KR101720288B1 - 뇌 영상용 염료 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 뇌 영상화용 형광 염료에 관한 것이다.
[화학식 1]
상기 [화학식 1]에서, R1, R2, R3, R4, R5 및 n는 각각 명세서에 정의한 바와 같다.
[화학식 1]
상기 [화학식 1]에서, R1, R2, R3, R4, R5 및 n는 각각 명세서에 정의한 바와 같다.
Description
본 발명은 뇌를 특이적으로 조영할 수 있는 생체 적합성 뇌 영상화용 염료 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
생체 물질 자체는 가시광 및 근적외 영역의 형광이 미약하거나 없으므로 바이오 분야에서는 생체 내/외에서 세포 및 세포 이하 단계에서의 생물학적인 현상을 관찰하거나 생체 내로 투영되어 조영 및 질환부위의 광학 영상을 얻기 위하여 생체 물질에 형광 염료 또는 형광 염료가 미리 표지된 특정 생체 물질을 광학장비와 함께 활용하는 다양한 기법을 통해 영상화한 자료를 얻고 있다.
바이오 분야에서 사용되는 다양한 광학 분석(optical anylsis) 장비들은 내장된 광원 및 필터에 따라 형광을 관찰하기에 적합한 여기 파장(excitation wavelength) 및 형광 파장(emission wavelength)를 가진 형광 염료를 기본 소재나 시약으로 선택하게 된다.
주로 사용되는 광학 분석 장비로는 세포 관찰을 위한 형광현미경(fluorescece microscope), 공초점현미경(confocal microscope), 유세포분석기(flowcytometer), 마이크로어레이(microarray), 정량 중합효소연쇄반응 장치(qualitative PCR system), 핵산 및 단백질 분리, 분석을 위한 전기영동(electrophoresis) 장치, 실시간 생체내 영상 장비(in vivo imaging system) 등 연구 목적의 장비 외에도, 면역 분석 기법(immnuno assay)이나 PCR 분석 및 통계 기술이 접목된 핵산 및 단백질 진단 키트(또는 바이오칩) 기반 체외 진단(in vitro diagnosis) 장비와 의료 영상 수술(image-guided surgery)을 위한 수술대 및 내시경 장비 등의 진단 및 치료를 위한 것들이 알려져 있으며, 지속적으로 새로운 응용 분야 및 더 높은 수준의 해상도 및 데이터 처리 능력을 가진 장비가 개발되고 있다.
고령화 사회에서는 퇴행성 뇌질환, 뇌혈관 질환 등의 뇌질환 발생이 급격히 증가하기 때문에, 이러한 뇌질환에 대한 예방, 진단 및 치료는 매우 중요한 분야로 인식되고 있다. 이러한 뇌질환의 진단에 있어 가장 널리 이용되는 방법이 뇌 영상화 기술이다. CT와 MRI 등은 뇌의 형태학적인 변화를 빠르고 정확하게 확인하여 다양한 정보를 제공하는 장점이 있으며, 바이오마커는 질환진단, 분류 및 예측에 활용될 수 있으며, 특히 질환이 발병하기 이전 단계에 적용되어 향후 발명을 예측하는데 활용될 수도 있다. 이러한 측면에서 뇌에 침투가 용이하면서, 독성이 없고, 뇌에 잔류하지 않아 뇌 영상화에 용이하게 적용할 수 있는 안전하고 효과적인 염료의 개발이 요구되고 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 뇌 영상화에 적합한 염료 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 뇌 영상화용 조영제를 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기 조영제를 이용하여 뇌 영상화 하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 뇌 영상화용 형광 염료를 제공한다.
[화학식 1]
상기 [화학식 1]에서,
R1은 C1 - 6알킬, 히드록시C1 - 6알킬 및 아질산C1 - 10알킬 중에서 선택되며,
R2는 수소, C1 - 6알킬, C1 - 6알콕시, -SO3 - 및 -SO3H 중에서 선택되고,
R3은 C1 - 6알킬이며,
R4는 C1 -10알킬 또는 아질산C1 - 10알킬이고,
R5는 수소, C1 - 6알킬 및 -C(O)(CH2)mCH3 중에서 선택되며,
n은 0 또는 1이고
m은 0 내지 5의 정수이다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 [화학식 1]로 표시되는 뇌 영상화용 형광 염료는 R1은 C2 - 5알킬, 히드록시C2 - 5알킬 및 아질산C2 - 7알킬 중에서 선택되며, R2는 수소, C1 - 3알콕시, -SO3 - 및 -SO3H 중에서 선택되고, R3은 C1 - 3알킬이며, R4는 C1 - 6알킬 또는 아질산C4 - 7알킬이고, R5는 수소 또는 -C(O)(CH2)mCH3이며, 상기 R1 및 R4 중 적어도 하나는 아질산C2 - 7알킬이고, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 5의 정수인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 뇌 영상화용 형광염료는 하기 화합물 1 내지 16 중에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
인돌기와 페닐아미닐을 연속적인 이중결합을 가지는 불포화 탄화수소가 가교하고 있는 구조로, 이중결합이 1개 내지 2개인 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 이중결합이 3개 이상인 경우에서는 뇌-혈관 장벽을 통과하기 어려워 뇌로 화합물이 이행되기 어렵거나, 뇌에 집적되지 않았다.
화합물 1:
화합물 2:
화합물 3:
화합물 4:
화합물 5:
화합물 6:
화합물 7:
화합물 8:
화합물 9:
화합물 10:
화합물 11:
화합물 12:
화합물 13:
화합물 14:
화합물 15:
화합물 16:
본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 가시광선 파장 범위인 400 내지 650 nm 범위의 파장을 방출하므로, 근적외 형광염료로 관찰이 어려웠던 질환부위의 영상화 또한 용이하게 적용할 수 있다.
한편, 본 발명은 상기 [화학식 1]로 표시되는 뇌 영상화용 형광 염료의 제조방법을 제공한다.
상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 하기 [화학식 2]의 화합물과 하기 [화학식 3]의 화합물을 유기용매하에서 반응시키는 단계;를 포함하여 수행함으로써 제조될 수 있다.
[화학식 2]
[화학식 3]
상기 [화학식 2] 내지 [화학식 3]에서,
R1은 C1 - 6알킬, 히드록시C1 - 6알킬 및 아질산C1 - 10알킬 중에서 선택되며,
R2는 수소, C1 - 6알킬, C1 - 6알콕시, -SO3 - 및 -SO3H 중에서 선택되고,
R3은 C1 - 6알킬이며,
R4는 C1 -10알킬 또는 아질산C1 - 10알킬이고,
R5는 수소, C1 - 6알킬 및 -C(O)(CH2)mCH3 중에서 선택되며,
n은 0 또는 1이고
m은 0 내지 5의 정수이다.
상기 아질산C1 - 10알킬은 ONO-(CH2)pCH2- 로 표기될 수 있으며, p는 0 내지 9의 정수이다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 유기용매는 아세트산:무수아세트산 10:1 내지 1:10 (v/v) 혼합용매일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 뇌 영상화용 형광 염료는 뇌-혈관 장벽을 통과하지 못하는 종래의 시아닌계열 염료, 인돌계 염료, FITC(fluorescein isothiocyanate)계 염료 및 Texas red에 비하여 뇌-혈관 장벽을 통과하여 뇌로 이행되었으며, 뇌에서 집적되는 집적률이 현저히 우수하므로, 생체 내 뇌의 영상화용 조영제로 유용하게 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물은 뇌-혈관 장벽을 통과하지 못하는 종래의 시아닌계열 염료 또는 인돌계 염료와는 상이하게 효과적으로 뇌-혈관 장벽을 통과하며, 뇌로 집적되는 효과가 우수하며, 세포독성이 낮으면서도 생체 내에서 안정적이며, 강한 형광성을 나타내어 뇌 영상화용 조영제물로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 화합물들의 인비보에서 화합물 분포변화를 IVIS 이미징을 통해 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 실시예 화합물들의 인비보에서 화합물 분포변화를 IVIS 이미징을 통해 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예 화합물들의 인비보에서 화합물 분포변화를 X-ray 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 실시예 화합물들의 ex vivo 장기별 화합물 분포를 IVIS 이미징을 통해 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 실시예 화합물들의 인비보에서 화합물 분포변화를 IVIS 이미징을 통해 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예 화합물들의 인비보에서 화합물 분포변화를 X-ray 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 실시예 화합물들의 ex vivo 장기별 화합물 분포를 IVIS 이미징을 통해 분석한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 독기 위하여 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
합성된 화합물들의 분석을 위하여 FT-NMR 분광 분석은 Bruker사의 Avance 300 또는 500을 사용하였고, LC/MS는 Agilent사의 LC/MSD (G-1956B)을 사용하여 측정하였다.
합성된 염료의 흡수 파장 및 최대 파장에서의 흡수값은 Agilent사의 Cary 8454 UV-VIS를 사용하여 측정하였고, 발광 파장 및 최대 발광 파장에서의 발광값은 Perkin Elmer사의 LS-55를 사용하여 측정하였다.
화합물의 분리 및 정제를 위한 칼럼 크로마토그래피는 정상(normal phase)의 경우, 실리카겔(silica gel)로서 Merck사의 kieselgel 60(230-400 mesh)을 사용하였고, 박층 크로마토그래피(TLC)는 실리카겔 60 GF254(0.25 mm, Merck)가 도포되어 있는 유리판을 사용하였다. TLC 상의 화합물 확인은 254 nm 및 365 nm의 자외선을 이용하거나, 발색제로 인몰리브덴산(phosphomolybdic acid) (PMA) 20 내지 30% 에탄올 용액 또는 KMnO4 발색제를 사용하여 확인하였다. 역상(reverse phase)의 경우, TLC는 실리카겔 60 RP-18 F254S(0.25 mm, Merck)가 도포되어 있는 유리판을 사용하였고, 칼럼 크로마토그래피의 경우는 Buchi사의 MPLC(medium pressure liquid chromatography) 기기인 Fraction Collector R-660에 역상 칼럼 Lichroprep RP-18 (40 내지 63 μm, Merck사 제품)를 연결하여 사용하였다.
제조예 1
1 단계
p-히드라지노벤젠설폰산(p-hydrazinobenzenesulfonic acid) (10 g, 53 mmol, 1 eq, Aldrich)과 3-메틸-2-부탄온(3-methyl-2-butanone) (17.18 mL, 160 mmol, 3.02 eq, TCI)에 아세트산 30 mL에 가한 후, 4 시간 동안 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 생성된 고체 입자를 여과하였다. 에틸아세테이트로 3회 세정한 후 감압 건조시켰다(11.34 g, 89%).
Rf = 0.68 (RP-C18, 아세토니트릴/물=1:4, v/v)
2 단계
수산화칼륨(1.427 g, 25.4 mmol, 1.2 eq)을 프로판올 35 mL에 용해시키고, 1 단계에서 얻은 화합물(5.073 g, 21.2 mmol, 1 eq)을 메탄올 35 mL에 용해시켜 가한 후, 상온에서 24 시간 교반 후, 여과하여 목적하는 화합물을 얻었다(5.35 g, 90%).
Rf = 0.68 (RP-C18, 아세토니트릴/물=1:4, v/v)
1H NMR (300 MHz, D2O) : δ 7.60 (s, 1H), 7.58 (d, 1H, J = 8.32 Hz), 7.32 (d, 1H, J = 7.99 Hz), 2.08 (s, 3H), 1.06 (s, 6H)
제조예 2.
제조예 1의 화합물(20 g, 72.1 mmol, 1 eq)에 에틸 아이오다이드(ethyl iodide) (110 mL, 1,375 mmol, 19 eq, TCI)를 가한 후 24 시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시킨 후, 잔여 에틸 아이오다이드를 제거하고, 50 mL의 아세톤으로 3회 세정한 다음 여과하고, 40 ℃에서 감압 건조시켜 목적하는 화합물을 얻었다(18.37 g, 95%).
Rf = 0.18 (RP-C18, 아세토니트릴/물=1:4, v/v)
1H NMR (400 MHz, D2O) : δ 7.99 (s, 1H), 7.88 (d, 1H, J = 8.23 Hz), 7.80 (d, 1H, J = 8.46 Hz), 4.43 (m, 2H), 1.52-1.40 (m, 12H)
LC/MS, 계산치 C13H17NO3S 267.34, 측정치 268.16
실시예
1
제조예 2의 화합물(16 g, 59.8 mmol, 1 eq)과 N,N'-디페닐포름아미딘(N,N'-Diphenylformamidine) (13.2 g, 67.3 mmol, 1.125 eq, TCI)를 40 mL의 아세트산과 40 mL의 무수 아세트산 혼합 용액에 넣고, 4 시간 동안 가열 환류시켰다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각시키고 용매를 제거한 후, 에틸아세테이트를 가하여 고체를 생성시켰다. 다음으로 여과한 후 감압건조하고, 반응 혼합물을 컬럼크로마토그래피로 정제하여 목적하는 화합물 [1]을 분리하였다(12.97 g, 57%).
Rf = 0.25 (RP-C18, 아세토니트릴/물=1:4, v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 7.85 (s, 1H), 7.70 (dd, 1H, J = 1.35 Hz, 1.32 Hz), 7.53-7.45 (m, 7H), 7.29 (dd, 1H, J = 1.92 Hz, 6.66 Hz), 4.13 (m, 2H), 1.70 (s, 6H), 1.32 (t, 3H, J = 7.05 Hz)
LC/MS, 계산치 C20H22N2O3S 370.47, 측정치 370.98
실시예
2
제조예 2의 화합물(3 g, 10.26 mmol, 1 eq)과 말론알데히드 디아닐리드 하이드로클로라이드(Malonaldehyde Dianilide Hydrochloride) (3.1 g, 12.3 mmol, 1.2 eq, TCI)를 13 mL의 아세트산과 13 mL의 무수 아세트산 혼합 용액에 넣고 4 시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시키고, 반응액을 제거한 후 에틸아세테이트로 고체를 생성시켜 여과하고 감압 건조한 다음 실리카겔 컬럼크로마토그래피법으로 정제하여 반응 혼합물로부터 목적하는 화합물 [2]를 분리하였다(3.47 g, 96%).
Rf = 0.20 (RP-C18, 아세토니트릴/물=1:4, v/v)
LC/MS, 계산치 C22H24N2O3S 396.5, 측정치 396.9
실시예
3
1 단계:
제조예 1의 화합물(2 g, 8.4 mmol, 1 eq)과 3-아이오도-1-프로필아세테이트(3-iodo-1-propylacetate) (1.91 g, 8.4 mmol, 1 eq, TCI)을 5 mL 의 1,2-디클로로벤젠 (1,2-dichlorobenzene)에 녹인 후 24시간 동안 환류하였다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각시키고, 용매를 제거한 후 에테르를 사용하여 2,3회 세척하고 감압건조 하였다. 건조된 화합물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피법(용리액 : 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트, gradiented)으로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다(2.5 g, 87.7 %).
Rf = 0.6(SiO2, 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트=2:4:1:3, 부피비)
LC/MS, 계산치 C16H21KNO5S+ 378.5, 측정치 381.1
2 단계:
상기 1 단계의 화합물(2.5 g, 7.37 mmol, 1 eq)에 2M 염산용액 80 mL(메탄올/증류수=1:1, v/v로 희석)을 투입한 후 2 시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 종료 후 감압 건조하였다. (2.2 g)
Rf = 0.55 (SiO2, 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트=2:4:1:3, v/v/v/v)
LC/MS, 계산치 C14H19NO4S 297.37, 측정치 297.9
3 단계:
상기 2 단계의 화합물(500 mg, 2.3 mmol, 1 eq)과 증류수 1.5 mL에 용해시킨 아초산(sodium nitrite) (316 mg, 4.6 mmol, 2 eq)을 혼합한 후, 진한 염산 용액 113 μL 와 증류수 83 μL의 혼합용액을 더 첨가하고, 1 시간 동안 0 ℃에서 교반하였다. 반응 종료 후 감압건조하여 목적하는 화합물을 제조하였다. (500 mg)
Rf = 0.5 (SiO2, 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트=2:4:1:3, v/v/v/v)
LC/MS, 계산치 C14H18N2O5S 326.37, 측정치 324.8
4 단계: 화합물 [3]의 합성
상기 3 단계의 화합물(500 mg, 2.02 mmol, 1 eq)과 N,N-diphenylformamidine (793 mg, 4.05 mmol, 2 eq)를 아세트산:무수 아세트산=1:1 혼합 용액 10 ml에 용해시킨 다음, 100 ℃에서 2 시간 동안 환류시켰다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각시키고, 용매를 제거한 뒤, 에틸 아세테이트를 가하여 고체를 생성시키고, 여과하여 감압건조 하였다. 건조된 화합물은 컬럼 크로마토그래피법(SiO2, 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트, grediented)으로 정제하여 반응혼합물로부터 목적하는 화합물 [3]을 분리하였다(5 mg, 0.6 %).
Rf = 0.7 (SiO2, 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트=2:4:1:3 v/v/v/v)
LC/MS, 계산치 C21H23N3O5S 429.49, 측정치 428.1
실시예
4
1 단계
2,3,3-트리메틸인돌레닌(2,3,3-trimethylindolenine) (3 g, 18.84 mmol, 1 eq, TCI)및 3-아이오도-1-프로필아세테이트(3-iodo-1-propylacetate) (4.30 g, 18.84 mmol, 1 eq)을 혼합한 후 2시간 동안 환류시켰다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각하고, 목적하는 화합물의 생성 여부를 확인하였다(수율 6.5g).
LC/MS, 계산치 C16H22NO2 260.35, 측정치 260.0
2 단계
상기 1 단계의 화합물(6.58 g, 25.3 mmol., 1 eq)에 2M 염산용액 100 mL(메탄올/증류수=1:1, v/v로 희석)을 첨가하여 12 시간 상온에서 교반하였다. 반응 종료 후, 감압 건조하고 목적하는 화합물의 생성 여부를 확인하였다(수율 6.21 g).
LC/MS, 계산치 C14H20NO 218.31, 측정치 218.0
3 단계
상기 2 단계의 화합물(1 g, 4.6 mmol, 1 eq)과 증류수 1 mL에 용해시킨 아초산(sodium nitrite)(348 mg, 5 mmol, 1.1 eq)을 혼합한 후, 진한 염산 용액 1 mL를 더 첨가하여 0 ℃에서 10분간 교반하였다. 반응 종료 후, 감압 건조하고 목적하는 화합물의 생성 여부를 확인하였다(수율 1.04 g).
Rf = 0.8 (SiO2, 디메틸 클로라이드/메탄올=10:1, v/v)
LC/MS, 계산치 C14H19N2O2 247.31, 측정치 247.0
4 단계
상기 3 단계의 화합(1.04 g, 4.21 mmol, 1 eq)과 N,N-diphenylformamidine (826 mg, 4.21 mmol, 1 eq)를 아세트산:무수 아세트산=1:1 혼합 용액 20 ml에 용해시킨 다음, 100 ℃에서 2 시간 동안 환류시켰다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각시키고, 감압건조 한 다음, 컬럼 크로마토그래피법(SiO2, 디클로로메탄/메탄올, grediented)으로 정제하여 반응혼합물로부터 목적하는 화합물 [4]를 분리하였다(137 mg, 9.3 %).
Rf = 0.9 (SiO2, 디메틸 클로라이드/메탄올=10:1, v/v)
LC/MS, 계산치 C21H24N3O2S 350.43, 측정치 349.0
실시예
5
1 단계
에틸 2-메틸 아세토아세테이트(Ethyl 2-methyl acetoacetate) (3.4 mL, 30.57 mmol, 1 eq), 21% 소듐 에토리드 용액(sodium ethoride solution) (7.5 mL, 122.3 mmol, 4 eq) 및 6-브로모-1-헥산올(6-bromo-1-hexanol) (4 mL, 30.57 mmol, 1 eq)을 에탄올 23 mL에 용해시킨 후 120 ℃에서 12 시간 동안 환류하였다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각시키고 여액은 감압건조한 뒤, 클로로포름과 물을 사용하여 추출하였다. 유기층은 모아 감압 건조한 뒤, 컬럼크로마토그래피법(SiO2, 핵산/에틸 아세테이트)으로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다(3 g, 40.4 %).
Rf = 0.2 (SiO2, 에틸 아세테이트/핵산=1:4, v/v)
LC/MS, 계산치 C13H24O4 244.33 측정치 246.2
2 단계
상기 1 단계의 화합물(3 g, 12.3 mmol, 1 eq) 및 가성소다(Sodium hydroxide) (1.5 g, 36.9 mmol, 3 eq)을 메탄올:물=10:3 혼합용액 13 mL에 용해시켜 50 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후 감압건조한 다음 1 M 염산용액을 첨가하여 산성화시켰다(pH=1). 다음으로 에틸아세테이트와 물을 사용하여 추출한 후 유기층을 모아 감압 건조하여 목적하는 화합물을 얻었다(수율 2.1 g).
Rf = 0.05 (SiO2, 에틸 아세테이트/핵산=1:4, v/v)
LC/MS, 계산치 C10H20O2 172.26 측정치 173.1
3 단계
상기 2 단계의 화합물(2.1 g, 12.3 mmol, 1 eq)과 p-히드라지노벤젠설폰산(p-hydrazinobenzenesulfonic acid) (2 g, 12.3 mmol, 1 eq, Aldrich)을 아세트산 16 mL에 용해시킨 후, 4 시간 동안 환류시켰다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각시키고, 생성된 고체는 여과한 뒤, 에틸아세테이트로 3회 세척하고 감압 건조하였다. 건조된 화합물은 컬럼크로마토그래피법(SiO2, 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트)으로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다(790 mg, 20.3 %).
Rf = 0.75 (SiO2, 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트=2:4:1:3, v/v/v/v)
LC/MS, 계산치 C16H22KNO4S 363.51, 측정치 365.8
4 단계
상기 3 단계의 화합물(790 mg, 1.84 mmol, 1 eq)에 3-아이오도-1-프로필아세테이트(3-iodo-1-propylacetate) (1.26 g, 5.52 mmol, 3 eq)를 첨가한 후 110 ℃ 일야반응 진행하였다. 반응 종료 후 에테르를 첨가하여 입자를 생성시킨 다음 여과하여 건조하였다. 건조된 입자는 컬럼크로마토그래피법(SiO2, 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트)으로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다(200 mg, 25.5 %).
Rf = 0.6 (SiO2, 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트=2:4:1:3, v/v/v/v)
LC/MS, 계산치 C21H31KNO6S+ 464.64, 측정치 465.9
5 단계
상기 4 단계의 화합물(200 mg, 0.47 mmol., 1 eq)에 2M 염산용액 10 mL(메탄올/증류수=1:1, v/v로 희석)을 첨가한 후 12 시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 종료 후 감압건조하고, 컬럼 크로마토그래피법(SiO2, 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트)으로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다(100 mg, 55.6 %).
Rf = 0.5 (SiO2, 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트=2:4:1:3, v/v/v/v)
LC/MS, 계산치 C19H29NO5S 383.5, 측정치 382.1
6 단계
상기 5 단계의 화합물(100 mg, 0.261 mmol, 1 eq), 트리페닐포스핀(Triphenylphosphine) (274 mg, 1.044 mmol, 4 eq), 2,3-디클로로-5,6-디시아노벤조퀴논(2,3-dichloro-5,6-dicyanobenzoquinone) (237 mg, 1.044 mmol, 4 eq) 및테트라부틸암모늄 니트레이트(Tetrabutylammonium nitrate) (318 mg, 1.044 mmol, 4 eq)을 아세토니트릴 5 mL에 용해시킨 다음 70 ℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각하여 감압 농축 한 다음, 농축물을 컬럼크로마토그래피법(RP-C18 역상 컬럼, 용리액: 30% 아세토니트릴 수용액)으로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다(100 mg, 86.7%).
Rf = 0.6 (SiO2, 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트=2:4:1:3, v/v/v/v)
LC/MS, 계산치 C19H27N3O7S 441.5, 측정치 442.6
7 단계
상기 6 단계의 화합물(100 mg, 0.226 mmol, 1 eq) 및 N,N-diphenylformamidine(89 mg, 0.452, 2 eq)를 아세트산 1 mL에 용해시킨 뒤, 120 ℃ 에서 2 시간 동안 환류시켰다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각시키고, 용액을 제거한 후, 에틸 아세테이트를 가하여 고체를 생성시켰다. 생성된 고체는 여과 및 감압건조하고, 컬럼 크로마토그래피법(SiO2, 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트)으로 정제하여 반응혼합물로부터 목적하는 화합물 [5]를 분리하였다(10 mg, 8.2%).
Rf = 0.45 (SiO2, 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트=2:4:1:3, v/v/v/v)
LC/MS, 계산치 C26H32N4O7S 544.62, 측정치 544.7
실시예
6
제조예 1 내지 2에서 p-히드라지노벤젠설폰산 대신에 페닐히드라진을 사용하여 제조된 물질을 이용하여 실시예 1의 방법으로 목적하는 화합물 [6]을 분리하였다.
LC/MS, 계산치 C22H26N3O2 364.20, 측정치 364.2
실시예
7
제조예 1 내지 2에서 p-히드라지노벤젠설폰산 대신에 4-메톡시페닐히드라진을 사용하여 제조된 물질을 이용하여 실시예 1의 방법으로 목적하는 화합물 [7]을 분리하였다.
LC/MS, 계산치 C23H28N3O3 394.21, 측정치 394.3
실시예
8
실시예 7과 유사한 방법으로 반응을 수행하였으며, 컬럼크로마토그래피법으로 정제하여 아세틸화된 화합물 [8]을 분리하였다.
LC/MS, 계산치 C25H30N3O4 436.22, 측정치 436.3
실시예
9
3-아이오도-1-프로필아세테이트 대신에 4-아이오도-1-부틸아세테이트를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5와 유사한 방법으로 반응을 수행하였으며, 반응 혼합물을 컬럼크로마토그래피로 정제하여 아세틸화된 화합물 [9]를 분리하였다.
LC/MS, 계산치 C30H39N4O6 551.29, 측정치 551.3
실시예
10
실시예 1과 유사한 방법으로 반응을 수행하였으며, 컬럼크로마토그래피로 정제하여 아세틸화된 화합물 [10]을 분리하였다.
LC/MS, 계산치 C22H24N2O4S 412.5, 측정치 411.1
실시예
11
실시예 2와 유사한 방법으로 반응을 수행하였으며, 컬럼크로마토그래피로 정제하여 아세틸화된 화합물 [11]을 분리하였다.
LC/MS, 계산치 C24H26N2O4S 438.54, 측정치 437.1
실시예
12
실시예 4와 유사한 방법으로 반응을 수행하였으며, 컬럼크로마토그래피로 정제하여 아세틸화된 화합물 [12]을 분리하였다.
LC/MS, 계산치 C23H25N3O6S 471.53, 측정치 470.1
실시예
13
실시예 3의 3 단계의 화합물을 사용하는 것 대신에 실시예 3의 2 단계의 화합물(500 mg, 2.3 mmol, 1 eq)를 사용하여 실시예 3의 4단계 방법으로 화합물 [13]을 합성하였다.
LC/MS, 계산치 C21H24N2O4S 400.49, 측정치 400.1
실시예
14
실시예 5의 6단계 화합물을 사용하는 것 대신에 실시예 5의 5단계 화합물(100 mg, 0.261 mmol, 1 eq)를 사용하여 실시예 5의 7단계 방법으로 화합물 [14]를 합성하였다.
LC/MS, 계산치 C26H33N3O6S 515.62, 측정치 515.2
실시예
15
실시예 13과 유사한 방법으로 목적하는 화합물 [15]를 합성하였다.
LC/MS, 계산치 C25H31N2O3 407.52, 측정치 407.2
실시예
16
실시예 14와 유사한 방법으로 목적하는 화합물 [16]를 합성하였다.
LC/MS, 계산치 C30H40N3O5 522.66, 측정치 522.3
비교예
1
제조예 2의 화합물(3 g, 10.26 mmol, 1 eq)과 Galutacon aldehydedianil acetic anhydride hydrochloride (2.9 g, 10.26 mmol, 1 eq, TCI)를 8 mL 의 아세트산과 10 mL의 무수 아세트산 혼합용액에 넣고 100 ℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 반응액을 제거한 후 에틸아세테이트로 고체를 생성시켜 여과하고 감압 건조한 다음 실리카겔 컬럼크로마토그래피법으로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다.
Rf = 0.80 (RP-C18, 아세토니트릴/물=1:2, v/v)
LC/MS, 계산치 C24H26N2O3S 422.54 측정치 423.0
비교예
2
1 단계
6-아미노-1,3-나프탈렌 디설포네이트 디소듐 염(6-amino-1,3-naphthalene disulfonate disodium salt) (10 g, 29 mmol, 1 eq, TCI)을 30 mL 물에 넣고 완용한 후 물 50 mL 및 진한염산 15 mL을 투입하였다. 반응 혼합액을 0 ℃로 냉각한 후 물 40 mL에 용해시킨 아초산(2.2 g, 32 mmol, 1.1 eq)을 1 시간 동안 천천히 첨가하였다. 스태노스 클로라이드(stannous chloride) (11 g, 58 mmol, 2 eq, Aldrich)를 물 30 mL 및 진한염산 6 mL 혼합용액에 용해시킨 후, 상기 반응 혼합물에 20분에 걸쳐 천천히 첨가하고 상온에서 일야 교반하였다. 반응 종료 후, 감압 건조하고, 이소프로필 알콜을 첨가하여 입자를 생성시킨 뒤, 생성된 입자를 여과하고, 이소프로필 알콜로 세척한 후 감압 건조하여 목적하는 화합물을 얻었다(9 g, 97%).
Rf = 0.95 (RP-18, 메탄올/물=3:7 v/v)
2 단계
상기 1 단계의 화합물(10 g, 25 mmol, 1 eq), 이소프로필메틸케톤(isopropyl methyl ketone) (12 g, 140 mmol, 5.6 eq) 및 포타슘 아세테이트(6 g, 61 mmol, 2.4 eq)를 빙초산 75 mL에 용해시켜 24 시간 동안 가열 환류시켰다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각하고 감압 건조하여 빙초산을 제거한 뒤, 메탄올에 용해하여 여과하였다. 여액을 모아 농축한 뒤, 이소프로필 알콜로 여러번 세척하고 감압건조하여 목적하는 화합물을 얻었다.(9.6 g, 100 %).
Rf = 0.8 (RP-C18, 메탄올/물=3:7, v/v)
3 단계
상기 2 단계의 화합물(4.6 g, 12.5 mmol, 1 eq) 및 에틸아이오다이드(ethyl iodide) (3.6 g, 23 mmol, 1.84 eq)를 DMF 25 mL에 용해시켜 24 시간 동안 가열 환류시켰다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각시키고 감압하여 에틸아이오다이드를 제거한 뒤, 고체를 아세톤을 사용하여 3회 세척하고, 여과한 다음 40℃ 에서 감압 건조하여 분홍색 고체의 목적하는 화합물을 얻었다(3.6 g, 73 %).
Rf = 0.55 (RP-C18, 메탄올/물 3:7 v/v)
4 단계
상기 3 단계의 화합물(5 g, 13 mmol, 1 eq)과 DPF(3.1 g, 15 mmol, 1.2 eq, TCI)를 아세트산:무수아세트산=1:1 혼합용매 34 mL에 용해시킨 다음 4 시간 동안 가열 환류시켰다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각시키고, 용매를 제거한 뒤, 에틸아세테이트를 첨가하여 고체를 형성시켰다. 형성된 고체는 여과한 뒤, 감압건조하고, 컬럼크로마토그래피법(SiO2, 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트)으로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다(58 mg, 0.89 %).
Rf = 0.55 (RP-C18, 메탄올/물=3:7 v/v)
LC/MS, 계산치 C24H24N2O6S2 500.59 측정치 501.8
비교예
3
상기 비교예 1의 3 단계 화합물(5 g, 13 mmol, 1 eq)과 MDH(4.1 g, 15 mmol, 1.2 eq, TCI)를아세트산:무수아세트산=1:1 혼합용매 34 mL에 용해시킨 다음 4 시간 동안 가열 환류시켰다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각시키고, 용매를 제거한 뒤, 에틸아세테이트를 첨가하여 고체를 형성시켰다. 형성된 고체는 여과한 뒤, 감압건조하고, 컬럼크로마토그래피법(SiO2, 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트)으로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다(65 mg, 0.95 %).
Rf = 0.48 (RP-C18, 메탄올/물=3:7 v/v)
LC/MS, 계산치 C26H26N2O6S2 526.62 측정치 524.8
비교예
4
상기 비교예 1의 3 단계 화합물(5 g, 13 mmol, 1 eq)과 GDH(4.5 g, 15 mmol, 1.2 eq, TCI)를 아세트산:무수아세트산=1:1 혼합용매 34 mL에 용해시킨 다음 4 시간 동안 가열 환류시켰다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각시키고, 용매를 제거한 뒤, 에틸아세테이트를 첨가하여 고체를 형성시켰다. 형성된 고체는 여과한 뒤, 감압건조하고, 컬럼크로마토그래피법(SiO2, 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트)으로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다(54 mg, 0.74 %).
Rf = 0.44 (RP-C18, 메탄올/물=3:7 v/v)
LC/MS, 계산치 C28H28N2O6S2 552.66 측정치 550.8
비교예
5.
비교예 3과 유사한 방법으로 반응을 수행하였으며, 컬럼크로마토그래피법(SiO2, 이소부탄올/n-프로판올/물/에틸아세테이트)으로 정제하여 아세틸화된 화합물을 얻었다.
LC/MS, 계산치 C28H28N2O7S2 558.66 측정치 567.1
시험예
1.
ISIV
이미징
분석
뇌-혈간 장벽을 통과하여 뇌에서의 집적도가 우수한 구조를 찾기 위해 타겟 구조를 선별하고, 스크리닝에 의해 뇌-혈관 장벽을 통과하여 뇌로 이행 및 집적도가 우수한 구조인 화합물들을 선별하였다. 선별된 화합물들은 인돌과 아닐린이 이중결합으로 연결된 구조를 포함하며, 인돌의 질소에는 알킬기를 포함하는 치환기를 가지며, 아닐린의 질소는 비치환되거나 또는 아세틸치환기를 포함하고 있었다. 스크리닝을 통해 본 발명에 따른 [화학식 1]로 표시되는 화합물이 뇌로 이행이 가능한 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물인 실시예 1 내지 16, 비교예 1 내지 4 및 상기 화합물들과 유사형광을 나타내는 FITC, Cy5.5, Texas red를 대조군으로 하여 체내분포양상을 분석하였다. 구체적으로,사용된 동물모델로 누드마우스(6주령, 수컷)를 음성과 양성 대조군을 포함하여 각 실험군 당 3마리 이상 사용하였으며, 화합물 농도별(0.5 mg/kg)로 복강 내 투여(i.p) 후 시간대별(0.5, 1, 2, 3, 6, 12 및 24시간)로 체내분포양상을 분석하였다.
마우스 동물 모델에서의 형광 체내 분포 양상의 분석을 위하여 바이오이미징 장비인 IVIS 장비(IVIS Lumina XRMS Series III LMXRMS, PerkinElmer Inc.)를 이용하여 측정하였으며, 다양한 흡수 파장 및 형광 파장을 설정하여 이미징하였다.
본 발명에 따른 실시예 1 내지 16의 화합물들은 복강 내 투여 후 체내분포 분석에서 염료가 머리(뇌)쪽으로 이동하였으나, 비교예 1 내지 4의 화합물과 FITC, Cy5.5, Texas red은 머리쪽으로 이동하지 않았다. 상기와 같은 결과들을 통해 염료가 뇌로 이행되기 위해서는 인돌 구조를 가지며, 인돌와 아닐린 사이의 이중결합은 1개 또는 2개가 있는 것이 바람직한 것으로 확인되었다.
인돌 구조의 유무 및 인돌과 아닐린 사이의 이중결합 수에 따른 뇌이행 효과를 확인하였으며, 이를 하기 도 1에 나타내었다. 실시예 1, 2의 화합물은 복강 내 투여 후 뇌로 이동되었으나, 비교예 1 내지 4의 화합물들은 뇌로 이동되지 못하였다. 특히, 이중결합이 1개인 실시예 1의 화합물은 특히, 형광의 세기가 강하였으며, 뇌-혈관 장벽을 통과하여 뇌로의 이행정도가 우수하였고, 머리에서 집적되는 정도가 우수한 반면, 이중결합의 수가 증가될수록 뇌에 집적되는 양이 줄어들었으며, 이중결합의 수가 3인 비교예 1의 화합물은 뇌로 이동되지 못하였다.
하기 표 1은 실시예 1, 2 및 비교예 1 내지 4의 화합물에 대한 스크리닝 결과 및 유사형광체를 나타낸 결과이다.
| 장분 | 실시예 1 | 실시예 2 | 비교예 1 | 비교예 2 | 비교예 3 | 비교예 4 |
| λexmax(nm) | 609 | 382 | 615 | 425 | 531 | 493 |
| λemmax(nm) | 477 | 472.5 | 642 | 504.5 | 565 | 589 |
| 분자량(M.W.) | 370.47 | 396.5 | 422.54 | 500.59 | 526.12 | 552.66 |
| 유사형광체 | FITC | FITC | Cy5.5 | FITC | Cy5.5 | Texas red |
인돌의 치환기에 따른 효과를 확인하기 위하여 실시예 3 내지 5의 화합물을 농도별(1 mg/kg)로 마우스의 복강 내 투여(i.p)하고 3시간 뒤 측정한 IVIS 이미지를 하기 도 2에 나타내었다. 본 발명에 따른 [화학식 1]의 R4가 C3 - 7알킬체인 바람직하게는 아질산C3 - 7알킬체인이면, 뇌에 대한 집적도를 향상시키는 것으로 확인되었다.
시험예
2. X-
ray
이미징
분석
동일한 조건으로 X-Ray 이미징을 통하여 해부학적으로 본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물이 뇌 부분에 분포하는지 측정하였으며, 이를 하기 도 3에 나타내었다.
본 발명에 따른 실시예 1, 3 내지 5의 화합물은 모두, X-ray 이미지상 해부학적으로 머리(뇌) 부분에 분포된 것을 확인할 수 있다.
시험예
3.
ex
vivo
이미징을
통한 장기별 [화학식 1]의 화합물 분포 분석
IVIS 이미징 촬영후, 주요 장기를 적출하여 본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물의 장기 분포 정도를 확인하였다. 장기는 적출 후 즉시 형광 이미징을 하였다.
하기 도 4에 나타낸 바와 같이, ex vivo 이미징을 통해 대조군(solvent)에 비해 본 발명에 따른 실시예 1, 3 내지 5의 화합물이 뇌로 이행됨을 확인하였다.
상기 결과들은 본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물이 뇌-혈관 장벽을 통과하며, 뇌로 집적되어 뇌를 영상화하는데 유용하게 이용될 수 있음을 시사하며, 본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물은 뇌 영상화용 조영제 조성물로 이용이 가능하다.
Claims (8)
- 하기 [화학식 1]로 표시되는 뇌 영상화용 형광 염료:
[화학식 1]
상기 [화학식 1]에서,
R1은 C1 - 6알킬, 히드록시C1 - 6알킬 및 아질산C1 - 10알킬 중에서 선택되며,
R2는 수소, C1 - 6알킬, C1 - 6알콕시, -SO3 - 및 -SO3H 중에서 선택되고,
R3은 C1 - 6알킬이며,
R4는 C1 - 10알킬 또는 아질산C1 - 10알킬이고,
R5는 수소, C1 - 6알킬 및 -C(O)(CH2)mCH3 중에서 선택되며,
n은 0 또는 1이고
m은 0 내지 5의 정수이다. - 제1항에 있어서,
상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은
R1은 C2 - 5알킬, 히드록시C2 - 5알킬 및 아질산C2 - 7알킬 중에서 선택되며,
R2는 수소, C1 - 3알콕시, -SO3 - 및 -SO3H 중에서 선택되고,
R3은 C1 - 3알킬이며,
R4는 C1 -6알킬 또는 아질산C4 - 7알킬이고,
R5는 수소 또는 -C(O)(CH2)mCH3이며,
상기 R1 및 R4 중 적어도 하나는 아질산C2 - 7알킬이고,
n은 0 또는 1이고,
m은 0 내지 5의 정수인 것을 특징으로 하는 뇌 영상화용 형광 염료. - 제1항에 있어서,
상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 하기 화합물 1 내지 화합물 16 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 뇌 영상화용 형광 염료:
화합물 1:
화합물 2:
화합물 3:
화합물 4:
화합물 5:
화합물 6:
화합물 7:
화합물 8:
화합물 9:
화합물 10:
화합물 11:
화합물 12:
화합물 13:
화합물 14:
화합물 15:
화합물 16:
- 제1항에 있어서,
400 내지 650 nm의 가시광선 영역의 파장을 방출하는 것을 특징으로 하는 뇌 영상화용 형광 염료. - 하기 [화학식 2]의 화합물과 하기 [화학식 3]의 화합물을 유기용매하에서 반응시키는 단계;를 포함하는 [화학식 1]로 표시되는 뇌 영상화용 형광 염료의 제조방법:
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 1]
상기 [화학식 1] 내지 [화학식 3]에 있어서,
R1은 C1 - 6알킬, 히드록시C1 - 6알킬 및 아질산C1 - 10알킬 중에서 선택되며,
R2는 수소, C1 - 6알킬, C1 - 6알콕시, -SO3 - 및 -SO3H 중에서 선택되고,
R3은 C1 - 6알킬이며,
R4는 C1 -1 0알킬 또는 아질산C1 - 10알킬이고,
R5는 수소, C1 - 6알킬 및 -C(O)(CH2)mCH3 중에서 선택되며,
n은 0 또는 1이고
m은 0 내지 5의 정수이다. - 제5항에 있어서,
R1은 C2 - 5알킬, 히드록시C2 - 5알킬 및 아질산C2 - 7알킬 중에서 선택되며,
R2는 수소, C1 - 3알콕시, -SO3 - 및 -SO3H 중에서 선택되고,
R3은 C1 - 3알킬이며,
R4는 C1 -6알킬 또는 아질산C4 - 7알킬이고,
R5는 수소 또는 -C(O)(CH2)mCH3이며,
상기 R1 및 R4 중 적어도 하나는 아질산C2 - 7알킬이고,
n은 0 또는 1이고,
m은 0 내지 5의 정수인 것을 특징으로 하는 뇌 영상화용 형광 염료의 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 유기용매는 아세트산:무수아세트산 10:1 내지 1:10 (v/v) 혼합용매인 것을 특징으로 하는 뇌 영상화용 형광 염료의 제조방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 형광 염료를 유효성분으로 포함하는 뇌 영상화용 조영제 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160057366A KR101720288B1 (ko) | 2016-05-11 | 2016-05-11 | 뇌 영상용 염료 및 이의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020160057366A KR101720288B1 (ko) | 2016-05-11 | 2016-05-11 | 뇌 영상용 염료 및 이의 제조방법 |
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020065421A1 (en) * | 2000-11-28 | 2002-05-30 | Giuseppe Caputo | Process and method for the preparation of asymmetric monfunctionalised indocyanine labelling reagents and obtained compounds |
| US20110190618A1 (en) | 2008-10-02 | 2011-08-04 | Harry John Wadsworth | Imaging neuroinflammation |
| WO2014026079A2 (en) | 2012-08-10 | 2014-02-13 | Lantheus Medical Imaging, Inc. | Compositions, methods, and systems of the synthesis and use of imaging agents |
| WO2015011267A1 (en) | 2013-07-25 | 2015-01-29 | Ge Healthcare Limited | Imaging neurological disease |
-
2016
- 2016-05-11 KR KR1020160057366A patent/KR101720288B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
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