KR101586516B1 - 진균 리파아제 및 지방산 알킬 에스테르를 사용하는 라이소스핑고리피드의 효소적 ｎ-아실화에 의한 스핑고리피드의 생성 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스핑고리피드의 효소적 합성, 및 라이소스핑고리피드 및 탄산 에스테르로부터의 스핑고리피드를 포함하는 조성물, 및 상기 스핑고리피드 또는 조성물을 포함하는 미용, 피부용 또는 제약 제제에 관한 것이다.

Description

진균 리파아제 및 지방산 알킬 에스테르를 사용하는 라이소스핑고리피드의 효소적 Ｎ-아실화에 의한 스핑고리피드의 생성 방법{METHOD FOR PRODUCING SPHINGOLIPIDS BY ENZYMATIC N-ACYLATION OF LYSOSPHINGOLIPIDS USING A FUNGAL LIPASE AND A FATTY ACID ALKYL ESTER}

본 발명은 스핑고리피드의 효소적 합성, 및 라이소스핑고리피드 및 카르복실산 에스테르로부터의 스핑고리피드를 포함하는 조성물, 및 이러한 스핑고리피드 또는 조성물을 포함하는 미용, 피부용 또는 제약 제제에 관한 것이다.

본 발명은 하기 화학식 II의 라이소스핑고리피드와 하기 화학식 III의 카르복실산 에스테르를 반응시키는, 하기 화학식 I의 스핑고리피드의 생체촉매적 제조 방법에 관한 것이다.

[화학식 I]

[화학식 II]

[화학식 III]

식 중, R¹, R², R³ 및 X는 하기 정의와 같다.

스핑고리피드는 미용 및/또는 피부용 활성 성분으로서 사용된다.

R² = H인 화학식 I의 스핑고리피드는 세라마이드로 지칭되고, 피부 (각질층)에서 천연적으로 생성되는 극성 지질이다. 외부의 퇴화된 각질세포에서, 세라마이드는 세포막의 주요 (지질 함량의 40-65％) 구성성분을 이루므로, 예를 들어 수분 침투성 조절에 의해 세포막의 보호 기능에서 중추적인 역할은 한다. 나이가 들면서, 각질형성세포에서 세라마이드 합성 활성의 많은 부분이 손실되기 때문에 피부는 그의 보호 효과를 잃고, 예를 들어 더 이상 상피의 수분 손실을 완전히 억제할 수가 없게 된다. 이는 세라마이드의 국소적 적용에 의해 적어도 부분적으로 보충될 수 있다 (예: 문헌 [Farwick, M. et al., Int . J. Cosm . Sci ., 2007, 29(4), 319-329] 또는 문헌 [Klee, S.K. et al. Basic Clinic . Dermatol., 2007, 40, 155-165]).

부가적으로, 세라마이드의 긍정적인 효과가 아토피성 피부염의 치료에서 보고되어 있다 (문헌 [Kerscher, M. et al., Eur . J. Dermatol., 1991, 1, 39-43]; 문헌 [Imokawa, G. et al., J. Soc . Cosmet . Chem . 1989, 40, 500-507]).

많은 산업화 국가, 특히 독일에서의 인구통계적 변화의 관점에서, 세라마이드에 대한 요구가 더 커질것으로 예상된다.

선행기술에서, 세라마이드는, 활성화된 카르복실산 유도체를 사용하여 R² = H인 화학식 II의 라이소스핑고리피드, 예를 들어 파이토스핑고신 (R² = H이고, X = CH₂-HCOH인 화학식 II)의 쇼텐-바우만 (Schotten-Baumann)-유사 N-아실화에 의해 제조된다.

파이토스핑고신은 통상적으로 발효 유도된다.

활성화된 카르복실산은 통상적으로, 그대로 사용되거나 카르복실산으로부터 그 자리에서 (in situ) 제조되는 카르보닐 클로라이드이다. 제US6420604호 (네덜란드 코스모페름 (Cosmoferm))에는 스핑고신 염기와 적절한 카르보닐 할라이드를 반응시키는 일부 세라마이드의 합성이 기재되어 있다. 이러한 방법의 두드러진 단점은, 한편으로는 독성 유기염소 화합물의 사용이 필요하다는 점, 그리고 최종 생성물 중 결과적인 높은 염 적재량이다. 또한, 고도 반응성인 카르보닐 할라이드의 사용으로 인하여 상당한 양의 원치않는 부산물의 형성이 예상될 수밖에 없다는 것을 당업자는 당연히 인지할 것이다.

대안적 합성 경로는 무수물을 통해 진행된다. 따라서, 예를 들어 제WO93/20038호 (네덜란드 기스트-브로케이즈 (Gist-Brocades))는, 파이토스핑고신의 N-아실화를 위한 반응성 카르복실산 유도체를 수득하기 위하여 카르복실산 및 알킬페닐설포닐 클로라이드로부터의 혼합된 무수물의 염기-촉매된 합성을 교시하고 있다.

반응성 카르복실산 유도체의 사용에 의존한다는 것은 상기 모든 경로의 공통이다. 이러한 점에 있어서의 단점은 상기 물질의 높은 부식성 및 그의 건강에 대한 위협 둘 모두이므로, 특수한 반응기 시스템 및 예방조치가 필요해지고 따라서 제조의 복잡성을 증가시킨다. 부가적으로, 생성물의 국소적 적용가능성을 위하여, 생성물에 반응성 및 독성인 전구체 및 부산물이 부재하도록 보장해야만 한다. 생성물 정제 및 폐기물 처치와 관련된 부가적 복잡성 뿐만 아니라, 높은 염 적재량 또한 예상될 수밖에 없다. 선행 기술의 방법의 추가적 단점은 단지 낮은 전구체 및 생성물 농도가 수득된다는 점이며, 따라서, 제WO93/20038호 (네덜란드 기스트-브로케이즈)에는, 반응성 및 독성인 공동 시약 p-톨루엔설포닐 클로라이드 및 트리에틸아민을 동시에 사용하는 독성 용매 메틸렌 클로라이드 중의 최대 15％ (w/v)의 전구체 용액이 기재되어 있다. 부가적으로, 생성물의 순도 또는 수율 (각 경우 80％ 정도임)이 불만족스럽다.

따라서, 본 발명의 목적은 선행 기술의 단점 중 적어도 하나를 극복할 수 있는, 무해하고 산업적으로 적용가능한 방식으로 세라마이드를 수득하는 대안적 방법을 제공하는 것이다.

아미드화 반응은 또한 생체촉매적으로, 즉, 촉매로서 효소를 사용하여 수득할 수 있다. 효소의 산업적 적용에 대한 리뷰는, 예를 들어 문헌 [Liese et al., Industrial Biotransformations; Second, Completely Revised Edition, Wiley-VCH, Weinheim, 2006]에서 참고한다. 카르복실산 유도체를 합성하기 위한 바람직한 생체촉매는 가수분해효소 (E.C. 3.1.x.x), 특히 리파아제 (트리아실글리세롤 가수분해효소, E.C. 3.1.1.3) 및 에스테라아제 (E.C. 3.1.1.1)이다.

세포의 대사에서의 그의 자연적인 기능과 관련하여, 리파아제는 우선적으로는 에스테르의 가수분해 절단을 촉매한다. 그러나, 에스테르의 축합 형성 또한 문헌에 여러번 기재되어 있다. 그의 대표적 예는 문헌 [Drauz and Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, A Comprehensive Handbook; Second, Completely Revised and Enlarged Edition, Vol. II, Wiley-VCH, Weinheim, 2002], [Aehle, Enzymes in Industry, Production and Applications; Second, Completely Revised Edition, Wiley-VCH, Weinheim, 2004] 또는 문헌 [Bornscheuer, Enzymes in Lipid Modification, Wiley-VCH, Weinheim, 2000]에서 확인된다.

리파아제-촉매된 축합 반응에서 친핵제로서의 아민의 용도에 대한 문헌 내에도 또한 예가 기재되어 있다.

문헌 [Y.-M. Xia et al., J Mol Catal B, 2004, 31, 111-115]에는, 예를 들어 칸디다 안탁티카 (CALB)로부터의 리파아제로 촉매되는 반응성 1차 아민을 사용한 메틸 라우레이트의 아미드화에 의한 N-라우로일-β-아미노프로피오-니트릴의 합성이 기재되어 있다. 기재된 공정의 단점은, 희석 기질 용액 (50 mM 미만)에 대한 제한 이외에도, 단지 94.3％ 전환율 이하의 비교적 낮은 전환율이다. 부가적으로, 보여지는 반응에서 위치선택성 또는 화학종선택성이 전혀 필요하지 않다.

이러한 선택성은, 그러나, 본 발명에 따른 반응에서는 반드시 필요할 수 있는데, 이는 전구체 분자, 예를 들어 파이토스핑고신이 복수의 반응성 관능기를 포함할 수 있기 때문이다. 이러한 선택성의 문제는, 예를 들어 문헌 [P. Tufvesson et al.: Biotechnol.Bioeng., 2007, 97(3), 447-453]에 기재되어 있고, 에탄올아민과 카르복실산의 CALB-촉매된 반응에서 효소-촉매된 에스테르화를 피하는 간단한 선택적 아미드화는 불가능하였다. 목적하는 아미드의 농후화를 달성하기 위해서는, 오로지 전구체의 다중 첨가 및 증류에 의한 반응의 물의 제거만이 가능하였다.

효소적 아미드화의 추가적 예에서, 문헌 [M. Nechab et al.: JOC, 2007, 72, 6918-6923]에는 CALB를 사용하는 (R)-배열 2차 아민의 입체선택적 반응이 기재되어 있다. 관찰되는 생성물의 높은 광학적 순도 (>99％ ee)는 (R)-배열 아민에 대한 CALB의 강한 선호를 시사하며, 따라서, 예를 들어 파이토스핑고신은, 그의 S-배열에 기인하여, 이러한 촉매를 사용하여 아민 탄소 원자 상에서 반응하는지의 여부가 의심스러워진다. 부가적으로, 또 다시 매우 희석된 기질 용액 (100 mM)과 동시에 높은 생체촉매 농도 (27％ w(CALB)/w(기질))가 적용되었고, 따라서 기재된 공정의 산업적 매력도를 현저히 제한한다.

제WO94/26919호 (네덜란드 기스트-브로케이즈)에는 박테리아 리파아제 또는 포유류 리파아제의 사용과 함께 카르복실산 에스테르를 사용하는 파이토스핑고신의 효소적 N-아실화가 기재되어 있다. 박테리아 리파아제 및 포유류 리파아제, 특히 슈도모나스 알칼리게네스 (Pseudomonas alcaligenes)로부터의 리파아제가 상기한 공정에 바람직하게 사용된다. 이러한 공정의 단점은 특히 단지 중간 정도의 전환율 (78％ 이하)을 달성하기 위하여 다량의 생체촉매 (30 내지 95％ w/w)가 필요하다는 점이다. 부가적으로, 상당한 양의 원치않는 N,O-디아실화 생성물 (17％ 이하)이 확인되었다. 게다가, 기질의 희석 용액 (59 내지 93 mM) 만이 사용되어, 낮은 공간-시간 수율을 초래한다. 추가적인 단점은 기질로서 파이토스핑고신 염기에 대한 제한이며, 이는 파이토스핑고신의 산부가 생성물, 예를 들어 파이토스핑고신 설페이트의 사용과 비교하여 기질 비용의 큰 증가를 수반한다. 더구나, 이스트 및 진균으로부터의 리파아제가 촉매로서 부적합함이 명백하게 지적된다. 제WO94/26919호에 기재되는 공정은 따라서 현존하는 화학적 공정의, 경제적인 가치가 있는 대안으로서는 배제되었다.

따라서, 이전에는 실현불가능했던 알킬 카르복실레이트로부터의 스핑고리피드의 생체촉매적 합성을 가능하게 하기 위하여, 선행 기술의 단점을 극복하는 라이소스핑고리피드의 효소적 아미드화 방법에 대한 요구가 계속 존재한다.

따라서, 본 발명의 목적은 선행 기술의 방법의 단점을 하나 이상 가지지 않는 방법을 제공하는 것이다. 특히, 전구체로서 용이하게 입수가능한 라이소스핑고리피드, 게다가 이를 고농도로 사용할 수 있는 공정을 개발하는 것을 의도하였다.

추가로, 명시적으로 언급하지 않은 목적은 하기 상세한 설명, 실시예 및 청구범위의 맥락으로부터 명백히 나타날 것이다.

선행 기술과는 대조적으로, 놀랍게도 진균의 리파아제가 고순도의 스핑고리피드를 형성하기 위한 카르복실산 에스테르와 라이소스핑고리피드의 선택적 반응을 가능하게 한다는 것을 확인하였다. 이러한 반응을 경제적으로 합리적인 방식으로 수행할 수 있다는 점을 부가적으로 확인하였다.

본 발명에 따른 방법 및/또는 본 발명에 따라 사용되는 생체촉매는, 비교적 낮은 효소 농도, 예를 들어 사용되는 전구체를 기준으로 10 중량％ 미만이 사용에 필요하고/하거나 생체촉매를 여러번, 예를 들어 10회 이상 재사용할 수 있기 때문에 아미드화 반응을 경제적으로 가치있는 방식으로 수행할 수 있다는 장점을 가진다. 본 발명에 따른 방법의 추가적인 장점은 따라서, 예를 들어 90％ 초과의 활성 함량 및 5％ 미만의 N,O-디아세틸화 생성물 비율의 고순도 생성물을 정교한 후처리 반응, 예컨대 크로마토그래피 또는 분별 결정화 없이 제조할 수 있다는 점이다. 본 발명에 따른 방법의 특정 장점은, 카르복실산 성분으로서, 임의의 원치않는 2차 반응을 야기시키기 않는, 용이하게 이용가능한 알킬 카르복실레이트, 예를 들어 메틸 에스테르의 사용으로 이루어진다.

따라서, 본 발명은 하기 화학식 II의 라이소스핑고리피드와 하기 화학식 III의 카르복실산 에스테르를 반응시키는, 하기 화학식 I의 스핑고리피드의 생체촉매적 제조 방법에 관한 것이며,

[화학식 I]

[화학식 II]

[화학식 III]

식 중, R¹은 2 내지 55개의 탄소 원자를 갖고, 하나 이상의 다중 결합 및/또는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 임의로 포함하고, 산소 원자 또는 에스테르 또는 아미드 관능기가 임의로 개재되고, 알킬, 하이드록시, 케토 또는 아민기로부터 선택되는 하나 이상의 추가적 기로 임의로 치환되는, 선형 또는 분지형 알킬 사슬을 나타내고, 바람직하게는 하나 이상의 다중 결합 및/또는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 임의로 포함하고, 산소 원자 또는 에스테르 또는 아미드 관능기가 임의로 개재되고, 알킬, 하이드록시, 케토 또는 아민기로부터 선택되는 하나 이상의 추가적 기로 치환되는, -CH₂-Y-CH₃ (식 중, Y = 1 내지 53개의 탄소 원자를 갖는 탄소-탄소 결합 또는 선형 또는 분지형 알킬렌 사슬임)이고,

R²는 H, 포스포콜린, 세린, 에탄올아민 또는 당, 바람직하게는 당 또는 H, 가장 바람직하게는 H를 나타내고,

X는 CH=CH, CH₂-CH₂ 또는 CH₂-HCOH, 바람직하게는 CH₂-HCOH를 나타내고,

R³은 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖고 하나 이상의 라디칼 -OR⁴로 치환될 수 있는 분지형 또는 비분지형 알킬 라디칼을 나타내고,

R⁴는 독립적으로 H 및 -C(O)R¹을 포함하는 군으로부터 선택되는 동일하거나 또는 상이한 라디칼이며,

사용되는 생체촉매가,

진균류계의 유기체로부터 단리할 수 있는 효소 종류 E.C. 3.1.1의 카르복실산 에스테르 가수분해효소, 및

진균류계의 유기체로부터 단리할 수 있는 것과 아미노산 수준에서 60％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 더 바람직하게는 90％ 이상, 특히 바람직하게는 95％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상동성인 효소 종류 E.C. 3.1.1의 카르복실산 에스테르 가수분해효소

를 포함하는 군으로부터 선택되는 효소 종류 E.C. 3.1.1의 1종 이상의 카르복실산 에스테르 가수분해효소를 포함하는 것을 특징으로 한다.

"아미노산 수준에서 상동"은 상기 또는 이후의 본 발명의 맥락에서, 공지된 방법으로 측정할 수 있는 "아미노산 동일성"을 의미한다. 일반적으로, 특정 요건을 고려한 알고리즘을 갖는 특수 컴퓨터 프로그램이 사용된다. 동일성을 측정하는 바람직한 방법은 먼저, 비교할 서열 사이의 최대 일치를 생성한다. 동일성을 측정하기 위한 컴퓨터 프로그램에는, 비제한적으로, 하기를 포함하는 GCG 프로그램 패키지가 포함된다:

- GAP (문헌 [Deveroy, J. et al., Nucleic Acid Research 12 (1984), page 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (WI)]), 및

- BLASTP, BLASTN 및 FASTA (문헌 [Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), pages 403-410]).

BLAST 프로그램은 국립생명공학정보센터 (National Centre For Biotechnology Information, NCBI) 및 추가적인 정보원인 문헌 [BLAST handbook, Altschul S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; 상기 Altschul S. et al.] 에서 수득할 수 있다.

당업자는 두 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 유사성 또는 동일성을 계산하기 위하여 다양한 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다는 점을 인지하고 있다. 따라서, 두 아미노산 서열 사이의 ％ 동일성을, 예를 들어 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com을 통해 수득가능함) 내의 GAP 프로그램에 통합시킨 니들만-분쉬 (Needleman and Wunsch) (문헌 [J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)]) 알고리즘으로 측정할 수 있으며, 구체적으로는, Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하여 측정할 수 있다. 당업자는 상이한 파라미터를 사용하면 약간 상이한 결과를 야기할 것이지만, 두 아미노산 서열 사이의 ％ 동일성은 전체적으로 유의하게 상이하지 않을 것임을 인지할 것이다. 보통, 사전설정 (갭 중량: 12, 길이 중량: 1)을 적용한 Blossom 62 매트릭스를 사용한다.

상기 알고리즘에 따른 60％ 동일성은 본 발명과 관련하여 60％ 상동성을 의미한다. 보다 높은 동일성에서도 동일하게 적용된다.

본 발명에 따른 방법에서, 화학식 III의 카르복실산 에스테르는 특히 바람직하게는 알코올 R³OH의 라디칼 -R³을 갖는 카르복실산의 에스테르이고, 여기서 카르복실산은 6 내지 30개의 탄소 원자, 특히 8 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 천연 식물성 또는 동물성 오일 기재의 천연적으로 생성되는 지방산의 군으로부터 선택된다. 천연 지방산은 비분지형이고 짝수의 탄소 원자로 이루어진다. 모든 2중 결합은 시스 (cis) 배열을 갖는다. 그 예에는, 카프로산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 팔미톨레산, 이소스테아르산, 스테아르산, 12-하이드록시스테아르산, 디하이드록시스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 페트로셀린산, 엘라이드산, 아라키드산, 베헨산, 에루스산, 가돌레산, 아이코사펜타산, 도코사헥사엔산, 아라키돈산이며, 이의 에스테르 생성물이 가장 특히 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 방법에서, 화학식 III의 카르복실산 에스테르는 바람직하게는 알코올 R³OH의 라디칼 -R³을 갖는 카르복실산의 에스테르이고, 여기서 카르복실산은 다중불포화 지방산의 하이드록실화 유도체의 군으로부터 선택된다. 이러한 지방산은, 예를 들어 9- 또는 13-하이드록시옥타데카디엔산, 15-하이드록시아이코사테트라엔산 및 일련의 소위 알파-하이드록시 산이다. 이와 관련하여 마찬가지로, 카르복실산은 특히 바람직하게는 하이드록시-관능화된 산의 중축합 생성물, 예를 들어 폴리-12-하이드록시스테아르산 또는 폴리리신올레산이다.

이와 관련하여 마찬가지로, 카르복실산은 특히 바람직하게는 방향족 치환기를 함유하는 합성 또는 천연적으로 생성되는 카르복실산, 예를 들어 벤조산, 신남산, 페룰린산, 프로토카테츄산, 갈산, 바닐라산, 시린지산, 이소페룰린산, 시나프산, 카페인산, 제니트산, 살리실산, 살리실루릭산 또는 니코틴산이다.

본 발명에 따른 방법에서, R³은 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 비치환된 알킬 라디칼이고, 바람직하게는 R³은 메틸, 에틸, 비닐, 프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸 및 tert-부틸 라디칼을 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명에 따른 방법의 추가적 실시양태에서, 화학식 III의 카르복실산 에스테르는 1종 이상의 산 R¹COOH를 갖는 폴리올의 완전 또는 부분 에스테르이다. 폴리올의 완전 또는 부분 에스테르로서 사용하기에 바람직한 것은 글리콜, 글리세릴, 1,2-펜탄디일, 1,3-펜탄디일, 1,2-부타디일, 1,3-부타디일, 1,4-부타디일 에스테르및 또한 그의 이성질체 및 불포화 유사체이다.

R¹COOH의 에스테르화를 통해 R³ 라디칼을 결정하는 상기 출발 재료는, 순수한 물질 또는 혼화물로서 존재할 수 있고, 따라서 화학식 III의 구조가 경우에 따라서 혼합물을 기술할 수 있다.

상이한 R¹을 갖는 화학식 III의 혼합물을 사용함으로써 화학식 I의 스핑고리피드의 혼합물의 생체촉매적 제조에 본 발명에 따른 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 상이한 R³을 갖는 화학식 III의 카르복실산 에스테르의 혼합물을 유사하게 사용할 수 있다.

본 발명에 따라, 예를 들어 문헌 [P. Lersch, U. Schick, Spec . Chem . Mag ., 2003, 23(6), 30-31]에 기재된 바와 같이, 예를 들어 전술한 파이토스핑고신의 경우에서 확립되는 발효 공정에서 생성되는 것과 같은, 라이소스핑고리피드의 산부가염으로도 지칭되는 산부가 생성물을 사용하는 것 또한 가능하다. 바람직하게 사용되는 라이소스핑고리피드의 산부가 생성물은 카르복실산 카르복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 카르보네이트, 하이드록사이드 또는 할라이드, 특히 바람직하게는 라이소스핑고리피드의 클로라이드 및 설페이트이다.

본 발명에 따른 방법에서 라이소스핑고리피드의 산부가 생성물을 사용하면, 효소적 반응 이전에 라이소스핑고리피드의 산부가 생성물의 탈양성자화에 의해 라이소스핑고리피드가 제조되는 것이 바람직하다.

이러한 방식으로 수득되는 라이소스핑고리피드는 또한 이후 라이소스핑고리피드 염기로도 지칭된다.

탈양성자화 처리는 통상적 유기 용매 중의 라이소스핑고리피드의 산부가 생성물의 용액 또는 현탁액 중에서 수행할 수 있다. 사용할 수 있는 용매의 예는, 파라핀, 1가 또는 다가 알코올 (예: 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 사이클로헥산올, 메틸사이클로헥산올, 2-부틸-1-옥탄올 및 이의 이성질체, 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 디아세톤 알코올, 이소부탄올 등), 에테르 (디에틸 에테르, tert-부틸 메틸 에테르, 테트라하이드로푸란, 디옥산, 폴리에톡실레이트, 폴리프로폭실레이트 및 공중합체 등), 케톤 (아세톤, 메틸 이소부틸 케톤, 메틸 에틸 케톤 등), 에스테르 (트리에틸 시트레이트, 트리부틸 시트레이트, 이소부틸 이소부티레이트, 이소부틸 아세테이트, 이소노닐 이소노나노에이트, 2-에틸헥실 아세테이트, 사이클로헥실 아세테이트, 4-tert-부틸사이클로헥실 아세테이트)이다. 독성면에서 허용되는 용매, 예컨대 메틸 이소부틸 케톤 또는 2-메틸-2-부탄올이 바람직하다.

탈양성자화 단계는 용매가 액체 상태인 반응 온도에서 수행할 수 있다. 바람직하게는 -80℃ 내지 +150℃, 특히 바람직하게는 0℃ 내지 120℃, 매우 특히 바람직하게는 +25℃ 내지 100℃의 반응 온도에서 수행할 수 있다.

이러한 방식으로 수득되는 라이소스핑고리피드 염기의 용액을 그대로 효소적 반응에 사용할 수 있고, 또는 그 전에 여과할 수도 있다.

본 발명의 추가적 실시양태에서, 탈양성자화 단계의 용매는 당업자에게 익숙한 방법 (예, 증류 또는 라이소스핑고리피드 염기의 침전/결정화와 후속된 여과에 의한 제거)으로 제거할 수 있다. 라이소스핑고리피드 염기는, 예를 들어 침전 또는 결정화, 또는 증류에 의한 용매의 제거에 의해 효소적 반응 이전에 임의로 단리시킬 수 있다. 탈양성자화 처리에서 생성되는 염을 제거하는 여과 단계를 라이소스핑고리피드의 산부가 생성물의 탈양성자화와 생체촉매적 제조 사이에 수행하는 것이 바람직하다.

대안으로서, 라이소스핑고리피드 염기를, 생체촉매작용 동안에 라이소스핑고리피드의 산부가 생성물의 탈양성자화에 의해 제조할 수 있다.

활성화와 연관된 탈양성자화는 염기를 사용하여, 바람직하게는 유기 또는 무기 염기를 수단으로하여 수행할 수 있다. 무기 염기로서 바람직하게 사용되는 것은 무기 하이드록사이드, 카르보네이트, 금속 하이드라이드 (예를 들어: 리튬 알루미늄 하이드라이드, 칼슘 하이드라이드, 나트륨 하이드라이드 등), 이온 교환 물질 (예를 들어, 양이온 또는 음이온 교환기)이고, 유기 염기로서는 금속 오르가닐 (예를 들어, 부틸리튬), 알코올레이트, 아민 및 그의 금속 염, 예를 들어 리튬 디이소프로필아미드가 있다.

놀랍게도, 효소적 반응 중에 특히 쉽게 반응할 수 있는 특히 고품질의 라이소스핑고리피드 염기는 특히, 산부가염과의 반응에서 형식적으로는 물을 전혀 생성하지 않는 염기에 의해 제공됨을 확인하였다. 특히 바람직한 염기는 따라서, 그의 반응에서 물이 유리되지 않는 것이다. 이러한 것이 양성자화 이후에 물을 전혀 유리시키지 않는 것이다. 알칼리 금속 알코올레이트가 염기로서 바람직하게 사용된다. 이는, 예를 들어 알코올성 용액 중에 존재할 수 있다. 나트륨 및 칼륨 메탄올레이트가 특히 바람직하다. 이 또한 마찬가지로 유기 용매 중의 용액으로서 사용할 수 있다.

반응의 물을 피하기 위한, 그리고 따라서 본 발명에 따른 방법에서 마찬가지로 바람직한 추가적인 대안은, 염기로서 알칼리 금속 및/또는 알칼리 토금속 하이드록사이드의 사용시 반응에서 생성되는 물을 결합시키기 위하여 물-결합, 바람직하게는 물-결합 무기염, 예를 들어 Na₂SO₄를 사용하는 것이다. Na₂SO₄가 바람직하게 사용된다.

공정 중 라이소스핑고리피드의 산부가 생성물과 염기 사이의 몰비는, 본 발명에 따라, 10:1 내지 0.05:1, 바람직하게는 3:1 내지 0.2:1, 특히 바람직하게는 1.4:1 내지 0.6:1 범위이고, 매우 특히 바람직한 라이소스핑고리피드의 산부가 생성물과 염기 사이의 몰비는 등몰이다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 라이소스핑고리피드 염기를 제조하기 위하여 존재하는 모든 물은 탈양성자화 혼합물로부터 제거한다. 이러한 목적상 적용되는 물-제거 공정은, 예를 들어 물리적 방법 (예, 증류, 막 공정 (membrane processes), 추출 또는 흡착 (예를 들어, 분자체 상으로)) 또는 달리 화학적 방법 (예, 금속 하이드라이드 및 옥사이드 또는 다른 반응물, 예컨대 무수물, 에스테르와의 반응)이다.

앞 부분에서 이미 언급한 바와 같이, 제WO94/26919호 (기스트-브로케이즈)에 기재된 바와 같은 선행 기술의 관점에서, 본 발명에 따른 방법에서 진균의 리파아제를 효율적인 생체촉매로서 사용할 수 있다는 점은 전적으로 놀랍다.

본 발명에 따른 방법에서 생체촉매는, 특히, 진균류계의 유기체로부터 단리할 수 있는 및/또는 진균류계의 유기체로부터 단리할 수 있는 것과 아미노산 수준에서 60％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 더 바람직하게는 90％ 이상, 특히 바람직하게는 95％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상동성인 효소 종류 E.C. 3.1.1의 카르복실산 에스테르 가수분해효소이고, 여기서 유기체는 아스페르길루스 (Aspergillus), 비폴라리스 (Bipolaris), 칸디다 (Candida), 푸사리움 (Fusarium), 게오트리쿰 (Geotrichum), 후미콜라 (Humicola), 미크로스포룸 (Microsporum), 무코르 (Mucor), 피키아 (Pichia), 테르모미세스 (Thermomyces), 페니실리움 (Penicillium), 리조푸스 (Rhizopus), 리조무코르 (Rhizomucor), 미크로스포룸 (Microsporum), 무코르 (Mucor), 노카르디아 (Nocardia), 사카로미세스 (Saccharomyces), 스트렙토미세스 (Streptomyces), 테르모미세스 (Thermomyces), 트리코스포론 (Trichosporon), 지고사카로미세스 (Zygosaccharomyces) 속의 군으로부터 선택된다.

예시적 대표는, 예를 들어 다음과 같다: 아스페르길루스 카에지엘러스 (Aspergillus caesiellus), 에이. 칸디두스 (A. candidus), 에이. 카르보나리우스 (A. carbonarius), 에이. 카르네우스 (A. carneus), 에이. 셰발리에리 (A. chevalieri), 에이. 클라바투스 (A. clavatus), 에이. 코스타리카엔시스 (A. costaricaensis), 에이. 크레텐시스 (A. cretensis), 에이. 데플렉투스 (A. deflectus), 에이. 플라비셉스 (A. flaviceps), 에이. 플라부스 (A. flavus), 에이. 플로쿨라토수스 (A. flocculatosus), 에이. 푸미가투스 (A. fumigatus), 에이. 글라우쿠스 (A. glaucus), 에이. 이베리쿠스 (A. ibericus), 에이. 락티코페아투스 (A. lacticoffeatus), 에이. 렌툴루스 (A. lentulus), 에이. 네오브리드게리 (A. neobridgeri), 에이. 니둘란스 (A. nidulans), 에이. 니게르 (A. niger), 에이. 니베우스 (A. niveus), 에이. 오크라세우스 (A. ochraceus), 에이. 오리자에 (A. oryzae), 에이. 파라시티쿠스 (A. parasiticus), 에이. 페니실로이데스 (A. penicilloides), 에이. 피페리스 (A. piperis), 에이. 슈도엘레간스 (A. pseudoelegans), 에이. 슈도피쉐리 (A. pseudofisheri), 에이. 레스트릭쿠스 (A. restrictus), 에이. 로세오글로불루스 (A. roseoglobulus), 에이. 스클레로티오니게르 (A. sclerotioniger), 에이. 소자에 (A. sojae), 에이. 스테이니이 (A. steynii), 에이. 시도위 (A. sydowi), 에이. 테레우스 (A. terreus), 에이. 우다가와에 (A. udagawae), 에이. 우스투스 (A. ustus), 에이. 베르시콜로르 (A. versicolor), 에이. 웨스터디즈키아에 (A. westerdijkiae), 비폴라리스 아우스트랄리엔시스 (Bipolaris australiensis), 비. 하와이엔시스 (B. hawaiiensis), 비. 피시페라 (B. picifera), 칸디다 안탁티카 (Candida antarctica), 씨. 실린드라세아 (C. cylindracea), 씨. 리폴리티카 (C. lipolytica), 씨. 루고사 (C. rugosa), 씨. 유틸리스 (C. utilis), 씨. 로부스타 (C. robusta), 씨. 케피르 (C. kefyr), 씨. 알비칸스 (C. albicans), 씨. 글라브라타 (C. glabrata), 씨. 크루세이 (C. krusei), 씨. 루시타니아에 (C. lusitaniae), 씨. 파라프실로시스 (C. parapsilosis), 씨. 트로피칼리스 (C. tropicalis), 푸사리움 클라미도스포룸 (Fusarium chlamydosporum), 에프. 코에룰레움 (F. coeruleum), 에프. 디메룸 (F. dimerum), 에프. 인카르나툼 (F. incarnatum), 에프. 모닐리포르메 (F. moniliforme), 에프. 옥시스포룸 (F. oxysporum), 에프. 프롤리페라툼 (F. proliferatum), 에프. 사카리 (F. sacchari), 에프. 세미텍툼 (F. semitectum), 에프. 솔라니 (F. solani), 에프. 스포로트리코이데스 (F. sporotrichoides), 에프. 서브 글루티난스 (F. sub glutinans), 에프. 타바시눔 (F. tabacinum), 에프. 베르티실리오이데스 (F. verticillioides), 게오트리쿰 칸디둠 (Geotrichum candidum), 지. 클레반니이 (G. klebahnii), 후미콜라 푸스코아트라 변종 푸스코아트라 (Humicola fuscoatra var . Fuscoatra), 에이치. 아 그리세아 변종 그리세아 (H.a grisea var . Grisea), 에이치. 그리세아 변종 테르모이데아 (H. grisea var . Thermoidea), 에이치. 인솔렌스 (H. insolens), 미크로스포룸 아마조니쿰 (Microsporum amazonicum), 엠. 아우도우이니이 (M. audouinii), 엠. 아우도우이니이 변종 랑게로니이 (M. audouinii var . Langeronii), 엠. 아우도우이니이 변종 리발리에리이 (M. audouinii var . Rivalierii), 엠. 보울라르디이 (M. boullardii), 엠. 카니스 (M. canis), 엠. 카니스 변종 디스토르툼 (M. canis var . distortum), 엠. 쿠케이 (M. cookei), 엠. 에퀴눔 (M. equinum), 엠. 페루기네움 (M. ferrugineum), 엠. 풀붐 (M. fulvum), 엠. 갈리나에 (M. gallinae), 엠. 깁세움 (M. gypseum), 엠. 나눔 (M. nanum), 엠. 페르시콜로르 (M. persicolor), 엠. 프라에콕스 (M. praecox), 엠. 라세모숨 (M. racemosum), 엠. 반브레우세게미이 (M. vanbreuseghemii), 무코르 자바니쿠스 (Mucor javanicus), 엠. 푸실루스 (M. pusillus), 엠. 플럼베우스 (M. plumbeus), 엠. 라세모수스 (M. racemosus), 엠. 히에말리스 (M. hiemalis), 노카르디아 아스테로이데스 (Nocardia asteroides), 엔. 브라실리엔시스 (N. brasiliensis), 엔. 오티티디스카비아룸 (N. otitidiscaviarum), 페니실리움 아우란티오그리세움 (Penicillium aurantiogriseum), 피. 브레비콤팍툼 (P. brevicompactum), 피. 크리소게눔 (P. chrysogenum), 피. 카멤베르티 (P. camemberti), 피. 디지타툼 (P. digitatum), 피. 시트리눔 (P. citrinum), 피. 코무네 (P. commune), 피. 코릴로필룸 (P. corylophilum), 피. 크루스토숨 (P. crustosum), 피. 시클로피움 (P. cyclopium), 피. 엑스판숨 (P. expansum), 피. 푸니쿨로숨 (P. funiculosum), 피. 글라브룸 (P. glabrum), 피. 글라우쿰 (P. glaucum), 피. 그리세오풀붐 (P. griseofulvum), 피. 이탈리쿰 (P. italicum), 피. 마르네페이 (P. marneffei), 피. 날기오벤세 (P. nalgiovense), 피. 노르디쿰 (P. nordicum), 피. 노타툼 (P. notatum), 피. 팔리탄스 (P. palitans), 피. 푸르푸르레센스 (P. purpurrescens), 피. 푸르푸로게눔 (P. purpurogenum), 피. 올소니이 (P. olsonii), 피. 오리자에 (P. oryzae), 피. 로퀘포르티 (P. roqueforti), 피. 바리아빌레 (P. variabile), 피. 비리디카툼 (P. viridicatum), 피. 베르루코숨 (P. verrucosum), 피키아 아카시아에 (Pichia acaciae), 피. 아밀로필리아 (P. amylophilia), 피. 시페르리이 (P. ciferrii), 피. 파스토리스 (P. pastoris), 피. 알니 (P. alni), 피. 아메리카나 (P. americana), 피. 아메티오니나 (P. amethionina), 피. 안고포라에 (P. angophorae), 피. 안구스타 (P. angusta), 피. 아노말라 (P. anomala), 피. 안틸렌시스 (P. antillensis), 피. 바르케리 (P. barkeri), 피. 베세이 (P. besseyi), 피. 비문달리스 (P. bimundalis), 피. 비스포라 (P. bispora), 피. 보비스 (P. bovis), 피. 칵토필라 (P. cactophila), 피. 카나덴시스 (P. canadensis), 피. 캅슐라타 (P. capsulata), 피. 카리바에아 (P. caribaea), 피. 카스틸라에 (P. castillae), 피. 캄바르디이 (P. chambardii), 피. 델프텐시스 (P. delftensis), 피. 데세르티콜라 (P. deserticola), 피. 드리아도이데스 (P. dryadoides), 피. 유포르비아에 (P. euphorbiae), 피. 유포르비이필라 (P. euphorbiiphila), 피. 파비아니이 (P. fabianii), 피. 파에칼리스 (P. faecalis), 피. 파리노사 (P. farinosa), 피. 페르멘탄스 (P. fermentans), 피. 필란디카 (P. finlandica), 피. 플룩수움 (P. fluxuum), 피. 갈라에이포르미스 (P. galaeiformis), 피. 글루코지마 (P. glucozyma), 피. 귈리에르몬디이 (P. guilliermondii), 피. 햄프시렌시스 (P. hampshirensis), 피. 하플로필라 (P. haplophila), 피. 헤에디이 (P. heedii), 피. 헤이미이 (P. heimii), 피. 헨리시이 (P. henricii), 피. 홀스티이 (P. holstii), 피. 이노시토보라 (P. inositovora), 피. 자디니이 (P. jadinii), 피. 자포니카 (P. japonica), 피. 클루이베리 (P. kluyveri), 피. 코다마에 (P. kodamae), 피. 린페르디이 (P. lynferdii), 피. 마가니시이 (P. maganishii), 피. 메디아 (P. media), 피. 멤브라니파시엔스 (P. membranifaciens), 피. 메타놀리카 (P. methanolica), 피. 메틸리보리아 (P. methylivoria), 피. 멕시카나 (P. mexicana), 피. 메이에라에 (P. meyerae), 피. 미누타 (P. minuta), 피. 미시시피엔시스 (P. mississippiensis), 피. 나카세이 (P. nakasei), 피. 나카자와에 (P. nakazawae), 피. 노르베겐시스 (P. norvegensis), 피. 오에즐레미이 (P. oezlemii), 피. 오푸나엔시스 (P. ofunaensis), 피. 오메리 (P. ohmeri), 피. 오니키스 (P. onychis), 피. 오푼티아에 (P. opuntiae), 피. 페테르소니이 (P. petersonii), 피. 필로덴드리 (P. philodendri), 피. 필로가에아 (P. philogaea), 피. 피즈페리 (P. pijperi), 피. 피니 (P. pini), 피. 포풀리 (P. populi), 피. 슈도칵토필라 (P. pseudocactophila), 피. 퀘르쿰 (P. quercuum), 피. 라바울렌시스 (P. rabaulensis), 피. 로다넨시스 (P. rhodanensis), 피. 살리카리아 (P. salicaria), 피. 스콜리티 (P. scolyti), 피. 세고비엔시스 (P. segobiensis), 피. 실비콜라 (P. silvicola), 피. 스파르티나에 (P. spartinae), 피. 스티피티스 (P. stipitis), 피. 스트라스부르겐시스 (P. strasburgensis), 피. 서브펠리쿨로사 (P. subpelliculosa), 피. 시도위오룸 (P. sydowiorum), 피. 탄니콜라 (P. tannicola), 피. 테르모톨레란스 (P. thermotolerans), 피. 톨레타나 (P. toletana), 피. 트레할로필라 (P. trehalophila), 피. 트리안굴라리스 (P. triangularis), 피. 베로나에 (P. veronae), 피. 위케르하미이 (P. wickerhamii), 피. 자일로사 (P. xylosa), 테르모미세스 라누기노사 (Thermomyces lanuginosa), 리조푸스 아리주스 (Rhizopus arrhizus), 알. 델레마르 (R. delemar), 알. 니베우스 (R. niveus), 알. 오리자에 (R. oryzae), 알. 아지고스포루스 (R. azygosporus), 알. 미크로스포루스 (R. microsporus), 알. 쉬페라에 (R. schipperae), 알. 스톨로니페르 (R. stolonifer), 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei), 사카로미세스 바르네티이 (Saccharomyces barnettii), 에스. 바야누스 (S. bayanus), 에스. 카스텔리이 (S. castellii), 에스. 세레비시아에 (S. cerevisiae), 에스. 다이레넨시스 (S. dairenensis), 에스. 엑시구우스 (S. exiguus), 에스. 파라독수스 (S. paradoxus), 에스. 파스토리아누스 (S. pastorianus), 에스. 로시니이 (S. rosinii), 에스. 세르바지이 (S. servazii), 에스. 스펜코에로룸 (S. spencoerorum), 에스. 트란스바알렌시스 (S. transvaalensis), 에스. 유니스포루스 (S. unisporus), 에스. 바일리이 (S. bailii), 스트렙토미세스 아종 (Streptomyces spp .), 트리코스포론 아사히이 (Trichosporon asahii), 티. 아스테로이데스 (T. asteroides), 티. 베이겔리이 (T. beigelii), 티. 코레미이포르메 (T. coremiiforme), 티. 쿠타네움 (T. cutaneum), 티. 파에칼레 (T. faecale), 티. 그라실레 (T. gracile), 티. 인킨 (T. inkin), 티. 무코이데스 (T. mucoides), 티. 오보이데스 (T. ovoides), 티. 풀루란스 (T. pullulans), 지고사카로미세스 비스포루스 (Zygosaccharomyces bisporus), 제트. 시드리 (Z. cidri), 제트. 페르만타티 (Z. fermantati), 제트. 플로렌티누스 (Z. florentinus), 제트. 멜리스 (Z. mellis), 제트. 미크로엘리프소이데스 (Z. microellipsoides), 제트. 엠라키이 (Z. mrakii), 제트. 로우시이 (Z. rouxii).

본 발명에 따른 방법에서 특히 바람직하게 사용되는 카르복실산 에스테르 가수분해효소는, 테르모미세스 라누기노사 (등록 번호 O59952)로부터의 리파아제, 칸디다 안탁티카 (등록 번호 P41365)로부터의 리파아제 A 및 B 및 무코르 미에헤이 (등록 번호 P19515)로부터의 리파아제, 리조무코르 자바니쿠스 (등록 번호 S32492)로부터의 리파아제, 리조푸스 오리자에 (등록 번호 P61872)로부터의 리파아제, 칸디다 루고사 (등록 번호 P20261, P32946, P32947, P3294 및 P32949)로부터의 리파아제, 리조푸스 니베우스 (등록 번호 P61871)로부터의 리파아제, 페니실리움 카멤베르티 (등록 번호 P25234)로부터의 리파아제, 아스페르길루스 니게르 (ABG73613, ABG73614 및 ABG37906)로부터의 리파아제 및 페니실리움 시클로피움 (등록 번호 P61869)으로부터의 리파아제의 군으로부터 선택되는 효소, 및 또한 각 경우 아미노산 수준에서 60％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 더 바람직하게는 90％ 이상, 특히 바람직하게는 95％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상동성인 것이다. 상동성과 관련하여 상기 정의를 참조할 수 있다.

상업적 예 및 본 발명에 따른 방법에서 마찬가지로 바람직하게 사용되는 카르복실산 에스테르 가수분해효소는 상품 Lipozyme TL IM, Novozym 435, Lipozyme IM 20, 리파아제 SP382, 리파아제 SP525, 리파아제 SP523, (모두 덴마크 박스바에르트 소재의 노보자임스 에이/에스 (Novozymes A/S)의 상품), Chirazyme L2, Chirazyme L5, Chirazyme L8, Chirazyme L9 (모두 독일 만하임 소재의 로슈 몰레큘라 바이오케미컬즈 (Roche Molecular Biochemicals)의 상품), 및 리파아제 M "Amano", 리파아제 F-AP 15 "Amano", 리파아제 AY "Amano", 리파아제 N "Amano", 리파아제 R "Amano", 리파아제 A "Amano", 리파아제 D "Amano", 리파아제 G "Amano" (모두 일본 소재의 아마노 (Amano)의 상품)이다.

생체촉매는 바람직하게는 무수 또는 부분 수화된 형태로 사용한다. 이는 고정화된 상태로 또는 동결건조물로서 사용할 수 있다. 고정화에 사용할 수 있는 담체는 불활성 유기 또는 무기 담체이다. 바람직하게 사용되거나 효소의 고정화된 형태로 존재하는 불활성 담체는 입자의 90％ 이상의 입자 크기가 10 내지 5000 ㎛, 바람직하게는 50 ㎛ 내지 2000 ㎛인 입자 크기 분포를 갖는 미립자 담체이다. 특히 사용할 수 있는 유기 담체는 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리비닐스티렌, 스티렌-디비닐벤젠 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 페레프탈레이트, PTFE 및/또는 다른 중합체를 포함하거나 이로 이루어지는 것이다. 고정화시킬 효소에 따라 담체 재료로서, 특히 산성 또는 염기성 이온 교환 수지, 예를 들어 Duolite A568, Duolite XAD 761, Duolite XAD 1180, Duolite XAD 7HP, Amberlite IR 120, Amberlite IR 400, Amberlite CG 50, Amberlyst 15 (모두 롬 앤 하스 (Rohm and Haas)의 제품) 또는 Lewatit CNP 105 및 Lewatit VP OC 1600 (모두 독일 레베르쿠젠 소재의 란세스 (Lanxess)의 제품)을 사용하는 것이 가능하다. 사용할 수 있는 무기 담체는 첨단 기술로 공지된 산화물성 및/또는 세라믹 담체이다. 특히, 사용할 수 있는 무기 담체는, 예를 들어 셀라이트, 제올라이트, 실리카, 제어된 기공 유리 (controlled-pore glass, CPG)이거나, 예를 들어 문헌 [L. Cao, "Carrier-bound Immobilized Enzymes: Principles, Application and Design", Wiley-VCH: 2005, Weinheim, Germany]에 기재된 것과 같은 다른 담체이다. 효소의 고정화된 형태로 존재하는 불활성 담체 또는 효소의 고정화된 형태를 제조하는데 사용되는 불활성 담체는, 특히 바람직하게는 폴리비닐스티렌, 폴리메타크릴레이트 또는 폴리아크릴레이트로 이루어진다.

본 발명에 따라 입자의 고정화는 공유결합 또는 비공유결합적으로 가능하며, 바람직하게는 비공유결합적이다. 비공유결합 고정화를 위해, 담체는, 예를 들어 추가적 구성성분, 예를 들어 무기염 또는 세제를 임의로 포함할 수 있는 효소 수용액과 인큐베이션하거나 이에 함침시킬 수 있다. 이러한 인큐베이션/함침은, 예를 들어 0℃ 내지 50℃, 바람직하게는 0℃ 내지 40℃의 온도에서 수행할 수 있다. 인큐베이션/함침은 바람직하게는 수 분에서부터 수 시간 이하까지의 기간에 걸쳐 수행한다. 인큐베이션의 진행에 후속하여 단백질 감정을 위한 통상적 방법으로 용액 중의 효소의 농도를 측정할 수 있다. 목적하는 정도의 고정화가 달성된 이후에, 담체를 바람직하게는 물로 세척할 수 있고, 필요한 경우 건조시킬 수 있다.

적합한 생체촉매를 포함하는 전체 세포를, 휴지 세포로서 또는 건조된 형태로서, 바람직하게는 선행 기술의 방법에 의해 침투화된 (permeabilized) 형태로서 사용하는 것 또한 가능하다.

본 발명에 따라 생체촉매는, 사용되는 기질에 대해 0.01％ (w/w) 내지 300％ (w/w)의 정량적 비율로 사용할 수 있다. 바람직한 질량비는 해당 반응 조건하에서 생체촉매의 특정 활성에 따른다 (특히, 기질, 그의 농도, 용매 및 반응 온도에 좌우됨). 이러한 파라미터에 따라, 생체촉매의 바람직한 양은 1 내지 96시간, 바람직하게는 8 내지 24시간의 기간 이내에 반응물의 완전한 전환을 가능하게 하는 양이다. 전구체의 총 질량을 기준으로 생체촉매의 양은, 바람직하게는 1％ (w/w) 내지 100％ (w/w), 매우 특히 바람직하게는 1％ (w/w) 내지 50％ (w/w), 특히 1％ (w/w) 내지 20％ (w/w) 범위로 적용된다.

특정 실시양태에서, 생체촉매는 회수된다.

본 발명에 따라, 효소적 반응의 시작시에 라이소스핑고리피드 대 카르복실산 에스테르의 몰비가 1:10 내지 10:1 이도록 반응물이 존재할 수 있다. 이와 관련하여 용어 "몰비"는 라이소스핑고리피드 아민 대 아실 공여자 카르복실레이트기의 몰비에 관한 것이다. 1:3 내지 3:1의 양의 비율이 바람직하게 사용된다. 1:1.4 내지 1.4:1의 양의 비율이 특히 바람직하게 사용되고, 양의 등몰비가 특히 바람직하다.

반응물은 추가적인 가용화제 없이 용융 상태로 또는 유기 용매 중에 용해 또는 현탁되어 존재할 수 있다. 반응은 바람직하게는 유기 용매 중에서 수행한다. 특히 적합한 용매는 20℃ 내지 130℃ 범위의 온도에서 높은 농도로 반응물을 용해시킬 수 있는 것이다. 특히 적합한 것으로 입증된 예는, 이러한 용매에 비제한적으로, 케톤 예컨대, 메틸 이소부틸 케톤 또는 사이클로헥사논, 입체 장애 2차 알코올, 예컨대 2-부틸-1-옥탄올, 메틸사이클로헥산올, 1-메톡시-2-프로판올, 2,3-부탄디올 2-옥탄올, 디아세톤 알코올, 2-메틸-2-부탄올, 입체 장애 에스테르, 예컨대 4-tert-부틸사이클로헥실 아세테이트, 2-에틸헥실 아세테이트, 사이클로헥실 아세테이트 및 에테르, 예컨대 1,4-디옥산, 테트라하이드로푸란 및 Varonic APM (독일 에센 소재의 에보니크 골드슈밋트 게엠베하 (Evonik Goldschmidt GmbH))이다. 부적합한 것으로 입증된 용매는, 특히 생체촉매에 의한 상당한 활성으로 전환되는 에스테르이다. 전구체로서 파이토스핑고신과의 에틸 부티레이트를 사용하는 반응에서, 아실 공여자 (예, 메틸 스테아레이트)를 사용하였을 때, 예를 들어 목적하는 생성물 이외에 상당한 양의 N-부티릴파이토스핑고신 및 에스테르교환 생성물을 검출할 수 있었다. 이는 부틸 아세테이트 (N-아세틸파이토스핑고신 및 아실 공여자 부틸 에스테르의 형성)의 사용시에도 동일하게 적용된다.

반응은, 칼 피셔 (Karl Fischer) 방법으로 검출하였을 때, 0.100 M 이하, 바람직하게는 0.010 M 이하, 특히 바람직하게는 최대 0.005 M인 물 함량으로 정의되는 무수 조건하에서 바람직하게 수행한다.

높은 기질 농도는 반응 속도를 위해 특히 유리하다. 전환율이 높을 때, 그로부터 높은 생성물 농도가 야기되지만, 놀랍게도 전환율이 높을 때, 효소 활성에는 부정적인 영향을 주지 않는다. 효소적 반응에서 보통 생성물 억제가 관찰되기 때문에 이러한 점은 당업자에게 놀라운 것이다. 부가적으로, 놀랍게도 매우 높은 정량적 전환율을 달성하기 위해 반응 혼합물로부터 반응 생성물 중 하나 (세라마이드 또는 알코올)를 제거하는 것이 반드시 필요한 것은 아니라는 것을 확인하였다. 당업자에게 익숙한 르샤틀리에 (Le Chatelier) 원리에 따라, 이러한 점이 본 평형 반응에서 예상됐을 것이다. 단지 67％ 내지 78％의 선행 기술 (제WO94/26919호, 기스트-브로케이즈) 반응 전환율은 그의 필요성이 예상되도록 하였다. 그러나, 본 발명에 따라 보다 낮은 기질 농도로도 효율적으로 반응하는 것이 가능하다.

본 발명의 맥락에서 바람직한 반응의 시작시 반응물 농도는 각 반응물에 있어서 0.01 M 내지 3 M 범위, 특히 0.2 M 내지 2 M 범위, 특히 바람직하게는 0.5 M 내지 1.5 M 범위이다.

반응 온도와 관련하여, 특히 적합한 온도는 기질이 용매 중에 균질하게 가용성인 온도임을 확인하였다. 20℃ 내지 130℃ 범위 이내의 반응 온도가 이러한 맥락에서 유리한 것으로 입증되었다. 특히 고온에서, 색 변화 때문에 반응 혼합물의 조심스러운 탈기가 필요하다. 그러나, 놀랍게도 이러한 유형의 예방조치는 100℃ 이하의 반응 온도에서는 불필요하다는 것을 확인하였다. 따라서, 반응 온도는 바람직하게는 40℃ 내지 90℃ 범위, 매우 특히 바람직하게는 70℃ 및 85℃ 범위이다.

반응은 바람직하게는 1 bar 미만, 바람직하게는 0.5 bar 미만, 특히 바람직하게는 0.05 bar 미만의 압력하에서 수행한다.

반응은 회분식 공정 (교반되는 용기) 또는 고정층 반응기에서 연속식 또는 반연속식으로 수행할 수 있다. 생체촉매의 빠른 속도의 비활성화가, 특히 회분식 공정에서 추정되었다. 여기에서, 교반을 통해 발생하는 기계적 응력에 기인하는 생체촉매의 기계적 파괴, 및 반응물 및 용매에 의해 야기되는 비활성화 효과에 수반되는 생체촉매의 열적 비활성화가 언급되어야 한다. 이러한 효과는 당업자에게 공지되어 있고, 적절한 해결책이 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 만약 교반 공정 중에 생체촉매의 기계적 마멸이 발생한다면, 이를 피하기 위하여 고정층을 적용하는 것이 따라서 가능하다. 당업자에게 공지되어 있는 추가적인 반응기 유형도 마찬가지로 기계적 효소 비활성화를 피하는데 적합하다.

에스테르를 아실 공여자로서 사용시, 유리된 알코올에 의해 생체촉매가 화학적으로 비활성화될 것임이 추가로 예상된다 (예, 문헌 [Y. Yoshida et al., J. Biosci. Bioeng., 2006, 102(1), 66-68]). 이러한 비활성화를 피하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 반응 혼합물로부터의 증류 또는 막 공정의 사용에 의한 알코올의 제거를 포함한다. 그러나, 놀랍게도 상기한 공정을 사용하지 않더라도 활성의 상당한 손실 없이 생체촉매를 여러번 재사용할 수 있다는 것을 확인하였다.

선행기술에 기재된 모든 공정에서, 생성된 생성물은 스핑고리피드 및 높은 비율의 (총 생성물의 19％ 이하) 상응하는 N,O-디아실화 생성물의 조성물이라는 점이 공통이다. 이러한 조성물은 미용 조성물 중에 전적으로 적용불가능한데, 이는, 예를 들어 N,O-디아실화 생성물의 비율이 5％ 미만이 아니기 때문이다. 또한 놀랍게도, 본 발명에 따른 방법에서, 2차 아민 관능기의 아미드화가 알코올 관능기 중 하나의 에스테르화에 비해 뚜렷하게 선호된다는 것을 확인하였다. 상반되는 거동, 특히 1차, 즉 입체적으로 용이하게 접근가능한 알코올 관능기에 대한 선호가 예상되었을 것이다. 선행 기술 (제WO94/26919호, 기스트-브로케이즈)에는 이와 유사한 상황이 기재되어 있는데, 박테리아 리파아제의 사용시, 심지어 파이토스핑고신에 대해 60 몰％ 과량의 아실 공여자를 사용하여도, 그로부터 수득된 반응 생성물은 상당한 비율의 N,O-디아실화 생성물 (모노아실화 생성물 대 디아실화 생성물 > 1:5)을 함유하였다.

대조적으로, 본 발명에 따른 방법에서, 심지어 라이소스핑고리피드에 대해 3.6-배 과량의 아실 공여자를 사용하여도, 반응 혼합물 중에 라이소스핑고리피드가 여전히 존재하는 한 현저한 디아실화는 이루어지지 않을 것이라 것을 확인할 수 있었다. 라이소스핑고리피드가 스핑고리피드로 완전히 전환된 후에야 느린 에스테르화 활성을 검출할 수 있었다. 라이소스핑고리피드 및 아실 공여자의 화학량론적 사용시, 상기한 원치 않는 부반응이 거의 관찰되지 않았다.

따라서, 본 발명은 효소적 반응으로부터 특히 순수한 N-아실파이토스핑고신이 심지어 조질 생성물로서 수득되는 방법에 관한 것이다. 화학식 I에 따른 표적 화합물과 관련된 전환율은, 이론적으로 예상되는 전환율의 바람직하게는 80％ 초과, 특히 바람직하게는 85％ 초과, 매우 특히 바람직하게는 90％ 초과이다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 화학식 I 및 0.001 내지 19 질량％, 바람직하게는 0.005 내지 19 질량％, 특히 바람직하게는 0.01 내지 5 질량％의 상응하는 N,O-디아세틸화 생성물을 포함하는 조성물을 제조하는데 적합하다.

따라서 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조한, 화학식 I 및 0.001 내지 19 질량％, 바람직하게는 0.005 내지 19 질량％, 특히 바람직하게는 0.01 내지 5 질량％의 상응하는 N,O-디아세틸화 생성물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조한 스핑고리피드에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 반응 혼합물로부터 스핑고리피드를 단리하는 방법에 관한 것이다. 스핑고리피드는, 그의 유리한 물리적 특성에 기인하여, 반응 용액으로부터 결정화/침전에 의해 용이하게 제거할 수 있고, 따라서 간단한 방식으로 조질 생성물의 이미 높은 순도를 추가로 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 스핑고리피드 및 조성물은 미용 및 제약 제제의 제조에 특히 적합하다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 1종 이상의 스핑고리피드 및/또는 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 미용 또는 제약 제제에 관한 것이다.

본 발명을 하기 실시예에서 예를 들어 설명하며, 전체 상세한 설명 및 청구범위로부터 적용 범위가 명백한 본 발명은 실시예에서 언급되는 실시양태에 제한되는 것을 의도하지 않는다.

하기 도면은 실시예의 일부이다.
도 1: 파이토스핑고신과 3.4-배 과량 아실 공여자의 효소적 반응의 과정.
도 2: 파이토스핑고신과 메틸 스테아레이트의 효소적 반응의 과정의 비교. 삼각형: 부가적 N-스테아로일파이토스핑고신 사용, 사각형: 부가적 N-스테아로일파이토스핑고신 사용하지 않음.
도 3: 생체촉매의 재순환: 당해 사이클의 초기 활성을 검정색으로 나타내고, 24시간 후의 수율을 빗금으로 나타냈음.
도 4: 다양한 용매 중에서의 파이토스핑고신과 메틸 스테아레이트의 효소적 반응의 시간-전환율 곡선.
도 5: 아실 공여자로서 트리스테아린을 사용하는 효소적 세라마이드III의 합성의 과정.

실시예

실시예 1: PS 설페이트의 탈양성자화

100 g의 파이토스핑고신 설페이트 (네덜란드 델프트 소재의 코스모페름 (Cosmoferm))를 55℃에서 600 g의 메탄올 중에 현탁시키고 46 g의 나트륨 메톡사이드와 혼화하고, 55℃에서 150분 동안 교반하였다. 그 후, 현탁액을 고온 여과하고 여과물을 농축시켰다. 연한 베이지색 고체 (78 g)를 후속 실험에 사용하였다.

실시예 2: 아미드화 반응성을 위한 상업적 리파아제의 선별

디옥산 (11 mL) 중 파이토스핑고신 (실시예 1로부터) 및 메틸 스테아레이트 (각각 1M)의 등몰 용액 중에 표 1에 나열된 각각의 진균의 리파아제 0.35 g (5％ w/w)를 현탁하고 80℃ 리파아제에서 72시간 동안 진탕하였다. 그 후, 생체촉매를 고온 여과하고 여과물을 기체 크로마토그래피로 분석하였다.

칸디다 안탁티카로부터의 리파아제 B를 후속 실험에 사용하였다.

실시예 4: 음성 대조군

파이토스핑고신과 아실 공여자의 모든 가능한 촉매되지 않은 반응을 제외시키기 위하여, 파이토스핑고신을 메틸 스테아레이트 중에 0.2 M 농도로 80℃에서 용해시키고 4시간 동안 인큐베이션하였다. 기체 크로마토그래피에 의한 후속 분석으로는 어떠한 현저한 (측정가능한) 전환도 나타나지 않았다.

실시예 5: 파이토스핑고신 설페이트와의 반응

파이토스핑고신 설페이트를 탈양성자화시켜야 하는 필요성을 보여주기 위하여, 하기 비교 실험을 수행하였다. 8.18 g의 파이토스핑고신 설페이트 및 6.72 g의 메틸 스테아레이트를 15 mL의 디옥산 중에 80℃에서 현탁하고, 0.16 g의 Novozym 435와 혼화하였다. 교반하면서 4시간 동안 인큐베이션 한 후, 반응 혼합물을 기체 크로마토그래피로 분석하였다. 단지 31.7 mM의 N-스테아로일파이토스핑고신이 확인되었다. 동일한 조건하에서의 비교 실시예에서, 2.4 g의 나트륨 카르보네이트를 첨가한 후에 368 mM N-스테아로일파이토스핑고신이 확인되었다.

실시예 6: 효소적 아실화의 위치선택성

파이토스핑고신에 대해 크게 과량인 아실 공여자를 수득하기 위하여, 4.43 g의 파이토스핑고신을 15.09 g의 메틸 스테아레이트 중에 120℃에서 용해시켰다. 이 용액을 0.98 g의 Novozym 435 (5％ w/w)와 혼화하고 표준 압력하에서 교반하였다. 주기적으로 샘플을 취하여 기체 크로마토그래피로 분석하였다.

반응 과정 (도 1)을 보고 알 수 있듯이, 원치않는 N,O-디스테아릴파이토스핑고신의 상당한 축적은, 사용된 파이토스핑고신의 완전한 전환에서만 이루어진다. 한 시간 후, 19 mM (전환율 99.5％ 초과)의 잔여 파이토스핑고신 농도에서 N,O-디아실화 생성물은 아직 검출되지 않았고, N,O-디아실화 생성물의 형성은 약 5 mM의 파이토스핑고신 농도 미만에서만 관찰되었다. 부가적으로, 2차 반응의 반응 속도는 목적하는 반응의 반응 속도보다 1/25배 미만으로 느리다.

실시예 7: 생성물 억제와 관련된 실험

모든 생성물 억제를 제외시키기 위하여, 두 실험을 동시에 병행하여 수행하였다. 이를 위하여, 1.59 g의 파이토스핑고신을 각 경우 7.45 g의 메틸 스테아레이트와 함께 25 mL의 디옥산 중에 80℃에서 용해시키고, 각 경우 0.49 g의 Novozyme 435와 혼화하였다. 두 반응 혼합물 중 하나를 부가적으로 1.3 g의 N-스테아로일파이토스핑고신 (네덜란드 델프트 소재의 코스모페름)과 혼화하였다. 두 시간-전환율 곡선의 비교는 (도 2) 반응 궤적이 동일함을 나타내며, 따라서 임의의 두드러진 생성물 억제를 제외시킬 수 있다.

실시예 8: 생체촉매 의 재사용성

생체촉매의 재사용성을 평가하기 위하여, 일련을 실험을 하기와 같이 수행하였다. 3.3 g의 파이토스핑고신을 14.9 g의 메틸 스테아레이트와 함께 50 mL의 디옥산 중에 80℃에서 용해시키고, 0.98 g의 Novo435를 첨가하여 반응을 시작하였다. 샘플을 주기적으로 취하여 기체 크로마토그래피로 분석하고, 그로부터 초기 속도 및 전환율을 계산하였다. 24시간 후, 반응 회분을 고온 여과하고 뒤에 남는 효소를 각 회마다 50 mL의 고온 (50℃) 디옥산으로 3회 세척하였다. 그 후, 이렇게 재순환된 생체촉매를 상기한 바와 동일한 조건하에서 재사용하였다. 이 절차를 총 6회 반복하였다.

도 3으로부터 명백히 나타나듯이, 생체촉매를, 어떠한 식별가능한 활성의 감소없이 7회 이상 반응에 사용할 수 있다.

실시예 9: 생체촉매 의 동력학 파라미터의 측정

효소적 N-아실화의 동력학 파라미터를 하기와 같이 측정하였다: 한 반응물의 농도를 변화시키면서 다른 물질의 농도는 일정하게 유지시켰다. 반응을 디옥산 중 80℃에서 각 경우 동일한 양의 효소를 사용하여 수행하였다. 샘플을 주기적으로 취하여 기체 크로마토그래피로 분석하였고, 이로부터 해당 초기 속도를 측정하고 라인웨버-버크 (Lineweaver-Burk)에 따라 분석하였다. 측정된 결과는, 파이토스핑고신에 있어서 K_M 값이 400 mM, 메틸 스테아레이트에 있어서 K_M 값이 196 mM이었다.

실시예 10: 반응 속도에 대한 온도의 영향

효소적 반응을, 모든 경우 등몰량으로 사용되는 다양한 기질에서 수행하였다. 효소의 양은 각 경우 1.4％ (w/w)였다. 초기 속도 및 또한 4시간 이후의 전환율의 기체-크로마토그래피 평가의 결과를 표 2에 나타내었다.

실시예 11: 다양한 용매의 사용

파이토스핑고신 및 메틸 스테아레이트를 각각 해당 용매 중에 80℃에서 1M로 용해시키고, 5％ (w/w)의 Novozym 435와 혼화하고 교반하였다. 주기적으로 샘플을 취하여 기체 크로마토그래피로 분석하였다. 도 4로부터 명백히 나타나듯이, 개별 반응의 전환율-시간 곡선 및 또한 24시간 이후의 전환율은 거의 일치했다.

실시예 12: 파이토스핑고신과 다양한 지방산 에스테르의 효소적 반응

파이토스핑고신 및 표 3에 보고된 아실 공여자를 각각 용매 중에 80℃에서 1M로 용해시키고, 5％ (w/w)의 Novozym 435와 혼화하고 교반하였다. 주기적으로 샘플을 취하여 기체 크로마토그래피로 분석하였다.

실시예 13: 생성물의 선택적 결정화

메틸 스테아레이트 (734 mM) 및 파이토스핑고신 (146 mM)을 2-메틸-2-부탄올 중에 80℃에서 용해시키고, 5％ (w/w)의 Novozym 435와 혼화하고 80℃에서 20시간 동안 교반하였다. 그 후, 효소를 고온 여과해내고 투명한 출발 용액을 45℃에서 밤새 온도 컨디셔닝하였다. 침전된 고체를 여과해내고, 여과물 및 여과 잔류물을 기체 크로마토그래피로 분석하였다. 표 4로부터 명백히 나타나듯이, 분별 침전은, 심지어 큰 과량의 기질의 존재하에서도 목적하는 생성물의 선택적 농후화를 달성할 수 있게 한다.

실시예 14: 아실 공여자로서 트리스테아린

트리글리세라이드 (트리스테아린)를 아실 공여자로서 사용하여 효소적 반응을 수행하였다. 0.5 g의 Novozym 435를 17 g의 디옥산 중 5.4 g의 파이토스핑고신 및 5 g의 트리스테아린의 용액 중에 80℃에서 첨가하고 대기압하에서 교반하였다. 샘플을 주기적으로 취하여 기체 크로마토그래피로 분석하였다.

도 5로부터 명백히 나타나듯이, 아실 공여자의 완전한 전환이 가능하였다. 이는 놀랍게도 상당한 양의 중간생성물 부분 글리세라이드 (글리세롤 디스테아레이트 또는 글리세롤 모노스테아레이트)가 관찰할 수 없다는 기체 크로마토그래피의 분석으로부터 밝혀졌다.

실시예 15: 파이토스핑고신 설페이트로부터의 N- 스테아로일파이토스핑고신의 단일 용기 합성

100 g의 파이토스핑고신 설페이트 (네덜란드 델프트 소재의 코스모페름)를 100 mL의 MIBK (메틸 이소부틸 케톤) 중에 55℃에서 현탁하고, 46 g의 나트륨 메톡사이드와 혼화하고 55℃에서 180분 동안 교반하였다. 그 후, 73.3 g의 메틸 스테아레이트 및 5 g의 Novo435를 첨가하였다. 이렇게 수득한 현탁액을 80℃에서 36시간 동안 교반하고 고온 여과해내었다. 투명한 여과물을 실온에서 4시간 동안 정치시키고 침전된 투명한 베이지색 고체 (122.3 g의 N-스테아로일파이토스핑고신, 순도 >97％)를 여과해내었다.

실시예 16: 고정층 반응기 내에서의 파일럿 회분

207.8 g의 파이토스핑고신 설페이트를 500 mL의 MIBK 중에 55℃에서 108.04 g의 NaOCH₃ 용액 (메탄올 중 25％ 농도)과 함께 현탁하고 후속하여 필터 프레스를 통해 고정층 반응기로 고온 전달하고 149.3 g의 메틸 스테아레이트와 혼화하였다. 고정층은 17.8 g의 Novozyme 435를 함유하였다. 전체 반응기는 80℃로 자동온도 조절하였다. 고정층을 약 25 ml 분^-1의 펌핑 속도에서 반응 혼합물로 플러싱하였다. 0.8 bar의 저압력을 적용하여 과량의 메탄올을 제거하였다. 24시간 후, 반응기르 질소로 통기시켜 비우고, 반응 용액을 실온에서 밤새 정치시켰다. 침전된 고체를 여과해냈다 (287.1 g의 N-스테아로일파이토스핑고신, 순도 98.7％).

Claims (25)

1. 하기 화학식 II의 라이소스핑고리피드와 하기 화학식 III의 카르복실산 에스테르를 반응시키는 것을 포함하며,
   사용되는 생체촉매가 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei), 테르모미세스 라누기노사 (Thermomyces lanuginosa), 칸디다 루고사 (Candida rugosa), 칸디다 실린드라세아 (Candida cylindracea) 및 칸디다 안탁티카 (Candida antarctica)의 군으로부터 선택되는 진균류계의 유기체로부터 단리할 수 있는 1종 이상의 리파아제를 포함하는 것을 특징으로 하는,
   하기 화학식 I의 스핑고리피드의 생체촉매적 제조 방법.
   [화학식 I]
   

   

   
   [화학식 II]
   

   

   
   [화학식 III]
   

   

   
   식 중, R¹은 2 내지 55개의 탄소 원자를 갖고, 알킬, 하이드록시, 케토 또는 아민기로부터 선택되는 하나 이상의 추가적 기로 치환 또는 비치환된, 선형 또는 분지형 알킬 사슬을 나타내고,
   R²는 H, 포스포콜린, 에탄올아민, 세린 또는 당을 나타내고,
   X는 CH=CH, CH₂-CH₂ 또는 CH₂-HCOH를 나타내고,
   R³은 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖고 하나 이상의 라디칼 -OR⁴로 치환될 수 있는 분지형 또는 비분지형 알킬 라디칼을 나타내고,
   R⁴는 독립적으로 H 및 -C(O)R¹ (식 중, R¹은 상기 정의와 같음)을 포함하는 군으로부터 선택되는 동일하거나 또는 상이한 라디칼이다.
2. 제1항에 있어서, R³이 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 비치환된 알킬 라디칼인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 화학식 III의 카르복실산 에스테르가 하나 이상의 산 R¹COOH를 갖는 폴리올의 완전 또는 부분 에스테르인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 라이소스핑고리피드가 효소적 반응 이전에 라이소스핑고리피드의 산 부가 생성물의 탈양성자화에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 라이소스핑고리피드의 산 부가 생성물의 탈양성자화와 생체촉매적 제조 사이에 여과 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 라이소스핑고리피드가 생체촉매작용 동안에 라이소스핑고리피드의 산 부가 생성물의 탈양성자화에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제4항에 있어서, 라이소스핑고리피드의 산 부가 생성물로서 라이소스핑고리피드의 카르복실산 카르복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 카르보네이트, 하이드록사이드 또는 할라이드를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제4항에 있어서, 유기 또는 무기 염기를 탈양성자화를 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 양성자화 이후에 물을 전혀 유리시키지 않는 염기를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제8항에 있어서, 알칼리 금속 알코올레이트를 염기로서 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제8항에 있어서, 라이소스핑고리피드의 산 부가 생성물과 염기 사이의 몰비가 10:1 내지 0.05:1 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 삭제
13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 생체촉매의 양이 전구체의 총 질량을 기준으로 1％ (w/w) 내지 100％ (w/w) 범위로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 생체촉매를 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 반응물이 효소적 반응의 시작시에 1:10 내지 10:1의 라이소스핑고리피드 대 카르복실산 에스테르의 몰비로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 반응을 유기 용매 중에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 반응을 칼 피셔 (Karl Fischer) 방법으로 검출하였을 때 0.1 M 이하인 물 함량으로 정의되는 무수 조건하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 반응의 시작시 반응물 농도가 각 반응물에 있어서 0.01 M 내지 3 M 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 온도가 20℃ 내지 130℃ 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 반응을 1 bar 미만의 압력하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I에 따른 표적 화합물과 관련된 전환율이, 이론적으로 예상되는 전환율의 80％ 초과인 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제1항에 있어서, 화학식 I 및 0.001 내지 19 질량％의 상응하는 N,O-디아세틸화 생성물을 포함하는 조성물이 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제

Images