KR101655486B1 - 헤르페스 바이러스의 잠복 감염에 관여하는 인자 및 그 이용 - Google Patents

헤르페스 바이러스의 잠복 감염에 관여하는 인자 및 그 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명에 관한 단백질 및 유전자는, 헤르페스 바이러스의 잠복 감염에 관여하는 인자이다. 정신 장애 환자의 약 50%에 상기 인자에 대한 항체가 검출되는 한편, 건강자에서는 거의 검출되지 않는다. 또한, SITH-1을 도입한 마우스는, 조울증이나 우울증과 같은 정신 장애를 나타냈다. 이 때문에, 이 사실에 근거하여, 정신 장애를 객관적으로 판정할 수 있는 방법 및 정신 장애 모델 동물을 제공할 수 있다.

Description

헤르페스 바이러스의 잠복 감염에 관여하는 인자 및 그 이용{FACTOR INVOLVED IN LATENT INFECTION WITH HERPESVIRUS, AND USE THEREOF}
본 발명은, 헤르페스 바이러스의 잠복 감염에 관여하는 인자와 그 이용에 관한 것으로, 특히, 헤르페스 바이러스의 잠복 감염시에 특이적으로 발현하는 신규 단백질, 및 그 단백질을 코드하는 유전자, 및 그 이용에 관한 것이다.
헤르페스 바이러스과의 바이러스는, 코어 단백질의 주위에 분자량 80~150×106달톤의 복쇄 선상 DNA가 162개의 캡소미어(capsomere)로 이루어지는 직경 약 100nm의 20면체의 캡시드(capsid) 중에 들어 있고, 이 뉴클레오캡시드를 엔벌로프(envelope가) 둘러싸서 전체로서 약 150~200nm의 크기의 바이러스이다. 헤르페스 바이러스는, 거의 모든 포유동물이나 양생류에 있어서 발견되고 있고. 특히, 인간을 숙주로 하는 헤르페스 바이러스과의 바이러스는, 인간 헤르페스 바이러스(HHV；human herpesvirus)라고 칭해진다. HHV는, 각각 α(단순 헤르페스 바이러스, 수두ㆍ대상 헤르페스 바이러스 등), β(사이트메가로 바이러스 등), 및 γ(EB바이러스 등)아과로 분류된다.
이와 같은 헤르페스 바이러스는, 「잠복 감염(latent infection)」을 특징으로 한다.「잠복 감염」이란, 바이러스가 숙주 세포내에서 감염성의 바이러스 입자를 산생(産生)하지 않고 계속 존속하는 감염 상태를 말하지만, 이 잠복 감염에 있어서도, 바이러스 유전자 및 그 바이러스 유전자의 존재를 보조하는 유전자 산물은 숙주 세포내에 유지되고 있다. 잠복 감염을 나타내는 헤르페스 바이러스는, 숙주에 어떠한 원인(예를 들면, 가령, 컨디션 불량(피로를 포함한다))에 의해 이상이 발생한 경우에, 바이러스 입자의 산생이 재개되어 다량의 바이러스가 복제되는 것이 알려져 있다(재활성화).
즉, 헤르페스 바이러스는, 숙주에 이상이 없으면 잠복 감염을 계속하지만, 한번 숙주의 신체에 변조가 생겨, 숙주의 위기를 찰지(察知)하면, 다른 건강한 숙주를 찾고자 재활성화한다는 특이한 성질을 가진다.
이와 같은 헤르페스과의 바이러스의 생태를 검토하기 위해서는, 바이러스의 잠복 감염ㆍ재활성화에 관한 이해가 불가결하다. 그러나, 헤르페스 바이러스 중에서, 잠복 감염에 관한 지견이 많은 것은 γ-헤르페스 바이러스에 속하는 EB바이러스뿐이며, 그 외의 것에 관해서는 불분명한 점이 많다.
특히, β-헤르페스 바이러스의 잠복 감염에 관여하는 인자에 관해서는, 본 발명자 등이 이전에 분명히 한 지견 이외의 정보는 얻지 못하고 있는 것이 실정이다. 예를 들면, 비특허문헌 1에는, HHV-6은 말초혈중의 비교적 분화도가 높은 매크로파지에 있어서 잠복 감염하는 것이 개시되어 있고, 숙주에 있어서의 HHV-6의 잠복 감염 부위가 밝혀져 있다. 또한, 비특허문헌 2에는, HHV-6은 초기 감염시에 매우 높은 비율로 뇌 내로 이행하여, 지속 감염ㆍ잠복 감염을 일으키는 것이 기재되어 있다. 비특허문헌 3에는, HHV-6의 잠복 감염시에 발현하는 유전자(잠복 감염 유전자)에 관하여 개시되어 있고, 그 유전자가 바이러스의 잠복 감염과 재활성화를 제어하는 기능을 가지는 것이 시사되어 있다.
또한 비특허문헌 4에는, HHV-6의 잠복 감염 상태에는, 비교적 안정하며 유전자 발현이 활발한 상태인 「중간 단계：intermediate stage」가 존재하고, 잠복 감염 유전자와 이 유전자에 코드되는 단백질(잠복 감염 단백질)이 이 중간 단계에 있어서 다량으로 발현하는 것이 나타나 있다. 더욱이 비특허문헌 5에서는, 만성 피로 증후군 환자의 혈청 중에 중간 단계에서 발현이 항진하는 잠복 감염 단백질에 대한 항체가 존재하는 것이 기재되어 있다.
비특허문헌 1:Kondo. K et al. Ltatent human herpesvirus 6 infection of human monocytes/macrophages(J Gen Virol 72:1401-1408, 1991)
비특허문헌 2:Kondo. K et al. Association of human herpesvirus 6 infection of the central nervous system with recurrence of febrile convulsions.(J Infect Dis 167:1197-1200, 1993.)
비특허문헌 3:Kondo. K et al. Identification of human herpesvirus 6 latency-associated transcripts.(J Virol. 76:4145-4151, 2002)
비특허문헌 4:Kondo K et al. Recognition of a Novel Stage of Beta-Herpesvirus Latency in Human Herpesvirus 6.(J Virol. 77:2258-2264, 2003)
비특허문헌 5:콘도 카즈히로저, 「헤르페스 바이러스 감염과 피로」, 바이러스, 제55권 제1호 p9-18 2005
그러나, 질환과 특이적으로 관계하는 잠복 감염 유전자 및 잠복 감염 단백질은 동정되지 않고, 그 기능이나 만성 피로 증후군의 발증 메카니즘과의 관계도 불명했다. 더욱이, HHV-6은, 만성 피로 증후군 이외의 질환에도 관여하고 있을 가능성이 있다.
그러므로, HHV-6의 감염과 질환과의 관련성을 분명히 하는 것과 동시에, 질환의 객관적인 진단이나 모델 동물의 성립에 이바지하는 기술을 개발하는 것이 강하게 요구되고 있었다.
본 발명은, 상기의 문제점을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은, HHV-6의 잠복 감염에 관여하는 인자를 특정함과 동시에, 그 이용법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자 등은, 상기 과제를 해결하고자 예의 검토를 행한 결과, HHV-6은 잠복 감염ㆍ재활성화라고 하는 특징적인 성질을 가지기 때문에, 이 잠복 감염ㆍ재활성화에 관연하는 인자를 동정함으로써, HHV-6의 감염과 정신 장애와의 관련성에 관하여 지견이 얻어지는 것은 아닌가 라는 독자적인 생각에 근거하여, 복잡 고도의 실험을 반복한 바, HHV-6의 잠복 감염에 특이적인 유전자가 활발하게 발현하는 중간 단계(intermediate stage)에 있어서 발현하는 신규의 유전자와, 거기에 코드되는 신규한 단백질 Small protein encoded by the Intermediate Transcript of HHV-6-1(SITH-1)을 동정했다. 그리고, 이들 유전자 및 그 유전자가 코드하는 단백질 SITH-1의 기능 해석을 행한 바, (i) SITH-1 단백질은 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 기능을 가지는 것, (ii) 또한 이들 SITH-1 단백질에 대한 항체가, 기분 장애 환자에서는 유의하게 검출되는 한편, 건강자에서는 거의 검출되지 않는다는 새로운 사실을 발견하여, 본원 발명을 완성시키기에 이르렀다. 본 발명은, 이러한 신규 지견에 근거하여 완성된 것이고, 이하의 발명을 포함한다.
(1) 이하의 (a) 또는 (b)에 기재된 단백질을 코드하는 유전자.
(a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
(b) 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 활성을 가지는 단백질.
(2) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열을 오픈 리딩 프레임 영역으로서 가지는 유전자.
(3) 서열번호 2 혹은 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 활성을 가지는 단백질을 코드하는 유전자.
(4) (1)~(3)의 어느 하나에 기재된 유전자에 코드되는 단백질.
(5) 이하의 (a) 또는 (b)에 기재된 단백질.
(a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
(b) 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 활성을 가지는 단백질.
(6) (4) 또는 (5)에 기재된 단백질을 인식하는 항체.
(7) (1)~(3)의 어느 하나에 기재된 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
(8) (1)~(3)의 어느 하나에 기재된 유전자 또는 청구항 7에 기재된 재조합 발현 벡터를 도입하여 이루어지는 형질 전환체.
(9) (1)~(3)의 어느 하나에 기재된 유전자에 있어서의 적어도 일부의 염기 서열 또는 그 상보 서열을 프로브로서 이용한 유전자 검출기구.
(10) (4) 또는 (5)에 기재된 단백질에 있어서의 적어도 일부의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 프로브로서 이용한 검출기구.
(11) 피험 대상 생물에 있어서, (6)에 기재된 항체가 존재하는지 여부를 판정하는 판정 방법.
(12) 상기 판정 방법은, (4) 또는 (5)에 기재된 단백질 혹은 그 부분 단편을 이용하여, 면역학적으로 (6)에 기재된 항체가 존재하는지 여부를 검출하는 (11)에 기재된 판정 방법.
(13) 상기 판정 방법은, 피험 대상 생물로부터 분리된 생물학적 시료를 이용하여 행해지는 (11) 또는 (12)에 기재된 판정 방법.
(14) (11)~(13)의 어느 하나에 기재된 판정 방법을 행하기 위한 판정 키트.
(15) 이하에 나타내는 (i)~(iii)로부터 선택되는 물질 중, 적어도 1개의 물질을 포함하는 (14)에 기재된 판정 키트.
(i) (4) 또는 (5)에 기재된 단백질
(ii) (i)의 부분 단편
(iii) (i) 또는 (ii)를 고정화한 기구
(16) 피험자가 정신 장애를 가지는지 여부를 진단하는 진단 방법으로서, (11)~(13)의 어느 하나에 기재된 판정 방법을 이용하여, 상기 피험자에 있어서 (6)에 기재된 항체가 존재하고 있는지 여부를 판정하는 판정 과정과, 상기 판정 과정에서, (6)에 기재된 항체가 존재하고 있다고 판정되었을 경우, 상기 피험자가 만성 피로 증후군을 이환(罹患)하고 있다고 판단하는 판단 과정을 포함하는 진단 방법.
(17) 상기 진단 방법은, 피험자로부터 분리된 생물학적 시료를 이용하여 행해지는 (16)에 기재된 진단 방법.
(18) 피험동물이 정신 장애를 가지는지 여부를 진단하는 진단 방법으로서, (11)~(13)의 어느 하나에 기재된 판정 방법을 이용하여, 상기 피험동물에 있어서 청구항 6에 기재된 항체가 존재하고 있는지 여부를 판정하는 판정 과정과, 상기 판정 과정에서, (6)에 기재된 항체가 존재하고 있다고 판정된 경우, 상기 피험동물이 정신 장애를 가진다고 판단하는 판단 과정을 포함하는 진단 방법.
(19) (16)~(18)의 어느 하나에 기재된 진단 방법을 행하기 위한 진단 키트.
(20) 이하에 나타내는 (i)~(iii)로부터 선택되는 물질 중, 적어도 1개의 물질을 포함하는 (19)에 기재된 진단 키트.
(i) (4) 또는 (5)에 기재된 단백질
(ii) (i)의 부분 단편
(iii) (i) 또는 (ii)를 고정화한 검출기구
(21) 피험동물이 정신 장애의 모델 동물로서 유용한지 여부를 판정하는 모델 동물의 판정 방법으로서, (18)에 기재된 진단 방법에 의해, 상기 피험동물이 정신 장애를 가지는지 여부를 진단하는 진단 과정과, 상기 진단 과정에 있어서, 피험동물이 정신 장애를 가지는 것을 지표로 하여, 상기 피험동물이 정신 장애의 모델 동물로서 유용하다고 판정하는 판정 과정을 구비하는 모델 동물의 판정 방법.
(22) 상기 (1)~(3)의 어느 하나에 기재된 유전자, 당해 유전자 산물, 또는 상기 (7)에 기재된 재조합 발현 벡터를 도입하여 이루어지는 모델 동물.
(23) 향정신약의 후보 물질을 스크리닝하는 스크리닝 방법으로서, 정신 장애의 모델 동물에 피험물질을 제공하는 과정과, (18)에 기재된 진단 방법에 의해, 상기 모델 동물의 정신 장애가 치유 또는 개선되는지 여부를 진단하는 과정과, 상기 모델 동물의 정신 장애가 치유 또는 개선하고 있는 것을 지표로 하여, 상기 피험 물질이 향정신약의 후보 물질이라고 판정하는 과정을 구비하는 스크리닝 방법.
또한, 상기 (23)의 스크리닝 방법에서는, (18)에 기재된 진단 방법에 맞추어서, 예를 들면, (지금까지 알려져 있는) 동물의 행동 이상이나 경악 반응 등을 이용한 진단 방법을 행하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 관한 유전자 또는 단백질은, 헤르페스 바이러스의 잠복 감염시에 특이적으로 발현하는 것으로, 잠복 감염과 재활성화를 제어하는 기능을 가진다. 또한, 후술하는 바와 같이, 본 발명에 관한 단백질의 항체는 정신 장애 환자에서 유의하게 존재하고 있는 것이 분명해졌기 때문에, 상기 항체의 유무를 검출하는 것에 의해, 정신 장애에 관하여 객관적으로 진단할 수 있다고 하는 효과를 얻는다.
또한, 본 발명에 관한 유전자 또는 단백질은, 여기에 기재한 이외에도, 여러 가지의 질환의 진단에의 이용 가능성이 있고, 또한, 약제의 스크리닝 방법, 모델 동물의 작성 방법, 각종 키트 등에의 이용도 가능하다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 및 뛰어난 점은, 이하에 나타내는 기재에 의해서 충분히 알 것이다. 또한, 본 발명의 이점은, 첨부 도면을 참조한 다음의 설명에 의해서 명백하게 될 것이다.
도 1은 잠복 감염 특이적 유전자의 구조와 해석용 프라이머의 위치를 모식적으로 나타내는 도면이다.
도 2는　HHV-6 유전자 산물의 PCR법에 의한 증폭의 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 신규 잠복 감염 특이적 유전자 mRNA의 RACE법에 의한 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는　Yeast Two-hybrid법에 의해, 단백질 SITH-1에 결합하는 숙주 단백질을 동정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 단백질 SITH-1에 의해서 아스트로사이트 모양 글리아 세포주내 CAML의 증가를 나타내는 도면이다.
도 6은 SITH-1에 의한 글리아 세포내 칼슘 농도의 상승을 나타내는 도면이다.
도 7은 정신 장애를 가지는 환자의 SITH-1에 대한 항체가를 나타내는 도면이다.
도 8은 미현수(尾懸垂) 테스트에 의한 SITH-1의 효과의 검토 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 강제 수영 테스트에 의한 SITH-1의 효과의 검토 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 경악 반응(Prepulse inhibition)에 의한 SITH-1의 효과의 검토 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 SITH-1을 아데노 바이러스 벡터에 의해 마우스의 글리아 세포에서 발현시켜, 3주일 후에 활차 회전으로 자발 운동량을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 12는 SITH-1을 렌티 바이러스 벡터에 의해 마우스의 글리아 세포에서 발현시켜, 8주일 후에 활차 회전으로 자발 운동량을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13은 SITH-1을 지표로 하여, 우울증을 병발하는 다른 질환에 관하여 진단한 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명의 실시의 하나의 형태에 관하여 이하에 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 기재로 한정되는 것은 아니다.
우선, 본 발명의 이해의 일조를 하기 위하여, 본 발명자 등이 본 발명을 완성시키기에 이른 경위를 간단하게 설명한다. 본 발명자 등은, 인간 헤르페스 바이러스 중, HHV-6의 감염이 정신 장애, 특히 기분 장애를 수반하는 정신 장애의 1원인일 가능성이 높다고 추측했다. 그 이유는, (i) 이전부터 HHV-6이 원인의 하나라고 말해지는 만성 피로 증후군(CFS；chronic fatigue syndrome)의 증상 중에, 우울증상 등, 정신 장애에 잘 보여지는 증상이 확인되는 것, (ii) HHV-6이 뇌 내에서 잠복 감염을 일으키는 것, (iii) 더욱이 CFS 환자의 혈청에, 지금까지 동정해 온 HHV-6의 잠복 감염 특이적 유전자의 단백질에 반응하는 항체나, 아직도 유전자나 단백질은 동정하고 있지 않기는 하지만, HHV-6의 잠복 감염 세포에서 발현하고 있는 미지의 단백질에 반응하는 항체가 고율로 검출되는 것, 등에 의한다.
또한, 본 발명자 등은, HHV-6이 뇌내에서는, 인간의 사고나 감정을 주관하는 전두엽이나 해마 영역 등에 주로 잠복 감염하고 있다고 하는 사실이나, 뇌내에 잠복 감염을 일으키는 바이러스는 HHV-6을 포함하여 그저 수종류밖에 없다고 하는 사실로부터, HHV-6과 정신 장애와의 관계를 추측했다. 더욱이, HHV-6은, 세라토닌 등의 우울증과 관계하는 뇌내 물질의 대사에 중요한 작용을 하는 아스트로사이트 등의 글리아 세포에서 잠복 감염을 일으키는 것이 알려져 있고, 이 점에서도 HHV-6이 기분 장애 등의 정신 장애와 관계할 가능성이 있다고 본 발명자 등은 독자적인 생각에 이르렀다.
이 때문에, CFS 환자 중에 HHV-6의 뇌에의 잠복 감염이 원인으로 되어 정신 증상을 일으키는 것이 상당한 비율로 포함되어 있는 것은 아닐까라고 본 발명자 등은 추측했다. 그 중에서도, 본 발명자는, 특히 HHV-6과 우울증이나 조울증 등의 기분 장애와의 관련성을 의심하고 있다.
기분 장애는, 우울증이나 조울증 등의 정신 장애로 보여지는 증상으로, 우울증상만이 나타나는"우울증"과, 조(躁)상태와 우울상태를 반복하는 "조울증"이 그 대표이다. 원인으로서, 스트레스, 유전자 이상, 감염 등의 여러가지 것이 열거되고 있지만 아직 확정한 것은 없다. 기분 장애는 최근 증가 경향에 있고, 큰 사회 문제가 되어 오고 있어, 시급한 병인(病因)ㆍ병태(病態)의 해명, 진단 방법, 및 치료 방법의 개발이 요망되고 있다. 그 중에서도, 기분 장애의 진단은 정성적으로 되기 쉽상이며, 객관적인 진단이 곤란하다고 하는 문제도 있다. 또한, 기분 장애의 연구나 치료법의 개발에 기여할 수 있는 모델 동물의 개발도 불충분하고, 원인 규명이나 치료법의 개발을 지연시키는 원인으로 되고 있다.
이 때문에, HHV-6의 감염과 기분 장애ㆍ정신 장애와의 관련성을 분명히 함과 동시에, 기분 장애ㆍ정신 장애의 객관적인 진단이나 모델 동물의 성립에 이바지하는 기술을 개발할 필요가 있다고 본 발명자 등은 생각했다.
또한, 말할 필요도 없는 것이지만, 이들의 추측은 본 발명자 등이 오랜 세월 본 연구 분야에 있어서 예의 검토를 행했던 결과 가까스로 도달한 독자적인 추측이며, 통상의 당업자가 용이하게 상도할 수 있는 종류의 것은 아니다.
이하, 본 발명에 관한 단백질, 유전자 등에 관하여, 차례로 상세하게 설명해 나간다.
(1) 본 발명에 관한 단백질, 유전자
(1-1) 구조
본 발명은, 헤르페스 바이러스의 잠복 감염에 관여하는 인자, 보다 상세하게는 헤르페스 바이러스의 잠복 감염시에 특이적으로 발현하는 단백질 및 그 단백질을 코드하는 유전자를 제공하는 것이다. 여기에서 「헤르페스 바이러스의 잠복 감염시에 특이적으로 발현한다」란, 헤르페스 바이러스가 감염하고 있는 숙주에 있어서, 헤르페스 바이러스가 잠복 감염하고 있을(증식 감염하고 있지 않을) 때에, 특이적으로, 헤르페스 바이러스 유래의 유전자 또는 유전자 산물이 발현하는 것을 말한다.
이러한 단백질 및 유전자로서는, 예를 들면, (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 및 이 단백질을 코드하는 유전자를 들 수 있다.
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질은, 후술하는 실시예에 나타난 바와 같이, 인간 헤르페스 바이러스-6(HHV-6)의 잠복 감염시에 특이적으로 발현하는 단백질로서 단리ㆍ동정된 것이고, 이하 Small protein encoded by the Intermediate Transcript of HHV-6-1(SITH-1) 단백질이라고 칭한다. SITH-1 단백질은, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 159 아미노산으로 이루어지는, 분자량 약 17.5kDa의 단백질이다.
SITH-1 단백질은, SITH-1 유전자에 의해서 코드되어 있다. 이 SITH-1 유전자의 cDNA는, 서열번호 3으로 표시된 바와 같이, 1795 염기쌍(약 1.79kbp)의 사이즈를 가지고 있고, 954번째부터 956번째의 염기 서열이 개시 코돈(Kozak　ATG)이고, 1431번째부터 1433번째의 염기 서열이 종지 코돈(TAA)이다. 따라서, 상기 SITH-1 유전자는, 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열 중, 954번째부터 1430번째까지의 염기 서열을 오픈 리딩 프레임(ORF) 영역으로서 가지고 있고, 이 ORF는, 477 염기쌍(약 0.48kbp)의 사이즈를 가지고 있다. SITH-1의 cDNA 중, ORF 영역을 나타내는 염기 서열을 서열번호 2로 나타낸다. 또한, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열은, 스톱 코돈의 3 염기를 포함하여 기재하고 있다.
　또한, 본 발명에 관한 단백질 및 유전자로서, (b) 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 헤르페스 바이러스의 잠복 감염시에 특이적으로 발현하는 단백질, 및 그 단백질을 코드하는 유전자를 들 수 있다.
상기 「1개 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되었다」란, 부위 특이적 돌연변이 유발법 등의 공지의 변이 펩티드 제작법에 의해 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가할 수 있을 정도의 수(바람직하게는 10개 이하, 보다 바람직하게는 7개 이하, 더욱 바람직하게는 5개 이하)의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되는 것을 의미한다. 이와 같이, 상기 (b)의 단백질은, 상기 (a)의 단백질의 변이 단백질이라고 말할 수 있다. 또한, 여기에서 말하는 「변이」는, 주로 공지의 변이 단백질 제작법에 의해 인위적으로 도입된 변이를 의미하지만, 천연에 존재하는 동일한 변이 단백질을 단리정제한 것이어도 좋다.
더욱이, 본 발명에 관한 단백질로서, (c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 헤르페스 바이러스의 잠복 감염시에 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 유전자를 들 수 있다.
상기 「스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건하에서 하이브리다이즈」한다는 것은, 적어도 90%의 동일성, 바람직하게는 적어도 95%의 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 97%의 동일성이 서열간에 존재할 경우에만 하이브리다이제이션이 일어나는 것을 의미한다.「스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건」의 구체적인 예로서, 예를 들면, 하이브리다이제이션 용액(50% 포름아미드, 5×SSC(150mM의 NaCl, 15mM의 시트르산삼나트륨), 50mM의 인산나트륨(pH7.6), 5×덴헐트(Denhert)액, 10% 황산덱스트란, 및 20㎍/ml의 변성 전단 연어 정자 DNA를 포함한다) 중에서 42℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 약 65℃에서 0.1×SSC 중에서 필터를 세정하는 조건을 들 수 있다. 또한, 상기 하이브리다이제이션은, J.Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)에 기재되어 있는 방법 등, 종래 공지의 방법으로 행할 수 있고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 통상, 온도가 높을수록, 염 농도가 낮을수록 스트린젠시는 높아지게 된다(하이브리다이즈하기 어려워진다).
또한, 본 명세서중에서 사용되는 경우, 용어 「유전자」는, 「폴리뉴클레오티드」, 「핵산」 또는 「핵산 분자」와 교환 가능하게 사용된다. 「폴리뉴클레오티드」는 뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. 따라서, 본 명세서에서의 용어 「유전자」에는, 2개 사슬 DNA 뿐만 아니라, 그것을 구성하는 센스 사슬 및 안티센스 사슬과 같은 각 1개 사슬 DNA나 RNA(mRNA 등)를 포함한다. 안티센스 사슬은, 프로브로서 또는 안티센스 약제로서 이용할 수 있다. 「DNA」에는, 예를 들면 클로닝이나 화학 합성 기술, 또는 그들의 조합으로 얻어지게 되는 cDNA나 게놈 DNA 등이 포함된다. 즉, DNA란, 동물의 게놈 중에 포함되는 형태인 인트론 등의 비코드 서열을 포함하는 「게놈」형 DNA이어도 좋고, 또한 역전사 효소나 폴리머라제를 이용하여 mRNA를 거쳐서 얻어지게 되는 cDNA, 즉 인트론 등의 비코드 서열을 포함하지 않는 「전사」형 DNA이어도 좋다. 더욱이, 본 발명에 관한 유전자는, 상기 (a) 또는 (b)에 기재된 아미노산을 코드하는 서열 이외에, 비번역 영역(UTR)의 서열이나 벡터 서열(발현 벡터 서열을 포함한다) 등의 서열을 포함하는 것이어도 좋다. 또한, 이들의 mRNA 또는 cDNA의 번역 영역의 말단 및/또는 내부에 조절 서열이나 폴리아데닐 서열 등의 임의의 폴리뉴클레오티드가 포함되어 있어도 좋다. 또한, 본 발명에 관한 단백질이 복수의 대립 유전자에 의해서 코드될 수 있는 경우에는, 모든 대립 유전자, 그들의 전사 산물, 및 cDNA가 걸리는 핵산에 포함된다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「핵산」으로 되는 말에는, 임의의 단순 뉴클레오티드 및/또는 수식 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 cDNA, mRNA, 전체 RNA, hnRNA, 등이 포함된다. 「수식 뉴클레오티드」에는, 이노신, 아세틸시티딘, 메틸시티딘, 메틸아데노신, 메틸구아노신을 포함하는 인산에스테르의 이외에, 자외선이나 화학물질의 작용으로 후천적으로 발생할 수 있는 뉴클레오티드도 포함된다.
용어 「염기 서열」은, 「핵산 서열」과 교환 가능하게 사용되고, 데옥시리보뉴클레오티드(각각 A, G, C 및 T로 생략 된다)의 서열로서 나타난다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 「염기 서열」은, DNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드에 대해서의 디옥시리보뉴클레오티드의 서열을 의도하고, 그리고 RNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드에 대해서의 리보뉴클레오티드(A, G, C 및 U)의 대응하는 서열(여기에서 특정되는 디옥시뉴클레오티드 서열에 있어서의 각 티미딘디옥시뉴클레오티드(T)는, 리보뉴클레오티드의 우리딘(U)에 의해서 치환되어진다)를 의도한다.
예를 들면, 디옥시리보뉴클레오티드의 약어를 이용하여 표시되는 「서열번호 2 또는 4의 서열을 가지는 RNA 분자」란, 서열번호 2 또는 4의 각 디옥시뉴클레오티드 A, G 또는 C가, 대응하는 리보뉴클레오티드 A, G 또는 C에 의해서 치환되고, 그리고 디옥시뉴클레오티드 T가, 리보뉴클레오티드 U에 의해서 치환되는 서열을 가지는 RNA 분자를 나타내는 것을 의도한다. 또한, 「서열번호 2 또는 4로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 프래그먼트」란, 서열번호 2 또는 4의 각 디옥시뉴클레오티드 A, G, C 및/또는 T에 의해서 표시되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편 부분을 의도한다.
또한, 본 발명에 관한 유전자의 단편(부분 서열)은, 예를 들면, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)의 프라이머, 또는 하이브리다이제이션 프로브로서 사용할 수 있다. 이러한 단편(폴리뉴클레오티드)은, 본 발명에 관한 유전자의 호모 로그, 오르소 로그를 특이적으로 PCR 증폭할 수 있고, 또한 본 발명에 관한 유전자의 호모 로그, 오르소 로그에 특이적으로 하이브리다이즈하는 하이브리다이제이션 프로브로서도 또한 이용 가능하다. 즉, 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명에 관한 유전자의 단편은, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 표적 서열의 증폭을 위한 프라이머로서, 또는 종래의 DNA 하이브리다이제이션 기술에 따른 프로브로서의 어느 하나로 진단적으로 유용하다고 말할 수 있다.
또한, 본 발명에 관한 유전자의 단편의 다른 용도로서는, Verma 등, Human Chromosomes:a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)에 기재된, 정확한 염색체 위치를 제공하기 위한 분열 중기 염색체 전개물에 대한 인사이츄하이브리다이제이션(in situ hybridization)(예를 들면, FISH)；및, 특정의 조직에 있어서의 본 발명에 관한 mRNA 발현을 검출하기 위한 노던 블롯 분석을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 관한 유전자에는, 이하의 물(物)이 포함될 수 있지만 이들로 한정되는 것이 아니다：그 자체에 의해서, 성숙 단백질의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드；성숙한 단백질의 코드 서열 및 새로운 서열(예를 들면, 리더 서열을 코드하는 서열)(예를 들면, 프리단백질 서열 또는 프로단백질 서열 또는 프리프로단백질 서열)；인트론, 비코드 5'서열 및 비코드 3'서열(예를 들면, 전사, mRNA 프로세싱(스프라이싱 및 폴리아데닐화 시그널을 포함한다)에 있어서 역할을 담당하는 전사 비번역 서열)；새로운 기능성을 제공하는 새로운 아미노산을 코드하는 새로운 코드 서열.
따라서, 예를 들면, 단백질을 코드하는 서열은, 마커 서열(예를 들면, 융합된 단백질의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 코드하는 서열)에 융합될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 마커 아미노산 서열은, 헥사-히스티딘펩티드(예를 들면, pQE 벡터(Qiagen, INC.)에 있어서 제공되는 태그)이어도 좋다. Gentz 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824(1989)에 있어서 기재되어 있는 바와 같이, 헥사-히스티딘 펩티드는, 융합 단백질의 간편한 정제에 유용하다. 또한, 이 이외에도, 많은 공적 및/또는 상업적으로 입수 가능한 마커 아미노산 서열을 이용 가능하다. 예를 들면, Wilson 등, Cell 37:767(1984)에 의해서 기재되어 있는 바와 같이, 「HA」태그는, 인플루엔자 적혈구 응집소(HA) 단백질 유래의 에피토프에 대응하는 정제를 위해서 유용한 펩티드이다. 그 밖에도, 본 발명에 관한 단백질의 N말단 또는 C말단에 Fc를 융합시킨 융합 단백질도 정제를 위해서 유용할 것이다.
또한, 본 발명에는, 본 발명에 관한 유전자의 변이체도 포함된다. 이러한 변이체는, 천연의 대립 유전자 변이체와 같이, 천연에 생길 수 있다. 「대립 유전자 변이체」에 의해서, 생물의 염색체상의 소정의 유전자좌를 차지하는 유전자의 몇개의 교환 가능한 형태의 하나가 의도된다. 또한, 천연에 존재하지 않는 변이체는, 예를 들면 당해 분야에서 공지의 변이 유발 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 이와 같은 변이체는, 상술한 바와 같이, 1 또는 몇 개의 뉴클레오티드 치환, 결실, 또는 부가에 의해서 생성되는 변이체를 포함한다. 치환, 결실, 또는 부가는, 1개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변이체는, 코드 혹은 비코드 영역, 또는 그 양쪽에 있어서 변화될 수 있다. 코드 영역에 있어서의 변이는, 보존적 혹은 비보존적인 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 생성할 수 있다.
또한, 본 발명에 포함되는 바람직한 단백질로서는, 성숙 단백질 외에, 세포외 도메인, 막관통 도메인, 세포내 도메인, 또는 막관통 도메인의 전부 또는 일부를 결실한 세포외 및 세포내 도메인을 포함하는 단백질을 들 수 있다. 본 명세서 중에서 사용되는 경우, 용어 「단백질」은, 「폴리펩티드」또는 「펩티드」와 교환 가능하게 사용된다. 더욱이, 본 발명은, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열에 의해서 코드되는 단백질의 1 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 부가 또는 결실한 폴리펩티드를 제공한다. 보존적 혹은 비보존적인 아미노산 치환, 결실, 또는 부가가 바람직하고, 특히 바람직한 것은, 사일런트(silent substitution) 치환, 부가, 및 결실이며, 이들은, 본 발명에 관한 단백질 또는 그 일부의 특성 및 활성을 변화시키지 않는다. 이들의 점에 있어서 특히 또한 바람직한 것은, 보존적 치환이라고 말할 수 있다.
더욱이, 본 발명에 관한 단백질은, 천연으로부터 분리된 것 뿐만 아니라, 화학 합성되어도 재조합 생성되어도 좋다. 즉, 본 발명에 관한 단백질은, 세포, 조직 등으로부터 단리정제된 상태이어도 좋고, 단백질을 코드하는 유전자를 숙주 세포에 도입하여, 그 단백질을 세포내 발현시킨 상태이어도 좋다. 또한, 본 발명에 관한 단백질은, 부가적인 폴리펩티드를 포함하는 것이어도 좋다.
또한, 본 발명은, 본 명세서 중에 기재된 단백질의 에피토프 보유 부분의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명에 관한 단백질의 에피토프 보유 부분(epitope-bearing part)의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드는, 적어도 6개, 7개, 8개, 9개, 10개의 아미노산을 가지는 폴리펩티드의 부분을 포함하고 있으면 좋지만, 더욱이, 서열번호 2 또는 4로 표시되는 염기 서열에 의해서 코드되는 단백질이나 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질의 전체 아미노산 서열의 길이까지의 임의의 길이(전체를 포함한다)의 에피토프 보유 부분 폴리펩티드도 또한 포함된다.
즉, 본 발명은, 본 발명에 관한 단백질의 에피토프 보유 펩티드를 제공한다. 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 관한 단백질은 면역원성(immunogenic)이다. 따라서, 본 발명에 관한 단백질에 있어서, 항체 응답을 야기하는 에피토프 부분은, 당해 분야에서 공지의 방법에 의해 동정할 수 있다. 예를 들면, Geysen, H. M. 들, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-400 (1984)에는, 효소-결합 면역 흡착 분석에 있어서의 반응에 이용 가능할 정도로, 충분히 순수한 몇백이라는 펩티드의 고체 지지체상의 신속한 동시 합성의 순서가 개시되어 있다. 합성 펩티드의 항체와의 상호작용은, 뒤이어, 그들을 지지체로부터 제거하지 않고 용이하게 검출 가능하다. 이 양식에 있어서, 소망하는 단백질의 면역원성 에피토프를 보유하는 펩티드는, 당업자에 의해 일상적으로 동정될 수 있다. 예를 들면, 구제역 바이러스의 코트 단백질에 있어서의 면역학적으로 중요한 에피토프는, 단백질의 213의 아미노산 서열 전체를 덮는 전체의 208의 가능한 헥사펩티드의 중복 세트의 합성에 의한 7 아미노산의 해명에 의해 Geysen 등에 의해 자리 매김되었다. 뒤이어, 모든 20 아미노산이 차례로 에피토프 내의 각 위치에서 치환된 펩티드의 완전한 치환 세트가 합성되고, 그리고 항체와의 반응을 위한 특이성을 부여하는 특정의 아미노산이 결정되었다. 따라서, 본 발명의 에피토프 보유 펩티드의 펩티드 아날로그는, 이 방법에 의해 일상적으로 제작될 수 있다. Geysen(1987)의 미국특허 제4,708,781호에는, 소망하는 단백질의 면역원성 에피토프를 보유하는 펩티드를 동정하는 이 방법이 더욱 상세하게 기재되어 있다.
「면역원성 에피토프」는, 단백질 전체가 면역원인 경우, 항체 응답을 유발하는 단백질의 일부로서 정의된다. 이들의 면역원성 에피토프는, 분자상의 2, 3의 초점에 제한된다고 생각되고 있다. 한편에서는, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역은, 「항원성 에피토프」라고 정의될 수 있다. 단백질의 면역원성 에피토프의 수는, 일반적으로는, 항원성 에피토프의 수보다도 적다. 예를 들면, Geysen, H. M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002(1984)를 참조.
본 발명의 항원성 에피토프 보유 펩티드는, 본 발명에 관한 단백질에 특이적으로 결합하는 모노크로날 항체를 포함하는 항체를 야기하는데 유용하다. 따라서, 항원 에피토프 보유 펩티드로 면역화된 도너로부터의 비장(脾臟) 세포의 융합에 의해 얻어지는 하이브리도마의 대부분은, 일반적으로 천연의 단백질과 반응성이 있는 항체를 분비한다. 항원성 에피토프 보유 펩티드에 의해 야기된 항체는, 모방 단백질을 검출하는데 유용하고, 그리고 상이한 펩티드에 대한 항체가, 번역 후 프로세싱을 받는 단백질 전구체의 여러 가지의 영역의 말로를 추적하기 위해서 사용될 수 있다. 면역 침강 분석에 있어서, 짧은 펩티드(예를 들면, 약 9 아미노산)조차, 보다 긴 펩티드에 결합하고 그리고 치환할 수 있는 것이 나타나 있으므로, 펩티드 및 항펩티드 항체는, 모방 단백질에 관한 여러 가지의 정성적 또는 정량적 분석, 예를 들면, 경합적 분석에 있어서 사용될 수 있다. 예를 들면, Wilson, I. A. 등 , Cell 37:767-778(1984) 777을 참조. 본 발명의 항단백질 항체도 또한, 모방 단백질의 정제(예를 들면, 당해 분야에서 주지의 방법을 사용하여, 흡착 크로마토그래피에 의해)에 유용하다.
상기의 가이드 라인에 따라서 설계된 본 발명의 항원성 에피토프 보유 펩티드는, 바람직하게는 본 발명에 관한 단백질의 아미노산 서열내에 포함되는 적어도 7, 보다 바람직하게는 적어도 9, 그리고 가장 바람직하게는 약 15~ 약 30 아미노산 사이의 서열을 포함한다. 그러나, 본 발명에 관한 단백질의 아미노산 서열의 약 30~약 50 아미노산 또는 전체까지의 임의의 길이 및 전체를 포함하는, 본 발명의 단백질의 아미노산 서열의 보다 대부분을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드도 또한, 본 발명의 에피토프 보유 펩티드라고 생각되고, 그리고 또한 모방 단백질과 반응하는 항체를 유도하는데 유용하다. 바람직하게는, 에피토프 보유 펩티드의 아미노산 서열은, 수성 용매 중에서 실질적인 용해성을 제공하도록 선택되고(즉, 그 서열은, 비교적 친수성 잔기를 포함하고, 그리고 고도한 소수성 서열은 바람직하게는 회피된다)；그리고 프로린 잔기를 포함하는 서열이 특히 바람직하다.
본 발명의 에피토프 보유 펩티드는, 본 발명에 관한 유전자를 사용하는 재조합 단백질을 제작하기 위한 임의의 종래의 수단에 의해 산생될 수 있다. 예를 들면, 짧은 에피토프 보유 아미노산 서열은, 재조합체 산생 및 정제하는 동안, 및 항단백질 항체를 산생하기 위한 면역화하는 동안, 캐리어로서 작용하는 보다 큰 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 에피토프 보유 펩티드는 또한, 화학 합성의 공지의 방법을 사용하여 합성될 수 있다.
또한, 본 발명에는, 번역된 단백질의 소포체의 관강(管腔) 내이거나, 주변질 공간내이거나, 또는 세포외 환경경내에의 분비를 위해서, 적절한 분비 시그널이, 발현되는 단백질 중에 조입된 것이 포함될 수 있다. 이러한 분비 시그널은, 폴리펩티드에 대해서 내인성이어도 좋고, 그들은 이종 시그널이어도 좋다.
따라서, 본 발명에 관한 단백질은, 융합 단백질과 같은 개변된 형태로 발현될 수 있고, 그리고 분비 시그널 뿐만 아니라, 부가적인 이종의 기능적 영역도 포함할 수 있다. 예를 들면, 부가적인 아미노산, 특히 하전성 아미노산의 영역이, 숙주 세포 내에서의, 정제하는 동안의, 또는 계속되는 조작 및 보존하는 동안의, 안정성 및 지속성을 개선하기 위해서, 단백질의 N말단에 부가될 수 있다. 또한, 펩티드 부분이, 정제를 용이하게 하기 위해서 단백질에 부가될 수 있다. 그와 같은 영역은, 단백질의 최종 조제 전에 제거될 수 있다. 특히, 분비 또는 배출을 일으키기 위해서, 안정성을 개선하기 위해서, 및 정제를 용이하게 하기 위한 펩티드 부분의 단백질에의 부가는, 당 분야에서 잘 알려져 있고, 그리고 일상적인 기술이다.
바람직한 융합 단백질은, 단백질의 가용화에 유용한 면역 글로블린 유래의 이종 영역을 포함한다. 예를 들면, EP A 0 464 533(또한, 캐나다 대응 출원 2045869)은, 다른 인간 단백질 또는 그 일부와 함께 면역 글로블린 분자에 있어서의 정상 영역의 여러 가지의 부분을 포함하는 융합 단백질을 개시하고 있다. 많은 경우, 융합 단백질 중의 Fc부분은, 치료 및 진단에 있어서의 사용에 충분히 유리하고, 따라서, 예를 들면 개선된 약물 동태학적 특성을 일으킨다(EP A 0232 262). 한편, 몇가지의 사용에 관해서, 융합 단백질이, 기재되는 유리한 양식으로, 발현되고, 검출되고, 및 정제된 후에 Fc부분이 결실될 수 있는 것이 바람직하다. 이것은, Fc부분이, 치료 및 진단에 있어서의 사용의 방해라고 판명되는 경우(예를 들면, 융합 단백질이 면역을 위한 항원으로서 사용되어야 할 경우)이다. 약물 스크리닝에 있어서, 예를 들면 hIL-5와 같은 인간 단백질은, hIL-5의 안타고니스트(antagonist)를 동정하기 위한 고처리 능력 스크리닝 분석의 목적으로 Fc부분과 융합되어 있다. D. Bennett 등, Journal of Molecular Recognition Vol. 8:52-58(1995) , 및 K. Johanson 등, The Journal of Biological Chemistry Vol. 270, No.16, 9459-9471페이지(1995)를 참조.
(1-2) 기능
본 발명에 관한 단백질의 기능에 관하여, 상술한 SITH-1 단백질을 예로 들어 상세하게 설명한다.
SITH-1 유전자는, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, HHV-6이 잠복 감염하고 있는 세포의 세포질에 있어서 항상 발현하고 있는 한편, 증식 (ii)를 세포에서는 발현이 확인되지 않았다. SITH-1 단백질을 코드하는 유전자는, 지금까지 보고한 HHV-6 잠복 감염 특이적 유전자(H6LT)와 상보쇄의 관계에 있는 DNA에 코드되고, 그 발현은, HHV-6의 잠복 감염의 중간 단계에 있어서 증강한다.
이들의 사실로부터, SITH-1 단백질은, HHV-6의 잠복 감염시에 특이적으로 발현하는 단백질이라고 생각되고, 지금까지 동정되어 있는 HHV-6의 잠복 감염에 관여하는 단백질과는 명확하게 다른 것인 것을 알 수 있었다.
더욱이, 본 발명자는, SITH-1 단백질의 기능 해석을 진행시킨 결과, SITH-1 단백질은, 숙주 단백질인 칼슘-시그널 모듈레이팅 시클로필린 리간드(calcium-modulating cyclophilin ligand, Accession #; U18242; CAML)과 결합하고, 아스트로사이트 등의 글리아 세포의 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 것을 알 수 있었다. CAML은 숙주 생체내에 있어서, 뇌와 임파구에 많이 존재하여, 세포내의 칼슘 농도를 상승시키는 것이 알려져 있는 단백질이다. 또한, SITH-1 단백질의 발현에 의한 세포내 칼슘 농도의 상승은, 잠복 감염 세포내의 전반적인 시그널 전달의 활성화를 가져와서, HHV-6의 효율적인 재활성화에 기여하는 것이라고 생각된다.
여기에서 말하는 「글리아 세포(glial cells)」란, 아스트로사이트(astrocytes), 올리고덴드로사이트(oligodendrocytes), 마이크로글리아(microglias) 및 상의 세포(ependymal cells)와 같은 중추 신경계의 글리아 세포의 성숙 세포, 전구 세포를 포함하는 모든 글리아 세포를 의도하지만, 그 외에도 말초신경계에 있어서의 외투 세포(satellite cells), 슈완 세포(Schwann cells) 및 말초 글리아 세포(terminal gliocytes)를 포함할 수 있다.
HHV-6은 뇌내의 아스트로사이트 등의 글리아 세포로 잠복 감염하는 것이 알려져 있고, 잠복 감염시나 활성이 높은 잠복 감염 상태인 중간 단계에 있는 HHV-6이 SITH-1을 발현시키면, 아스트로사이트 등의 글리아 세포내의 칼슘 농도가 상승하는 것이라고 생각된다. 최근의 정신과학 영역의 연구에 의해, 뇌의 세포에 있어서의 세포내 칼슘 농도의 상승은, 기분 장애 등의 정신 장애와 많이 관계하는 것이라고 생각되고 있다.
또한, 실제로, 실시예에서 나타낸 바와 같이, SITH-1 단백질을 마우스의 아스트로사이트 등의 글리아 세포로 발현시키면, 정신 장애인 기분 장애 같은 증상과 과민성의 항진이 생기는 것이 판명되었다. 이것은, 아스트로사이트 등의 글리아 세포에서 잠복 감염하고 있는 HHV-6이 SITH-1 단백질을 개재시켜 정신 장애를 일으킬 수 있는 것을 강하게 시사하고 있다.
또한, HHV-6은, 아스트로사이트 뿐만 아니라, 미크로 글리아 등의 다른 글리아 세포에도 잠복 감염 할 수 있기 때문에, 우울증이나 조울증 등의 정신 장애의 원인이, 아스트로사이트 뿐만 아니라, 다른 글리아 세포가 원인일 가능성이 있다고 말할 수 있다.
이상의 지견으로부터, 본 발명에 관한 단백질은, 숙주의 단백질인 CAML과 결합하는 활성을 유지하고, 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 기능을 가지는 것이다. 또한, 본 발명에 관한 단백질을, 이 단백질이 가장 강하게 발현한다고 생각되는 아스트로사이트 등의 글리아 세포로 발현시키는 것에 의해, 정신 장애를 유도할 수 있다는 것이 판명되었다. 그러므로, 본 발명에 관한 단백질은, 헤르페스 바이러스의 잠복 감염시 또는 재활성화 초기에 발현하여, 숙주에 정신 장애를 일으키게 하는 기능을 가진다고 생각된다.
(1-3) 유전자 및 단백질의 취득 방법
본 발명에 관한 유전자 및 단백질의 취득 방법(또는 생산 방법)은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 대표적인 방법으로서 다음에 나타내는 각 방법을 들 수 있다.
<단백질의 취득 방법>
본 발명에 관한 단백질을 취득하는 방법(또는 단백질의 생산 방법)은, 상술한 바와 같이 특별히 한정되는 것은 아니지만, 우선, 본 발명에 관한 단백질을 함유하는 생물학적 시료(예를 들면, 세포, 조직, 생물 개체 등) 등으로부터 단순 정제하는 방법을 들 수 있다. 또한 정제 방법에 관해서도 특별히 한정되는 것이 아니고, 공지의 방법으로 세포나 조직으로부터 세포 추출액을 조제하고, 이 세포 추출액을 공지의 방법, 예를 들면 컬럼 등을 이용하여 정제하면 좋다. 예를 들면, 세포 또는 조직으로부터 추출한 조(粗)단백질 화분(fraction)을 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에 걸어서, 본 발명에 관한 단백질의 정제ㆍ분리를 행할 수 있다.
또한, 그 외의 본 발명에 관한 단백질을 취득하는 방법으로서, 유전자 재조합 기술 등을 이용하는 방법도 들 수 있다. 이 경우, 예를 들면, 본 발명에 관한 유전자를 벡터 등에 조입한 후, 공지의 방법에 의해, 발현 가능하게 숙주 세포에 도입하고, 세포내에서 번역되어 얻어지는 상기 단백질을 정제한다고 하는 방법 등을 채용할 수 있다. 유전자의 도입(형질 전환)이나 유전자의 발현 등의 구체적인 방법에 관해서는 후술한다.
또한, 이와 같이 숙주에 외래 유전자를 도입하는 경우, 외래 유전자의 발현을 위해 숙주내에서 기능하는 프로모터를 조입한 발현 벡터, 및 숙주에는 여러가지 것이 존재하므로, 목적에 따른 것을 선택하면 좋다. 산생된 단백질을 정제하는 방법은, 이용한 숙주, 단백질의 성질에 따라서 다르지만, 태그의 이용 등에 의해서 비교적 용이하게 목적의 단백질을 정제하는 것이 가능하다.
변이 단백질을 제작하는 방법에 관해서도, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 부위 특이적 돌연변이 유발법(Hashimoto-Gotoh, Gene 152,271-275(1995) 외), PCR법을 이용하여 염기 서열에 점변이를 도입하여 변이 단백질을 제작하는 방법, 혹은 트랜스포존(transposon)의 삽입에 의한 돌연변이주 제작법 등의 주지의 변이 단백질 제작법을 이용할 수 있다. 이들 방법을 이용하는 것에 의해서, 상기 (a)의 단백질을 코드하는 cDNA의 염기 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 염기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되도록 개변을 더하는 것에 의해서 제작할 수 있다. 또한, 변이 단백질의 제작에는, 시판의 키트를 이용해도 좋다.
본 발명에 관한 단백질의 취득 방법은, 상술한 것에 한정되지 않고, 예를 들면, 시판되고 있는 펩티드 합성기 등을 이용하여 화학 합성된 것이어도 좋다. 또한 그 외의 예로서는, 무세포계의 단백질 합성액을 이용하여, 본 발명에 관한 유전자로부터 본 발명에 관한 펩티드를 합성해도 좋다.
<유전자의 취득 방법>
본 발명에 관한 유전자를 취득하는 방법(또는 유전자의 생산 방법)도 상술한 바와 같이 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 디퍼렌셜 스크리닝(서브 트랙션 클로닝)을 이용하는 방법을 들 수 있다. 이 방법에서는, 공지의 기술에 따라서, 시험관 내에서의 직접적 하이브리다이제이션을 반복하여, 목적의 cDNA(본 발명에 관한 유전자)를 농축하면 좋다.
상기 디퍼렌셜 스크리닝에 있어서의 각 스텝에 관해서는, 통상 이용되는 조건하에서 행하면 좋다. 이것에 의해서 얻어진 클론은, 제한 효소 지도의 작성 및 그 염기 서열 결정(시퀀싱)에 의해서, 더욱 상세하게 해석할 수 있다. 이들의 해석에 의해서, 본 발명에 관한 유전자 서열을 포함하는 DNA 단편을 취득했는지 용이하게 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 관한 유전자를 취득하는 방법으로서, 공지의 기술에 의해, 본 발명에 관한 유전자를 포함하는 DNA 단편을 단리하고, 클로닝하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 상기 cDNA 서열의 일부 서열과 특이적으로 하이브리다이즈하는 프로브를 조제하고, 게놈 DNA 라이브러리나 cDNA 라이브러리를 스크리닝하면 좋다. 이와 같은 프로브로서는, 상기 각 cDNA 서열 또는 그 상보 서열의 적어도 일부에 특이적으로 하이브리다이즈하는 프로브이면, 어느 서열ㆍ길이의 것을 이용해도 좋다.
또한, 본 발명에 관한 유전자를 취득하는 방법으로서, PCR 등의 증폭 수단을 이용하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 관한 유전자의 cDNA 서열 중, 5'측 및 3'측의 서열(또는 그 상보 서열) 중에서 각각 프라이머를 조제하고, 이들 프라이머를 이용하여 게놈 DNA(또는 cDNA) 등을 주형으로 하여 PCR 등을 행하고, 양 프라이머 사이에 끼워지는 DNA 영역을 증폭함으로써, 본 발명에 관한 유전자를 포함하는 DNA 단편을 대량으로 취득할 수 있다.
또한 유전자 서열 정보를 기초로 하여, 상기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를, 공지의 화학 합성을 이용하여 합성해도 좋다.
(2) 본 발명에 관한 항체
본 발명에 관한 항체는, 본 발명에 관한 단백질, 예를 들면 상기 (a) 또는 (b)에 기재된 단백질, 또는 그 부분 펩티드를 항원으로 하여, 공지의 방법에 의해 폴리크로날 항체 또는 모노크로날 항체로서 얻어지는 항체이다. 공지의 방법으로서는, 예를 들면, 문헌(Harlow 등의 「Antibodies:A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988)), 이와사키 등의 「모노크로날 항체 하이브리도마와 ELISA, 코단샤(1991)」」에 기재된 방법을 들 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 항체는, 본 발명에 관한 단백질의 검출ㆍ측정 등에 이용할 수 있다.
예를 들면, 상기(1-1) 란에 기재한, 본 발명의 에피토프 보유 펩티드는, 당해 분야에 주지의 방법에 따라 항체를 유도하기 위해서 사용된다. 예를 들면, Chow, M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910-914；및 Bittle, F. J. 등, J. Gen. Virol. 66:2347-2354(1985)를 참조. 일반적으로는, 동물은 유리 펩티드로 면역화될 수 있다；그러나, 항단백질 항체역가(antibody titer)는 펩티드를 고분자 캐리어(예를 들면, 키홀림페트헤모시아닌(KLH) 또는 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid))에 커플링하는 것에 의해 추가 면역될 수 있다. 예를 들면, 시스테인을 함유하는 펩티드는, m-말레이미드벤조일-N-히드록시숙신이미드에스테르(MBS)와 같은 링커를 사용하여 캐리어에 커플링 될 수 있고, 한편, 다른 펩티드는, 글루타르알데히드와 같은, 보다 일반적인 연결제를 사용하여 캐리어에 커플링될 수 있다. 토끼, 래트, 및 마우스와 같은 동물은, 유리 또는 캐리어-커플링 펩티드의 어느 하나에서, 예를 들면, 약 100㎍의 펩티드 또는 캐리어 단백질 및 Freund의 아쥬반트(adjuvant)를 포함하는 에멀젼의 복강내 및/또는 피내 주사에 의해 면역화 된다. 몇개의 추가 면역 주사가, 예를 들면, 고체 표면에 흡착된 유리 펩티드를 사용하여 ELISA 분석에 의해 검출될 수 있는 유용한 역가의 항단백질 항체를 제공하기 위해서, 예를 들면, 약 2주간의 간격으로 필요하게 될 수 있다. 면역화 동물로부터의 혈청에 있어서의 항단백질 항체의 역가는, 항단백질 항체의 선택에 의해, 예를 들면, 당해 분야에서 주지의 방법에 의한 고체 지지체상의 펩티드에의 흡착 및 선택된 항체의 용출에 의해 증가될 수 있다.
또한, 본 명세서 중에서 사용되는 경우, 용어 「항체」는, 면역 글로블린(IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 및 이들의 Fab프래그먼트, F(ab')2 프래그먼트, Fc프래그먼트)를 의미하고, 예로서는, 폴리크로날 항체, 모노크로날 항체, 단쇄 항체, 항이디오타이프 항체 및 인간화 항체를 들 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 중에서 사용되는 경우, 용어 「본 발명에 관한 단백질을 인식하는 항체」는, 상술한 본 발명에 관한 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 완전한 분자 및 항체 프래그먼트(예를 들면, Fab 및 F(ab')2 프래그먼트)를 포함하는 것을 의미한다. Fab 및 F(ab')2 프래그먼트는 완전한 항체의 Fc 부분을 결실하고 있고, 순환에 의해서 더욱 신속하게 제거되고, 그리고 완전한 항체의 비특이적 조직 결합을 거의 가질 수 없다(Wahl 등, J. Nucl. Med. 24:316-325(1983)). 따라서, 이들의 프래그먼트가 바람직하다.
혹은, 본 발명에 관한 단백질을 인식할 수 있는 새로운 항체가, 항이디오타이프 항체의 사용을 통해서 2 공정 순서로 산생될 수 있다. 이와 같은 방법은, 항체 그 자체가 항원이라는 사실을 사용하고, 따라서, 2차 항체에 결합하는 항체를 얻는 것이 가능하다. 이 방법에 따라서, 본 발명에 관한 단백질 특이적 항체는, 동물(바람직하게는, 마우스)을 면역하기 위해서 사용된다. 뒤이어, 이와 같은 동물의 비세포는 하이브리도마 세포를 산생하기 위해서 사용되고, 그리고 하이브리도마 세포는, 본 발명에 관한 단백질 특이적 항체에 결합하는 능력이 본 발명에 관한 단백질 항원에 의해서 블록될 수 있는 항체를 산생하는 클론을 동정하기 위해서 스크리닝 된다. 이와 같은 항체는, 본 발명에 관한 단백질 특이적 항체에 대한 항이디오타이프 항체를 포함하고, 그리고 새로운 본 발명에 관한 단백질 특이적 항체의 형성을 유도하기 위해서 동물을 면역하기 위해서 사용될 수 있다.
Fab 및 F(ab')2 및 본 발명에 관한 항체의 다른 프래그먼트는, 본 명세서 중에서 개시되는 방법에 따라서 사용될 수 있는 것이 분명하다. 이와 같은 프래그먼트는, 대표적으로는, 파파인(Fab 프래그먼트를 생성한다) 또는 펩신(F(ab')2 프래그먼트를 생성한다)과 같은 효소를 사용하는 단백질 분해에 의한 절단에 의해서 산생된다. 혹은, 본 발명에 관한 단백질 결합 프래그먼트는, 재조합 DNA 기술의 적용 또는 합성 화학에 의해서 산생될 수 있다.
사람에 있어서의 진단을 위해서, in vivo에서의 이미징을 이용하여, 상승 레벨의 본 발명에 관한 단백질을 검출하는 경우, 「사람화」키메라모노클로날 항체("humanized" chimeric monoclonal antibody)를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이와 같은 항체는, 상기의 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포 유래의 유전 구축물을 이용하여 생성될 수 있다. 키메라 항체를 생성하기 위한 방법은, 당해 분야에서 공지이다. 총설에 관해서는, Morrison, Science 229:1202(1985)；Oi 등, BioTechniques 4:214(1986)；Cabilly 등, 미국특허 제4,816,567호；Taniguchi 등, EP 171496；Morrison 등, EP 173494；Neuberger 등, WO 8601533；Robinson 등, WO 8702671；Boulianne 등, Nature 312:643(1984)；Neuberger 등, Nature 314:268(1985)을 참조.
(3) 본 발명에 관한 재조합 발현 벡터
본 발명에 관한 재조합 발현 벡터는, 상기 (a) 또는 (b)에 기재된 단백질을 코드하는 본 발명의 유전자를 포함하는 것이다. 예를 들면, cDNA가 삽입된 재조합 발현 벡터를 들 수 있다. 재조합 발현 벡터의 제작에는, 플라스미드, 파지(phage), 또는 코스미드 등을 이용할 수 있지만 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한, 제작 방법도 공지의 방법을 이용하여 행하면 좋다.
벡터의 구체적인 종류는 특별히 한정되는 것은 아니고, 숙주(호스트) 세포 중에서 발현 가능한 벡터를 적절히 선택하면 좋다. 즉, 호스트 세포의 종류에 따라서, 확실히 유전자를 발현시키기 위해서 적절히 프로모터 서열을 선택하고, 이것과 본 발명에 관한 유전자를 각종 플라스미드 등에 조입한 것을 발현 벡터로서 이용하면 좋다. 이러한 발현 벡터는, 예를 들면, 파지 벡터, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 레트로 바이러스 벡터, 염색체 벡터, 에피솜 벡터, 및 바이러스 유래 벡터(예를 들면, 세균 플라스미드, 박테리오 파지, 효모 에피솜, 효모 염색체 엘리먼트, 바이러스(예를 들면, 바큐로 바이러스(baculoviruses), 파포바 바이러스(papovaviruses), 웍시니어 바이러스(vaccinia viruses), 아데노 바이러스(adenoviruses), 트리폭스 바이러스(avipoxviruses), 가성 광견병 바이러스(pseudoviruses), 헤르페스 바이러스(herpesviruses), 렌티 바이러스(lentiviruses) 및 레트로 바이러스(retroviruses)), 및 그들의 조합에 유래하는 벡터(예를 들면, 코스미드 및 파지미드)를 이용 가능하다.
일반적으로, 플라스미드 벡터는, 인산칼슘 침전물과 같은 침전물 중이거나, 또는 하전된 지질과의 복합체 중에서 도입된다. 벡터가 바이러스인 경우, 벡터는, 적절한 패키징 세포주를 이용하여 in vitro로 패키징될 수 있고, 뒤이어 숙주 세포에 형질 도입될 수 있다. 또한, 레트로 바이러스 벡터는, 복제 가능하거나 또는 복제 결손일 수 있다. 후자의 경우, 바이러스의 증식은, 일반적으로, 상보 숙주 세포에 있어서만 생긴다.
또한, 목적의 유전자에 대한 시스 작용성 제어 영역을 포함하는 벡터가 바람직하다. 적절한 트랜스 작용성 인자는, 숙주에 의해서 공급될 수 있거나, 상보 벡터에 의해서 공급될 수 있거나, 또는 숙주로 도입할 때에 벡터 자체에 의해서 공급될 수 있다. 이 점에 관한 바람직한 실시형태로서는, 벡터는, 유도성 및/또는 세포형 특이적일 수 있는 특이적인 발현을 제공하는 것인 것이 매우 적절하다. 이와 같은 벡터 중에서 특히 바람직한 벡터는, 온도 및 영양 첨가물과 같은 조작하는 것이 용이한 환경 인자에 의해서 유도성인 벡터이다.
세균에 있어서의 사용에 바람직한 벡터 중에는, 예를 들면, pQE70, pQE60, 및 pQE-9(Qiagen로부터 입수 가능)；pBS 벡터, Phagescript 벡터, Bluescript 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(Stratagene로부터 입수 가능)；및 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(Phrmacia로부터 입수 가능)가 포함된다. 또한, 바람직한 진핵생물 벡터 중에는, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, 및 pSG(Stratagene로부터 입수 가능)；및 pSVK3, pBPV, pMSG, 및 pSVL(Phrmacia로부터 입수 가능)이 포함된다.
본 발명에 관한 유전자가 숙주 세포에 도입되었는지 여부, 또한 숙주 세포 중에서 확실히 발현하고 있는지 여부를 확인하기 위해서, 각종 마커를 이용해도 좋다. 즉, 발현 벡터는, 적어도 1개의 선택 마커를 포함하는 것이 바람직하다. 이와 같은 선택 마커로서는, 예를 들면, 진핵생물 세포 배양에 관해서는 디히드로엽산 리덕타제 또는 네오마이신 내성, E.coli 및 다른 세균에 있어서의 배양에 관해서는 테트라사이클린 내성 유전자 또는 암피실린 내성 유전자 등의 약제 내성 유전자를 들 수 있다. 또한, 그 외에도 숙주 세포 중에서 결실하고 있는 유전자를 마커로서 이용하고, 이 마커와 본 발명에 관한 유전자를 포함하는 플라스미드 등을 발현 벡터로서 숙주 세포에 도입한다. 이것에 의해서 마커 유전자의 발현으로부터 본 발명에 관한 유전자의 도입을 확인할 수 있다. 혹은, 본 발명에 관한 단백질을 융합 단백질로서 발현시켜도 좋고, 예를 들면, 발광 해파리 유래의 녹색 형광 단백질 GFP(Green Fluorescent Protein)를 마커로서 이용하고, 본 발명에 관한 단백질을 GFP 융합 단백질로서 발현시켜도 좋다. 또한, 본 발명에 관한 유전자는, 숙주 세포에 있어서의 증식을 위한 선택 마커를 포함하는 벡터에 결합되어도 좋다.
또한, DNA 인서트(insert)는, 적절한 프로모터(예를 들면, 파지 λPL프로모터, E.coli　lac 프로모터, trp 프로모터, 및 tac 프로모터, SV40 초기 프로모터 및 후기 프로모터, 및 레트로 바이러스 LTR의 프로모터)에 작동 가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 다른 적절한 프로모터로서는, 당업자에게 공지의 것을 이용 가능하다.
본 발명에 있어서, 사용에 적절한 공지의 세균 프로모터 중에는, E.coli　lacI 및 lacZ 프로모터, T3프로모터 및 T7프로모터, gpt 프로모터, λPR프로모터 및 λPL프로모터, 및 trp 프로모터가 포함된다. 적절한 진핵생물 프로모터로서는, CMV전 초기 프로모터, HSV 티미딘키나제 프로모터, 초기 SV40 프로모터 및 후기 SV40 프로모터, 레트로 바이러스 LTR의 프로모터(예를 들면, 라우스 육종 바이러스(RSV)의 프로모터), 및 메타로티오네인 프로모터(예를 들면, 마우스메타로티오네인 I프로모터)를 들 수 있다.
재조합 발현 벡터는, 또한, 전사 개시, 전사 종결을 위한 부위, 및, 전사 영역 중에 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 포함하는 것이 바람직하다. 벡터 구축물에 의해서 발현되는 성숙 전사물의 코드 부분은, 번역되어야 할 폴리펩티드의 처음에 전사 개시 AUG를 포함하고, 그리고 마지막에 적절히 위치되는 종지 코돈을 포함하게 된다.
또한, 고등 진핵 생물에 의한 DNA의 전사는, 벡터 중에 인핸서 서열을 삽입하는 것에 의해서 증대시킬 수 있다. 인핸서는, 소정의 숙주 세포형에 있어서의 프로모터의 전사 활성을 증대하도록 작용하고, 통상 약 10~300bp의 DNA의 시스 작용성 엘리먼트이다. 인핸서의 예로서는, SV40 인핸서(이것은, 복제 기점의 후기측상의 100~270bp에 위치된다), 사이토메가로 바이러스의 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후기측상의 폴리오머 인핸서, 및 아데노 바이러스 인핸서를 들 수 있다.
또한, 상기 숙주 세포는, 특별히 한정되는 것은 아니고, 종래 공지의 각종 세포를 매우 적절하게 이용할 수 있다. 적절한 숙주의 대표적인 예로서는, 균체(예를 들면, E.coli 세포, Streptomyces 세포, 및 Salmonella typhimurium 세포)；진균 세포(예를 들면 효모 세포)；곤충 세포(예를 들면, Drosophila　S2세포 및 Spodoptera Sf9 세포)；동물세포(예를 들면, CHO 세포, COS 세포, 및 Bowes 흑색종 세포)；및 식물세포를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 인간이나 마우스 등의 포유류의 세포뿐만 아니라, 예를 들면, 누에나방 유래의 세포를 비롯하여, 드로소필라(Drosophila) 등의 곤충, 대장균(Escherichia coli) 등의 세균, 효모(출아 효모 Saccharomyces cerevisiae나 분열 효모 Schizosaccharomyces pombe), 선충( Caenorhabditis elegans), 아프리카 발톱개구리(Xenopus laevis)의 난모세포 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되는 것은 아니다. 상기의 숙주 세포를 위한 적절한 배양 배양지 및 조건은 당 분야에서 공지의 것을 이용 가능하다.
상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 방법, 즉 형질 전환 방법도 특별히 한정되는 것은 아니고, 전기 천공법, 인산칼슘법, 리포솜법, DEAE덱스트란법, 마이크로인젝션법, 양이온성 지방질 매개 트란스펙션, 일렉트로포레이션, 형질 도입, 감염 등의 종래 공지의 방법을 적절하게 이용할 수 있다. 이와 같은 방법은, Davis 등, Basic Methods In Molecular Biology(1986)와 같은 많은 표준적 연구실 매뉴얼에 기재되어 있다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 관한 단백질의 부분 단편(프래그먼트)을 재조합적으로 생성하기 위한, 본 발명에 관한 단백질의 부분 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터, 재조합 발현 벡터로 유전자 조작된 형질 전환체(숙주 세포)를 제공할 수도 있다.
또한, 본 발명에는, 상술한 재조합 기술에 의해서 본 발명에 관한 단백질, 또는 그 프래그먼트의 산생에 관한 발명도 포함될 수 있다. 즉, 본 발명에는, 재조합 기술을 이용하여 본 발명에 관한 단백질이나 그 프래그먼트를 생산하는 방법도 포함될 수 있다. 이러한 비술(秘術)에 의해서 생산된 재조합 단백질은, 황산암모늄 침전 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스크로마트그라피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 어피니티(affinity) 크로마토그래피, 히드록시 아파타이트(hydroxyapatite) 크로마토그래피, 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 주지의 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수되고, 그리고 정제될 수 있다. 가장 바람직하게는, 고속 액체 크로마토그래피(「HPLC」)가 정제를 위해서 이용된다.
(4) 본 발명에 관한 형질 전환체
본 발명에 관한 형질 전환체는, 본 발명에 관한 유전자가 도입된 형질 전환체, 즉, 상기 (3)란에 기재된 재조합 발현 벡터가 도입된 형질 전환체이다. 여기에서, 「유전자가 도입되었다」란, 공지의 유전자 공학적 수법(유전자 조작 기술)에 의해, 대상 세포(숙주 세포) 내에 발현 가능하게 도입되는 것을 의미한다. 또한, 상기 「형질 전환체」란, 세포ㆍ조직ㆍ기관 뿐만 아니라, 생물 개체를 포함하는 의미이다.
본 발명에 관한 형질 전환체의 제작 방법(생산 방법)은, 상술한 재조합 발현 벡터를 형질 전환하는 방법을 들 수 있다. 또한, 형질 전환의 대상으로 되는 생물도 특별히 한정되는 것은 아니고, 상기 숙주 세포에서 예시한 각종 미생물이나 동물(예를 들면 트랜스제닉(transgenic) 마우스)을 들 수 있다. 또한, 프로모터나 벡터를 선택하면, 식물도 형질 전환의 대상으로 하는 것이 가능하다.
(5) 본 발명에 관한 유전자 검출기구
본 발명에 관한 유전자 검출기구는, 본 발명에 관한 유전자에 있어서의 적어도 일부의 염기 서열 또는 그 상보 서열을 프로브로서 이용한 것이다. 유전자 검출기구는, 여러 가지 조건하에 있어서, 본 발명에 관한 유전자의 발현 패턴의 검출ㆍ측정 등에 이용할 수 있다.
본 발명에 관한 유전자 검출기구로서는, 예를 들면, 본 발명의 유전자와 특이적으로 하이브리다이즈하는 상기 프로브를 기판(담체)상에 고정화한 DNA 칩을 들 수 있다. 여기에서 「DNA 칩」이란, 주로, 합성한 올리고뉴클레오티드를 프로브에 이용하는 합성형 DNA 칩을 의미하지만, PCR 산물 등의 cDNA를 프로브에 이용하는 첩부형 DNA 마이크로 어레이도 포함하는 것으로 한다.
프로브로서 이용하는 서열은, cDNA 서열 중에서 특징적인 서열을 특정하는 종래 공지의 방법에 따라서 결정할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, SAGE：Serial Analysis of Gene Expression법(Science 276:1268, 1997;Cell 88:243, 1997;Science 270:484, 1995;Nature 389:300, 1997;미국특허 제5,695,937호) 등을 들 수 있다.
또한, DNA 칩의 제조에는, 공지의 방법을 채용하면 좋다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드로서 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우에는, 포토리소그래피 기술과 고상법 DNA 합성 기술과의 조합에 의해, 기판상에서 상기 올리고뉴클레오티드를 합성하면 좋다. 한편, 올리고뉴클레오티드로서 cDNA를 이용하는 경우에는, 어레이기를 이용하여 기판상에 첩부하면 좋다.
또한, 일반적인 DNA 칩과 동일하게, 퍼펙트 매치 프로브(올리고뉴클레오티드)와, 상기 퍼펙트 매치 프로브에 있어서 1염기 치환된 미스매치 프로브를 배치하여 유전자의 검출 정밀도를 보다 향상시켜도 좋다. 더욱이, 상이한 유전자를 병행하여 검출하기 위해서, 복수종의 올리고뉴클레오티드를 동일한 기판상에 고정하여 DNA 칩을 구성해도 좋다.
이하, 본 발명에 관한 유전자 검출기구에 관해서, 보다 상세하게 설명한다.
<기판>
본 발명에 관한 유전자 검출기구에 이용하는 기판의 재질로서는, 올리고뉴클레오티드를 안정하여 고정화할 수 있는 것이면 좋다. 예를 들면, 폴리카보네이트나 플라스틱 등의 합성 수지, 유리 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 기판의 형태도 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 판상, 필름상 등의 기판을 적절하게 이용할 수 있다.
<기판 표면에 고정화되는 올리고뉴클레오티드>
본 발명에 관한 유전자 검출기구의 기판 표면에 고정화되는 올리고뉴클레오티드는, 본 발명에 관한 유전자의 적어도 일부분의 염기 서열에 근거하는 올리고뉴클레오티드이면 좋다. 당해 올리고뉴클레오티드와 샘플 유래의 핵산과의 사이에 하이브리다이제이션이 성립하는 것에 의해, 샘플중에 포함되어 있는 유전자를 검출하는 것이 가능해진다. 또한, 상기 본 발명에 관한 유전자의 적어도 일부분의 염기 서열에 근거하는 올리고뉴클레오티드를, 이하 「캡쳐 올리고(capture oligo)」라고 칭하는 경우도 있다.
캡쳐 올리고는 본 발명에 관한 유전자의 염기 서열에 근거하여 설계하면 좋다. 따라서, 상기 염기 서열 그 자체이어도 좋고, 검출 대상의 시료(샘플)로부터 조제한 핵산과 특이적인 하이브리다이제이션이 성립하는 한에 있어서, 변이가 포함되어 있어도 좋다. 변이의 위치는 특별히 한정되는 것은 아니다.
캡쳐 올리고의 길이(염기수)는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 너무 짧으면 하이브리다이제이션의 검출이 곤란하게 되고, 너무 길면 비특이적 하이브리다이제이션을 허용해 버린다. 본 발명자는, 캡쳐 올리고의 길이의 최적화에 관해서 검토를 거듭하여, 표준적인 길이를 12~50 염기길이로 했다. 바람직하게는, 12~40 염기길이, 보다 바람직하게는 12~30 염기길이, 더욱 보다 바람직하게는, 13~22 염기길이이지만, 이들에 한정되지 않는다. 염기길이는 주로 서열 특성(특정의 염기의 함유율, 동일 염기의 리피트)에 의존하는 것이고, 결합성이 좋은 것은 단쇄이어도 특이적 하이브리다이제이션이 가능하다고 하는 것이, 발명자 등에 의해 확인되고 있다.
캡쳐 올리고가, 샘플 유래의 핵산과의 하이브리다이제이션을 방해하는 헤어핀 구조, 루프 구조, 또는 그 이외의 입체 구조를 가지는 경우, 캡쳐 올리고를 구성하는 1 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 이노신 또는 어느 뉴클레오티드와도 대합(對合)하지 않는 핵산으로 치환하는 것에 의해, 그 입체 구조를 해제할 수 있다.
캡쳐 올리고의 합성법은 특별히 한정되는 것은 아니고, 공지의 방법(예를 들면, Maniatis, T. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)에 기재된 방법 등)에 의해 합성하면 좋다. 일반적으로는, 시판의 DNA 합성기를 이용하여 화학 합성할 수 있다.
본 발명에 관한 유전자 검출기구에 있어서, 상기 본 발명에 관한 유전자의 적어도 일부분의 염기 서열에 근거한 올리고뉴클레오티드 뿐만이 아니라, 그들에 추가하여, 이른바 컨트롤ㆍ캡쳐 올리고를 기판 표면에 고정화하는 것이 바람직하다. 컨트롤ㆍ캡쳐 올리고에는, 양성 컨트롤ㆍ캡쳐 올리고 및 음성 컨트롤ㆍ캡쳐 올리고가 포함된다. 양성 컨트롤ㆍ캡쳐 올리고는, 후술하는 프로브 조제 공정에 있어서 증폭 반응이 잘 되고 있는지 여부를 판정하기 위해서 이용하는 것이다. 음성 컨트롤ㆍ캡쳐 올리고는, 비특이적 하이브리다이제이션이 생기지 않은 것, 즉 의사양성(false-positive)의 하이브리다이제이션 시그널이 생기지 않은 것을 확인하기 위해서 이용하는 것이다. 이들의 양성 컨트롤ㆍ캡쳐 올리고 및 음성 컨트롤ㆍ캡쳐 올리고가 기판 표면에 고정화된 유전자 검출기구도 본 발명에 포함된다.
양성 컨트롤ㆍ캡쳐 올리고는 검출 대상의 시료로부터 조제하는 프로브에 포함되는 염기 서열에 근거하여 설계되는 것이면 좋다. 또한, 복수의 검출 대상 시료를 동시에 동일한 유전자 검출기구를 이용하여 검출하는 경우에는, 각 검출 대상의 시료에 관하여 양성 컨트롤ㆍ캡쳐 올리고를 설계해도 좋지만, 복수의 검출 대상의 시료로부터 조제하는 프로브에 공통되는 염기 서열에 근거하여 설계해도 좋다. 모든 검출 대상의 시료로부터 조제하는 프로브에 공통되는 염기 서열이 없는 경우는, 몇개의 그룹마다 양성 컨트롤ㆍ캡쳐 올리고를 설계해도 좋다. 혹은, 프라이머 서열 부분이 동일하고, 대상으로 되는 세균의 서열과는 상이한 인공적인 서열을 설계하고, 이 서열의 일부를 양성 컨트롤ㆍ캡쳐 올리고로 할 수도 있다. 상기 인공적인 서열을 주형으로 하여 프로브를 조제하고(본 명세서에서는, 이와 같은 프로브를 컨트롤 프로브라고 칭한다.), 샘플로부터 조제한 프로브에 첨가하는 것에 의해, 하이브리다이제이션의 특이성을 검증하는 것이 가능해진다. 또한, 상기 프로브에 관해서는 후술한다.
음성 컨트롤ㆍ캡쳐 올리고는, 양성 컨트롤ㆍ캡쳐 올리고의 염기 서열에 있어서, 1염기 이상이며, 또한, 당해 서열이 가지는 염기수의 20% 미만의 범위내에서 인위적인 염기의 치환을 포함하는 염기 서열을 가지도록 설계하는 것이 바람직하다. 염기 치환을 행하는 염기수는, 하이브리다이제이션의 조건과의 관계로 결정되고, 검출 대상의 시료 유래의 프로브가 하이브리다이제이션을 일으키지 않는 염기수를 선택하면 좋다.
검출 대상의 시료는 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한, 1개의 기판상에 고정화하는 캡쳐 올리고는, 적어도 1종류 이상이면 좋고, 특별히 상한은 없다. 본 발명에 관한 유전자 검출기구도, 1개의 기판상에, 본 발명에 관한 유전자의 부분 단편(각각 다른 염기 서열을 가지는 것)을 캡쳐 올리고로서 복수 고정화한, 이른바 마이크로 어레이형의 기구로 하는 것이 가장 바람직하다.
<올리고뉴클레오티드(캡쳐 올리고)의 고정화>
올리고뉴클레오티드의 기판 표면에의 고정화법은 특별히 한정되는 것은 아니고, 공지의 방법을 적절히 선택하여 이용하면 좋다. 예를 들면, 물리적 흡착, 전기적 결합 또는 분자 공유결합 등의 일반적인 하이브리다이제이션법에 이용되는 수법이 이용 가능하다. 본 발명에 관한 유전자 검출기구에 있어서는, 표면에 카르보디이미드기 또는 이소시아네이트기를 가지는 기재를 사용하여(미국특허：US5,908,746, 특개평 8-23975호), 고정화하는 것이 바람직하다.
올리고뉴클레오티드를 스포팅(spotting)할 때에, 올리고뉴클레오티드의 스포트량이 너무 적으면, 올리고뉴클레오티드와 프로브와의 사이의 반응성을 충분히 확보할 수 없어, 판정이 곤란하게 되는 경우가 있다. 또한, 고집적도의 스포팅은 기술적인 문제와 동시에 코스트가 들고, 더욱이 프로브의 형광 표지나 화학 발색 등을 이용한 하이브리다이제이션 시그널의 검출에도 보다 정밀하고 고액의 검출 장치(예를 들면, 스캐너)가 필요하다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는, 기판의 표면에 지름 10~1,000㎛의 사이즈로 고정하는 것이 바람직하다. 올리고뉴클레오티드의 기판상에의 스포팅 방법은 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 스포팅 머신을 사용하여 기판상에 올리고뉴클레오티드 용액을 스포팅하는 것에 의해 행할 수 있다. 이것에 의해 올리고뉴클레오티드 용액은, 통상 거의 원형으로 스포팅된다.
(6) 본 발명에 관한 단백질 또는 그 부분 단편을 이용한 검출기구
본 발명에 관한 검출기구는, 본 발명에 관한 단백질에 있어서의 적어도 일부의 아미노산 서열을 프로브로서 이용한 것이다. 즉, 본 발명에 관한 단백질 또는 그 부분 단편(프래그먼트)을 고정화한 검출기구라고 환언할 수 있다. 이러한 검출기구는, 여러 가지의 조건하에 있어서, 본 발명에 관한 단백질과 상호작용하는 물질(폴리펩티드, 핵산, 항체 등)의 검출ㆍ측정 등에 이용할 수 있다.
본 발명에 관한 검출기구로서는, 예를 들면, 본 발명의 단백질을 인식하는 항체와 특이적으로 결합하는 상기 프로브를 기판(담체)상에 고정화한 것 등을 들 수 있다. 프로브로서 이용하는 아미노산 서열은, 본 발명에 관한 단백질 중, 본 발명에 관한 항체와 특이적으로 상호작용하는 부분, 즉, 본 발명에 관한 단백질의 에피토프 보유 펩티드를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 관한 검출기구에 이용하는 기판의 재질로서는, 올리고 펩티드를 안정시켜 고정화할 수 있는 것이면 좋다. 예를 들면, 폴리카보네이트나 플라스틱 등의 합성 수지, 유리 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 기판의 형태도 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 판상, 필름상 등의 기판을 적절하게 이용할 수 있다.
또한, 올리고 펩티드를 기판에 고체화하는 방법은, 종래 공지의 방법을 이용 가능하고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 불용성 담체에 공유결합법이나 흡착법으로 올리고 펩티드를 결합시키는 방법, 올리고 펩티드의 주위를 고분자 물질로 둘러싸는 포괄 고정화법, 가교화제 등을 이용하여 올리고 펩티드를 지지체에 고정화하는 방법 등을 들 수 있다. 또한, 고정화하고 싶은 기판과 올리고 펩티드의 상성(相性), 고정화물의 이용의 목적에 따라서, 최적의 고정화법을 선택할 수 있다.
(7) 본 발명에 관한 유전자, 단백질 등의 유용성
본 발명에 관한 유전자 및 단백질은, 상술한 바와 같이 헤르페스 바이러스의 잠복 감염시에 특이적으로 발현하는 것이며, 상기 단백질은, 뇌내 아스트로사이트 등의 글리아 세포로 발현시키는 것에 의해 숙주의 정신 장애를 유도할 수 있는 기능을 가진다고 생각된다.
더욱이, 흥미로운 지견으로서, 본 발명에 관한 유전자 및 단백질은, 정신 장애 환자와의 관련성을 가진다고 하는 현상이 분명하게 되었다. 보다 상세하게는, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 기분 장애를 중심으로 하는 각종 정신 장애 환자의 약 5할에서, 항SITH-1 항체가 검출되는 한편, 건강자에서는 이 항SITH-1 항체가 거의 검출되지 않았다(건강자에 있어서 항SITH-1 항체가 검출되는 비율은 약 2% 미만).
이와 같이, 본 발명에 관한 단백질의 특이적 항체는, 기분 장애를 중심으로 하는 정신 장애 환자에서만 유의하게 존재하고, 건강자에서는 거의 검출되지 않는다고 하는 현상을 본 발명자는 독자적으로 발견했다. 또한, 본 발명에서 말하는 「정신 장애」란, 정신 장애로는 의식, 지능, 기억, 감정, 사고, 행동과 같은 정신 기능의 장애 때문에, 일상생활 또는 사회생활에 상당한 제한을 받는 상태를 의도한다. 또한, 「기분 장애」란, 지속적인 기분 혹은 감정의 변화로, 비정상으로 억제된 울적한, 또는 고양된 감정을 체험하여, 일상생활 기능이나 사회 기능에 장애를 가져오는 상태를 의도한다.
이와 같은 「본 발명에 관한 단백질의 특이적 항체는, 정신 장애 환자에서만 유의하게 존재하고, 건강자에서는 거의 검출되지 않는다」라고 하는 현상의 상세한 이유는, 해명(解明)을 향해서 현재 열심히 검토중이지만, 본 발명에 관한 단백질은, 잠복 감염이 재활성화를 향해서 유도되는 중간 단계에서 활발하게 산생되는 성질을 가지고 있다. 헤르페스 바이러스(예를 들면, HHV-6)는, 스트레스에 의해서 재활성화가 유도되고, 본 발명에 관한 단백질을 제작하는 것이라고 생각된다. 정신 장애 환자의 약 5할에 해당하는, 본 발명에 관한 단백질에 대한 항체를 가지는 자는, 스트레스나 어떠한 유전적 요인에 의해서, 본 발명에 관한 단백질이 HHV-6의 잠복 감염 세포인 뇌내 아스트로사이트 등의 글리아 세포에서 다량으로 장기간 발현하고 있다고 생각된다. 이 결과, 아스트로사이트 등의 글리아 세포내에서의 칼슘 농도의 상승이 장기간 계속하고, 세라토닌의 대사(代射) 등의 아스트로사이트 등의 글리아 세포의 중요한 기능이 장애되는 것에 의해, 정신 장애가 발증(發症)한다고 생각된다. 또한, 만성 피로 증후군(CFS) 환자의 정신 장애에서 본 발명에 관한 단백질에 대한 항체의 보유율이 높은 이유는, CFS 환자에서는 건강자보다도 다수의 HHV-6이 체내에 잠복 감염하고 있는 경우가 많아, 본 발명에 관한 단백질(SITH-1 단백질)도 산생되기 쉬운 것을 나타내는 것이라고 생각된다. 또한, CFS 환자에서는 건강자보다 다수의 HHV-6이 체내에 잠복 감염하고 있다고 하는 사실은, 지금까지 보고해 온 잠복 감염 특이적 유전자 산물과 CFS 환자의 항체 반응의 결과로부터도 나타난다(비특허문헌 5 참조)
이와 같이, 정신 장애 환자에서만 본 발명에 관한 단백질에 대한 항체가 검출된다고 하는 현상의 상세한 기구는 아직도 분명하지 않지만, 이러한 현상을 이용하는 것에 의해, 정신 장애를 객관적으로 판단하는데 이바지하는 판정 방법이나 진단 방법을 제공할 수 있다. 또한, 동시에 본 발명은, 판정 키트, 진단 키트, 모델 동물의 작성 방법, 약제 스크리닝 방법에도 관한 것이다. 이하, 각 방법에 관하여 상세하게 설명한다.
(7-1) 본 발명에 관한 판정 방법
본 발명에 관한 판정 방법은, 본 발명에 관한 단백질을 인식하는 항체, 즉 상기 (a) 또는 (b)에 기재된 단백질을 인식하는 항체가, 피험 대상 생물중에 존재하는지 여부를 판정하는 방법이면 좋다. 또한, 용어 「피험 대상 생물」이란, 인간 및 인간 이외의 포유류의 동물을 의미한다.
항체에 대한 분석은, 예를 들면, 상기 항체가 인식하는 단백질 또는 그 부분 단편과의 결합 반응에 의해서 검출 가능하다. 즉, 본 판정 방법에서는, 상기 항체가 인식하는 단백질 또는 그 부분 단편을 이용하여, 면역학적으로(항원 항체 반응을 이용하여), 상기 항체가 존재하는지 여부를 판정하는 것이 바람직하다. 또한, 「부분 단편」이란, 적어도 에피토프 보유 펩티드를 포함하는 것이 바람직하다.
본 판정 방법의 일례를 들면, 본 발명에 관한 단백질 또는 그 부분 단편을 고정화한 불용성 담체와, 피험 대상 생물로부터 채취한 생물학적 시료를 접촉시킨 후, 세정하고, 이 불용성 담체상의 단백질 또는 그 부분 단편과 특이적으로 결합한 항체를 검출하는 방법을 들 수 있다. 그리고, 이 불용성 담체상의 단백질 또는 그 부분 단편과 특이적으로 결합한 항체는, 예를 들면, 피험 대상 생물 유래의 항체이기 때문에, 피험 대상 생물의 항체에 대한 특이적 항체, 이른바 2차 항체를 이용하여, 용이하게 검출 가능하다. 그 때, 2차 항체에 염료, 효소 또는 방사성 또는 형광 표지를 포함하여, 검출을 증강하는 것에 의해, 검출이 보다 한층 용이하게 된다.
즉, 본 판정 방법에 이용되는 항체 분석(antibody assays)으로서는, 형광 항체법, 도트블롯분석법(dot blot assay), 웨스턴 블롯법(western blotting technique), 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA, 샌드위치 ELISA법을 포함한다), 방사성 이뮤노분석법(radioimunoassay)(RIA), 및 면역 확산 분석법과 같은 전통적인 면역 조직학적 방법을 이용한 분석법을 들 수 있다. 이들의 분석은, 분자의 고정화 및 검출을 위해서 아비딘(abidin) 및 비오틴(biotin)과 같은 분자를 이용하지만, 이들의 시약을 조제하는 기술 및 그것을 사용하는 방법은, 당업자에게 공지의 기술을 이용 가능하다. 또한, 본 판정 방법의 결과로서, 병리학 시험을 위한 조직 절편의 면역 조직학적 염색이 얻어진다.
또한, 본 판정 방법은, 피험 대상 생물로부터 분리된 생물학적 시료를 이용하여 행해지는 것이 바람직하다. 용어 「분리된 생물학적 시료」란, 피험 대상 생물로부터 채취된 세포, 조직 또는 그 파편 등을 포함하는 시료이면 좋고, 말초혈, 타액, 소변, 변 이외, 세포 샘플 등, 특별히 한정되지 않지만, 헤르페스 바이러스가 말초혈 중의 매크로 파지에 있어서도 잠복 감염한다고 하는 사실로부터, 피험 대상 생물로부터 채취한 말초혈을 이용하는 것이 특히 바람직하다. 이 경우, 더욱이 피험 대상 생물의 침습도가 낮다고 하는 이점도 있다.
생물학적 시료(샘플) 중에 존재하는 항체의 양은, 예를 들면, 직선 회귀 컴퓨터 알고리즘을 사용하여, 표준적인 조제물(예를 들면, 건강자의 표준 시료 혹은 전형적인 정신 장애 환자의 표준 시료) 중에 존재하는 양과의 비교에 의해서 간단하고 쉽게 산출될 수 있다. 항체를 검출하기 위한 이와 같은 분석법은, 예를 들면, ELISA에 관해서, Iacobelli 등, Breast Cancer Research and Treatment 11:19-30 (1988)에 기재되어 있다.
적절한 효소 표지로서는, 예를 들면, 기질과의 반응에 의한 과산화수소의 생성을 촉매하는 옥시다아제군 유래의 것을 들 수 있다. 글루코스옥시다아제는, 그것이 양호한 안정성을 가지고, 그리고 그 기질(글루코오스)이 용이하게 입수할 수 있기 때문에, 특히 바람직하다. 옥시다아제 표지의 활성은, 효소-표지 항체/기질 반응에 의해서 형성되는 과산화수소의 농도를 측정하는 것에 의해서 분석될 수 있다. 효소에 더하여, 다른 적절한 표지로서 방사성 동위 원소(예를 들면, 요오드(125I, 121I), 탄소(14C), 유황(35S), 토릴튬(3H), 인듐(112In), 및 테크네튬(99mTc)), 및 형광 표지(예를 들면, 플루오레세인 및 로다민) 및 비오틴을 들 수 있다.
피험 대상 생물로부터 얻어지는 생물학적 시료중의 항체(본 발명에 관한 단백질에 대한 항체) 레벨은, 상술한 이뮤노분석법 이외에도, 예를 들면, 화상 해석에 의해서 in vivo로 검출될 수 있다. 즉, 본 발명에 관한 단백질에 대한 항체도 단백질이라는 사실 때문에, 상기 항체를 특이적으로 인식하는 항체를 이용하는 것에 의해, 피험 대상 생물로부터 얻어지는 생물학적 시료중의 항체(본 발명에 관한 단백질에 대한 항체) 레벨을 화상 해석에 의해서 in vivo로 검출할 수 있다.
항체의 in vivo에서의 화상 해석을 위한 항체 표지 또는 마커로서, X선 촬영법, NMR, 또는 ESR에 의해서 검출 가능한 것을 들 수 있다. X선 촬영법에 관해서는, 적절한 표지로서, 검출 가능한 방사선을 방사하지만, 피검체에 대해서 분명하게는 유해하지 않은, 바륨 또는 세슘과 같은 방사성 동위 원소를 들 수 있다. NMR 및 ESR을 위한 적절한 마커로서, 관련된 하이브리도마의 영양분의 표지에 의해서 항체중에 도입될 수 있는, 중수소와 같은 검출 가능한 특징적인 회전을 가지는 것을 들 수 있다.
방사성 동위 원소(예를 들면, 131I, 111In, 99mTc), 방사성 불투과체(radio-opaque) 기질, 또는 핵자기 공명에 의해서 검출 가능한 물질과 같은 적절한 검출 가능한 화상 해석 부분에서 표지되어 있는, 본 발명에 관한 단백질에 대한 항체의 특이적 항체 또는 항체 프래그먼트가, 장애에 관해 시험되는 포유동물 중에(예를 들면, 비경구적, 피하, 또는 정맥내) 도입된다. 피검체의 크기 및 사용되는 화상 해석 시스템에 의해서, 진단용의 화상을 일으키기 위해서 필요하게 되는 화상 해석 부분의 양이 결정되는 것이, 당해 분야에서 이해된다. 방사성 동위 원소 부분의 경우, 인간 피검체에 관해서는, 주사되는 방사 활성의 양은, 통상 약 5~20밀리퀴리의 범위의 99mTc이다. 뒤이어, 표지 항체 또는 항체 프래그먼트는, 본 발명에 관한 단백질에 대한 항체를 포함하는 세포의 위치에 우선적으로 축적한다. 또한, in vivo로의 종양의 화상 해석에 관해서는, S. W. Burchiel 등, 「Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments」(Tumer Imaging 제13장:The Radiochemical Detection of Cancer, Burchiel, S. W. 및 Rhodes, B. A. 편, Masson Publishing Inc.(1982))에 기재되어 있다.
본 발명에 있어서 이용 가능한 표지에 관해서, 구체적인 예를 이하에 나타낸다. 적절한 효소 표지의 예로서는, 말산디히드로게나제, 스타피로콕쿠스뉴클레아제(staphylococcus nuclease), 효모알코올디히드로게나제, α-글리세롤인산디히드로게나제, 트리오스인산이소머라제, 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼린포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스옥시다아제, β-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코오스-6-인산디히드로게나제, 글루코아밀라제, 및 아세틸콜린에스테라제를 들 수 있다.
적절한 방사성 동위체 표지의 예로서는, 3H, 111In, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd 등을 들 수 있다. 111In는, in vivo로의 이미징이 이용되는 경우에 바람직한 동위체이다. 왜냐하면, 이것은, 125I 또는 131I로 표지한 모노클로날 항체의 간장에 의한 탈할로겐화의 문제를 회피하기 때문이다. 더욱이, 이 방사성 핵종은, 이미징을 위해서 보다 바람직한 γ 방출 에너지를 가진다(Perkins 등, Eur. J. Nucl. Med. 10:296-301 (1985)；Carasquillo 등, J. Nucl. Med. 28:281-287(1987)). 예를 들면, 1-(P-이소티오시아네이트벤질)-DPTA를 이용하여 모노크로날 항체에 커플링한 111In은, 비종양성 조직(특히 간장)에 있어서의 취입(uptake)을 거의 나타내 보이지 않았다. 그러므로, 종양 국재화(局在化)의 특이성을 증강한다(Esteban 등, J. Nucl. Med. 28:861-870(1987)).
적절한 비방사성 동위체 표지의 예로서는, 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr, 및 56Fe를 들 수 있다.
적절한 형광 표지의 예로서는, 152Eu 표지, 플루오레세인 표지, 이소티오시아네이트 표지, 로다민 표지, 피코에리트린 표지, 피코시아닌 표지, 아로피코시아닌 표지, o-프탈알데히드 표지, 및 플루오레사민 표지를 들 수 있다.
적절한 독소 표지의 예로서는, 디프테리아 독소, 리신, 및 콜레라 독소를 들 수 있다.
화학 발광 표지의 예로서는, 루미날 표지, 이소루미날 표지, 방향족 아크리디늄에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄염 표지, 옥살산에스테르 표지, 루시페린 표지, 루시페라제 표지, 및 에크오린 표지를 들 수 있다.
핵자기공명 콘트라스트제의 예로서는, Gd, Mn, 및 Fe와 같은 중금속 원자핵을 들 수 있다.
상기의 표지를 항체에 결합하기 위한 대표적인 기술은, Kennedy 등(Clin. Chim. Acta 70:1-31(1976)) 및 Schurs 등(Clin. Chim. Acta 81:1-40(1977))에 의해 제공된다. 후자에 있어서 언급되는 커플링 기술은, 글루타르알데히드 방법, 과요오드산 방법, 디말레이미드 방법, m-말레이미드벤질-N-히드록시-숙신이미드에스테르 방법이며, 이들의 방법은 모두 본 명세서 중에 참고로서 원용된다.
(7-2) 진단 방법
본 발명에 관한 진단 방법은, 상기의 판정 방법을 이용하고 있으면 좋고, 그 외의 구체적인 구성, 조건 등은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 피험대상의 환자 또는 피험동물에 있어서, 본 발명에 관한 항체가 존재하는 것을 지표로 하여, 당해 피험대상의 환자 또는 피험동물이 정신 장애에 이환(罹患)하고 있다고 판정할 수 있다. 또한, 본 발명에 관한 항체의 정량치를 지표로서 진단하는 경우, 건강자에 있어서의 정량치(정상치)나 전형적인 정신 장애 환자의 정량치(질환치)를 참고로 하여 적절한 역치를 설정하고, 상기 역치를 상회하는지, 또는 하회하고 잇으면, 정신 장애일 가능성이 높다고 진단할 수도 있다. 본 발명에서는, 정신 장애의 발증에 의해서 상기 항체의 양이 증가하기 때문에, 예를 들면, 건강자에 있어서의 정량치(정상치)를 역치로서 설정하는 경우, 피험자의 측정치가 이 역치를 상회하고 있으면, 정신 장애일 가능성이 높다고 판정할 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서, 용어 「피험자」란 인간을 의미하고, 「피험동물」이란 인간 이외의 동물을 의미하며, 예를 들면 마우스, 래트, 및 원숭이 등이 포함되지만, 인간 이외의 동물이면, 임의의 동물이 「피험동물」이 될 수 있다.
따라서, 본 진단 방법에 의하면, 간편하고 정확하게 피험 대상 생물이 정신 장애인지 아닌지, 또는 피험 대상 생물이 정신 장애로 이환할 가능성이 있는지 여부를 진단할 수 있다. 또한, 피험동물에 대한 진단 방법은, 예를 들면, 정신 장애의 치료약을 개발할 때의 약제 스크리닝이나 약제 효과를 시험하기 위한 동물 실험등에 매우 유용할 것이다.
(7-3) 판정 키트, 진단 키트
본 발명에 관한 판정 키트 또는 진단 키트는 각각, 상기 (7-1)란에서 설명한 판정 방법 또는 상기 (7-2)란에서 설명한 진단 방법을 실시하기 위한 것이면 좋고, 이것에 포함되는 구체적인 구성, 재료, 기기 등은, 특별히 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는, 본 발명에 관한 항체를, 면역학적으로 검출하기 위해서, 이하의 (i)~(iii)의 몇가지의 물질이 포함되어 있는 것이 바람직하다. (i) 본 발명에 관한 단백질, (ii) (i)의 부분 단편(에피토프 보유 펩티드를 포함하는 것이 바람직하다), (iii) (i) 또는 (ii)를 고정화한 검출기구.
상기와 같은 구성의 키트에 의하면, 본 발명에 관한 판정 방법 또는 진단 방법을 간편하고 또한 확실하게 실시할 수 있기 때문에, 매우 유용하다.
또한, 상기의 구성 이외에도, 상기 판정 방법 또는 진단 방법의 각 공정을 실시하기 위한 물질이 포함되어 있어도 좋다. 예를 들면, 피험 대상 생물로부터 시료를 채취하기 위해서, 예를 들면, 말초혈을 채혈하기 위한 기기로서, 슈린지(주사기) 등이 포함되어 있어도 좋고, 또한, 본 판정 방법이나 진단 방법을 실시하기 위해서 필요한 것, 예를 들면, 각종 시약(예를 들면, ELISA 등의 면역학적 반응을 행하기 위해서 이용하는 시약류 등)이나 실험기구를 들 수 있다. 또한, 상기 판정을 보다 간편하고 정확하게 행하기 위해서 필요한 각종 연산장치(예를 들면, 컴퓨터 등)나 소프트웨어가 포함되어 있어도 좋다.
(7-4) 모델 동물의 작성 방법, 판정법, 스크리닝 방법, 평가 방법
본 발명의 진단 방법은, 인간을 제외한 정신 장애의 모델 동물의 작성법, 유용성을 판정하는 방법, 및 이와 같은 모델 동물을 이용한 약물 스크리닝에 있어서, 약물의 유효성을 판정하는 방법에 응용할 수 있다. 즉, 정신 장애의 모델 동물의 작성의 경우에는, 실시예에도 있는 바와 같이, 벡터 등을 이용하여 동물의 뇌내에 SITH-1 단백질을 도입하여 작성할 수 있다. 또한, 정신 장애의 모델 동물의 유용성을 판정하는 경우에는, 상기 판정 방법이나 진단 방법과 동일하게, 본 발명에 관한 항체의 유무에 근거하여, 피험동물이 정신 장애를 발병하고 있는지 여부를 판단하고, 상기 동물이 정신 장애를 발병하고 있으면, 정신 장애의 모델 동물로서 유용하다고 판정할 수 있다.
상기 각종 방법에 있어서는, 지금까지 알려져 있는 동물의 행동 이상이나 경악 반응 등을 이용한 진단 방법을 함께 평가 수법으로서 이용하는 것이 더욱 바람직하다. 구체적으로는, 동물 실험의 진단은, 미현수 테스트나 강제 수영 테스트 등의 행동 비정상에 관한 시험이나, 경악 반응 등의, 기존의 뇌기능 시험을 사용할 수 있다.
또한, 여기에서 말하는 「피험동물」이란, 인간 이외의 동물이면 좋지만, 특히 실험동물로서 적절한 마우스, 래트, 몰모트, 개, 토끼, 원숭이, 침팬지 등이 바람직하다. 인간 이외의 동물에서는, 정신 장애의 판정(진단)은, 더욱 곤란하므로, 상기 방법은 지극히 유용하다고 말할 수 있다. 더욱이, 이와 같은 모델 동물에, 향정신약 또는 항정신병약(정신 장애를 치료 또는 개선하는 약제)의 후보 물질을 투여한 후, 행동 이상의 검사에 더하여, 상기와 같이 본 발명에 관한 항체를 검출하고, 정신 장애가 치유 또는 개선되고 있으면, 상기 후보 물질은 항정신 장애 작용을 가지고 있다고 판단할 수 있다. 즉, 본 발명의 진단 방법을 이용하면, 향정신약의 후보 물질을 용이하고 확실하게 스크리닝할 수 있다. 여기에서 말하는 「향정신약의 후보 물질」은, 시험자가 소망하는 임의의 물질일 수 있다.
또한, 본 발명의 판정 방법 또는 진단 방법 등의 주제는, 헤르페스 바이러스의 잠복 감염시에 특이적으로 발현하는 단백질에 대한 항체를 검출하는 것에 의해서, 정신 장애의 이환(罹患)의 유무를 판정하기 위한 객관적인 판정 방법을 제공하는 것에 존재하고 있어서, 본 명세서 중에 구체적으로 기재한 개개의 조작에 존재하는 것은 아니다. 따라서, 상기 각 조작 이외의 조작을 이용한 판정 방법이나 진단 방법도 본 발명의 범위에 속하는 것에 유의해야 한다.
추가하여, 헤르페스 바이러스의 감염은, 실시예에도 있는 CFS 등의 면역 부전을 수반하는 질환(예를 들면, 클론병 등의 자기면역 질환 등)이나 약제성 과민증 증후군 등의 HHV-6이 관계한다고 말해지고 있는 피부 질환이나 HHV-6에 의한 뇌염ㆍ뇌증(腦症)과의 관련성도 고려되기 때문에, 이들의 질환에 관해서도 객관적으로 진단ㆍ평가할 수도 있다고 생각된다.
즉, 본 발명에 관한 단백질 및 유전자 등을 이용하는 것에 의해, 이것을 HHV-6의 관여가 시사되는 여러가지 질환의 질환 마커로서 이용할 수 있다.
또한, 본 발명에는, 상술한 본 발명에 관한 유전자, 당해 유전자 산물(예를 들면, 유전자에 코드되는 단백질) 또는 당해 유전자를 가지는 재조합 발현 벡터를 도입하여 이루어지는 모델 동물도 포함된다. 상술한 바와 같이, 본 발명에 관한 유전자는, 정신 장애와 관련하는 것이기 때문에, 본 유전자, 본 유전자 산물(예를 들면, 유전자에 코드되는 단백질 등), 또는 본 유전자를 가지는 재조합 발현 벡터를 도입하여 이루어지는 모델 동물은, 정신 장애의 증상을 나타낸다. 이러한 정신 장애의 증상으로서는, 예를 들면, 정신 장애의 증상은, 조울증과 같은(manic-depressive-like) 증상, 조증 같은(mania-like) 증상, 울증 같은(depression-like) 증상 외에, 검사법에 따라서는 통합 실조증(정신 분열병) 같은(schizophrenia-like) 증상을 들 수 있다.
대상으로 되는 동물은, 실험동물로서 이용 가능한 것이면 특별히 한정되는 것이 아니고, 특히 포유동물이 바람직하고, 예를 들면, 마우스, 래트, 원숭이 등을 들 수 있다.
또한, 상기 유전자, 유전자 산물 및 재조합 발현 벡터의 도입 방법은 종래 공지의 수법을 이용할 수 있고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 당해 단백질의 뇌내에의 발현 방법은, 아데노바이러스 벡터를 이용한 방법도 레트로 바이러스 벡터를 이용한 방법도 가능(후술하는 실시예 참조)하고, 물론, 이것 이외의 벡터를 이용하는 수법도 가능하다. 또한, 일반적인 트랜스 진(트랜스제닉 마우스 작성)에 의한 유전자 도입을 이용해도 좋다. 더욱이, 당해 단백질을 직접 뇌내에 접종하는 방법도 좋다.
이와 같은 정신 장애의 모델 동물은, 정신 장애의 치료법의 검토, 약제의 효과의 검토, 판정, 약제 이외의 치료 방법(온열 요법 등)의 평가 등에 적절하게 이용할 수 있어 매우 유용하다.
더욱이, 정신 장애의 발증 요인에 관한 요인의 검토도 가능하다. 예를 들면, 피로나 스트레스가 어느 정도 정신 장애의 유도에 기여할지 여부를 검토하는 것에 의해, 정신 장애의 발증 예방의 연구에도 이용할 수 있다.
이하 실시예를 나타내고, 본 발명의 실시의 형태에 관하여 더욱 상세하게 설명한다. 물론, 본 발명은 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니고, 세부에 관해서는 여러가지 태양이 가능하다는 것은 말할 나위도 없다. 더욱이, 본 발명은 상술한 실시 형태로 한정되는 것은 아니고, 청구항에 나타낸 범위에서 여러 가지의 변경이 가능하고, 각각 개시된 기술적 수단을 적절히 조합하여 얻어지는 실시 형태에 관해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
[실시예]
<1. 잠복 감염 단백질 SITH-1을 코드하는 유전자 산물(mRNA)의 동정>
　비특허 문헌 1에 나타낸 HHV-6이 잠복 감염하고 있는 매크로 파지로부터 메신저 RNA(mRNA)를 분리하고, 랜덤 프라이머 및 sense transcripts의 역전사용 프라이머로서 IE4RB를, anti-sense transcript의 역전사용으로 프라이머 IE2FB를 이용하여 역전사 반응을 행했다. 그 후 역전사 산물(cDNA)을, 프라이머 IE4RB와 IE2FB를 이용하여 PCR법으로 증폭하고, 그 산물을 내측의 프라이머 IE4RA와 IE2FA를 이용하여 double-nested PCR법으로 증폭했다. 도 1에, 공지인 증식 감염시의 mRNA와 Sense transcript(H6LT)와, 신규 잠복 감염 특이적 유전자의 위치 관계 및 잠복 감염 특이적 단백질 SITH-1의 open reading fram을 나타낸다. SITH-1 및 신규 잠복 감염 특이적 유전자의 시퀀스 정보는, 서열목록 참조.
그 결과, HHV-6이 증식 감염하고 있는 MT-4 세포에서 발현하고 있는 mRNA로부터 증폭되는 351bp의 산물과도, 비특허 문헌 3에 나타낸, HHV-6의 매크로 파지(MΦ)에서의 잠복 감염시에 검출되는 잠복 감염 특이적 유전자 산물(HHV-6 latency-associated transcript：H6LT)로부터 증폭되는 351bp의 산물과도 다른 925bp의 산물이 증폭되었다.
이것은, HHV-6 DNA로부터의 증폭 산물 1241bpt와도 다르고, HHV-6 잠복 감염 세포의 anti-sense transcript의 역전사 산물만으로부터 증폭되는 것으로부터, 지금까지 알려지지 않았던 신규의 잠복 감염 특이적 유전자 산물인 것이 나타났다(도 2 참조). 도 2 중, "R"은 랜덤 프라이머를 나타내고, "S"는 sense transcript를 나타내고, "anti-S"는 anti-sense transcript를 나타낸다.
이 신규 잠복 감염 특이적 유전자 mRNA의 구조를 결정하기 위해서, 5'-rapid amplification of cDNA ends(RACE)법과 3'-RACE법을 실시하여, 5'-말단과 3'-말단을 결정함과 동시에, 전체의 염기 서열도 결정했다(도 3 참조).
IE4RB: 5' GATGCTCCTTCTTCCACATTACTGG 3'
IE2FB: 5' CATCCCATCAATTATTGGATTGCTGG 3'
IE2FA: 5' GAAACCAC-CACCTGGAATCAATCTCC 3'
IE4RA: 5' GACACATTCTTGGAAGCGATGTCG 3'
N1: 5' GCTGGGTAGTCCCCACCTTTCTAGA 3'
αF1: 5' CTGAAGCATGTAAGCACATCTCTTGC 3'
αR1: 5' GCTTCGAGATCAGTAGTGGTACG 3'
<2. 신규 잠복 감염 특이적 유전자 단백질 SITH-1의 기능 해석>
단백질 SITH-1의 기능을 검토하기 위해서, 단백질 SITH-1이 세포내에서 결합하는 숙주 단백질의 동정을 행했다. 방법으로서는, 단백질 SITH-1을 bait로 하여, Yeast Two-hybrid법으로 사람 태아뇌 cDNA 라이브러리의 스크리닝을 행했다. 이 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4 중, A는, SITH-1과 CAML의 결합에 의해, 강한 β-갈락토시다제 발현을 볼 수 있던 yeast의 클론이다. B는, in vitro의 pull-down assay에 의해, 대장균으로 발현시킨 GST-SITH-1 융합 단백질에 의해, 대장균으로 발현시킨 CAML이 공침시킬 수 있던 것을, 웨스턴 블롯과 항CAML 항체의 염색에 의해 확인한 도면이다. C는, 293 T세포에 FLAG 태그를 붙인 SITH-1과 CAML를, 발현 벡터를 이용하여 도입하고, 항CAML 항체에 의해서 SITH-1을 공침시킬 수 있던 것을, 웨스턴 블롯과 항FLAG 항체의 염색에 의해 확인한 결과를 나타내는 도면이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 단백질 SITH-1이 칼슘-시그널 모듈레이팅 시클로필린 리간드와 강하게 결합하는 것이 표시되었다(도 4).
CAML은, 임파구나 뇌내에서 강하게 발현하는 것이 보고되어 있는 단백질로, 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 기능을 가지는 것이 알려져 있다. 따라서, 단백질 SITH-1이 CAML를 개재시켜 세포내 칼슘 농도를 상승시킬지 여부를 검토했다. 구체적으로는, SITH-1을 발현시킨 아스트로 사이트 모양 글리아 세포주(U373)와 미처리의 U373 세포를 항SITH-1 항체와 항CAML 항체를 이용하여 형광 항체법으로 염색했다. 그 결과, 아스트로 사이트 세포주(U373)에 단백질 SITH-1을 발현시키면, 미처리의 U373 세포에 비하여 CAML의 양이 증가하는 것이 관찰되었다(도 5). 또한, U373 세포에 있어서의 CAML 발현 레벨은, 미처리에서는 그다지 강하지 않지만, SITH-1을 발현시키는 것에 의해, CAML의 양이 증가하는 것이 관찰되었다.
또한, SITH-1을, 레트로 바이러스 벡터를 이용하여 아스트로 사이트 모양 글리아 세포주(U373)에 도입한 것과, 벡터만을 도입한 것을, 타프시가르긴(TG)으로 자극하고, Fura2를 이용하여 세포내 칼슘 농도를 측정했다. 그 결과, 실제로 세포내 칼슘 농도를 측정하면, SITH-1을 발현하고 있는 아스트로 사이트의 세포내 칼슘 농도가 타프시가르긴(TG) 자극에 의해서, 벡터만을 도입한 세포에 비해 현저하게 상승하는 것이 판명되었다(도 6).
이들의 결과로부터, 단백질 SITH-1은, 단백질 HHV-6의 잠복 감염시에 발현하고, 세포내 CAML의 양을 증가시키는 것에 의해, 아스트로 사이트 모양 글리아 세포주의 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 기능을 가지는 것이 판명되었다.
<3. SITH-1과 정신 장애와의 관계>
다음에, SITH-1과 정신 장애와의 관계를 조사했다. 그 결과를 도 7에 나타낸다. SITH-1에 대한 항체는, 비특허 문헌 5 등에서 보고되어 온 잠복 감염 유전자 단백질과는 다르고, 만성 피로 증후군 환자 그 자체와의 관련성은 낮았지만, 정신 장애를 가지는 환자에서는 높은 비율로 항체 보유자가 존재했다. 정신 증상을 수반하는 만성 피로 증후군(CFS) 환자는, 주로 울(鬱)증상을, 소아의 CFS 환자는 주로 이상한 흥분성을 나타내는 경우가 많았다. 쌍극I형은, 증상이 강한 조울증 환자를 나타낸다. 또한, 정상 성인은 SITH-1에 대한 항체를 거의 보유하지 않았다. 또한, 항체가는, SITH-1을 발현시킨 293T세포를 항원으로 하여, 형광 항체법으로 측정했다.
<4. SITH-1 발현에 의한 정신 장애 모델 마우스의 작성>
SITH-1의 open reading frame 상류에 아스트로 사이트 등의 글리아 세포로 특이적으로 발현하는 glial fibrillary acidic protein(GFAP) 프로모터를 부가한 것을, 아데노 바이러스 벡터 또는 레트로 바이러스 벡터를 이용하여, 생후 얼마 안되는 마우스의 뇌내에 주사했다. 약 4~5주 후에 마우스의 행동을 관찰하여, SITH-1 도입에 의한 정신 장애 모델 마우스의 성립을 확인했다.
정신 장애에 관한 테스트는, 우울증이나 조울증 등의 관찰에 잘 이용되는, 미(ii)를 테스트와 강제 수영 테스트에 의한 검토를 행했다. 구체적으로는, 우선, SITH-1을, 아데노 바이러스 벡터를 이용하여 도입한 마우스의 미현수 테스트를 행했다. 그 결과, SITH-1 도입 마우스에서는, 무동(無動)시간이 현저하게 감소하고 있어, 이 마우스가 조(躁)상태인 것이 판명되었다(도 8). 뒤이어, SITH-1을, 레트로 바이러스 벡터를 이용하여 도입한 마우스의 강제 수영 테스트를 행했다. 그 결과, SITH-1 레트로 바이러스 벡터를 고역가(high)로 도입한 것에서는, 컨트롤로서 enhanced green fluorescence protein(EGFP) 유전자를 도입한 것에 비해 무동시간이 연장하고 있어, 우울상태로 되어 있는 것을 나타낸다. 이것에 대해, SITH-1 레트로 바이러스 벡터를 저역가(low)로 도입한 것에서는, 무동시간이 단축하고 있어, 조상태가 되어 있는 것이 판명되었다(도 9). 즉, 미현수 테스트에서 조상태가, 강제 수영 테스트에 의해서 조상태와 우울상태가 관찰되었다. 또한, SITH-1을 도입했을 때의 레트로 바이러스 벡터의 역가에 의해서 조상태와 우울상태의 양쪽이 관찰되는 것은, 이 모델이 우울증과 조울증의 양쪽의 모델이 될 수 있는 것을 나타낼 뿐만 아니라, SITH-1의 발현량이 정신 장애의 증상에 영향을 주는 일도 시사되었다.
또한, 조울증이나 통합 실조증에 있어서 이상이 보이는 경악 반응의 이상을 Prepulse inhibition을 측정함으로써 검토했다. 구체적으로는, SITH-1을, 아데노 바이러스 벡터를 이용하여 도입한 마우스의 경악 반응(Prepulse inhibition)을 조사했다. 그 결과, (ii)를에 나타낸 바와 같이, SITH-1 도입 마우스에서는, Prepulse inhibition이 현저하게 감소하고 있어, 마우스가 자극에 대해 상당히 과민하게 되어 있는 것이 판명되었다. 따라서, 경악 반응에 있어서도 현저한 이상이 관찰되어, SITH-1이 정신 장애에 관계하는 뇌기능에 큰 영향을 주는 것이 나타났다.
<5. SITH-1 발현에 의한 정신 장애 모델 마우스의 작성 2>
다음에, SITH-1의 open reading frame을, GFAP 프로모터하에 연결하고, 아데노 바이러스 벡터를 이용하여, 마우스의 글리아 세포로 발현시켜, 3주일 후에 Wheel running activity(활차 회전)로 자발 운동량을 측정했다. 결과를 도 11에 나타낸다.
동 도면에 나타낸 바와 같이, SITH-1을 발현시킨 마우스는, 컨트롤로서 EGFP(enhanced green fluorescence protein)를 발현시킨 마우스에 비하여 자발 운동이 항진하여, 조상태로 되는 경향을 나타냈다.
<6. SITH-1 발현에 의한 정신 장애 모델 마우스의 작성 3>
뒤이어, SITH-1의 open reading frame을, GFAP 프로모터하에 연결하고, 렌티 바이러스 벡터를 이용하여, 마우스의 글리아 세포로 발현시켜, 8주일 후에 Wheel running activity(활차 회전)로 자발 운동량을 측정했다. 그 결과를 도 12에 나타낸다.
동 도면에 나타낸 바와 같이, SITH-1을 발현시킨 마우스는, 컨트롤로서 EGFP(enhanced green fluorescence protein)를 발현시킨 마우스에 비하여 자발 운동량이 억제되고, 우울상태로 되는 경향을 나타냈다.
이들 도 11과 도 12에 나타낸 바와 같이, 동일한 SITH-1이 조상태와 우울상태라는 반대의 현상을 나타내는 것을 알 수 있었다. 이 이유로서는, 1) 아데노 바이러스 벡터에서는 SITH-1의 발현량이 렌티 바이러스 벡터보다 많고, 2) 렌티 바이러스 벡터의 쪽이 SITH-1을 장기간 발현시킬 수 있기 때문에, SITH-1이 장기간 발현한 영향을 관찰하고 있다고 하는 차이가 고려된다.
이들 SITH-1 발현에 의해서 조상태와 우울상태의 모델 마우스를 작성할 수 있다고 하는 사실은, SITH-1에 대한 항체가 조울병 환자와 우울증 환자의 양자로부터 검출된다고 하는 임상적인 결과와, 잘 일치하는 결과라고 말할 수 있다.
<7. SITH-1을 지표로 한 진단>
SITH-1에 의한 진단이, 우울증을 병발하는 다른 질환의 진단에도 유용한 것을 조사했다. 그 결과를 도 13에 나타낸다.
동 도면에 나타낸 바와 같이, 항SITH-1 항체에 의한 진단은, 우울증, 조울증, 만성 피로 증후군과 같은 기분 장애에 매우 특이적이지만, 지금까지의 검토로, 예외적으로, 크론병 환자에 있어서도 높은 양성율을 나타낸다. 유사한 질환인 궤양성 대장염에서는 양성을 나타내지 않았다.
다만, 크론병은, 매우 「우울증상」의 합병이 많은 질환인 것이 알려져 있고, 도 13 중의 항SITH-1 항체 양성자는, 크론병 자체가 중증으로, 우울증상의 합병을 일으킨 예이다. 이 예는, 자기면역 질환으로 분류되는 만성 질환인 크론병 환자에서, 우울증상을 나타내는 중증예에서도, SITH-1에 의한 「우울증」의 진단이 가능한 것을 나타내는 예이며, 항SITH-1 항체에 의한 검사가, 「본래 정신과 질환이 아닌 다른 질환에 의해서도 초래되는, 우울증의 진단에도 유용하다」는 것을 나타내는 것이다고 생각된다.
[산업상 이용가능성]
이상과 같이, 본 발명에 관련되는 유전자 및 단백질은, 헤르페스 바이러스의 잠복 감염에 관여하는 인자이며, 이것을 지표로 하는 것에 의해, 정신 장애의 이환의 유무에 관하여 객관적인 판정을 행할 수 있다. 이 때문에, 본 발명은, 학술적ㆍ기초연구적으로 가치가 있을 뿐만 아니라, 임상 의학적으로도 매우 가치가 있는 것이다. 따라서, 여러가지 면에서 산업상의 이용 가능성이 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Virus Ikagaku Kenkyusho Inc. <120> FACTOR INVOLVED IN LATENT INFECTION WITH HERPESVIRUS, AND USE THEREOF <130> SK0843 <140> PCT/JP2008/067300 <141> 2008-09-25 <150> JP2007-250461 <151> 2007-09-27 <160> 10 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 159 <212> PRT <213> Human herpesvirus 6 <400> 1 Met Gly Tyr Glu Glu Lys Val Ser Ala Thr Gly Lys Thr Arg Leu Lys 1 5 10 15 Ile Leu Ala Cys Leu Ile Val Leu Ile Leu Ala Ala Ala Ile Thr Met 20 25 30 Leu Thr Leu Glu Ile Ile Ser Asn Gln Lys Arg Thr Thr Thr Asp Leu 35 40 45 Glu Ala Val Thr Val Ala Leu Lys His Val Ser Thr Ser Leu Ala Ser 50 55 60 Cys Thr Glu Ser Thr Thr Ser Val His Thr Asp Ser Val Thr Ser Gln 65 70 75 80 Pro Thr Lys Asn Lys Glu Ser Arg Lys Lys Ile Glu Gly Lys Ser Pro 85 90 95 Ser Trp Val Gln Ala Leu Thr Thr Ala Ser Gly Ile Ile Leu Leu Phe 100 105 110 Cys Ile Met Met Ile Phe Ile Thr Cys Ser Trp Thr Thr Glu Lys Asp 115 120 125 Thr Glu Lys Ser Glu Val Gln Ser Tyr Ala Ser Ser Val Glu Thr Leu 130 135 140 Asp Ser Leu Asn Glu Ala Ile Ile Pro Lys Thr Glu Met Asn Val 145 150 155 <210> 2 <211> 480 <212> DNA <213> Human herpesvirus 6 <400> 2 atgggatatg aagaaaaagt gtcagctact ggaaagactc gtttaaagat actggcatgt 60 ctgatcgttt taatactagc tgcggcaata actatgttaa cgctggaaat tatatcgaac 120 caaaaacgta ccactactga tctcgaagct gtgactgtgg cgctgaagca tgtaagcaca 180 tctcttgcca gctgcactga atccactact tctgtacata ccgattctgt gacgagccaa 240 cccacgaaaa acaaagaatc gaggaaaaaa attgaaggga aatctccaag ttgggttcag 300 gctttaacta cagcatctgg aattatccta ctgttttgta taatgatgat attcattaca 360 tgttcctgga ccacagaaaa agatacagag aagagtgaag tgcaatctta tgcttcttca 420 gtagagactt tagactcttt aaatgaggct attataccga aaactgaaat gaatgtgtaa 480 <210> 3 <211> 1795 <212> DNA <213> Human herpesvirus 6 <400> 3 aggctctgct ggaggctctg ctggaggcct tgctgaaggc tctgctggag gccctgctgg 60 aggtcttgct ggaggctctg ctggaggctc tgctggaggc tctgctggag gctctgctgg 120 aggctctgct ggaggctctg ctggaggctc tgtcagagac ctcggtgaaa gttttactca 180 gaggtttatc agagttttcg ccattagttt ggttagaagt ttcagattta ttttcggtgg 240 aactgcagtt aggtttcatg tcagtacatt catcaccgtt agaagtgcta ttcatggtgc 300 tgttgccact gttggatttg ttaaaagcag taaatgagct aggattggaa tgactccgaa 360 tagctaataa atttgagcat tttcttcgaa tggatcataa tcagagggat agccatctaa 420 tttaaagact tccattttat cactgttgca atcacttcta atggagtatc tggatacatt 480 ttttctacat ctttttcatc ccctccaaca tggatctgtg cagcgttaat aagccagcgg 540 agttaattaa atcgtcttcc atgttagaca gttcctgttt catggcagcc ttcactgatg 600 caccaatact ttggatgcaa gtgccaacgg actgagctag gatgtaaaag aagatattct 660 aattttgaat tcttcagatg ctccttcttc cacattactg gaataggaca cattcttgga 720 agcgatgtcg ttggaagact ctgggatgaa aagatcacag gcttccagtt ctggaaaaag 780 caggctttca aaggacacat cacacttgag actctcttcc aatatttctt tgatggattc 840 ttccaccact ggatcgggat ggtagctata tatactatat aaggagatta ccaccaccac 900 ctctttcttt gcagagatta ttctctgctt gaaaatctgt aacactgatc atgatgggat 960 atgaagaaaa agtgtcagct actggaaaga ctcgtttaaa gatactggca tgtctgatcg 1020 ttttaatact agctgcggca ataactatgt taacgctgga aattatatcg aaccaaaaac 1080 gtaccactac tgatctcgaa gctgtgactg tggcgctgaa gcatgtaagc acatctcttg 1140 ccagctgcac tgaatccact acttctgtac ataccgattc tgtgacgagc caacccacga 1200 aaaacaaaga atcgaggaaa aaaattgaag ggaaatctcc aagttgggtt caggctttaa 1260 ctacagcatc tggaattatc ctactgtttt gtataatgat gatattcatt acatgtccct 1320 ggaccacaga aaaagataca gagaagagtg aagtgcaatc ttatgctcct tcagtagaga 1380 ctttagaccc tttaaatgag gctattatac cgaaaactga aatgaatgtg taatgtctgt 1440 atttttcttt acagagatgt acggagagtt tatatttggg gaaaatacct gactgttctg 1500 cctatatgcg aatgttaaag tatgtataat ataaattctt accttttaag agtgattcaa 1560 ggtggaggtt tctttggaga ttgattccag gtggtggttt cgggtgcaat caatctttct 1620 tctgggcggg aagaaaatcc agcaatccaa taattgatgg gatgtaatca atgtcacaaa 1680 tctgtaagat taaatgtgaa cagtataaat tctttcgtgc ttatcaaatt acaattatgc 1740 gcatgaaaat atcattaaat tgttttaaac attcttaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1795 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> primer <400> 4 gatgctcctt cttccacatt actgg 25 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> primer <400> 5 catcccatca attattggat tgctgg 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> primer <400> 6 gaaaccacca cctggaatca atctcc 26 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> primer <400> 7 gacacattct tggaagcgat gtcg 24 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> primer <400> 8 gctgggtagt ccccaccttt ctaga 25 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> primer <400> 9 ctgaagcatg taagcacatc tcttgc 26 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> primer <400> 10 gcttcgagat cagtagtggt acg 23

Claims (28)

  1. 이하의 (a), (b), 또는 (c)에 기재된 유전자.
    (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 유전자;
    (b) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열을 오픈 리딩 프레임 영역으로서 가지는 유전자; 또는
    (c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 활성 또는 칼슘-모듈레이팅 시클로필린 리간드(CAML)와 결합하는 활성을 가지는 단백질을 코드하는 유전자로서, 상기 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건은, 하이브리다이제이션 용액(50% 포름아미드, 5×SSC(150mM의 NaCl, 15mM의 시트르산삼나트륨), 50mM의 인산나트륨(pH7.6), 5×덴헐트(Denhert)액, 10% 황산덱스트란, 및 20㎍/ml의 변성 전단 연어 정자 DNA를 포함한다) 중에서 42℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 65℃에서 0.1×SSC 중에서 필터를 세정하는 조건인 것.
  2. 이하의 (a) 또는 (b)에 기재된 단백질.
    (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
    (b) 제 1항에 기재된 유전자에 의해 코드되는 단백질.
  3. 제 1항에 기재된 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  4. 제 1항에 기재된 유전자 또는 제 3항에 기재된 재조합 발현 벡터를 도입하여 이루어지고, 인간을 제외하는 형질 전환체.
  5. 제 1항에 기재된 유전자에 있어서의 염기 서열 또는 그 상보 서열을 가지는 프로브를 포함하는, 유전자 검출기구.
  6. 제 2항에 기재된 단백질을 포함하는, 상기 단백질을 인식하는, 항체 검출용 검출기구.
  7. 분리된 생물학적 시료를 이용하여 피험자가 우울증 또는 조울증을 가지는지 여부를 진단하기 위한 정보 취득 방법으로서,
    (i) 피험자로부터 분리된 생물학적 시료중에서 단백질을 인식하는 항체의 양 또는 레벨을 판정하는 판정 과정과,
    (ii) 생물학적 시료중의 항체의 양을 나타내는 정량치를 지표로서 사용하여 피험자가 우울증 또는 조울증을 가지는지 여부를 판정하는 판정 과정을 포함하고,
    상기 단백질은,
    (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 오픈 리딩 프레임 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 단백질; 및
    (c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되고, 또한 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 활성 또는 칼슘-모듈레이팅 시클로필린 리간드(CAML)와 결합하는 활성을 가지는 단백질
    로부터 선택되고,
    상기 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건은, 하이브리다이제이션 용액(50% 포름아미드, 5×SSC(150mM의 NaCl, 15mM의 시트르산삼나트륨), 50mM의 인산나트륨(pH7.6), 5×덴헐트(Denhert)액, 10% 황산덱스트란, 및 20㎍/ml의 변성 전단 연어 정자 DNA를 포함한다) 중에서 42℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 65℃에서 0.1×SSC 중에서 필터를 세정하는 조건인, 정보 취득 방법.
  8. 인간을 제외한 피험동물이 우울증 또는 조울증을 가지는지 여부를 진단하는 진단 방법으로서,
    (i) 단백질을 인식하는 항체가 인간을 제외한 피험 동물에 존재하고 있는지 여부를 판정하는 판정 과정과,
    (ii) 상기 판정 과정에서, 단백질을 인식하는 항체가 존재하고 있다고 판정되었을 경우, 상기 인간을 제외한 피험동물이 우울증 또는 조울증을 가진다고 판정하는 판정 과정을 포함하고,
    상기 단백질은,
    (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 오픈 리딩 프레임 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 단백질; 및
    (c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되고, 또한 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 활성 또는 칼슘-모듈레이팅 시클로필린 리간드(CAML)와 결합하는 활성을 가지는 단백질
    로부터 선택되고,
    상기 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건은, 하이브리다이제이션 용액(50% 포름아미드, 5×SSC(150mM의 NaCl, 15mM의 시트르산삼나트륨), 50mM의 인산나트륨(pH7.6), 5×덴헐트(Denhert)액, 10% 황산덱스트란, 및 20㎍/ml의 변성 전단 연어 정자 DNA를 포함한다) 중에서 42℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 65℃에서 0.1×SSC 중에서 필터를 세정하는 조건인, 진단 방법.
  9. 제 7항에 기재한 정보 취득 방법을 실시하는 키트로서,
    (i) 단백질; 및
    (ii) 단백질 (i)을 고정화한 검출기구
    로부터 선택되는 적어도 1개를 포함하고,
    상기 단백질은,
    (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 오픈 리딩 프레임 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 단백질; 및
    (c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되고, 또한 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 활성 또는 칼슘-모듈레이팅 시클로필린 리간드(CAML)와 결합하는 활성을 가지는 단백질
    로부터 선택되고,
    상기 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건은, 하이브리다이제이션 용액(50% 포름아미드, 5×SSC(150mM의 NaCl, 15mM의 시트르산삼나트륨), 50mM의 인산나트륨(pH7.6), 5×덴헐트(Denhert)액, 10% 황산덱스트란, 및 20㎍/ml의 변성 전단 연어 정자 DNA를 포함한다) 중에서 42℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 65℃에서 0.1×SSC 중에서 필터를 세정하는 조건인, 키트.
  10. 제 8항에 기재한 진단 방법을 실시하는 진단 키트로서,
    (i) 단백질; 및
    (ii) 단백질 (i)을 고정화한 검출기구
    로부터 선택되는 적어도 1개를 포함하고,
    상기 단백질은,
    (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 오픈 리딩 프레임 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 단백질; 및
    (c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되고, 또한 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 활성 또는 칼슘-모듈레이팅 시클로필린 리간드(CAML)와 결합하는 활성을 가지는 단백질
    로부터 선택되고,
    상기 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건은, 하이브리다이제이션 용액(50% 포름아미드, 5×SSC(150mM의 NaCl, 15mM의 시트르산삼나트륨), 50mM의 인산나트륨(pH7.6), 5×덴헐트(Denhert)액, 10% 황산덱스트란, 및 20㎍/ml의 변성 전단 연어 정자 DNA를 포함한다) 중에서 42℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 65℃에서 0.1×SSC 중에서 필터를 세정하는 조건인, 진단 키트.
  11. 인간을 제외한 피험동물이 우울증 또는 조울증의 모델 동물로서 유용한지 여부를 판정하기 위한 인간을 제외한 모델 동물의 판정 방법으로서,
    (i) 단백질을 인식하는 항체가 인간을 제외한 동물에 존재하고 있는지 여부를 판정하는 판정 과정과,
    (ii) 상기 판정 과정에 있어서, 항체가 인간을 제외한 피험 동물에 존재한다고 판정되었을 경우, 인간을 제외한 피험 동물이 우울증 또는 조울증의 인간을 제외한 피험 동물로서 유용하다고 판정하는 판정 과정을 포함하고,
    상기 단백질은,
    (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 오픈 리딩 프레임 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 단백질; 및
    (c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되고, 또한 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 활성 또는 칼슘-모듈레이팅 시클로필린 리간드(CAML)와 결합하는 활성을 가지는 단백질
    로부터 선택되고,
    상기 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건은, 하이브리다이제이션 용액(50% 포름아미드, 5×SSC(150mM의 NaCl, 15mM의 시트르산삼나트륨), 50mM의 인산나트륨(pH7.6), 5×덴헐트(Denhert)액, 10% 황산덱스트란, 및 20㎍/ml의 변성 전단 연어 정자 DNA를 포함한다) 중에서 42℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 65℃에서 0.1×SSC 중에서 필터를 세정하는 조건인, 모델 동물의 판정 방법.
  12. 단백질을 코드하는 유전자, 또는 그 유전자를 가지는 재조합 발현 벡터를 도입하여 이루어지는 인간을 제외한 우울증 또는 조울증의 모델 동물로서,
    상기 단백질은,
    (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 오픈 리딩 프레임 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 단백질; 및
    (c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되고, 또한 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 활성 또는 칼슘-모듈레이팅 시클로필린 리간드(CAML)와 결합하는 활성을 가지는 단백질
    로부터 선택되고,
    상기 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건은, 하이브리다이제이션 용액(50% 포름아미드, 5×SSC(150mM의 NaCl, 15mM의 시트르산삼나트륨), 50mM의 인산나트륨(pH7.6), 5×덴헐트(Denhert)액, 10% 황산덱스트란, 및 20㎍/ml의 변성 전단 연어 정자 DNA를 포함한다) 중에서 42℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 65℃에서 0.1×SSC 중에서 필터를 세정하는 조건인, 모델 동물.
  13. 향정신약 또는 항정신병약의 후보 물질을 스크리닝하는 스크리닝 방법으로서,
    (i) 제 12항에 기재된 인간을 제외한 우울증 또는 조울증의 모델 동물에 피험물질을 주는 과정과,
    (ii) 행동 이상(異常)에 관한 시험 또는 뇌기능 시험의 결과, 우울증 또는 조울증이 치유 또는 개선된 경우에, 상기 후보 물질이 항정신 장애 작용을 갖는다고 판정하는 판정 과정을 포함하는, 스크리닝 방법.
  14. 피험 대상 생물로부터 분리된 생물학적 시료중에서 단백질을 인식하는 항체를 검출하는 검출과정을 포함하고,
    상기 단백질은,
    (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 오픈 리딩 프레임 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 단백질; 및
    (c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되고, 또한 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 활성 또는 칼슘-모듈레이팅 시클로필린 리간드(CAML)와 결합하는 활성을 가지는 단백질
    로부터 선택되고,
    상기 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건은, 하이브리다이제이션 용액(50% 포름아미드, 5×SSC(150mM의 NaCl, 15mM의 시트르산삼나트륨), 50mM의 인산나트륨(pH7.6), 5×덴헐트(Denhert)액, 10% 황산덱스트란, 및 20㎍/ml의 변성 전단 연어 정자 DNA를 포함한다) 중에서 42℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 65℃에서 0.1×SSC 중에서 필터를 세정하는 조건인, 우울증 또는 조울증 또는 크론병에 기인하는 정신 질환의 진단을 위한 항체 검출 방법.
  15. 피험 대상 생물로부터 분리된 생물학적 시료의 사용을 통하여 피험 대상 생물이 우울증 또는 조울증을 가지는지 여부를 진단하기 위한 정보 취득 방법으로서,
    (i) 피험 대상 생물로부터 분리된 생물학적 시료중에서 단백질을 코드하는 유전자 또는 단백질의 양을 판정하는 판정 과정과,
    (ii) 생물학적 시료중의 단백질 또는 유전자의 양을 나타내는 정량치를 지표로서 사용하여 피험 대상 생물이 우울증 또는 조울증을 가지는지 여부를 판정하는 판정 과정을 포함하고,
    상기 단백질은,
    (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 오픈 리딩 프레임 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 단백질; 및
    (c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되고, 또한 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 활성 또는 칼슘-모듈레이팅 시클로필린 리간드(CAML)와 결합하는 활성을 가지는 단백질
    로부터 선택되고,
    상기 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건은, 하이브리다이제이션 용액(50% 포름아미드, 5×SSC(150mM의 NaCl, 15mM의 시트르산삼나트륨), 50mM의 인산나트륨(pH7.6), 5×덴헐트(Denhert)액, 10% 황산덱스트란, 및 20㎍/ml의 변성 전단 연어 정자 DNA를 포함한다) 중에서 42℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 65℃에서 0.1×SSC 중에서 필터를 세정하는 조건인, 정보 취득 방법.
  16. 피험 대상 생물이 우울증 또는 조울증을 가지는지 여부를 진단하기 위한 진단 시약을 제조하는 방법으로서,
    단백질, 상기 단백질을 코드하는 유전자, 또는 상기 단백질을 확인하는 항체를 사용하여, 상기 진단 시약을 제조하는 공정을 포함하며,
    상기 단백질은,
    (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 오픈 리딩 프레임 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 단백질; 및
    (c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되고, 또한 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 활성 또는 칼슘-모듈레이팅 시클로필린 리간드(CAML)와 결합하는 활성을 가지는 단백질
    로부터 선택되고,
    상기 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건은, 하이브리다이제이션 용액(50% 포름아미드, 5×SSC(150mM의 NaCl, 15mM의 시트르산삼나트륨), 50mM의 인산나트륨(pH7.6), 5×덴헐트(Denhert)액, 10% 황산덱스트란, 및 20㎍/ml의 변성 전단 연어 정자 DNA를 포함한다) 중에서 42℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 65℃에서 0.1×SSC 중에서 필터를 세정하는 조건인, 진단 시약 제조 방법.
  17. 분리된 생물학적 시료의 사용을 통하여 피험자가 우울증 또는 조울증 또는 크론병에 기인하는 정신 질환을 가지는지 여부를 진단하기 위한 정보 취득 방법으로서,
    (i) 피험자로부터 분리된 생물학적 시료중에서 단백질을 인식하는 항체의 양을 판정하는 판정 과정과,
    (ii) 생물학적 시료중의 항체의 양을 나타내는 정량치를 지표로서 사용하여 피험자가 크론병에 기인하는 정신 질환을 가지는지 여부를 판정하는 판정 과정을 포함하고,
    상기 단백질은,
    (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 오픈 리딩 프레임 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 단백질; 및
    (c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되고, 또한 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 활성 또는 칼슘-모듈레이팅 시클로필린 리간드(CAML)와 결합하는 활성을 가지는 단백질
    로부터 선택되고,
    상기 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건은, 하이브리다이제이션 용액(50% 포름아미드, 5×SSC(150mM의 NaCl, 15mM의 시트르산삼나트륨), 50mM의 인산나트륨(pH7.6), 5×덴헐트(Denhert)액, 10% 황산덱스트란, 및 20㎍/ml의 변성 전단 연어 정자 DNA를 포함한다) 중에서 42℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 65℃에서 0.1×SSC 중에서 필터를 세정하는 조건인, 정보 취득 방법.
  18. 단백질을 코드하는 유전자 또는 그 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 인간을 제외한 동물에 도입하는 도입과정을 포함하는, 인간을 제외한 우울증 또는 조울증 또는 크론병에 기인하는 정신 질환의 모델 동물 제조 방법으로서,
    상기 단백질은,
    (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 오픈 리딩 프레임 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 단백질; 및
    (c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되고, 또한 세포내 칼슘 농도를 상승시키는 활성 또는 칼슘-모듈레이팅 시클로필린 리간드(CAML)와 결합하는 활성을 가지는 단백질
    로부터 선택되고,
    상기 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건은, 하이브리다이제이션 용액(50% 포름아미드, 5×SSC(150mM의 NaCl, 15mM의 시트르산삼나트륨), 50mM의 인산나트륨(pH7.6), 5×덴헐트(Denhert)액, 10% 황산덱스트란, 및 20㎍/ml의 변성 전단 연어 정자 DNA를 포함한다) 중에서 42℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 65℃에서 0.1×SSC 중에서 필터를 세정하는 조건인, 모델 동물 제조 방법.
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