KR101657717B1 - 포유동물 발현 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 적어도 하나의 발현 카세트 (POI); (b) 포유동물의 선택가능 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (MSM); (c) 포유동물의 증폭가능한 선택가능 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (MASM)을 포함하는, 포유동물 세포에서 적어도 하나의 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 벡터 핵산을 제공하고; 여기서 발현 카세트 (POI)는 5'에서 발현 카세트 (MASM)이 옆에 접하고, 발현 카세트 (MSM)은 발현 카세트 (POI)로부터 3'에 위치하고, 발현 카세트 (MASM), (POI) 및 (MSM)은 동일한 5'에서 3'으로의 배향으로 배열된다. 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 각각의 숙주 세포를 사용하여 폴리펩티드를 생산하는 방법을 또한 제공한다.

Description

포유동물 발현 벡터{MAMMALIAN EXPRESSION VECTOR}

본 발명은 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 포유동물 발현 벡터, 및 각각의 벡터를 사용함으로써 포유동물 숙주 세포에서 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 방법, 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

재조합 펩티드 및 단백질을 대량으로 클로닝하고 발현시키는 능력은 최근에 점점 더 중요해지고 있다. 고수준의 단백질을 정제하는 능력은 예를 들어 단백질 약품을 생산하기 위해 인간 제약 및 생명공학 분야에서, 및 예를 들어 3차원 구조의 결정을 허용하도록 단백질을 결정화하기 위해 기초 연구 상황에서 중요하다. 달리 일정량을 얻기 어려운 단백질을 숙주 세포 내에서 과다-발현시키고, 후속적으로 단리 및 정제할 수 있다.

재조합 단백질의 생산을 위한 발현 시스템의 선택은 관심있는 단백질의 세포 성장 특징, 발현 수준, 세포내 및 세포외 발현, 번역후 변형 및 생물학적 활성, 및 치료 단백질의 생산에서 조절 문제 및 경제적 고려사항을 포함하는 많은 요인에 따라 좌우된다. 다른 발현 시스템, 예를 들어 세균 또는 효모에 비해 포유동물 세포의 중요한 잇점은 적합한 단백질 폴딩, 복잡한 N-연결된 글리코실화 및 정확한 O-연결된 글리코실화, 및 광범위한 다른 번역후 변형을 수행하는 능력이다. 설명된 잇점 때문에, 포유동물 세포가 모노클로날 항체와 같은 복잡한 치료 단백질을 생산하기 위해 현재 선택되는 발현 시스템이다. 재조합 세포주를 생성하는데 있어서 제1 단계는 발현 벡터의 구성이다. 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 이종 유전자의 발현을 추진하고 재조합 세포주를 생성하기 위한 선택 마커를 제공하기 위한 핵심 요소이다. 포유동물 발현 벡터의 필수 요소는 대체로 강건한 전사 활성이 가능한 구성적 또는 유도가능 프로모터; 대체로 Kozak 서열, 번역 종결 코돈, mRNA 절단 및 폴리아데닐화 신호, 및 mRNA 스플라이싱 (splicing) 신호를 포함하는 최적화된 mRNA 처리 및 번역 신호; 전사 종결자; 안정한 세포주의 제조 및 유전자 증폭을 위한 선택 마커; 세균 내에서 벡터 전파를 위한 원핵생물 복제 기점 및 선택 마커를 포함한다.

최근에, 개발의 촛점은 포유동물 세포 내에서 유전자 발현을 위한 개선된 벡터의 설계에 집중되고 있었다. 그러나, 과다하게 이용가능한 벡터에도 불구하고, 포유동물 세포 내에서 강건한 폴리펩티드/단백질 생산은 여전히 도전받고 있다. 프로모터 강도, 5' 비번역 및 번역 개시 구역의 환경, 폴리아데닐화하고 전사를 종결시키는 3' 비번역 구역의 효능, 숙주 염색체 내에 무작위로 통합된 재조합 유전자의 삽입 부위, 및 발현되는 유전자의 통합된 카피의 수를 포함하는 몇몇 인자가 포유동물 세포 내에서 재조합 발현에 영향을 미칠 수 있다. 유전자 카피수 (copy number)의 증가는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 또는 글루타민 합성효소 (GS)와 같은 효소가 결핍되는 세포주를 이들 효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 발현 벡터, 및 DHFR을 억제하는 메토트렉세이트 (MTX) 및 GS를 억제하는 메티오닌 술폭사민 (MSX)과 같은 물질과 함께 사용하는 유전자 증폭에 의해 가장 일반적으로 달성된다. 강한 프로모터의 제어 하에 재조합 유전자를 함유하는 발현 벡터, 및 DHFR 또는 GS를 코딩하는 유전자를 사용하여, 각각 DHFR⁺ 또는 GS⁺ 형질감염체를 먼저 수득한 후, 점진적으로 증가하는 농도의 MTX 또는 MSX 내에서 형질감염체를 성장시킴으로써 유전자 증폭을 달성한다.

본 발명의 목적은 포유동물 세포에서 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 개선된 발현 벡터 및 발현 시스템을 제공하는 것이다.

따라서, (a) 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 적어도 하나의 발현 카세트 (POI);

(b) 포유동물의 선택가능 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (MSM);

(c) 포유동물의 증폭가능한 선택가능 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (MASM)을 포함하는, 포유동물 세포 내에서 적어도 하나의 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 벡터 핵산을 제공하고;

여기서, 발현 카세트 (POI)는 5'에서 발현 카세트 (MASM)이 옆에 접하고, 발현 카세트 (MSM)은 발현 카세트 (POI)로부터 3'에 위치하고, 발현 카세트 (MASM), (POI) 및 (MSM)은 동일한 5'에서 3'으로의 배향으로 배열된다.

본 발명에 따른 "벡터 핵산"은 적어도 하나의 외래 핵산 단편을 보유하는 폴리뉴클레오티드이다. 벡터 핵산은 핵산, 각각의 폴리뉴클레오티드의 단편을 숙주 세포 내로 전달하는, "분자 담체"와 유사한 기능을 한다. 벡터 핵산은 조절 및 코딩 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함한다. 발현 카세트는 편입된 폴리뉴클레오티드의 적합한 발현을 허용한다. 본 발명에 중대한 발현 카세트를 후에 추가로 상세히 설명할 것이다. 예를 들어, 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드는 발현시키기 위해 벡터 핵산의 발현 카세트 내로 삽입될 수 있다. 본 발명에 따른 벡터 핵산은 원형 (circular) 또는 선형화된 형태로 존재할 수 있다. 상기 부위는 예를 들어, 다중 클로닝 부위 (MCS)일 수 있다.

발현 카세트 (POI)는 관심있는 폴리펩티드 ( p olypeptide o f i nterest)를 발현시키기 위한 발현 카세트를 규정한다. 상기 발현 카세트 (POI)는 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위해 적합한 부위를 포함한다.

"폴리펩티드"는 펩티드 결합(들)에 의해 함께 연결된 아미노산의 중합체를 포함하는 분자를 나타낸다. 폴리펩티드는 임의의 길이의 폴리펩티드, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 50개 초과의 아미노산을 갖는) 및 펩티드 (예를 들어, 2 - 49개의 아미노산을 갖는)를 포함한다. 폴리펩티드는 임의의 활성 또는 생활성의 단백질 및/또는 펩티드를 포함한다. 적합한 예를 아래에 개략한다.

발현 카세트 (MSM)은 포유동물의 선택가능 마커 유전자 ( m ammalian s electable m arker g ene)를 포함하는 발현 카세트를 규정한다. 포유동물의 선택가능 마커 유전자는 상기 유전자를 포함하는 포유동물 숙주 세포의, 따라서 벡터를 포함하는 포유동물 숙주 세포의 선택을 허용한다. 적합한 예를 아래에 상세히 설명한다.

발현 카세트 (MASM)은 포유동물의 증폭가능한 선택가능 마커 유전자 ( m ammalian a mplifiable, s electable m arker gene)를 포함하는 발현 카세트를 규정한다. 포유동물의 증폭가능한 선택가능 마커 유전자는 벡터-함유 포유동물 숙주 세포의 선택 및 유전자 증폭을 허용한다. 적합한 예를 아래에 상세히 설명한다.

용어 "5'" 및 "3'"는 예를 들어 5'에서 3' 방향으로 진행하는 RNA 중합효소에 의한 전사 또는 리보솜에 의한 번역과 같은, 유전자 요소의 위치 및/또는 사건의 방향 (5'에서 3'으로의)에 관련하여 핵산 서열의 특징을 기술하기 위해 사용되는 관용적인 표현이다. 동의어는 상류 (5') 및 하류 (3')이다. 통상적으로, DNA 서열, 유전자 맵, 벡터 카드 (card) 및 RNA 서열은 좌측으로부터 우측으로 5'에서 3'으로 도시되거나, 5'에서 3'으로의 방향은 화살표로 지시되고, 여기서 화살촉은 3' 방향으로 가리킨다. 따라서, 상기 관용적인 표현을 따를 때 5' (상류)은 좌측 측면을 향해 위치하는 유전자 요소를 나타내고, 3' (하류)은 우측 측면을 향해 위치하는 유전자 요소를 나타낸다.

본 발명의 벡터 내에 존재하는 발현 카세트의 배열 및 배향은 중요하다. 본 발명의 교시 내용에 따르면, 발현 카세트 (POI)는 5'에서 발현 카세트 (MASM)이 옆에 접한다. 따라서, 발현 카세트 (MASM)은 발현 카세트 (POI)의 5'에 인접하여 그에 아주 근접하게 위치한다. 물론, 벡터 백본 서열은 발현 카세트 (MASM) 및 (POI)를 분리할 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 발현 카세트 (MASM) 및 발현 카세트 (POI) 사이에 다른 발현 카세트가 위치하지 않는다. 발현 카세트 (MSM)은 발현 카세트 (POI)로부터 3'에 위치한다. 발현 카세트 (POI) 및 (MSM) 사이에 추가의 발현 카세트, 예를 들어 추가의 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 추가의 발현 카세트 (POI')가 삽입될 수 있다 (본원에서 아래에 추가로 설명함). 발현 카세트 (MASM), (POI) 및 (MSM)은 모두 동일한 5'에서 3'으로의 배향으로 배열된다. 본 발명자들은 상기 특정 벡터 핵산의 입체형상이 고수율 세포주의 신속한 생성을 허용함을 발견하였다.

하나의 대안에 따르면, 발현 카세트 (POI)는 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 따라서, "빈 (empty)" 발현 카세트 (POI)를 갖는 발현 벡터가 제공된다. 그러나, 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 적절한 클로닝 방법을 사용하여, 예를 들어 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현 카세트 (POI) 내로 삽입하기 위해 제한 효소를 사용함으로써 발현 카세트 (POI) 내로 편입될 수 있다. 상기 목적을 위해, 발현 카세트 (POI)는 예를 들어 모든 해독 프레임에서 사용될 수 있는 다중 클로닝 부위 (MCS)를 예를 들어 포함할 수 있다. 적합한 MCS 부위는 아래에 상세히 설명된다. 각각의 "빈" 벡터 핵산이 예를 들어 고객에게 제공될 수 있고, 이들은 이후 발현시킬 관심있는 그들의 특이적 폴리뉴클레오티드를 발현 카세트 (POI) 내로 삽입한다. 발현 카세트 (POI)는 또한 교체 폴리뉴클레오티드 또는 스터퍼 (stuffer) 핵산 서열을 포함할 수 있고, 이는 절제되고 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 교체될 수 있다. 본 발명에서는 또한 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 (POI)를 포함하는, 상기 설명한 바와 같은 벡터 핵산을 제공한다. 상기 실시태양은 기본적으로 발현을 위해 숙주 세포 내로 형질감염되는 최종 발현 벡터 핵산에 관한 것이다.

폴리뉴클레오티드는 대체로 하나의 데옥시리보스 또는 리보스로부터 다른 것으로 연결되는 뉴클레오티드의 중합체이다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 크기 제한을 포함하지 않고, 또한 변형, 특히 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

한 실시태양에 따르면, 벡터 핵산은 원형이고, 발현 카세트 (MSM)은 발현 카세트 (POI)의 3'에 배열되고, 발현 카세트 (MASM)은 발현 카세트 (MSM)의 3'에 배열된다. 별법으로서, 본 발명의 교시 내용에 따른 원형 벡터의 설명은

(a) 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 적어도 하나의 발현 카세트 (POI);

(b) 포유동물의 선택가능 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (MSM);

(c) 포유동물의 증폭가능한 선택가능 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (MASM)을 포함하는, 포유동물 세포에서 적어도 하나의 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 원형 벡터 핵산에 대한 것이고;

여기서 발현 카세트 (MSM)은 발현 카세트 (POI)의 3'에 배열되고, 발현 카세트 (MASM)은 발현 카세트 (MSM)의 3'에 배열되고, 발현 카세트 (MASM), (POI) 및 (MSM)은 동일한 5'에서 3'으로의 배향으로 배열된다.

벡터 핵산은 그의 원형 형태로 숙주 세포 내로 형질감염될 수 있다. 수퍼코일드 (supercoiled) 벡터 분자는 대체로 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제의 활성으로 인해 핵 내에서 선형 분자로 전환될 것이다. 그러나, 형질감염 이전의 벡터 핵산의 선형화는 종종 안정한 형질감염의 효율을 개선한다. 벡터가 형질감염에 앞서 선형화되면, 이는 또한 선형화의 지점으로서 제어될 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 실시태양에 따르면, 발현 벡터는 예비규정된 제한 부위를 포함하고, 이는 형질감염 전에 벡터 핵산의 선형화를 위해 사용될 수 있다. 상기 제한 부위는 벡터 핵산이 개방/선형화되는 위치를 결정하여 구성체가 포유동물 세포의 게놈 내로 통합될 때 발현 카세트의 순서/배열을 결정하기 때문에, 상기 선형화 제한 부위의 지능적인 배치가 중요하다.

따라서, 벡터 핵산은 벡터를 선형화하기 위한 선형화 제한 부위를 포함할 수 있고, 여기서 상기 선형화 제한 부위는 발현 카세트 (MSM)과 (MASM) 사이에 위치한다. 바람직하게는, 상기 선형화 제한 부위는 특유하고, 발현 벡터 핵산 내에 단지 1개만 존재한다. 예를 들어, 벡터가 선형화 제한 부위에서만 절단되고, 예를 들어 발현 카세트(들) 또는 벡터 백본 내에서는 절단되지 않는 (또는 단지 드물게 절단되는) 것을 장려하기 위해, 낮은 절단 빈도를 갖는 제한 효소에 의해 인식되는 선형화 제한 부위가 사용될 수 있다. 이는 예를 들어, 6개 초과의 염기쌍의 인식 서열을 갖거나 염색체 DNA 내에 불충분하게 제시된 서열을 인식하는 제한 효소에 대한 제한 부위를 제공함으로써 장려될 수 있다. 적합한 예는 SwaI 효소이고, 따라서, 벡터는 특유한 선형화 제한 부위로서 SwaI 인식 부위를 포함할 수 있다. 상기 선형화 제한 부위가 벡터 핵산 서열 (관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는) 내에 1개 초과로 존재하는 경우에, 또는 벡터 핵산 서열 내에서 수회 절단하는 제한 효소가 사용되는 경우에, 예를 들어, 추가의 제한 부위를 제거하기 위해 및 특유하거나 적어도 희귀한 선형화 제한 부위를 얻기 위해, 발현 카세트 (MSM)과 (MASM) 사이에 위치하는 선형화 제한 부위 외의 제한 부위를 변경/돌연변이시키는 것 또한 본 발명의 범위 내에 있다.

벡터가 예를 들어, 몇몇 상이한 폴리펩티드의 발현을 위한 도구로서 의도된 표준 발현 벡터로서 사용되는 경우에, 낮은 절단 빈도를 갖는 효소에 대한 다수의 인식 부위를 포함하는 선형화 제한 부위를 제공하는 것이 유리하다. 선형화를 위해 선택된 제한 효소는 바람직하게는 효소가 벡터의 적합한 선형화를 위해 1회만 절단하도록 보장하기 위해 선택가능 마커 또는 다른 벡터 백본 서열에 대한 발현 카세트 내에서 절단하지 않아야 한다. 낮은 절단 빈도를 갖는 제한 효소에 대한 다수의 인식 부위를 포함하는 선형화 제한 부위를 제공함으로써, 사용자는 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 내에서의 제한을 확실하게 방지하기 위해 제공된 선택사항으로부터 선형화를 위해 적합한 제한 효소를 선택할 수 있다. 그러나, 상기 개략한 바와 같이, 추가의 제한 부위는 돌연변이될 수 있거나, 부분적 제한 소화가 수행될 수도 있다.

발현 카세트 (MSM)과 발현 카세트 (MASM) 사이에 선형화 제한 부위를 배치하면, 발현 카세트 (POI) (및 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 추가의 발현 카세트 - 존재하는 경우)의 5'에 발현 카세트 (MASM)이 옆에 접하게 되는 효과가 있다. 발현 카세트 (MSM)은 선형화 시에 발현 카세트 (POI)의 3'에 위치한다. 그에 의해, 발현 카세트 (MSM) 및 (MASM)은 원형 벡터 핵산의 선형화 시에 분리된다. 세균 선택 마커에 대한 발현 카세트 (PSM)이 존재하는 경우에 (아래 참조), 선형화 제한 부위는 바람직하게는 발현 카세트 (PSM)과 (MASM) 사이에 놓인다. 이것은 세균 선택 마커 유전자가 선형화된 벡터 핵산의 "포유동물" 부분의 3'에, 따라서 그의 "외부에" 존재하도록 하는 효과가 있다. 세균 서열이 포유동물 세포에서 메틸화 또는 다른 침묵화 효과를 증가시킬 수 있으므로 세균 유전자는 포유동물 발현을 위해 유리하지 않을 것으로 추정되므로 상기 배열이 바람직하다.

발현 카세트 (MSM)에 포함될 수 있는 포유동물의 선택가능 마커 유전자의 비-제한적인 예는 예를 들어 G418; 히그로마이신 (hyg 또는 hph, 라이프 테크놀로지스, 인크. (Life Technologies, Inc., 미국 메릴랜드주 게이테스보로)로부터 상업적으로 입수가능함); 네오마이신 (neo, 라이프 테크놀로지스, 인크.로부터 상업적으로 입수가능함); 제오신 (Sh Ble, 파밍겐 (Pharmingen, 미국 캐리포니아주 샌 디에고)으로부터 상업적으로 입수가능함); 퓨로마이신 (pac, 퓨로마이신-N-아세틸-트랜스퍼라제, 클론테크 (Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로알토)로부터 상업적으로 입수가능함); 오우아바인 (oua, 파밍겐으로부터 상업적으로 입수가능함) 및 블라스티시딘 (인비트로겐 (Invitrogen)으로부터 입수가능함)에 대한 내성을 부여하는 항생제 내성 유전자를 포함한다. 각각의 포유동물의 선택가능 마커 유전자는 잘 알려져 있고, 상기 유전자를 포함하는 포유동물 숙주 세포의, 따라서 벡터를 포함하는 숙주 세포의 선택을 허용한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어 "유전자"는 의도하는 내성을 제공하는 선택가능 마커의 기능성 변이체를 코딩하는 천연 또는 합성 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 따라서, 야생형 유전자 또는 합성 폴리뉴클레오티드의 끝이 잘린 또는 돌연변이된 버전도 의도된 내성을 제공한다면 또한 포함된다. 바람직한 실시태양에 따르면, 상기 발현 카세트 (MSM)은 효소 기능성 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (I 또는 II)를 코딩하는 유전자를 포함한다. 상기 실시태양은 증폭가능한 선택가능 마커 유전자로서 효소 기능성 DHFR을 코딩하는 유전자의 사용과 조합으로 잘 작동한다.

증폭가능한 선택가능 포유동물 마커 유전자는 벡터-함유 포유동물 숙주 세포의 선택 및 유전자 증폭을 허용한다. 증폭가능한 선택가능 포유동물 마커 유전자의 비-제한적인 예는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자이다. 현재 사용되는 다른 시스템은 특히 글루타민 합성효소 (gs) 시스템 (Bebbington et al., 1992) 및 히스티디놀 추진 선택 시스템 (Hartmann and Mulligan, 1988)이다. 이들 증폭가능한 마커는 또한 선택가능 마커이고, 따라서 벡터를 수득한 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있다. DHFR 및 글루타민 합성효소는 우수한 결과를 제공한다. 두 경우 모두에, 선택은 대체로 적절한 대사물 (DHFR의 경우에 하이포잔틴 및 티미딘, GS의 경우에 글루타민)의 부재 하에 일어나, 비-형질전환된 세포의 성장을 방지한다. 증폭가능한 시스템, 예를 들어 DHFR 시스템을 사용할 때, 재조합 단백질의 발현은 세포를 DHFR 시스템의 경우에 항엽산제 (예를 들어 메토트렉세이트 (MTX))와 같은 유전자 증폭을 촉진하는 특정 물질에 노출시킴으로써 증가될 수 있다. 유전자 증폭을 촉진하는 GS에 대한 적합한 억제제는 메티오닌 술폭시민 (MSX)이다. MSX에 노출시키면 또한 유전자 증폭을 일으킨다. 한 실시태양에 따르면, 상기 발현 카세트 (MASM)은 효소 기능성 글루타민 합성효소 (GS) 또는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 코딩하는 유전자를 포함한다.

한 실시태양에 따르면, 상기 발현 카세트 (MSM)은 효소 기능성 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하고, 상기 발현 카세트 (MASM)은 효소 기능성 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 코딩하는 유전자를 포함한다.

벡터는 추가의 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 적어도 하나의 추가의 발현 카세트 (POI')를 포함할 수 있다. 상기 추가의 발현 카세트 (POI')는 발현 카세트 (POI)와 발현 카세트 (MSM) 사이에 위치한다. 상기 발현 카세트 (POI')는 발현 카세트 (POI) 및 (MSM)과 동일한 5'에서 3'으로의 배향으로 배열된다. 한 실시태양에 따르면, 이는 추가의 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

따라서, 본 발명에 따른 벡터 핵산은 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 하나 초과의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 따라서, 상이한 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 몇몇 발현 카세트 ((POI), (POI'), (POI") 등)가 본 발명에 따른 발현 벡터 핵산 내에 배열되는 것이 또한 가능하다. 이들 발현 카세트는 5'에서 발현 카세트 (MASM)이 옆에 접하고 3'에서 발현 카세트 (MSM)이 옆에 접한다. 따라서, 본 발명은 또한 예를 들어 이량체 또는 그 이상의 다량체성 단백질의 서브유닛을 코딩하는 하나 초과의 발현 카세트를 포함하는 벡터 핵산을 제공한다. 예를 들어, 각각 상이한 발현 카세트에 편입된, 다량체성 단백질의 상이한 서브유닛들을 코딩하는 발현 카세트는 서로에 인접하게 배치될 수 있다. 적어도 2개의 구분되는 유전자에 의해 코딩되는 다량체성 단백질 (예를 들어, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 또는 그의 기능성 단편, 예를 들어 적어도 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 가변 구역)에 대해, 관심있는 폴리펩티드의 목적하는 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현 카세트 (POI) 및 (POI')에 삽입된다. 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 적어도 2개의 발현 카세트 (POI) 및 (POI')를 사용하는 각각의 실시태양은 면역글로불린 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 기능성 단편을 발현시키기 위해 특히 유리하다. 따라서, 각각의 발현 카세트 (POI) 및 (POI') 내에 면역글로불린 분자 또는 그의 단편의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역글로불린 분자를 발현시키기 위한 벡터 핵산을 제공하고, 여기서 각각의 발현 카세트 (POI) 및 (POI')는 하나의 상기 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 발현 카세트 (POI)는 면역글로불린 분자의 경쇄를 발현시키기 위한 폴리뉴클레오티드, 또는 면역글로불린 분자의 중쇄를 발현시키기 위한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

한 바람직한 실시태양에 따르면, 발현 카세트 (POI)는 상기 면역글로불린 분자 또는 그의 기능성 단편의 경쇄의 적어도 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 발현 카세트 (POI')는 상기 면역글로불린 분자 또는 그의 기능성 단편의 중쇄의 적어도 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 경쇄에 대한 발현 카세트를 중쇄의 발현 카세트에 5'로 배열하는 것이 면역글로불린 분자의 발현 속도에 관하여 유익한 것으로 입증되었다. 한 실시태양에 따르면, 발현 벡터 핵산은 발현 카세트(들)이 면역글로불린 분자의 불변 구역의 적어도 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이미 포함하도록 설계된다. 이어서, 면역글로불린 분자의 가변 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편이 최종 발현 벡터를 얻기 위해 적절한 클로닝 전략을 사용함으로써 사용자/고객에 의해 발현 카세트 내로 삽입될 수 있다.

본 발명에 따른 발현 벡터 내에 존재하는 발현 카세트는 포유동물 세포에서 편입된 폴리뉴클레오티드/유전자의 발현을 허용하도록 설계된다. 이를 위해, 발현 카세트는 대체로 필요한 조절 서열, 예를 들어 프로모터 및/또는 전사 종결 서열, 예를 들어 폴리A 부위를 포함한다.

관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사용되는 벡터는 대체로 발현 카세트의 요소로서 전사를 추진하기 위해 적합한 전사 제어 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 전사 중지 또는 종결 신호를 함유한다. 폴리펩티드의 적합한 발현을 위해, 적합한 번역 제어 요소, 예를 들어 리보솜 동원에 적합한 5' 캡 (cap) 구조를 생성시키는 5' 비번역 구역, 및 번역 과정을 종결시키는 정지 코돈이 벡터 내에 포함되는 것이 바람직하다. 특히, 선택가능 마커 유전자로서 기능하는 폴리뉴클레오티드, 및 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적절한 프로모터 내에 존재하는 전사 요소의 제어 하에 전사될 수 있다. 선택가능 마커 유전자의 생성되는 전사체 및 관심있는 폴리펩티드의 생성되는 전사체는 실질적인 수준의 단백질 발현 (즉, 번역) 및 적절한 번역 종결을 용이하게 하는 기능적 번역 요소를 보유한다. 편입된 폴리뉴클레오티드의 발현을 적합하게 추진할 수 있는 기능적 발현 단위는 또한 본원에서 "발현 카세트"로서 언급된다. 바람직하게는, 발현 카세트는 3' UTR 구역을 포함한다.

따라서, 발현 카세트가 적어도 하나의 프로모터 및/또는 프로모터/인핸서 요소를 포함하는 벡터 핵산이 제공된다. 이들 2개의 제어 요소들 사이의 물리적 경계가 항상 분명한 것은 아니지만, 용어 "프로모터"는 대체로 RNA 중합효소 및/또는 임의의 연관된 인자가 결합하고 전사가 개시되는 핵산 분자 상의 부위를 나타낸다. 인핸서는 프로모터 활성을 일시적으로 및 공간적으로 강화시킨다. 많은 프로모터는 광범위한 세포 종류에서 전사 활성을 보인다. 프로모터는 2개의 클래스, 즉 구성적으로 기능하는 클래스 및 유도 또는 탈억제 (derepression)에 의해 조절되는 클래스로 구분된다. 포유동물 세포에서 단백질의 고수준 생산을 위해 사용되는 프로모터는 강력하고 바람직하게는 재조합 폴리펩티드의 정성적 및 정량적 평가를 허용하도록 광범위한 세포 종류에서 활성을 보여야 한다. 프로모터는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, EF1알파 프로모터, RSV 프로모터, BROAD3 프로모터, 쥐 로사 (rosa) 26 프로모터, pCEFL 프로모터 및 β-액틴 프로모터로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다. 많은 세포 종류에서 발현을 추진하는 강한 구성적 프로모터는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 최조기 프로모터, SV40 및 라우스 (Rous) 육종 바이러스 프로모터, 및 쥐 3-포스포글리세레이트 키나제 프로모터 및 EF1a를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 프로모터 및/또는 인핸서가 CMV 및/또는 SV40으로부터 얻어질 경우에 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 우수한 결과가 달성된다.

한 실시태양에 따르면, 관심있는 폴리펩티드(들)을 발현시키기 위한 발현 카세트(들)은 선택가능 마커를 발현시키기 위한 발현 카세트보다 더 강한 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 상기 배열은 선택 마커에 대한 전사체보다 관심있는 폴리펩티드에 대한 전사체가 더 많이 생성되는 효과를 갖는다. 이종 단백질을 생산하는 개별 세포 능력은 무한정하지 않고 따라서 관심있는 폴리펩티드에 집중되어야 하므로, 분비되는 관심있는 폴리펩티드의 생산이 선택 마커의 생산에 비해 우세한 것이 유리하다.

한 실시태양에 따르면, 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사용되는 발현 카세트 (POI) 및 (POI') (존재하는 경우)는 CMV 프로모터/인핸서를 포함한다. 구체적인 예를 아래에 상세히 설명한다. 바람직하게 DHFR 및 네오마이신 마커 유전자를 발현하는 발현 카세트 (MSM) 및 (MASM)은 SV40 프로모터 또는 SV40 프로모터/인핸서를 포함한다. CMV 프로모터는 포유동물 발현을 위해 이용가능한 가장 강한 프로모터 중의 하나로 알려져 있고, 매우 우수한 발현 속도를 나타낸다. 상기 프로모터는 SV40 프로모터보다 유의하게 더 많은 전사체를 생성시키는 것으로 여겨진다.

또한, 발현 카세트는 적절한 전사 종결 부위를 포함할 수 있다. 상류 프로모터로부터 제2 전사 단위를 통한 지속적인 전사로서 이것은 하류 프로모터의 기능을 억제할 수 있다 (프로모터 폐쇄 (occlusion) 또는 전사 간섭으로서 공지된 현상). 상기 사건은 원핵생물 및 진핵생물 모두에서 설명되었다. 2개의 전사 단위들 사이의 전사 종결 신호의 적절한 배치는 프로모터 폐쇄를 방지할 수 있다. 전사 종결 부위는 잘 특성화되어 있고, 발현 벡터 내의 그들의 편입은 유전자 발현에 대해 다수의 유익한 효과를 갖는 것으로 나타났다.

대부분의 진핵생물 신생 mRNA는 1차 전사체의 절단 및 커플링된 폴리아데닐화 반응을 포함한 복잡한 과정 동안 첨가되는 폴리A 테일 (tail)을 그들의 3' 말단에 갖는다. 폴리A 테일은 mRNA 안정성 및 전달가능성을 위해 유리하다. 따라서, 본 발명에 따른 벡터의 발현 카세트는 대체로 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 포유동물 발현 벡터에서 사용될 수 있는 몇몇 효율적인 폴리A 신호, 예를 들어, 소 성장 호르몬 (bgh), 마우스 베타-글로빈, SV40 조기 전사 단위 및 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자로부터 유래된 것이 존재한다. 그러나, 또한 합성 폴리아데닐화 부위가 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Levitt et al, 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025]에 기초하는 프로메가 (Promega)의 pCI-neo 발현 벡터를 참조한다). 폴리아데닐화 부위는 SV40 폴리A 부위, 예를 들어 SV40 후기 및 조기 폴리A 부위 (예를 들어 문헌 [Subramani et al, 1981, Mol. Cell. Biol. 854-864]에 기재된 바와 같은 플라스미드 pSV2-DHFR을 참조한다), 합성 폴리A 부위 (예를 들어 문헌 [Levitt et al, 1989, Genes Dev. 3 (7): 1019-1025]에 기초하는 프로메가의 pCI-neo 발현 벡터를 참조한다), 및 bgh 폴리A 부위 (소 성장 호르몬)로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다.

발현 카세트는 인핸서 (상기 참조) 및/또는 인트론을 포함할 수 있다. 한 실시태양에 따라, 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 발현 카세트(들)은 인트론을 포함한다. 고등 진핵생물로부터의 대부분의 유전자는 RNA 처리 동안 제거되는 인트론을 함유한다. 게놈 구성체는 인트론이 결여되는 동일한 구성체보다 트랜스제닉 (transgenic) 시스템에서 더 효율적으로 발현되는 것으로 밝혀졌다. 대체로, 인트론은 개방 해독 프레임의 5' 말단에 배치된다. 따라서, 발현 속도를 증가시키기 위해 인트론은 관심있는 폴리펩티드(들)을 발현시키기 위한 발현 카세트(들)에 포함될 수 있다. 상기 인트론은 프로모터 및 또는 프로모터/인핸서 요소(들)과 발현시킬 폴리펩티드의 개방 해독 프레임의 5' 말단 사이에 위치할 수 있다. 따라서, 적어도 발현 카세트 (POI)가 프로모터와 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 폴리뉴클레오티드의 개시 코돈 사이에 배열되는 인트론을 포함하는 벡터 핵산이 제공된다. 본 발명과 함께 사용할 수 있는 몇몇 적합한 인트론이 당업계에 공지되어 있다.

한 실시태양에 따르면, 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 발현 카세트에서 사용된 인트론은 합성 인트론, 예를 들어 SIS 또는 RK 인트론이다. RK 인트론은 바람직하게는 관심있는 유전자의 ATG 개시 코돈 앞에 배치되는 강한 합성 인트론이다. RK 인트론은 CMV 프로모터의 인트론 공여 스플라이스 부위 및 마우스 IgG 중쇄 가변 구역의 억셉터 스플라이스 부위로 이루어진다 (예를 들어, [Eaton et al., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347], [Neuberger et al., 1983, EMBO J. 2(8), 1373-1378] 참조; 이는 pRK-5 벡터로부터 수득할 수 있다 (비디 파밍겐 (BD PharMingen))).

또한, 놀랍게도 DHFR 유전자의 개방 해독 프레임의 3' 말단에서 인트론의 배치는 구성체의 발현/증폭 속도에 유리한 효과를 갖는 것으로 발견되었다. DHFR 발현 카세트에서 사용된 인트론은 DHFR 유전자의 보다 작은 비-기능성 변이체를 생성시킨다 (Grillari et al., 2001, J. Biotechnol. 87, 59-65). 그에 의해, DHFR 유전자의 발현 수준이 저하된다. 이는 MTX 및 보다 엄격한 선택 조건에 대한 감수성을 증가시킨다. 따라서, 발현 카세트 (MASM)이 증폭가능한 선택가능 마커 유전자의 3'에 위치하는 인트론을 포함하는 벡터 핵산이 제공된다. 적합한 인트론은 pSV2-DHFR 벡터로부터 얻을 수 있다 (예를 들어 상기 참조).

상기 벡터는 원핵생물의 선택가능 마커 유전자를 포함하는 적어도 하나의 추가의 발현 카세트 (PSM)을 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트 (PSM)은 발현 카세트 (MSM)과 (MASM) 사이에 위치한다. 상기 선택가능 마커는 항생제, 예를 들어 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린 및/또는 클로람페니콜에 대한 내성을 제공할 수 있다. 상기 발현 카세트 (PSM)은 바람직하게는 다른 발현 카세트 (POI), (MSM) 및 (MASM)과 동일한 5'에서 3'으로의 배향으로 배열된다.

DHFR 유전자는 마커 및 유전자 증폭 유전자로서 기능한다. 선택은 적절한 대사물 (하이포잔틴 및 티미딘)의 부재 하에 세포를 배양하여 비-형질전환된 세포의 성장을 억제함으로써 수행될 수 있다. DHFR 시스템을 사용할 때, 관심있는 폴리펩티드의 발현은 세포를 항엽산제, 예를 들어 DHFR의 활성을 차단하는 약물인 메토트렉세이트 (MTX)에 노출함으로써 증가시킬 수 있다. 특정 시간 동안 MTX에 노출시킨 후에, 대부분의 세포는 죽지만, DHFR을 과다생산하는 소수의 세포는 대체로 생존한다. MTX 처리시에, 농도를 증가시킴에 따라, 생존하는 세포는 종종 길어진 염색체 내에 넣어진 수백 내지 수천 카피까지의 통합된 벡터를 함유한다. 각각 증폭된 대부분의 세포는 증폭되지 않은 세포보다 더 많은 재조합 단백질을 생산한다.

본 발명과 함께 사용할 수 있는 몇몇 적합한 DHFR 효소 및 그에 따른 유전자가 당업계에 공지되어 있다. DHFR은 야생형 DHFR 또는 그의 기능성 변이체 또는 유도체일 수 있다. 용어 "변이체" 또는 "유도체"는 각각의 DHFR 효소의 아미노산 서열에 관하여 하나 이상의 아미노산 서열 교체 (예를 들어 결실, 치환 또는 부가)를 갖는 DHFR 효소, DHFR 효소 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질, 및 추가의 구조 및/또는 기능을 제공하도록 변형된 DHFR 효소뿐만 아니라 여전히 DHFR 효소의 적어도 하나의 기능을 갖는 상기한 것들의 기능성 단편을 포함한다. DHFR 유전자는 바람직하게는 야생형 DHFR, 야생형 DHFR에 비해 감소된 MTX 감수성을 갖는 DHFR 변이체, 및 야생형 DHFR에 비해 향상된 MTX 감수성을 갖는 DHFR 변이체로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 한 실시태양에 따르면, DHFR 유전자는 야생형 DHFR 유전자이다. 상이한 실시태양에 따르면, DHFR 유전자는 DHFR의 보다 덜 기능성의 변이체를 코딩한다. 이는 MTX 및 보다 엄격한 선택 조건에 대한 감수성을 증가시킨다. 이는 예를 들어, DHFR 유전자의 3' 말단에 인트론을 배치함으로써 달성할 수 있다 (상기 참조). 상이한 대안은 야생형 DHFR보다 MTX에 대한 더 큰 감수성을 갖는 DHFR 돌연변이체/변이체의 사용에 의존할 수 있다. 상기 실시태양은 벡터가 DHFR^-인 숙주 세포에서 사용되는 경우에 특히 유익하다.

그들 자신의 게놈 내에 DHFR 유전자의 카피를 포함하는 숙주 세포 (예를 들어 CHO DHFR⁺)에서 DHFR 시스템을 사용하기를 원하는 경우에, 야생형 DHFR보다 항엽산제, 예를 들어 MTX에 대해 덜 감수성이고, 따라서 어느 정도로 항엽산제-내성, 각각 MTX-내성인 DHFR 유전자의 돌연변이체/변이체가 사용되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 유전자의 돌연변이로 인해, MTX에 대한 DHFR 유전자의 감수성은 유의하게 감소될 수 있어서, 상기 변이체는 보다 높은 항엽산제 (MTX) 농도에서 사용될 수 있다. 상기 항엽산제 및 특히 MTX에 대해 덜 감수성인 DHFR 변이체는 예를 들어, 감소된 항엽산제/MTX 결합 친화도를 가질 수 있다. 각각의 DHFR 변이체는 야생형 세포주에서 내인성 DHFR 발현의 "과도적정 (overtitration)"을 위해 사용될 수 있다. 각각의 "내성" 또는 덜 감수성인 DHFR 변이체는 선행 기술에 잘 알려져 있다.

발현 벡터는 다음으로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다:

(a) 다음 유전자 요소를 지시된 배열로 포함하는 원형 또는 선형 벡터 핵산 (여기서, 5'에서 3' 방향은 →로 표시된다):

I. (MASM) 발현 카세트의 프로모터 (→)

II. (MASM) 발현 카세트의 포유동물의 증폭가능한 선택가능 마커를 코딩하는 유전자 (→)

III. 임의로 (MASM) 발현 카세트의 인트론 (→)

IV. (MASM) 발현 카세트의 폴리A 부위 (→)

V. (POI) 발현 카세트의 프로모터 (→)

VI. (POI) 발현 카세트의 인트론 (→)

VII. (POI) 발현 카세트 내에 삽입되는, 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (→)

VIII. (POI) 발현 카세트의 폴리A 부위 (→)

IX. (POI') 발현 카세트의 프로모터 (→)

X. (POI') 발현 카세트의 인트론 (→)

XI. (POI') 발현 카세트 내에 삽입되는, 추가의 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (→)

XII. (POI') 발현 카세트의 폴리A 부위 (→)

XIII. (MSM) 발현 카세트의 프로모터 (→)

XIV. (MSM) 발현 카세트의 포유동물 선택가능 마커를 코딩하는 유전자 (→)

XV. (MSM) 발현 카세트의 폴리A 부위 (→)

XVI. PSM 발현 카세트 (→) 또는 (←)

XVII. 벡터 핵산이 원형이면 선형화 제한 부위; 및

(b) 유전자 요소와 동일한 입체형상, 각각 배열을 포함하는 서열 1 또는 서열 16으로 제시된 벡터 핵산 또는 그의 유도체.

그의 원형 형태의 변이체 (a)의 바람직한 실시태양을 도 1 및 상응하는 표 1에 제시한다.

본 발명에 따른 벡터는 발현 카세트를 위에서 상세히 설명된 바와 같이 적절한 순서 및 배향으로 배열함으로써 얻을 수 있다. 발현 카세트/유전자 요소의 배열은 발현 벡터를 조립하기 위해 적합한 제한 효소 및 클로닝 전략을 사용함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 상기 설명한 바와 같은 벡터 핵산을 생산하는 방법을 또한 제공하고, 여기서 상기 방법은 적어도

(a) 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 적어도 하나의 발현 카세트 (POI);

(b) 포유동물의 선택가능 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (MSM);

(c) 포유동물의 증폭가능한 선택가능 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (MASM)의 유전자 요소를, 발현 카세트 (POI)는 5'에서 발현 카세트 (MASM)이 옆에 접하고, 발현 카세트 (MSM)은 발현 카세트 (POI)로부터 3'에 위치하고, 발현 카세트 (MASM), (POI) 및 (MSM)은 동일한 5'에서 3'으로의 배향으로 배열되도록 배열하는 것을 포함한다.

원형 벡터 핵산이 생산되는 경우에, 유전자 요소는 발현 카세트 (MSM)이 발현 카세트 (POI)의 3'에 위치하고, 발현 카세트 (MASM)은 발현 카세트 (MSM)의 3'에 위치하도록 조립된다.

본 발명에 따른 벡터는 많은 상이한 포유동물 숙주 세포에서 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 대체로 게놈 내로 통합되어 유지된다. 숙주 세포의 2개의 주요 형식, 즉 부착 세포의 배양액 및 현탁 배양액이 존재한다. 현탁 배양액이 바람직하다. 대부분의 확립된 세포주는 이들을 현탁 성장에 대해 적응시키기 위해 특별한 노력을 기울이지 않으면 그들의 부착-의존 특징을 유지한다. 상업적으로 입수가능한 배지 제형은 전이를 용이하게 한다. 기본적으로, 폴리펩티드의 발현을 허용한다면 임의의 포유동물 숙주 세포가 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명을 위해 적합한 포유동물 숙주 세포는 마우스 (예를 들어, COP, L, C127, Sp2/0, NS-0, NS-1, At20 또는 NIH3T3), 래트 (PC12, PC12h, GH3, MtT), 햄스터 (예를 들어, BHK, CHO 및 DHFR 유전자 결함 CHO), 원숭이 (예를 들어, COS1, COS3, COS7, CV1 및 Vero) 및 인간 (예를 들어 Hela, HEK-293, 망막-유래 PER-C6, 이배체 섬유모세포로부터 유래된 세포, 골수종 세포 및 HepG2)으로부터 유도된 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 숙주 세포는 CHO 세포이다. 본 발명에 따른 벡터 구성은 설치류 세포, 예를 들어 CHO 및 DHFR 유전자 결함 CHO 세포에서 폴리펩티드를 생산하기에 특히 적합하다.

또한, 본 발명에 따른 발현 벡터를 포함하는 포유동물 숙주 세포를 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 발현 벡터 또는 그의 세그먼트를 게놈 내에 포함하는 안정한 세포주를 제공한다. 세그먼트는 적어도 본 발명에 결정적인 발현 카세트를 포함할 것이다. 벡터 및 그의 특징 및 적합한 숙주 세포는 위에서 상세히 설명되므로, 본 발명자들은 상기 개시내용을 참조한다. 따라서, 상기 설명한 바와 같은 숙주 세포를 생산하는 방법을 또한 제공하고, 여기서 숙주 세포는 제1항 내지 16항 중 적어도 하나의 항에 따른 벡터 핵산으로 형질감염된다.

발현 벡터를 포유동물 숙주 세포 내로 도입하기 위한, 당업계에 공지된 몇몇 적절한 방법이 존재한다. 각각의 방법은 인산칼슘 형질감염, 전기천공, 리포펙션 (lipofection), 바이오리스틱 (biolistic)- 및 중합체-매개 유전자 전달을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 적합한 숙주 세포는 상기한 바와 같다.

발현 벡터 핵산을 숙주 세포(들) 내로 도입한 후, 얻어진 형질전환체를 발현 카세트 (MSM)에 혼입된 포유동물의 선택가능 마커 유전자의 발현을 분석하기 위해 적합한 선택 조건 하에서 배양한다. 이것은, 예를 들어, 포유동물의 선택가능 마커 유전자가 항생제 내성 유전자일 때, 형질전환체를 포유동물 세포에서 활성을 보이는 상응하는 항생제를 함유하는 배지 내에서 배양하고, 상기 조건 하에 생존가능한 형질전환체를 선택하여 마커 유전자 및 따라서 편입된 벡터를 발현하는 형질전환체를 수득할 수 있음을 의미한다. 추가로, 제2 선택 단계는 발현 카세트 (MASM)에 포함된 증폭가능한 선택가능 마커 유전자를 선택하기 위해 적용된 선택 배지 내에서 형질전환체를 배양함으로써 수행할 수 있다. 예를 들어, DHFR이 증폭가능한 선택가능 마커 유전자로서 사용되는 경우에, 형질전환체는 DHFR 억제제의 존재 하에 뉴클레오티드 또는 퓨린-미함유 배지 내에서 배양될 수 있다.

유도가능 프로모터가 적어도 하나의 발현 카세트 내에 사용되는 경우에, 폴리펩티드의 발현을 개시하기 위해 대응하는 유도 신호가 제공되어야 한다.

DHFR 선택/증폭 시스템을 이용하기 위해서, 상기 숙주 세포를 DHFR 억제제의 존재 하에 배양할 수 있다. 적합한 DHFR 억제제는 항엽산제, 예를 들어 MTX이다. 사용된 항엽산제/MTX의 농도는 숙주 세포 및 벡터에 편입된 DHFR 변이체에 따라 결정된다. 농도 범위는 DHFR^- 숙주 세포에서 다단계 증폭 절차를 위해, 예를 들어 약 5 nM - 20 nM의 값에서 및 2차 또는 추가의 증폭 단계를 위해 500 nM 내지 1000 nM 이상의 값에서 선택될 수 있다. DHFR⁺ 세포에 대해, 출발 농도는 대체로 제1 단계에서 100 nM 내지 750 nM, 바람직하게는 500 nM, 및 추가의 증폭 단계를 위해 500 nM 내지 1000 nM 이상의 범위로 보다 높다. 적합한 DHFR 변이체는 위에서 설명된 바 있다.

GS 선택/증폭 시스템을 이용하기 위해서, 상기 숙주 세포는 예를 들어 MSX의 존재 하에 배양될 수 있다. 사용된 MSX의 농도는 숙주 세포에 따라 결정된다. 농도 범위는 약 15 내지 150 μM, 20 내지 100 μM, 및 25 내지 50 μM 사이에서 선택될 수 있다. 이들 범위는 NSO 및 CHO 세포에 특히 적합하다.

본 발명에 따른 발현 벡터를 사용하여, 몇 개의 상이한 관심있는 폴리펩티드를 발현/생산할 수 있다. 용어 폴리펩티드는 펩티드 결합(들)에 의해 함께 연결된 아미노산의 중합체를 포함하는 분자를 나타낸다. 폴리펩티드는 임의의 길이의 폴리펩티드, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 50개 초과의 아미노산을 갖는) 및 펩티드 (예를 들어, 2 - 49개의 아미노산)를 포함한다. 폴리펩티드는 임의의 활성 또는 생활성의 단백질 및/또는 펩티드, 예를 들어 생활성 폴리펩티드, 예를 들어 효소 활서의 단백질 또는 펩티드 (예를 들어 프로테아제, 키나제, 포스파타제), 수용체 단백질 또는 펩티드, 수송체 단백질 또는 펩티드, 살균 및/또는 내독소-결합 단백질, 구조 단백질 또는 펩티드, 면역 폴리펩티드, 독소, 항생제, 호르몬, 성장 인자, 백신 등을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 펩티드 호르몬, 인터류킨, 조직 플라스미노겐 활성인자, 시토킨, 면역글로불린, 특히 항체 또는 그의 항체 단편 또는 변이체로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다. 상기 면역글로불린은 임의의 이소형의 것일 수 있다. 매우 종종, IgG (예를 들어 IgG1) 분자가 치료 단백질로서 생산/요구된다. 항체 단편은 적어도 여전히 항원 결합 능력을 갖는, 상기 전체 항체로부터 적어도 20개 아미노산, 바람직하게는 적어도 100개 아미노산을 포함하는 항체의 임의의 단편이다. 항체 단편은 항체의 결합 구역, 예를 들어 Fab 단편, F(ab)2 단편, 다수의 결합 도메인을 포함하는 멀티바디 (multibody), 예를 들어 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody) 또는 테트라바디 (tetrabody), 단일 도메인 항체 또는 애피바디 (affibody)를 포함할 수 있다. 항체 변이체는 동일한 결합 기능을 갖지만 예를 들어 변경된 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편의 유도체이다. 상기 항체 및/또는 항체 단편은 쥐 경쇄, 인간 경쇄, 인간화 경쇄, 인간 중쇄 및/또는 쥐 중쇄 및 그의 활성 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 항체 및/또는 항체 단편은 예를 들어 쥐, 인간, 키메라 (chimera) 또는 인간화 항체일 수 있다.

또한, 본 발명에서는 관심있는 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명에 따른 벡터 핵산을 포함하는 적어도 하나의 숙주 세포를 상기 관심있는 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에 세포 배양 배지 내에서 배양하는 것을 포함한다.

다음 단계에서, 상기 폴리펩티드는 세포 배양액으로부터 단리/수거될 수 있다. 발현된 관심있는 폴리펩티드는 숙주 세포를 파괴함으로써 얻을 수 있다. 폴리펩티드는 또한 배양 배지 내로 발현되고, 예를 들어 분비될 수 있고, 그로부터 얻을 수 있다. 또한, 각각의 방법의 조합이 가능하다. 그에 의해, 생성물, 특히 폴리펩티드는 고수율로 효율적으로 생산되고 수득/단리될 수 있다. 수득한 폴리펩티드는 또한 관심있는 생성물을 목적하는 품질로 생산하기 위해 추가의 처리 단계, 예를 들어 정제 및/또는 변형 단계로 처리할 수 있다.

하나의 대안에 따라, 상기 관심있는 폴리펩티드는 세포 배양 배지 내로 분비되고, 후속적으로 세포 배양 배지로부터 단리된다. 폴리펩티드는 바람직하게는 면역글로불린 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 기능성 단편이다. 관심있는 폴리펩티드의 분비를 촉진하기 위해, 리더 (leader) 서열이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 면역글로불린 분자의 리더 서열이 사용된다.

본 발명에 따른 발현 벡터 및 적합한 숙주 세포 및 관심있는 폴리펩티드는 위에서 상세히 설명된 바와 같고; 본 발명자들은 상기 개시내용을 참조한다.

관심있는 폴리펩티드를 생산하는 방법은 다음 단계 중의 적어도 하나를 포함할 수 있다:

- 상기 세포 배양 배지로부터 및/또는 상기 숙주 세포로부터 관심있는 폴리펩티드의 단리; 및/또는

- 단리된 관심있는 폴리펩티드의 처리.

본 발명에 따라 생산된 관심있는 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법에 의해 회수되고/되거나, 추가로 정제되고/되거나, 단리되고/되거나 변형될 수 있다. 예를 들어, 생성물은 원심분리, 여과, 한외-여과, 추출 또는 침전을 포함하고 이로 제한되지 않는 통상적인 절차에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다. 정제는 크로마토그래피 (예를 들어 이온 교환, 친화도, 소수성, 크로마토포커싱 (chromatofocusing), 및 크기 배제), 전기영동 절차 (예를 들어, 예비 등전 포커싱), 차별적 용해도 (예를 들어 황산암모늄 침전) 또는 추출을 포함하고 이로 제한되지 않는, 당업계에 공지된 다양한 절차에 의해 수행할 수 있다.

제약 단백질/펩티드의 생산을 위해 특히 유리한 한 실시태양에 따르면, 숙주 세포는 무혈청 조건 하에 현탁액으로 배양된다. 수득된 폴리펩티드는 그 후에 예를 들어, 크로마토그래피 방법 (예를 들어 친화도 정제)을 사용하여 세포 배양 상등액 내에 존재하는 폴리펩티드를 정제함으로써 정제될 수 있다.

본 발명에 따라 생산된 폴리펩티드는 우수한 안정성 특성을 보인다. 결과는 또한 폴리펩티드가 기능적 형태로 발현되고 따라서 올바른 입체형태로 발현됨을 보여준다. 따라서, 본 발명에서는 또한 위에서 상세히 설명되어 있는 발현 벡터를 사용하는 본 발명에 따른 생산 방법에 의해 수득된 폴리펩티드를 제공한다. 상기 개략한 바와 같이, 폴리펩티드는 우수한 수율로 수득된다. 폴리펩티드는 바람직하게는 면역글로불린 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 기능성 단편이다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시태양에 따른 원형 벡터 핵산을 보여준다.
도 2는 선형화 제한 부위의 위치의 영향을 입증하기 위해 도 1에 따른 벡터 핵산의 선형화 버전을 보여준다.

도 1 및 2에 도시된 숫자 1 내지 17은 벡터 핵산의 유전자 요소/특징을 가리키고, 하기 표 1에 상세히 설명된다. 달리 규정되지 않으면, 백색 화살표는 프로모터 또는 프로모터/인핸서 요소를 특징짓고; 줄무늬 네모는 인트론 요소를 특징짓고; 흑색 화살표는 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 폴리뉴클레오티드를 상징하고; 체크무늬 네모는 폴리A 부위를 특징짓고; 체크무늬 화살표는 발현 카세트 (MSM) 및 (MASM)의 포유동물 마커 유전자를 특징짓고; 줄무늬 화살표는 원핵생물의 선택가능 마커 유전자를 특징짓는다. 제시된 바와 같이, 모든 유전자 요소는 동일한 5'에서 3'으로의 배향 (화살표 방향으로 지시되는)으로 배열된다. 아래에서 추가로 상세히 설명되는 벡터 핵산 pBW147, pBW154 및 pBW160이 각각 구성된다.

후속적으로, 설명된 벡터 요소의 적합한 예가 주어지지만, 이는 비-제한적이다.

포유동물의 증폭가능한 선택가능 마커로서, DHFR의 사용이 바람직하다. 야생형 마우스 DHFR 폴리뉴클레오티드의 적합한 예는 서열 5로 제공되고, 이는 바람직하게는 DHFR^- 숙주 세포와 함께 사용된다. 적합한 돌연변이체 형태의 DHFR은 서열 6으로 제공된다. 각각의 돌연변이체 형태는 바람직하게는 DHFR+ 세포와 함께 사용된다. 서열 12는 선택 압력을 추가로 증가시키기 위해 적합한 인트론을 포함하는 돌연변이체 DHFR을 보여준다 (상기 참조). 또한, 상기한 것의 기능성 변이체 또는 단편을 사용할 수 있다.

포유동물의 선택가능 마커 유전자로서, neo의 사용이 바람직하다. 적합한 서열은 서열 7로 제공된다. 또한, 그의 기능성 변이체 또는 단편을 사용할 수 있다.

관심있는 폴리펩티드의 발현을 추진하기 위한 프로모터 서열로서, CMV 프로모터의 사용이 바람직하다. 적합한 서열은 서열 8로 제공된다. 또한, 그의 기능성 변이체 또는 단편을 사용할 수 있다.

선택가능 마커 유전자 MSM 및 MASM의 발현을 추진하기 위한 프로모터 서열로서, SV40 프로모터의 사용이 바람직하다. 적합한 서열은 서열 9로 제공된다. 또한, 그의 기능성 변이체 또는 단편을 사용할 수 있다.

관심있는 폴리펩티드 및/또는 MASM에 대한 폴리아데닐화 서열로서, SV40 폴리A 부위가 사용될 수 있다. 적합한 서열은 서열 10으로 제시된다. 또한, 그의 기능성 변이체 또는 단편 또는 역배향 (후기 또는 조기 SV40 폴리A 부위)를 사용할 수 있다.

관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (POI)에 대한 인트론 서열로서, Rk 인트론이 사용될 수 있다. 적합한 서열은 서열 11로 제공된다. 또한, 그의 기능성 변이체 또는 단편을 사용할 수 있다.

예를 들어 포유동물 선택가능 마커 (MSM)와 함께 사용될 수 있는 합성 폴리아데닐화 부위는 서열 13으로서 제시된다. 또한, 그의 기능성 변이체 또는 단편을 사용할 수 있다.

적합한 세균 선택가능 마커 (PSM)은 예를 들어, 암피실린 내성을 제공하는 베타-락타마제 유전자이다. 적합한 서열은 서열 14로 제공된다. 또한, 그의 기능성 변이체 또는 단편을 사용할 수 있다.

또한, 벡터 핵산은 예를 들어, 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위한 적어도 하나의 다중 클로닝 부위 (MCS)를 포함할 수 있다. MCS는 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 및 5'에 제공될 수 있다. 적합한 MCS 부위는 서열 4 (바람직하게는 5' 부위/구역에 위치함) 및 서열 15 (바람직하게는 3' 부위/구역에 위치함)로서 제공된다. 이들 MCS 부위는 예를 들어, 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위해 사용될 수 있다.

특히 바람직한 벡터 핵산은 서열 1 (야생형 DHFR 유전자 포함, 상기 벡터는 DHFR- 시스템에 대해 특히 유용하다) 및 서열 16 (돌연변이된 DHFR 유전자 포함, 상기 벡터는 DHFR + 시스템에 대해 특히 유용하다)으로서 제시된다.

본원에서 인용되는 모든 참조문은 참조로 포함되고, 따라서 본원의 개시내용의 일부를 형성한다.

실시예

본 발명은 이제 비-제한적인 예에 의해 설명되지만, 이는 본 발명의 바람직한 실시태양을 구성한다.

I. 세포 배양 방법 및 형질감염

이어서, 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위해 본 발명에 따른 숙주 세포를 형질감염시키고 배양하기 위한 적절한 방법을 예로서 설명한다.

실시예 1: 세포 배양

CHO 세포를 적합한 CHO 배지, 예를 들어 ExCell81134 (에스에이에프씨 바이오사이언시즈 (SAFC Biosciences)로부터 입수함) 내에서 배양한다. 세포를 주당 2-3회 신선한 배지 내로 통과시키고, 연구 전체 기간 동안 로그 성장기에서 유지시킨다.

실시예 2: 형질감염 전략

형질감염을 위해, 생활력이 90%를 초과하는 지수 성장기의 모계 CHO 세포를 사용한다. 리포펙션에 의한 형질감염은 제조자의 지시에 따라 DMRIE-C 반응물질 (인비트로겐 (Invitrogen))을 사용하여 수행한다. 세포 양을 OptiMEM I 배지 (인비트로겐) 내에 1x10⁶ 세포로 조정한다. 리포펙션을 위해, 2 ㎍ 또는 4 ㎍의 발현 벡터 및 4 ㎕의 DMRIE-C 시약을 28 min 동안 실온에서 함께 혼합하고, 세포에 4 h 동안 37℃에서 첨가한다. 이어서, 세포를 2x10⁵ 세포/ml 배양 배지로 희석하고, 2일 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이팅한다.

실시예 3: 네오마이신 선택 및 유전자 증폭

발현 벡터 핵산 상에 위치하는 네오마이신 선택 마커는 G418 내성에 대한 선택을 허용한다. 형질감염체의 선택을 위해, 세포를 0.8 mg/ml G418 (인비트로겐)의 존재 하에 약 2주 동안 배양한다. 형질감염 및 G418 선택 2주 후에, 주로 G418 내성 세포로 이루어지는 풀 (pool) 집단이 나타난다. 이어서, 세포를 뉴클레오티드의 부재 하에 약 2주 동안 배양한다. 이어서, 20 nM MTX를 배양 배지에 첨가하여 유전자 증폭을 개시시킨다. 3주 배양 후에, 증폭된 비균질 세포 풀이 생성된다. DHFR (디히드로폴레이트 리덕타제) 선택/증폭 마커는 엽산 유사체 메토트렉세이트 (MTX)를 배양 배지에 첨가함으로써 DHFR 유전자의 증폭 및 도입유전자 (transgene)의 증폭을 허용하여, 형질감염 풀에 대한 역가를 증가시킨다. 이어서, 위기 회복 후에, 풀은 각각 약 2주 동안 보다 높은 MTX 농도 (100 nM 및 500 nM MTX)를 사용하여 제2 및 제3 증폭 단계를 겪는다. 각각의 단계에서, 세포는 풀 회수 후에 동결시킨다.

실시예 4: 클로날 세포주의 확립

클로날 세포주 (즉, 단일 세포로부터 유래된 세포주)를 얻기 위해, 안정하게 형질감염된 세포의 풀을 희석하고 96 웰 플레이트 내에서 0.3 - 0.5 세포/웰의 세포 밀도로 접종할 수 있다 (제한 희석). 구분되는 콜로니를 형성하는 세포를 표준 절차를 이용하여 규모를 확대시킨다. 궁극적으로, 개별 클론을 재조합 폴리펩티드 발현에 대해 평가하고, 최고 생산자를 배양 및 분석을 위해 보유한다. 이들 후보로부터, 적절한 성장 및 생산력 특징을 갖는 세포주를 재조합 단백질의 생산을 위해 선택한다. 생산력은 대체로 배양 조건을 확립/조정함으로써, 즉, 펩톤과 같은 첨가제를 첨가함으로써 추가로 개선될 수 있다.

II . 벡터 구성

본 발명의 교시 내용에 따른 몇몇 벡터 조립체가 실현 가능하다. 벡터의 개별 요소는 당업계에 공지되어 있으므로, 적합한 벡터는 예를 들어, 목적하는 배향으로의 기본 유전자 요소 및 발현 카세트의 서열결정 또는 증폭 및 적절한 클로닝에 의해 조립할 수 있다. 각각의 클로닝 방법은 당업계의 기술 수준 내에 있고, 또한 상기 설명된 유전자 요소의 서열은 당업계에 설명되어 있다. 후속적으로, 몇몇 벡터 구성체의 생성을 예로서 설명한다. 그러나, 당업자는 각각의 벡터를 얻기 위한 몇몇 다른 실시태양 및 방식이 적합하고 쉽게 이용가능함을 이해할 것이다.

예로서 본원에서 설명되는 벡터 구성체 및 그들의 전구체 벡터의 배열의 이해를 용이하게 하기 위해, 표 1 및 2에서는 이들 벡터 내에 포함된 주요 유전자 요소, 그들의 순서 및 배향에 관한 개요를 제공한다. 물론, 주요 요소만이 제공되지만, 벡터는 추가의 유전자 요소 또는 백본 서열을 포함할 수 있다. 표 내의 각각의 컬럼은 하나의 벡터 구성체를 나타낸다. 상부 열로부터 하부 열로, 발현 카세트의 유전자 요소가 벡터 상의 그들의 배열 및 배향의 순서로 나열된다. 설명된 벡터는 원형이므로, 각각의 컬럼의 마지막 열에 제시된 요소는 실제로 제1열에 제시된 유전자 요소에 인접한다 (물론, 백본 서열이 존재할 수 있다). 각각의 유전자 요소의 배향은 화살표로 표시된다. 화살촉은 각각의 유전자 요소의 3' 방향을 가리킨다.

상기 표 1 내지 3과 도 1 및 2의 약자는 당업자에게 명백한 및 상기 설명한 바와 같은 통성적인 의미를 갖고, 특히 다음 의미를 갖는다:

MCS = 다중 클로닝 부위

mAB-HC = 모노클로날 항체 중쇄

mAB-LC = 모노클로날 항체 경쇄

인트론 = 문헌 [Grillari et al, 2001, 3. Biotechnol. 87, 59-65] 참조

prom/enh = 프로모터/인핸서

실시예 5: 발현 벡터 pBW147 의 구성

본 구성에서, bgh pA-부위와 조합된 mAB 유전자 및 DHFR^* (야생형 DHFR보다 MTX에 대한 감수성이 더 낮은 돌연변이 변이체)의 직렬 (tandem) 입체형상을 시험한다. DHFR^* 카세트는 mAB-LC를 포함하는 발현 카세트 (POI) 앞의 5'에 놓이고, 따라서 모든 개방 해독 프레임은 하나의 해독 방향으로 놓인다. pBW147의 조립을 표 3에 제시한다.

pBW147은 pBW133 (표 2를 또한 참조한다)으로부터 구성될 수 있다. pBW147의 구성은 본원에서 설명된다.

pBW133 의 구성

아래 설명되는 벡터 구성은 상업적으로 입수가능한 pCI-neo 발현 벡터 (프로메가 코오퍼레이션 (Promega Cooperation, 미국))에 기초한 것이다. 전체 DNA 서열은 공개적으로 이용가능하다 (GenBank/EMBL 기탁 번호: U47120). 새로운 다중 클로닝 부위가 pCIneo 내에 도입된다.

다중 클로닝 부위의 2개 가닥은 드 노보 (de novo)로 합성된다. pCIneo를 NheI 및 XmaI로 절단한다. 오래된 MCS는 겔 전기영동에 의해 제거한다. 새로운 다중 클로닝 부위는 안티센스 가닥의 5' 단부의 4개의 말단 뉴클레오티드 및 상부 DNA 가닥의 3' 말단 단부가 합성되지 않는 방식으로 합성된다. 두 가닥의 어닐링 (annealing) 후에, NheI 및 XmaI에 대한 적합성 (compatible) 단부가 생성된다.

새로운 다중 클로닝 부위의 서열은 다음과 같다 (서열 2 참조):

pCIneo를 새로운 MCS와 라이게이션하여 생성되는 플라스미드는 설명을 위해 pCI-neo-2로 간주한다. pCI-neo-2는 pRK5 (비디 파밍겐)로부터의 pRK 인트론을 도입함으로써 추가로 변형된다. 따라서, pCI-neo-2를 ApaI로 소화시킨다. T4 중합효소 처리에 의해 블런트 (blunt) 말단을 생성시킨다. 이어서, 플라스미드를 NdeI로 소화시킨다. pRK5를 NdeI 및 NruI (블런트 말단 절단기)로 소화시킨다. RK 인트론 함유 단편을 단리하고, pCIneo2 백본과 라이게이팅시킨다. 생성되는 플라스미드는 pCIneo2RK이다.

두 발현 카세트를 하나의 벡터 상에 놓기 위해, 벡터 pCIneoDHFR^*-RK를 얻을 수 있다. pCIneoDHFR^*-RK는 다음과 같이 수득한다:

DHFR^* 발현 카세트를 벡터 pCHI-LC (Simulect SP2/0 경쇄 발현 벡터)로부터 PCR에 의해 증폭시킨다. 프라이머는 BB35 (GGGCACTACGTGCCGCGGATTTAAATGCGGCCGCATATGGTGCACT - 서열 3) 및 BB36 (GGGCACGTAGTGTTTATTAGGGGAGCAGAGAACTTGAA - 서열 4)이다.

PCR 단편을 DraIII 제한 소화를 통해 pCIneoRK 내로 클로닝하여, 벡터 pCIneoDHFR^*-RK를 제공한다. pCIneoDHFR^*-RK는 Eco0109I를 사용한 소화에 의해 개방된다. 블런트 말단을 생성시키기 위해서, Klenow 효소를 사용한 처리를 그 후에 수행한다.

pCIneo2RK로부터의 발현 카세트는 플라스미드를 BglII, NgoMIV 및 StuI로 소화시킴으로써 절제한다. 2개의 단편의 라이게이션 후에, "빈" 발현 벡터 pCHO2neoN이 생성된다. pCHO2neoN 내로 MluI 및 SalI 제한 부위를 통해 항체 경쇄 유전자를 삽입하여, 벡터 구성체를 생성하고 이를 pBW108로서 칭한다. 따라서, 항체 유전자는 2개의 제한 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 증폭된다.

mAB 중쇄를 벡터의 PmeI 및 AscI 소화를 통해 pBW108 내로 삽입하고, 그에 의해 설명을 위해 pBW111로 간주되는 벡터 구성체를 수득한다. 중쇄는 5' 말단에서 블런트 말단을 생성하고, 유전자의 3' 말단에서 AscI 제한 부위를 함유하도록 PCR 증폭된다.

pBW111에서, 추가의 ATG 코돈이 경쇄 cDNA의 앞에 존재하기 때문에 경쇄의 5' 비-번역 구역 말단은 교환된다. 이는 pBW111으로부터 BglII / MluI 단편을 절제하고, 이를 정확한 단편으로 교체함으로써 달성된다. 새로운 플라스미드는 pBW133으로 간주된다. pBW133은 모든 유전자를 하나의 플라스미드 상에 갖는 제1 벡터이다. 유전자의 배열은 LC - DHFR (반대 방향) - neo - HC이다 (또한 표 2 참조). 상기 벡터는 본 발명의 교시 내용에 따른 벡터를 수득하기 위해 사용할 수 있는 출발 물질 중 하나이다. 그러나, 각각의 벡터를 얻기 위해 몇몇 다른 방식이 존재함이 명백하다.

pBW139 의 구성

pBW147을 얻기 위해 사용할 수 있는 제2 벡터 구성체는 pBW139의 입체형상을 갖는다. pBW139는 pBW115로부터 생성될 수 있다. pBW115의 구성을 위해, 중쇄 유전자를 pCIneoRK 내로 클로닝한다 (상기 참조). 따라서, pCIneoRK는 MluI 및 NruI (블런트 말단 절단기)로 소화시키는 반면, 중쇄 PCR 단편은 AscI (3') (MluI에 적합성인)로 소화시키고, 5'에서 블런트를 생성시킨다. 생성되는 플라스미드를 pBW115로 간주한다. pBW115를 ScaI 및 BglII로 소화시킨다. 이어서, Klenow 필-인 (fill-in)을 수행하여 블런트 말단을 생성시킨다. 경쇄 발현 카세트를 ScaI 및 DraIII을 사용하여 pBW133으로부터 절제한다. 블런트 말단을 생성시키기 위해, T4-DNA 중합효소 처리를 수행한다. 라이게이션에 의해 pBW139와 같은 입체형상을 갖는 벡터가 생성된다 (표 2 참조).

pBW147 의 조립

pBW147을 얻기 위해, pBW133을 SpeI, XhoI로 소화시킨다. CMV 프로모터의 일부 및 중쇄의 제1 부분을 함유하는 단편을 단리시키고 pBW139에 라이게이팅하고, 이를 또한 SpeI, XhoI로 절단한다. 생성되는 벡터에서, 방해하는 추가의 ATG 코돈 없이 중쇄 카세트가 발견된다. 경쇄를 벡터 내로 다시 넣기 위해, pBW139를 SpeI로 소화시킨다. LC 함유 단편을 pBW148 내로 삽입하고, 이를 SpeI로 개방시킨다. 생성되는 플라스미드는 pBW146과 같은 입체형상을 갖는다 (표 2 참조).

pBW146에서, pBW112 (다른 프로젝트로부터의 발현 벡터)로부터의 DHFR 유전자를 삽입한다. 그러나, DHFR 유전자는 또한 목적하는 DHFR 변이체의 종류에 따라 상이한 공급원으로부터 수득할 수 있다. pBW146은 BglII로 소화시킨다. 그 후에, DHFR 카세트를 BglII 및 BamHI 제한 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킨다. PCR 단편을 2개의 효소로 소화시키고, pBW146의 적절한 BglII 부위 내에 삽입한다. 생성되는 플라스미드는 pBW147과 같은 입체형상을 갖고, 여기서 모든 발현 카세트는 동일한 배향을 갖는다. 구조를 표 3에 제시한다.

상기 발현 벡터는 안정한 형질감염을 얻기 위해 사용될 수 있다. 발현 수율을 추가로 증가시키기 위해, 매우 MTX "감수성"인 야생형 DHFR 변이체를 선택할 수 있고, 여기서 또한 MTX 농도는 적당하게 조정되어야 한다.

실시예 6: 발현 벡터 pBW154 의 구성

상기 벡터에 대하여, mAB 유전자 및 pSV2DHFR (MTX에 대한 높은 감수성을 갖는 야생형 버젼의 DHFR)로부터의 DHFR 유전자 카세트의 직렬 입체형상을 시험한다. pSV2DHFR (ATCC#374146)로부터의 DHFR 발현 카세트를 PCR에 의해 증폭시킨다. 단편은 프로모터 및 폴리A 부위를 함유하였다. 앞에서와 같이, 올리고는 BglII / BamHI 제한 부위를 갖는다. DHFR 발현 카세트를 pBW146의 BglII 제한 부위에 삽입하여, pBW154와 동일한 구조를 갖는 벡터 구성체를 생성시킨다. pBW154의 구조를 표 3에 제시하고, 유전자 요소의 각각의 전체 구조/입체형상을 갖는 벡터 구성체의 일반적인 예를 보여주는 도 1 및 2로부터 유도할 수 있다. pBW154의 서열은 서열 1로서 제공한다. 서열 1에서 경쇄 폴리뉴클레오티드를 n (우선권 주장의 기초가 되는 출원에서는 위치소유자 (placeholder) V로 나타냄)으로 표지하고, 중쇄 폴리뉴클레오티드를 n (우선권 주장의 기초가 되는 출원에서는 위치소유자 Y로 나타냄)으로 표지한다. pBW154의 특징을 표 4에 요약한다. 물론, 또한 다른 벡터 요소, 예를 들어 상이한 프로모터, 상이한 인핸서, 상이한 폴리A 부위 및 다른 요소, 예를 들어 상이한 ori를 사용할 수 있다. 또한, 면역글로불린 분자의 경쇄 및 중쇄에 대해 발현 카세트를 스위칭 (switching)하는 것도 가능하다. 그러나, 벡터 요소의 제시된 선택 및 배열이 바람직하다. 상기 개략한 바와 같이, 또한 면역글로불린 분자의 기능성 단편을 사용할 수 있다. 따라서, 지시된 "nnn"은 단지 예시를 목적으로 하고, 보다 작은 또는 보다 큰 면역글로불린 서열이 대응하는 위치에 존재할 수 있으므로 임의의 크기 제한을 나타내지 않는다. 본 발명의 바람직한 실시태양에 따른 벡터의 일반적인 구성을 보여주는 도 1 및 2와의 비교를 완화하기 위해, 본 발명자들은 도 1 및 2에서 대응하는 요소의 넘버링을 표시하였다.

모든 유전자 요소는 동일한 5'에서 3'으로의 배향으로 배열된다. 야생형 DHFR을 사용하는 상기 벡터 구성체에서, 상기 설명한 바와 같은 유전자 증폭은 매우 효율적으로 작용한다. 표준 배치 (batch) 실험에서 역가는 10-20배 증가될 수 있다. 본원에서, MTX 증폭 시에 항체 발현 역가의 큰 증가가 관찰된다. G418 처리로부터 출발하여, 뉴클레오티드 없이 몇몇 상이한 농도까지의 MTX (20 및 100 nM MTX)를 사용한 처리에 걸쳐, 역가는 끊임없이 그리고 상당히 증가한다. 그러나, 각각의 높은 농도가 사용될 수는 있지만, 훨씬 더 높은 MTX 농도 (예를 들어 500 nM MTX)를 사용하여도 대체로 CHO 세포에서 추가의 잇점을 제공하지 않는다. 선택/증폭 공정에 걸쳐 풀에 대해 얻어진 항체 역가는 표준 배양 절차를 사용할 때 2 내지 60 mg/L 초과의 범위이다. 발현 역가는 추가로 풀로부터 클로날 세포주를 확립할 때, 및 수득가능한 역가는 또한 사용된 배지에 따라 결정되므로 세포 발현을 향상시키기 위해 맞춤 배지를 사용하여 증가될 수 있다.

실시예 7: 발현 벡터 pBW160 의 구성

본 실험은 또한 벡터 내의 DHFR 유전자의 배향이 결정적임을 입증한다. pBW146 (상기 참조) 내에, EcoRI 제한 부위가 존재한다. 최종 발현 벡터 내에 존재하는 단일 절단기로서 EcoRI를 갖기 위해, pBW146을 EcoRI로 소화시키고, Klenow 필-인을 수행하고, 탈락시킴으로써 부위를 제거할 수 있다. 이에 의해 pBW158과 같은 입체형상을 갖는 플라스미드가 생성된다 (도시하지 않음). DHFR 카세트가 상기 설명된 바와 같이 pBW158 내에 통합될 수 있다. 두 배향 (pBW159 및 pBW160에 제시된 배향, 표 2 및 3 참조)은 자동으로 생성되므로, 둘 모두 발현 수준에 대해 시험할 수 있다. 본 발명의 결과는 모든 개방 해독 프레임이 하나의 5'에서 3' 해독 방향으로 배향된 입체형상의 우수한 성능을 보여준다.

pBW159 벡터와 같은 입체형상을 갖는 벡터 (표 2 참조) (여기서, DHFR 배향은 mAB 유전자의 역순이다)는 대체로 MTX 증폭 (대체로 1 mg/L 미만) 후에도 단지 매우 낮은 발현 역가를 보인다. pBW160과 같은 디자인을 갖는 벡터 (표 3 참조) (여기서, DHFR 배향은 mAB 유전자와 인 프레임 (in frame)인 배향이다)는 5 mg/L 초과, 심지어 10 초과, 또는 심지어 15 mg/L 초과의 보다 높은 항체 역가 (풀로부터 수득가능한)를 제공할 수 있다. 다시, 클로날 세포주를 확립함으로써 및 고성능 배지를 사용함으로써, 역가 수율은 본 발명에 따른 벡터 구성체를 사용할 때 추가로 증가될 수 있다.

상기 실험은 본 발명의 교시 내용에 따라 사용되는 바와 같은 선택 마커 및 mAB 코딩 유전자의 "인 프레임 입체형상"의 잇점을 입증할 수 있다. 상기 결과는 벡터 요소의 5' 내지 3' 배향이 높은 발현 벡터를 위한 중요한 인자라는 발견을 지지한다. 또한, 본 발명에 따른 발현 벡터를 사용할 때 발현 안정성은 매우 유리하다.

본 발명에 따른 벡터 입체형상은 높은 세포 특이적 생산력을 갖는 세포 풀의 용이한 생성을 가능하게 한다. 핵심 요소는 5' 내지 3' 배향, 선택된 DHFR 변이체, 및 벡터 상의 DHFR 선택 마커의 배치뿐만 아니라 플라스미드 상의 항체 유전자 및 제2 선택 마커 (neo)의 배열이다. 또한, 벡터는 비-항체 단백질 또는 펩티드의 생산을 위해 사용될 수 있다. 상기 설명한 바와 같이, DHFR 카세트의 근소한 조정을 이용하여, 상기 시스템은 DHFR 양성 CHO-K1PD 세포주에서 유전자 증폭을 위해 사용가능하다. DHFR⁺ 숙주 세포에서 유전자 증폭을 위해, 돌연변이된 버전의 DHFR 유전자가 사용된다 (상기 참조). pBW117과 같은 돌연변이된 버전의 DHFR 유전자를 포함하는 벡터의 완전 DHFR 발현 카세트는 BamHI 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭될 수 있다. 이어서, 단편을 pBW158의 BglII 부위 내로 클로닝하여, 벡터 pBW165를 생성시킨다. 돌연변이된 DHFR 유전자를 포함하는 pBW165와 같은 입체형상을 갖는 벡터를 사용하여 (및 다른 항체를 사용하여 추적하여), 고수율 세포주가 DHFR⁺ 세포주인 CHO-K1-PD 숙주 세포 내에서 생성될 수 있다. 각각의 벡터 서열의 예는 서열 16으로 제공된다. 물론, 제시된 것과 상이한 벡터 요소, 예를 들어 상이한 프로모터, 상이한 인핸서, 상이한 폴리A 부위 및/또는 다른 요소, 예를 들어 상이한 ori를 또한 사용할 수 있다. 또한, 면역글로불린 분자의 경쇄 및 중쇄에 대해 발현 카세트를 스위칭하는 것도 가능하다. 그러나, 벡터 요소의 제시된 선택 및 배열이 바람직하다. 상기 개략한 바와 같이, 전장 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 기능성 단편을 벡터로부터 발현시킬 수 있다. 서열 16 내에, 각각의 면역글로불린 서열이 최종 발현 벡터 내에 위치/삽입될 수 있는 부위만을 삽입 부위로서 나타낸다. 임의의 면역글로불린 서열이 대응하는 위치에 존재할 수 있다. 또한, 상기 개략한 바와 같이, 관심있는 상이한 폴리펩티드를 발현시키는 것도 또한 가능하다.

실시예 8: 형질감염된 CHO 세포를 사용한 항체의 소규모 생산

현탁 배양액에서 시험을 위해, 세포를 250 ml 둥근 바닥 필터 캡 (filter cap) 배양 플라스크 내에서 50 ml ExCell81134 배지 (에스에이에프씨 바이오사이언시즈) 내에 1x10⁵ 세포/ml로 접종한다. 세포를 37℃에서 10% CO₂ 환경 내에서 연구 기간 동안 큐에너 쉐이커 (Kuehner Shaker) ISF-4-W/인큐베이터 (incubator) 내에서 65 rpm에서 진탕시킨다. 독점 사용권이 있는 (proprietary) 용액을 갖는 단일 공급물을 세포 팽창의 제4일에 시작하는 고정 공급 계획에 따라 제공한다. 제13일에, 1 ml 샘플을 수거하고, 표준 HPLC 및 단백질 A 컬럼을 사용하여 역가를 측정한다.

최상의 클론의 진탕 플라스크 배양액으로부터 생성되는 세포 배양 상등액을 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제한다.

실시예 9: 발현된 항체의 단백질 A 정제

단백질 A 정제를 위해, 약 32.4 mg 항체를 함유하는 약 27 mL 무세포 배양 상등액을 0.5x10 cm MabSelect 친화도 컬럼 상에 로딩한다. 로딩 후에, 컬럼을 충분히 세정하고 세척한다. 이어서, 항체를 pH 3-4에서 용출시킨다. 용출액을 단백질 A 컬럼을 사용한 표준 HPLC로 분석하였다. 약 30.5 mg 항체가 수득된다.

III . 세포 특이적 생산력 및 수율에 대한 실시예

클로날 팽창 후에 선택된 클론을 그들의 생산력에 대해 시험한다.

실시예 10: IgG1 항체의 발현

IgG1 항체를 발현시킨다. 클론을 상업적으로 입수가능한 배지 Ex-Cell81134 (SAFC 바이오사이언시즈) 내에서 성장시킨다. 공급물 용액 및 통상적인 첨가제, 예를 들어 펩톤을 첨가한다. 본 발명에 따른 벡터를 사용할 때 높은 생산율을 얻을 수 있다:

Qp = 세포 특이적 생산력.

실시예 11: IgG1 항체 및 IgG4 항체의 발현

IgG1 항체 및 IgG4 항체를 발현시킨다. 클론을 적절한 배양 배지 내에서 성장시킨다. 공급물 용액 및 통상적인 첨가제, 예를 들어 펩톤을 첨가한다. 본 발명에 따른 벡터를 사용할 때 높은 생산율을 얻을 수 있다:

Qp = 세포 특이적 생산력.

실시예 12: 형질감염된 CHO 세포를 사용한 폴리펩티드의 대규모 생산

대규모 폴리펩티드의 생산은 예를 들어, 웨이브 (wave), 유리 또는 스테인레스 스틸 생물반응기 내에서 수행할 수 있다. 이러한 목적으로, 세포를 대체로 단일 동결된 바이알, 예를 들어 매스터 셀 뱅크 (Master Cell Bank)의 바이알로부터 출발하여 팽창시킨다. 세포를 해동하고, 수회의 단계를 통해 팽창시킨다. 상이한 규모의 생물반응기에 적절한 양의 세포를 접종한다. 세포 밀도는 공급물 용액 및 첨가제를 생물반응기에 첨가함으로써 증가시킬 수 있다. 세포를 장시간 동안 높은 생활력에서 유지시킨다. 수백 밀리그램/리터 내지 수 그램/리터 이하의 반응기 내의 생성물 역가가 대규모로 달성된다. 정제는 친화도, 이온 교환, 소수성 상호작용 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있는, 표준 크로마토그래피 방법에 의해 수행할 수 있다. 생물반응기의 크기는 최종 규모에서 수천 리터 이하의 부피일 수 있다 (또한 예를 들어, 문헌 [F. Wurm, Nature Biotechnology Vol. 22, 11, 2004, 1393-1398] 참조).

실시예 13: 새로운 항체 유전자를 벡터 내에 도입하기 위한 클로닝 전략

특히, 새로운 관심있는 폴리펩티드를 삽입하기 위한 하나의 전략은 다음과 같다 (예로서, pBW154와 같은 입체형상을 갖는 벡터를 사용하여 설명함):

경쇄 유전자의 클로닝

경쇄 유전자를 MluI 부위를 ATG 코돈의 5'에 및 SalI 부위를 유전자의 3'에 도입시키는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킬 수 있다. PCR 산물을 이들 2개의 제한 효소를 통해 pBW154 내로 도입시킨다. 이렇게 하여 경쇄만으로 이루어진 중간 벡터를 생성시킨다.

중쇄 유전자의 클로닝

중쇄 유전자를 벡터의 NruI 부위의 사용을 위한 블런트 말단을 ATG 코돈의 5'에 및 XbaI 부위를 유전자의 3'에 도입하는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킬 수 있다. PCR 생성물을 이들 2개의 제한 효소를 통해 pBW154 내로 도입시킨다. 이렇게 하여 이미 존재하는 경쇄 및 새로운 중쇄를 갖는 중간 벡터를 생성시킨다.

최종 벡터의 조립

새로운 mAB-HC 함유 단편을 SalI 소화를 통해 HC 벡터로부터 절제한다. 이어서, 이를 SalI를 통해 LC-중간 벡터 내로 삽입하여 최종적인 새로운 LC-HC 벡터를 생성시킨다.

SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> Organic compounds <130> 52411-WO-PCT <150> 07150339.5-2401 <151> 2007-12-21 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11109 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Vector sequence pBW154 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(743) <223> CMV prom/enh <220> <221> misc_feature <222> (825)..(1024) <223> RK-intron <220> <221> misc_feature <222> (857)..(1000) <223> RK-intron region which is spliced out upon expression <220> <221> misc_feature <222> (1054)..(1767) <223> mAB LC (originally indicated in Seq. Id. No: 1 with symbol "v") <220> <221> misc_feature <222> (1815)..(2036) <223> SV40polyA <220> <221> misc_feature <222> (2367)..(3109) <223> CMV prom/enh <220> <221> misc_feature <222> (3191)..(3390) <223> RK-intron <220> <221> misc_feature <222> (3223)..(3366) <223> RK-intron which is spliced out upon expression <220> <221> misc_feature <222> (3452)..(4864) <223> mAB HC (originally indicated in Seq. Id. No: 1 with symbol "y") <220> <221> misc_feature <222> (4931)..(5152) <223> SV40 poly A <220> <221> misc_feature <222> (5247)..(5702) <223> f1 region <220> <221> misc_feature <222> (5766)..(6184) <223> SV40 prom <220> <221> misc_feature <222> (6229)..(7023) <223> Neomycin phosphotransferase gene <220> <221> misc_feature <222> (7087)..(7135) <223> Synthetic polyA <220> <221> misc_feature <222> (7546)..(8406) <223> Beta lactamase antibiotic resistance gene <220> <221> misc_feature <222> (9243)..(9243) <223> Unique linearisation site <220> <221> misc_feature <222> (9276)..(9623) <223> SV40prom <220> <221> misc_feature <222> (9521)..(9568) <223> SV40 minimum origin of replication <220> <221> misc_feature <222> (9640)..(10203) <223> DHFR gene <220> <221> misc_feature <222> (9776)..(10426) <223> Intron (Donor - Acceptor) <220> <221> misc_feature <222> (10910)..(11097) <223> SV40polyA <400> 1 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc 660 cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag 780 aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg ccgggaacgg tgcattggaa cgcggattcc 840 ccgtgccaag agtgacgtaa gtaccgccta tagagtctat aggcccaccc ccttggcttc 900 gttagaacgc ggctacaatt aatacataac cttatgtatc atacacatac gatttaggtg 960 acactataga ataacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccaggtccaa 1020 ctgcacctcg gttctatcga aaacgcgtcc accnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1080 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1140 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1200 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1260 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1320 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1380 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1440 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1500 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1560 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1620 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1680 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1740 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnngtc gacccgggcg gccgcttccc tttagtgagg 1800 gttaatgctt cgagcagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag 1860 aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac 1920 cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt 1980 tcagggggag atgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat 2040 ccgataagga tcgatccggg ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 2100 caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg 2160 cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc 2220 ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa 2280 atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gagctttacg gcacctcgac cgcaaaaaac 2340 ttgatttggg tgatggttca cgatcttcaa tattggccat tagccatatt attcattggt 2400 tatatagcat aaatcaatat tggctattgg ccattgcata cgttgtatct atatcataat 2460 atgtacattt atattggctc atgtccaata tgaccgccat gttggcattg attattgact 2520 agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc 2580 gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 2640 acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa 2700 tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 2760 agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac 2820 atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc 2880 atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga 2940 tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg 3000 gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta 3060 cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc 3120 catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggccgg 3180 gaacggtgca ttggaacgcg gattccccgt gccaagagtg acgtaagtac cgcctataga 3240 gtctataggc ccaccccctt ggcttcgtta gaacgcggct acaattaata cataacctta 3300 tgtatcatac acatacgatt taggtgacac tatagaataa catccacttt gcctttctct 3360 ccacaggtgt ccactcccag gtccaactgc acctcggttc tatcgcgatt gaattccccg 3420 gggatcctct agggtgaccg tttgtgccac cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3480 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3540 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3600 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3660 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3720 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3780 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3840 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3900 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3960 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4020 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4080 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4140 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4200 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4260 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4320 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4380 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4440 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4500 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4560 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4620 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4680 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4740 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4800 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4860 nnnnggcgcg tggtacctct agagtcgacc cgggcggccg cttcccttta gtgagggtta 4920 atgcttcgag cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg 4980 cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt 5040 ataagctgca ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag 5100 ggggagatgt gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg taaaatccga 5160 taaggatcga tccgggctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 5220 agttgcgcag cctgaatggc gaatggacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 5280 tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 5340 cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 5400 ggggctccct ttagggttcc gatttagagc tttacggcac ctcgaccgca aaaaacttga 5460 tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 5520 gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 5580 tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa 5640 aaatgagctg atttaacaaa tatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat 5700 ttcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgcg 5760 gatctgcgca gcaccatggc ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt 5820 ctgaggcgga aagaaccagc tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg 5880 ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg 5940 aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc 6000 aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca 6060 ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc 6120 ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa 6180 gcttgattct tctgacacaa cagtctcgaa cttaaggcta gagccaccat gattgaacaa 6240 gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg 6300 gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc 6360 ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca 6420 gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc 6480 actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca 6540 tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat 6600 acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca 6660 cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg 6720 ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc 6780 gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg 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gene <220> <221> misc_feature <222> (4973)..(5021) <223> synthetic polyA <220> <221> misc_feature <222> (5432)..(6292) <223> Beta lactamase antibiotic resistance <220> <221> misc_feature <222> (7170)..(7508) <223> SV40 prom <220> <221> misc_feature <222> (7585)..(8148) <223> DHFR mutant <220> <221> misc_feature <222> (8149)..(8526) <223> DHFR mutant intron <220> <221> misc_feature <222> (9010)..(9205) <223> SV40 polyA <400> 16 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc 660 cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag 780 aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg ccgggaacgg tgcattggaa cgcggattcc 840 ccgtgccaag agtgacgtaa gtaccgccta tagagtctat aggcccaccc ccttggcttc 900 gttagaacgc ggctacaatt aatacataac cttatgtatc atacacatac gatttaggtg 960 acactataga ataacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccaggtccaa 1020 ctgcacctcg gttctatcga aaacgcgtcc accgtcgacc cgggcggccg cttcccttta 1080 gtgagggtta atgcttcgag cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac 1140 aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt 1200 tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt 1260 tcaggttcag ggggagatgt gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg 1320 taaaatccga taaggatcga tccgggctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc 1380 ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggacgc gccctgtagc ggcgcattaa 1440 gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 1500 ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 1560 ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagagc tttacggcac ctcgaccgca 1620 aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgat cttcaatatt ggccattagc catattattc 1680 attggttata tagcataaat caatattggc tattggccat tgcatacgtt gtatctatat 1740 cataatatgt acatttatat tggctcatgt ccaatatgac cgccatgttg gcattgatta 1800 ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag 1860 ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc 1920 ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 1980 cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 2040 atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 2100 cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 2160 attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca 2220 cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat 2280 caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg 2340 cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctcgtttag tgaaccgtca gatcgcctgg 2400 agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagacacc gggaccgatc cagcctccgc 2460 ggccgggaac ggtgcattgg aacgcggatt ccccgtgcca agagtgacgt aagtaccgcc 2520 tatagagtct ataggcccac ccccttggct tcgttagaac gcggctacaa ttaatacata 2580 accttatgta tcatacacat acgatttagg tgacactata gaataacatc cactttgcct 2640 ttctctccac aggtgtccac tcccaggtcc aactgcacct cggttctatc gcgattgaat 2700 taattccccg gggatcctct agggtgaccg tttaaaacac cggtgccacc ggcgcgtggt 2760 acctctagag tcgacccggg cggccgcttc cctttagtga gggttaatgc ttcgagcaga 2820 catgataaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg 2880 ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa 2940 acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg agatgtggga 3000 ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa atgtggtaaa atccgataag gatcgatccg 3060 ggctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 3120 aatggcgaat ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc 3180 gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt 3240 cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag 3300 ggttccgatt tagagcttta cggcacctcg accgcaaaaa acttgatttg ggtgatggtt 3360 cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt 3420 tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt 3480 cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt 3540 aacaaatatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttcg cctgatgcgg 3600 tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tacgcggatc tgcgcagcac 3660 catggcctga aataacctct gaaagaggaa cttggttagg taccttctga ggcggaaaga 3720 accagctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca 3780 gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct 3840 ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc 3900 ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg 3960 gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc 4020 agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaagctt gattcttctg 4080 acacaacagt ctcgaactta aggctagagc caccatgatt gaacaagatg gattgcacgc 4140 aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat 4200 cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt 4260 caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg 4320 gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag 4380 ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc 4440 tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc 4500 tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga 4560 agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga 4620 actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg 4680 cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg 4740 tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc 4800 tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc 4860 cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg 4920 gggttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat cacgatggcc gcaataaaat 4980 atctttattt tcattacatc tgtgtgttgg ttttttgtgt gaatcgatag cgataaggat 5040 ccgcgtatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg 5100 acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta 5160 cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc 5220 gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat 5280 aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat 5340 ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata 5400 aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct 5460 tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa 5520 agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa 5580 cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt 5640 taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg 5700 tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca 5760 tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa 5820 cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt 5880 gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc 5940 cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa 6000 actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga 6060 ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc 6120 tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga 6180 tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga 6240 acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga 6300 ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat 6360 ctaggtgaag atcctttttg 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tattaataac tatgctcaaa aattgtgtac ctttagcttt 8940 ttaatttgta aaggggttaa taaggaatat ttgatgtata gtgccttgac tagagatcat 9000 aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc 9060 cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta 9120 taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact 9180 gcattctagt tgtggtttga attcggatct 9210

Claims (26)

1. (a) 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 프로모터, 또는 프로모터 및 인핸서 요소를 포함하는, 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기에 적합한 적어도 하나의 발현 카세트 (POI);
   (b) 적어도 하나의 프로모터, 또는 프로모터 및 인핸서 요소를 포함하는, 항생제 내성 유전자인 포유동물의 선택가능 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (MSM);
   (c) 적어도 하나의 프로모터, 또는 프로모터 및 인핸서 요소를 포함하는, 포유동물의 증폭가능한 선택가능 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (MASM); 및
   (d) 원핵생물의 선택가능 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (PSM)
   을 포함하고,
   여기서, 발현 카세트 (POI)는 5'에서 발현 카세트 (MASM)이 옆에 접하고, 발현 카세트 (MSM)은 발현 카세트 (POI)로부터 3'에 위치하며, 발현 카세트 (MASM), 발현 카세트 (POI) 및 발현 카세트 (MSM)은 동일한 5'에서 3'으로의 배향으로 배열되고,
   벡터의 원형 형태 내의 발현 카세트 (PSM) 및 발현 카세트 (MASM) 사이에 위치하는 특유의 제한 효소 인식 부위를 통하여 선형화된 것이고, 벡터의 상기 원형 형태 내의 발현 카세트 (PSM)은 발현 카세트 (MSM) 및 발현 카세트 (MASM) 사이에 위치하여 선형화된 벡터 내에서 발현 카세트 (POI)는 5'에서 발현 카세트 (MASM)이 옆에 접하고 3'에서 발현 카세트 (MSM)이 옆에 접하며, 발현 카세트 (PSM)은 발현 카세트 (MSM)의 3'에 위치하는 것인,
   포유동물 세포 내에서 적어도 하나의 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기에 적합한 선형화된 벡터 핵산.
2. 제1항에 있어서, 상기 발현 카세트 (MSM)이 효소 기능성 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하고, 상기 발현 카세트 (MASM)이 효소 기능성 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 코딩하는 유전자를 포함하는 것인 벡터 핵산.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 벡터가 추가의 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 적어도 하나의 추가의 발현 카세트 (POI')를 포함하는 것이고, 상기 발현 카세트 (POI')는 추가의 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 추가의 발현 카세트 (POI')는 발현 카세트 (POI)와 발현 카세트 (MSM) 사이에 위치하고, 발현 카세트 (POI')가 발현 카세트 (POI) 및 (MSM)과 동일한 5'에서 3'으로의 배향으로 배열되는 것인 벡터 핵산.
4. 제3항에 있어서, 면역글로불린 분자의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각의 발현 카세트 (POI) 및 발현 카세트 (POI') 내에 포함하고, 여기서 각각의 발현 카세트 (POI) 및 발현 카세트 (POI')는 상기 폴리뉴클레오티드 중의 하나를 포함하는 것인, 면역글로불린 분자를 발현시키기 위한 벡터 핵산.
5. 제4항에 있어서, 면역글로불린이 항체, Fab 단편, F(ab)₂ 단편, 다수의 결합 도메인을 포함하는 멀티바디 (multibody), 단일 도메인 항체 및 애피바디 (affibody)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 벡터 핵산.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다음 중 하나 이상을 특징으로 하는 벡터 핵산:
   - 발현 카세트 (POI)가 CMV 프로모터 및 인핸서를 포함하고,
   - 발현 카세트 (MSM) 및 발현 카세트 (MASM)이 SV40 프로모터 및 인핸서, 또는 SV40 프로모터를 포함함.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 발현 카세트 (PSM)이 발현 카세트 (POI), 발현 카세트 (MSM) 및 발현 카세트 (MASM)과 동일한 배향으로 배열되는 것인 벡터 핵산.
8. 제3항에 있어서, 발현 벡터가
   (a) 하기 유전자 요소를 지시된 배열로 포함하는 선형 벡터 핵산 (여기서, 5'에서 3' 방향은 →로 표시된다):
   I. (MASM) 발현 카세트의 프로모터 (→)
   II. (MASM) 발현 카세트의 포유동물의 증폭가능한 선택가능 마커 유전자 (→)
   III. (MASM) 발현 카세트의 인트론 (→)
   IV. (MASM) 발현 카세트의 폴리A 부위 (→)
   V. (POI) 발현 카세트의 프로모터 (→)
   VI. (POI) 발현 카세트의 인트론 (→)
   VII. (POI) 발현 카세트 내에 삽입되는, 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (→)
   VIII. (POI) 발현 카세트의 폴리A 부위 (→)
   IX. (POI') 발현 카세트의 프로모터 (→)
   X. (POI') 발현 카세트의 인트론 (→)
   XI. (POI') 발현 카세트 내에 삽입되는, 추가의 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (→)
   XII. (POI') 발현 카세트의 폴리A 부위 (→)
   XIII. (MSM) 발현 카세트의 프로모터 (→)
   XIV. (MSM) 발현 카세트의 포유동물의 선택가능 마커 유전자 (→)
   XV. (MSM) 발현 카세트의 폴리A 부위 (→)
   XVI. PSM 발현 카세트 (→) 또는 (←); 및
   (b) 서열 1 또는 서열 16으로 제시된 벡터 핵산
   으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 벡터 핵산.
9. 적어도
   (a) 적어도 하나의 프로모터, 또는 프로모터 및 인핸서 요소를 포함하는, 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 적어도 하나의 발현 카세트 (POI);
   (b) 적어도 하나의 프로모터, 또는 프로모터 및 인핸서 요소를 포함하는, 항생제 내성 유전자인 포유동물의 선택가능 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (MSM);
   (c) 적어도 하나의 프로모터, 또는 프로모터 및 인핸서 요소를 포함하는, 포유동물의 증폭가능한 선택가능 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (MASM);
   (d) 원핵생물의 선택가능 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트 (PSM)
   의 유전자 요소를, 발현 카세트 (POI)는 5'에서 발현 카세트 (MASM)이 옆에 접하고, 발현 카세트 (MSM)은 발현 카세트 (POI)로부터 3'에 위치하고, 발현 카세트 (MASM)은 발현 카세트 (MSM)의 3'에 배열되고, 발현 카세트 (PSM)은 발현 카세트 (MSM) 및 발현 카세트 (MASM) 사이에 위치하고, 발현 카세트 (MASM), (POI) 및 (MSM)은 동일한 5'에서 3'으로의 배향으로 배열되도록 원형 벡터 내에 배열하는 단계를 포함하고,
   여기서 상기 원형 백터는 벡터를 선형화하기 위한, 발현 카세트 (PSM)과 (MASM) 사이에 위치하고 벡터 핵산 내에 단지 1개만 존재하는 제한 효소 인식 부위를 포함하며,
   벡터 핵산 내에 단지 1개만 존재하는 상기 제한 효소 인식 부위를 통해 원형 벡터를 선형화하는 단계를 포함하는,
   제1항에 따른 선형화된 벡터 핵산의 생산 방법.
10. 포유동물 숙주 세포의 게놈 내로 안정하게 통합된 것인 제1항에 따른 선형화된 벡터 핵산을 포함하는 포유동물 숙주 세포.
11. 포유동물 숙주 세포의 게놈 내로 안정하게 통합된 것인 제7항에 따른 선형화된 벡터 핵산을 포함하는 포유동물 숙주 세포.
12. 포유동물 숙주 세포의 게놈 내로 안정하게 통합된 것인 제2항에 따른 선형화된 벡터 핵산을 포함하는 포유동물 숙주 세포.
13. 포유동물 숙주 세포의 게놈 내로 안정하게 통합된 것인 제3항에 따른 선형화된 벡터 핵산을 포함하는 포유동물 숙주 세포.
14. 포유동물 숙주 세포의 게놈 내로 안정하게 통합된 것인 제8항에 따른 선형화된 벡터 핵산을 포함하는 포유동물 숙주 세포.
15. 숙주 세포를 제1항에 따른 선형화된 벡터 핵산으로 안정하게 형질감염시키는 것을 포함하는, 제10항에 따른 숙주 세포의 생산 방법.
16. 제10항에 따른 적어도 하나의 숙주 세포를 관심있는 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에서 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 관심있는 폴리펩티드의 생산 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 관심있는 폴리펩티드가 세포 배양 배지 내로 분비되고, 세포 배양 배지로부터 단리되는 것인 방법.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 숙주 세포가 제1항에 따른 선형화된 벡터 핵산을 포함하고, 상기 발현 카세트 (MSM)이 효소 기능성 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 발현 카세트 (MASM)이 효소 기능성 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 코딩하는 유전자를 포함하는 것인 방법.
19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 숙주 세포가 제1항에 따른 선형화된 벡터 핵산을 포함하고, 벡터가 추가의 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 적어도 하나의 추가의 발현 카세트 (POI')를 포함하는 것이고, 상기 발현 카세트 (POI')는 추가의 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 추가의 발현 카세트 (POI')는 발현 카세트 (POI)와 발현 카세트 (MSM) 사이에 위치하고, 발현 카세트 (POI')가 발현 카세트 (POI) 및 발현 카세트 (MSM)과 동일한 5'에서 3'으로의 배향으로 배열되는 것인 방법.
20. 제16항 또는 제17항에 있어서, 숙주 세포가 제1항에 따른 선형화된 벡터 핵산을 포함하고, 벡터가 추가의 관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 적어도 하나의 추가의 발현 카세트 (POI')를 포함하는 것이고, 상기 발현 카세트 (POI')는 추가의 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 추가의 발현 카세트 (POI')는 발현 카세트 (POI)와 발현 카세트 (MSM) 사이에 위치하고, 발현 카세트 (POI')가 발현 카세트 (POI) 및 발현 카세트 (MSM)과 동일한 5'에서 3'으로의 배향으로 배열되며,
    발현 벡터가
    (a) 하기 유전자 요소를 지시된 배열로 포함하는 선형 벡터 핵산 (여기서, 5'에서 3' 방향은 →로 표시된다):
    I. (MASM) 발현 카세트의 프로모터 (→)
    II. (MASM) 발현 카세트의 포유동물의 증폭가능한 선택가능 마커 유전자 (→)
    III. (MASM) 발현 카세트의 인트론 (→)
    IV. (MASM) 발현 카세트의 폴리A 부위 (→)
    V. (POI) 발현 카세트의 프로모터 (→)
    VI. (POI) 발현 카세트의 인트론 (→)
    VII. (POI) 발현 카세트 내에 삽입되는, 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (→)
    VIII. (POI) 발현 카세트의 폴리A 부위 (→)
    IX. (POI') 발현 카세트의 프로모터 (→)
    X. (POI') 발현 카세트의 인트론 (→)
    XI. (POI') 발현 카세트 내에 삽입되는, 추가의 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (→)
    XII. (POI') 발현 카세트의 폴리A 부위 (→)
    XIII. (MSM) 발현 카세트의 프로모터 (→)
    XIV. (MSM) 발현 카세트의 포유동물의 선택가능 마커 유전자 (→)
    XV. (MSM) 발현 카세트의 폴리A 부위 (→)
    XVI. PSM 발현 카세트 (→) 또는 (←); 및
    (b) 서열 1 또는 서열 16으로 제시된 벡터 핵산
    으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인
    방법.
21. 제3항에 있어서, 다음 중 하나 이상을 특징으로 하는 벡터 핵산:
    - 발현 카세트 (POI)가 CMV 프로모터 및 인핸서를 포함하고,
    - 발현 카세트 (POI')가 CMV 프로모터 및 인핸서를 포함하고,
    - 발현 카세트 (MSM) 및 발현 카세트 (MASM)이 SV40 프로모터 및 인핸서, 또는 SV40 프로모터를 포함함.
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