BRPI0821311B1 - Ácido nucleico de vetor linearizado, método para produção de uma célula hospedeira de mamífero compreendendo o referido ácido, e método para produção de um polipetídeode interesse - Google Patents

Description

(54) Título: ÁCIDO NUCLÉICO DE VETOR LINEARIZADO, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UMA CÉLULA HOSPEDEIRA DE MAMÍFERO COMPREENDENDO O REFERIDO ÁCIDO, E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM POLIPETÍDEO DE INTERESSE (51) Int.CI.: C12N 15/79 (30) Prioridade Unionista: 21/12/2007 EP 07 150339.5 (73) Titular(es): NOVARTIS AG (72) Inventor(es): HANS-PETER KNOPF; BURKHARD WILMS (85) Data do Início da Fase Nacional: 18/06/2010

1/45

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ÁCIDO NUCLEICO DE VETOR LINEARIZADO, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UMA CÉLULA HOSPEDEIRA DE MAMÍFERO COMPREENDENDO O REFERIDO ÁCIDO, E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM POLIPETÍDEO

DE INTERESSE.

A presente invenção se refere a um vetor de expressão em mamíferos para expressar um polipeptídeo de interesse bem como a métodos para expressar um polipeptídeo de interesse em uma célula hospedeira de mamífero utilizando um respectivo vetor e células hospedeiras compreendendo o dito vetor.

A capacidade de clonar e expressar peptídeos e proteínas recombinantes em grandes quantidades tem sido cada vez mais importante nos últimos anos. A capacidade de purificar altos níveis de proteínas é importante no campo farmacêutico e biotecnológico, por exemplo, para produzir produtos farmacêuticos proteicos bem como no ambiente de pesquisa básico, por exemplo, para cristalização de proteínas de modo a permitir a determinação da estrutura tridimensional. As proteínas que são, de outro modo, difíceis de se obter em quantidade podem ser superexpressas em uma célula hospedeira e subsequentemente isoladas e purificadas.

A escolha de um sistema de expressão para a produção de pro20 teínas recombinantes depende de muitos fatores, inclusive características de crescimento celular, níveis de expressão, expressão intracelular e extracelular, modificações pós-traducionais e atividade biológica da proteína de interesse, bem como padrões reguladores e considerações econômicas na produção de proteínas terapêuticas. As principais vantagens de células de ma25 míferos sobre outros sistemas de expressão como bactérias ou levedura se devem à capacidade de realizar o enovelamento de proteínas adequado, glicosilação W-ligada complexa e glicosilação autêntica O-ligada, bem como um amplo espectro de outras modificações pós-traducionais. Devido às vantagens descritas, as células de mamíferos atualmente consistem no sistema de expressão de seleção para produzir proteínas terapêuticas complexas como anticorpos monoclonais. A primeira etapa de geração de uma linhagem celular recombinante é a construção de um vetor de expressão. O vetor

Petição 870180000712, de 04/01/2018, pág. 17/30

2/45 de expressão é o elemento principal para conduzir a expressão do gene heterólogo na célula hospedeira e para fornecer marcadores de seleção de modo a gerar a linhagem celular recombinante. Os elementos essenciais de vetores de expressão em mamíferos incluem geralmente um promotor cons5 titutivo ou induzível capaz de forte atividade transcricional; sinais de processamento e tradução de mRNA otimizados que geralmente incluem uma sequência de Kozak, um códon de terminação traducional, sinais de divagem e poliadenilação de mRNA, bem como sinais de junção de mRNA; um terminador de transcrição; marcadores de seleção para a preparação de linha10 gens celulares estáveis e para amplificação de genes; uma origem procariótica de marcadores de replicação e seleção para propagação de vetor em bactérias.

Nos últimos anos, o foco de desenvolvimento se concentrou no projeto de vetores aprimorados para expressão de genes em células de mamíferos. Apesar da pletora de vetores disponíveis, entretanto, a forte produção de polipeptídeo/proteína em células de mamíferos ainda é desafiadora. Diversos fatores podem influenciar a expressão recombinante em células de mamíferos, inclusive a resistência do promotor, o contexto da região de iniciação não traduzida 5' e de tradução, a eficiência da região não traduzida

3', para poliadenilar e terminar a transcrição, o sítio de inserção do gene recombinante aleatoriamente integrado no cromossomo hospedeiro, e o número de cópias integradas do gene que está sendo expresso. O aumento no número de cópias do gene é mais comumente obtido por amplificação de genes utilizando linhagens celulares desprovidas de uma enzima como di25 hidrofolato redutase (DHFR) ou glutamina sintetase (GS) em conjunto com vetores de expressão contendo genes que codificam essas enzimas e agentes como metotrexato (MTX), que inibe DHFR, e metionina sulfoxamina (MSX) que inibe GS. A utilização de vetores de expressão contendo o gene recombinante sob controle de um forte promotor e genes que codificam transfectantes de DHFR ou GS, DHFR⁺ ou GS⁺, respectivamente, é primeiro obtida e a amplificação de genes é então realizada ao desenvolver os transfectantes em concentrações progressivamente crescentes de MTX ou MSX.

3/45

O objetivo da presente invenção é proporcionar um vetor de expressão aprimorado bem como um sistema de expressão para expressar um polipeptídeo de interesse em uma célula de mamífero.

Consequentemente, proporciona-se um ácido nucléico de vetor 5 para expressar ao menos um polipeptídeo de interesse em uma célula de mamífero, que compreende (a) ao menos um cassete de expressão (POI) para expressar um polipeptídeo de interesse;

(b) um cassete de expressão (MSM) que compreende um gene 10 marcador selecionável de mamífero;

(c) um cassete de expressão (MASM) que compreende um gene marcador selecionável e amplificável de mamífero;

onde o cassete de expressão (POI) é flanqueado 5' pelo cassete de expressão (MASM), o cassete de expressão (MSM) fica localizado 3' a partir do cassete de expressão (POI) e onde os cassetes de expressão (MASM), (POI) e (MSM) são dispostos na mesma orientação 5' a 3'.

Um ácido nucléico de vetor de acordo com a presente invenção é um polinucleotídeo que transporta ao menos um fragmento de ácido nucléico estranho. Um ácido nucléico de vetor funciona como um veículo molecular, distribuindo fragmentos de ácidos nucléicos aos polinucleotídeos respectivamente em uma célula hospedeira. Esse compreende ao menos um cassete de expressão que compreende sequências reguladoras e codificadoras. Um cassete de expressão permite a expressão adequada de um polinucleotídeo incorporado. Os cassetes de expressão decisivos para a presente invenção serão subsequentemente descritos em mais detalhes. Os polinucleotídeos estranhos, por exemplo, que codificam o polipetídeo de interesse podem ser inseridos nos cassetes de expressão do ácido nucléico de vetor para serem expressos. O ácido nucléico de vetor de acordo com a presente invenção pode estar presente sob a forma circular ou linear. O dito sítio pode ser, por exemplo, um sítio múltiplo de clonagem (MCS).

O cassete de expressão (POI) define o cassete de expressão para expressar um polipeptídeo de interesse. O dito cassete de expressão

4/45

(POI) compreende o polinucleotídeo que codifica o polipetídeo de interesse ou compreende um sítio adequado para inserir um respectivo polinucleotídeo que codifica o polipetídeo de interesse.

Um polipetídeo se refere a uma molécula que compreende um 5 polímero de aminoácidos ligados uns aos outros por uma ligação/ligações peptídica(s). Os polipetídeos incluem polipetídeos de qualquer comprimento, inclusive proteínas (por exemplo, que possuem mais de 50 aminoácidos) e peptídeos (por exemplo, que possuem 2 a 49 aminoácidos). Os polipetídeos incluem proteínas e/ou peptídeos de qualquer atividade ou bioatividade. E10 xemplos adequados são descritos abaixo.

O cassete de expressão (MSM) define o cassete de expressão que compreende um gene marcador selecionável de mamífero. Os genes marcadores selecionáveis de mamífero permitem a seleção de células hospedeiras de mamífero que compreendem os ditos genes e, assim, de células hospedeiras de mamífero que compreende o vetor. Exemplos adequados são descritos em detalhes abaixo.

O cassete de expressão (MASM) define o cassete de expressão que compreende um gene marcador selecionável e amplificável de mamífero. Os genes marcadores selecionáveis e amplificáveis de mamífero permi20 tem a seleção de células hospedeiras de mamífero contendo vetor bem como amplificação de genes. Exemplos adequados são descritos em detalhes abaixo.

Os termos 5' e 3' consistem em uma convenção usada para descrever as características de uma sequência de ácido nucleico relaciona25 da à posição de elementos genéticos e/ou à direção de eventos (5’ a 3’), como, por exemplo, transcrição por RNA polimerase ou tradução pelo ribossomo que procede na direção 5' até 3'. Os sinônimos são a montante (5') e a jusante (3'). De modo convencional, as sequências de DNA, mapas de genes, placas vetoriais e sequências de RNA são representadas com 5' a 3' da esquerda para a direita ou a direção 5' a 3' é indicada com setas, onde a ponta da flecha aponta na direção 3'. Consequentemente, 5' (a montante) indica os elementos genéticos posicionados em direção ao lado esquerdo, e

5/45

3' (a jusante) indica os elementos genéticos posicionados em direção ao lado direito, quando obedecem a essa convenção.

A disposição e orientação dos cassetes de expressão presentes no vetor da invenção são importantes. De acordo com as instruções da pre5 sente invenção, o cassete de expressão (POI) é flanqueado 5' pelo cassete de expressão (MASM). Consequentemente, o cassete de expressão (MASM) fica localizado 5' adjacente ao cassete de expressão (POI) e em estreita proximidade a esse. Naturalmente, as sequências de cadeia principal do vetor podem separar os cassetes de expressão (MASM) e (POI). En10 tretanto, de preferência, nenhum outro cassete de expressão fica localizado entre o cassete de expressão (MASM) e o cassete de expressão (POI). O cassete de expressão (MSM) fica localizado 3' a partir do cassete de expressão (POI). Cassetes de expressão adicionais podem ser inseridos entre os cassetes de expressão (POI) e (MSM), como, por exemplo, um cassete de expressão adicional (ΡΟΓ) para expressar um polipetídeo de interesse adicional (descrito em mais detalhes abaixo). Os cassetes de expressão (MASM), (POI) e (MSM) são dispostos na mesma orientação 5' a 3'. Os inventores descobriram que essa configuração de ácido nucléico de vetor permite a rápida geração de linhagens celulares de alto rendimento.

De acordo com uma alternativa, o cassete de expressão (POI) não compreende o polinucleotídeo que codifica o polipetídeo de interesse. Assim, proporciona-se um vetor de expressão com um cassete de expressão vazio (POI). Entretanto, o dito polinucleotídeo que codifica o polipetídeo de interesse pode ser incorporado no cassete de expressão (POI) utilizando métodos de clonagem adequados, por exemplo, utilizando enzimas de restrição para inserir o polinucleotídeo que codifica o polipetídeo de interesse dentro do cassete de expressão (POI). Para esse propósito o cassete de expressão (POI) pode compreender, por exemplo, um sítio múltiplo de clonagem (MCS) que pode ser, por exemplo, usado em todos os quadros de leitura. Os sítios MCS adequados são descritos em detalhes abaixo. Um respectivo ácido nucléico de vetor vazio pode ser, por exemplo, fornecido aos clientes, esses então inserem seu polinucleotídeo de interesse específi6/45 co que será expresso dentro do cassete de expressão (POI). O cassete de expressão (POI) também pode compreender um polinucleotídeo de substituição ou uma sequência de ácido nucléico do stuffer, que pode ser removido e substituído pelo polinucleotídeo que codifica o polipetídeo de interesse. A presente invenção também fornece um ácido nucléico de vetor como descrito acima, que compreende um cassete de expressão (POI) que compreende o polinucleotídeo que codifica o polipetídeo de interesse. Essa modalidade se refere basicamente ao ácido nucléico de vetor de expressão final que é transfectado para expressão dentro da célula hospedeira.

Um polinucleotídeo é um polímero de nucleotídeos que são geralmente ligados de uma desoxirribose ou ribose a outra. O termo polinucleotídeo não compreende nenhuma restrição de tamanho e também inclui polinucleotídeos que compreendem modificações, em particular nucleotídeos modificados.

De acordo com uma modalidade, o ácido nucléico de vetor é circular e o cassete de expressão (MSM) fica disposto 3' do cassete de expressão (POI) e o cassete de expressão (MASM) fica disposto 3' do cassete de expressão (MSM). Como uma descrição alternativa de um vetor circular de acordo com as instruções da presente invenção é um ácido nucléico de vetor circular para expressar ao menos um polipetídeo de interesse em uma célula de mamífero, que compreende (a) ao menos um cassete de expressão (POI) para expressar um polipetídeo de interesse;

(b) um cassete de expressão (MSM) que compreende um gene marcador selecionável de mamífero;

(c) um cassete de expressão (MASM) que compreende um gene marcador selecionável e amplificável de mamífero;

onde o cassete de expressão (MSM) fica disposto 3' do cassete de expressão (POI) e o cassete de expressão (MASM) fica disposto 3' do cassete de expressão (MSM), e onde os cassetes de expressão (MASM), (POI) e (MSM) ficam dispostos na mesma orientação 5' a 3'. O ácido nucleico de vetor pode ser transfectado dentro da célula hospedeira em sua forma

7/45 circular. As moléculas de vetor superespiraladas serão convertidas em moléculas lineares dentro do núcleo devido à atividade de endo e exonucleases. Entretanto, a linearização do ácido nucléico de vetor antes da transfecção geralmente aumenta a eficácia de uma transfecção estável. Essa tam5 bém como o ponto de linearização pode ser controlada se o vetor for linearizado antes da transfecção.

Então, de acordo com uma modalidade da presente invenção o vetor de expressão compreende um sítio de restrição predefinido, que pode ser usado para linearização do ácido nucléico de vetor antes da transfecção.

O posicionamento inteligente do dito sítio de restrição de linearização é importante, pois o dito sítio de restrição determina se o ácido nucléico de vetor está aberto/linearizado e, desse modo, determina a ordem/disposição dos cassetes de expressão quando a construção é integrada dentro do genoma da célula de mamífero.

Consequentemente, o ácido nucléico de vetor pode compreender um sítio de restrição de linearização para linearizar o vetor, onde o dito sítio de restrição de linearização fica localizado entre os cassetes de expressão (MSM) e (MASM). De preferência, o dito sítio de restrição de linearização é exclusivo e está presente apenas uma vez no vetor de expressão áci20 do nucléico. Por exemplo, um sítio de restrição de linearização que pode ser usado é identificado por uma enzima de restrição que possui uma baixa frequência de corte para sustentar que o vetor é apenas clivado no sítio de restrição de linearização, porém não (ou apenas raramente), por exemplo, dentro do(s) cassete(s) de expressão ou da cadeia principal do vetor. Isso pode ser, por exemplo, encorajado ao fornecer um sítio de restrição para uma enzima de restrição que possui uma sequência de reconhecimento de mais de seis pares de base ou que reconhece as sequências que são subrepresentadas em DNA cromossômico. Um exemplo adequado é a enzima Swal e o vetor pode, portanto, incorporar um sítio de reconhecimento Swal como o sítio de restrição de linearização exclusivo. No caso de o dito sítio de restrição de linearização estar presente mais de uma vez na sequência de ácido nucléico de vetor (inclusive os polinucleotídeos que codificam o polipe8/45 tídeo de interesse), ou no caso de uma enzima de restrição ser usada para cortar diversas vezes a sequência de ácido nucléico de vetor, também está dentro do escopo da presente invenção, por exemplo, alterar/modificar os sítios de restrição além do sítio de restrição de linearização que fica localiza5 do entre os cassetes de expressão (MSM) e (MASM), para eliminar aqueles sítios de restrição adicionais e obter um sítio de restrição de linearização exclusivo ao menos raro.

No caso de o vetor ser usado como um vetor de expressão padrão destinado, por exemplo, como uma ferramenta para a expressão de vários polipetídeos diferentes, é vantajoso fornecer um sítio de restrição de linearização que compreende múltiplos sítios de reconhecimento de enzimas que possuem uma baixa frequência de corte. As enzimas de restrição selecionadas para linearização não devem ser cortadas, de preferência, dentro dos cassetes de expressão dos marcadores selecionáveis ou outras se15 quências de cadeia principal de vetor para garantir que a enzima seja cortada apenas uma vez para linearização adequada do vetor. Ao fornecer um sítio de restrição de linearização que compreende múltiplos sítios de reconhecimento para enzimas de restrição que possuem uma baixa frequência de corte, o usuário deve selecionar uma enzima de restrição adequada para linearização a partir das opções fornecidas para evitar com segurança a restrição dentro do polinucleotideo que codifica o polipetídeo de interesse. Entretanto, como descrito acima, os sítios de restrição adicionais podem ser modificados ou uma digestão de restrição parcial poderia ser realizada.

O posicionamento do sítio de restrição de linearização entre o cassete de expressão (MSM) e o cassete de expressão (MASM) apresenta o efeito que o cassete de expressão (POI) (e cassetes de expressão adicionais para expressar os polipetídeos de interesse - se presentes) é flanqueado 5' pelo cassete de expressão (MASM). O cassete de expressão (MSM) fica localizado 3' do cassete de expressão (POI) mediante a linearização.

Assim, os cassetes de expressão (MSM) e (MASM) são separados mediante a linearização do ácido nucléico de vetor circular. Se um cassete de expressão (PSM) de um marcador de seleção bacteriano estiver presente (veja a9/45 baixo), o sítio de restrição de linearização é, de preferência, posicionado entre os cassetes de expressão (PSM) e (MASM). Isso tem o efeito que o gene marcador de seleção bacteriano é 3' e, assim, for a das partes do mamífero do ácido nucléico de vetor linearizado. Essa disposição é favorável visto que os genes bacterianos não são aparentemente vantajosos para expressão em mamíferos visto que as sequências bacterianas podem resultar em metilação aumentada ou outros efeitos de silenciamento nas células de mamíferos.

Exemplos não limitativos de genes marcadores selecionáveis de 10 mamíferos que podem estar incluídos no cassete de expressão (MSM) incluem genes de resistência a antibióticos, por exemplo, que conferem resistência a G418; higromicina (hyg ou hph, comercialmente disponível junto à Life Technologies, Inc. Gaithesboro, Md.); neomicina (neo, comercialmente disponível junto à Life Technologies, Inc. Gaithesboro, Md.); zeocina (Sh Ble, comercialmente disponível junto à Pharmingen, San Diego Calif.); puromicina (pac, puromicina-N-acetil-transferase, disponível junto à Clontech, Paio Alto Calif.), ouabaína (oua, disponível junto à Pharmingen) e blasticidina (disponível junto à Invitrogen). Os respectivos genes marcadores selecionáveis de mamíferos são bem-conhecid os e permitem a seleção de células hospedeiras de mamíferos que compreendem os ditos genes e, desse modo, de células hospedeiras que compreendem o vetor. O termo gene como usado aqui também se refere a um polinucleotídeo natural ou sintético que codifica uma variante funcional do marcador selecionável fornecendo a resistência pretendida. Então, também versões truncadas ou modificadas de um gene de ocorrência natural ou polinucleotídeos sintéticos são incluídas desde que essas forneçam a resistência pretendida. De acordo com uma modalidade preferida, o dito cassete de expressão (MSM) compreende um gene que codifica uma neomicina fosfotransferase enzimaticamente funcional (I ou

II). Essa modalidade funciona bem em combinação com o uso de um gene que codifica uma DHFR enzimaticamente funcional como um gene marcador selecionável e amplificável.

Os genes marcadores selecionáveis e amplificáveis de mamífero

10/45 permitem a seleção de células hospedeiras de mamífero contendo vetor bem como amplificação de genes. Um exemplo não limitativo de um gene marcador selecionável e amplificável de mamífero é o gene de di-hidrofolato redutase (DHFR). Outros sistemas atualmente em uso são entre outros o sistema de glutamina sintetase (gs) (Bebbington et al., 1992) e o sistema de seleção conduzido por histidinol (Hartmann and Mulligan, 1988). Esses marcadores amplificáveis também são marcadores selecionáveis e podem ser, desse modo, usados para selecionar aquelas células que obtiveram o vetor. DHFR e glutamina sintetase fornecem resultados satisfatórios. Em ambos os casos a seleção geralmente ocorre na ausência do metabólito apropriado (hipoxantina e timidina no caso de DHFR, glutamina no caso de GS), impedindo o crescimento de células não transformadas. Com sistemas amplificáveis como o sistema DHFR, a expressão de uma proteína recombínante pode ser aumentada ao expor as células a alguns agentes que promovem a amplificação de genes como antifolatos (por exemplo, metotrexato (MTX)) no caso do sistema DHFR. Um inibidor adequado para GS que promove a amplificação de genes é metionina sulfoximina (MSX). A exposição a MSX também resulta em amplificação de genes. De acordo com uma modalidade, o dito cassete de expressão (MASM) compreende um gene que codifica uma glutamina sintetase enzimaticamente funcional (GS) ou uma di-hidrofolato redutase (DHFR).

De acordo com uma modalidade, o dito cassete de expressão (MSM) compreende um gene que codifica uma neomicina fosfotransferase enzimaticamente funcional e o dito cassete de expressão (MASM) compreende um gene que codifica uma di-hidrofolato redutase enzimaticamente funcional (DHFR).

O vetor pode compreender ao menos um cassete de expressão adicional (POI') para expressar um polipetídeo de interesse adicional. O dito cassete de expressão adicional (POI') fica localizado entre o cassete de expressão (POI) e o cassete de expressão (MSM). O dito cassete de expressão (POI') fica disposto na mesma orientação 5' a 3' como os cassetes de expressão (POI) e (MSM). De acordo com uma modalidade, esse comprettMBàyçájaájiiía

ÍVSHã -•vC*·^ --Ϊ. \ *> -d

11/45 ende o polinucleotídeo que codifica o polipetídeo de interesse. Adicional.

Consequentemente, o ácido nucléico de vetor de acordo com a presente invenção pode compreender mais de um cassete de expressão para expressar os polipetídeos de interesse. Portanto, também é possível que vários cassetes de expressão ((POI), (ΡΟΓ), (ΡΟΓ) etc.) para expressar polipetídeos de interesse diferentes estejam dispostos no vetor de expressão ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Esses cassetes de expressão são flanqueados 5' pelo cassete de expressão (MASM) e 3’ pelo cassete de expressão (MSM). Então, a presente invenção também fornece um ácido nucléico de vetor que compreende mais de um cassete de expressão que codifica, por exemplo, subunidades de proteínas diméricas ou multiméricas de ordem superior. Os cassetes de expressão que codificam subunidades diferentes de uma proteína multimérica, cada uma incorporada em um cassete de expressão diferente, podem ser substituídos um adjacente ao outro. Para proteínas multiméricas codificadas por ao menos dois genes distintos (por exemplo, cadeias leves e pesadas de imunoglobulina ou fragmentos funcionais dessas como ao menos as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas de imunoglobulina), os polinucleotídeos que codificam as subunidades desejadas do polipetídeo de interesse são inseridos nos cassetes de expressão (POI) e (POI'). Uma respectiva modalidade que utiliza ao menos dois cassetes de expressão (POI) e (ΡΟΓ) para expressar os polipetídeos de interesse é particularmente vantajosa para expressar moléculas de imunoglobulina como anticorpos ou fragmentos funcionais desses. Consequentemente, um ácido nucléico de vetor é fornecido para expressar uma molécula de imunoglobulina que compreende em cada cassete de expressão (POI) e (ΡΟΓ) um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve ou pesada de uma molécula de imunoglobulina ou fragmentos dessa, em que cada cassete de expressão (POI) e (POI') compreende um dos ditos polinucleotídeos. Consequentemente, o cassete de expressão (POI) pode compreender o polinucleotídeo para expressar a cadeia leve, ou o polinucleotídeo para expressar a cadeia pesada da molécula de imunoglobulina.

De acordo com uma modalidade preferida, o cassete de expres12/45 são (POI) compreende o polinucleotídeo que codifica ao menos parte da cadeia leve da dita molécula de imunoglobulina ou um fragmento funcional dessa e o cassete de expressão (ΡΟΓ) compreende um polinucleotídeo que codifica ao menos parte da cadeia pesada da dita molécula de imunoglobuli5 na ou um fragmento funcional dessa. A disposição do cassete de expressão na cadeia leve 5' até o cassete de expressão da cadeia pesada provou ser benéfica com relação à taxa de expressão das moléculas de imunoglobulina. De acordo com uma modalidade, o vetor de expressão ácido nucléico é projetado de modo que o(s) cassete(s) de expressão já compreendam um poli10 nucleotídeo que codifica ao menos parte das regiões constantes de uma molécula de imunoglobulina. Os fragmentos de polinucleotídeo que codificam as partes variáveis da molécula de imunoglobulinas podem ser então inseridos pelo usuário/cliente dentro dos cassetes de expressão utilizando estratégias de clonagem adequadas para obter o vetor de expressão final.

Os cassetes de expressão presentes no vetor de expressão de acordo com a presente invenção são projetados de modo que esses permitam a expressão dos polinucleotídeos/genes incorporados em células de mamíferos. Para esse propósito os cassetes de expressão geralmente compreendem as sequências reguladoras necessárias, como o promotor e/ou uma seqüência de terminação de transcrição como um sítio polyA.

Os vetores usados para expressar os polipetídeos de interesse geralmente contêm elementos de controle transcricional para conduzir a transcrição como, por exemplo, promotores, intensificadores, sinais de poliadenilação, sinais de pausa ou terminação de transcrição como elementos de um cassete de expressão. Para expressão apropriada dos polipetídeos, elementos de controle adequados são, de preferência, incluídos no vetor, como, por exemplo, regiões não traduzidas 5' resultando em estruturas de terminação 5' adequadas para recrutar ribossomos e códons de parada concluir o processo de tradução. Em particular, o polinucleotídeo que serve como os genes marcadores selecionáveis bem como o polinucleotídeo que codifica o polipetídeo de interesse pode ser transcrito sob o controle de elementos de transcrição presentes em promotores apropriados. As transcrições resul13/45 tantes dos genes marcadores selecionáveis e aquelas do polipetídeo de interesse hospedam elementos traducionais funcionais que facilitam níveis substanciais de expressão de proteína (ou seja, tradução) e terminação de tradução adequada. Uma unidade de expressão funcional, capaz de conduzir a5 dequadamente a expressão de um polinucleotídeo incorporado também é referida aqui como um cassete de expressão. De preferência, essa compreende uma região UTR 3'.

Consequentemente, os ácidos nucleicos de vetor são fornecidos onde os cassetes de expressão compreendem ao menos um promotor e/ou elemento intensificador de promotor. Embora os limites físicos entre esses dois elementos de controle nem sempre sejam claros, o termo promotor geralmente se refere a um sítio na molécula de ácido nucléico ao qual uma RNA polimerase e/ou qualquer fator associado se liga e onde a transcrição é iniciada. Os intensificadores potenciam a atividade de promotor, temporari15 amente bem como espacialmente. Muitos promotores são transcricionalmente ativos em uma ampla gama de tipos de células. Os promotores podem ser divididos em duas classes, aqueles que funcionam de maneira constitutiva e aqueles que são regulados por indução ou desrepressão. Os promotores usados para produção de alto nível de proteínas em células de mamíferos deveríam ser fortes e, de preferência, ativos em uma ampla gama de tipos de células para permitir uma avaliação qualitativa e quantitativa do polipetídeo recombinante. O promotor pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um promotor SV40, um promotor CMV, um promotor alfa EF1, um promotor RSV, um promotor BROAD3, um promotor murino rosa 26, um promotor pCEFL e um promotor β-actina. Os promotores constitutivos fortes que conduzem a expressão em muitos tipos de células incluem, porém sem caráter limitativo, o promotor tardio maior do adenovírus, o promotor inicial imediato do citomegalovírus humano, o promotor do vírus SV40 e Rous Sarcoma, e o promotor de 3-fosfoglicerato quinase murino e EF1a. Resultados satisfatórios são obtidos com o vetor de expressão da presente invenção quando o promotor e/ou intensificador for obtido a partir de CMV e/ou SV40.

De acordo com uma modalidade, o(s) cassete(s) de expressão _-Ê??^fe^^'^,^-^5^^^!3Ss^í<^^^>^SAASiéW^^M^S3*^^_<e^i^^«^à^Mi^ -JÇS^áA^Mffl^SSSu&^S^StíSKSi MMBMMteJL

14/45 para expressar o(s) polipetídeo(s) de interesse compreende/compreendem um promotor e/ou intensificador mais forte do que os cassetes de expressão para expressar os marcadores selecionáveis. Essa disposição possui o efeito que se gera mais transcrição do polipetídeo de interesse do que os mar5 cadores de seleção. É vantajoso que a produção do polipetídeo de interesse que é secretado seja dominante sobre a produção dos marcadores de seleção, visto que a capacidade celular individual para produzir proteínas heterólogas não é ilimitada e deve ser, desse modo, concentrada no polipetídeo de interesse.

De acordo com uma modalidade, os cassetes de expressão (POI) e (ΡΟΓ) (se presentes) que é/são usado(s) para expressar o polipetídeo de interesse compreendem um promotor/intensificador de CMV. Exemplos específicos são descritos em detalhes abaixo. Os cassetes de expressão (MSM) e (MASM), que expressam, de preferência, a DHFR e os genes marcadores de neomicina, compreendem um promotor SV40 ou um promotor/intensificador de SV40. O promotor CMV é conhecido como um dos promotores mais fortes disponíveis para expressão em mamíferos e resulta em uma taxa de expressão bastante satisfatória. Esse é considerado por fornecer significativamente mais transcrição do que o promotor SV40.

Ademais, os cassetes de expressão podem compreender um sítio de terminação de transcrição apropriado. Esse, à medida que a transcrição continua a partir de um promotor a montante através de uma segunda unidade de transcrição pode inibir a função do promotor a jusante, uma fenômeno conhecido como oclusão de promotor ou interferência transcricional.

Esse evento foi descrito tanto em procariotos como eucariotos. O posicionamento adequado de sinais de terminação transcricional entre duas unidades de transcrição pode impedir a oclusão de promotor. Mostrou-se que os sítios de terminação de transcrição são bem caracterizados e sua incorporação em vetores de expressão possuem múltiplos efeitos benéficos sobre a expressão de genes.

A maioria dos mRNAs nascentes eucarióticos possui uma cauda polyA em sua extremidade 3' que é adicionada durante um processo com15/45 plexo que envolve a divagem da transcrição primária e uma reação de poliadenilação acoplada. A cauda poliA é vantajosa para a estabilidade e transferência de mRNA. Então, os cassetes de expressão do vetor de acordo com a presente invenção geralmente compreendem um sítio de poliadenilação. Há vários sinais poliA eficazes que podem ser usados em vetores de expressão em mamíferos, inclusive aqueles derivados de hormônio de crescimento bovino (bgh), beta-globina de camundongo, a unidade de transcrição inicial SV40 e o gene de timidina quinase do vírus simples da Herpes. Entretanto, também sítios de poliadenilação sintéticos são conhecidos (veja, por exemplo, o vetor de expressão pCI-neo de Promega que é baseado em Levitt el al, 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025). O sítio de poliadenilação pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em sítio SV40polyA, como o sítio final SV40 e poly-A inicial (veja, por exemplo, plasmídeo pSV2-DHFR como descrito em Subramani et al, 1981 , Mol. Cell. Biol. 854-864), um sítio polyA sintético (veja, por exemplo, o vetor de expressão pCI-neo de Promega que é baseado em Levitt el al, 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025) e um sítio polyA bgh (hormônio do crescimento bovino).

Os cassetes de expressão podem compreender um intensificador (veja acima) e/ou um íntron. De acordo com uma modalidade, o(s) cassete(s) de expressão para expressar o polipetídeo de interesse compreende/compreendem um íntron. A maioria dos genes de eucariotos superior contém íntrons que são removidos durante o processamento de RNA. Descobriu-se que as construções genômicas são expressas de maneira mais eficaz em sistemas transgênicos do que construções idênticas sem íntrons. Geralmente, os íntrons são colocados na extremidade 5' do quadro de leitura aberto. Consequentemente, um íntron pode ser incluído no(s) cassete(s) de expressão para expressar o(s) polipetídeo(s) de interesse para aumentar a taxa de expressão. O dito íntron pode ficar localizado entre o promotor e/ou elemento(s) promotor(es)/intensificador(es) e a extremidade 5' do quadro de leitura aberto do polipetídeo que será expresso. Então, proporciona-se um ácido nucléico de vetor, onde ao menos o cassete de expressão (POI) compreende um íntron que fica disposto entre o promotor e o códon de partida

16/45 do polinucleotídeo para expressar o polipetídeo de interesse. Diversos íntrons adequados conhecidos no estado da técnica podem ser usados em conjunto com a presente invenção.

De acordo com uma modalidade, o íntron usado nos cassetes de 5 expressão para expressar os polipetídeos de interesse, é um íntron sintético como o íntron SIS ou RK. O íntron RK é um íntron sintético forte que é, de preferência, posicionado antes do códon de partida ATG do gene de interesse. O íntron RK consiste no sítio juncional doador de íntron do promotor CMV e o sítio juncional aceitador da região variável de cadeia pesada do IgG de camundongo (veja, por exemplo, Eaton et al., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347, Neuberger et al., 1983, EMBO J. 2(8), 1373-1378; esse pode ser obtido a partir do vetor pRK-5 (BD PharMingen)).

Ademais, foi surpreendentemente descoberto que o posicionamento de um íntron na extremidade 3' do quadro de leitura aberto do gene

DHFR possui efeitos vantajosos sobre a taxa de expressão/amplificação da construção. O íntron usado no cassete de expressão DHFR resulta em uma variante não funcional menor do gene DHFR (Grillari et al., 2001 , J. Biotechnol. 87, 59- 65). Desse modo, o nível de expressão do gene DHFR é reduzido. Isso resulta em sensibilidade aumentada de MTX e condições de seleção mais severas. Consequentemente, proporciona-se um ácido nucleico de vetor, onde o cassete de expressão (MASM) compreende um íntron que fica localizado 3' do gene marcador selecionável e amplificável. Um íntron adequado pode ser obtido a partir do vetor pSV2-DHFR (veja, por exemplo, acima).

O dito vetor pode compreender ao menos um cassete de expressão adicional (PSM) que compreende um gene marcador selecionável procariótico. O dito cassete de expressão (PSM) fica localizado entre os cassetes de expressão (MSM) e (MASM). O dito marcador selecionável pode proporcionar uma resistência a antibióticos como, por exemplo, ampicili30 na, canamicina, tetraciclina e/ou cloranfenicol. O dito cassete de expressão (PSM) fica, de preferência, disposto na mesma orientação 5' a 3' que os outros cassetes de expressão (POI), (MSM) e (MASM).

r^aS»ÃS«.’**ir τί-'Β^ίΰΙί £',?V.irjiS3S? »> Vá^íisfiS·^,HSrâBW.i'-iU· jNMw^nUS&utfè Vtt~*tè..Mt, a* ~a ,*uu^s»MÍiitoaiUtt^ -..-,-,- .Λ 17/45

O gene DHFR funciona como um marcador e um gene de amplificação genética. A seleção pode ocorrer ao cultivar as células na ausência dos metabólitos apropriados (hipoxantina e timidina) impedindo, assim, o crescimento de células não transformadas. Com o sistema DHFR, a expres5 são dos polipetídeos de interesse pode ser aumentada ao expor as células a antifolatos como, por exemplo, metotrexato (MTX), um fármaco que bloqueia a atividade de DHFR. Apos um determinado tempo de exposição a MTX a maioria das células morre, porém um pequeno número de células que geralmente sobrevive superproduz DHFR. Mediante o tratamento com MTX, em concentração elevada, as células sobreviventes podem conter frequentemente até centenas a milhares de cópias do vetor integrado incorporado em cromossomos que são geralmente alongados. As células mais respectivamente amplificadas produzem mais proteína recombinante do que as células não amplificadas.

Várias enzimas DHFR adequadas e, consequentemente, genes conhecidas na técnica anterior podem ser usadas em conjunto com a presente invenção. A DHFR pode ser uma DHFR de ocorrência natural ou uma variante funcional ou derivado dessa. O termo uma variante ou derivado inclui enzimas DHFR que possuem uma ou mais trocas de seqüência de aminoácido (por exemplo, deleções, substituições ou adições) com relação à sequência de aminoácido da respectiva enzima DHFR, proteínas de fusão que compreendem uma enzima DHFR ou fragmento funcional desse e enzimas DHFR que foram modificadas para fornecer uma estrutura e/ou função adicional, bem como fragmentos funcionais anteriormente mencionados desses, que ainda possuem ao menos uma função de uma enzima DHFR. O gene de DHFR é, de preferência, selecionado a partir do grupo que consiste em DHFR de ocorrência natural, uma variante DHFR que possui uma sensibilidade a MTX reduzida comparada com a DHFR de ocorrência natural e uma variante de DHFR que possui uma sensibilidade a MTX aumentada compara com a DHFR de ocorrência natural. De acordo com uma modalidade, o gene DHFR é o gene de DHFR de ocorrência natural. De acordo com uma modalidade diferente, o gene de DHFR codifica uma variante menos

18/45 funcional de DHFR. Isso resulta em uma sensibilidade aumentada a MTX e condições de seleção mais severas. Isso pode ser obtido, por exemplo, ao posicionar um íntron na extremidade 3' do gene de DHFR (veja acima). Uma alternativa diferente poderia contar com o uso de um mutante/variante de

DHFR que possui uma sensibilidade maior a MTX do que a DHFR de ocorrência natural. Essas modalidades são particularmente benéficas no caso de o vetor ser usado em células hospedeiras que são DHFR.

No caso de alguém desejar utilizar o sistema de DHFR em células hospedeiras incorporando uma cópia do gene de DHFR em seu próprio genoma (por exemplo, CHO DHFR⁺), prefere-se que um mutante/variante do gene DHFR seja usado, esse é menos sensível a antifolatos como MTX do que a DHFR de ocorrência natural e é, desse modo, até um certo ponto antifolato respectivamente resistente a MTX. Por exemplo, devido a mutações no gene a sensibilidade do gene DHFR a MTX pode ser significativamente reduzida de modo que a dita variante possa ser usada em concentrações de antifolato maiores (MTX). O dito antifolato em menor quantidade e em particular variante de DHFR sensível a MTX pode, por exemplo, possuir uma afinidade de ligação a antifolato/MTX reduzida. As respectivas variantes DHFR podem ser usadas para supertitular a expressão de DHFR endogênea em linhagens celulares de ocorrência natural. As respectivas variantes de DHFR resistentes ou menos sensíveis são bem-conhecid as na técnica.

O vetor de expressão pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em (a) um ácido nucléico de vetor circular ou linear que compreende os seguintes elementos genéticos na disposição indicada, onde a direção 5' a 3' é indicada pela —>*

I. Promotor do cassete de expressão (MASM) —>*

II. Gene que codifica o marcador selecionável e amplificável de mamífero do cassete de expressão (MASM) (—>)

III. Opcionalmente um íntron do cassete de expressão (MASM) (^)

IV. Sítio PolyA do cassete de expressão (MASM) (—>)

19/45

V. Promotor do cassete de expressão (POI) (—>)

VI. íntron do cassete de expressão (POI) (—>)

VII. Polinucleotídeo que codifica um polipetídeo de interesse, que é inserido no cassete de expressão (POI) (-+)

VIII. Sítio PolyA do cassete de expressão (POI) (—>}

IX. Promotor do cassete de expressão (POI') (—»)

X. íntron do cassete de expressão (ΡΟΓ) (—>)

XI. Polinucleotídeo que codifica um polipetídeo de interesse adicional, que é inserido no cassete de expressão (POI') (-^-)

XII. Sítio PolyA do cassete de expressão (ΡΟΓ) (—>)

XIII. Promotor do cassete de expressão (MSM) (—>)

XIV. Gene que codifica o marcador selecionável de mamífero do cassete de expressão (MSM) (—>)

XV. Sítio PolyA do cassete de expressão (MSM) (->)

XVI. cassete de expressão PSM (—>) ou (<—)

XVII. Sítio de restrição de linearização se o ácido nucléico de vetor for circular;

(b) um ácido nucléico de vetor como mostrado como Seq. ID No. 1 ou Seq. ID No. 16 ou um derivado desse, que compreende a mesma con20 figuração respectiva da disposição de elementos genéticos

Uma modalidade preferida da variante (a) em sua forma circular é mostrada na Figura 1 e Tabela correspondente 1.

O vetor de acordo com a presente invenção pode ser obtido ao dispor os cassetes de expressão na ordem e orientação adequadas como 25 descrito em detalhes acima. A disposição dos cassetes de expressão/elementos genéticos pode ser feita utilizando enzimas de restrição adequadas e estratégias de clonagem para montar o vetor de expressão. Consequentemente, também se proporciona um método de produção de um ácido nucléico de vetor como descrito acima, onde o dito método compreende dispor ao menos os seguintes elementos genéticos (a) ao menos um cassete de expressão (POI) para expressar um polipetídeo de interesse;

20/45 (b) um cassete de expressão (MSM) que compreende um gene marcador selecionável de mamífero;

(c) um cassete de expressão (MASM) que compreende um gene marcador selecionável e amplificável de mamífero;

de modo que o cassete de expressão (POI) é flanqueado 5' pelo cassete de expressão (MASM), o cassete de expressão (MSM) fica localizado 3' do cassete de expressão (POI) e onde os cassetes de expressão (MASM), (POI) e (MSM) ficam dispostos na mesma orientação 5' a 3'.

No caso de um ácido nucleico de vetor circular ser produzido, os elementos genéticos são reunidos de modo que o cassete de expressão (MSM) fique consequentemente localizado 3' do cassete de expressão (POI) e o cassete de expressão (MASM) fique localizado 3' do cassete de expressão (MSM).

O vetor de acordo com a presente invenção pode ser usado para expressar o polipetídeo de interesse em muitas células hospedeiras de mamífero diferentes. O vetor de expressão da presente invenção é geralmente integrado e mantido no genoma. Há dois formatos principais de células hospedeiras, culturas de células aderentes e culturas de suspensão. As culturas de suspensão são preferidas. A maioria das linhagens celulares estabeleci20 das mantém seu caráter dependente de ancoragem a menos que esforços especiais sejam feitos para adaptá-las ao crescimento de suspensão. As formulações de meio comercialmente disponíveis facilitam a transição. Basicamente qualquer célula hospedeira de mamífero pode ser usada em conjunto com a presente invenção desde que essa permita a expressão de um polipetídeo. As células hospedeiras de mamífero adequadas para os propósitos da presente invenção incluem, porém sem caráter limitativo, células derivadas de camundongos (por exemplo, COP, L, C127, Sp2/0, NS-O, NS1, At20 ou NIH3T3), ratos (PC12, PC12h, GH3, MtT), hamsters (por exemplo, BHK, CHO e CHO defeituosa de gene DHFR), macacos (por exemplo,

COS1 , COS3, COS7, CV1 e Vero) e seres humanos (por exemplo, Hela,

HEK-293, PER-C6 derivado de retina, células derivadas de fibroblastos diploides, células do mieloma e HepG2). De preferência, a célula hospedeira é

21/45 uma célula CHO. A construção de vetor de acordo com a presente invenção é particularmente adequada para produzir polipetídeos em células de roedores como células CHO defeituosas de gene DHFR.

Também são fornecidas células hospedeiras de mamífero, que 5 compreendem o vetor de expressão de acordo com a presente invenção. Também se proporciona uma linhagem celular estável, que compreende um vetor de expressão de acordo com a presente invenção ou um segmento desse no genoma. O segmento deve compreender ao menos os cassetes de expressão decisivos para a presente invenção. Visto que o vetor e suas ca10 racterísticas bem como células hospedeiras adequadas são descritos em detalhes acima, faz-se referência à descrição acima. Consequentemente, também se proporciona um método para produzir uma célula hospedeira, como descrito acima, onde a célula hospedeira é transfectada com o ácido nucléico de vetor de acordo com ao menos uma das reivindicações 1 a 16.

Há diversos métodos adequados conhecidos na técnica para introduzir um vetor de expressão em uma célula hospedeira de mamífero. Os respectivos métodos incluem, porém sem caráter limitativo, transfecção de fosfato de cálcio, eletroporação, lipofecção, transferência de genes mediada por biolística e polímero. As células hospedeiras adequadas são descri20 tas acima.

Após a introdução do ácido nucléico de vetor de expressão na(s) célula(s) hospedeira(s), os transformantes obtidos são cultivados sob condições seletivas adequadas para analisar a expressão do gene marcador selecionável de mamífero encerrado no cassete de expressão (MSM). Isso significa que, por exemplo, quando o gene marcador selecionável de mamífero for um gene resistente a antibiótico, os transformantes são cultivados em um meio que contém o antibiótico correspondente ativo em células de mamíferos e os transformantes que são viáveis sob tais condições são selecionados, permitindo assim a obtenção de transformantes que expressam o gene marcador e, desse modo, incorporados no vetor. Adicionalmente, uma segunda etapa de seleção pode ser realizada ao cultivar os transformantes em um meio de seleção adaptado para selecionar o gene marcador selecio22/45 nável e amplificável incluído no cassete de expressão (MASM). Por exemplo, no caso de DHFR ser usada como um gene marcador selecionável e amplificável, os transformantes podem ser cultivados em um nucleotídeo ou meio isento de purina na presença de um inibidor de DHFR.

No caso de um promotor induzível ser usado em ao menos um cassete de expressão, um sinal de indução correspondente deve ser fornecido para começar a expressão do polipetídeo.

Para fazer uso do sistema de seleção/amplificação de DHFR, as ditas células hospedeiras podem ser cultivadas na presença de um inibidor de DHFR. Os inibidores de DHFR adequados são antifolatos como, por exemplo, MTX. A concentração de antifolato/MTX usada depende da célula hospedeira e do variante de DHFR incorporado no vetor. A faixa de concentração pode ser selecionada para procedimentos de amplificação em múltiplas etapas em células hospedeiras DHFR', por exemplo, em valores em torno de 5nM a 20nM que variam até valores de 500nM a 1000nM ou ainda superiores para etapas de amplificação secundárias ou adicionais. Para células DHFR⁺ as concentrações de partida são geralmente superiores na faixa de 100nM a 750nM, de preferência, 500nM nas primeiras etapas e 500nM a 1000nM e acima para etapas de amplificação adicionais. As variantes de

DHFR adequadas são descritas acima.

Para fazer uso do sistema de seleção/amplificação de GS as ditas células hospedeiras podem ser cultivadas na presença, por exemplo, de MSX. A concentração de MSX usada depende da célula hospedeira. A faixa de concentração pode ser selecionada entre cerca de 15 a 150 μΜ, 20 a 100 pM e 25 a 50 pM. Essas faixas são particularmente adequadas para células NSO e CHO.

Com o vetor de expressão de acordo com a presente invenção, diversos polipetídeos de interesse diferentes podem ser expressos/produzidos. O termo polipetídeo se refere a uma molécula que compre30 ende um polímero de aminoácidos ligados por uma ligação/ligações peptídica(s). Os polipetídeos incluem polipetídeos de qualquer comprimento, inclusive proteínas (por exemplo, que possuem mais de 50 aminoácidos) e peptí23/45 deos (por exemplo, 2 a 49 aminoácidos). Os polipetídeos incluem proteínas e/ou peptídeos de qualquer atividade ou bioatividade, inclusive, por exemplo, polipetídeos bioativos como proteínas ou peptídeos enzimáticos (por exemplo, proteases, quinases, fosfatases), proteínas ou peptídeos receptores, proteínas ou peptídeos transportadores, bactericidas e/ou proteínas de ligação à endotoxina, proteínas ou peptídeos estruturais, polipetídeos imunes, toxinas, antibióticos, hormônios, fatores de crescimento, vacinas ou similares. O dito polipetídeo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em hormônios peptídicos, interleucinas, ativadores do plasminogênio tecidu10 al, citocinas, imunoglobulinas, em particular anticorpos ou fragmentos de anticorpo ou variantes desses. A dita imunoglobulina pode ser qualquer isotipo. Muito frequentemente as moléculas de IgG (por exemplo, IgGI) são produzidas/necessárias como proteínas terapêuticas. Um fragmento de anticorpo é qualquer fragmento de um anticorpo que compreende ao menos 20 aminoácidos do dito anticorpo total, de preferência, ao menos 100 aminoacidos, esse ao menos ainda possui uma capacidade de ligação ao antígeno. O fragmento de anticorpo pode compreender a região de ligação do anticorpo como um fragmento Fab, um fragmento F(ab)2, multicorpos que compreendem múltiplos domínios de ligação como anticorpos bivalentes, anticorpos trivalentes ou anticorpos tetravalentes, anticorpos de domínio único ou affibodies. Uma variante de anticorpo é um derivado de um anticorpo ou fragmento de anticorpo que possui a mesma função de ligação, porém, por exemplo, uma sequência de aminoácido alterada. O dito anticorpo e/ou fragmento de anticorpo pode compreender uma cadeia leve murina, cadeia leve humana, cadeia leve humanizada, cadeia pesada humana e/ou cadeia pesada murina bem como fragmentos ativos ou derivados desses. Consequentemente, esse pode ser, por exemplo, murino, humano, quimérico ou humanizado.

A presente invenção também proporciona métodos de produção de um polipetídeo de interesse, sendo que o dito método compreende cultivar ao menos uma célula hospedeira que compreende um ácido nucléico de vetor de acordo com a presente invenção em um meio de cultura celular sob

24/45 condições que permitem a expressão do dito polipetídeo de interesse.

Em uma próxima etapa, o dito polipetídeo pode ser isolado/colhido da cultura celular. O polipetídeo de interesse expresso pode ser obtido ao dividir as células hospedeiras. Os polipetídeos também podem ser expressos, por exemplo, secretados no meio de cultura e podem ser obtidos a partir dessa. Também combinações dos respectivos métodos são possíveis. Assim, produtos, em particular polipetídeos pode ser produzidos e obtidos/isolados de maneira eficaz com alto rendimento. O polipetídeo obtido também pode ser submetido a etapas de processamento adicionais como, por exemplo, etapas de purificação e/ou modificação para produzir o produto de interesse na qualidade desejada.

De acordo com uma alternativa, o dito polipetídeo de interesse é secretado no meio de cultura celular e subsequentemente isolado do meio de cultura celular. O polipetídeo é, de preferência, uma molécula de imuno15 globulina como um anticorpo ou um fragmento funcional desse. Para promover a secreção do polipetídeo de interesse uma sequência líder pode ser usada. De preferência, utiliza-se a sequência líder de uma molécula de imunoglobulina.

O vetor de expressão de acordo com a presente invenção bem como células hospedeiras e polipetídeos de interesse adequados são descritos em detalhes acima; faz-se referência à descrição acima.

O método de produção do polipetídeo de interesse pode compreender ao menos uma das seguintes etapas:

- isolar o polipetídeo de interesse do dito meio de cultura celular e/ou da dita célula hospedeira; e/ou

- processar o polipetídeo de interesse isolado.

O polipetídeo de interesse produzido de acordo com a invenção pode ser recuperado, adicionalmente purificado, isolado e/ou modificado por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o produto pode ser recupera30 do do meio nutriente por procedimentos convencionais inclusive, porém sem caráter limitativo, centrifugação, filtração, ultrafiltração, extração ou precipitação. A purificação pode ser realizada por uma variedade de procedimentos

25/45 conhecidos na técnica inclusive, porém sem caráter limitativo, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, exclusão hidrofóbica, focagem cromatográfica, e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo,, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio) ou extração.

De acordo com uma modalidade que é em particular vantajosa para a produção de proteínas/peptídeos farmacêuticos, a célula hospedeira é cultivada em suspensão sob condições isentas de soro. O polipetídeo obtido pode ser posteriormente purificado, por exemplo, ao purificar o polipetídeo presente no sobrenadante de cultura celular utilizando métodos cromatográficos (por exemplo, purificação por afinidade).

Os polipetídeos produzidos de acordo com o método da presente invenção apresentam propriedades de estabilidade satisfatórias. Os resultados também mostram que os polipetídeos são expressos em uma forma funcional e, consequentemente, na conformação certa. Consequentemente, a invenção também proporciona polipetídeos obtidos pelo método de produção de acordo com a presente invenção utilizando o vetor de expressão descrito em detalhes acima. Como descrito acima, os polipetídeos são obtidos com um rendimento satisfatório. O polipetídeo é, de preferência, uma molécula de imunoglobulina como um anticorpo ou um fragmento funcional desse.

A Figura 1 mostra um ácido nucleico de vetor circular de acordo com uma modalidade preferida da presente invenção.

A Figura 2 mostra a versão linearizada do ácido nucleico de vetor de acordo com a Figurai para demonstrar a influência da posição do sítio de restrição de linearização.

Os números 1 a 17 mostrados nas Figuras 1 e 2 indicam os elementos genéticos/características do ácido nucleico de vetor e são descritos em detalhes na tabela subsequente 1. Se não definido de outro modo, as setas brancas caracterizam promotores ou elementos promotores/intensificadores; as caixas listradas caracterizam elementos de íntron, as setas pretas simbolizam os polinucleotídeos para expressar o polipetídeo de

26/45 interesse; as caixas quadriculadas caracterizam o sítio polyA; as setas quadriculadas caracterizam os genes marcadores de mamífero do cassete de expressão (MSM) e (MASM); a seta listrada caracteriza o gene marcador selecionável procariótico. Como pode ser observado, todos os elementos genéticos ficam dispostos na mesma orientação 5' a 3' (indicada pela direção da seta). Os ácidos nucleicos de vetor pBW147, pBW154 e pBW160, que são descritos em detalhes abaixo, são respectivamente construídos.

Tabela 1 - orientação e disposição dos elementos genéticos de acordo com um ácido nucléico de vetor como mostrado na Figura 1 e 2

Numeração na Figura 1 e 2	Elemento genético
1	Promotor do cassete de expressão (POI) (diagramado pela seta branca). Esse é, por exemplo, um promotor/intensificador CMV
2	íntron do cassete de expressão (POI). Esse é, por exemplo, um íntron-RK, como descrito acima
3	Polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, que é inserido no cassete de expressão (POI) (diagramado pela seta preta). De acordo com a modalidade mostrada, esse é a cadeia leve de um anticorpo monoclonal (mAB-LC).
4	Sítio PolyA do cassete de expressão (POI) (diagramado pela caixa quadriculada). Esse é, por exemplo, um sítio PolyA SV40
5	Promotor do cassete de expressão (POI') (diagramado pela seta branca). Esse é, por exemplo, um promotor/intensificador CMV
6	íntron do cassete de expressão (POI') (diagramado pela caixa listrada). Esse é, por exemplo, um íntron-RK, como descrito acima
7	Polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, que é inserido no cassete de expressão (POI') (diagramado pela seta preta). De acordo com a modalidade mostrada, esse é a cadeia pesada de um anticorpo monoclonal (mAB-HC).

27/45

Numeração na Figura 1 e 2	Elemento genético
8	Sítio PolyA do cassete de expressão (ΡΟΓ) (diagramado pela caixa quadriculada). Esse é, por exemplo, um sítio PolyA SV40
9	Promotor do cassete de expressão (MSM) (diagramado pela seta branca). Esse é, por exemplo, um promotor/intensificador SV40
10	Gene que codifica o marcador selecionável de mamífero do cassete de expressão (MSM) (diagramado pela caixa quadriculada). Esse é, por exemplo, o neo gene
11	Sítio PolyA do cassete de expressão (MSM) (diagramado pela barra). Esse é, por exemplo, um sítio PolyA sintético como descrito acima
12	Cassete de expressão PSM (diagramado pela seta listrada). Esse pode compreender, por exemplo, um gene marcador selecionável procariótico que fornece uma resistência contra ampicilina
13	Sítio de restrição de linearização (diagramado pela barra). 0 dito sítio é, de preferência, um sítio de restrição exclusivo
14	Promotor do cassete de expressão (MASM) (diagramado pela seta branca). Esse é, por exemplo, um promotor SV40
15	Gene que codifica o marcador selecionável e amplificável de mamífero do cassete de expressão (MSM) (diagramado pela seta quadriculada). Esse é, por exemplo, o gene DHFR
16	íntron do cassete de expressão (MASM) (diagramado pela barra). Esse íntron está opcionalmente presente
17	Sítio polyA do cassete de expressão (MASM) (diagramado pela caixa quadriculada. Esse é, por exemplo, um sítio polyA SV40

Subsequentemente, são fornecidos exemplos adequados dos elementos de vetor descritos, esses são, entretanto, não limitativos.

Como o marcador selecionável e amplificável de mamífero o uso de DHFR é preferido. Um exemplo adequado de um polinucleotídeo DHFR

3π· χ« «Αα «κ_Λ^ίκ

28/45 de camundongo de ocorrência natural é fornecido com Seq. ID No. 5 que é, de preferência, usado em conjunto com as células hospedeiras DHFR'. Uma forma mutante adequada de DHFR é fornecida com Seq. ID No. 6. Uma respectiva forma mutante é, de preferência, usada juntamente com as células

DHFR⁺. A Seq. ID No. 12 mostra uma DHFR mutante que inclui um íntron adequado para aumentar adicionalmente a pressão de seleção (veja acima). Também variantes ou fragmentos funcionais desses podem ser usados.

Como o gene marcador selecionável de mamífero o uso de neo é preferido. Uma sequência adequada é fornecida com Seq. ID No. 7. Tam10 bém variantes ou fragmentos funcionais desses podem ser usados.

Como uma sequência de promotor para conduzir a expressão do polipetídeo de interesse o uso de um promotor CMV é preferido. Uma sequência adequada é proporcionada com Seq. ID No. 8. Também variantes ou fragmentos funcionais desses podem ser usados.

Como uma sequência de promotor para conduzir a expressão dos genes marcadores selecionáveis MSM e MASM o uso de promotor SV40 é preferido. Uma sequência adequada é proporcionada com Seq. ID No. 9. Também variantes ou fragmentos funcionais desses podem ser usados.

Como uma sequência de poliadenilação dos polipetídeos de interesse e/ou MASM um sítio poly SV40 pode ser usado. Uma sequência adequada é mostrada como Seq. ID No. 10. Também variantes ou fragmentos funcionais desses ou uma orientação reversa (sítio poly A SV40 final ou inicial) podem ser usados.

Como uma sequência de íntron do cassete de expressão (POI) que codifica o polipetídeo de interesse um íntron Rk pode ser usado. Uma sequência adequada é fornecida com Seq. ID No. 11. Também variantes ou fragmentos funcionais desses podem ser usados.

Como sitio de poliadenilação sintético que pode ser usado, por exemplo, em conjunto com o marcador selecionável de mamífero (MSM) é mostrado com Seq. ID No. 13. Também variantes ou fragmentos funcionais desses podem ser usados.

29/45

Um marcador selecionável bacteriano adequado (PSM) é, por exemplo, o gene beta-lactamase que fornece resistência à ampicilina. Uma sequência adequada é fornecida com Seq. ID No. 14. Também variantes ou fragmentos funcionais desses podem ser usados.

Ademais, o ácido nucléico de vetor pode compreende ao menos um sítio múltiplo de clonagem (MCS) para inserir, por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um polipetídeo de interesse. MCS pode ser fornecido 3' e 5' do polinucleotídeo que codifica o polipetídeo de interesse. Os sítios MCS adequados são fornecidos como Seq. ID No. 4 (de preferência, locali10 zados no sítio/região 5') e Seq. ID No. 15 (de preferência, localizada na sítio/região 3'). Esses sítios MCS podem ser usados, por exemplo, para introduzir o polinucleotídeo que codifica o polipetídeo de interesse.

Os ácidos nucléicos de vetor particularmente preferidos são mostrados como Seq. ID No. 1 (que compreende o gene DHFR de ocorrên15 cia natural, o dito vetor é particularmente útil no sistema DHFR ) e Seq. ID No. 16 (que compreende um gene DHFR modificado, o dito vetor é particularmente útil no sistema DHFR⁺).

Todas as referências citadas aqui são incorporadas a título de referência e, assim, formam parte da presente descrição.

EXEMPLOS

A presente invenção é descrita agora por meio de exemplos não limitativos, que, entretanto, constituem as modalidades preferidas da presente invenção.

I, Métodos de cultura e transfecção celular 25 Subsequentemente, os métodos adequados para transfecção e cultura das células hospedeiras de acordo com a presente invenção para expressar um polipetídeo de interesse são descritos por meio de exemplos. Exemplo 1 : Cultura celular

As células CHO são cultivadas em um meio CHO adequado co30 mo, por exemplo, ExCell81134 (obtido junto à SAFC Biosciences). As células ficam 2-3 vezes por semana dentro do meio fresco e são mantidas em fase de crescimento logarítmica ao longo do estudo.

30/45

Exemplo 2: Estratégia de transfecção

Para transfecção, as células CHO de origem em fase de crescimento exponencial com uma viabilidade acima de 90 % são usadas. As transfecções por lipofecção são realizadas utilizando o reagente DMRIE-C de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). A quantidade de células é ajustada para 1x10⁶ células em meio OptiMEM I (Invitrogen). Para lipofecção, 2 pg ou 4 pg do vetor de expressão e 4 pl do reagente DMRIE-C são misturados durante 28 min à temperatura ambiente e adicionados às células durante 4 h a 37°C. As células são então diluídas em 2x10⁵ célu10 las/ml de meio de cultura e incubadas durante 2 dias a 37°C e 5% de CO₂. Exemplo 3: Seleção de neomicina e amplificação de genes

O marcador de seleção de neomicina localizado sobre o ácido nucléico de vetor de expressão permite a seleção de resistência a G418. Para a seleção de transfectantes, as células são cultivadas na presença de

0,8 mg/ml de G418 (Invitrogen) durante aproximadamente duas semanas.

Duas semanas após a transfecção e seleção de G418, as populações que consistem predominantemente em células resistentes a G418 são combinadas. As células são então cultivadas na ausência de nucleotídeos durante cerca de duas semanas. A amplificação de genes é então iniciada pela adi20 ção de 20nM de MTX ao meio de cultura. Após três semanas de cultivação, um grupo celular heterogêneo amplificado é gerado. O marcador de seleção/amplificação DHFR (di-hidrofolato redutase) permite a amplificação do gene DHFR bem como do transgene mediante a adição do análogo de ácido fólico metotrexato (MTX) ao meio de cultura, resultando em títulos aumenta25 dos para grupos de transfecção. Após a recuperação de crises, os grupos são submetidos a uma segunda e uma terceira etapa de amplificação utilizando uma concentração de MTX maior durante aproximadamente duas semanas (100nM e 500nM MTX). Em cada etapa as células são congeladas após a recuperação de grupos.

Exemplo 4: Estabelecimento de linhagens celular clonais

Para obter uma linhagem celular clonal (ou seja, uma linhagem celular derivada de uma única célula), o grupo de células estavelmente /45 transfectadas pode ser diluído e semeado em placas de 96 poços com uma densidade celular de 0,3 a 0,5 célula por poço (diluição limitada). As células que formam uma colônia distinta são representadas em escala utilizando procedimentos padrão. Eventualmente, os clones individuais são avaliados para expressão polipeptídica recombinante, com os procedimentos máximos sendo mantidos após a cultivação e análise. A partir desses candidatos, a linhagem celular com as características de crescimento e produtividade adequadas é selecionada para produção da proteína recombinante. A produtividade pode ser de modo geral adicionalmente aprimorada ao estabele10 cer/adaptar as condições de cultura, ou seja, ao adicionar aditivos como peptonas.

II. Construções de vetor

Diversos conjuntos de vetores são possíveis de acordo com a presente invenção. À medida que os elementos individuais do vetor são co15 nhecidos na técnica, os vetores adequados podem ser agrupados, por exemplo, mediante o sequenciamento ou amplificação e clonagem adequada dos elementos genéticos básicos e cassetes de expressão na orientação desejada. Os respectivos métodos de clonagem são de última geração e também a sequência dos elementos genéticos descritos acima são repre20 sentados na técnica anterior. Subsequentemente, a geração de várias construções de vetor é descrita a título de exemplo. Entretanto, é entendido pelos versados na técnica que várias outras modalidades e formas de se obter os respectivos vetores são adequadas e facilmente disponíveis. Para facilitar a compreensão da disposição das construções de vetor descritas aqui a título de exemplo e seus vetores precursores, as tabelas 1 e 2 fornecem uma visão geral dos elementos genéticos principais incluídos nesses vetores, sua ordem e orientação. Naturalmente, apenas os elementos principais são mostrados, os vetores podem, entretanto, compreender elementos genéticos ou sequências de cadeia principal adicionais. Cada coluna na tabela representa uma construção de vetor. A partir da linha superior até a linha inferior os elementos genéticos dos cassetes de expressão são listados na ordem de sua disposição e sua orientação sobre o vetor. Visto que os vetores descri32/45 tos são circulares, o elemento mostrado na última linha de cada coluna é, na verdade, adjacente ao elemento genético mostrado na primeira linha (naturalmente, sequências de cadeia principal podem estar presentes). A orientação de cada elemento genético é indicada pelas setas. As pontas da seta na direção 3' do respectivo elemento genético.

Tabela 2 - ordem dos elementos genéticos nos vetores precursores

pBW133 10416bp	pBW139 9213bp	pBW146 9247bp	pBW159 11122bp
Prom/intenCMV	Prom/intenCMV	Prom/intenCMV compreendendo um sítio de restrição Spel (153) —>	Prom/intenCMV
Íntron-RK —>	Íntro-RK ->	Íntro-RK	Íntro-RK —>
mAB-LC	mAB-LC	mAB-LC	mAB-LC
MCS I	MSC	MSC	MSC
SV40polyA	SV40polyA ->	SV40polyA	SV40polyA
Sítio de restrição Dralll (2365)	Prom/intenCMV	Prom/intenCMV compreendendo um sítio de restrição Spel (2519)	Prom/intenCMV
DHFR* conduz um sítio de restrição (2870); orientação inversa <—	Íntron-RK—>	Íntron-RK—>	Íntron-RK—>
Prom/intenCMV; orientação inversa <—	MCS	MCS2	mAB-HC
Sítio de restrição Dralll (351)	mAB-HC	mAB-HC	MCS
Prom/intenSV40	MCS	MCS	Promotor T3
Neo ->	SV40polyA -+	Promotor T3	SV40polyA

33/45

pBW133 10416bp	pBW139 9213bp	pBW146 9247bp	pBW159 11122bp
Prom/intenSV40	Região de fago f1 compreendendo um sítio de restrição Dra\II (5456)	SV40-polyA —>	Região de fago f1
Íntron-RK —>	Prom/intenSV40	Região de fago f1	Prom/intenSV4 0^
MCS2	Neo —*	Prom/intenSV40 que compreende SV40 de origem mínima de replicação —>	Neo —>
mAB-HC	SV40polyA —>	Neo —>	Poly A Sintético
SV40 polyA	Amp compreendendo um sítio de restrição Seal (7828) -9	Poly A Sintético	Amp —>
Amp conduz Seal (9031)	Sítio de restrição Bg/W (9029), 5' até o prom/intens CMV	Amp -*	Sítios 3pA
		Sítio de restrição Bg/ll (9243) 5' adjacente do prom/intens CMV	íntron
			DHFR; orientação inversa <—
			SV40prom; oritenação inversa 5—
			Sítio de restrição Swal (11113)

. 4TO1.AJ «

34/45

Tabela 3 - ordem dos elementos genéticos nos vetores de expressão

pBW147 11053bp	pBW154 11109bp	pBW160 11122bp
Prom/intensCMV, compreendendo um sítio de restrição Spel (153)	Prom/intensCMV —>	Prom/intensCMV
Íntron-RK —>	Íntron-RK —>	Íntron-RK
mAB-LC	mAB-LC	mAB-LC ->
SVpolyA —>	SVpolyA —>	SVpolyA —>
Prom/intens CMV compreendendo um sítio de restrição Spel (2519)	Prom/intens CMV	Prom/intens CMV
Íntron-RK	Íntron-RK ->	Íntron-RK -»
mAB-LC ->	mAB-LC	mAB-LC
SVpolyA —>	SVpolyA —>	SVpolyA —»
Prom/intens CMV -*	Prom/intens CMV	Prom/intens CMV
Neo —>	Neo —>	Neo —>
polyA sint	polyA sint	polyA sint
Amp —>	Amp —>	Amp —>
Sítio de restrição Swal (9288)	Sítio de restrição Swal (9243)	Sítio de restrição Swal (9256)
DHFR*	DHFR —>	DHFR—>
Sítio Bgh pA —>	íntron	íntron
	SV40polyA	SV40polyA

As abreviações nas tabelas acima 1 a 3 e nas Figuras 1 e 2 possuem os significados comuns como avaliado por um versado na técnica e como descrito acima, e possuem em particular os seguintes significados:

MCS = sítio múltiplo de clonagem mAB-HC = anticorpo monoclonal de cadeia pesada mAB-LC = anticorpo monoclonal de cadeia leve íntron = veja Grillari et al, 2001 , 3. Biotechnol. 87, 59-65 prom/intens = promotor/intensificador

Exemplo 5: Construção de vetor de expressão pBW147

Nessa disposição a configuração conjunta de genes mAB e a

35/45

DHFR* (variante mutante que possui uma sensibilidade menor a MTX do que a DHFR de ocorrência natural) combinada com o sítio bgh pA, é testada. O cassete DHFR* é posicionado 5' antes do cassete de expressão (POI), que compreende mAB-LC, de modo que os quadros de leitura abertos sejam posicionados em uma direção de leitura. O conjunto de pBW147 é mostrado na tabela 3.

pBW147 pode ser construído a partir de pBW133 (favor também referir-se à tabela 2). A construção de pBW147 é descrita aqui.

Construção de pBW133

As construções de vetor descritas estão baseadas no pCI-neo vetor de expressão comercialmente disponível (Promega Cooperation, USA). A sequência completa de DNA está publicamente disponível (GenBank/EMBL Número de acesso: U47120). Um novo sítio múltiplo de clonagem é introduzido em pCIneo.

Os dois filamentos do sítio múltiplo de clonagem são sintetizados de novo. pCIneo é cortado com Nhe\ e Xmal. O MCS antigo é removido por eletroforese em gel. O novo sítio múltiplo de clonagem é sintetizado em uma forma que os 4 nucleotídeos terminais da extremidade 5' da cadeia antisenso e da extremidade terminal 3' de filamento de DNA superior não são sintetizados. Após a têmpera de ambos os filamentos extremidade compatíveis de Nhe\ e Xmal são criadas.

A sequência do novo sítio múltiplo de clonagem é a seguinte (veja Seq. ID No. 2): _

ApalSgrAI
Agel Pmel	EcoRV PshAI
EcoOlOSl fisfEII	Pmt\ BspEI Ascl

O plasmídeo resultante da ligação de pCIneo com o novo MCS é considerado pCI-neo-2 para propósitos de descrição. pCI-neo-2 é adicionalmente modificado ao introduzir o íntron pRK de pRK5 (BD PharMingen). Portanto, pCI-neo-2 é digerido com Apal. As extremidades cegas são criadas por tratamento de polimerase T4. Então o plasmídeo é digerido com Ndel.

pRK5 é digerido com Ndel e Nrul (cortador de extremidade cega). O íntron

36/45

RK contendo o fragmento é isolado e ligado com a cadeia principal de pCIneo2. O plasmídeo resultante é pClneo2RK. Para posicionar ambos os cassetes de expressão sobre um vetor, o vetor pClneoDHFR*-RK pode ser obtido. pClneoDHFR*-RK é obtido da seguinte maneira:

O cassete de expressão DHFR* é amplificado por PCR a partir do vetor pCHI-LC (vetor de expressão de cadeia leve Simulect SP2/0). Os iniciadores são BB35 (GGGCACTACGTGCCGCGGATTTAAATGCGGCCGCATATGGTGCACT Seq. ID No. 3) e BB36 (GGGCACGTAGTGTTTATTAGGGGAGCAGAGA10 ACTTGAA - Seq. ID No. 4).

O fragmento de PCR é clonado em pCIneoRK através de digestão por restrição Dralll obtendo o vetor pClneoDHFR*-RK. pClneoDHFR*-RK é aberto por digestão com Eco0109l. Para criar extremidades cegas, o tratamento com a enzima Klenow é realizado posteriormente.

O cassete de expressão de pClneo2RK é cortado ao digerir o plasmídeo com Bg/W, Λ/goMIV e StuL Após a ligação dos dois fragmentos o vetor de expressão vazio pCHO2neoN é criado. O gene de anticorpo de cadeia leve é inserido dentro de pCHO2neoN através do sítio de restrição Mlu\ e Sa/I criando assim uma construção de vetor, referida como pBW108.

O gene de anticorpo é, portanto, amplificado utilizando iniciadores que contêm os dois sítios de restrição.

O mAB de cadeia pesada é inserido em pBW108 através de digestão de Pmel e Ascl do vetor obtendo assim uma construção de vetor considerada pBW111 para propósitos de descrição. A cadeia pesada é am25 plificada por PCR com a extremidade 5' gerando extremidades cegas e a extremidade 3' do gene contendo o sítio de restrição Ascl.

Em pBWm a extremidade de região não traduzida 5' da cadeia leve é trocada, pois um códon ATG adicional está presente na frente do cDNA de cadeia leve. Isso é realizado ao cortar um fragmento Sg/ll / Mlul de pBW111 e ao substituí-lo pelo fragmento corrigido. O novo plasmídeo é considerado pBW133. pBW133 é o primeiro vetor com todos os genes sobre um plasmídeo. A disposição dos genes é: LC - DHFR (direção oposta) - neo 37/45

HC (veja também tabela 2). Esse vetor é um dos materiais de partida que pode ser usado para obter vetores de acordo com as instruções da presente invenção. Entretanto, é óbvio que há várias outras maneiras de se obter os respectivos vetores.

Construção de pBW139

A segunda construção de vetor que pode ser usada para obter pBW147 possui a configuração de pBW139. pBW139 pode ser criada a partir de pBW115. Para a construção de pBW115, o gene de cadeia pesada é clonado em pCIneoRK (veja acima). Portanto, pCIneoRK é digerido com

Mlu\ e Nru\ (cortador de extremidade cega), enquanto o fragmento de PCR de cadeia pesada é digerido com Ascl (3') (compatível com Mlu\) e é cego 5'. O plasmídeo resultante é considerado pBW115. pBW115 é digerido com Seal e BgA\. Então um preenchimento com Klenow é feito para criar extremidade cegas. O cassete de expressão de cadeia leve é cortado a partir de pBW133 com Seal e Dralll. Para criar extremidades cegas, o tratamento de T4-DNA polimerase é realizado. O vetor resultante da ligação é um que possui uma configuração como pBW139 (veja tabela 2).

Conjunto de pBW147

Para obter pBW147, pBW133 é digerido com Spel, Xhol. O fragmento contendo partes do promotor CMV e a primeira parte da cadeia pesada é isolada e ligada a pBW139, que também é cortado com Spel, Xho\. No vetor resultante o cassete de cadeia pesada é obtido sem um códon ATG adicional perturbante. Para trazer de volta a cadeia leve para dentro do vetor, pBW139 é digerido com Spel. O fragmento contendo LC é inserido em pBW148 que é aberto com Spel. O plasmídeo resultante possui uma configuração como pBW146 (veja tabela 2).

Em pBW146 o gene DHFR de pBW112 (vetor de expressão de outro projeto) é inserido. Entretanto, o gene DHFR também poderia ser obtido de uma fonte diferente, dependendo do tipo de variante de DHFR deseja30 da. pBW146 é digerido com Bg/W. Posteriormente, o cassete de DHFR é amplificado por PCR com iniciadores contendo sítios de restrição fíg/ll e

BamHI. O fragmento de PCR é digerido com as duas enzimas e inserido no

38/45 sítio Bg/W de pBW146. O plasmídeo resultante possui uma configuração como pBW147, onde todos os cassetes de expressão possuem a mesma orientação. A estrutura é mostrada na tabela 3.

Esse vetor de expressão pode ser usado para obter transfec5 ções estáveis. Para aumentar adicionalmente o rendimento da expressão, uma variante DHFR de ocorrência natural muito sensível a MTX pode ser selecionada, onde também as concentrações de MTX devem ser adequadamente adaptadas.

Exemplo 6: Construção de vetor de expressão pBW154 10 Para esse vetor, a configuração conjunta dos genes mAB e o cassete de gene DHFR de pSV2DHFR (versão de ocorrência natural de DHFR com alta sensibilidade a MTX) é testada. O cassete de expressão DHFR de pSV2DHFR (ATCC#374146) é amplificado por PCR. O fragmento continha o promotor e os sítios polyA. Como anteriormente, os oligos possu15 em sítios de restrição fig/ll/fíamHI. O cassete de expressão DHFR é inserido no sítio de restrição fíg/ll de pBW146, resultando em uma construção de vetor que possui a mesma estrutura que pBW154. A estrutura de pBW154 é mostrada na tabela 3 e pode ser derivada das Figuras 1 e 2 que mostram um exemplo geral de uma construção de vetor que possui uma respectiva estrutura/configuração total dos elementos genéticos. A sequência de pBW154 é fornecida como Seq. ID No 1. O polinucleotideo de cadeia leve é marcado n (na aplicação de prioridade indicada com a incógnita V), o polinucleotídeo de cadeia pesada é marcado n (na aplicação de prioridade indicada com a incógnita Y) na Seq. ID No. 1. As características de pBW154 são resumidas na Tabela 4. Naturalmente, também outros elementos de vetor, por exemplo, promotores diferentes, intensificadores diferentes, sítios Poly A diferentes e outros elementos como oris diferentes podem ser usados. Ademais, é possível trocar os cassetes de expressão pela cadeia leve e pesada da molécula de imunoglobulina. Entretanto, prefere-se a seleção e disposi30 ção mostradas dos elementos de vetor. Como apresentado acima, também fragmentos funcionais de moléculas de imunoglobulina podem ser usados. Portanto, nnn indicado serve apenas para propósitos de ilustração e não

39/45 indica nenhuma restrição de tamanho visto que sequências de imunoglobulina menores ou maiores podem estar presentes na posição correspondente. Para amenizar a comparação com as Figuras 1 e 2, que mostram a construção geral de vetores de acordo com a modalidade preferida da invenção, a numeração dos elementos correspondentes é indicada nas Figuras 1 e 2.

Tabela 4

Início de par de bases	Extremidade	Característica	Numeração correspondente na Fig. 1 e 2
1	743	Prom/intens CMV	1
857	1000	Íntron-RK	2
1054	1766	mAB LC	3
1815	2036	SV40polyA	4
2367	3109	Prom/intens CMV	5
3223	3366	Íntron-RK	6
3452	4863	mAB HC	7
4931	5152	SV40polyA	8
5766	6184	SV40prom	9
6229	7024	Neomicina fosfo- transferase	10
7087	7135	polyA sintético	11
7546	8406	Resistência ao antibiótico beta lactamase	12
9243		Sítio de linearização exclusivo	13
9422	9617	SV40prom	14
9640	10204	DHFR	15
9776	10426	íntron (doadoraceitador)	16
10909	11098	SV40polyA	17

Todos os elementos genéticos estão dispostos na mesma orientação 5' a 3'. Com essa construção de vetor que utiliza uma DHFR de ocorrência natural, a amplificação de genes, como descrito acima, funciona de maneira muito eficiente. O título em um experimento de lote padrão pode ser aumentado 10 a 20 vezes. Aqui, um grande aumento no título de expressão

40/45 de anticorpo é observado mediante a amplificação de MTX. Partindo do tratamento de G418, ao longo do tratamento sem nucleotídeos a várias concentrações diferentes com MTX (20 e 100nM de MTX), o título aumenta constante e consideravelmente. Entretanto, utilizando concentrações de

MTX muito maiores (por exemplo, 500nM de MTX) geralmente não traz nenhuma vantagem com células CHO, mesmo que as respectivas altas concentrações possam ser usadas. Os títulos de anticorpo obtidos de grupos através do processo de seleção/amplificação variaram de 2 a mais de 60mg/L quando se utiliza procedimentos de cultura padrão. Os títulos de ex10 pressão pode ser adicionalmente aumentados ao estabelecer linhagens celulares clonais dos grupos e utilizando meio customizado para aumentar a expressão celular visto que o título obtenível também depende do meio usado.

Exemplo 7: Construção de vetor de expressão pBW160

Os experimentos também demonstram que a orientação do gene

DHFR no vetor é decisiva. Em pBW146 (veja acima) um sítio de restrição EcoRI está presente. Para ter EcoRI como um único cortador presente no vetor de expressão final, o sítio pode ser removido ao digerir pBW146 com EcoRI, preenchimento com Klenow e relegação. Isso resulta em plasmídeo com a configuração como pBW158 (não mostrada). O cassete de DHFR pode ser integrado em pBW158, como descrito acima. Visto que ambas as orientações (orientação como mostrada em pBW159 e pBW160, veja tabela 2 e 3) são automaticamente geradas, ambas podem ser testadas para níveis de expressão. Os resultados mostram desempenho superior da configuração com todos os quadros de leitura abertos orientados em uma direção de leitura 5' a 3'.

Os vetores com uma configuração como vetor pBW159 (veja tabela 2), onde a orientação DHFR está na ordem inversa dos genes mAB geralmente mostram títulos de expressão muito baixos, mesmo após a am30 plificação de MTX (geralmente menos que 1 mg/L). Os vetores com um desenho como pBW160 (veja tabela 3), onde a orientação de DHFR está no quadro com os genes mAB, pode fornecer títulos de anticorpo maiores de

41/45 mais de 5mg/L e ainda maiores que 10 ou ainda maiores que 15mg/L (obteníveis a partir dos grupos). Novamente, ao estabelecer uma linhagem celular clonal e ao utilizar um meio de alto desempenho o rendimento de título pode ser adicionalmente aumentado quando construções de vetor são utilizadas de acordo com a presente invenção.

Esses experimentos podem demonstrar a vantagem da configuração em quadro dos marcadores de seleção e os genes de codificação mAB como usados de acordo com as instruções da presente invenção. Esse resultado sustenta a descoberta que a orientação 5' a 3' dos elementos de vetor é um fator importante para altos vetores de expressão. Ademais, a estabilidade de expressão é muito favorável com os vetores de expressão de acordo com a presente invenção. A configuração de vetor de acordo com a presente invenção permite a geração direta de grupos de células com altas produtividades específicas celulares. Os elementos principais são a orienta15 ção 5' a 3', as variantes de DHFR selecionadas e o posicionamento do marcador de seleção de DHFR sobre o vetor bem como a disposição dos genes de anticorpo e o segundo marcador de seleção (neo) sobre o plasmídeo. O vetor também pode ser usado para a produção de proteínas ou peptídeos de não anticorpo. Como descrito acima, com ligeiras adaptações do cassete de

DHFR, esse sistema também é utilizável para amplificação de gene na linhagem celular CHO-K1PD DHFR positiva. Para amplificação de gene em células hospedeiras DHFR⁺ uma versão modificada do gene de DHFR é usada (veja acima). O cassete de expressão de DHFR completo de um vetor que compreende uma versão modificada do gene DHFR como pBW117 po25 de ser amplificada por PCR com iniciadores incorporando um sítio a BamHI. Esse fragmento é então clonado no sítio Sg/ll de pBW158 resultando no vetor pBW165. Com os vetores com uma configuração como pBW165 compreendendo um gene de DHFR modificado (e funcionam com outros anticorpos), linhagens celulares de alto rendimento podem ser geradas na célula hospedeira CHO-K1-PD, que é uma linhagem celular DHFR⁺. Um exemplo de uma respectiva sequência de vetor é fornecido como Seq. ID No. 16. Naturalmente, também elementos de vetor diferentes daqueles mostrados po42/45 dem ser usados, por exemplo, promotores diferentes, intensificadores diferentes, sítios Poly A diferentes e/ou outros elementos como, por exemplo, oris diferentes. Ademais, é possível trocar os cassetes de expressão pela cadeia leve e pesada da molécula de imunoglobulina. Entretanto, prefere-se a seleção e disposição mostradas dos elementos de vetor. Como apresentado acima, as moléculas de imunoglobulina de comprimento total bem como fragmentos funcionais de moléculas de imunoglobulina podem ser expressos a partir do vetor. Na Seq. ID No. 16 apenas o sítio é indicado como sítio de inserção, onde a respectiva sequência de imunoglobulina pode ficar locali10 zada/inserida no vetor de expressão final. Qualquer sequência de imunoglobulina pode estar presente na posição correspondente. Ademais, como apresentado acima, também é possível expressar polipetídeos de interesses diferentes.

Exemplo 8: Produção em pequena escala de anticorpos com células CHO transfectadas

Para teste em culturas de suspensão, as células são semeadas em 1x10⁵ células/ml em 50 ml de meio ExCell81134 (SAFC Biosciences) em um frasco de cultura de tampa de filtro de fundo arredondado de 250 ml. As células são agitadas a 65 rpm em um Kühner Shaker ISF-4-W/incubator a

37°C em 10% de ambiente de CO₂ durante o estudo. Alimentações simples com soluções proprietárias são dadas de acordo com um esquema fixo começando no 4° dia de expansão celular. No 13°dia, amostras de 1 ml são colhidas e o título é medido utilizando HPLC padrão e uma coluna de proteína A.

O sobrenadante de cultura celular resultante da agitação de culturas de frasco dos melhores clones é purificado por cromatografia de afinidade de proteína A.

Exemplo 9: Purificação de Proteína A do anticorpo expresso

Para purificação de proteína A cerca de 27 mL de sobrenadante de cultura isenta de células contendo aproximadamente 32,4 mg de anticorpo são carregados em uma coluna de afinidade MabSelect de 0,5x10 cm.

Após o carregamento, a coluna é suficientemente enxaguada e lavada. En43/45 tão o anticorpo é eluído em pH 3-4. O eluído é analisado com HPLC padrão utilizando uma coluna de proteína A. Aproximadamente 30,5 mg de anticorpo são obtidos.

III. Exemplos de produtividades e rendimentos específicos celulares

Os clones que são selecionados após a expansão clonal são testados para sua produtividade.

Exemplo 10: Expressão de um anticorpo IgGI

Um anticorpo IgGI é expresso. Os clones são desenvolvidos no meio comercialmente disponível Ex-Cell81134 (SAFC Biosciences). As soluções de alimentação e aditivos convencionais como peptona são adicionados. Taxas de alta produtividade podem ser obtidas quando se utiliza o vetor de acordo com a presente invenção:

Clone	Qp (pg/célula/dia)
1	114
2	91
3	103

Qp = produtividade específica celular.

Exemplo 11: Expressão de um anticorpo e um anticorpo lgG4 15 Um anticorpo IgGI e um anticorpo lgG4 são expressos. Os clones são desenvolvidos em um meio de cultura adequado. As soluções de alimentação e aditivos convencionais como peptona são adicionados. Taxas de alta produtividade podem ser obtidas quando se utiliza o vetor de acordo com a presente invenção:

Clone	Anticorpo lgG1 Qp (pg/célula/dia)	Anticorpo lgG4 Qp (pg/célula/dia)
1	76
2	96
3		73

Qp = = produtividade específica celular.

Exemplo 12: Produção em larga escala de polipetídeos com células CHO transfectadas

A produção de polipetídeos em larga escala pode ser realizada, *~ώ>ώΓ~'ϊ.·χ£&^&κΧ>

44/45 por exemplo, em biorreatores de onda, vidro ou aço inoxidável. Para esse propósito as células são expandidas, geralrnente partindo de um único frasco congelado, por exemplo, um frasco de Master Cell Bank. As células são descongeladas e expandidas através de várias etapas. Os biorreatores de escala diferente são inoculados com quantidades adequadas de células. A densidade celular pode ser aumentada ao adicionar soluções de alimentação e aditivos ao biorreator. As células são mantidas em uma alta viabilidade durante um período prolongado. Os títulos de produto no reator que variam de centenas de miligramas por litro a várias gramas por litro são obtidos em larga escala. A purificação pode ser realizada por metodologia de cromatografia padrão, que pode incluir etapas de cromatografia por afinidade, troca iônica, interação hidrofóbica ou exclusão por tamanho. O tamanho do biorreator pode ser de milhares de litros na escala final (veja também, por exemplo, F. Wurm, Nature Biotechnology Vol. 22, 11,2004, 1393-1398).

Exemplo 13: Estratégia de clonagem para introdução de novos genes de anticorpo nos vetores

Uma estratégia - entre outras - para inserir novos polipetídeos de interesse é exposta a seguir (explicada a título de exemplo utilizando um vetor que possui uma configuração como pBW154):

Clonagem do gene de cadeia leve

O gene de cadeia leve pode ser amplificado por PCR com iniciadores introduzindo um sítio Mlul 5' do códon ATG e um sítio Sa/I 3' do gene. O produto de PCR é introduzido em pBW154 através de duas enzimas de restrição. Isso resulta em um vetor intermediário que consiste apenas na cadeia leve.

Clonagem do gene de cadeia pesada

O gene de cadeia pesada pode ser amplificado por PCR com iniciadores introduzindo uma extremidade cega para uso do sítio 5' Nrul do vetor do códon ATG e um sítio 3' Xbal do gene. O produto de PCR é intro30 duzido em pBW154 através dessas duas enzimas de restrição. Isso resulta em um vetor intermediário com a cadeia leve antiga e a cadeia pesada nova.

Conjunto do vetor final

45/45

O novo fragmento contendo mAB-HC é removido do vetor HC através da digestão de Sa/I. Esse é então inserido no vetor intermediário LC através de Sa/I para resultar no novo vetor LC-HC final.

1/5

Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Ácido nucleico de vetor linearizado adequado para expressar pelo menos um polipetídeo de interesse em uma célula de mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende:

   5 (a) ao menos um cassete de expressão para expressar um polipetídeo de interesse (cassete de expressão (POI)), em que o dito cassete de expressão compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse e compreende pelo menos um promotor ou promotor/elemento intensificador;

   10 (b) um cassete de expressão que compreende um gene marcador selecionável de mamífero (cassete de expressão (MSM)), em que o dito gene marcador selecionável de mamífero é um gene de resistência a antibiótico e em que o dito cassete de expressão compreende pelo menos um promotor ou promotor/elemento intensificador;

   15 (c) um cassete de expressão que compreende um gene marcador selecionável e amplificável de mamífero (cassete de expressão (MASM)), em que o dito cassete de expressão (MASM) compreende pelo menos um promotor ou promotor/elemento intensificador; e (d) um cassete de expressão compreendendo um gene marcador

   20 selecionável procariótico (cassete de expressão (PSM));

   em que o cassete de expressão (POI) é flanqueado 5' pelo cassete de expressão (MASM), o cassete de expressão (MSM) está localizado 3' do cassete de expressão (POI), e o cassete de expressão (PSM) está localizado 3' do cassete de expressão (MSM), e em que os cassetes de

   25 expressão (MASM), (POI) e (MSM) estão dispostos na mesma orientação 5' a 3'; e em que o vetor foi linearizado via um sítio único de restrição de linearização que está localizado entre os cassetes de expressão (PSM) e (MASM).

   30 2. Ácido nucleico de vetor linearizado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito cassete de expressão (MASM) compreende um gene que codifica uma di-hidrofolato redutase

   Petição 870180047102, de 01/06/2018, pág. 14/22
2. 2/5 enzimaticamente funcional (DHFR) apresentando a sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 6 e 12.
3. 3. Ácido nucleico de vetor linearizado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito cassete de expressão

   5 (MSM) compreende um gene que codifica uma neomicina fosfotransferase enzimaticamente apresentando a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7.
4. 4. Ácido nucleico de vetor linearizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o vetor

   10 compreende pelo menos um cassete de expressão adicional para expressar um polipetídeo de interesse adicional (cassete de expressão (POI')) e em que o cassete de expressão adicional (POI') está localizado entre o cassete de expressão (POI) e o cassete de expressão (MSM) e em que o cassete de expressão (POI') está disposto na mesma orientação 5' a 3' que os cassetes

   15 de expressão (POI) e (MSM).
5. 5. Ácido nucleico de vetor linearizado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é para expressar uma molécula de imunoglobulina que compreende em cada cassete de expressão (POI) e (POI') um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve ou pesada de uma

   20 molécula de imunoglobulina ou fragmentos funcionais da mesma, em que cada cassete de expressão (POI) e (POI') compreende um dos ditos polinucleotídeos.
6. 6. Ácido nucleico de vetor linearizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que os ditos cassetes

   25 de expressão compreendem um íntron.
7. 7. Ácido nucleico de vetor linearizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão (POI) e/ou o cassete de expressão (POI'), se presente, compreende um promotor CMV apresentando a sequência de ácido nucleico

   30 de SEQ ID NO: 8 e/ou em que os cassetes de expressão (MSM) e (MASM) compreendem um um promotor SV40 apresentando a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9.

   Petição 870180047102, de 01/06/2018, pág. 15/22

   3/5
8. 8. Ácido nucleico de vetor linearizado, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que pelo menos o cassete de expressão (POI) compreende um íntron que está disposto entre o promotor e o códon de partida do polinucleotídeo para expressar o polipetídeo de

   5 interesse.
9. 9. Ácido nucleico de vetor linearizado, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o íntron no cassete de expressão (POI) é um íntron Rk apresentando a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11.
10. 10 10. Ácido nucleico de vetor linearizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão (MASM) compreende um íntron que fica localizado 3' do gene marcador selecionável amplificável de mamífero.
11. 11. Ácido nucleico de vetor linearizado, de acordo com qualquer

    15 uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o gene marcador selecionável procariótico fornece uma resistência a antibiótico, em que o dito antibiótico é selecionado a partir do grupo que consiste em ampicilina, canamicina, tetraciclina e cloranfenicol.
12. 12. Ácido nucleico de vetor linearizado, de acordo com a

    20 reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o gene marcador selecionável de procarioto é o gene da beta-lactamase que fornece resistência à ampicilina, apresentando a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14.
13. 13. Ácido nucleico de vetor linearizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o vetor de

    25 expressão é selecionado a partir do grupo que consiste em:

    (a) um ácido nucleico de vetor linear que compreende os seguintes elementos genéticos na disposição indicada, em que a direção 5' a 3' é indicada pela ^:

    I. Promotor do cassete de expressão (MASM) (^)

    30 II. Gene que codifica o marcador selecionável e amplificável de mamífero do cassete de expressão (MASM) (^)

    III. Íntron do cassete de expressão (MASM) (^)

    Petição 870180047102, de 01/06/2018, pág. 16/22

    4/5

    IV. Sítio PoliA do cassete de expressão (MASM) (^)

    V. Promotor do cassete de expressão (POI) (^)

    VI. Íntron do cassete de expressão (POI) (^)

    VII. Polinucleotídeo que codifica um polipetídeo de interesse, que 5 é inserido no cassete de expressão (POI) (^)

    VIII. Sítio PoliA do cassete de expressão (POI) (^)

    IX. Promotor do cassete de expressão (POI') (^)

    X. Íntron do cassete de expressão (POI') (^)

    XI. Polinucleotídeo que codifica um polipetídeo de interesse

    10 adicional, que é inserido no cassete de expressão (POI') (^)

    XII. Sítio PoliA do cassete de expressão (POI') (^)

    XIII. Promotor do cassete de expressão (MSM) (^)

    XIV. Gene que codifica o marcador selecionável de mamífero do cassete de expressão (MSM) (^)

    15 XV. Sítio PolyA do cassete de expressão (MSM) (^)

    XVI. cassete de expressão PSM (^) ou (^);

    (b) um ácido nucleico de vetor como mostrado como SEQ ID NO:

    1 ou SEQ ID NO: 16.
14. 14. Método para produção de uma célula hospedeira de mamífero

    20 compreendendo um ácido nucleico de vetor linearizado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende transfectar uma célula hospedeira com o vetor de ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo

    25 fato de que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo consistindo em COP, L, C127, Sp2/0, NS-0, NS-1, NIH3T3, PC12, PC12h, BHK, CHO, COS1, COS3, COS7, CV1, Vero, HeLa, HEK-293, PER-C6 derivadas da retina, células derivadas de fibroblastos diploides, células de mieloma e HepG2.

    30
16. 16. Método para produção de um polipetídeo de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar pelo menos uma célula hospedeira de mamífero que compreende um vetor de ácido nucleico, como

    Petição 870180047102, de 01/06/2018, pág. 17/22

    5/5 definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 integrado de forma estável no genoma, em um meio de cultura celular sob condições que permitem a expressão do dito polipetídeo de interesse.
17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o dito polipetídeo de interesse é secretado no meio de cultura celular e isolado do meio de cultura celular.
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o polipetídeo de interesse é uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento funcional da mesma.
19. 19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende isolar o polipeptídeo de interesse a partir da dita célula hospedeira.

    Petição 870180047102, de 01/06/2018, pág. 18/22

    1/2