KR101707107B1 - 리퀴리티제닌을 활성 성분으로 포함하여 약학적, 화장품적으로 우수하며 다양한 기능성을 보이는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 리퀴리티제닌을 활성 성분으로 포함하여 약학적 내지 화장품적으로 다양한 생리 활성을 보이는 조성물에 관한 것으로서, 활성 성분으로 포함되는 리퀴리티제닌이 항아토피, 항염, 항알러지 활성을 보이며, 또한 피부 세포의 증식에 효과가 있어, 본 발명에 따른 조성물은 아토피, 피부의 염증성 질환, 알러지에 의한 피부 질환, 피부의 상처 및 튼살 등을 치료하고 증상을 개선하는데 매우 우수한 약학적 조성물 및 화장품 조성물이다.

Description

리퀴리티제닌을 활성 성분으로 포함하여 약학적, 화장품적으로 우수하며 다양한 기능성을 보이는 조성물{Composition for multi-functional activation comprising Liquiritigenin}
본 발명은 리퀴리티제닌을 활성 성분으로 포함하여 약학적 내지 화장품적으로 다양한 생리 활성을 보이는 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 리퀴리티제닌을 활성 성분으로 아토피 치료 및 증상 개선, 염증성 질환, 특히 피부의 염증성 질환 치료 및 증상 개선, 피부 세포 증식에 의한 상처 치유와 튼살 개선 효과를 보이는 우수한 약학적 조성물 또는 화장품 조성물에 관한 것이다.
감초는 콩과의 다년생 초본으로 목질로 덩굴져 있는 땅속 줄기와 땅속 깊이 길게 뻗어 있는 뿌리를 가졌다.
위로 뻗어난 1m 가량의 줄기에는 9 ~ 17개의 길고 둥근 잎을 가진 잎줄기들이 많이 있다. 이용 부위는 3년 된 뿌리와 땅속의 줄기이며 약성은 보통이고 맛은 단 것이 특징이다.
만주감초는 중국동북부, 화북부 및 서북부, 몽고, 시베리아에 분포하고 있으며 스페인감초는 남유럽, 중앙아시아, 중국에 분포되어 있으며 변종으로 러시아감초(G. glabra var . typica), 페르시아감초(G. glabra var . glanduliferra) 등이 있다. 러시아감초는 스페인, 이탈리아에 야생하고 있으며 스페인, 독일, 영국, 시리아에서 재배되며, 페르시아감초는 러시아, 소아시아, 시리아, 중국 남부에 분포한다.
중국에서 재배되는 감초의 종류는 만주감초, 스페인감초, 창과감초를 포함해 8종이 있으며, 주로 재배되는 것은 만주감초, 유럽감초, 창과감초이다.
감초는 의약품과 담배 및 식료품으로 광범위하게 사용되고 있으며, 거담, 변통, 경련 진정, 근육 완화 등의 활성이 있음은 물론 다른 약품 조제시 맛을 내기 위해 많이 쓰이기 때문에 가장 많이 이용되는 약초 중의 하나이다.
현재까지 밝혀진 감초 성분은 트리터페노이드 유도체(triterpenoid derivatives), 플라본류(flavones) 및 이소플라본류(isoflavones)의 세 계열로 구분되며, 트리터페노이드 계열로는 글리시리진(glycyrrhizin), 8-베타-글리시레티닉 애시드(8-β-glycyrrhetinic acid), 리쿼릭 애시드(liquoric acid), 글리시레톨(glycyrrhetol), 글라브릭 애시드(glabric acid) 등이 동정되었고, 플라본 계열로는 이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin), 네오리퀴리틴(neoliquiritin), 네오이소리퀴리틴(neoisoliquiritin), 트렌스-이소리퀴리티제닌 4'-베타-D-글루코피라노사이드(trans-isoliquiritigenin 4'-β-D-glucopyranoside), 사포네레틴(saponeretin), 람노리퀴리틴(rhamnoliquiritin), 리퀴리틴(liquiritin), 리퀴리틴 아피오사이드(liquiritin apioside), 리퀴리티제닌(liquiritigenin), 이소리퀴리틴(isoliquiritin), 이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin) 등이 보고되었고, 이소플라본 계열로는 리코리콘(licoricone), 리코칼콘 A와 B(licochalcone A & B), 글리세스트론(glycestrone), 글리시롤(glycyrol), 5-O-메틸글리시롤(5-O-methylglycyrol), 이소글리시롤(isoglycyrol) 외에 베투릴 애시드(betulic acid), 리코리딘(licoridin), 7-아세톡시-2-메틸이소플라본(7-acetoxy-2-methyl-isoflavone), 7-메톡시-2-메틸이소플라본(7-methoxy-2-methylisoflavone), 7-히드록시-2-메틸이소플라본(7-hydroxy-2-methylisoflavone) 등의 구조가 규명되었다.
대한민국 특허공개공보 제 10-2001-0093861호, 대한민국 특허공개공보 제10-2003-0026663호, 대한민국 특허공개공보 제10-2002-0015588호 및 대한민국 공개특허공보 제 10-2005-0075115호의 내용을 보면, 이러한 감초의 추출물은 다른 식물 추출물과 함께 사용되어 피부 미백 효과가 있는 것으로 나타나 있다.
그러나 감초 추출물 중에서 어떤 성분이 피부 미백 효과에 관여하는지 등은 전혀 알려져 있지 않으며, 또한 소량 함유(0.02~0.1%)되어 있는 리퀴리티제닌이 피부 질환 및 피부 미용에 어떠한 효과를 지니고 있는 지에 대해서도 전혀 개시된 바가 없습니다.
1.대한민국 특허공개공보 제 10-2001-0093861호 2. 대한민국 특허공개공보 제10-2003-0026663호 3. 대한민국 특허공개공보 제10-2002-0015588호 4. 대한민국 공개특허공보 제 10-2005-0075115호
따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 상기 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은 리퀴리티제닌을 다양한 기능성을 규명하고 규명된 기능에 따른 약학적 조성물 및 화장품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 기술과 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은
약학적으로 허용된 담체 및 활성 성분으로 리퀴리티제닌을 포함하여 항아토피 활성, 항염 활성, 항알러지 활성, 피부 세포 증식에 의한 피부 상처 치유 및 피부 튼살 개선 효과를 나타내는 것을 특징으로 약학적 조성물 또는 화장품 조성물을 제공한다.
활성 성분으로 포함되는 리퀴리티제닌이 항아토피, 항염, 항알러지 활성을 보이며, 또한 피부 세포의 증식에 효과가 있어, 본 발명에 따른 조성물은 아토피, 피부의 염증성 질환, 알러지에 의한 피부 질환, 피부의 상처 및 튼살 등을 치료하고 증상을 개선하는데 매우 우수한 약학적 조성물 또는 화장품 조성물이며, 또한 본 발명에 따른 조성물은 활성 성분이 천연물의 추출물이기 때문에 세포 독성 등의 부작용은 없는 매우 유용한 조성물이다.
도 1은 본 발명에 따른 조성물의 튼살 개선 효과에 실험 결과 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 조성물의 iNOS, COX-2, NF-kB의 발현 억제 결과 도면이다.
이하 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 실시예를 통하여 상세하게 설명하기로 한다. 하기 실시예들은 본 발명에 따른 조성물 중에서 활성 성분으로 포함되는 리퀴리티제닌의 독성 및 다양한 활성을 입증하기 위한 것이다.
1. 각질형성세포에서의 세포독성평가
● 실험 방법
- 세포 배양
Human keratinocyte cell line인 HaCaT cell을 1% antibiotic 와 10% fetal bovine serum 이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 3일에 한번 씩 계대 배양을 실시하였다.
- 세포 생존률 측정 ( MTT 분석)
시료가 세포의 성장에 미치는 영향을 측정하기 위하여 MTT 분석을 수행 하였다. 대사가 왕성한 살아있는 세포는, 세포 내 mitochondria의 탈 수소 효소작용에 의하여 수용성의 노란색인 3-(4,5-dimethylthiaxo-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide를 환원시켜 자주색을 띠는 비수용성 formazan을 형성한다.
HaCaT cell를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 3.0 × 105 cells/㎖로 96 well plate에 넣고 18시간 배양 후 각 시료 농도별로 처리하고 24시간 배양하였다. 이후 MTT 용액 50 ㎕를 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다. 배양 배지를 완전히 제거하고 dimethylsulfoxide를 200 ㎕를 가하여 침전물을 완전히 용해시킨 후, microplate reader 를 사용하여 540 nm 흡광도를 측정하였다. 각 시료 군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포생장률을 평가하였다.
● 실험 결과
Human keratinocyte인 HaCaT cell을 24 well plate에 3.0 * 105 cells/well으로 24시간 배양하였다. 이후 Liquiritigenin을 400 ㎍/㎖ 이하의 농도로 처리하여 24시간 배양한 후 MTT 분석을 이용하여 세포 생존율을 확인한 결과 200 ㎍/㎖ 이하의 농도범위에서 100%의 생존율을 보여 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였다(표 1 참조).
sample Cell viability (%)
- 100


Liquiritigenin
(㎍/㎖)		 6.25 101.2 ± 0.03
12.5 102.0 ± 0.1
25 100.5 ± 0.01
50 100.8 ± 0.05
100 101.5 ± 0.05
200 100.2 ± 0.05
400 8.6 ± 0.08
2. 항아토피 효능 평가
1) 염증성 chemokines ( TARC , MDC ) 생성 억제 활성 측정
● 실험방법
- 세포배양
Human keratinocyte cell line인 HaCaT cell을 한국 세포주 은행으로부터 구입하였으며, 1% antibiotic 과 10% fetal bovine serum 이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 3일에 한번 씩 계대 배양을 실시하였다.
- 염증성 chemokines ( TARC , MDC ) 생성 억제 활성 측정
HaCaT cell을 3.0 * 105 cells/㎖로 24 well plate에 18시간 전 배양하고, 시료를 농도별로 준비한 후 준비된 시료에 IFN-γ 와 TNF-α 를 각각 10 ng/㎖ 농도로 혼합하여 cell에 동시에 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한다. 이후 배양액 1.5 ㎖를 tube에 옮겨 원심 분리하여 얻어진 상층액의 chemonkines 합성량을 측정한다. 모든 시료는 정량 전까지 냉동보관 한다. 염증성 chemokines는 Human enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선의 r 2 값은 0.99 이상이었다.
● 실험결과
아토피 피부염 환자에서 TARC의 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다. Human keratinocyte인 HaCaT cell을 이용하여 Liquiritigenin이 TARC의 발현에 영향을 미치는지 확인해 보았다. TNF-α, IFN-γ 단독 처리군을 통해 TARC의 발현이 유도됨을 확인하였고, Liquiritigenin을 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖로 처리하였을 때 TNF-α, IFN-γ 단독 처리군과 비교하여 TARC의 발현을 100%, 96% 억제하는 것과 농도의존적인 것을 확인하였다. 이로서 Liquiritigenin에 대하여 높은 수준의 TARC 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다(표 2 참조).
Sample TARC production (%)
- 0
TNF-α (10 ng/㎖) + IFN-γ (10 ng/㎖) 100

TNF-α (10 ng/㎖) + IFN-γ (10 ng/㎖) +
Liquiritigenin (㎍/㎖)		 6.25 100.3 ± 0.05
12.5 95.5 ± 0.3
25 70.9 ± 0.08
50 40.6 ± 0.1
100 4.2 ± 0.2
200 0.0 ± 0.03
Human keratinocyte인 HaCaT cell을 이용하여 Liquiritigenin이 아토피 피부염을 유발하는 것으로 알려진 중요 케모카인 중 하나인 MDC의 발현을 억제하는지 확인해 보았다. TNF-α와 IFN-γ를 단독 처리군을 통해 MDC의 발현이 유도됨을 확인하였고, Liquiritigenin을 200 ㎍/㎖로 처리하였을 때 MDC의 발현을 100% 억제하였고 100㎍/㎖ 에서는 67.4% 로 억제함으로서 농도의존적으로 유의성 있는 결과를 확인하였다. 이로서 Liquiritigenin에 대하여 높은 수준의 MDC 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다(표 3 참조).
Sample MDC production (%)
- 0
TNF-α (10 ng/㎖) + IFN-γ (10 ng/㎖) 100
TNF-α (10 ng/㎖) + IFN-γ (10 ng/㎖) +
Liquiritigenin (㎍/㎖)		 6.25 99.7 ± 0.2
12.5 99.8 ± 0.09
25 99.5 ± 0.1
50 97.2 ± 0.5
100 32.6 ± 0.03
200 0.0 ± 0.05
2) 면역 세포에서의 염증성 cytokine ( IL -2) 발현 억제 활성 측정
● 실험 방법
- 세포 배양
사람의 림프구 T 세포인 Jurkat T cell 을 1% antibiotic 와 10% fetal bovine serum 이 함유된 RPMI medium 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 3일에 한번 씩 계대 배양을 실시하였다.
- 염증성 cytokine ( IL -2) 생성 억제 활성 측정
Jurkat T cell을 1.0 * 105 cells/㎖로 24 well plate에 18시간 전 배양하고, PMA (1 ㎍/㎖)와 A23187 (1 μM) 과 시료 용액을 농도별로 넣은 후 6시간 배양한다. 이후 세포 배양 배지를 원심 분리하여 얻어진 상층액의 IL-2 발현 억제 활성을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 냉동보관 하였다. IL-2 발현량은 Human enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선의 r 2 값은 0.99 이상이었다.
● 실험 결과
사람의 림프구 T 세포인 Jurkat T cell을 1.0 * 105 cells/㎖로 24 well plate에 18시간 배양한 뒤 단독 처리군 PMA와 A23187를 통하여 IL-2의 발현이 유도됨을 확인할 수 있었다. Liquiritigenin 또한 PMA와 A23187를 6시간 동안 처리하여 IL-2 발현량을 확인한 결과 200 ㎍/㎖의 농도에서 62.4% 억제하여 우수한 억제효과와 농도의존적인 억제효과가 나타냄을 확인하였다(표 4 참조).
Sample IL -2 production (%)
- 0
PMA (1 ㎍/㎖) + A23187 (1 μM) 100
PMA (1 ㎍/㎖) + A23187 (1μM) +
Liquiritigenin (㎍/㎖)		 6.25 101.6 ± 0.03
12.5 75.7 ± 0.1
25 60.8 ± 0.06
50 40.9 ± 0.02
100 38.9 ± 0.5
200 37.6 ± 0.3
3) 비만세포에서의 염증성 cytokine ( TNF -α) 발현 억제 활성
● 실험 방법
- 세포 배양
비만 세포인 RBL-2H3 cell 을 1% antibiotic 와 10% fetal bovine serum 이 함유된 DMEM medium 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 3일에 한번 씩 계대 배양을 실시하였다.
- 염증성 cytokine ( TNF -α) 생성 억제 활성 측정
비만 세포인 RBL-2H3 cell을 2.0 * 105 cells/㎖의 밀도로 24 well plate에 18시간 전 배양하고 PMA (1 ㎍/㎖)와 A23187 (1 μM), 시료용액을 농도별로 넣은 후 24시간 배양한다. 이후 세포 배양 배지를 원심 분리하여 얻어진 상층액의 염증성 cytokine 합성량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 냉동보관 하였다. 염증성 cytokine는 rat enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선의 r 2 값은 0.99 이상이었다.
● 실험 결과
아토피 개선 또는 치료의 효능을 확인하기 위해 염증성 cytokine 중 하나인 TNF-α의 발현에 미치는 영향을 확인해 보았다. mast cell인 RBL-2H3 cell을 2.0 * 105 cells/㎖로 24 well plate에 18시간 배양한 뒤 단독처리군 PMA와 A23187에 의해 TNF-α의 발현이 유도됨을 확인 할 수 있었다. Liquiritigenin과 PMA와 A23187를 동시에 처리하여 TNF-α 발현량을 확인한 결과 200 ㎍/㎖의 농도에서 TNF-α의 발현을 84.4% 억제하였고 농도의존적인 억제효과를 나타내었다(표 5 참조).
Sample TNF -α production (%)
- 0
PMA (1 ㎍/㎖) + A23187 (1 μM) 100
PMA (1 ㎍/㎖) + A23187 (1 μM) +
Liquiritigenin (㎍/㎖)		 6.25 109.1 ± 0.05
12.5 100.7 ± 0.07
25 92.2 ± 0.06
50 59.9 ± 0.06
100 27.1 ± 0.08
200 15.6 ± 0.02
3. 상처 치유 및 튼살 개선 효능 평가
● 실험방법
- 세포배양
Human keratinocyte인 HaCaT cell과 Human dermal fibroblast cell을 한국 세포주 은행으로부터 구입하였으며, 1% antibiotic 과 10% fetal bovine serum 이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 3, 4일에 한번 씩 계대 배양을 실시하였다.
- fibroblast 와 keratinocyte 이동성 평가 ( Wound healing assay )
fibroblast와 keratinocyte의 이동성 평가를 위해 CytoSelectTM 24-Well Wound Healing Assay kit (CELL BIOLABS INC. USA)를 사용하였다. 멸균된 포셉을 이용하여 wound field inserts를 24 well plate의 각 well에 잘 고정시킨다. fibroblast와 keratinocyte를 24well plate에 각각 8.0x104 cells/well, 3.0x105 cells/well로 접종한다. 이 때 wound field insert가 움직이지 않도록 조심한다. 37℃, 5% CO2 incubator에서 18시간 전배양 한 후 시료를 농도별로 준비한다. 멸균된 포셉을 이용하여 wound field insert를 제거한 후 배양액을 제거하고 PBS로 2번 세척한다. 준비된 시료를 각 well에 처리한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 2시간 동안 배양한 후 배양액을 제거한 다음 PBS로 세척 후 시료가 들어있지 않은 배양액으로 교체한다. 그리고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간, 48시간, 72시간 동안 시간별로 cell 상태를 확인하고, 배양을 멈춰야 하는 시간 때에 배양액을 제거한 후 cell의 잔여물이 남지 않도록 PBS로 2번 세척한다. 각 well에 cell stain solution을 250ul 씩 넣은 후 실온에서 15분 동안 반응시키고 다시 PBS로 3번 세척한 다음 실온에서 건조시킨다. 건조된 plate를 가지고 현미경으로 cell의 이동성 상태를 확인한다.
● 실험결과
피부는 외부환경에 대한 일차 장벽으로 개체를 보호하는 주된 역할을 담당한다. keratinocyte는 피부의 표피를 구성하는 주요 세포로서, 분열 및 분화를 통해 피부장벽을 만드는 역할을 담당한다. 피부질환은 피부 장벽이 정상적으로 만들어지지 않거나 비정상적 각질형성세포 분화가 일어나게 되므로, 이러한 경우 각질형성세포 분화를 촉진시킴으로서 정상적 피부장벽 형성에 도움을 줄 수 있다. fibroblast는 피부 내 진피 층 건조중량의 70%를 차지하는 collagen을 생성하며, 진피층을 이루는 주요 세포이다. 결손 된 피부의 진피층이 재생되기 위하여 fibroblast의 재생이 가장 중요하다. Liquiritigenin이 keratinocyte와 fibroblast에 대한 상처치유에 영향을 미치는지 확인해 보기 위해 wound healing assay를 수행하였다. 아무 처리 하지 않은 control군과 Liquiritigenin을 각각 50 ㎍/㎖ 씩 처리한 세포군의 증식정도를 관찰하였다. fibroblast에서는 72시간을, keratinocyte에서는 48시간을 배양하여 확인하였다. 그 결과 두 개의 시료를 처리한 세포군 모두 fibroblast와 keratinocyte에서 시간이 지날수록 negative control 보다 세포의 이동과 증식의 속도가 빠른 것으로 관찰되었다(도 1 참조).
4. 항염증 효능 평가
1) Nitric oxide (NO) 생성 억제 활성 측정
● 실험 방법
- 세포배양
Murine macrophage cell line인 RAW 264.7 cell을 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank)으로부터 구입하였으며, 1% antibiotic (Gibco, USA)과 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, Grand Island, USA)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 2일에 한번 씩 계대 배양을 실시하였다.
- Nitric oxide ( NO ) 생성 억제 활성 측정
RAW 264.7 cell를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 2.0 × 105 cells/㎖로 24 well plate에 넣고 18시간 배양한다. 시료를 농도별로 준비한 후 준비된 시료에 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 혼합하여 cell에 동시에 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한다. 세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess 시약 100 ㎕를 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정한다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로 측정하고 sodium nitrite (NaNO2)를 standard로 사용한다.
● 실험결과
생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다. LPS 단독 처리군은 NO의 생성을 유도하였고, 대조군으로서 iNOS inhibitor인 2-amino- 4-methylpyridine은 NO의 생성을 약 83.3% 억제함을 확인할 수 있었다. Liquiritigenin에 대한 NO 생성 억제 활성을 측정한 결과, 100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 처리하였을 때 각각 90.1%와 66.5%을 나타내었다. 처리한 농도에 따라 NO 생성 억제 활성이 농도의존적인 것으로 확인하였고 높은 NO 생성 억제 효과가 있음을 알 수 있었다(표 6 참조).
Sample NO production (%)
LPS (-) -
LPS (+, 1 ㎍/㎖ ) 100
2-amino-4-methylpyridine (10 μM) 16.7 ± 2.4
LPS (1 ㎍/㎖) + Liquiritigenin (㎍/㎖) 12.5 79.2 ± 3.1
25 60.5 ± 1.7
50 33.5 ± 2.1
100 9.9 ± 3.9
2) 전염증성 cytokines ( TNF -α, IL -6) 생성 억제 활성 측정
● 실험 방법
RAW 264.7 cell를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.8 × 105 cells/㎖로 24 well plate에 접종하고, 18시간 배양하였다. 시료를 농도별로 준비한 후 준비된 시료에 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 혼합하여 cell에 동시에 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 이후 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3 min) 하여 얻어진 상층액의 전염증성 cytokine 생성 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 냉동보관 (-20℃) 하였다. 전염증성 cytokines은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선의 r 2 값은 0.99 이상이었다.
● 실험 결과
염증 반응 시 생성되는 pro-inflammatory cytokines인 TNF-α와 IL-6의 생성 억제 활성을 조사한 결과 Liquiritigenin은 LPS 단독 처리군과 비교했을 때 50 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖의 처리 농도에서 IL-6의 생성을 86.8%, 64.2%로 억제함으로서 농도 의존적으로 유의하게 억제함을 확인하였고 TNF-α의 생성 또한 80.8%, 51.7%로 억제함으로서 농도 의존적으로 유의하게 억제함을 확인할 수 있었다(표 7 및 표 8 참조).
Sample IL -6 production (%)
LPS (-) -
LPS (+,1 ㎍/㎖) 100
LPS + Liquiritigenin (㎍/㎖) 3.13 104.7 ± 0.03
6.25 100.1 ± 0.09
12.5 69.7 ± 0.02
25 35.8 ± 0.03
50 13.2 ± 0.05
Sample TNF -α production (%)
LPS (-) -
LPS (+,1 ㎍/㎖) 100
LPS + Liquiritigenin (㎍/㎖) 3.13 103.2 ± 0.06
6.25 101.5 ± 0.02
12.5 83.1 ± 0.05
25 48.3 ± 0.02
50 19.2 ± 0.04
3) Prostaglandin E 2 ( PGE 2 ) 생성 억제 활성 측정
● 실험 방법
RAW 264.7 cell를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.8 × 105 cells/㎖로 24 well plate에 접종하고, 18시간 배양하였다. 시료를 농도별로 준비한 후 준비된 시료에 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 혼합하여 cell에 동시에 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3 min) 하여 얻어진 상층액의 PGE2 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 냉동보관 (-20℃) 하였다. PGE2는 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선의 r 2 값은 0.99 이상이었다.
● 실험 결과
PGE2는 염증반응 시 COX-2에 의해 생성되며 혈관을 확장시키고 혈관투과성을 증가시켜 백혈구의 염증부위로의 화학주성을 증가시킨다. Liquiritigenin에 대하여 PGE2 생성 억제 활성을 ELISA kit를 이용하여 확인해 보았다.
세포독성을 가지지 않은 50 ㎍/㎖ 이하의 농도 범위에서 Liquiritigenin은 LPS 단독 처리군과 비교했을 때 50 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖의 처리 농도에서 94.8%, 77.9% 로 PGE2 의 생성을 농도의존적으로 억제하고 있음을 확인할 수 있었다(표 9 참조).
Sample PGE 2 production (%)
LPS (-) -
LPS (+,1 ㎍/㎖) 100
LPS + Liquiritigenin
(㎍/㎖)		 3.13 108.2 ± 0.08
6.25 100.3 ± 0.07
12.5 51.6 ± 0.09
25 22.1 ± 0.02
50 5.2 ± 0.05
4) iNOS , COX -2, NF - kB 발현 억제 활성
● 실험방법
RAW 264.7 cell를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.5 × 105 cells/㎖로 6 well plate에 18시간 배양 후 시료와 LPS (1 ㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 nuclear extraction kit (active motif)를 이용하여 iNOS와 COX-2는 cytoplasmic 추출을, NF-kB는 nuclear 추출을 하여 단백질을 분리하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin (BSA)을 표준으로 Bio-Rad protein assay reagent를 사용하여 정량하였다. 정량한 단백질을 8∼12%의 polyacylamid gel에 전기영동하고 poly-vinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, USA)에 200 mA, 2시간 동안 전이시켰다. 단백질이 전이된 membrane을 5% 탈지분유를 포함한 0.05% Tween 20/Tris-buffered saline (0.05% T/TBS)에 넣고 상온에서 1시간 blocking 시킨 후, 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체 반응은 iNOS antibody (1:1000, Calbiochem, USA), COX-2 antibody (1:250, BD Biosciences Pharmingen, USA), β-actin antibody clone AC-74 (1:5000, Sigma, USA), NF-kB antibody (1:500, Cell signaling, USA)를 이용하여 4℃에서 하루 밤 동안 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 membrane은 0.05% T/TBS 용액으로 3회 세척 후 peroxidase-conjugated된 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch, USA)를 1:1,000 또는 1:5,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응한 뒤 0.05% T/TBS 용액으로 3회 세척하였다. 단백질은 Enhanced chemiluminescence (ECL) 방법을 이용해 X-ray 필름으로 결과를 확인하였다.
● 실험 결과
Liquiritigenin이 iNOS와 COX-2, NF-kB 단백질 발현에 영향을 미치는지 알아보기 위해Western blot analysis로 확인하였다. RAW 264.7 cell에 LPS (1 ㎍/㎖)와 Liquiritigenin을 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 6시간 배양한 후 NF-kB에 대한 발현 억제 활성을 확인하였고, 24시간 배양한 후 iNOS, COX-2에 대한 발현 억제 활성을 확인하였다. 그 결과 LPS 단독 처리군에서는 iNOS, COX-2, NF-kB의 발현이 현저히 증가하였고 Liquiritigenin은 농도 의존적으로 iNOS, COX-2, NF-kB의 발현을 억제함을 알 수 있었다( 도 2 참조).

Claims (3)

  1. 약학적으로 허용된 담체 및 활성 성분으로 리퀴리티제닌을 포함하여 피브로블라스트(fibroblast)와 케라티노사이트(keratinocyte)의 이동과 증식의 속도 향상을 통하여 세포 증식 효과를 나타내어 피부 상처 치유 용도로 사용 가능한 것을 특징으로 하는 피부 외용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
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