CN115947777A - 一种近红外二区荧光化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种近红外二区荧光化合物及其制备方法与应用。该近红外二区荧光化合物具有如式(Ⅰ)～式(Ⅷ)任一所示结构：

其中，R₁为生物标志物响应基团A或A‑B‑，B为自消除基团；R为靶向基团；n为0～50的整数。该近红外二区荧光化合物不仅具有高特异性和灵敏度，还具有较好的安全性、生物相容性和光学稳定性，该近红外二区荧光化合物及其药学上可接受的盐或溶剂化物、对映异构体、非对映异构体、互变异构体可用于制备荧光分子探针。

Description

一种近红外二区荧光化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，更具体地，涉及一种近红外二区荧光化合物及其制备方法与应用。

背景技术

荧光成像技术由于具有无创、快速响应和高灵敏度等优点，在生物医学传感和成像领域得到了广泛的应用。它可以直接显示各种生物分子之间的相互作用和疾病发展的病理过程，同时定量检测与疾病诊断相关的各项指标，并通过目标特异性荧光探针在体内进行精确治疗。然而，常规荧光成像在可见光谱范围内存在严重的组织散射、吸收和自荧光，导致低信噪比和组织穿透深度不足。与可见光区相比，近红外一区(NIR-I)(650～900nm)的荧光成像技术具有组织穿透能力强、自荧光强度低、组织损伤小等优点，在近十年来得到了广泛的应用，比如名称为一种近红外发光材料及其制备方法和应用的中国专利提供的近红外发光材料可发射650～900nm的近红外光。虽然大量的近红外一区荧光成像的研究有力地推动了生物学和医学的快速发展，但仍有许多问题需要克服。在此基础上发展起来的近红外二区(NIR-II)(900～1700nm)荧光成像技术由于其相比近红外一区荧光所具有的前所未有的穿透深度、对细胞大幅降低的光损伤以及在较长的波长内可以忽略的自荧光，已成为一个重要但具有挑战性的研究方向。

最近的研究表明，NIR-II荧光成像技术由于在具有高分辨率的同时减少了光的吸收及散射，增加了光的深穿透性，大幅提高了信噪比，从而显著提高荧光图像的保真度。近十年来，基于近红外二区的荧光生物成像在基础研究和临床前诊断和预后方面都显示出巨大的潜力，与无机造影剂和NIR-l相比，NIR-II型有机染料分子具有质量低、生物相容性好、分子设计灵活等优点，具有广阔的生物应用前景。因此，研发可修饰的近红外二区荧光化合物十分必要。

发明内容

本发明的首要目的是克服目前荧光成像的近红外二区荧光化合物的研究仍较缺乏的问题，提供一种近红外二区荧光化合物。

本发明的另一目的是提供上述近红外二区荧光化合物的制备方法。

本发明的另一目的是提供上述近红外二区荧光化合物及其药学上可接受的盐或溶剂化物、对映异构体、非对映异构体、互变异构体在制备荧光分子探针中的应用。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

一种近红外二区荧光化合物，具有如式(Ⅰ)～式(Ⅷ)所示结构：

其中，R₁为生物标志物响应基团A或A-B-，B为自消除基团；

R为靶向基团；n为0～50的整数。

本发明近红外二区荧光化合物以特定的主链结构作为发色团/荧光团，然后两端分别连接生物标志物响应基团和靶向基团，来得到生物标志物响应型荧光示踪剂。该近红外二区荧光化合物具有非对称的结构，相比传统的对称荧光化合物，其拥有一个光学可调的羟基和一个可以进行click反应的叠氮长链，共计两个修饰基团。相比一区荧光化合物，该近红外二区荧光化合物具有穿透深度大，抗干扰强，空间分辨率高等优点。其中，荧光团具有较好的量子产率，靶向基团可实现生物标志物响应型荧光示踪剂特异性靶向肿瘤细胞，生物标志物响应基团可被生物标志物激活发生分子结构和光学性能的改变，进而发出较强的荧光信号，并利用荧光成像技术实时监测；本发明提供的近红外二区荧光化合物不仅具有高特异性和灵敏度，还具有较好的安全性、生物相容性和光学稳定性。另外，该近红外二区荧光化合物可制备成多种给药方式(静脉注射，腹腔注射或者喷晒)的制剂。以静脉注射方式为例，本发明的近红外二区荧光化合物经静脉注射入后，在健康组织中由于组织没有发生病变，生物标志物表达含量非常低，生物标志物响应型荧光示踪剂则不会被生物标志物激活发生分子结构和光学性能的改变，因此正常组织种不会检测到明显的荧光信号；当出现癌变部位时，由于近红外二区荧光化合物具有高靶向性，能够高效的靶向至肿瘤组织，生物标志物响应型荧光示踪剂上的响应基团会被癌变部位高表达的肿瘤生物标志物切除并释放荧光信号，通过荧光成像可实时监测荧光信号，实现不同部位肿瘤组织实时检测和肿瘤手术引导以及转移淋巴结可视化识别，可更为精准地指导肿瘤及微小转移灶可视化切除，提高手术疗效和患者预后，有望为人类疾病诊断和治疗中提供一种新的辅助方法。

根据生物标志物的不同，R₁基团可进行对应选取。本发明在此也提供一系列生物标志物响应基团。

优选地，所述生物标志物响应基团A为

-SO₃H、

或

经研究，上述生物标志物响应基团与生物标志物之间的特异性激发对应关系如下：

优选地，所述自消除基团为

或

应当理解的是，自消除基团为

时，左侧连接位点与A-连接；自消除基团为

时，左侧连接位点与A-连接；自消除基团为

时，右侧连接位点与A-连接。

根据靶向部分的不同，R基团可进行对应选取。

优选地，所述靶向基团为

或

其中，0<n₁<100，0<n₂<100，R₂为氢或炔丙基。

优选地，所述近红外二区荧光化合物具有如下所示结构：

上述近红外二区荧光化合物的制备方法，包括如下步骤：

S1.式(8)所示结构的化合物8和式(12)所示结构的化合物12发生缩合反应，得到式(13)所示的化合物13；

或式(12)所示结构的化合物12和式(15)所示结构的化合物15发生缩合反应，得到式(32)所示的化合物32；

或式(12)所示结构的化合物12和式(17)所示结构的化合物17发生缩合反应，得到式(29)所示的化合物29；

或式(12)所示结构的化合物12和式(16)所示结构的化合物16发生缩合反应，得到式(34)所示的化合物34；

或式(12)所示结构的化合物12和式(18)所示结构的化合物18发生缩合反应，得到式(30)所示的化合物30；

或式(12)所示结构的化合物12和式(19)所示结构的化合物19发生缩合反应，得到式(28)所示的化合物28；

或式(21)所示结构的化合物21和式(8)所示结构的化合物8发生缩合反应，得到式(33)所示的化合物33；

或式(21)所示结构的化合物21和式(35)所示结构的化合物35发生缩合反应，得到式(31)所示的化合物31；

S2.化合物13发生取代反应得到式(14)所示的化合物14，化合物14和R-H发生取代反应，即得如式(Ⅳ)所示近红外二区荧光化合物；

或化合物32发生取代反应得到式(25)所示的化合物25，化合物25和R-H发生取代反应，即得如式(Ⅱ)所示近红外二区荧光化合物；

或化合物29发生取代反应得到式(22)所示的化合物22，化合物22和R-H发生取代反应，即得如式(Ⅴ)所示近红外二区荧光化合物；

或化合物34发生取代反应得到式(27)所示的化合物27，化合物27和R-H发生取代反应，即得如式(Ⅷ)所示近红外二区荧光化合物；

或化合物28发生取代反应得到式(20)所示的化合物20，化合物20和R-H发生取代反应，即得如式(Ⅶ)所示近红外二区荧光化合物；

或化合物30发生取代反应得到式(23)所示的化合物23，化合物23和R-H发生取代反应，即得如式(Ⅵ)所示近红外二区荧光化合物；

或化合物31发生取代反应得到式(24)所示的化合物24，化合物24和R-H发生取代反应，即得如式(Ⅰ)所示近红外二区荧光化合物；

或化合物33发生取代反应得到式(26)所示的化合物26，化合物26和R-H发生取代反应，即得如式(Ⅲ)所示近红外二区荧光化合物；

优选地，所述化合物8通过如下步骤制备得到：

S11.式(1)所示结构的化合物1经过烷基化反应得到(2)所示的化合物2；

S12.式(2)所示的化合物2发生取代反应得式(3)所示的化合物3；

S13.式(3)所示的化合物3和DMF发生缩合反应得式(4)所示的化合物4；

S14.式(4)所示的化合物4发生还原反应得式(5)所示的化合物5，备用；

S15.式(6)所示的化合物6发生溴代反应得到式(7)所示的化合物7，备用；

S16.化合物5和化合物7发生成环反应，得到化合物8。

更为优选地，S11中所述烷基化反应的温度为10～50℃，时间为3～24h，所述取代反应的溶剂为乙腈、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种。

更为优选地，S12所述取代反应的温度为10～50℃，时间为12～24h，所述取代反应的溶剂为乙腈、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种。

更为优选地，S13所述缩合反应的温度为0～50℃，时间为6～12h，所述缩合反应的溶剂为乙醚、甲苯或四氢呋喃中的一种或几种。

更为优选地，S14所述还原反应的温度为10～30℃，时间为1～6h，所述还原反应的溶剂为乙醇、异丙醇或甲醇中的一种或几种。

更为优选地，S15所述的溴代反应的反应温度为0～50℃，时间为3～12h。

更为优选地，S16所述成环反应的温度为10～30℃，时间为3～12h，所述成环反应的活化剂为碳酸钾、碳酸铯、醋酸钠或醋酸钾中的一种或几种，所述成环反应的溶剂为乙腈或N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种。

优选地，所述化合物12通过如下步骤制备得到：

S17.式(9)所示的化合物9和式(10)所示的化合物10发生取代反应，得到式(11)所示的化合物11；

S18.化合物11发生还原反应得到化合物12；

更为优选地，S17所述取代反应的温度为30～120℃，时间为8～24h，所述取代反应的溶剂为无溶剂、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺中的一种。

更为优选地，S8所述还原反应的温度为-20～0℃，时间为3～12h，所述还原反应的溶剂为乙腈或N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种。

优选地，步骤S1所述缩合反应的温度为30～120℃，时间为8～24h；步骤S2中所述取代反应的温度都为0～60℃，时间都为8～24h。

优选地，步骤S1所述缩合反应的溶剂为无溶剂、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺中的至少一种；步骤S2中所述取代反应的活化剂为碳酸钾、碳酸铯、醋酸钠或醋酸钾中的一种或几种，所述取代反应的溶剂为乙腈、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种。

上述近红外二区荧光化合物及其药学上可接受的盐或溶剂化物、对映异构体、非对映异构体、互变异构体在制备荧光分子探针中的应用。

优选地，所述药学上可接受的盐为盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、甲基硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、氨基硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、羟基乙酸盐、苯基乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、异丁酸盐、戊酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、丙烯酸盐、延胡索酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、水杨酸盐、对氨基水杨酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、庚酸盐、邻苯二甲酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、邻乙酰氧基苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟苯酸盐、甲氧基苯甲酸盐、扁桃酸盐、丹宁酸盐、甲酸盐、硬脂酸盐、抗坏血酸盐、棕榈酸盐、油酸盐、丙酮酸盐、双羟奈酸盐、丙二酸盐、月桂酸盐、戊二酸盐、谷氨酸盐、丙酸酯月桂硫酸盐(estolate)、甲磺酸盐、乙磺酸盐、2-羟基乙磺酸盐、苯磺酸盐、对氨基苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐(甲苯磺酸盐)和萘-2-磺酸盐。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供的近红外二区荧光化合物不仅具有高特异性和灵敏度，还具有较好的安全性、生物相容性和光学稳定性。

附图说明

图1为实施例1～11中各化合物的合成示意图；

图2为近红外二区荧光化合物的最低检测限数据；

图3为近红外二区荧光化合物在有和无次氯酸存在的情况下的荧光光谱变化；

图4为近红外二区荧光化合物在有和无次氯酸存在的情况下的紫外光谱变化；

图5为为近红外二区荧光化合物在不同活性物质下的选择性响应测试结果。

图6为各化合物的荧光发射波长汇总图。

图7近红外二区荧光化合物在肠炎小鼠模型中不同组的活体荧光成像和体外肠道成像；

图8为近红外二区荧光化合物在肠炎小鼠模型中的体外不同器官荧光成像；

图9为近红外二区荧光化合物在肠炎小鼠模型中不同组所收集的粪便的荧光成像结果。

具体实施方式

为了更清楚、完整的描述本发明的技术方案，以下通过具体实施例进一步详细说明本发明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明，可以在本发明权利限定的范围内进行各种改变。

除非特别说明、本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1化合物2的合成

将2,7-二羟基萘(1.6g，10mmol，化合物1)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中，然后加入无水碳酸钾(690mg，5mmol)在25℃下搅拌混合物24小时，然后往反应液加入水溶解固体后，用乙酸乙酯进行萃取。有机相用无水硫酸钠进行干燥后，在减压下蒸发溶剂，并使用石油醚/乙酸乙酯(20/1，v/v)作为洗脱剂通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到白色晶体化合物2(890mg，51％产率)。¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.66(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),7.05(d,J＝2.5Hz,1H),7.03–6.97(m,2H),6.95(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),3.91(s,3H).ESI-MS(m/z)：计算值：174.07，谱图显示[m+H]⁺：175.03。

实施例2化合物3的合成

将化合物2(890mg，5mmol)溶解于四氢呋喃(15mL)中，然后添加氢化钠(NaH)(720mg，30mmol)和氯甲基甲醚(400mg，5mmol)。反应混合物在0℃下搅拌12h，然后用无水乙醇淬灭，然后在真空下浓缩，并用水和乙酸乙酯进行萃取，在减压下蒸发溶剂，并使用石油醚/乙酸乙酯(15/1，v/v)作为洗脱剂通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到无色油状化合物3(927mg，84％产率)。¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.66(t,J＝9.3Hz,2H),7.31(d,J＝2.5Hz,1H),7.06(dd,J＝8.9,2.5Hz,2H),7.01(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),5.28(s,2H),3.90(s,3H),3.52(s,3H).ESI-MS(m/z)：计算值：218.25，谱图显示[m+H]⁺：219.44。

实施例3化合物4的合成

将化合物3(927mg，4.25mmol)溶解在20ml乙醚中，加入10ml正丁基锂和N,N-二甲基甲酰胺的混合物，反应混合物在25℃下搅拌6h，然后用饱和氯化铵溶液淬灭，然后在真空下浓缩，并用水和乙酸乙酯进行萃取，干燥后在减压下蒸发溶剂，并使用石油醚/乙酸乙酯(30/1，v/v)作为洗脱剂通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到淡黄色油状化合物4(419mg，46％产率)。¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ10.54(s,1H),8.31(s,1H),7.76(s,1H),7.38(s,1H),7.05(d,J＝7.2Hz,2H),5.40(s,2H),3.93(s,3H),3.57(s,3H).ESI-MS(m/z)：计算值：246.26，谱图显示[m+H]⁺：247.12。

实施例4化合物5的合成

将化合物4(419mg，1.7mmol)溶解在20ml异丙醇中，加入2ml浓盐酸，反应混合物在25℃下搅拌2h，反应结束后用饱和碳酸氢钠溶液中和，然后在真空下浓缩，并用水和乙酸乙酯进行萃取，干燥后在减压下蒸发溶剂，并使用石油醚/乙酸乙酯(30/1，v/v)作为洗脱剂通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到淡黄色固体化合物5(281mg，81％产率)。¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ10.48(s,1H),10.00(s,1H),8.04(s,1H),7.75(d,J＝9.0Hz,1H),7.15(s,1H),6.97(t,J＝4.0Hz,2H),3.94(s,3H).ESI-MS(m/z)：计算值：202.21，谱图显示[m+H]⁺：203.95。

实施例5化合物7的合成

将N,N-二甲基甲酰胺(730mg，10mmol)溶解在20ml二氯甲烷中，随后添加三溴化磷(PBr₃)(1.08g，4.0mmol)，在25℃下搅拌30min后，缓慢滴加环己酮(980mg，10mmol，化合物6)溶液，随后在25℃下搅拌反应8h，反应结束后用饱和碳酸氢钠溶液中和，然后在真空下浓缩，并用水和二氯甲烷进行萃取，有机相干燥后在减压下蒸发溶剂，无需进一步纯化，得到淡黄色油状化合物7(1364mg，72％产率)。¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ10.02(s,1H),2.75(td,J＝3.8,1.9Hz,2H),2.28(dd,J＝5.5,3.1Hz,2H),1.78–1.74(m,2H),1.69(dd,J＝5.8,2.0Hz,2H).ESI-MS(m/z)：计算值：189.05，谱图显示[m+H]⁺：190.55。

实施例6化合物8的合成

将化合物5(281mg，1.4mmol)溶解在20ml的N,N二甲基甲酰胺中，随后加入碳酸铯(910mg，2.8mmol)和化合物7(530mg，2.8mmol)在25℃下搅拌反应8h，然后将反应液加入水溶解固体后，用乙酸乙酯进行萃取。有机相用无水硫酸钠进行干燥后，在减压下蒸发溶剂，并使用石油醚/乙酸乙酯(15/1，v/v)作为洗脱剂通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到黄色晶体化合物8(218mg，54％产率)。¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ10.44(s,1H),7.67(d,J＝8.6Hz,1H),7.53(s,1H),7.36(s,1H),7.07–7.01(m,2H),6.80(s,1H),3.92(s,3H),2.62(d,J＝6.1Hz,2H),2.48(t,J＝6.4Hz,2H),1.76(t,J＝6.5Hz,2H).计算值：292.33，谱图显示[m+H]⁺：294.55。

实施例7化合物11的合成

将苯并吲哚酮(640mg，4mmol，化合物10)和1-叠氮-6-碘己烷(900mg，4mmol，化合物9)的混合物在50ml圆底烧瓶中，90℃无溶剂条件下加热12小时。将混合物冷却至室温并在乙醚中沉淀。粗产物用乙醚洗涤以获得化合物11(1220mg)，并在下一步中使用，无需进一步纯化。¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.80(d,J＝7.3Hz,1H),8.63(d,J＝8.0Hz,1H),8.30(t,J＝7.5Hz,2H),8.08(t,J＝7.7Hz,1H),7.93(t,J＝7.8Hz,1H),4.74(t,J＝7.6Hz,2H),3.36(s,3H),3.27(t,J＝6.6Hz,2H),2.10(p,J＝7.7Hz,2H),1.60(dd,J＝13.8,6.9Hz,4H),1.50(td,J＝9.2,8.2,5.5Hz,2H).LRMS(m/z)：计算值：294.1，谱图显示[m+H]⁺：295.2。

实施例8化合物12的合成

将化合物11(500mg，2mmol)和甲基氯化镁(5ml)的混合物放在装有5ml四氢呋喃溶剂的25ml圆底烧瓶中，0℃条件下搅拌反应12小时。然后向反应液中加入水进行淬灭，用二氯甲烷进行萃取，有机相用无水硫酸钠进行干燥后，在减压下蒸发溶剂，并使用石油醚/乙酸乙酯(1/1，v/v)作为洗脱剂通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到化合物12(400mg，产率81％)。¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.80(d,J＝7.3Hz,1H),8.63(d,J＝8.0Hz,1H),8.30(t,J＝7.5Hz,2H),8.08(t,J＝7.7Hz,1H),7.93(t,J＝7.8Hz,1H),4.74(t,J＝7.6Hz,2H),3.27(t,J＝6.6Hz,2H),2.10(p,J＝7.7Hz,2H),1.60(dd,J＝13.8,6.9Hz,4H),1.50(td,J＝9.2,8.2,5.5Hz,2H).LRMS(m/z)：计算值：293.1，谱图显示[m+H]⁺：294.2。

实施例9化合物13的合成

将化合物12(257mg，1mmol)溶解在20ml的二氯甲烷中，随后加入醋酸钠(246mg，3mmol)和化合物8(294mg，1mmol)在25℃下搅拌反应8h，然后向反应液中加入水溶解固体，用乙酸乙酯进行萃取。有机相用无水硫酸钠进行干燥后，在减压下蒸发溶剂，并使用二氯甲烷/甲醇(15/1，v/v)作为洗脱剂通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到化合物13。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆₎δ11.08(s,1H),10.20(s,1H),9.06(d,J＝14.4Hz,1H),8.75(d,J＝7.6Hz,1H),8.42(d,J＝8.1Hz,1H),8.06(dd,J＝7.7,7.4Hz,1H),7.95(d,J＝7.9Hz,1H),7.86–7.76(m,2H),7.64–7.57(m,1H),7.26–7.20(m,1H),7.08(d,J＝2.4Hz,1H),7.00–6.94(m,1H),6.86(d,J＝14.3Hz,1H),6.66–6.57(m,1H),4.50(t,J＝6.8Hz,2H),2.81(m,2H),2.30(m,4H),1.94–1.76(m,4H),1.64–1.33(m,6H).(254mg，69％产率)。ESI-MS(m/z)：计算值：554.68，谱图显示[m+H]⁺：555.49。

实施例10化合物14的合成

将化合物13(555mg，1mmol)和二甲氨基硫代甲酰氯(250mg，2mmol)的混合物在25mL圆底烧瓶中，二氯甲烷回流1小时，然后向反应液中加入水，用二氯甲烷进行萃取。有机相用无水硫酸钠进行干燥后，在减压下蒸发溶剂，得到化合物14，在下一步中使用，无需进一步纯化。¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.94(d,J＝7.4Hz,1H),8.13(d,J＝8.0Hz,1H),7.79(d,J＝8.0Hz,1H),7.76(d,J＝7.8Hz,1H),7.56(dd,J＝8.2,7.3Hz,1H),7.46(d,J＝7.3Hz,1H),4.35(t,J＝7.6Hz,2H),3.32(t,J＝6.6Hz,2H),1.92(m,4H),1.80(s,6H),1.47–1.36(m,4H).ESI-MS(m/z)：计算值：598.32，谱图显示[m+H]⁺：598.2。

实施例11近红外二区荧光化合物的合成

将化合物14(598.2mg,1mmol)和肠道炎症靶向多肽基团KPV(300mg,1mmol)的混合物加入到DMSO中，随后加入溴化亚铜(14.3mg,0.1mmol)，室温条件下反应过夜，然后向反应液中加入水，用1000mw的透析膜透析24h，得到深黄绿色产物，即近红外二区荧光化合物(700mg，65％产率)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.64(s,1H),8.87–7.75(m,14H),4.39(m,4H),4.13(s,2H),3.17–2.77(m,17H),2.63(m,7H),1.93(s,5H),1.57(m,10H),1.40(s,1H),1.20(m,J＝27.8,21.6Hz,5H),0.77(d,J＝39.7Hz,5H).计算值：1020.33，谱图显示[m+H]⁺：1020.25。

近红外二区荧光化合物的结构式如下：

其中，n＝4。

实施例1～11中各化合物的反应过程如图1。

实施例12

将化合物21(243mg，1mmol)溶解在20ml的二氯甲烷中，随后加入醋酸钠(278.7mg,3.4mmol)和化合物35(294mg，1mmol)在25℃下搅拌反应8h，然后向反应液中加入水溶解固体，用乙酸乙酯进行萃取。有机相用无水硫酸钠进行干燥后，在减压下蒸发溶剂，并使用二氯甲烷/甲醇(15/1，v/v)作为洗脱剂通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到化合物31。¹HNMR(400MHz,Methanol-d₄)δ8.47–8.31(m,1H),8.11(d,J＝7.9Hz,1H),7.71(s,1H),7.62(s,1H),7.49–7.44(m,1H),7.40(d,J＝7.5Hz,1H),7.26(m,2H),7.10(d,J＝9.5Hz,1H),7.04–6.91(m,1H),6.75(m,1H),6.59(d,J＝7.8Hz,1H),4.22(s,3H),2.88–2.66(m,2H),

2.08–1.97(m,2H),1.64–1.54(m,2H),1.28(s,6H)。(192mg，42％产率)。ESI-MS(m/z)：计算值：435.56，谱图显示[m+H]⁺：435.31。

参照实施例10和实施例11的反应条件，化合物31发生取代反应得到化合物24，化合物24再发生取代反应接上靶向基团，即得到近红外二区荧光化合物。

实施例13

将化合物12(496.8mg,1.7mmol)溶解在20ml的二氯甲烷中，随后加入醋酸钠(278.7mg,3.4mmol)和化合物15(296.6mg,1.7mmol)在25℃下搅拌反应8h，然后向反应液中加入水溶解固体，用乙酸乙酯进行萃取。有机相用无水硫酸钠进行干燥后，在减压下蒸发溶剂，并使用二氯甲烷/甲醇(15/1，v/v)作为洗脱剂通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到化合物32。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.88(d,J＝14.0Hz,1H),8.60(d,J＝7.4Hz,1H),8.33(d,J＝8.2Hz,1H),8.01(dd,J＝7.1,7.7Hz,1H),7.85(dd,J＝4.0Hz,4.2Hz,1H),7.75–7.66(m,3H),7.54(d,J＝8.5Hz,1H),7.12(s,1H),6.91(d,J＝6.0Hz,1H),6.72(d,J＝14.3Hz,1H),4.39(s,3H),1.83(m,4H),1.50(m,2H)。(325.6mg，41％产率)。ESI-MS(m/z)：计算值：393.48，谱图显示[m+H]⁺：393.20。

参照实施例10和实施例11的反应条件，化合物32发生取代反应得到化合物25，化合物25再发生取代反应接上靶向基团，即得到近红外二区荧光化合物。

实施例14

将化合物21(597.1mg,2.05mmol)溶解在20ml的二氯甲烷中，随后加入醋酸钠(340.44mg,4.10mmol)和化合物8(496.1mg,2.05mmol)在25℃下搅拌反应8h，然后向反应液中加入水溶解固体，用乙酸乙酯进行萃取。有机相用无水硫酸钠进行干燥后，在减压下蒸发溶剂，并使用二氯甲烷/甲醇(15/1，v/v)作为洗脱剂通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到化合物33。¹HNMR(400MHz,Methanol-d₄)δ8.81(d,J＝15.1Hz,1H),8.48(s,1H),7.86(s,1H),7.80(d,J＝9.0Hz,1H),7.71(d,J＝8.5Hz,1H),7.63(d,J＝7.4Hz,1H),7.60–7.56(m,1H),7.52(s,1H),7.36(s,1H),7.13(d,J＝2.4Hz,1H),7.08(m,1H),6.59(d,J＝15.3Hz,1H),3.93(s,3H),2.80–2.78(m,2H),2.73–2.68(m,2H),1.93–1.89(m,2H),1.88(s,6H)。(236.6mg，32％产率)。ESI-MS(m/z)：计算值：435.56，谱图显示[m+H]⁺：434.92。

参照实施例10和实施例11的反应条件，化合物33发生取代反应得到化合物26，化合物26再发生取代反应接上靶向基团，即得到近红外二区荧光化合物。

实施例15

将化合物12(144.77mg，0.362mmol)溶解在20ml的二氯甲烷中，随后加入醋酸钠(59.37mg,0.724mmol)和化合物16(65.96mg，0.362mmol)在25℃下搅拌反应8h，然后向反应液中加入水溶解固体，用乙酸乙酯进行萃取。有机相用无水硫酸钠进行干燥后，在减压下蒸发溶剂，并使用二氯甲烷/甲醇(15/1，v/v)作为洗脱剂通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到化合物34。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.81(s,1H),8.94(d,J＝7.2Hz,1H),8.62(d,J＝15.2Hz,1H),8.47(d,J＝8.1Hz,1H),8.08(d,J＝8.3Hz,1H),8.02–7.92(m,2H),7.81(d,J＝7.1Hz,1H),7.75(d,J＝8.6Hz,1H),7.47(d,J＝15.7Hz,1H),7.33(d,J＝3.8Hz,1H),7.24(s,1H),7.08(d,J＝21.0Hz,3H),6.96(s,1H),6.72(d,J＝15.7Hz,1H),6.60(d,J＝8.8Hz,1H),6.49(s,1H),3.97(s,3H),2.36(m,4H),1.72(m,2H)。(69.69mg，35％产率)。ESI-MS(m/z)：计算值：551.69，谱图显示[m+H]⁺：551.37。

参照实施例10和实施例11的反应条件，化合物34发生取代反应得到化合物27，化合物27再发生取代反应接上靶向基团，即得到近红外二区荧光化合物。

实施例16

将化合物12(257mg，1mmol)溶解在20ml的二氯甲烷中，随后加入醋酸钠(246mg，3mmol)和化合物17(294mg，1mmol)在25℃下搅拌反应8h，然后向反应液中加入水溶解固体，用乙酸乙酯进行萃取。有机相用无水硫酸钠进行干燥后，在减压下蒸发溶剂，并使用二氯甲烷/甲醇(15/1，v/v)作为洗脱剂通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到化合物29。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆₎δ11.08(s,1H),10.20(s,1H),9.06(d,J＝14.4Hz,1H),8.75(d,J＝7.6Hz,1H),8.42(d,J＝8.1Hz,1H),8.06(dd,J＝7.7,7.4Hz,1H),7.95(d,J＝7.9Hz,1H),7.96–7.88(m,1H),7.84–7.77(m,2H),7.26–7.20(m,1H),7.08(d,J＝2.4Hz,1H),7.00–6.94(m,1H),6.86(d,J＝14.3Hz,1H),6.66–6.57(m,1H),4.50(t,J＝6.8Hz,2H),2.81(m,2H),2.30(m,4H),1.94–1.76(m,4H),1.64–1.33(m,6H).(184mg，42％产率)。ESI-MS(m/z)：计算值：554.68，谱图显示[m+H]⁺：555.49。

参照实施例10和实施例11的反应条件，化合物29发生取代反应得到化合物22，化合物22再发生取代反应接上靶向基团，即得到近红外二区荧光化合物。

实施例17

将化合物12(257mg，1mmol)溶解在20ml的二氯甲烷中，随后加入醋酸钠(246mg，3mmol)和化合物18(294mg，1mmol)在25℃下搅拌反应8h，然后向反应液中加入水溶解固体，用乙酸乙酯进行萃取。有机相用无水硫酸钠进行干燥后，在减压下蒸发溶剂，并使用二氯甲烷/甲醇(15/1，v/v)作为洗脱剂通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到化合物30。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆₎δ11.54(s,1H),10.20(s,1H),9.06(d,J＝14.4Hz,1H),8.75(d,J＝7.6Hz,1H),8.42(d,J＝8.1Hz,1H),8.06(dd,J＝7.7,7.4Hz,1H),7.95(d,J＝7.9Hz,1H),7.74–7.66(m,1H),7.58–7.47(m,2H),7.26–7.20(m,1H),7.08(d,J＝2.4Hz,1H),7.00–6.94(m,1H),6.86(d,J＝14.3Hz,1H),6.66–6.57(m,1H),4.50(t,J＝6.8Hz,2H),2.81(m,2H),2.30(m,4H),1.94–1.76(m,4H),1.64–1.33(m,6H).(200mg，48％产率)。ESI-MS(m/z)：计算值：554.68，谱图显示[m+H]⁺：555.49。

参照实施例10和实施例11的反应条件，化合物30发生取代反应得到化合物23，化合物23再发生取代反应接上靶向基团，即得到近红外二区荧光化合物。

实施例18

将化合物12(257mg，1mmol)溶解在20ml的二氯甲烷中，随后加入醋酸钠(246mg，3mmol)和化合物19(294mg，1mmol)在25℃下搅拌反应8h，然后向反应液中加入水溶解固体，用乙酸乙酯进行萃取。有机相用无水硫酸钠进行干燥后，在减压下蒸发溶剂，并使用二氯甲烷/甲醇(15/1，v/v)作为洗脱剂通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到化合物28。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆₎δ11.36(s,1H),10.20(s,1H),9.06(d,J＝14.4Hz,1H),8.75(d,J＝7.6Hz,1H),8.42(d,J＝8.1Hz,1H),8.06(dd,J＝7.7,7.4Hz,1H),7.95(d,J＝7.9Hz,1H),7.86–7.76(m,1H),7.64–7.57(m,1H),7.26–7.20(m,2H),7.08(d,J＝2.4Hz,1H),7.00–6.94(m,1H),6.86(d,J＝14.3Hz,1H),6.66–6.57(m,1H),4.50(t,J＝6.8Hz,2H),2.81(m,2H),2.30(m,4H),1.94–1.76(m,4H),1.64–1.33(m,6H).(150mg，39％产率)。ESI-MS(m/z)：计算值：554.68，谱图显示[m+H]⁺：555.49。

参照实施例10和实施例11的反应条件，化合物28发生取代反应得到化合物20，化合物20再发生取代反应接上靶向基团，即得到近红外二区荧光化合物。

性能测试

1、光谱测试：

将10μM的实施例11的近红外二区荧光化合物溶液与次氯酸钠在37℃的超纯水中反应。反应后测定溶液的紫外可见光谱和荧光光谱。采用IVIS系统采集荧光图像，激发波长为808±10nm，发射波长为1080±10nm，采集时间为0.1s。

测试结果如图2，从图2经过计算可知，本发明的近红外二区荧光化合物的检测限约为20nM，具有十分高的灵敏性。

测试结果如图3，从图3可知，本发明的近红外二区荧光化合物的最大发射波长在1080nm，近红外二区荧光化合物溶液与次氯酸钠溶液反应后的最大吸收波长1080nm有明显增长，增长倍数达到6倍。

测试结果如图4，从图4可知，本发明的近红外二区荧光化合物的最大吸收波长在690nm，近红外二区荧光化合物溶液与次氯酸钠溶液反应后的最大吸收波长在800nm。

测试结果如图5所示，从图5中可知，本发明的近红外二区荧光化合物的具有高度的选择性。

将实施例9得到的化合物13、实施例12得到的化合物31、实施例13得到的化合物32、实施例14得到的化合物33、实施例15得到的化合物34、实施例16得到的化合物29、实施例17得到的化合物30和实施例18得到的化合物28分别加入到ep管中用二氯甲烷配置成1ml标准溶液(10μM,pH7.4)。在37℃下分别用600nm波长的光线进行激发，测定各自的标准溶液在600～1700nm下的荧光光谱，测试结果如图6所示，从图6中可知，各化合物在波长为900～1700nm的区间内可以检测到荧光信号，相应地，当接上生物标志物响应基团和靶向基团得到近红外二区荧光化合物后，其在在波长为900～1700nm的区间内也可以检测到荧光信号。

2、模型成像

肠炎小鼠模型的建立：随机选取Balb/c裸鼠，将含3％DSS的水溶液作为饮用水，连续喂养10天后进行影像学检查。

肠炎小鼠模型中的实时体内NIRF成像：

对于肠炎小鼠模型，在DSS诱导小鼠肠炎10天后，再静脉注射15(10μmol/kg)后6小时进行实时NIRF成像。使用IVISspectrumCT系统采集荧光图像，激发波长为808±10nm，发射波长为1080±10nm，采集时间为1s。小鼠在注射实施例11的近红外二区荧光化合物6小时后被安乐死，处死后对小鼠切除的器官进行成像。

测试结果如图7，8，从图7，8可知，近红外二区荧光化合物在体内对炎症部位具有很好的响应性，相比正常小鼠，肠炎小鼠体内器官的荧光强度明显增加，表明该近红外二区荧光化合物在活体成像方面具有高选择性，高灵敏度，高空间分辨率的优点。

测试结果如图9所示，从图9中可知，近红外二区荧光化合物在被代谢进入到粪便的过程之中的荧光强度与肠炎小鼠炎症的严重程度相对应，说明该近红外二区荧光化合物的代谢稳定性，性能优异。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种近红外二区荧光化合物，其特征在于，具有如式(Ⅰ)～式(Ⅷ)任一所示结构：

其中，R₁为生物标志物响应基团A或A-B-，B为自消除基团；

R为靶向基团；n为0～50的整数。

2.根据权利要求1所述近红外二区荧光化合物，其特征在于，所述生物标志物响应基团A为

3.根据权利要求1所述近红外二区荧光化合物，其特征在于，所述自消除基团为

4.根据权利要求1所述近红外二区荧光化合物，其特征在于，所述靶向基团为

其中，0<n₁<100，0<n₂<100，R₂为氢或炔丙基。

5.根据权利要求1所述近红外二区荧光化合物，其特征在于，所述近红外二区荧光化合物具有如下所示结构：

6.权利要求1～5任一所述近红外二区荧光化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.式(8)所示结构的化合物8和式(12)所示结构的化合物12发生缩合反应，得到式(13)所示的化合物13；

或式(12)所示结构的化合物12和式(15)所示结构的化合物15发生缩合反应，得到式(32)所示的化合物32；

或式(12)所示结构的化合物12和式(17)所示结构的化合物17发生缩合反应，得到式(29)所示的化合物29；

或式(12)所示结构的化合物12和式(16)所示结构的化合物16发生缩合反应，得到式(34)所示的化合物34；

或式(12)所示结构的化合物12和式(18)所示结构的化合物18发生缩合反应，得到式(30)所示的化合物30；

或式(12)所示结构的化合物12和式(19)所示结构的化合物19发生缩合反应，得到式(28)所示的化合物28；

或式(21)所示结构的化合物21和式(8)所示结构的化合物8发生缩合反应，得到式(33)所示的化合物33；

或式(21)所示结构的化合物21和式(35)所示结构的化合物35发生缩合反应，得到式(31)所示的化合物31；

S2.化合物13发生取代反应得到式(14)所示的化合物14，化合物14和R-H发生取代反应，即得如式(Ⅳ)所示近红外二区荧光化合物；

或化合物32发生取代反应得到式(25)所示的化合物25，化合物25和R-H发生取代反应，即得如式(Ⅱ)所示近红外二区荧光化合物；

或化合物29发生取代反应得到式(22)所示的化合物22，化合物22和R-H发生取代反应，即得如式(Ⅴ)所示近红外二区荧光化合物；

或化合物34发生取代反应得到式(27)所示的化合物27，化合物27和R-H发生取代反应，即得如式(Ⅷ)所示近红外二区荧光化合物；

或化合物28发生取代反应得到式(20)所示的化合物20，化合物20和R-H发生取代反应，即得如式(Ⅶ)所示近红外二区荧光化合物；

或化合物30发生取代反应得到式(23)所示的化合物23，化合物23和R-H发生取代反应，即得如式(Ⅵ)所示近红外二区荧光化合物；

或化合物31发生取代反应得到式(24)所示的化合物24，化合物24和R-H发生取代反应，即得如式(Ⅰ)所示近红外二区荧光化合物；

或化合物33发生取代反应得到式(26)所示的化合物26，化合物26和R-H发生取代反应，即得如式(Ⅲ)所示近红外二区荧光化合物；

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述化合物8通过如下步骤制备得到：

S11.式(1)所示结构的化合物1经过烷基化反应得到(2)所示的化合物2；

S12.式(2)所示的化合物2发生取代反应得式(3)所示的化合物3；

S13.式(3)所示的化合物3和DMF发生缩合反应得式(4)所示的化合物4；

S14.式(4)所示的化合物4发生还原反应得式(5)所示的化合物5，备用；

S15.式(6)所示的化合物6发生溴代反应得到式(7)所示的化合物7，备用；

S16.化合物5和化合物7发生成环反应，得到化合物8。

8.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述化合物12通过如下步骤制备得到：

S17.式(9)所示的化合物9和式(10)所示的化合物10发生取代反应，得到式(11)所示的化合物11；

S18.化合物11发生还原反应得到化合物12；

9.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，步骤S1所述缩合反应的温度为30～120℃，时间为8～24h；

步骤S2中所述取代反应的温度都为0～60℃，时间都为8～24h。

10.权利要求1～5任一所述近红外二区荧光化合物及其药学上可接受的盐或溶剂化物、对映异构体、非对映异构体、互变异构体在制备荧光分子探针中的应用。

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