형성한다.
역미셀을 포함하는 지질 단일층에 의해 안정화된 폴리머 나노캐리어
[00636] 일부 실시예에서, 역미셀을 포함하는 지질 단일층에 의해 안정화된 폴리머 나노입자들이 하나 또는 복수의 면역조절제를 전달하기 위해 사용된다(도 10). 앞에서 언급된 지질에 의해 안정화된 폴리머 나노캐리어들(도 9)은 소수성 면역조절제를 운반하는 데에만 한정되어 있기 때문에, 여기에서, 작은 역미셀들(1 nm -20 nm)은 친수성 면역조절제를 캡슐화하기 위해 제조된 뒤, 생분해성 폴리머들과 혼합되어 폴리머 나노캐리어 중심을 형성한다.
예 3: 인간 IgG로부터의 Fc 절편을 사용한 SCS-Mph의 생체 내 표적화
[00637] 형광 비변형 대조군 나노입자들(위쪽 패널, 도 24A) 또는 Fc 표면-접합 표적된 나노입자들(중간과 아래쪽 패널, 도 24A)은 마취된 마우스들의 발바닥에 주사되었으며, 배수 슬와 림프절이 1시간 뒤에 절제되었고 유세포 분석기를 위해 단일 세포 현탁액이 제조되었다. 또한, 표적된 나노입자들은 클로드로네이트를 장착한 리포솜들의 주사에 의해 림프절 대식세포들이 고갈된 지 일주일 후에도 마우스들에게 주사되었다(아래쪽 패널, 도 24A). 게이트들의 세포 군집들은 CD11b의 높은 발현에 따른 나노입자-연관된 대식세포들로 확인되었다. 이러한 결과들은(i) 나노입자의 결합은 클로드로네이트-감수성 대식세포들의 존재에 의존한다는 것과 (ii) 표적된 나노입자들은 대조군 나노입자들에 비해 최대 두 배 정도의 대식세포들에 결합한다는 것을 나타낸다.
[00638] 도 24의 오른편에 있는 패널들은 청색 형광 대조군(위쪽 패널, 도 24A) 또는 표적된 나노입자들(중간과 아래쪽 패널, 도 24A)을 주사한 이후의 동결 림프절 절편들의 형광 현미경 사진을 보여준다. 절편들은 항-CD169와 수질 또는 B 세포들을 식별하는 마커로 대비염색 되었다. 나노입자를 주사한 지 한 시간 이후(위쪽, 도 24A), 대부분의 대조군 입자들은 수질에서 발견되었으며, 표적된 나노입자들은 B 세포 여포에 인접한 CD169+ SCS-Mph와 공-국재화 되었다(중간, 도 24A). 주사한 지 24시간 이후, 표적된 나노입자들의 개별적 세포-크기의 축적이 SCS와 수질 사이의 피질 부위에서 보였으며, 이는 이동된 수지상 세포들에 의한 흡수와 운반을 제시한다.
[00639] 마우스들은 적색 형광 B 세포들을 정맥 내에, 그리고 대조군과 Fc 표적된 나노입자들의 1:1 혼합물을 발바닥에 주사 받았다, 24시간 후, 유입된 B 세포들 중 일부가 B 세포 여포로 이동하였을 때, 배수 슬와 림프절이 절제되어 공초점 현미경과 녹색:청색 형광 비율의 양적 이미지 분석을 위해 절편화 되었다. 피막하동(SCS) 영역은 청색과 녹색 나노입자들을 비슷한 정도로 포함하였으며(오른편에 원형으로 둘러싼 세포들, 도 24B), SCS에서는 Fc-표적된 나노입자들과 연관된 녹색 형광이 두 배 정도 더 높았다. 또한, 흩어진 적색 B 세포들에 의해 표현된, B 여포들 내부에의 녹색 나노입자들의 현저한 축적도 있었다. 이 영역들은 대식세포들과 수지상 세포들이 풍부한 Fc 수용체들을 발현하는 것으로 알려진 것처럼, 특유의 크기, 모양 및 소포 수지상 세포들의 분포를 지닌다.
예 4: 항원을 포함하는 표적된 나노입자들은 높은 정도로 면역성을 가지며 높은 항체 역가를 유도한다.
[00640] 마우스들의 그룹들(5/그룹)은 각각 다음으로 면역화 되었다: UV-비활성된 수포상 구내염 바이러스(VSV, 혈청형 Indiana) 또는 VSV의 정제된 면역성 피막 당단백질(VSV-G). VSV-G는 백반과 혼합된 가용성 형태로, 또는(표면 고정된 인간 Fc와) 비-표적된 또는 표적된 PLGA 나노입자들과 접합되어 백반을 보조제로 첨가 또는 비첨가하여 제공되었다. 자유 VSV-G의 투여량은 나노입자와 전달된 VSV-G의 투여량보다 최대 열 배 정도 높을 것으로 추정되었다. 마우스들은 보강 주사를 일차 면역화된 지 55일 후에 받았으며, 10주 이후에 혈청을 획득하여 Vero 세포들에서 VSV-매개 용균반 형성의 중화 여부에 대해 시험하였다. 결과들은 적어도 50%만큼 용균반 형성을 차단한 가장 높은 혈청 희석도로서 역가들을 보여준다. 각 상징은 하나의 마우스에서의 중화 항-VSV 역가를 반영한다. Fc-표적된 나노입자들에 제시된 VSV-G로 면역화된 마우스 그룹은 임의의 다른 그룹들보다 유의미하게 높은 중화 항-VSV 역가를 생성하였다(이 그룹에서 가장 높은 역가를 보인 두 동물들은 가장 높은 희석도에서도 용균반 형성을 완전히 중화시켰으므로, 실제 역가들은 더 높을 수도 있다).
[00641] 나노입자(NP) 백신에 의해 도출된, 유도된 면역 반응은 VSV의 치사량으로부터의 강한 보호를 부여한다. 모든 백신 접종된 그룹들이 어느 정도의 보호를 보였지만, Fc-표적된 나노입자들에 접합된 VSV-G와 백반을 투여받은 그룹만이 치사량 감염으로부터 100% 보호를 보였다. 자유 VSV-G(VSV-G + 백반)의 수여자들은 나노입자들에 접합된 VSV-G를 받은 동물들보다 약 10배 정도의 항원들을 받았다. 음성 대조군으로, 한 그룹의 마우스들은 VSV-G를 제외한 Fc-표적된 나노입자들을(NP-Fc) 받았으며, 이 경우 보호를 부여하지 않았다.
예 5: 면역조절성 나노입자들에 의한 생체 내 T 세포 활성화
[00642] C57BL6J 마우스들에게 MHC 2형에서 제시된, 난백 알부민(OVA)에 특이적인 형질전환 TCR을 발현하는 CFSE-표지된 CD4 T 세포들을 OT-II 공여자 마우스들로부터 얻어 정맥내에 주사하였다. 이후, 면역화 실험들이 자유 OVA를, 또는 모델 항원으로서 동량의 OVA를 캡슐화한 PLA 또는 PLGA로 이루어진 나노입자들을 한쪽 발바닥에 주사함으로써 수행되었다. 또한, 모든 항원성 혼합물들은 CpG(TLR9 효현제)을 보조제로서 포함하였다. 동물들은 면역화 사흘 뒤에 주사되고 희생되었으며, OT-II T 세포 활성화는 유세포 분석기에 의해 다른 조직들로부터의 단일 세포 현탁액에서 측정되었다.
[00643] 비자극된 5,6-카르복실-숙신이미딜-플루오레세인-에스테르(CFSE)로 표지된 T 세포들은 분할되지 않으며, 그러므로 균일하게 높은 CFSE 농도를 운반함으로서 밝은 형광 세포들의 좁은 단일 피크라는 결과로 이어진다. 반대로, 활성화된 T 세포들은 분할하는 과정을 통해 두 딸세포들 사이에 형광 염료를 절반으로 나눔으로서, 각각의 계속적인 분할에 따라 형광 세기의 점차적인 감소라는 결과로 이어진다. 따라서, CFSE에서 왼쪽으로 이동하는 값이 클수록, T 세포가 활성되는 형광이 더 강하였다. 결과들은 다음을 나타낸다:(i) 나노입자로 캡슐화된 항원은 배수 슬와 림프절에 있는 자유 항원보다 보다 더 강한 CD4 T 세포 반응을 생성한다(popLN, 위쪽 줄);(ii) 자유 OVA가 아닌 오직 나노입자들만이, 국소 T 세포 증식을 팔의 림프절(중간 줄)과 비장(아래쪽 줄)을 포함하는 원위 림프 조직들에서 유도하였다. 자유 OVA의 수여자들에서, 팔의 림프절과 비장은 분할되지 않은 세포들 또는 매우 낮은 CFSE의 양을 가지는 세포들만을 포함하였다. 후자의 개체군은 국소 T 세포 활성화를 나타내지 않지만, 다른 곳에서 활성화된 T 세포들의 이동을 나타낸다.
[00644] OT-I 공여자 마우스로부터 얻은 CFSE로 표지된, MHC I형에 제시된 난백 알부민 특이적 형질전환 T 세포 수용체를 발현하는 CD8 T 세포들이 C57BL6J 마우스들에 정맥 내 주사되었다. 실험 프로토콜의 달리 바로 위에서 기술된 것과 동일하였다.
[00645] 위에서와 같은, OT-I 공여자 마우스들로부터 얻은 CFSE로 표지된 CD8 T 세포들이 C57BL6J 마우스들에 정맥 내 주사되었다. 그러나, 이 실험에서는 CL097, 즉 TLR-7과 TLR-8을 활성화시키는 이미다조퀴놀린 화합물이 보조제로서 사용되었으며 보조제 전달의 각기 다른 방법들이 시험되었다. 이 사례에서의 T 세포 활성화는 자유 OVA(1 ㎍ 또는 100 ng)를 자유 보조제(160 ng)와 혼합한 것을 발바닥에 주사한 지 사흘 이후에 배수 슬와 림프절에 있는 OT-I T 세포들의 총 숫자를 계수함으로써 평가되었다. 나노입자들을 받은 모든 동물들은 100 ng OVA 가 주어지거나 160 ng CL097이 주어지지 않았다. 나노입자들 내부에 캡슐화되었지만, PLA 폴리머에는 공유적으로 부착되지 않은 물질이 []에 나타나 있다. PLA에 대한 CL097의 공유결합은 하이픈 연결을 통해 식별되었다. 동일한 구획 내에서 자유 형태로 혼합된 물질들은 "+"에 의해 확인된다. 이러한 결과들은 보조제가 부형제에 공유결합되어 있으며 난백알부민이 캡슐화되어 있는 나노입자를 받은 동물들에서의 CD8 T 세포 증식의 주목할 만한 증가를 드러내 놓았다.
예 6. 나노입자들의 형성
[00646] PLA-PEG-COOH(DCM에 용해된 3 mg/ml)이 PLA-R848(DCM에 용해된 3 mg/ml) 또는 R848(DCM/DMSO(5%)에 용해된 15.7 mg/ml)과 혼합되었다. 500 ㎕의 PLA-PEG-COOH 용액을 500 ㎕ PLA-R848에 첨가하고, 격렬히 교반한 뒤, 500 ㎕의 OVA(물에 용해된 5 mg/ml) 또는 SIINFEKL 펩티드(2 mg/ml)를 첨가한 뒤, SINOMIX(초음파기 S-4000)을 이용하여 초음파 처리한 뒤(15 초, 50 진폭), 2 ml의 PVA 용액(물에 용해된 1% w/v)을 첨가하고, 초음파 처리한 뒤(15 초, 50 진폭) 용액을 40 ml 물에 첨가하였다. 2 시간 동안 교반하고, 물로 3회 세척하고 PBS로 1회 세척하였다. 캡슐화된 R848 제형을 위해, 500 ㎕의 PLA-PEG-COOH 용액을 400 ㎕ 자유 PLA(3.75 mg/ml) 및 100 ㎕ R848에 첨가하고, 격렬히 교반한 뒤, 500 ㎕의 OVA(물에 용해된 5 mg/ml) 또는 SIINFEKL 펩티드(2 mg/ml)를 첨가한 뒤, 초음파 처리한 뒤(15 초, 50 진폭) 용액을 40 ml 물에 첨가하였다. 2시간 동안 교반하고, 물로 3회 세척하고 PBS로 1회 세척하였다.
예 7. PLA-R848의 합성
[00647] 방법 1, 주석 에틸헥사노에이트 촉매
[00648] 응축기와 교반 막대가 장비된 2구 둥근 바닥 플라스크에 이미다조퀴놀린 레지퀴모드(R-848, 100 mg, 3.18 X 10-4 몰), D/L 락티드(5.6 gm, 3.89 X 10-2 몰) 및 무수황산나트륨(4.0 gm)이 첨가되었다. 플라스크와 내용물들은 50℃, 진공 조건에서 8시간 동안 건조되었다. 이후 플라스크는 아르곤으로 흘려보낸 뒤 톨루엔(100 mL)이 첨가되었다. 반응은 모든 락티드가 용해될 때까지 오일 수조 세트에서 교반되며 120℃로 가열되었고, 이후 피펫을 통해 주석 에틸헥사노에이트(75 mg, 60 ㎕)가 첨가되었다. 가열은 이후 아르곤 속에서 16시간 동안 계속되었다. 냉각 이후, 물(20 mL)이 첨가되고 교반이 30분 동안 계속되었다. 반응은 다른 톨루엔(200 mL)으로 희석된 뒤에 물(200 mL)로 세척되었다. 톨루엔 용액은 이후 5% 농축된 염산을 포함하는 10% 염화나트륨 용액(200 mL)으로 세척된 뒤에, 다시 포화된 중탄산나트륨(200 mL)으로 세척되었다. TLC(실리카, 염화메틸렌에 용해된 10% 메탄올)은 용액이 자유 R-848을 포함하고 있지 않다는 것을 보였다. 용액은 황산마그네슘을 통해 건조되었고, 여과된 뒤에 진공에서 증발되어 3.59 그램의 폴리락트산-R-848 접합체를 제공하였다. 폴리머의 일부가 염기에서 수화되었으며 R-848의 함량이 HPLC에 의해 조사되었다. R-848 농도 대 HPLC 반응의 표준 곡선과 대조를 통해, 폴리머는 폴리머 1 g당 4.51 mg의 R-848을 포함하는 것을 알게 되었다. 폴리머의 분자량은 GPC에 의해 약 19,000 정도인 것으로 측정되었다.
[00649] 방법 2, 리튬 디이소프로필아미드 촉매.
[00650] 이미다조퀴놀린(R-848), D/L 락티드와 연관된 유리기구 모두는 사용하기 이전에 50℃, 진공 조건에서 8시간 동안 건조되었다. 응축기와 교반 막대가 장비된 둥근 바닥 플라스크에 R-848(33 mg, 1.04 X 10-4 몰) 및 건조 톨루엔(5 ml)이 첨가되었다. 이것은 모든 R-848을 용해시키기 위해 환류 가열되었다. 용액은 질소 조건 하에서 교반되고 잘게 나뉘어진 R-848의 현탁액을 제공하기 위해 상온까지 냉각되었다. 이 현탁액에 상온에서 5분 동안 더 교반된 뒤에, 리튬 디이소프로필아미드(THF에서 2.0 M, 50uL, 1.0 x 10-4 몰) 용액이 첨가되었다. 형성된 옅은 노란색 용액이 주사기를 통해 질소 조건하에서 D/L 락티드(1.87 gm, 1.3 X 10-2 몰)의 뜨거운(120℃) 용액에 첨가되었다. 가열을 멈춘 뒤 옅은 노란색 용액은 한시간 동안 상온에서 교반되었다. 용액은 염화메틸렌(200 mL)으로 희석되었으며 이후 1% 염산(2 X 50 mL)으로 세척된 뒤에 다시 포화된 중탄산나트륨 용액(50 mL)으로 세척되었다. 용액은 황산마그네슘을 통해 건조되었고, 여과된 뒤에 진공에서 증발되어 폴리락트산-R-848 접합체를 제공하였다. TLC(실리카, 염화메틸렌에서 10% 메탄올)는 용액이 자유 R-848을 포함하고 있지 않다는 것을 보였다. 폴리머는 염화메틸렌(10mL)에 용해되었으며 교반된 헥산(200 mL)으로 적하되었다. 침전된 폴리머는 상층액 분리를 통해 분리되었으며 진공에서 건조되어 1.47 그램의 흰 고체 상태인 폴리락트산-R-848 접합체를 제공하였다. 폴리머의 일부가 염기에서 수화되었으며 R-848의 함량이 HPLC에 의해 조사되었다. R-848 농도 대 HPLC 반응의 표준 곡선과 대조를 통해, 폴리머는 폴리머 1 g 당 10.96 mg의 R-848을 포함하는 것을 알게 되었다.
Figure 112011035177379-pct00017
예 8. 캡슐화된 R848 형성: 캡슐화 및 방출
[00651] 500 ul의 PLA-PEG-COOH 용액(DCM에 용해된 3 mg/ml)을 500 ul PLA-R848에 첨가하고, 격렬히 교반을 한 뒤, 500 ul의 OVA 또는 SIINFEKL 펩티드를 첨가한 뒤, 초음파 처리한 뒤(15 초, 50 진폭), 2 ml의 PVA 용액(물에 용해된 1% w/v)을 첨가하고, 초음파 처리한 뒤(15 초, 50 W), 용액을 물 40 ml에 떨어뜨렸다. 2시간 동안 교반한 뒤, 물로 3회 세척하고 PBS로 1회 세척하였다. PLAR848의 EE%는 100%로 가정되었으며, 로딩은 최대 5~10%로 예상되었다. 로딩은 나노입자를 형성하기 위해 PLA-PEG-COOH와 혼합된 PLA-R848의 양에 의해 조절되었다. HPLC 실험은 역상 C18 칼럼(Supelco)에서 1 mL/분의 이동상 속도를 사용하여 수행되었다. 이동상은 0.1% TFA/물 및 0.1% TFA/ACN/물(60:40)로 구성된다. 검출 파장은 320 nm이다. 주사 부피는 100 uL이다.
[00652] 1.57 mg의 자유 R848(5% DMSO/DCM에 용해됨, 15.7 mg/ml)이 PLA-PEG-COOH/PLAR848(1:1, DCM에서 총 3 mg/mL, 1 mL)와 혼합된 뒤, 이중 에멀젼 기법을 사용해 나노-침전 되었다. 최종 NP[R848] 용액은 1.0 mL이며, 평균 NP 크기는 약 250 nm이다. 자유 R848의 캡슐화 효율도(EE%)는 3.54%이며, 로딩(loading)은 1.85 wt% 이다.
[00653] R848 방출 실험은 2L PBS 완충액에서 37℃ 조건으로 수행되었다. 0.5 mL NP 용액(1 mg/ml)은 PBS 용액에 침지된 소형 투석 카세트(3500 Da)에 첨가되었다. 각 시간점에서, 500 ㎕의 표본들이 재추출되었고(3회 반복) 분석을 위해 HPLC 주사 되기 전에 용액 100 ㎕가 아세토나이트릴 100 ㎕과 혼합되었다.
[00654] 방출된 R848의 농도/양을 측정하기 위한 HPLC 실험이 역상 C18 칼럼(Supelco)에서 1 mL/분의 이동상 속도를 사용하여 수행되었다. 이동상은 0.1% TFA/물 및 0.1% TFA/ACN/물(60:40)로 구성된다. 검출 파장은 320 nm이다. 주사 부피는 100 ㎕이다.
[00655] 도 32에 데이터가 도시되어 있다.
예 9: SIINFEKL 제형: 캡슐화 및 방출
[00656] SIINFEKL은 마우스 MHC I형(H2k-b)에 결합하고 형질전환 OT-I T 세포들에 의해 인식되는 난백 알부민(OVA)으로부터 유도된 면역성 펩티드이다. 500 uL의 2 mg/mL SIINFEKL이 1mL PLA-PEG-COOH/PLAR848 용액(1:1, DCM에서 총 3 mg/mL) 내부에 이중 에멀젼 기법을 사용해 캡슐화되었다. 최종 NPR848[SIINFEKL] 용액은 1.5 mL이다. 평균 NP 크기는 약 220 nm이다. SIINFEKL의 캡슐화 효율도(EE%)는 1.32%이며, 로딩은 0.44 wt% 이다.
[00657] SIINFEKL 방출 실험은 1 1mL PBS 완충제에서 37℃ 조건으로 수행되었다. 0.5 mL NP 용액은 PBS 용액에 침지된 소형 투석 카세트(3500 Da)에 첨가되었다. 각 시간점에서, 2 mL PBS가 추출되었고 2 mL의 신선한 PBS가 대체되었다. 표본들은 동결건조되었고 HPLC 분석을 위해 150 uL 탈이온수에 용해되었다.
[00658] 방출된 SIINFEKL의 양을 측정하기 위한 HPLC 실험이 역상 C18 칼럼(Supelco)에서 1 mL/분의 속도를 사용하여 수행되었다. 이동상은 0.1% TFA/물 및 0.1% TFA/ACN/물(60:40)를 포함한다; 시간 구배는 0 - 16분일 때, 100% -> 40% TFA/물 및 16-38분일 때 40% -> 0% TFA/물. 검출 파장은 21 5nm이다. 주사 부피는 100 uL이다. 각 시간점에서, SIINFEKL 방출은 3개의 병렬적 표본으로부터 수량화되어 평균값을 구하였다.
[00659] SIINFEKL 방출에 대한 데이터가 도 29C에 도시되어 있다.
예 10: 캡슐화된 OVA 제형: 캡슐화 및 방출
[00660] OVA 방출 실험은 10 mL PBS 완충제에서, 37℃ 조건으로 수행되었다. 3 mg NP 용액과 캡슐화된 OVA(3회 반복)은 10ml PBS 용액에 침지되었다. 각 시간점에서, 0.5 ml의 용액이 수거되었고, 원심분리되었으며(8 분, 13 rpm), 상층액이 수거되었으며 나노입자들을 BCA 수량화를 위해 원심분리하였다.
[00661] 방법 1: OVA 수량화를 위한 BCA 분석의 사용. NP-OVA를 BCA 완충 용액에서 60℃ 조건으로 30분 동안 직접 배양.
[00662] 결과들:
[00663] 1.0% PVA: 1.09 mg/mL; EE% 21.8%; 로딩 36.3 wt%
[00664] 1.5% PVA: 1.18 mg/mL; EE% 23.6%; 로딩 39.3 wt%
[00665] 2.0% PVA: 1.39 mg/mL; EE% 27.8%; 로딩 46.3 wt%
[00666] 방법 2: OVA 수량화를 위한 단백질 겔 전기영동의 사용
[00667] NP-OVA를 로딩 완충제에서 95℃ 조건으로 5분 동안 직접 배양. Bio-Rad 준비된 겔들(10% PAGE)이 사용되었으며, 200V 조건에서 30분 동안 수행되었다.
[00668] 결과들:
[00669] 1.0% PVA: 약 0.6 mg/mL; EE% 12%; 로딩 약 20 wt%
[00670] 겔 전기영동의 데이터는 NP-OVA 조성물에서 OVA의 분해/변성이 일부 일어날 수 있지만, OVA는 크게 변화가 없이 남아있다는 것을 나타내었다.
[00671] OVA의 생체 내 전달 및 처리.
[00672] DQ-OVA는 OVA가 단백질 분해를 통해 항원 제시 세포(대부분 수지상 세포)에 의해 처리되기 이전에는 비형광으로 남아있는 형광 염료와 접합되어 있는 OVA로 구성된다. NP-캡슐화된 OVA의 투여 이후 마우스 림프절의 분석은 피하 주사 이후 배수 림프절들에서 수지상 세포들에 의해 NP-캡슐화된 OVA가 처리되고, 운반되며 제시된다.
예 11. 생체 내 CD8 T 세포 활성화
[00673] OVA 항원과 CL097 보조제를 포함하는 나노입자들이 제조되어 본 명세서에 기술된 절차들에 따라 생체 내에서 시험되었다. 다음 여섯 조성물들이 제조되었다:(1) 자유 OVA; (2) 자유 OVA 및 자유 CL097; (3) NP[OVA](즉, 캡슐화된 OVA를 포함하는 나노입자들); (4) NP[OVA + CL097](즉, 캡슐화된 OVA 및 캡슐화된 CL097을 포함하는 나노입자들); (5) NP-CL097[OVA](즉, CL097에 접합되며 캡슐화된 OVA를 포함하는 나노입자들); 및 OVA + NP-CL097(즉, 자유 OVA 및 CL097에 접합된 나노입자들). 림프절(LN) T 세포 숫자의 데이터가 도 33에 도시되어 있다.
[00674] 도 34는 다음 조성물들의 투여 하루 이후에 마우스 림프절에서 관찰된 OT-I 세포 계수들을 제공한다:(1) 자유 SIINFEKL; (2) 자유 SIINFEKL 및 자유 R848; (3) 나노입자들 내부에 캡슐화된 SIINFEKL; 및 (4) R848에 접합된 나노입자들 내부에 캡슐화된 SIINFEKL. 데이터는 SINFEKL-캡슐화 및 R848 접합된 나노입자들이 최고 OT-1 세포 계수를 획득하였다는 것을 도시한다. 세포 계수는 하루 이후에만 측정되었다; 조성물 (1),(2) 및 (3)의 OT-I 세포 계수는 하루 이후에 측정될 경우 관찰된 값보다 더 낮을 것으로 예상되지만, 조성물(4)의 OT-I 세포 계수는 하루 이후에 측정되어도 관찰된 값과 비슷할 것으로 예상된다.
예 12. 나노입자 표적화
[00675] I. 리간드들을 포함하는 리포솜에 의한 피막하동 대식세포(SCS-Mph) 표적화
[00676] 리포솜 제조 및 특성 분석. 작은 단층 리포솜들이 소낭 분출 방법에 의해 제조되었다. 클로로포름에 용해되어 있는 지질들은 질소의 흐름 하에서 건조되고, 이후 3시간 동안의 진공 건조를 통해 건조되었다. 다음으로, 지질들은 PBS 버퍼에서 재수화되었다. 5번의 동결-해동 사이클 이후에, 리포솜들은 100-nm 소낭들을 포함하는 폴리카르보네이트 필터(Whatman)을 통해 20회 분출되었다. 이 방법에 의해 제조된 리포솜들은 입도분석기(Brookhaven Instruments)를 사용하여 동적광산란법을 통해 특성이 분석되었다.
[00677] SCS - Mph 표적화를 위해 시험된 리포솜들. (1) 리포솜들의 일부 표본들이 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 모노시알로갱글리오시드 GM3 및 N-4-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸 포스파티딜에탄올아민(NBD-PE)을 포함하는 상태로 제조되었다. 표본들의 GM3 밀도들은 약 10 내지 약 30 몰%까지 다양하였다. 지질 농도는 약 1 mg/mL 정도이며, 평균 리포솜 크기는 약 110 nm이다. 표적화 데이터는 더 높은 GM3 밀도가 더욱 정확한 표적화로 이어질 수 있다는 것을 보였다. 구체적으로, 데이터는 피하 주사 한 시간 이후 배수 림프절에 있는 SCS Mph들에서 리포솜들의 축적이 일어나는 것을 보였다. (2) POPC 및 NBD-PE만을 포함하는 리포솜들 또한 대조군으로서 제조되었다. 시험된 조건들 하에서는 표적화가 일어나지 않았다. 지질 농도외 리포솜 크기는 (1)과 유사하다.
[00678] II. 리간드들을 포함하는 폴리머 나노입자에 의한 SCS-Mph 표적화
[00679] 1. 나노입자(NP) 제조 및 특성 분석. NP들은 나노-침전 방법에 의해 제조되었다. 100 uL 폴리머(아세토니트릴에 용해된 PLA-PEG-COOH 5 mg/mL)는 500 uL 탈이온수에 한 방울씩 첨가되었다. 용액은 400 rpm에서 2시간 동안 교반 되었으며 Amicon 튜브들(100 KDa)을 사용하여 탈이온수로 2회 및 PBS로 1회 세척되었다. NP 용액의 최종 농도는 약 1 mg/mL이었다. 평균 입자 크기(약 74 nm)는 입도분석기(Brookhaven Instruments)를 사용하여 동적광산란법을 통해 측정되었다.
[00680] 2. 리간드 접합. 리소자임, 단백질 G, 항-CD169 및 시알릴락토스를 포함하는 리간드들은 EDC/NHS 반응을 통해 NP의 표면에 접합되었다. 폴리머 나노침전 후, NP 용액은 탈이온수로 2회 세척되었다. 표면의 카르복실산기들은 이후 EDC/NHS 용액(15 mg/mL)으로 1시간 동안 배양하여 활성화되었다. NP 용액은 이후 리간드 용액과 2시간 동안 혼합되었으며(폴리머 대 리간드의 몰비는 단백질들에 대해 1:1이며 시알릴락토스에 대해 1:2이다), PBS 완충제로 3회 세척되었다. PLA-PEG-OCH3 표적화 실험에서, NP는 (1)에서 기술된 것과 동일한 절차로 제조되었다. NP 이미지 촬영을 위해, 10% PLA-Alexa Fluor 647이 PLA-PEG 폴리머와 나노침전 실험에서 혼합되었다.
[00681] 결론: 공초점 형광 이미지들은 NP-OCH3 및 NP-항CD169가 SCS-Mph에 결합할 수 있다는 것과, SCS에서의 NP-시알릴락토스의 약한 축적을 보였다. 실험적 조건의 특정 집합에서, NP-리소좀과 NP-단백질 G의 SCS-Mph에 대한 결합은 관찰되지 않았다.
[00682] III. 리간드들을 포함하는 폴리스티렌 비드들에 의한 SCS-Mph 표적화
[00683] 1. 폴리스티렌 비드들 및 리간드 접합. NeutrAvidin으로 표지된 비드들(FluoSpheres, 0.01g/mL)은 Invitrogen으로부터 구입되었다. 평균 크기는 약 200 nm 이다. 비오틴이 부착된 항-CD169 및 비오틴이 부착된 올리고머 G(12 량체)들을 포함하는 리간드들이 NeutrAvidin으로 표지된 비드들에 2시간 동안의 배양을 통해 연결되었다.
[00684] 2. 결과들. 항-CD169 및 올리고머 G로 접합된 비드들 모두가 SCS-Mph들에 축적되었다.
예 13. T-세포 발현
[00685] 다양한 자유 보조제들(즉, 나노입자들과 연관되지 않은)을 포함하는 다양한 농도의 용액들이 제조되었다. 보조제들은 CL097, 이미퀴모드, LPS, R848 및 R854였다. 그러한 보조제들의 수지상 세포들의 활성화를 유도하는 능력들을 측정하기 위해, 수지상 세포들은 각각 다른 보조제 용액들의 존재 하에 하룻밤동안 배양되었다. 활성화 마커들(CD40, CD80 및 CD86)의 표면 발현이 측정되었다. 데이터가 도 35a에 도시되어 있으며, 결과들은 처리되지 않은 수지상 세포들에 연관되어 유도된 배수로서 표현된다. 동일한 실험적 절차를 사용하여, 보통의 나노입자들(즉, 비-기능화 또는 면역자극 모이어티 또는 면역조절 모이어티와 연관됨)의 활성도가 시험되었으며 NP들 자체는 DC 활성화를 유도하지 않는다는 것을 보이기 위해 LPS와 비교되었다. 데이터는 도 35b에 도시되어 있다. 다시 동일한 실험적 절차를 사용하여, 보통 NP들, 캡슐화된 R848을 포함하는 NP들(NP[R848]), 접합된 R848을 포함하는 NP들(NP-R848) 및 DC 활성을 유도하는 자유 LPS들의 활성들이 비교되었다. 데이터는 도 35c에 도시되어 있다.
[00686] 도 36은 T 세포 증식을 도시하는 FACS 데이터를 제공한다. 나이브 T 세포들은 세포질성 염색제인 CFSE로 표지되었다. 세포가 분열할 때, 염색제는 딸세포들 사이에서 분열되어, 그 딸세포들이 각각 절반씩 형광을 띠도록 한다. 만약 이 세포들이 더 분열을 하면, 그들은 4분의 1만큼 형광을 띠고, 그와 같은 양상을 계속 보인다. 이러한 방식으로 피크들은 세포 분열의 횟수를 나타낸다. 다음의 제형들은 시험되었다: 자유 SIINFEKL; 자유 SIINFEKL 및 자유 R848; 캡슐화된 SIINFEKL을 포함하는 NP(NP[SIINFEKL]); 및 접합된 R848 및 캡슐화된 SIINFEKL를 포함하는 NP(NP-R848[SIINFEKL]).
예 14. 접합체 형성
[00687] 코티닌-PEG-코티닌 접합체들이 이중 말단-기능화된 PEG들을 사용하여 다음의 반응식에 따라 형성되었다:
Figure 112011035177379-pct00018
코티닌-PEG-코티닌의 리튬알루미늄하이드라이드를 사용한 환원은 HO-PEG-니코틴의 형성을 허용하였다:
Figure 112011035177379-pct00019
[00688] 유사하게도, 니코틴에 접합된 PLA와 PEG의 공중합체들이 HO-PEG-니코틴을 개환 중합반응의 개시인자로 사용하여 다음의 반응에 따라 제조되었다:
Figure 112011035177379-pct00020
[00689] 니코틴-NP가 50% PLA-PEG-니코틴과 50% PLA를 사용하여 제조된 뒤에 피하(sc) 주사를 통해 마우스들에 투여되었다. 피하 주사된 지 1시간 후에 배수 림프절들이 수거되었으며, 절편들은 B 세포들을 표지하기 위해 APC-B220(회색), 이후 항-니코틴 Ab(클론 HB-9123)을 표지하기 위해 Alexa568-항-마우스 IgG(적색)으로 염색되었다. 형광 데이터는 니코틴-NP가 배수 림프절의 SCS에서 피하 주사된 지 1시간 후에 축적된다는 것을 보여준다.
예 15. 면역화된 마우스들에서의 항-니코틴 IgG
[00690] 실험들의 제 1 시리즈에서, C57BL6 마우스들의 그룹들(4-5)은 니코틴 면역나노치료제 조성물들로 0일에 면역화 되었고, 2, 4, 8주 뒤에 보강면역 되었다. Ab 역가는 ELISA에 의해 측정되었으며 항-니코틴 MAb의 표준 곡선과 대조되어 농도를 계산하였다. 한 마우스 그룹은 T 세포의 도움을 보강하기 위해 OVA-특이적 OT-II T 세포들(5x105 IV)을 백신 접종 이전에 받았다. 데이터는 도 36에 도시되어 있다. 곡선들은 면역화 제형에 의해 확인된다. 예를 들면, "니코틴+R848+OVA"로 표지된 데이터는 마우스들이 자유 니코틴, 자유 R848 및 자유 OVA를 포함하는 제형으로 면역화되었다는 것을 나타낸다. "PLA-니코틴[OVA]"로 표지된 데이터는 마우스들이 캡슐화된 OVA를 지닌 PLA-니코틴 나노입자들을 포함하는 제형으로 면역화되었다는 것을 나타낸다.
[00691] 실험들의 제 2 시리즈에서, 다른 니코틴 역가들이 측정되어 도 37에 도시되어 있다. 다른 자료는 초기(3주) 역가를 도시한다. 투여량과 주사의 시기와 연관된 프로토콜은 제 1 시리즈와 동일하였다. 그러나, 일부 새로운 입자 제형들이 다음과 같은 항목들을 평가하기 위해 시험되었다: a)(50% 니코틴-PEG-PLA를 포함하는) 기존에 동결된 나노입자들이 그들의 면역성을 유지했는지의 여부; b) 니코틴-PEG-PLA의 함량이 항체 역가들에 어떻게 영향을 미쳤는지의 여부; 및 c)(50% 니코틴-PEG-PLA) 나노입자들이 MHC II형 결손 마우스들에서 어떻게 작용하는지의 여부. 제형들은 다음과 같다:(1) 제조된 상태로(즉, 동결되지 않고) 사용된, 50% 니코틴-PEG-PLA와 50% PLA-R848 및 캡슐화된 OVA를 포함하는 NP;(2) 하룻밤 동안 동결된 뒤에 해동되어 사용된, 50% 니코틴-PEG-PLA와 50% PLA-R848 및 캡슐화된 OVA를 포함하는 NP;(3) 5% 니코틴-PEG-PLA와 45% PLA-PEG 및 50% PLA-R848을 포함하는 NP;(4) 25% 니코틴-PEG-PLA와 25% PLA-PEG 및 50% PLA-R848을 포함하는 NP;(5) R848 투여량을 동일하게 유지하기 위해 일반에 비해 투여량을 두 배로 한, 75% 니코틴-PEG-PLA와 25% PLA-R848을 포함하는 NP;(6) 자유 R848이 주사 직전에 조제에 혼합된, 50% 니코틴-PEG-PLA와 50% PLA 및 캡슐화된 OVA를 포함하는 NP;(7) 마우스가 OVA-특이적 OT-II T 세포들을 백신 접종 이전에 받은, 50% 니코틴-PEG-PLA 나노입자들과 50% PLA-R848 및 캡슐화된 OVA를 포함하는 NP; (8) 50% 니코틴-PEG-PLA와 50% PLA-R848 및 캡슐화된 OVA를 포함하는 NP, MHC II형 결핍 마우스;(9) 50% 니코틴-PEG-PLA와 50% PLA 및 캡슐화된 OVA를 포함하는 NP, MHC II형 결핍 마우스. ELISA 감수성의 차이점으로 인해, 이 시리즈의 역가의 절대적 강도는 제 1 시리즈의 자료에 직접 비교될 수 없다. 다음의 결론들이 도달되었다: a) 기존에 동결되었다가 해동된 NP들은 여전히 면역성이었다; b) 초기 항체 역가는(R848-PLA는 항상 동일한 50% 양을 사용함) 5% 내지 50% 범위의 니코틴-PEG-PLA의 NP들을 받은 마우스들에서는 비슷하게 나타났지만, 75% 니코틴-PEG-PLA가 사용된 경우에는 더 낮았다; c) MHC-II 결핍 마우스들에서 니코틴-NP들에 대한 체액성 반응이 유도되었으며, 이를 통해 T-독립적 IgG 반응의 유도 능력을 나타냈다.
[00692] 도 36과 37에 있는 데이터는 자유 니코틴(즉, 접합되지 않음)이 PLA-R848, R848 및/또는 OVA가 투여되었을 때조차, 니코틴 항체들의 생성을 도출하지 않는다는 것을 도시한다. 그러나, 니코틴 나노입자들은 그러한 생성을 도출한다. T 세포 도움의 부재 시에도, 본 명세서에 기술된 니코틴 나노입자들은 상당한 항체 생성을 유발한다.
[00693] 요약하자면, 도 36에서 도시된 데이터는 니코틴을 포함하는 면역특징 표면과 같은 면역특징 표면을 포함하는 합성된 나노캐리어들은 보조제와 단백질-기반 항원들을 APC에 효율적으로 전달함으로서, 강한 T 도움 세포 활성화로 이어진다. 이것은 R848과 OVA 모두를 포함하는 PLA-PEG-니코틴 합성 나노캐리어들로 진행한 면역화에서, 항-니코틴 IgG 역가가 나이브 OT-II(즉, OVA-특이적) T 도움 세포들을 받은 마우스들에서 OT-II 세포들을 받지 않은 마우스들보다 최대 10배 정도 증가하였다는 사실에 의해 입증된다. 이 효과는 면역특성-수정된 합성 나노캐리어들에 포함된 보조제(R848)와 T 세포 항원(OVA)들이 OVA를 T 세포들에 제시하는 수지상 세포들에 효율적으로 표적화 되었다는 것을 나타낸다. OVA-특이적 T 세포들의 OT-II 세포들을 받은 동물에서의 더욱 큰 이용 가능성은 B 세포들에 의한 항-니코틴 항체들의 생산을 보강시킨, 증가된 도움 반응으로 이어졌다. 따라서, 위의 기준에 따라 면역특징 표면을 형성할 수 있는 모이어티는 합성 나노캐리어 면역성을, 그 나노캐리어의 APC에 대한 결합 친화도가 시험관 내 포획 검사에 의해 발견되기에 너무 낮아 검출될 수 없을 경우에조차도 보강시킬 수 있다.
예 16. 림프절 APC에 대한 생체 내 나노입자 표적화
[00694] 니코틴-변형되고 대조군(PLA-PEG) 나노입자들의 림프절 APC에서의 생체 내 축적. 형광 나노입자들(약 100 nm)이 이중 에멀젼 기법을 사용하여 형성되었다. 니코틴 입자들은 50% PLA-PEG-Nic(약 15 kD PLA), 15% PLGA-Dye-PLGA(총 약 15 kD PLGA) 및 35% PLA(약 15 kD)를 포함하였으며, 대조군 입자들은 50% PLA-PEG(최대 15kD PLA, PEG는 메톡시 제거됨), 15% PLGA-Dye-PLGA(총 약 15 kD PLGA) 및 35% PLA(약 15kD)를 사용하여 형성되었다. 수지상 세포에 대한 표적화를 평가하기 위해, 캡슐화된 OVA 단백질(OVA)을 사용한, 그리고 사용하지 않은 두 집합의 대조군 입자들이 형성되었다. 모든 입자 집합들은 PLGA-로다민-B(=PLGA-염색제)를 녹색(543 nm) 형광 표지로 포함하기 위해 생성되었다. 또한, 대조군 입자들(OVA 없이) 또한 분광학적으로 독특한(적색) 형광 방출을 가지는 Alexa 647을 포함하기 위해 생성되었다. 모든 녹색 입자들은 동량의 적색 대조군 입자들과 혼합되었으며, 혼합물은 어린 성인 C57/BL6 마우스들의 발바닥에 주입되었다. 배수 슬와 림프절은 4시간 또는 24시간 이후에 검출되었으며, 4℃에서 인산으로 버퍼된 L-리신과 1% 파라포름알데히드/페리오데이트로 하룻밤동안 고정되어, PBS에서 10%, 20% 그리고 30%의 설탕을 순차적으로 사용하여 동결보호된 뒤, 조직 동결 배지(Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC)에서 급속 동결되어 동결 절편의 면역형광분석을 위해 준비되었다. APC에 대한 표적화는 Adobe Photoshop CS3을 사용하여 디지털 공초점 현미경 이미지의 면적 측정에 의해 결정되었다. 자료들이 도 38a와 38b에 제공되었다.
[00695] 도 38a에서, 4시간 샘플들이 피막하동 대식세포에서의 축적을 SCS에 지정된 흥미영역(F-scs)과 전체 림프절 절편에서의 녹색(실험군)과 적색(대조군) 형광 픽셀들의 총 숫자(F-total)를 수량화함으로써 평가하기 위해 사용되었다. "상대적 축적" 이 F-scs/F-total x 100%를 계산함으로서 주어진다. 자료에서 보인 것처럼, 니코틴을 포함하는 샘플("니코틴 4h")은 대조군("PLA-PEG 4h")와 비교했을 때 유의미하게 더 큰 상대적 축적값을 제공하였다.
[00696] 도 38b에서, CD11c 공국재화 분석이 24시간 샘플에서 수지상 세포들에 대한 표적화를 평가하기 위해 진행되었다. T 세포 영역에 있는 DC들이 청색 형광 항-CD11c로 염색됨을 통해 식별되어 흥미영역으로 정의되었다. 흥미영역에서 공국재화된 녹색과 적색 픽셀들이 측정되었으며 비율로서 표현되었다. 적색과 녹색 형광 대조군 입자들과 마찬가지로, 캡슐화된 OVA를 포함하는 입자들은 수지상 세포에서 비슷한 축적을 보였으며, 반면에 니코틴을 포함하는 면역특징 표면은 APC에 대한 통계적으로 유의미한 표적화를 제공하였다.
[00697] 요약하자면, 본 명세서에 나타난 자료들은 합성 나노캐리어들이 본 명세서의 다른 곳에서 정의된 면역특징 표면들을 포함할 수 있도록 제작될 수 있다는 증거를 제공한다. 피막하동 대식세포들과 수지상 세포들에 대한 합성 나노캐리어의 면역특징 표면에 의해 유도된 표적화들에 대한 증거는 마우스들의 발바닥에 형광 합성 나노캐리어들을 주사한 뒤에, 위에서 기술된 것과 같이 합성 나노캐리어의 분포와, 배수 림프절에서의 전문적 항원표시세포와의 연관을 통해 설명되었다.
예 17. 수지상 세포 결합의 시험관 내 비교
[00698] 각기 다른 밀도로 고정된 항-CD11c 또는 니코틴으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트 위에서의 마우스 수지상 세포의 시험관 내 축적이 면역특징 표면들의 성질들의 확장적인 증거들을 제공하기 위해 사용되었다. 자료들은 도 39a와 39b에 보여진다.
[00699] 도 39a에서, MAXISORP NUNC-IMMUNO 96 MICROWELL 플레이트들(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)이 정제된 햄스터 항-마우스 CD11c 항체(Clone HL3, Bd Biosciences, San Jose, CA)로, 제시된 농도에서 인산염-완충 식염수 조건에서 37℃로 1시간 동안 코팅되었다. 플레이트들은 이후 PBS에서 3번 세척되었다. 수지상 세포들은 양성 면역자기성 세포 선별(약 98% Cd11c+; Miltenyi Biotec)을 통해 정제되었다. 수지상 세포들은 10%(vol/vol) 소태아혈청(FCS; Invitrogen, Carlsbad, CA)가 포함된 RPMI(Mediatech Inc., Manassas, VA)에서 5 mM CFSE로 7분동안 25℃ 조건으로 배양되었고, 세척된 뒤에 제시된 농도에서 각 웰들에 첨가되었다. 플레이트들은 60 rpm으로 혼합기에서 15분 동안 37℃ 조건으로 배양되었다. 플레이트들은 PBS에 담그는 방법으로 2번 세척되었고, 4% 파라포름알데히드로 고정된 뒤 Perkin Elmer Victor fluorescence Plate Reader를 사용하여 판독되었다(485 nm/535 nm, 1.0 s). 자료들은 표면에 고정된 CD11c 항체가 시험된 모든 농도들에서 수지상 세포들에 유의미한 결합을 제공한다는 것을 보인다.
[00700] 도 39b에서, 마이크로타이터 플레이트들은 메톡시 제거된 PEG-PLA와 다른 비율로 혼합되거나, 희석되지 않은(100%)로 사용된 PLA-PEG-니코틴으로 코팅되었다. 니코틴 고정은 니코틴-특이적 MAb(clone 402C10; Bjercke et al. J Immunol Methods, 1986 Jun 24; 90(2):203-13)의 결합을 측정함으로서 확인되었다. 100% PLA-PEG-니코틴으로 코팅된 플레이트들은 1015 니코틴 분자/cm2를 제시할 것으로 예상되었으며, 최대 항-CD11c MAb 코팅(1 ug)은 약 1011 IgG 분자/cm2의 밀도를 보였다. 수지상 세포들은(A)에서처럼 정제되었고, 염색된 뒤에 플레이트에 첨가되었다. 플레이트들은(A)에서처럼 배양되고, 세척된 뒤 고정되어 판독되었다. 니코틴이 나노캐리어들에 대한 면역특성으로서 사용되었을 때에는(예 16에서 설명된 것처럼) 생체 내 APC 표적화 특성을 부여하였음에도 불구하고, 최대 APC 결합을 부여하기 위해 요구되는 고친화성 항체의 코팅 밀도보다 4배 이상 높은 강도의 코팅 밀도에서조차 APC에 대한 결합 친화도는 APC의 발견 가능한 정도의 결합력을 이뤄 내기에는 너무 낮았다. 이것은 니코틴-NP가 저친화성, 고결합력의 표면을 제공한다는 확장적인 증거다.
[00701] 도 39a와 39b는 니코틴 면역특징 표면들이 저친화성/ 고결합력 상호작용을 통해 APC와 상호작용한다는 것을 설명한다. 마이크로타이터 플레이트들이 니코틴(니코틴-PEG-PLA를 사용하여) 또는 고친화성 MAb를 수지상 세포에서 특이적으로 발현되는 당단백질인 CD11c에 제시하는 것을 통해 다양한 농도로 표면 코팅되었다. 패널 A는 고친화성 MAb가 마이크로타이터 플레이트에 첨가된, 부유된 DC에 효율적으로 결합하여 고정시킨다는 것을 보인다. 반대로, 니코틴 면역특징 표면-코팅된 플레이트들은 코팅되지 않은 대조군 표면들에 비해, 같은 검사조건 하에 효율적인 수지상 세포 결합을 이뤄 낸 MAb 밀도보다 최소 3배 이상의 높은 강도였던, 도달할 수 있는 최대의 니코틴 밀도(1015 분자/ cm2) 에서도 효율적으로 수지상 세포를 포획하지 못하였다. 이것은 사용된 검사 조건들에서, 플레이트의 약한 세척으로 일어나는 수지상 세포 분리에 저항할 수 있을 만큼 충분한 기계적 강도로 수지상 세포와의 결합이 일어날 수 있게 하기에는 마우스 수지상 세포에 대한 니코틴 면역특징 표면의 친화도가 너무 낮다는 것을 설명한다. 그럼에도 불구하고, 본 명세서에 기술된 생체 내 표적화 결과들을 바탕으로 했을 때, 니코틴 면역특징 표면들이 합성 나노캐리어와의 분리를 저항할 수 있을 만큼 충분하게 높은 결합력으로 APC와 결합할 수 있다고 결론내리는 것은 타당하다.
예 18. APC 표적화의 생체 내 시험
[00702](이전에 기술된) 도 27에서의 자료는 아민-변형된 합성 나노캐리어들이 카르복실산-수정된 합성 나노캐리어들보다 SCS-Mph에 더 효율적으로 표적화된다는 것을 설명한다. 그러므로, 아민 수정은 면역특징 표면의 한 실시예를 생성한다.
[00703] 뿐만 아니라, 도 40a 와 40b는 면역특징 표면이 SCS-Mph에 대한 표적화를 부여하며, 대조군 입자들은 그러한 표적화를 부여하지 않는다는 것을 설명한다. PLA-PEG-니코틴(왼쪽) 또는 PLA-PEG-대조군 나노입자들(오른쪽)이 어린 성인 C57/BL6 마우스들의 발바닥에 주입되었다. 입자들은 도 36에 기술된 면역화 실험과 같은 것들이었다. 배수 슬와 림프절은 1시간 이후에 검출되었으며, 4℃에서 인산으로 버퍼된 L-리신과 1% 파라포름알데히드/페리오데이트로 하룻밤동안 고정되어, PBS에서 10%, 20% 그리고 30%의 설탕을 순차적으로 사용하여 동결보호된 뒤, 조직 동결 배지(Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC)에서 급속 동결되어 동결 절편의 면역형광분석을 위해 준비되었다. 절편들은 니코틴-특이적 MAb(clone 402C10; Bjercke et al. J Immunol Methods, 1986 Jun 24; 90(2):203-13)으로, 그 다음에는 Alexa568-접합된 항-마우스 IgG2a 이차 항체로 염색되었다. 동일한 설정을 사용하여 리포솜 형광 신호의 디지털 흑백 이미지들이 획득되고 가공되었다. 시각화를 향상시키기 위해, 이미지들은 Adobe Photoshop CS3을 사용하여 뒤집어졌다. 도 40a와 40b에서, SCS 영역들은 화살표들에 의해 식별되었다. 도 40a에서, 나노입자들의 유의미한 양이 SCS에서 관찰되었으며, 반면에 도 40b 에서는, 나노입자들의 유의미한 양이 SCS에서 관찰되지 않았다.
[00704] 다양한 표면-결합 모이어티들을 사용한 면역특징 표면들의 확장적인 예시들로서, 도 41(a)-(d)는 GM3이 SCS에 나노입자 표적화를 제공한다는 것을 보이는 자료를 제공한다.
[00705] 단층 리포솜들이 소낭 분출 방법에 의해 제조되었다. 클로로포름에 용해되어 있는 지질들은 질소의 흐름 하에, 이후 3시간 동안의 진공 건조를 통해 건조되었다. 다음으로, 지질들은 PBS 버퍼에서 재수화되었다. 5번의 동결-해동 순환을 통해, 리포솜들은 100-nm 소낭들을 포함하는 폴리카르보네이트 필터(Whatman)을 통해 20회 분출되었다. 이 방법에 의해 제조된 리포솜들은 입도분석기(Brookhaven Instruments)를 사용하여 동적광산란법을 통해 특성이 분석되었으며 평균 리포솜 크기는 약 110 nm인 것으로 밝혀졌다. .
[00706] POPC/GM3(30mol%)/NBD-PE(a,c) 또는 POPC/NBD-PE(b,d) 들이 어린 성인 C57/BL6 마우스들의 발바닥에 주입되었다. 배수 슬와 림프절은 1시간 이후에 검출되었으며, 4℃에서 인산으로 버퍼된 L-리신과 1% 파라포름알데히드/페리오데이트로 하룻밤동안 고정되어, PBS에서 10%, 20% 그리고 30%의 설탕을 순차적으로 사용하여 동결보호된 뒤, 조직 동결 배지(Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC)에서 급속 동결되어 동결 절편의 면역형광분석을 위해 준비되었다. 동일한 설정을 사용하여 리포솜 형광 신호의 디지털 흑백 이미지들이 획득되고 가공되었다. 시각화를 향상시키기 위해, 이미지들은 Adobe Photoshop CS3을 사용하여 뒤집어졌다. 도 41에서, "SCS"는 피막하동을, 그리고 "Med"는 수질을 의미한다.
[00707] 도 41(a)와 41(b)는 림프절 횡단도의 개요를 도시한다. 도 41(c)와 41(d)는 피막하동 부위의 확대를 도시한다.
[00708] 도 41에서 보여진 것처럼, 대조군 그리고 GM3-수정된 나노입자들모두는 수질에 유지되어 있지만, GM3-수정된 나노입자들만이 SCS에 축적되며, 이것을 통해 피막하동 대식세포들에 나노캐리어들을 표적화시키기 위해 GM3 갱글리오시드가 면역특징 표면을 형성할 수 있다는 것을 나타낸다.
균등물 및 범위
[00709] 당업자는 본 명세서에 기술된 통상적인 실험만을 이용하여 본 발명의 특이적인 실시예에 많은 균등물이 있다는 것을 인식할 것이며 또는 확인할 수 있다. 본 발명의 범위는 상기 설명에 한정되는 의도는 아니며, 오히려 첨부된 청구범위에 설명된 바와 같다.
[00710] 당업자는 본 명세서에 기술된 통상적인 실험만을 이용하여 본 발명의 특이적인 실시예에 많은 균등물이 있다는 것을 인식할 것이며 또는 확인할 수 있다. 본 발명의 범위는 상기 설명에 한정되는 의도는 아니며, 오히려 첨부된 청구범위에 설명된 바와 같다.
[00711] 청구범위에서 "하나", "한가지" 및 "상기"와 같은 관사들은 달리 지시되거나 문맥으로부터 달리 명백한 것이 아니면 하나 이상을 의미할 수 있다. 따라서, 예를 들면, "하나의 나노입자"라는 언급은 복수의 그러한 나노입자를 포함하며, "상기 세포"라는 언급은 당업자에게 알려진 하나 이상의 세포들에 대한 언급 등을 포함한다. 일 그룹의 하나 이상의 구성요소들 사이에 "또는"을 포함하는 청구항 또는 설명은 달리 지시되거나 문맥으로부터 달리 명백한 것이 아니면 상기 그룹 구성요소들 중 하나, 하나 이상 또는 모두가 주어진 생성물 또는 프로세스에 존재하고, 이에 채용되거나 주어진 생성물 또는 프로세스에 적절한 것이라면 충족된 것으로 간주된다. 본 발명은 상기 그룹의 정확히 하나의 구성요소가 주어진 생성물 또는 프로세스에 존재하고 이에 채용되거나 주어진 생성물 또는 프로세스에 적절한 실시예들을 포함한다. 본 발명은 상기 그룹 구성요소들 모두가 주어진 생성물 또는 프로세스에 존재하고 이에 채용되거나 주어진 생성물 또는 프로세스에 적절한 실시예들을 포함한다. 또한, 본 발명은 열거된 청구항들 중 하나 이상으로부터 하나 이상의 제한, 구성요소, 조항, 서술적 용어들 등이 다른 청구항으로 도입되어 있는 모든 변형들, 조합들 및 순열들을 포함한다는 것을 알아야 할 것이다. 예를 들면, 다른 청구항에 종속된 임의의 청구항은 변형되어 동일한 기본 청구항에 종속된 임의의 다른 청구항에서 발견되는 하나 이상의 제한들을 포함할 수 있다. 또한, 청구항들이 조성물을 인용하는 곳에서는, 달리 지시된 것이 아니거나 모순 또는 불일치가 일어난다는 것이 당업자에게 명백한 것이 아니면 본 명세서에 개시된 목적에 상기 조성물의 이용방법이 포함되며, 본 명세서에 개시된 제조 방법에 따라 상기 조성물의 제조 방법 또는 업계에 공지된 다른 방법들이 포함된다는 것을 알아야 할 것이다.
[00712] 구성요소들이 예컨대, 마쿠쉬 그룹 양식과 같이 목록으로 제시된 곳에서는, 구성요소들의 각각의 하위 그룹도 개시되며 임의의 구성요소(들)은 상기 그룹으로부터 제거될 수 있다는 것을 알아야 할 것이다. 일반적으로, 본 발명 또는 본 발명의 측면들이 특정한 구성요소들, 특징들 등을 포함하는 것으로 언급된 곳에서는, 본 발명의 특정 실시예 또는 본 발명의 측면은 그러한 구성요소들, 특징들 등으로 구성되거나 그러한 구성요소들, 특징들 등으로 필수적으로 구성된다. 단순함을 위해, 그러한 실시예들은 본 명세서에서 같은 단어를 사용하여(in haec verba) 구체적으로 설명되지 않았다. "포함하는"이라는 용어는 열린 것으로 의미하며 다른 구성요소들 또는 단계들의 포함을 허용하는 것을 유의한다.
[00713] 범위들이 주어진 곳에서는 종말점(endpoint)이 포함된다. 또한, 달리 지시되지 않거나 당업자의 문맥 및 이해로부터 달리 명백하지 않으면, 범위로 표현된 수치들은 본 발명의 다른 실시예들에서 기술된 범위들 내에서 임의의 특이적인 수치 또는 하위 범위를 문맥이 명백히 다른 것을 지시하지 않으면 상기 범위의 하한 단위의 10분의 1까지 취할 수 있다는 것을 알아야 할 것이다.
[00714] 또한, 선행 기술 내에 속하는 본 발명의 임의의 특정 실시예는 하나 이상의 청구항들로부터 명백히 배제될 수 있다는 것을 알아야 할 것이다. 그러한 실시예들은 당업자에게 알려진 것으로 간주되기 때문에, 이들은 상기 배제가 본 명세서에서 명백히 기술되지 않는다 하더라도 배제될 수 있다. 본 발명의 조성물들의 특정 실시예(예컨대, 임의의 면역조절제, 임의의 표적화제, 임의의 면역자극제, 임의의 항원 제시 세포, 임의의 백신 나노캐리어 구조물, 임의의 마이크로유기물, 임의의 투여방법, 임의의 예방 및/또는 치료적 응용 등)는 선행 기술의 존재에 관련 여부에 관계없이 임의의 이유로 인해 하나 이상의 청구항으로부터 배제될 수 있다.
[00715] 상기 및 텍스트 전체에 걸쳐서 토의된 발간물들은 본 출원의 제출일 이전에 이의 개시 목적으로만 제공된다. 본 명세서의 어떠한 것도 본 발명자들이 선행 개시물에 의하여 그러한 개시물보다 선행하는 자격이 없는 것으로 허용되는 것으로 해석되어서는 안 된다.

Claims (33)

  1. (1) 환자의 항원에 대한 내성을 유도하기 위한 합성 나노캐리어들; 및
    (2) 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물이고,
    상기 합성 나노캐리어들은 50nm와 100 nm 사이의 평균 직경을 가지며,
    (a) 합성 나노캐리어들의 표면에 결합하거나, 상기 합성 나노캐리어들이 형성되는 폴리머에 결합하거나, 상기 합성 나노캐리어들의 내에 캡슐화된 항원과,
    (b) 상기 합성 나노캐리어들의 표면에 결합하거나 상기 합성 나노캐리어들이 형성되는 폴리머에 결합하거나, 상기 합성 나노캐리어들의 내에 캡슐화된 면역 억제제를 포함하고,
    상기 합성 나노캐리어들은, 친수성 폴리머 및 소수성 폴리머를 포함하는 양친매성 폴리머들을 포함하는 자가-조립체(self-assembly)에서 형성되며,
    상기 소수성 폴리머들은 폴리에스테르를 포함하고, 상기 친수성 폴리머는 폴리알킬렌 옥사이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리에스테르는 폴리(락트산), 폴리(글리콜산) 및 폴리(락티드-코-글리콜리드)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 폴리알킬렌 옥사이드는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역 억제제는 라파마이신(rapamycin), TGF-β, 레티노산(retinoic acid), 시클로스포린(cyclosporin), 스테로이드, 메토트렉세이트(methotrexate) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 항원은 아토피성 질병 항원, 자가면역 질병 항원, 대사성 질병 효소 또는 효소 생성물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 항원은 상기 합성 나노캐리어내에 캡슐화된 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 항원은 상기 합성 나노캐리어의 표면에 결합되거나, 상기 합성 나노캐리어들이 합성 나노캐리어들 안으로 자가-조립되기전에 형성되는 폴리머에 결합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역 억제제는 상기 합성 나노캐리어 안에 캡슐화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역 억제제는 상기 합성 나노캐리어의 표면에 결합되거나, 상기 합성 나노캐리어들이 합성 나노캐리어들 안으로 자가-조립되기 전에 형성되는 폴리머에 결합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 3 항에 있어서,
    상기 면역 억제제는 라파마이신인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 합성 나노캐리어의 표면은 표적화 모이어티를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 항원은 B-세포 항원, T-세포 항원, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 8 항에 있어서,
    상기 항원은, 상기 합성 나노캐리어의 코어 영역 내에 캡슐화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 약학적으로 허용가능한 부형제는 용매, 분산매, 희석제 또는 다른 액체 운반체, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고체 결합체 및 윤활제로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 피막하동 대식세포를 표적하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 수지상 세포를 표적하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 보체를 실질적으로 활성화시키지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 11 항에 있어서,
    상기 표적화 모이어티는 친수성 폴리머의 말단에 결합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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