发明内容
本发明者等鉴于上述课题进行悉心研究的结果,通过对免疫方法加以改良,获得针对S.mutans的血清型未确定菌株的抗血清,并将S.mutans的血清型未确定菌株定义为新型血清型(k型)。
为了分析、决定此新型血清型k型多糖抗原,特定了该k型菌株中、编码参与S.mutans多糖抗原生物合成的酶(rgpA、rgpB、rgpC、rgpD、rgpE、rgpF、ORF7、rgpH、rgpI及ORF10)的基因全序列。对于这些基因序列,在k型菌株和已知的血清型S.mutans菌株之间比较,发现了在rgpF中存在与多个k型菌株共有的特异序列。且,本发明者等使用根据在rgpF中发现的S.mutans的k型菌株的特异性碱基序列设计的引物,通过将从被检体中获得的组织样品进行PCR扩增,可有效且高效地检测出该被检体中S.mutans的血清型未确定菌株的存在,使本发明得以完成。
即,本发明的多核苷酸或其片段,其特征在于,包含变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株的特异性碱基序列或该碱基序列的互补序列。
优选的是,本发明的多核苷酸或其片段,其特征在于,其是编码使变形链球菌特异性多糖抗原葡萄糖侧链量降低的多肽的多核苷酸。
上述多核苷酸,其特征在于,优选的是由:序列号1~4中任一项所示的碱基序列;或
序列号1~4中任一项所示的碱基序列中1个或数个碱基缺失、取代或附加了碱基序列所组成的多核苷酸。
上述多核苷酸,其特征在于,还优选的是
序列号1~4中任一项所示的碱基序列组成的多核苷酸;或
与由序列号1~4中任一项所示的碱基序列组成的多核苷酸的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸。
更优选的是,上述多核苷酸的特征为,由序列号1~4中任一项所示的碱基序列组成。
根据上述组成,可提供具有新型血清型的变形链球菌菌株特异性存在的多核苷酸。
即,本发明的寡核苷酸,其特征在于,包含变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株的特异性碱基序列或该碱基序列的互补序列。
优选的是,上述寡核苷酸的特征为,其中包含序列号1~4中任一项所示的至少12个连续的碱基序列或其互补序列。
上述寡核苷酸,优选包含序列号8~10中任一项所示的碱基序列或其互补序列。
根据上述组成,可提供在特异性检测具有新型血清型的变形链球菌菌株时优异的寡核苷酸。
即,本发明的多肽,其特征在于,使变形链球菌特异性多糖抗原的葡萄糖侧链量降低。
优选的是,本发明的多肽的特征为,其由上述多核苷酸或其片段编码。
更优选的是,本发明的多肽的特征为,其由序列号1~4中任一项所示的碱基序列组成的多核苷酸编码。
根据上述组成,可提供具有变形链球菌的血清型c、e或f菌株以外的新型血清型变形链球菌菌株特异性存在的多肽。
即,本发明的变形链球菌菌株,其特征在于,变形链球菌特异性多糖抗原的葡萄糖侧链量降低了。
优选的是,本发明的变形链球菌菌株的特征为,其是变形链球菌的血清型特异多糖抗原的葡萄糖侧链量降低了的新型血清型。
一方面,本发明的变形链球菌菌株,优选具有上述多核苷酸,
另一方面,本发明的变形链球菌菌株,优选表达上述多肽。
根据上述组成,在具有已知血清型变形链球菌有关的新理论增加的同时,还可提供只靠具有已知血清型的变形链球菌所不能解决的、对疾病的治疗及/或预防有效的变形链球菌菌株。
即,为了解决上述课题,本发明的抗体,其特征在于,与变形链球菌血清型c、e或f菌株特异性多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株的多糖抗原特异性结合。
即,本发明的抗体,其特征在于,与变形链球菌血清型特异多糖抗原的葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株与特异性多糖抗原结合。
优选的是,本发明的抗体的特征为,与上述变形链球菌菌株的血清型特异多糖抗原进行特异性结合。
根据上述组成,可提供用于检测变形链球菌血清型特异多糖抗原的葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株,即具有新型血清型的变形链球菌菌株的有用的抗体。
即,本发明的检测被检样品中变形链球菌菌株的方法,其特征在于,包含将上述寡核苷酸作为引物使用,以进行PCR反应的步骤。
优选的是,本发明的检测被检样品中变形链球菌菌株的方法的特征为,其还包含从被检样品中分离细菌的步骤、及提取上述分离后的细菌的基因组DNA或总RNA的步骤。
本发明的检测被检样品中变形链球菌菌株的方法中,上述组织样品优选从血液、唾液或牙垢中获得。
本发明的检测被检样品中变形链球菌菌株的方法中,上述引物优选是由序列号8中所示的碱基序列组成的寡核苷酸及由序列号9或10中所示的碱基序列所组成的寡核苷酸。
即,根据上述组成,编码对具有新型血清型的变形链球菌菌株血清型特异多糖抗原的生物合成重要的酶的基因,检测此基因的存在,即可知该新型血清型菌株的存在。
即,为了解决上述课题,本发明的检测被检样品中变形链球菌菌株的方法,其特征在于,包含将上述寡核苷酸作为探针使用,进行杂交反应的步骤。
优选的是,本发明的检测被检样品中变形链球菌菌株的方法的特征为,其还包含从被检样品中分离细菌的步骤、及提取上述分离后细菌的基因组DNA或总RNA的步骤。
本发明的检测被检样品中变形链球菌菌株的方法中,上述组织样品优选从血液、唾液或牙垢中获得。
本发明的检测被检样品中变形链球菌菌株的方法中,优选上述寡核苷酸由序列号8~10中任一项所示的碱基序列组成。
本发明的检测被检样品中变形链球菌菌株的方法中,分离上述细菌的步骤优选使用上述抗体。
即,为了解决上述课题,本发明的通过杂交反应鉴定变形链球菌血清型的方法,其特征在于,用于上述杂交反应的探针,使用包含变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株、特异性的碱基序列或该碱基序列的互补序列的寡核苷酸,同时,上述特异性碱基序列,是序列号1~4中任一项所示的碱基序列的至少12个连续碱基序列。
优选的是,本发明的通过杂交反应鉴定变形链球菌血清型的方法的特征为,用于上述杂交反应的探针,还可使用包含变形链球菌血清型c、e或f菌株的特异性的碱基序列中的、至少12个连续碱基序列或该碱基序列的互补序列的寡核苷酸。
优选的是,本发明的通过杂交反应鉴定变形链球菌血清型的方法的特征为,还可从被检体的组织样品中获得染色体DNA或总RNA。
优选的是,本发明的通过杂交反应鉴定变形链球菌的血清型的方法的特征为,上述组织样品还可从血液、唾液或牙垢中获得。
优选的是,本发明的通过杂交反应鉴定变形链球菌的血清型的方法的特征为,还包含从唾液或牙垢中分离菌的步骤。
根据上述组成,在特异性检测变形链球菌的血清型c、e或f菌株的特异性多糖类葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株时,可提供优异的鉴定变形链球菌血清型的方法。
即,根据上述组成,对具有新型血清型的变形链球菌菌株的血清型特异多糖抗原的生物合成重要的酶进行检测,即可知该新型血清型菌株的存在。
即,为解决上述课题,本发明的变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株的检测方法,其特征在于,包含使用上述抗体进行免疫反应的步骤。
优选的是,本发明的检测被检样品中变形链球菌菌株的方法,其特征在于,包含
从被检样品中分离细菌的步骤;
孵育上述分离后的细菌和权利要求9中所述的抗体的步骤;及
检测与上述抗体结合的细菌的步骤。
根据上述组成,可提供对具有新型血清型变形链球菌有效的检测方法。
即,本发明的被检样品中变形链球菌菌株的血清型鉴定方法,其特征在于,使用检测上述变形链球菌菌株的方法。
即,为解决上述课题,本发明的通过PCR反应、鉴定S.mutans血清型的方法,其特征在于,作为用于上述PCR反应的引物,可以使用包含S.mutans血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的S.mutans菌株的特异性碱基序列或该碱基序列的互补序列的寡核苷酸,同时,上述特异性碱基序列,是序列号1~4中任一项所示的碱基序列中至少12个连续的碱基序列。
优选的是,本发明通过PCR反应鉴定变形链球菌血清型的方法的特征为,用于上述PCR反应的引物,还可使用包含变形链球菌的血清型c、e或f菌株的特异性碱基序列中、至少12个连续碱基序列或该碱基序列的互补序列的寡核苷酸。
优选的是,本发明的通过PCR反应鉴定变形链球菌血清型的方法的特征为,还可从被检体的组织样品中获得染色体DNA或总RNA。
优选的是,本发明的通过PCR反应鉴定变形链球菌血清型的方法的特征为,上述组织样品还可从血液、唾液或牙垢中获得。
优选的是,本发明的通过PCR反应鉴定变形链球菌血清型的方法的特征为,还包含从唾液或牙垢中分离菌的步骤。
根据上述组成,可提供在特异性检测变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株上优异的、鉴定变形链球菌血清型的方法。
即,为解决上述课题,本发明变形链球菌菌株的血清型的鉴定方法,其特征在于,使用与变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株特异性结合的抗体。
优选的是,本发明的鉴定变形链球菌菌株的血清型的方法的特征为,进一步使用与变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株特异性结合的抗体。
根据上述组成,可提供在特异性检测变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株上优异的、鉴定变形链球菌血清型的方法。
即,本发明变形链球菌菌株的筛选方法,其特征在于,使用上述检测变形链球菌菌株的方法。
即,本发明的变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株的筛选方法,其特征在于,使用上述的多核苷酸或其片段。
优选的是,本发明的变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株的筛选方法的特征为,上述多核苷酸或其片段用于PCR反应。
优选的是,本发明的变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株的筛选方法的特征为,上述多核苷酸或其片段用于杂交反应。
优选的是,本发明的变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株的筛选方法,使用上述的抗体。
根据上述组成,可提供变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株的优异的筛选方法。
即,本发明的变形链球菌菌株,其特征在于,由上述的筛选方法获得。
即,本发明的变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株,其特征在于,通过上述筛选方法分离。
根据上述组成,可提供新筛选的变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株。
即,为解决上述课题,本发明的变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株,其特征在于,通过上述筛选方法筛选。
根据上述组成,可进一步提供具有新型血清型的变形链球菌菌株。
即,用于检测本发明的变形链球菌菌株的试剂盒,其特征在于,具备上述的寡核苷酸。
本发明的用于检测变形链球菌菌株的试剂盒中,上述寡核苷酸,优选为由序列号9中所示的碱基序列组成的寡核苷酸。
本发明的用于检测变形链球菌菌株的试剂盒中,优选进一步具备由序列号8中所示的碱基序列组成的寡核苷酸。
本发明的用于检测变形链球菌菌株的试剂盒中,优选进一步具备由序列号10中所示的碱基序列组成的寡核苷酸。
本发明的用于检测变形链球菌菌株的试剂盒,优选用于PCR反应或杂交反应。
即,为解决上述课题,本发明的用于鉴定变形链球菌菌株血清型的试剂盒,其特征在于,具备包含变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株的特异性碱基序列或该碱基序列的互补序列的寡核苷酸,同时,上述特异性碱基序列,是序列号1~4中任一项所示的碱基序列中的至少12个连续碱基序列。
优选的是,本发明的用于鉴定变形链球菌菌株血清型的试剂盒的特征为,还具备包含对变形链球菌的血清型c、e或f菌株特异性的碱基序列的至少12个连续碱基序列或其互补序列的寡核苷酸。
优选的是,本发明的用于鉴定变形链球菌菌株血清型的试剂盒的特征为,还包含用于从被检体的组织样品中获得染色体DNA或总RNA的试剂。
优选的是,本发明的用于鉴定变形链球菌菌株血清型的试剂盒的特征为,上述组织样品还可从血液、唾液或牙垢中获得。
优选的是,本发明的用于鉴定变形链球菌菌株血清型的试剂盒的特征为,还包含用于从唾液或牙垢中分离菌的试剂。
优选的是,本发明的用于鉴定变形链球菌菌株血清型的试剂盒的特征为,还包含用于PCR反应的试剂。
优选的是,本发明的用于鉴定变形链球菌菌株血清型的试剂盒的特征为,还包含用于杂交反应的试剂。
优选的是,本发明的用于鉴定变形链球菌菌株血清型的试剂盒的特征为,上述寡核苷酸还被标记。
根据上述组成,可提供在特异性检测变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株上优异的、用于鉴定变形链球菌血清型的试剂盒。
即,根据上述组成,对具有新型血清型的变形链球菌菌株特异性多糖抗原的生物合成重要的酶,检测编码此酶的基因的存在,即可知该新型血清型菌株的存在。
即,为解决上述课题,本发明的用于鉴定变形链球菌菌株血清型的试剂盒,其特征在于,具备与变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株特异性结合的抗体。
优选的是,本发明的用于鉴定变形链球菌菌株血清型的试剂盒,其特征在于,具备与具有新型血清型的变形链球菌菌株特异性结合的上述抗体。
根据上述组成,可提供对具有新型血清型变形链球菌菌株检测有效的试剂盒。
优选的是,本发明的用于鉴定变形链球菌菌株血清型的试剂盒,其特征在于,还具备与变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株的多糖抗原特异性结合的抗体。
根据上述组成,可提供特异性检测变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株,即具有新型血清型的变形链球菌菌株优异的、用于鉴定变形链球菌血清型的试剂盒。
即,为解决上述课题,本发明的抗体的制造方法,其特征在于,是改良以往的免疫方法的方法。
一方面,本发明的抗体的制造方法,优选包含将悬浮于磷酸缓冲生理盐水的上述变形链球菌菌株连续5日进行兔耳缘静脉注射的步骤。
本发明的抗体的制造方法,优选进一步包含间隔一星期后,再在2星期内,每星期5日反复注射悬浮于磷酸缓冲生理盐水中的上述变形链球菌菌株的步骤。
根据上述方法,可提供与变形链球菌血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的变形链球菌菌株,即具有新型血清型的变形链球菌菌株特异性结合的抗体的制造方法。
根据上述组成,可提供对于用以往的免疫方法未能获得的、具有新型血清型变形链球菌的表面抗原的抗体。
即,本发明的细菌检测器具,其特征在于,包含具有新型血清型变形链球菌菌株的特异性碱基序列或其互补序列的寡核苷酸固定于载体上。
优选的是,本发明的细菌检测器具中,上述碱基序列的特征为,其是对于具有新型血清型变形链球菌菌株特异性多糖抗原的生物合成重要的酶进行编码的多核苷酸碱基序列的至少12个连续碱基序列。
根据上述组成,可检测鉴定样品中含有的具有新型血清型的变形链球菌菌株。
还可根据上述组成,进行样品中含有的变形链球菌菌株的全面检查。
本发明进一步的其他的目的、特征、及优点,根据以下所示的记载可十分明了。且本发明的益处,在参照附图的如下的说明中也会十分清楚。
具体实施方式
以下详细说明本发明的一实施方式,但本发明不限于以下的记载。
(1)血清型k的S.mutans菌株
S.mutans,有时能从患感染性心内膜炎的患者的血液中分离,但其侵入机制及生存机制还有不明之处。从患菌血症或感染性心内膜炎患者得到的4株血液分离菌株中的2株(TW295菌株及TW871菌株),经过免疫沉淀试验,在血清学上还不确定。
对于上述血清型未确定菌株使用抗血清进行免疫扩散分析,从100人的被检体中得到的100菌株口腔分离菌株中,有2株显示了阳性反应。再对从50人的被检体中得到的2500菌株的口腔分离菌株进一步进行免疫扩散分析,从单一患者得到的50个分离菌株,全部未与抗c型抗血清、抗e型抗血清、及抗f型抗血清反应,而与抗TW295抗血清及抗TW871抗血清反应。这些菌株显示了与对照菌株S.mutans菌株MT8148同样的生物学特性[例如,高水平的蔗糖依赖性粘附及菌体疏水性、以及葡萄糖基转移酶及蛋白质抗原(PA)的表达]。本发明者等将此生物命名为血清型k。
本发明者等从人体的血液样品及口腔样品中分离出血清型k的新型S.mutans菌株,并赋予其特征。发现了血清型k菌株的血清学特征与MT8148的gluA失活突变株(MT8148GD)的特征同样。
血清型k的口腔分离菌株与血液分离菌株及MT8148GD同样,对吞噬作用显示了抵抗性。这些结果表明,S.mutans血清型k菌株不仅存在于人体的口腔内,还因其对吞噬作用感受性低,所以可生存于血液中。
MT8148GD对玻璃表面的蔗糖依赖性粘附、对唾液被覆的羟基磷灰石的非蔗糖依赖性粘附、葡聚糖结合活性、及细胞结合型(cell-associated)葡萄糖基转移酶(GTF)活性等的生物学特性,比其亲本MT8148菌株显著低下。
而且,Western印迹分析显示出,血清型k中GTFB/GTFC的表达率比虽较MT8148有所减少,但对于大鼠的龋齿诱发能力,MT8148、MT8148GD及血清型k的口腔分离菌株之间程度相同。
上述结果表明,S.mutans的血清型特异性多糖中葡萄糖侧链的缺失可与龋齿的诱发能力相关,但比其他主要的表面蛋白质(例如,GTF、PAc等)的程度低。
本发明中,通过对以往的免疫方法加以改良,获得了血清型k的S.mutans菌株的抗血清。特定与S.mutans菌株血清型特异多糖抗原生物合成有关的基因群的序列,比较血清型k和已知菌株的结果,鉴定了与血清型k的S.mutans菌株共存的rgpF基因的序列突变。
(A)多核苷酸
本发明提供编码使变形链球菌特异性多糖抗原葡萄糖侧链量降低的多肽的多核苷酸。在本说明书中使用时,“使变形链球菌特异性多糖抗原葡萄糖侧链量降低的多肽”可与“参与血清型k的S.mutans菌株特异性多糖抗原生物合成的多肽”或“参与血清型k的S.mutans菌株血清型特异多糖抗原生物合成的多肽”互换使用。在一实施方式中,本发明提供具有序列号1~4中任一项所示的碱基序列的多核苷酸或其片段。在本说明书中使用时,术语“多核苷酸”可与“核酸”或“核酸分子”交换使用,指核苷酸的聚合体。在本说明书中使用时,术语“碱基序列”可与“核酸序列”或“核苷酸序列”交换使用,作为脱氧核糖核苷酸(省略为A、G、C及T)的序列表示。且“包含序列号1~4中任一项所示的碱基序列的多核苷酸或其片段”,是指包含由序列号1~4的各脱氧核苷酸A、G、C及/或T表示的序列的多核苷酸或其片段部分。
本发明涉及的多核苷酸,可以RNA(例如mRNA)的形态或DNA的形态(例如,cDNA或基因组DNA)存在。DNA可以是双链或单链。单链DNA或RNA可以是编码链(也称为有义链),或其也可以是非编码链(也称为反义链)。
在本说明书中使用时,术语“寡核苷酸”是指数个~数十个核苷酸结合而成,可与“多核苷酸”交换使用。寡核苷酸中短的被称为二核苷酸(二聚物)、三核苷酸(三聚物),长的用30链节(mers)或100链节聚合的核苷酸数表示。寡核苷酸可作为更长的多核苷酸的片段生成,也可被化学合成。
本发明的多核苷酸的片段,是指至少为12nt(核苷酸)、优选为约15nt、更优选至少约为20nt、且尤其优选至少约为30nt、最优选至少约为40nt长度的片段。例如,“序列号1~4中任一项所示的核苷酸序列的至少20nt长度的片段”,是指包含序列号1~4中任一项所示的核苷酸序列中的20或大于20的连续碱基片段。参照本说明书,可提供序列号1~4中任一项所示的核苷酸序列,所以,本领域技术人员可容易地制备此种DNA片段。例如,通过限制性核酸内切酶切割或超声波剪切,可方便地用于制备各种长短的片段。或此种片段可由合成制备。适合的片段(寡核苷酸),可通过Applied Biosystems Incorporated(ABI,850 Lincoln Center Dr.,Foster City,CA 94404)392型合成仪等合成。
本发明与是否编码参与血清型k的S.mutans菌株特异性多糖抗原生物合成的多肽无关,与序列号1~4中任一项所示的碱基序列的至少12个连续序列或其互补序列组成的多核苷酸有关。特定的多核苷酸不编码参与对血清型k的S.mutans菌株特异性多糖抗原生物合成涉及的多肽时,本领域技术人员应很容易理解,上述多核苷酸,例如可作为聚合酶链式反应(PCR)的引物、或杂交探针使用。因本发明的多核苷酸,可将编码参与血清型k的S.mutans菌株特异性多糖抗原生物合成的多肽的多核苷酸进行特异性PCR扩增,所以,本发明的多核苷酸,还可作为与编码参与血清型k的S.mutans菌株特异性多糖抗原生物合成的多肽的多核苷酸特异性杂交的杂交探针来利用。不编码与血清型k的S.mutans菌株特异性多糖抗原生物合成有关的多肽的本发明多核苷酸的其他用途,可以举出Verma等的Human Chromosomes:aManual of Basic Techniques,Pergamon Press,New York(1988)中所述的,对用于提供正确的染色体位置的分裂中期染色体展开物的原位杂交(例如,FISH);及用于检测参与特定组织中血清型k的S.mutans菌株特异性多糖抗原生物合成的多肽的mRNA表达的Northern印迹分析。
例如,“长度至少为20nt”的多核苷酸的部分,是指参照的多核苷酸的核苷酸序列中20或大于20的相连的核苷酸。优选的实施方式中,本发明的此部分,作为通过聚合酶链式反应(PCR)进行靶序列扩增用的引物,或作为按照以往的DNA杂交技术的探针,均在诊断上有用。
另一方面,本发明提供,在严谨杂交条件下,包含上述本发明的多核苷酸(例如,由序列号1~4中任一项所示的碱基序列组成的多核苷酸)或其一部分杂交的多核苷酸的分离的多核苷酸。术语“严谨杂交条件”,是指在杂交溶液[含有50%甲酰胺、5×SSC(150mM的NaCl、15mM的柠檬酸三钠)、50mM的磷酸钠(pH7.6)、5×模板(Denhardt)溶液、10%硫酸葡聚糖、及20μg/ml的变性的剪切鲑鱼精子DNA]中,42℃培育一夜后,在约65℃,在0.1×SSC中洗涤杂交膜。与多核苷酸的“一部分”杂交的多核苷酸,是指与参照的多核苷酸的至少约15个核苷酸(nt)、优选至少约为20nt、更优选至少约为30nt、且最优选约为30~70nt杂交的多核苷酸(DNA或RNA的任一个)。这些,作为本说明书中更详细考察的、诊断用引物及诊断用探针是有用的。
把参与血清型k的S.mutans菌株血清型特异多糖抗原生物合成的多肽编码的本发明的多核苷酸,不限于以下举例:根据其自身,把成熟多肽的氨基酸序列编码的多核苷酸;成熟多肽的编码序列及更多的序列(例如,编码前导序列的序列)[例如,前体蛋白(preprotein)序列或原蛋白(proprotein)序列或前原蛋白(preproprotein)序列);内含子、非编码5’序列及非编码3’序列[例如,转录、mRNA加工(包含拼接及多聚酰苷酸化信号)中起作用的转录非翻译序列];把提供具有更多功能的更多氨基酸进行编码的更多编码序列。因此,例如把多肽编码的序列,可与标记序列(例如,使融合的多肽的纯化易进行的肽进行编码的序列)融合。在本发明的此方面特定的优选实施方式中,标记氨基酸序列是六聚组氨酸肽[例如,pQE媒体(Qiagen,Inc.)中提供的标签],很多其他的可由公开的及/或商业性手段获得。例如,如Gentz等,在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824(1989)中所述,六聚组氨酸提供融合蛋白质的简便的纯化。“HA”标签,是用于对来源于流感红血球凝集素(HA)蛋白质的表位纯化有用的其他的肽,其如Wilson等在Cell 37:767(1984)中所述。其他的此种融合蛋白质,包含在N末端或C末端与Fc融合的、参与血清型k的S.mutans菌株特异性多糖抗原生物合成的多肽或其片段。
把参与血清型k的S.mutans菌株血清型特异多糖抗原生物合成的多肽或其片段编码的本发明涉及的多核苷酸,可与含有用于在宿主细胞中增殖的选择性标记的载体结合。一般地,质粒载体导入如磷酸钙沉淀物的沉淀物中,或与带电的脂质复合的复合体中。另外,如下详述,也可使用DEAE葡聚糖法、电穿孔法。载体是病毒时,载体可使用适当的包装细胞株进行体外包装后,转导至宿主细胞。
本发明还涉及把参与血清型k的S.mutans菌株血清型特异多糖抗原生物合成的多肽编码的本发明多核苷酸突变体。突变体如天然的等位基因突变体一样,可天然生成。“等位基因突变体”,是指占据生物染色体规定基因座的基因的一些可交替形式中的一个。非天然存在的突变体,例如可使用该领域中公知的诱变技术生成。
这样的突变体,包含由本发明的多核苷酸中1个或数个核苷酸经取代、缺失、或附加后生成的突变体。取代、缺失、或附加,可含有1个或大于1个的核苷酸。突变体可在编码或非编码区域、或其两者中变化。编码区域中的突变,可生成保留或非保留的氨基酸取代、缺失、或附加。
所以,可以说,本发明涉及的多核苷酸,至少含有序列号1~4中任一项所示的碱基序列或其突变体即可。且本发明涉及的多核苷酸的碱基序列,可用适当的连接肽编码的多核苷酸连接。
即,本发明的目的是提供,把参与血清型k的S.mutans菌株特异性多糖抗原生物合成的多肽编码的多核苷酸、及用于检测该多核苷酸的多核苷酸(寡核苷酸),但不局限于本说明书中具体记载的多核苷酸制备方法等。因此,必须注意,由上述各方法以外的方法获得的把参与血清型k的S.mutans菌株特异性多糖抗原生物合成的多肽编码的多核苷酸、及用于检测该多核苷酸的多核苷酸(寡核苷酸),也属于本发明的范围。
(B)多肽
本发明者等发现了新型血清型(k型)的S.mutans菌株,还发现了参与决定此血清型的多糖抗原生物合成酶中的一种,即rgpF中存在着突变。
在本说明书中使用时,术语“多肽”可与“肽”或“蛋白质”交换使用。且多肽的“片段”是指该多肽的部分片段。本发明涉及的多肽,可从天然供给源分离,也可化学合成。
术语“被分离”的多肽或蛋白质,是指由其天然环境中获取的多肽或蛋白质。例如,在宿主细胞中表达重组产生的多肽及蛋白质,与通过任意的适当的技术、实质上被纯化的天然或重组的多肽及蛋白质同样,可认为是被分离。
本发明涉及的多肽,包含天然的纯化产物、化学合成工序的产物、及由原核生物宿主或真核生物宿主(例如,包含细菌细胞、酵母细胞、高等植物细胞、昆虫细胞、及哺乳动物细胞)通过重组技术产生的产物。根据重组产生工序中使用的宿主,本发明涉及的多肽可糖基化,或非糖基化。而且本发明涉及的多肽,在一些情况下,其宿主介导过程的结果,还可包含改变起始的蛋氨酸残基。
一方面,本发明提供k型S.mutans菌株的rgpF多肽。在本说明书中使用时,“k型S.mutans菌株的rgpF多肽”,是指参与新型血清型k的S.mutans菌株多糖抗原生物合成酶的rgpF多肽。
在一种的实施方式中,本发明提供通过序列号1~4中任一项所示的碱基序列编码的多肽。本发明优选的多肽,可以举出含在成熟多肽、细胞外结构域、跨膜结构域、细胞内结构域、或跨膜结构域的全部或一部分缺失的细胞外及细胞内结构域的多肽。
本发明还进一步提供实质上显示了k型S.mutans菌株rgpF多肽活性的k型S.mutans菌株的rgpF多肽的突变体。在一种实施方式中,本发明提供由序列号1~4中任一项所示的碱基序列编码的多肽中,1个或数个氨基酸取代、附加或缺失了的,显示k型S.mutans菌株的rgpF多肽活性的多肽的突变体。
在本说明书中使用时,术语“k型S.mutans菌株的rgpF多肽活性”,是指参与公知的血清型S.mutans菌株中不存在的多糖抗原,即,k型S.mutans菌株特异性多糖抗原生物合成的rgpF多肽的特征。
这种突变体包含缺失、插入、倒位、重复、及类型(type)取代[例如,亲水性残基被其他残基取代(通常强亲水性残基不被强疏水性残基取代)]。“中性”氨基酸取代,一般基本上不影响活性。
多肽的氨基酸序列中的一些氨基酸,不显著影响此多肽的结构或功能,易被改变,在该领域是众所周知的。而且,不仅可人为改变,而且,在天然蛋白质中存在不使该蛋白质的结构或功能发生显著变化的突变体,也是众所周知的。
本领域技术人员使用众所周知的技术,可容易地使多肽的氨基酸序列中1个或数个氨基酸产生突变。例如,根据公知的点突变导入法,可使编码多肽的多核苷酸的任意碱基产生突变。另外,设计对应编码多肽的多核苷酸的任意部位的引物,可制备缺失突变体或附加突变体。而且,使用本说明书中记载的方法,可很容易地鉴定出所制备的突变体是否具有所希望的活性。
优选的突变体具有保留或非保留的氨基酸取代、缺失、或附加。优选的是沉默取代、附加、及缺失,特别优选的是保留取代。上述这些的其k型S.mutans菌株的rgpF多肽活性不发生变化。
被认为是代表性的保留取代,是脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu、及Ile中1个氨基酸被其他的氨基酸取代;羟基残基Ser及Thr的取代、酸性残基Asp及Glu的取代、酰胺残基Asn及Gln之间的取代、碱性残基Lys及Arg的取代、以及芳香族残基Phe、Tyr之间的取代。
如上详述,哪一种氨基酸的变化可能是沉默表达型(即,是否可能会对功能具有显著的有害作用),关于这一点的进一步的指导,可参考Bowie,J.U.ら“Deciphering the Message in Protein Sequences:Tolerance to Amino Acid Substitutions”,Science 247:1306—1310(1990)(在本说明书中作为参考引用)。
其他方面,本发明涉及的多肽,可通过融合蛋白质的被改变的形态重组表达。例如,附加的氨基酸,特别是带电氨基酸区域,为改善宿主细胞内的纯化期间或继续纯化操作及保存期间的稳定性及持续性,可在多肽的N末端附加。
在特定的情况下,本发明涉及的k型S.mutans菌株的rgpF多肽,例如,可将编码使融合多肽的纯化容易进行的肽的序列的标签[标签(tag)序列或标记物(marker)序列]附加到N末端或C末端。此类序列可在多肽的最终制备前除去。本发明此方面的特定优选实施方式中,标签(tag)氨基酸序列是六聚组氨酸肽[例如,pQE载体(Qiagen,Inc.)提供的标签(tag)],其中,多数可通过公开的及/或商业手段获得。例如,如Gentz等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821—824(1989)(本说明书中也作为参考引用)中所述,六聚组氨酸提供融合蛋白质的简便的纯化。“HA”标签,是用于对来源于流感红血球凝集素(HA)蛋白质的表位纯化有用的另一种肽,其如Wilson等,Cell 37:767(1984)(本说明书中也作为参考引用)中所述。其他的融合蛋白质,包含在N或C末端与Fc融合的、本实施方式涉及的k型S.mutans菌株的rgpF多肽或其片段。
本发明涉及的k型S.mutans菌株的rgpF多肽,可按如下详述重组生成,也可化学合成。
重组生成可使用该领域中众所周知的方法进行,例如,可使用以下详述的载体及细胞。
合成肽可使用化学合成的公知的方法合成。例如,Houghten记载的用不满4个星期制备的,且赋予特征的HA1多肽片段的单一氨基酸改变体,合成10~20mg的248不同的13残基肽的多数肽的简单方法。Houghten,R.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5131—5135(1985)。此“Simultaneous Multiple Peptide Synthesis(SMPS)”方法,还在Houghten等(1986)的美国专利第4,631,211号中作了记载。此方法中,用于各种肽固相合成的各种树脂,包含于各自的溶剂渗透性袋中,在与固相法相关联的多个相同的重复步骤中得到最佳使用。完整的使用方法,可同时进行500~1000或大于1000的合成(Houghten等,前面已出现,5134)。这些文献在本说明书中也作为参考引用。
一方面,本发明涉及具有本说明书中所述的k型S.mutans菌株rgpF多肽表位携带部分的氨基酸序列的多肽。具有本发明k型S.mutans菌株rgpF多肽表位携带部分的氨基酸序列的多肽,含有至少具有6个、7个、8个、9个、10个氨基酸的多肽部分,还包含由序列号1~4中任一项所示的碱基序列编码的、到本发明k型S.mutans菌株的rgpF多肽的全氨基酸序列长度为止、任意长度(包含全体)的表位携带部分的多肽。
本发明k型S.mutans菌株rgpF多肽的表位部分,用该领域公知的方法鉴定。例如,Geysen等(1984)公开了,将用于酶联免疫吸附试验反应的十分纯的几百个肽同時于固相载体上迅速合成的手法。因与合成肽的抗体相互作用,故不需将其从载体上除去,即可方便地检测。此种方式中,携带所希望的蛋白质免疫原性表位的肽,易被本领域技术人员鉴定。例如,口蹄疫病毒外壳蛋白的免疫学上重要的表位,是由Geysen等通过覆盖蛋白质213个氨基酸序列全体的全部208个可能的六肽的重複组(set)的合成,由7个氨基酸的解明而定位。之后,全部20个氨基酸按顺序在表位内的各位置,合成被取代的肽的完整取代组(set),且鉴定了赋予抗体反应特异性的特定氨基酸。因此,本发明的表位携带肽的肽信号,可通过此方法日常地制备。Geysen(1987)的美国专利第4,708,781号,进一步记载了此鉴定携带所需蛋白质免疫原性表位的肽的方法。
“免疫原性表位”定义为,蛋白质全体为免疫原时,诱发抗体应答的蛋白质的一部分。这些免疫原性表位,被限制在分子上的2、3个位点。同时,抗体可结合的蛋白质分子的区域,被定义为“抗原性表位”。蛋白质的免疫原性表位的数量,一般比抗原性表位的数量少。例如,可参照Geysen,H.M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002(1984)。
本发明的抗原性表位携带肽,在激发含有与本发明的多肽特异性结合的单克隆抗体的抗体上有用。因此,由用抗原表位携带肽免疫的供体的脾脏细胞融合所获得的杂交瘤的大部分,一般分泌与天然蛋白质具有反应性的抗体。由抗原性表位携带肽激发的抗体,对检测模拟蛋白质有用,而对于不同的肽的抗体,可在追踪接受了翻译后加工的蛋白质前体各种区域的踪迹时使用。在免疫沉淀试验中,既可与短肽(例如,约9个氨基酸),又可与更长的肽结合、取代,所以,肽及抗肽抗体,可用于模拟蛋白质的各种定性的或定量的检测,例如,在竞争试验中使用。例如,参照Wilson,I.A.等,Cell 37:767-778(1984)777。本发明的抗肽抗体,还在模拟蛋白质的纯化(例如,使用该领域中众所周知的方法,通过吸附色谱法)中有用。
根据上述指导设计的本发明的抗原性表位携带肽,优选包含在本发明的多肽的氨基酸序列中含有的至少7个,更优选至少为9个,最优选为约15~约30个氨基酸之间的序列。但是,包含本发明多肽的氨基酸序列约30~约50个氨基酸或到全体为止的任意长度及全体的长度,含有本发明多肽的氨基酸序列更大部分的肽或多肽,也是本发明的表位携带肽,且在诱导与模拟蛋白质反应的抗体时有用。表位携带肽的氨基酸序列,优选在水性溶剂中选择时,提供实质性溶解性的(即,其序列含有较亲水性残基,且优选避免高度疏水的序列);而且特别优选含有脯氨酸残基的序列。
使用本发明多核苷酸的重组方式,通过制备包含上述方式的肽时使用的任意以往的手段,可产生本发明的表位携带肽。例如,短的表位携带氨基酸序列,在重组体产生及纯化过程中、以及在用于产生抗肽抗体的免疫过程中,能与作为载体起作用的更大的多肽融合。表位携带肽还可使用化学合成的公知的方法合成。
本发明的表位携带肽,可通过该领域众所周知的方法,在诱导抗体时使用。例如,参照Chow,M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:910-914;及Bittle,F.J.等,J.Gen.Virol.66:2347-2354(1985)。一般地,动物可用游离肽免疫;但是,抗肽抗体的效价,可通过将肽与高分子载体[例如,钥孔血蓝素(keyholelimpet haemocyanm)(KLH)或破伤风类毒素]偶联,进行加强免疫。例如,含有胱氨酸的肽,可使用间—马来酰亚胺苯酰基(maleimide benzoyl)—N—羟基琥珀酰亚胺酯(hydoxysuccinimide ester)(MBS)链节(リンカ-)与载体偶联,另外,其他的肽可使用如戊二醛等更一般的连接剂与载体偶联。兔子、大鼠及小鼠等动物,是使用游离或载体偶联肽的任一种,例如,含有约100μg的肽或载体蛋白质及福式(Freund)佐剂的油质乳剂,通过腹腔内及/或皮内注射进行免疫。一些加强免疫注射,例如为使用吸附于固体表面的游离肽,提供可由ELISA试验检测的有用效价的抗肽抗体,例如,约需间隔2星期。免疫动物的血清中抗肽抗体的效价,通过抗肽抗体的选择,例如,可根据该领域众所周知的方法,通过肽在固相载体上的吸附及选择的抗体的洗脱,可得以增加。
(C)载体及细胞
本发明涉及用于生成k型S.mutans菌株的rgpF多肽的载体。本发明涉及的载体,可以是用于体外翻译的载体,也可以是用于重组表达的载体。
本发明还涉及,用于重组生成本发明涉及的k型S.mutans菌株rgpF多肽的,通过用含有本发明涉及的多核苷酸的重组构建物转化的宿主细胞及重组技术,产生k型S.mutans菌株的rgpF多肽或其片段的方法。
重组构建物可使用感染、转导、转染、电穿孔法、及转化的众所周知的技术导入宿主细胞。作为重组构建物的载体,例如,可以是噬菌体载体、质粒载体、病毒载体、或反转录病毒载体。反转录病毒载体可以复制或复制缺损。为后者时,病毒的增殖一般只在互补宿主细胞中产生。
把以表达为目的的多肽加以编码的多核苷酸,可使用该领域中众所周知的方法获得。公知的蛋白质的部分序列,可对所需位点设计引物,通过PCR扩增,获得对应的多核苷酸后,插入表达载体,即可在细胞内容易地获得。
对目的插入多核苷酸具有顺式作用调控区域的载体是优选的。适当的反式作用因子,可由宿主供给,可由互补载体供给,或可由向宿主导入时载体自身供给。
在特定的实施方式中,载体,优选的是提供具有诱导性及/或细胞特异性的特异性表达的载体。此种载体中特别优选的载体,是通过操作容易的环境因子,如温度及营养添加物调节的诱导性载体。
本发明中有用的表达载体,可例举为是染色体载体、附加型载体、及来源于病毒的载体[例如,细菌质粒、噬菌体(bacteriophage)、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒(例如,杆状病毒(Baculovirus)、乳多空病毒(papovavirus)、牛痘病毒(Vaccinia virus)、腺病毒(Adenovirus)、鸟痘病毒(pox virus)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)、及反转录病毒(retrovirus)]、以及来源于其组合的载体[例如,粘粒及噬菌粒(phagmid)]。
DNA插入物,应与适合的启动子(例如,噬菌体λPL启动子、E.colil???ac启动子、trp启动子、及tac启动子、SV40早期启动子及晚期启动子、以及反转录病毒LTR的启动子)可起作用地连接。其他适当的启动子,为本领域技术人员公知。表达构建物,包含用于转录开始、转录终止的部位、及转录区域中用于翻译的核糖体结合部位。由构建物表达的成熟转录物的编码部分,包含应被翻译的多肽在开始时的转录起始密码子,且包含终止时位于适当位置的终止密码子。
表达载体,优选至少含有1个选择性标记。此种标记,可例举为真核生物细胞培养时的双氢叶酸还原酶或新霉素抗性基因、E.coli及其他的细菌培养时的四环素抗性基因或氨苄青霉素抗性基因。适合的宿主的代表例,可例举为细菌(例如E.coli细胞、Streptomyces细胞、及Salmonella typhimurium细胞);真菌细胞(例如酵母细胞);昆虫细胞(例如Drosophila S2细胞及Spodoptera Sf9细胞);动物细胞[例如,CHO细胞、COS细胞、及Bowes黑素瘤细胞(melanoma cells)];以及植物细胞。用于上述宿主细胞的适当的培养培养基及条件,是该领域众所周知的。
优选的实施方式中,本发明涉及的载体,可表达细菌(特别是E.coli)中本发明涉及的k型S.mutans菌株的rgpF多肽。细菌中优选使用的载体中,包含pQE70、pQE60、及pQE—9(可由Qiagen获得);pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(可由Stratagene获得);以及ptrc99a、pKK223—3、pKK233—3、pDR540、pRIT5(可由Pharmacia获得)。
适于本发明中使用的公知的细菌启动子,包含E.coli lacI及lacZ启动子、T3启动子及T7启动子、gpt启动子、λPR启动子及λPL启动子、以及trp启动子。适合的真核生物启动子,可例举为CMV即刻早期启动子、HSV胸腺嘧啶核苷激酶启动子、早期SV40启动子及晚期SV40启动子、反转录病毒LTR的启动子[例如,劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)(RSV)的启动子]、以及金属巯基组氨酸三甲基内盐(metallothionneine)启动子(例如,小鼠金属巯基组氨酸三甲基内盐I启动子)。
其他的实施方式中,本发明涉及的载体,可表达高等真核生物细胞中本发明涉及的k型S.mutans菌株的rgpF多肽。高等真核生物细胞DNA的转录,可通过在载体中插入增强子序列来使其增大。为使所需的宿主细胞中启动子的转录活性增大,增强子通常为约10~300bp的DNA的顺式作用元件。增强子可例举为,SV40增强子(其位于复制起点的晚期侧上的100~270bp处)、巨细胞病毒的早期启动子增强子、复制起点的晚期侧上的多瘤病毒增强子、及腺病毒增强子。
优选的真核生物的载体,可例举为pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、及pSG(可由Stratagene获得);以及pSVK3、pBPV、pMSG、及pSVL(可由Phrmacia获得)。其他适合的载体,是本领域技术人员众所周知的。
向宿主细胞的构建物的导入,可通过磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导转染、阳离子脂质体介导转染、电穿孔法、转导、感染或其他的方法进行。这些方法在如Davis等,Basic Methods In Molecular Biology(1986)(在本说明书中作为参考引用)的很多标准化研究室使用指南中均有所记载。
通过高等真核生物的DNA的转录,可通过在载体中插入增强子序列而使其增大。为使所需的宿主细胞中启动子的转录活性增大,增强子通常为约10~300bp的DNA的顺式作用元件。增强子,可例举为SV40增强子(其位于复制起点的晚期侧的100~270bp处)、巨细胞病毒的早期启动子增强子、复制起点的晚期侧上的多瘤病毒增强子、及腺病毒增强子。
为向翻译后的蛋白质内质网的内质网内腔、或周质空间内、或细胞外环境分泌适宜的分泌信号,可整合进表达的多肽中。信号对于多肽可以是内因性的,或其还可以是异种信号。
因此,多肽可以融合蛋白质的被改变了的形态表达,并且不仅可包含分泌信号,还可包含附加的异种功能区域。例如,附加的氨基酸、特别是带电氨基酸区域,为改善宿主细胞内、纯化过程中、或继续操作及保存期间的稳定性及持续性,可附加于多肽的N末端。另外,为使纯化容易进行,可向多肽附加肽部分。这样的区域,可在多肽的最终制备前除去。尤其是,为产生分泌或排出、改善稳定性、及使纯化容易进行的肽部分向多肽的附加,是在本领域为人所知、日常的技术。优选的融合蛋白质,包含来源于对蛋白质可溶化有用的免疫球蛋白的异种区域。例如,EP A 0 464 533(另外,对应加拿大的申请2045869)公开了,在其他的人体蛋白质或其一部分,同时,在免疫球蛋白分子中含有恒定区的各种部分的融合蛋白质。很多情况下,融合蛋白质中的Fc部分,对治疗及诊断中使用十分有利,因此,例如产生改善了的药物动态学的特性(EP A 0232 262)。另外,对于一些使用如记载的有利形式中,融合蛋白质优选在表达、检测、及纯化后,Fc部分缺失。这是因为Fc部分在治疗及诊断中,成为使用中的障碍(例如,融合蛋白质应作为免疫用抗原使用时)。在药物探索中,例如hIL—5的人体蛋白质,为了用于鉴定hIL—5拮抗物的、高处理能力的筛选检测,可与Fc部分融合。参照D.Bennett等,Journal of Molecular Recognition Vol.8:52-58(1995)、及K.Johanson等,The Journal of Biological Chemistry Vol.270,No.16,9459-9471页(1995)。
k型S.mutans菌株的rgpF多肽,可根据众所周知的方法(例如,硫酸铵沉淀或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水作用色谱法、亲和层析法、羟基磷灰石色谱法、及外源凝集素色谱法)从重组细胞培养物中回收、纯化。最优选使用高效液相色谱法(“HPLC”)纯化。
因此,本发明涉及的载体,至少含有本发明涉及的多核苷酸即可。即,还应注意,表达载体以外的载体也包含于本发明技术范围内。
另外,本发明涉及的细胞,可以说至少包含本发明涉及的载体即可。即,还应注意市场销售的细胞以外的初代培养细胞,也包含于本发明的技术范围内。
也就是说,本发明的目的,是提供含有本发明涉及的多核苷酸的载体、及含有该载体的细胞,而并非本说明书中具体记载的各种载体种及细胞种、以及载体制备方法及细胞导入方法。因此,必须注意,使用上述以外的载体种及细胞种、以及载体制备方法及细胞导入方法获得的载体及细胞,也属于本发明的范围。
(D)细菌
本发明提供分离的血清型k的S.mutans菌株。本发明血清型k的S.mutans菌株,优选使用以下详述的、与血清型k的S.mutans菌株特异性结合的抗体,由生物学样品分离。优选的血清型k的S.mutans菌株,可例举为血液分离菌株2菌株(TW295及TW871)、口腔分离菌株154菌株(FT1~FT51、SU1~SU51、及YK1~YK50、以及AT1及YT1),但不限于此。术语“生物学样品”,是指可从个体、体液、细胞株、组织培养物、或血清型k的S.mutans菌株蛋白质或含有其DNA或mRNA的其他的供给源中获得的、任意的生物学样品。生物学样品,可例举为含有血清型k的S.mutans菌株蛋白质的体液(例如血液、唾液、牙垢、血清、血浆、尿、滑液及髓液)或具有表达血清型k的S.mutans菌株蛋白质可能性的组织供给源。在本说明书中使用时,术语“组织样品”,是指由组织供给源中获得的生物学样品。用于从哺乳动物中获得组织活检及体液的方法,是该领域众所周知的。生物学样品含有mRNA时,组织活检是优选的供给源。在本说明书中使用时,术语“样品”也可例举为,在上述生物学样品及上述组织样品以外,从上述生物学的样品及上述组织样品中提取的基因组DNA样品及/或总RNA样品。
一方面,本发明提供S.mutans的血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的S.mutans菌株。在本说明书中使用时,术语“S.mutans的血清型c、e或f的菌株特异性多糖类的葡萄糖侧链量降低”,是指使用S.mutans的血清型c、e或f菌株特异性的已知的抗体不能检出之意。因此,参照本说明书,此术语不是指完全没有S.mutans的血清型c、e或f菌株特异性多糖抗原的葡萄糖侧链,而是指对于S.mutans的血清型c、e或f菌株特异性已知的抗体,其抗原性显著降低了的状态,本领域技术人员应容易理解。
(E)抗体
本发明提供与S.mutans的血清型c、e、或f菌株特异性多糖抗原的葡萄糖侧链量降低了的血清型菌株特异性结合的抗体。本发明优选提供与血清型k的S.mutans菌株特异性结合的抗体。在本说明书中使用时,术语“抗体”是指免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及这些的Fab片段、F(ab’)2片段、Fc片段),例如,可例举为多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗独特型抗体及人源化抗体,但不限于此。本发明的抗体,用以往的免疫方法不能获得,但通过不断创造免疫方法可以获得。而且,本发明的抗体,是将具有k型以外血清型的已知的S.mutans菌株,使用由公知的葡萄糖侧链的缺失方法制备的突变株进行制备。而且,本发明的抗体,是将本发明的多肽用作抗原来制备。本发明的抗体对血清型k的S.mutans菌株的检测及/或诊断有用。
在本说明书中使用时,术语“血清型k的S.mutans菌株的抗体”,是指包含可与血清型k的S.mutans菌株抗原特异性结合的完整分子及抗体片段[例如,Fab及F(ab’)2片段]。Fab及F(ab’)2片段缺少完整抗体的Fc部分,通过循环可进一步迅速除去,且基本不具有完整抗体的非特异性组织结合[Wahl等,J.Nucl.Med.24:316-325(1983)]。因此,这些片段也是优选的。
或者,可与血清型k的S.mutans菌株抗原进一步结合的抗体,可通过抗独特型抗体的使用,由两步骤产生。此种方法,使用抗体自身即抗原的事实,因此,可得到与二次抗体结合的抗体。根据此方法,血清型k的S.mutans菌株特异性抗体在动物(优选小鼠)免疫时使用。之后,此种动物的脾细胞,用于产生杂交瘤细胞时使用,并且杂交瘤细胞,为了鉴定产生与血清型k的S.mutans菌株特异性抗体结合的能力,通过血清型k的S.mutans菌株抗原产生被阻断的抗体的克隆,而进行筛选。此类抗体含有对血清型k的S.mutans菌株特异性抗体的抗独特型抗体,且把用于诱导更多的血清型k的S.mutans菌株特异性抗体形成的动物,用于免疫。
已很明确,Fab及F(ab’)2以及本发明抗体的其他片段,可按照本说明书中公开的方法使用。此种片段,代表性地可使用如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶[产生F(ab’)2片段]的酶,通过蛋白质分解由切断产生。或血清型k的S.mutans菌株结合片段,可通过重组DNA技术的适用或化学合成而产生。
为在人体中诊断,使用生物体内成像,检测上升水平的血清型k的S.mutans菌株时,可优选使用“人源化”嵌合单克隆抗体。此种抗体,可使用来源于生成上述单克隆抗体的杂交瘤细胞的遗传构建物生成。生成嵌合抗体所用的方法,是该领域中公知的。总的来说,可参照Morrison,Science 229:1202(1985);Oi等,BioTechniques 4:214(1986);Cabilly等美国专利第4,816,567号;Taniguchi等,EP 171496;Morrison等,EP 173494;Neuberger等,WO 8601533;Robinson等,WO 8702671;Boulianne等,Nature 312:643(1984);Neuberger等,Nature 314:268(1985)。
因此,本发明涉及的抗体,可以说至少具备识别本发明涉及的k型S.mutans菌株的抗体片段[例如,Fab及F(ab’)2片段]即可。即应注意,由识别本发明涉及的k型S.mutans菌株的抗体片段、与不同的抗体分子的Fc片段组成的免疫球蛋白也包含于本发明。
即,本发明的目的,是提供识别本发明涉及的k型S.mutans菌株的抗体,而不局限于本说明书中具体记载的各个免疫球蛋白的种类(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)、嵌合抗体的制备方法、肽抗原制备方法等。因此,必须注意,根据上述各方法以外的方法获得的抗体,也属于本发明的范围内。
(2)血清型k的S.mutans菌株的检测法及诊断法
本发明涉及的S.mutans的血清型检测法及诊断法,是检测及诊断可存在于被检体中的血清型k的S.mutans菌株的方法。
含有感染粒子、或代谢产物、核酸、及蛋白质的疾病指标的分子的检测,是医学上疾病的诊断及治疗、以及研究中基本的要素。很多的方法论在现今的检测中仍然使用。这些方法论,一般可分为,对引发疾病的因子的成分进行编码的遗传物质核酸的诊断检测、及对引发疾病的因子或疾病的副产物的任一成分的蛋白质的抗体为基础的诊断检测。
本发明提供在生物学样品中,特别是从被检体中获得的组织或其他的细胞或体液中,通过检测把参与血清型k的S.mutans菌株特异性多糖抗原生物合成的酶加以编码的多核苷酸,诊断血清型k的S.mutans菌株相关障碍的方法。
(A)对核酸的检测法及诊断法
对核酸的检测,涉及从用于检测多核苷酸(核酸分子)存在的放射性标记探针的Northern印迹杂交法的单纯方法,到通过杂交技术,于序列检测中使用的、用于扩增非常少量的特定核酸序列的聚合酶链式反应(PCR)的范围。核苷酸探针,可使用市场销售的染料、或酶、荧光、化学发光、或放射性的标记进行标记。这些探针,在通过杂交,检测细胞中或组织试样中的基因或相关序列(此处,其基因是通常的成分)的表达,及筛选被怀疑具有由生物感染产生的疾病的人体血清或组织试样时使用。引物还可在使用反转录酶或DNA聚合酶及聚合酶链式反应制备的、组织或液体中非常少量存在的多核苷酸的检测时使用。
聚合酶链式反应(PCR),特别是在克隆、基因表达的分析、DNA序列鉴定、遗传作图、药物发现等方面适用,且是非常重要的手段。例如,参照Innis等,PCR Protocols A guide to Methods and Applications,Academic Press,San Diego(1990);及美国专利第4,683,195,4,683号。
本发明提供检测血清型k的S.mutans菌株的方法,该法包括将由序列号1~4中所示的碱基序列的至少12个连续碱基序列或其互补序列组成的寡核苷酸作为引物使用,以进行PCR反应的步骤。PCR试剂及方法,可由Perkin Elmer,761 Main Ave.,Norwalk,Conn.06850;或Roche MolecularSystems,1145 Atlantic Ave.,Suite 100,Alameda,CA 94501获得。优选的PCR反应,将20ml的PCR反应液[含有20ng/μl的基因组DNA5μl、dNTP混合物2μl、10×PCR缓冲液2μl、正向引物(20pmol/μl)1μl、反向引物(20pmol/μl)1μ1、AmpliTaq Gold 0.1μl、MilliQ水8.9μl],用94℃、预变性5分钟后,进行94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒的30个循环,之后再用72℃、延伸7分钟,但并不限于此。在本说明书中使用时,术语“至少12个”是指12、13、14、15、或其以上的整数。根据本发明,可有效且高效地鉴定出,从被检体所得到的样品中是否存在血清型k的S.mutans菌株。
传统的技术中,PCR及杂交过程是分别操作进行的。但是,通过组合PCR及杂交过程所获得的优点也有很多:(i)只需单一的试剂添加步骤,由此,不需打开反应试管,即可进行此组合的反应,由此可减少样品混合及样品污染的机会;(ii)需要的试剂更少量;(iii)需要的试剂添加步骤更少,自动化更容易;并且(iv)在正常的方法中,为了保护热循环期间细胞样品的完整性而把使用的样品密闭(containment)组装以防不必要的分解。单一的反应中,将PCR与杂交过程组合的1种存在的方法是作为“Taqman”的已知技术。例如,参照Holland等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280(1991)。
原位的PCR,是指为使特定扩增后的核酸在原本含有靶核酸序列的细胞或下位的细胞结构中实质性含有,而在被固定的细胞中实行的PCR扩增。细胞可在水性悬浮液中,或也可以是组织样品的部分(例如,组织化学的切片或细胞化学的弥散条带)。在本说明书中使用时,术语“组织化学的切片”,是指被冻结或化学方式固定,通过包埋在蜡或塑料中固定,于薄板(代表性的是数微米的厚度)上切片,并且附着在固相载体(例如,显微镜幻灯片)的生物学组织的固体样品,而术语“细胞化学的弥散条带”是指被化学方式固定,且附着于显微镜幻灯片的细胞(例如,血球)的悬浮物。细胞,优选通过如蛋白酶酶切、使用表面活性剂或有机溶剂的液体提取、或透过(permeabilization)法等其他的方法,使其对PCR试剂为透过性。
在本说明书中使用时,术语“被固定的细胞”,是针对通过溶剂变化、温度变化、机械压力、或干燥产生破裂而强化的细胞结构(特别是膜)进行化学处理后的生物学细胞样品。细胞,可固定于悬浮物中,或作为组织样品的部分被固定,任一种均可。细胞固定液,一般是通过使细胞结构的蛋白质组成要素,最一般性地是与蛋白质氨基反应而交联的化学药品。优选的固定液,含有福尔马林缓冲液、95%乙醇、甲醛、多聚甲醛、及戊二醛。被固定的细胞的透过性,可通过蛋白酶、或表面活性剂、或用溶解膜脂质的有机溶剂处理而使增加。
本发明提供检测血清型k的S.mutans菌株的方法,该法进一步包含将序列号1~4中所示的碱基序列的至少12个连续碱基序列或其互补序列组成的寡核苷酸作为探针使用,以进行杂交反应的步骤。根据本发明,可有效且高效地鉴定出由被检体获得的样品中存在的S.mutans菌株。
本发明的寡核苷酸,作为通过与染色体原位杂交而进行基因作图,以及作为通过例如Northern印迹法分析,检测人体组织中血清型k的S.mutans菌株表达用的探针是有用的。如以下的详细记载,检测特定组织中血清型k的S.mutans菌株基因表达的变化,可提示特定的疾病及/或病灶。
在优选的实施方式中,本发明的寡核苷酸被标记。作为适当的标记,例如,可以举出来源于通过催化与底物反应、生成过氧化氢的氧化酶群的酶。葡萄糖氧化酶,因其具有良好的稳定性,且其底物(葡萄糖)易获得,所以特别优选。氧化酶标记的活性,可通过测定由酶—标记抗体/底物反应形成的过氧化氢的浓度进行检测。除酶以外,其他适当的标记,可例举为放射性同位素[例如,碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)、及锝(99mTc)]、以及荧光标记(例如,荧光素(Fluorescein)及罗丹明)以及生物素。
(B)针对蛋白质的检测法及诊断法
对蛋白质的检测方法,可进一步分为分子(通常抗体)与被检蛋白质间的结合反应;或包含可使酶活化,产生可检测的颜色变化的底物裂开,酶与酶结合的目的分子间的反应。多数的结合检测,含有染料、酶或放射性或荧光标记,增強检测。针对蛋白质的抗体,可从患者、免疫动物、或抗原特异性单克隆细胞株获得。这些抗体检测,包含夹心ELISA检测、Western印迹法、放射性免疫测定、及免疫扩散检测等检测。其他的检测,采用用于分子固定化及检测的抗生物素蛋白及生物素等分子。制备这些试剂的技术及使用它的方法,是本领域技术人员公知的。
本发明提供检测血清型k的S.mutans菌株的方法,该法包含使用变形链球菌的血清型c、e、或f菌株特异性多糖类葡萄糖侧链量降低了的血清型的菌株特异性结合的抗体,进行免疫反应的步骤。。在本说明书中使用时,术语“免疫反应”,可例举为夹心ELISA检测、Western印迹法、放射性免疫测定、及免疫扩散检测等检测,但不限于此。根据本发明,可有效且高效地鉴定出,从被检体获得的样品中是否存在血清型k的S.mutans菌株。
如上所述,根据本发明,可鉴定出侵入血液中时是否携带不易受多型核白血球吞噬作用的S.mutans菌株。而且,通过与其他主要的病原菌鉴定法组合,可使预防感染性心内膜炎的对象者减少,使抗生素的使用量降低,通过抗生素的使用,还可抑制抗性菌的出现。
本发明进一步提供,使用与本说明书中所述的血清型k的S.mutans菌株特异性结合的抗体、诊断血清型k的S.mutans菌株的方法。作为使用抗体的检测方法,可例举为夹心ELISA检测、Western免疫印迹法、放射性免疫检测、及免疫扩散检测的检测。其他的检测,采用用于进行分子固定化及检测的抗生物素蛋白及生物素等分子。这些试剂的制备技术及其使用方法,是本领域技术人员公知的。
生物学样品中血清型k的S.mutans菌株蛋白质水平的检测,可使用该领域任意的公知方法进行。基于抗体的技术,在用于检测生物学样品中血清型k的S.mutans菌株的蛋白质水平时是优选的。例如,组织中血清型k的S.mutans菌株蛋白质的表达,可用包含Western印迹法检测或点印迹法检测的、传统的免疫组织化学方法进行研究。此时,特异性识别虽可通过一次抗体(多克隆或单克隆)提供,但二次检测体系可利用由荧光、酶、或其他结合的二次抗体。其结果是,可得到用于病理学检测的组织切片的免疫组织化学染色。
根据用于检测血清型k的S.mutans菌株蛋白质水平时有用的其他抗体的方法,包含免疫分析[例如,酶联免疫吸附试验(ELISA)及放射免疫分析(RIA)]。例如,血清型k的S.mutans菌株特异性单克隆抗体,可用于检测及定量血清型k的S.mutans菌株蛋白质的、作为免疫吸附剂及酶标记探针的两种功能。样品中存在的血清型k的S.mutans菌株蛋白质的量,可使用线性回归计算机算法,通过与标准制备物中存在的量的比较来计算。用于检测抗原的此种ELISA,如Iacobelli等,Breast Cancer Research andTreatment 11:19-30(1988)中所述。在其他的ELISA检测中,2种不同的特异性单克隆抗体,可用于检测体液中血清型k的S.mutans菌株蛋白质。在此检测中,一方面抗体可作为免疫吸附剂使用,另一方面还可作为酶标记探针使用。
适当的酶标记,例如,包含催化来源于与底物反应、生成过氧化氢的氧化酶的标记。葡萄糖氧化酶,因其具有良好的稳定性,且其底物(葡萄糖)易获得,所以是特别优选的。氧化酶标记的活性,可通过测定由酶—标记抗体/底物反应形成的过氧化氢浓度进行检测。不仅酶,作为其他适当的标记,还可例举为放射性同位素[例如,碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)、及锝(99mTc)]、以及荧光标记[例如,荧光素(Fluorescein)及罗丹明]以及生物素。
除可检测从个体中获得的生物学样品中的血清型k的S.mutans菌株水平外,血清型k的S.mutans菌株,还可通过图像分析进行生物体内检测。用于血清型k的S.mutans菌株生物体内图像分析的抗体标记或标记物,可例举为通过X射线摄影法、NMR、或ESR可检测的抗体标记或标记物。X射线摄影法,其适当的标记,可以举出发射可检测的放射线,但对被检体无明显危害的钡或铯的放射性同位素。用于NMR及ESR的适当的标记物,可以举出通过相关的杂交瘤营养成分标记掺入抗体中,具有如重氢的可检测的特征性旋转的物质。
通过放射性同位素(例如,131I、111In、99mTc)、放射性不透过体(radio-opaque)底物、或核磁共振可检测的物质的适当的可检测图像分析部分进行标记的血清型k的S.mutans菌株特异性抗体或抗体片段,导入对于病症进行检测的哺乳动物中(例如,非经口的、皮下、或静脉内)。通过被检体的大小及使用的图像分析系统,可确定形成诊断用图像的必要的图像分析部分的量,其已被该领域理解。为放射性同位素部分时,对于人体被检体,注射的放射活性的量,通常约为5~20毫居里范围的99mTc。之后,标记抗体或抗体片段,在包含血清型k的S.mutans菌株细胞的位置优先积累。生物体内的肿瘤图像分析,如S.W.Burchiel等,《Immunopharmacokinetics ofRadiolabeled Antibodies and Their Fragments》[Tumer Imaging第13章:TheRadiochemical Detection of Cancer,Burchiel,S.W.及Rhodes,B.A.编,Masson Publishing Inc.(1982)]中所述。
对于本发明的血清型k的S.mutans菌株特异性抗体的进一步适当的标记提供如下。作为适当的酶标记例,可例举为磷酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、酵母乙醇脱氢酶、α—甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β—半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖—6—磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶、及乙酰胆碱脂酶。
作为适当的放射性同位素标记例,可例举为3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd等。111In是在生物体内使用图像分析时优选的同位素。这是由于,要回避由用125I或131I标记的单克隆抗体的肝脏脱卤化反应的问题。而且,此放射性核种为用于图像分析,更优选具有γ释放能[Perkins等,Eur.J.Nucl.Med.10:296-301(1985);Carasquillo等,J.Nucl.Med.28:281-287(1987)]。例如,使用1—(P—异硫氰酸苄酯(isothiocyanate benzyl))—DPTA与单克隆抗体偶联的111In,基本上未显示在非肿瘤性组织(特别是肝脏)中的掺入。因此,增强了肿瘤局部存在的特异性[Esteban等,J.Nucl.Med.28:861-870(1987)]。
作为适当的非放射性同位体标记例,可例举为157Gd、55Mn、162Dy、52Tr、及56Fe。
作为适当的荧光标记例,可例举为152Eu标记、荧光素标记、异硫氰酸酯标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、邻—酞醛标记、及萤光胺标记。
作为适当的毒素标记例,可例举为白喉毒素、蓖麻子蛋白、及霍乱毒素。
作为化学发光标记例,可例举为鲁米诺(Luminol)标记、异鲁米诺(Isoluminol)标记、芳香族吖啶鎓酯(acridinium ester)标记、咪唑鎓盐标记、吖啶盐(acridinium)标记、草酸酯标记、底物荧光素(Luciferin)标记、荧光素酶(Luciferase)标记、及发光蛋白(Aequorin)标记。
作为核磁共振对比剂例,可例举为Gd、Mn、及Fe的重金属原子核。
用于将上述标记与抗体结合的代表性技术,可由Kennedy等[Clin.Chim.Acta70:1-31(1976)]及Schurs等[Clin.Chim.Acta 81:1-40(1977)]提供。后者提及的偶联技术,是戊二醛交联法、过碘酸氧化法、双马来酰亚胺法、m—马来酰亚胺苄基—N—羟基—琥珀酰亚胺酯法,这些方法均可作为本说明书中的参考来引用。
(C)血清型k的S.mutans菌株的筛选
本发明提供从生物学样品中筛选血清型k的S.mutans菌株的方法。一方面,本发明使用含有序列号1~4中所示的碱基序列的、且由S.mutans的血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的血清型菌株特异性碱基序列或其互补序列组成的多核苷酸或其片段,筛选S.mutans的血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的血清型菌株的方法。优选的实施方式中,上述S.mutans的血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的血清型菌株,是血清型k的S.mutans菌株。更优选的实施方式中,本发明的筛选方法,进一步包含使用本发明的抗体鉴定S.mutans菌株血清型的步骤。
另一方面,本发明使用与S.mutans的血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的血清型菌株特异性结合的抗体,提供筛选S.mutans的血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的血清型菌株的方法。优选的实施方式中,上述S.mutans的血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的血清型菌株是血清型k的S.mutans菌株。更优选的实施方式中,本发明的筛选方法,进一步包含使用本发明的多核苷酸或其片段、鉴定S.mutans菌株的血清型的步骤。
本发明进一步提供,使用上述筛选方法鉴定的、S.mutans的血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的血清型菌株。优选的实施方式中,上述S.mutans的血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链量降低了的血清型菌株,是血清型k的S.mutans菌株。更优选的实施方式中,上述血清型k的S.mutans菌株,可例举为TW295、TW871、FT1~FT51、SU1~SU51、YK1~YK50、FT1GD、YK1R、AT1及YT1,但不限于此。
(3)血清型k的S.mutans菌株的检测试剂盒及诊断试剂盒
本发明涉及的S.mutans的血清型鉴定试剂盒,是鉴定作为鉴定对象的S.mutans菌株是否是上述k型的试剂盒。
本发明提供的试剂盒,其是用于检测具备由序列号1~4中所示的碱基序列的至少12个连续碱基序列或其互补序列组成的寡核苷酸的,血清型k的S.mutans菌株。为本发明的试剂盒,优选进一步具备与c型、e型或f型的S.mutans菌株特异性结合的寡核苷酸。更优选为上述寡核苷酸已被标记。根据本发明,可简便地鉴定患者是否携带血清型k的S.mutans菌株。特别是,还可检测出检测极限以下的病例中血清型k的S.mutans菌株。
一方面,本发明的试剂盒是,上述寡核苷酸为PCR引物。在优选的实施方式中,本发明的试剂盒,进一步包含用于PCR反应的试剂。
另一方面,本发明的试剂盒是,上述寡核苷酸为杂交探针。更优选的实施方式中,本发明的试剂盒,进一步包含用于杂交反应的试剂。
在一实施方式中,本发明的试剂盒的特征在于,具备由序列号9中所示的碱基序列组成的寡核苷酸。本实施方式涉及的试剂盒,优选进一步具备序列号8中所示的碱基序列组成的寡核苷酸,更优选进一步具备由序列号10中所示的碱基序列组成的寡核苷酸。
本发明还提供用于检测,具备与血清型k的S.mutans菌株多糖抗原特异性结合的抗体的血清型k的S.mutans菌株的试剂盒。优选上述寡核苷酸被标记。根据本发明,可简便地鉴定出患者是否携带血清型k的S.mutans菌株。特别是,还可检测出至今为止、为检测极限以下的病例中血清型k的S.mutans菌株。
(4)血清型k的S.mutans菌株的检测器具及诊断器具
本发明涉及的细菌检测器具,是用于检测鉴定样品中的细菌的器具,基于对象细菌所属的种或属中的特异性碱基序列的寡核苷酸固定于载体表面,通过该寡核苷酸与来源于样品的核酸进行杂交,检测鉴定样品中的细菌。用于血清型k的S.mutans菌株的检测时,上述寡核苷酸,包含把参与血清型k的S.mutans菌株特异性多糖抗原生物合成酶加以编码的多核苷酸的碱基序列中至少12个连续碱基序列或其互补序列。另外,在全面检查其他种的细菌时,包含其他种的细菌(也可为多种)特异性碱基序列的寡核苷酸,也于载体上固定是优选的。因此,通过使含有多种细菌的样品用于检测时,也可知血清型k的S.mutans菌株具有与何种细菌种共存的倾向。
(A)载体
用于本发明涉及的细菌检测器具的载体的材质,只要可稳定地固定寡核苷酸均可。例如,可为聚碳酸酯、塑料等的合成树脂、玻璃等,但不限于此。载体的形态也无特别限定,例如,可优选使用板状、膜状等的载体。
〔被固定于载体表面的寡核苷酸〕
被固定于本发明涉及的细菌检测器具的载体表面的寡核苷酸,只要是基于被检体细菌属于的种或属中特异性碱基序列的寡核苷酸均可。通过该寡核苷酸与来源于样品的核酸间的杂交成立,即可检测出样品中含有的、属于目的种或属的细菌。还有,根据上述被检体细菌所属的种或属的特异性碱基序列的寡核苷酸,以下均称为“Capture Oligo”。
上述特异性碱基序列,只要能从被检体细菌的基因组的碱基序列中找到属或种的特异性碱基序列即可,但从对应于被检体细菌的核糖体RNA基因的碱基序列中发现是优选的。其中,已知细菌的16S核糖体RNA基因大量含有属或种的特异性碱基序列,所以,从对应于16S核糖体RNA基因的DNA序列中,发现属或种的特异性碱基序列是特别优选的。核糖体RNA基因的碱基序列,可从GenBank、EMBL、DDBJ等数据库等中获得。
Capture Oligo,根据上述属或种的特异性碱基序列设计即可。因此,可以是上述属或种的特异性碱基序列本身,只要与由被检体细菌制备的核酸的特异性杂交成立,也可含有突变。突变的位置未特别限定。
Capture Oligo的长度(碱基数)未特别限定,但过短时,杂交检测较困难,过长时,会允许非特异性杂交。发明者等对Capture Oligo的最佳长度进行了探讨,将标准的长度定为12~50碱基长。优选为12~40碱基长,更优选为12~30碱基长,最优选为13~22碱基长,但不限于此。碱基长主要依赖于序列特性(特定的碱基含有率,同一碱基的重复),结合性好的,即使是短链,也可进行特异性杂交,其已被发明者等鉴定。
Capture Oligo具有妨碍与来源于样品的核酸杂交的发夹结构、茎环结构、或其他的立体结构时,可通过将组成Capture Oligo的1个或大于1个的核苷酸取代为不联合肌苷或任一个核苷酸的核酸,以解除其立体结构。
Capture Oligo的合成法未特别限定,由公知的方法[例如,Maniatis,T.etal.,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)中所述的方法等]合成即可。一般地,可使用市场销售的DNA合成机进行化学合成。
本发明涉及的细菌检测器具,不只是基于上述被检体细菌所属的种或属的特异性碱基序列的寡核苷酸,而且,优选将所谓的对照Capture Oligo固定于载体表面。对照Capture Oligo中,包含阳性对照Capture Oligo及阴性对照Capture Oligo。阳性对照Capture Oligo,是在后述的探针制备步骤中,鉴定扩增反应是否顺利进行时使用的物质。阴性对照Capture Oligo,是鉴定不产生非特异性杂交,即,不产生假阳性杂交信号时使用的物质。这些阳性对照Capture Oligo及阴性对照Capture Oligo被固定于载体表面的细菌检测器具,也包含于本发明。
阳性对照Capture Oligo,只要是根据由检测对象细菌制备的探针中含有的碱基序列设计的物质即可。另外,将多个检测对象细菌同时使用同一细菌检测器具进行检测时,可设计针对各检测对象细菌的阳性对照Capture Oligo,但也可以根据多个检测对象细菌中制备的探针的共有碱基序列设计。没有与所有的检测对象细菌中制备的探针共有的碱基序列时,可分成各个小组,分别设计阳性对照Capture Oligo。或者也可设计引物序列部分相同,对象细菌的序列不同的人工序列,将此序列的一部分作为阳性对照Capture Oligo。以上述人工序列为模板制备探针(本说明书中,将此种探针称为对照探针),通过添加于从样品制备的探针中,可检验杂交的特异性。还有,上述探针如后所述。
阴性对照Capture Oligo,在阳性对照Capture Oligo的碱基序列中,为1碱基或大于1碱基,且优选设计为,使在该序列所具有的碱基数低于20%的范围内,包含人为的碱基置换的碱基序列。进行碱基置换的碱基数,由与杂交条件的关系来决定,选择来源于检测对象细菌的探针不产生杂交的碱基数。
对检测对象细菌未作特别限定,从目的样品中,适当选择欲检测的细菌即可。例如,可例举为混入食品中的具有污染该食品可能性的细菌。食品中混入有害细菌,在公共卫生上是非常严重的问题。通过上述食品污染细菌的存在及/或与其量的比较,可测定本发明的血清型k的S.mutans菌株的存在及/或其量。
污染食品的细菌,可例举为属于乳杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediocuccus)、链球菌属(Streptococcus)、巨球形菌属(Megasphaera)及Pectinatus的细菌。另外,属于乳杆菌属(Lactobacillus)的细菌种,可例举为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、Lactobacillus coryniformis、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、Lactobacillus lindneri、Lactobacillusmalefermentans、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri),属于明串珠球菌属(Leuconostoc)及发酵单胞菌属(Zymomonas)的细菌,以及耐久肠球菌(Enterococcus durans)及乳酸菌(Lactococcus lactis)。但检测对象细菌不限于此。
作为用于检测鉴定上述例举的细菌的Capture Oligo,可以例举为对应于上述列举的细菌16S核糖体RNA基因的碱基序列中,基于各属的特异性序列的寡核苷酸,但不限于这些。
在本发明涉及的细菌检测器具载体表面固定的Capture Oligo,只要是与从对象细菌制备的探针的杂交成立即可,而未作特别限定。
固定于1个载体上的Capture Oligo,至少应为1种或大于1种,而无特别的上限。一般地,检测混入试样中的细菌时,可将样品中可检测出的细菌用1个载体全面地检测的方式,从操作的简便性及检查的迅速性的观点看可谓优选。因此,本发明涉及的细菌检测器具,在1个载体上,固定多个对应于目的细菌种或属的Capture Oligo,即所谓的微阵列型器具是最优选的。
(B)寡核苷酸(Capture Oligo)的固定化
向寡核苷酸的载体表面固定化的方法,未作特别限定,可适当选择公知的方法使用。例如,可利用物理吸附、电结合或分子共价结合等一般的杂交法中使用的手法。本发明涉及的细菌检测器具中,优选使用表面具有碳化二亚胺基或异氰酸酯基的基材(美国专利:US 5,908,746、日本特开平8—23975号)进行固定。将寡核苷酸点样时,当寡核苷酸的点量过少时,不能充分确保寡核苷酸与探针之间的反应性,给鉴定带来困难。而高密度的点样,带来技术上的问题,同时,还有成本问题,而且,使用了探针的荧光标记及化学显色等的杂交信号的检测,需要更精密、高昂的检测装置(例如,扫描仪)。因此,寡核苷酸在载体表面以直径10~1,000μm范围固定是优选的。向寡核苷酸的载体上点样的方法,无特别限定。例如,可使用点样仪,在载体上将寡核苷酸溶液进行点样。所以,寡核苷酸溶液通常近似圆形地点样。
(5)本发明的用途
通过使用本发明,可简便地鉴定患者是否携带感染性心内膜炎病原菌之一的S.mutans中具有高病原性的菌株。特别是,可检测出至今为止为检测极限以下的病例中的病原菌。而且,可限制个体携带感染性心内膜炎发病危险性高的菌株,由此可抑制为预防感染性心内膜炎而使用大量的抗生素,还可抑制由于抗生素的乱用引起的抗药性菌的出现。另外,可知病原菌S.mutans菌株与症状间的相关关系,同时,还可提供与其他病原菌间关系的更多的信息。
实施例
以下根据实施例对本发明进行更加详细地说明,但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
(A)S.mutans临床口腔分离株的收集及S.mutans血清型的鉴定
从本发明者的实验室储存库中选取1982年到1990年间从571名幼儿体内分离的1326个S.mutans菌株(分离株的MT4000系列或MT10000系列)。
此外,还随机选取了从2002年8月在大阪大学齿学部医院小儿齿科(日本国大阪府吹田市)看病的100人的被检体(3~17岁,平均8、9岁)上得到的菌株(NN2000系列)。这些被检体包括88名健康的幼儿,5名患唇裂、上鄂裂的患者,3名患心室中隔膜缺损的患者,2名患牙釉质发育不全的患者,1名患脊柱裂的患者以及1名患自闭症的患者。
按照有关人体被检体研究的大阪大学伦理委员会的规定,收集临床标本。将菌斑样品悬浮于灭菌的PBS中,稀释,然后平铺在含有杆菌肽(0.2单位/ml:Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.)和15%(w/v)蔗糖的MS琼脂培养基(Difco)上。根据菌落的形态,从每个被检体上各选择1个菌落以供试验使用。
根据Masuda,N.et al.,1985.Transmission of Streptococcus mutansin some selected families.Microbios.44:223-232所述的方法,取得S.mutans菌株的c型、e型及f型的抗血清,通过使用抗血清的免疫扩散法,决定上述临床标本的血清型。
MT系列的1326株全部分类为血清学c、e或f,没有发现血清型不确定的分离株。另一方面,NN2000系列的100株中,78株分类为血清型c、17株分类为血清型e、3株分类为血清型f,剩下的2株(FT1(NN2011)及SU1(NN2029)),没有与c型、e型及f型的特异性抗血清发生反应(表1)。此外,分别从具有血清学不定株(FT1株或SU1株)的被检体内分离了50个菌落。
[表1]
(S.mutans临床口腔分离株的2个系列中的血清型分布)
(B)S.mutans菌株
使用上述S.mutans菌株的c型、e型及f型的抗血清,鉴定S.mutans血液分离株TW295、TW871、TW964及TW1378分别为血清型不确定菌株、血清型不确定菌株、f型株和e型株。这些S.mutans菌株和上述口腔分离株MT8148(c型株)、MT4245株(e型株)、及MT4251(f型株)的特征如表2所示。
[表2]
(本实施例使用的细菌株)
(C)S.mutans的抗血清的制备
取得S.mutans血清型不确定菌株的抗血清。因为新型血清型的S.mutans的抗血清的抗原性显著降低,所以采用原来的方法得不到抗血清,本发明者通过对免疫方法进行研究,成功得到其抗血清。
具体为:将S.mutans的TW295株和TW871株的全菌体悬浮于磷酸缓冲生理盐水(PBS)中,使每种菌体以每天5mg干燥重量的量向兔子耳缘静脉内注射,连续注射5天。间隔1周时间后,后2周内每周反复注射5天,从兔子耳静脉内采血,得到S.mutans的TW295株和TW871株的抗血清。
(D)葡萄糖侧链缺失突变株的构建及其细菌学特征、血清学特征
在gluA基因上插入抗生素抗性基因并使其失活,从而构建MT8148的葡萄糖侧链缺失(GD)突变株。从S.mutans菌株Xc(GenBank accessionno.AB001562)及Oklahoma大学公开的S.mutans基因组数据库(GenBankaccession no.AE014133)取得gluA序列,以此序列为基础设计引物,使用该引物和AmpliTaq Gold聚合酶(Applied Biosystems,Foster City,Calif)进行聚合酶链式反应(PCR),通过该反应扩增gluA基因及其邻接区。接着将该扩增的片断克隆到pST Blue-1载体(Promega,Madison,Wis)上,制备质粒pRN101。将pRN101的gluA的开放阅读框架的中间部用Stul消化,接着插入由pVA838得到的830bp的红霉素抗性基因(erm)片断,构建质粒pRN102。用限制酶NotI消化线状化,通过Tobian及Macrina方法将该质粒导入S.mutans MT8148株内。该转化体在含有红霉素(10μg/ml)的Mitis-salivarius(MS)琼脂培养基(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)的平板上筛选。通过gluA基因的PCR扩增和免疫扩散法,确认突变株MT8148GD的适当的插入失活。
MT8148GD具有S.mutans的典型的生物学特性。作为该特征可以是:在MS琼脂培养基上粗糙菌落、糖发酵阳性、PA及GTF表达、高水平蔗糖依赖性粘附、高水平菌体疏水性。
(E)各种S.mutans菌株的抗血清的反应性
为了实施使用上述抗体的免疫扩散法(凝胶沉淀反应),将TW295株、TW871株及c型、e型、f型的S.mutans菌株培养一夜,在121℃加热15分钟,然后离心分离,取得的上清液为抗原(Rantz-Randall(RR)抗原)。
S.mutans的TW295株及TW871株的抗血清,不与用S.mutansc型株、e型株及f型株制备的抗原发生反应,而与用S.mutans TW295株和TW871株制备的抗原发生反应(图1A~E)。将这些S.mutans的TW295株和TW871株的血清型命名为k型。
图1A中央的样品槽含有TW295株的RR提取物(样品槽1),外侧的样品槽含有TW295株的抗血清(样品槽2)、TW871株的抗血清(样品槽3)、血清型c的特异性抗血清(样品槽4)、血清型e的特异性抗血清(样品槽5)、血清型f的特异性抗血清(样品槽6)。此外,图1B中央的样品槽含有TW871株的抗血清(样品槽7),其外侧的样品槽含有TW295株的RR提取物(样品槽8)、TW871株的RR提取物(样品槽9)、MT4251株(f)的RR提取物(样品槽10)、MT4245株(e)的RR提取物(样品槽11)以及MT8148株(c)的RR提取物(样品槽12)。此外,图1C中央的样品槽含有FT1株的RR提取物(样品槽13),其外侧的样品槽含有TW871株的特异性抗血清(样品槽14)、血清型c的特异性抗血清(样品槽15)、血清型e的特异性抗血清(样品槽16)、血清型f的特异性抗血清(样品槽17)。图1D中央的样品槽含有血清型c的特异性抗血清(样品槽18),其外侧的样品槽含有MT8148株的RR提取物(样品槽19)、MT8148GD株(c)的RR提取物(样品槽20)。图1E中央的样品槽含有TW871株的抗血清(样品槽21),图1E外侧的样品槽含有TW295株的RR提取物(样品槽22)、TW871株的RR提取物(样品槽23)、FT1株的RR提取物(样品槽24)、SU1株的RR提取物(样品槽25)、YK1株的RR提取物(样品槽26)以及MT8148GD株的RR提取物(样品槽27)。
MM8148GD株的RR提取物与TW871的抗血清形成沉淀带(但与血清型c的特异性抗血清不形成沉淀带),该沉淀带与TW295、TW871、FT1、SU1、YK1的沉淀带融合。
使用该抗血清,调查从100人的被检体内分离的100株(NN2000系列)的S.mutans中k型株存在的频度。2株RR抗原不与c型、e型或f型的S.mutans菌株的抗血清发生反应,而与k型S.mutans菌株的抗血清发生反应。剩余的98株的RR抗原与c型株、e型株或f型株的特异性抗血清中的任何一个都反应。因此,鉴定NN2000系列的S.mutans临床口腔分离株中的血清型不确定菌株(FT1株、SU1株)为k型株。
(F)血清型不确定菌株S.mutans的特征
根据Hamada等(1981)、及Rosenberg等(1980)所述方法,评价血清型不确定临床分离株的蔗糖依赖性粘附性及菌体疏水性。细胞结合型(cell-associated)葡萄糖基转移酶(CA-GTF)或细胞游离型(cell-free)葡萄糖基转移酶(CF-GTF)以及表层蛋白质抗原(PA)的表达,利用使用GTF特异性抗体和PA特异性抗体的免疫印迹法进行鉴定(图2A~C)。从试验菌体中提取基因组DNA,决定16S rRNA序列,然后与对照株NCTC10449(GenBankaccession no.X58303、S70358)的序列进行比较。
在图2A及B中,用7%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离全细胞,并且与S.mutans的PA(图2A)或CA-GTF(图2B)的兔抗体发生反应。另一方面,在图2C中,用硫酸铵沉淀浓缩的细胞上清(C)转录到PVDF膜上的蛋白质用7%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,使其与CF-GTF(C)的兔抗体发生反应。对各泳道进行解释,那么第1泳道是MT8148株、第2泳道是FT1株、第3泳道是SU1株、第4泳道是YK1株。FT1株和SU1株表达了PA及3种类型的GTF。
FT1株及SU1株具有高水平蔗糖依赖性粘附和菌体疏水性(没有用数据表示)。这些16S rRNA基因序列,与NCTC10449株(GenBank accession no.X58303及S70538)的16S rRNA基因序列相同。并且,FT1株的RR提取物与TW871株及TW295株的抗血清形成沉淀带,该沉淀带又与TW871的RR提取物和TW871株的抗血清的沉淀带相融合,并且,从具有FT1株及SU1株的各被检体得到的50株,不与c型、e型、f型的特异性抗血清发生反应。
此外,这两株都具有S.mutans的特征,即MS琼脂培养基上的粗糙菌落、杆菌肽抗性、血液琼脂上的γ-溶血性、甘露醇、山梨醇、蜜三糖及蜜二糖的糖发酵阳性以及葡聚糖凝集阴性。(G)临床分离株的鉴定
从2003年年初在大阪大学齿学部医院小儿齿科看病的其它组的50人被检体(3~19岁,平均7、8岁)中得到S.mutans的临床分离株2500个。这些被检体包括45名健康幼儿、5名患有一般健康问题或口腔健康问题(如唐氏综合症、先天性心脏障碍、唇裂及上鄂裂、牙釉质形成不全症及部分无齿症)的患者。
表3表示2500个(其中2450个分类为c型、e型或f型)上述S.mutans分离株的血清型分布。
[表3]
(50人被检体的2500个S.mutans的血清型分布)
另一方面,由单一被检体(唐氏综合症)得到的另外50株(YK1~YK50)的RR提取物,与TW871的抗血清形成沉淀带,该沉淀带又与TW295、TW871、FT1及SU1的RR提取物的沉淀带融合。表4表示各被检体的血清型分布模式,发现这些被检体几乎都只具有S.mutans血清型c,其次只具有血清型e,50人中有5人具有多种血清型。
[表4]
(50人被检体的血清型分布)
(H)吞噬作用的测定
将生物在Brain Heart Infusion broth(Difco)中37℃培养18小时。将该菌体洗净后,用PBS把细胞浓度调整为1.0×108CFU/ml。从健康的志愿者身体上收集人体末梢血(500μl),然后与500μl的细菌(5.0×107CFU)一起37℃培养10分钟。使用吉姆萨染色剂(Wako Pure Chemical Industries,Osaka,Japan)染色,使用光学显微镜(倍数、×100;Olympus Industries,Tokyo,Japan),求出呈现吞噬作用的多型核白血球(PMN)的比例。用每100个PMN中进行吞噬的PMN的平均值(试验了500个PMN)表示比例。
分别在15分钟后、30分钟后、60分钟后、90分钟后及120分钟后观察MT8148株、MT8148GD株、FT1株、TW295株的经时性吞噬作用比例的变化。各种因子在组之间的差异,根据因素模型的统计学方差分析(ANOVA)进行评价(图3)。
图3A、3B表示S.mutans的口腔分离株及血液分离株的吞噬率。此外,图3A、3B的结果表示5次实验的平均±标准偏差。在图3A中,12株的吞噬率在培养10分钟后试验。在图3B中,表示培养15分钟、30分钟、60分钟、90分钟及120分钟时的MT8148(●)、MT8148GD(○)、FT1(▲)、TW295(□)的吞噬率的变化。
MT8148GD株的吞噬率是22.0±2.4%,比亲本MT8148的吞噬率(68.4±4.1%)显著降低(P<0.001)。并且,NN2001(c)、NN2002(e)及NN2003(f)的口腔分离株,具有与MT8148同等的吞噬率,但其吞噬率比血清型k的口腔分离株FT1、SU1及YK1或MT8148的显著降低(P<0.001)。4个血液分离株的吞噬率都比口腔分离株的吞噬率显著降低(P<0.001),此外,MT8148GD、FT1及TW295的吞噬率,失活60分钟也比MT8148的显著降低,TW295的吞噬率,失活90分钟后也比MT8148的显著降低(P<0.001)。
已知感染性心内膜炎是因病原性细菌侵入血流内而开始的,但仍然没有查明其侵入机制及在血液中S.mutans的生存机制。在本实施例中,本发明者等发现血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链缺失的同系突变株的吞噬率比亲株(建议改为亲本)的吞噬率低。用Fisher PLSD分析决定时,MT8148(血清型c)和其他株之间存在统计学显著差异(*P<0.001)。
血清型k的口腔分离株及血液分离株在PMN的作用下吞噬率降低,总之,这些发现都表示血清型k株(认为其血清型特异多糖抗原葡萄糖侧链缺失)很可能就是菌血症的病原性菌株。另一方面,血液分离株TW964(e)和TW1378(f),与口腔分离株NN2002(e)和NN2003(f)相比,对吞噬作用没有感受性。但是,本发明者等发现TW964缺失葡聚糖结合性蛋白质A,而TW1378却没有任何这样的突变。因此,除了对吞噬功能具有效果的血清型特异多糖抗原外,可能还存在菌体表面结构的突变。
(1)考察
2株血清分离株(TW295和TW871)、152株口腔分离株(FT1~FT51、SU1~SU51、YK1~YK50)以及gluA失活株(MT8148GD)的RR提取物,与TW295或TW871的抗血清形成沉淀带。另一方面,这些分离株都表示具有S.mutans的典型生物学特征(高水平蔗糖依赖性粘附、高水平疏水性、葡萄糖基转移酶)。
本研究中的S.mutans血清型c、e及f被分离频度,与丹麦的研究报告内容非常相似。在该报告中,从人的牙垢样品得到的76个mutansstreptococci中的1个和从人的龋齿性病变得到的70个mutansstreptococci中的7个不能按照血清学分类为血清型a~g。生物化学分析显示这些血清型不确定菌株属于S.mutans,但其没有血清型特异多糖的结构。在别的研究中,从人的牙垢样品、龋齿性象牙质样品、或粪样品中采集的1047个S.mutans分离株或S.sorbinus的分离株全部分类为血清型c、e、f、d或g。并且,在日本其他地区进行的最新的研究中,从牙垢中得到的144个S.mutans或S.sorbinus全部分类为血清型c、e、d或g,并且没有检出f型菌株或血清型不确定菌株。另一方面,有报告指出最近在日本,103人的被检体中9人具有血清学不定的S.mutans,但没有正确记载有关血清型特异多糖的特征。上述内容表明本发明者等发现了最近日本出现的血清型k型。
在本研究中,从3个幼儿的菌斑样品中发现了具有这种新型血清型的S.mutans,其中152株全部分类为血清型k。虽然还没有鉴定这些临床分离株的起源,但血清型k株占从这3人被检体的牙垢样品中发现的S.mutans菌株中的大部分。并且这些株全部具有高水平菌体疏水性、高水平蔗糖依赖性粘附及高水平抗吞噬作用。由此可以确定:S.mutans的血清型k株,由于GTF及PA的表达及其高水平疏水性和高水平蔗糖依赖性粘附,从而使其能够存在于口腔内,并且由于其吞噬作用低而能够存在于血液中。因此,具有心脏障碍的幼儿必须特别注意。特别是,对于口腔内具有S.mutans血清型k株的唐氏综合症患者,可能合并发生心室中隔缺损和多型核白蛋白(PMN)功能障碍,所以更加危险。在这些患者中检出新的血清型k表明危险性又增加了,因此,在齿科处理之前有必要进行抗生素处方的临床研究,并且应该注意这种情况。
实施例2:S.mutans的k型株的特异性基因序列的检索
从S.mutans的k型株(TW295株、TW871株、FT1株、YK1株)提取基因组DNA,对于各株,把参与血清型特异多糖抗原生物合成的酶加以编码的基因序列进行确定,并与血清型c的MT8148株对应的序列相比较。并且将S.mutans的k型株的DNA序列与数据库上的菌株(Xc株:GenBankaccession no.AB010970、UA159株:GenBank accession no.AE014133)的DNA序列相比较,特定k型株特异性基因序列。发现在k型株中rgp基因组中有各种突变,但确认全部k型株共同在rgpF基因的前半部发生突变(图4~图13)。
实施例3:S.mutans的k型株的简易鉴定法的确立
与S.mutans的c型株相比较,对于S.mutans的k型株,rgpF基因前半部分的三分之一存在特异性基因序列。利用该区域,在rgpF基因的起始密码子上游,以各血清型(c型、e型、f型及k型)的株之间的共有序列为基础,设计正向引物(ATTCCCGCCGTTGGACCATTCC(序列号8):CEFK-F);以k型的特异性序列为基础设计反向引物(CCAATGTGATTCATCCCATCAC(序列号9):K-R)、以及以c型、e型、f型的特异性序列为基础设计反向引物(CCGACAAAGACCATTCCATCTC(序列号10):CEF-R)(表5及图14)。
[表5]
(引物的设计及其位置)
与Xc(c)株(GenBank accession no.AB010970)的位置相对应的位置
用上述引物对确立仅对k型株特异性PCR扩增的系统。具体来说,从S.mutans的k型株(TW295株、TW871株、FT1株、YK1株)及唾液样品中提取基因组DNA,使用CEFK-F和CEF-R引物对及CEFK-K和K-R引物对,根据图15所示,使PCR反应溶液在94℃5分钟循环1次,94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒各循环30次,72℃7分钟循环1次的条件下进行PCR反应。将得到的反应溶液进行1.5%琼脂凝胶电泳。其结果如图16所示。
实施例4:S.mutans的血清型k以外的菌株或血清型k株的PCR检测的灵敏度
使用S.mutans菌体的滴定培养,分析使用CEFK-F和CEF-R引物对及CEFK-F和K-R的PCR引物对反应的灵敏度。具体来说,对于每毫升相当于108个的MT8148株(c型)、TW295株(k型)及FT1株(k型),使用CEFK-K和K-R引物对进行PCR反应。作为模板使用从上述菌体中提取的基因组DNA。使用在灭菌水中稀释的已知数量(5×104个、5×103个、5×102个、5×101个及5个)的菌体,决定PCR的检出限(图16)。
此外,在图16中,使用每毫升相当于108个的MT8148株(c型)、TW295株(k型)及FT1株(k型)的细胞的滴定培养,分析PCR反应的灵敏度。添加下述数量的细胞:5×104个(第1泳道)、5×103个(第2泳道)、5×102个(第3泳道)、5×101个(第4泳道)及5个(第5泳道)。M表示分子大小的标识(100bp DNA Ladder)。
对于S.mutans的k型株(TW295株和FT1株),使用k型特异性引物可进行PCR扩增,对于c型(MT8148株),使用k型特异性引物不进行PCR扩增。
检出限,使用血清型c/e/f株特异性引物对时为50~500细胞;使用血清型k株特异性引物对时为5~50细胞,证明有良好的灵敏度。实施例5:用于检出S.mutans血清型k株的PCR检测
将从各种血清型的S.mutans菌株及S.mutans以外的链球菌提取的DNA作为模板使用,确定使用CEFK-F和CEF-R引物对及CEFK-F和K-R引物对的PCR的准确性(图17A、17B)。
在图17A中,使用血清型c/e/f株的特异性引物对(CEFK-F和CEF-R),将从血清型c/e/f株细菌中提取的基因组DNA(第1~4泳道)、从血清型k株细菌中提取的基因组DNA(第5~8泳道)、从唾液样品中提取的基因组DNA(第9~14泳道)作为模板,进行PCR反应。此外,在图17B中,使用血清型k株的特异性引物对(CEFK-F和K-R)(B),将从血清型c/e/f株细菌中提取的基因组DNA(第1~4泳道)、从血清型k株细菌中提取的基因组DNA(第5~8泳道)、从唾液样品中提取的基因组DNA(第9~14泳道)作为模板,进行PCR反应。
对各泳道进行说明,那么第1泳道是MT8148(c型)、第2泳道是NN2001(c型)、第3泳道是NN2002(e型)、第4泳道是NN2003(f型)、第5泳道是TW295(k型)、第6泳道是TW871(k型)、第7泳道是FT1(k型)、第8泳道是YT1(k型)、第9泳道是Steptococcus sanguinis ATCC10556、第10泳道是Streptococcus oralis ATCC10557、第11泳道是Streptococcus gordoniiATCC10558、第12泳道是Streptococcus mitis ATCC903、第13泳道是Streptococcus milleri NCTC10703、第14泳道是Streptococcussalivarius HHT。
CEFK-F和CEF-R引物对能够特异地检出血清型c/e/f株,CEFK-F和K-R引物对能够特异地检出血清型k株。但不论那个引物对都没有检出S.mutans以外的链球菌。由此可见,使用CEFK-F和CEFK-R引物对和CEFK-F和K-R引物对,不仅能够特异检出血清型c/e/f株和血清型k株,而且只能够检出S.mutans。
实施例6:根据使用唾液样品的PCR反应,鉴定具有S.mutans血清型k株的被检体
2004年1月~2月,从在大阪大学齿学部小儿齿科看病的200名小儿或青春期的患者(2~18岁、平均7.9±3.6岁)收集吐出的全部唾液(约1ml)。将这些唾液样品用于对Hoshino等(2004)报告的方法进行了一定的改变的PCR检测中。简单来说,将无刺激的全部唾液收集到灭菌试管内,并放置在冰上。在16,000×g、5分钟的条件下,从500μl的唾液中把菌体回收到微量离心管内,在电子烤箱内用500W处理5分钟,然后,在N-乙酰胞壁酰五肽移位酶SG(Seikagaku Corp.,Tokyo,Japan)中于50℃消化1小时。接着,添加80μl的核溶解(nucleilysis)液(Promega),于80℃培养5分钟,然后,添加60μl的蛋白质沉淀液(Promega),在16,000×g、3分钟的条件下离心分离、除去蛋白质。通过苯酚-三氯甲烷提取和乙醇沉淀,生成DNA。将提取的DNA溶解在50μl的TE缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH8.0))中。该DNA的提取方法也可在从牙垢提取菌体基因组时使用。
通过将上述得到的DNA作为模板使用的PCR,使用CEFK-F和CEF-R引物对可检出血清型c/e/f株(A),使用CEFK-F和K-R引物对可检出血清型k株(B)(图18A、18B)。其结果是,从被检体200人上得到的临床标本中,有190个对血清型k株的非特异性(对血清型c/e/f株特异)引物对(A)显示阳性,对血清型k株的特异性引物对(B)为阴性。此外,剩下的10个标本,对血清型k株的特异性引物对(B)和对血清型k株的非特异性引物对(A)(对血清型c/e/f株特异)显示阳性。
图18A表示上述190个标本中的代表性的5例,该5例使用CEFK-F和CEF-R引物对,对血清型k株的非特异性(对血清型c/e/f株特异)引物对(A)显示阳性、对血清型k株的特异性引物对(B)显示阴性。此外,在图18B中,为了检出血清型k株,使用CEFK-F和K-R引物对。对各泳道进行说明,第1~5泳道表示对血清型k株的特异性引物对显示阴性的上述190株标本中的有代表性的5例,第6~8泳道表示对血清型k株的特异性引物对显示阳性的菌株。
如上所述,对于S.mutans的k型株(TW295株、TW871株、FT1株、SU1株、YK1株、YT1株及AT1株)和S.mutans的临床分离株(NN2000系列:c型78株、e型17铢、f型3株),使用k型的特异性引物可进行PCR扩增,使用c型、e型、f型的特异性引物不进行扩增。此外,对于98个c型、e型或f型的S.mutans菌株,使用c型、e型或f型的特异性引物可进行PCR扩增,使用k型的特异性引物不进行PCR扩增。
实施例7
根据S.mutans的细胞表面多糖的化学组成,可把其分为c型、e型及f型的血清型(Linzer等,1987)。已知S.mutans的血清型特异多糖由鼠李糖骨架及具有α-糖苷残基或β-糖苷残基的侧链的鼠李糖-葡萄糖聚合物构成。在本发明者等以前的研究中发现,从菌血症患者血液中得到的血清型不确定菌株(TW295)及从感染性心内膜炎的患者血液中得到的血清型不确定菌株(TW871)的血清型特异多糖的葡萄糖侧链的量降低(Fujiwara等,2001)。
如实施例1所示,具有k型血清型的MT8148GD显示了高水平蔗糖依赖性粘附,但其粘附率比亲株(建议改为亲本)MT8148(c型)的粘附率显著降低。
最近证明,血清型特异多糖在链球菌向人体单核球及纤维芽细胞上附着的过程中担负着重要的作用,并且预测其为最有效的细胞因子刺激成分(Engels-Deutsch等,2003)。但是,血清型特异多糖与龋齿之间的关系仍有待阐明。
因此,本发明者对重新阐明的S.mutans血清型k株的龋齿原的血清型特异多糖的葡萄糖侧链的作用进行了分析。
(A)S.mutans菌株
本实施例使用的S.mutans菌株如表6所示。从本发明者的实验室的培养物收集库中选择MT8148(c)的口腔分离株。从日本幼儿的口腔内分离出FT1株(k)、SU1株(k)及YK1株(k)。并且,从6岁健康少年的口腔内分离出YT1株,并且根据实施例1所述方法确定为S.mutans血清型k。将MT8148R株及YK1R株在浓度不断增加的链霉素(每1ml琼脂培养基最终浓度为1500μg)中反复继代培养,使其对链霉素产生抗性(Ooshima等,2000)。与实施例1一样,构建MT8148GD株(MT8148的gluA失活同系突变株)。
[表6]
(本实施例使用的细菌株)
Emr:红霉素抗性、Smr:链霉素抗性
(B)龋齿病原特性的体外试验(in vitro)分析
S.mutans对玻璃试管的蔗糖依赖性粘附性和对唾液包埋的羟磷灰石(SHA)的非蔗糖依赖性粘附性,根据以前所述方法(Ooshima等,2001;Nakano等,2002)进行分析;菌体疏水性及葡聚糖结合活性,根据以前所述方法(Fujiwara等,2001;Nakano等,2002)进行分析。
根据因素模型的统计学方差分析(ANOVA)评价各种因子在组之间的差异(表7)。
表7表示用体外试验(in vitro)分析得到的龋齿病原的生物学特性。MT8148GD对玻璃表面的蔗糖依赖性粘附性、对SHA的非蔗糖依赖性粘附率、葡聚糖结合能、CA-CTF活性及CF-CTF活性的数值显著降低(P<0.001)。但是,这些特性在FT1和FT1GD之间并没有显著差异。
[表7]
(血清型k株的生物学特性)
株 | 蔗糖依赖性粘附[平均±SD(%)] | 非蔗糖依赖性粘附[平均±SD(%)] | 葡聚糖结合能[平均±SD] | CA-GTF活性[平均±SD(mU/mL)] | CF-GTF活性[平均±SD(mU/mL)] |
MT8148(c) | 91.5±0.5 | 100.0±2.1 | 0.15±0.03 | 73.0±3.9 | 95.0±2.8 |
MT8148GD(k) | 70.5±3.8<sup>a</sup> | 88.6±1.7<sup>a</sup> | 0.02±0.01<sup>a</sup> | 29.4±0.8<sup>a</sup> | 59.8±0.9<sup>a</sup> |
TW295(k) | 70.4±3.1<sup>a</sup> | 77.9±2.0<sup>a</sup> | 0.03±0.01<sup>a</sup> | 34.9±1.6<sup>a</sup> | 25.1±0.3<sup>a</sup> |
TW871(k) | 75.1±0.9<sup>a</sup> | 56.0±3.8<sup>a</sup> | 0.09±0.04<sup>a</sup> | 61.2±1.5<sup>a</sup> | 56.0±2.3<sup>a</sup> |
FT1(k) | 83.1±2.1<sup>a</sup> | 89.6±0.3<sup>a</sup> | 0.05±0.00<sup>a</sup> | 38.6±0.3<sup>a</sup> | 35.7±0.7<sup>a</sup> |
FT1GD(k) | 81.8±0.4<sup>a</sup> | 89.8±0.2<sup>a</sup> | 0.05±0.01<sup>a</sup> | 41.2±1.2<sup>a</sup> | 38.0±1.1<sup>a</sup> |
SU1(k) | 85.4±0.9<sup>a</sup> | 105.9±4.1 | 0.07±0.02<sup>a</sup> | 48.3±3.7<sup>a</sup> | 33.0±0.2<sup>a</sup> |
YK1(k) | 82.7±1.2<sup>a</sup> | 95.0±3.4 | 0.03±0.00<sup>a</sup> | 47.4±2.5<sup>a</sup> | 38.4±0.6<sup>a</sup> |
YT1(k) | 80.8±1.4<sup>a</sup> | 87.7±9.7<sup>a</sup> | 0.02±0.01<sup>a</sup> | 28.9±1.7<sup>a</sup> | 30.4±0.4<sup>a</sup> |
根据Fisher的PLSD分析,MT8148与其他株之间存在显著差异(aP<0.001)
(C)GTF的表达
为了评价表达的蛋白质的量,使用本发明者在以前研究中制备的抗菌体结合型(CA)GTF抗血清及抗菌体游离型(CF)GTF抗血清,进行了GTF的免疫印迹分析。于37℃,使试验生物在Brain Heart Infusion(BHI)肉汤(DifcoLaboratories,Detroit,MI,USA)中增殖,增殖到550nm处的吸光度为1.0。将该菌体及上清液(用硫酸铵沉淀浓缩)溶解到SDS凝胶电泳缓冲液中。利用7%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离出等量的各蛋白质,接着转录到聚偏二氟乙烯(Poly vinylidenedifluoride)薄膜(Immobilon;Millipore,Bedford,MA,USA)上,使该转录的蛋白质带和CA-GTF或CF-GTF的兔抗体反应,接着,使用碱性磷酸酶复合物的抗兔免疫球蛋白G血清抗体(New England Biolabs,Beverly,MA,USA)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐-蓝四唑基质(Moss Inc.,Pasadena,MD,USA))使其可视化。并且,各株的GTFB表达强度/GTFC表达强度之比,通过使用NIH image软件(National Technical InformationService,Springfield,VA,USA)的反应带相对密度分析方法进行评价。
发现GTFB、GTFC、及GTFD在全部试验株中表达。但是,GTFB的强度在MT8148株中比在其他任何株中明显增强,GTFB表达强度/GTFC表达强度之比为1.80±0.15。该值比MT8148GD的值(0.80±0.11)及血清型k株的其他血液分离株及口腔分离株的值(0.17~0.81的范围)明显增高(P<0.001)。作为对照,在试验的全部株中GTFD的表达强度没有显著差异。
(D)CA-GTF及CF-CTF活性的测定
使用以前所述方法(Matsumoto等,2003),用[14C]蔗糖合成[14C]葡聚糖,评价CA-GTF及CF-CTF的活性。规定1单位的GTF活性为1μmol的葡萄糖残基在1分钟内从蔗糖整合葡聚糖时所必要的酶量。
血清型k的血液分离株TW295及TW871、及3个口腔分离株SU1、YK1及YT1分别与MT8148相比,都显示明显低的蔗糖依赖性粘附率、葡聚糖结合能、CA-CTF活性、CF-CTF活性(P<0.001)。与对SHA的非蔗糖依赖性粘附率相同,试验的血清型k株(除SU1株及YK1株之外)的值,比MT8148的数值显著降低(P<0.001)。并且,在MT8148和试验的其他株之间,菌体疏水性没有显著差异。
(E)对大白鼠的龋齿诱发实验
根据以前所述方法(Nakano等,2002),在36只无特异性病原体的(SPF)Sprague-Dawley大白鼠(Charles River Inc.,Osaka,Japan)(每组12只)上,试验龋齿诱发活性。使试验的3株(MT8148R、MT8148RGD及YK1R)分别以每天1×109CFU、连续5天给药,经口感染18~22天的大白鼠,到第72天评价每只大白鼠的菌斑及龋齿的得分。
根据因素模型的统计学方差分析(ANOVA)评价各种因子在各组之间的差异。
对于大白鼠,血清型k明显诱发其龋齿。但是,MT8148R株和其突变株MT8148RGD以及口腔分离株YK1R之间,龋齿得分或菌斑指数没有显著差异(表8)。
[表8]
(大白鼠的血清型k株的龋齿诱发能力)
(F)考察
在本发明中,将通过gluA基因(编码催化生成葡萄糖侧链供给体的前体UDP-D-葡萄糖的酶)的插入失活构建的MT8148GD的生物学特性与亲株(建议改为亲本)MT8148的生物学特性进行比较。有报告指出,UDP-D-葡萄糖对低pH环境下的S.mutans的生存度很重要,因此,本发明者预测gluA基因自身能够引起龋齿病原相关特性的变化。所以,本发明者构建了插入gluA基因失活的血清型k株FT1的突变菌株(FT1GD)。本发明者的结果表示FT1和FT1GD之间没有显著的生物学特性差异(表7)。这表明gluA基因自身的失活与该体外试验(in vitro)测定的特性之间没有关系。因此,本发明者得出的结论是:血清型特异多糖的葡萄糖侧链的存在对产生更高水平蔗糖依赖性粘附、非蔗糖依赖性附着、葡聚糖结合能力、进而对CA-CTF及CF-CTF活性都很重要。
CA-CTF及CF-CTF的活性降低在血清型k的临床分离株中表现突出(表7)。并且,血清型k的临床分离株的CA-CTF活性及CF-CTF活性,与30个S.mutans分离株(16株血清型c、8株血清型e、6株血清型f)的CA-CTF活性及CF-CTF活性相比显著降低。在本发明者以前的研究中已决定了体外试验(In vitro)的粘附能所需要的最合适GTFB/GTFC/GTFD比率(Ooshima等,2001)。偏离该比率会对菌体的附着能、菌斑生物膜的结构产生影响(Idone等,2003)。本研究的免疫印迹法分析显示,GTFB的表达,与MY8148相比,其在血清型k株中的表达有更低的倾向(图19A、B)。
此外,在图19A中,利用7%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离全菌体(A),使转录到PVDF膜上的蛋白质与S.mutans的CA-GTF的兔抗体反应。在图19B中,用硫酸铵沉淀浓缩的培养上清液,该上清液用7%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,使转录到PVDF膜上的蛋白质条带与CF-GTF的兔抗体反应。对各泳道进行说明,那么第1泳道是MT8148株,第2泳道是MT8148GD株,第3泳道是TW295株,第4泳道是TW871株,第5泳道是FT1株,第6泳道是FT1GD株,第7泳道是SU1株,第8泳道是YK1株,第9泳道是YT1株。
有人认为GTFB承担大部分不溶性葡聚糖的合成,并且其为变形链球菌向齿面附着及在牙垢内积蓄时重要的毒性因子(Mattos-Graner等,2000)。因此,血清型k株的低CA-CTF活性可能起因于GTFB的低表达。另一方面,其在菌体表层的表达可能与血清型特异多糖的葡萄糖侧链的存在有关。总之,可以得出下述结论:这些结果比S.mutans的其他主要表面结构(如GTF、PA及Gbp)更低,但S.mutans的血清型特异多糖的葡萄糖侧链的缺失与S.mutans的龋齿病原相关。
此外,在用于实施本发明的优选方式项中的具体实施方式或实施例,只不过是使本发明的技术内容更明确的部分,而不应该狭义地理解为仅限于这些具体例,只要是在本发明的精神和所述的权利要求书的范围内,可以实施各种变更。
到目前为止,对于与呈现感染性心内膜炎症状相关的S.mutans株,不容易将其与其他的S.mutans株辨别。但是,本发明可以容易地将参与感染性心内膜炎感染可能性高的S.mutans株判明为新型的血清型k型。因此,本发明不仅可应用于齿科医疗领域等医疗现场,而且可广泛应用于医药品行业、检查行业。
从预防可能致人死亡的感染性心内膜炎发病的观点来看,认为S.mutans血清型不确定菌株是重要的,本发明能够提供有效判明S.mutans血清型不确定菌株是否在被检体中存在的方法。