KR101520114B1 - 스트론튬 화합물을 함유하는 섬유소 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 섬유소원(fibrinogen), 트롬빈, 및 스트론튬(Sr) 함유 화합물 및/또는 가능하게는 칼슘과 같은 또 다른 금속을 함유하는 화합물을 포함하는 무기 성분을 포함하는 점탄성 히드로겔 또는 액상 제제 형태의 골 치유 및 골 재생에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다. 스트론튬-함유 화합물은 트롬빈 용액에 용해되거나 또는 결정질 미립자 형태로 응괴에 첨가될 수 있다. 성분들의 혼합시, 겔화가 발생하여 바탕질(matrix)이 형성된다. 조성물은 또한 가소제로서 작용하는 요오드-함유 화합물을 포함할 수 있다.
섬유소, 스트론튬, 골 치유, 골 재생

Description

스트론튬 화합물을 함유하는 섬유소 조성물{FIBRIN COMPOSITIONS CONTAINING STRONTIUM COMPOUNDS}
본 출원은 2007년 4월 23일에 출원되었고 그 전문이 참조로 구체적으로 본원에 포함되는 미국 가출원 번호 제60/925,716호의 우선권을 주장한다.
본 발명은 일반적으로는 골 치유 및 골 재생에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이며, 구체적으로는 섬유소원(fibrinogen), 트롬빈, 및 스트론튬(Sr) 함유 화합물 및/또는 가능하게는 칼슘과 같은 또 다른 금속을 함유하는 화합물을 포함하는 무기 성분을 포함하는 점탄성 히드로겔 또는 액상 제제에 관한 것이다. 스트론튬-함유 화합물은 트롬빈 용액에 용해되거나 또는 결정질 미립자 형태로 조성물에 첨가될 수 있다. 성분들의 혼합시, 겔화가 발생하여 바탕질(matrix)이 형성된다.
골 치유 및 재생에 있어서 현재의 관행은 골 공극을 골 이식편(자가이식편 또는 동종이식편), 골 시멘트, 예를 들면 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 또는 주입형 또는 삽입형 칼슘염 공극 충전물로 채우는 것이다. 이 용도로는 자가이식편이 "절대적 표준" 선택이지만, 기증자 조직 한계, 외상, 감염, 및 이환에 관한 쟁점이 있다. 동종이식편에는 질병 전달 및 면역원성의 위험을 비롯한 다수의 문제가 있다. 자가이식편 및 동종이식편은 모두 이차 재형성으로 인한 생물학적 및 기계적 특성의 손실을 나타낸다. 골 이식편의 대체재에 대한 관심을 촉구하는 것은 이러한 한계들이다[Parikh SN. 2002; J. Postgrad . Med. 48:142-148].
PMMA는 재흡수 불가능한 중합체 물질이다. 그의 중합 동안, 미반응 단량체, 촉매, 및 저분자량 올리고머가 중합체 내에 갇힌다. 이러한 화합물들은 물질로부터 스며나와 국소화된 세포독성적 및 면역학적 반응을 유발할 가능성이 있다. PMMA 중합은 잠재적으로 열 괴사를 일으킬 수 있는 높은 발열 반응을 갖는다. 이 발열은 또한 PMMA가 어떤 약리학제 또는 화학요법제에 포함될 수 있는 능력을 제한한다. 결손부로부터의 PMMA 누출은 인접 구조의 압박(추가 수술을 요함) 및/또는 색전증을 비롯한 매우 심각한 합병증을 유발할 수 있다.
나노-수준(10-9 m)에서 골 바탕질은 칼슘염의 작은 결정들이 매립되어 있는 아교질 섬유로 구성된다. 골의 자연적 구성을 모사하기 위해, 칼슘염을 흔히 골의 복구에 사용한다. 칼슘염 기반의 "주입형 공극 충전물"이 다수 공지되어 있다. 칼슘염 시멘트의 한 가지 주요한 문제는 통상 화학 반응에 의해 달성되는 그의 생체내 경화 요건이다. 즉, 세포 및 약리학제와 같이 충전물에 혼입된 임의의 생물제제(biologics)는 잠재적으로 손상될 수 있다. 또한, 충전제는 너무 "유동적인" 경우 결손부 밖의 인접 공간으로 누출되어 구조의 압박 및 가능하게는 색전으로 이어질 수 있다. 관절에 가까운 결손부로부터의 누출은 잠재적으로는 관절 기능을 손상시킬 수 있다.
칼슘 포스페이트(CP) 염 히드록시애퍼타이트(HA; 구조식 Ca10(PO4)6(OH)2)는 골의 무기질 상에 가장 가까우며, 실험실에서 쉽게 합성될 수 있다. 다른 양이온(예를 들면, 마그네슘, 나트륨, 및 스트론튬) 또는 음이온(클로라이드, 플루오라이드, 및 카르보네이트)이 결정 내에 치환된 HA를 제조하는 것도 또한 가능하다. 본 발명에 관련된 것은 CP 결정에서 칼슘(Ca2 +) 이온을 스트론튬(Sr2 +) 이온으로 치환하는 것이다. 스트론튬 및 칼슘은 모두 알칼리 토류 원소에 속하며, 체내의 전체 칼슘 및 스트론튬의 99％ 이상이 골에 집중되어 있다는 점에서 서로 유사하다. 스트론튬은 골 강도와 긍정적 관계를 갖는 것으로 확인된 유일한 원소이다. 즉, 골의 기계적 강도는 스트론튬 함량의 증가에 따라 증가한다. 스트론튬의 잠재적인 치료 효과는 얼마 전부터 알려져 있었다. 그러나, 정상적인 안정한 Sr2 + (84Sr, 86Sr, 87Sr, 및 88Sr)과 그의 방사선 동위 원소(85Sr, 86mSr, 87Sr, 및 88Sr)의 혼동으로 인해 치료 효과가 간과되었을 수도 있음이 문헌[Dahl et al., Bone; 28 (4) pp. 446-453]에 제안되었다. 최근에 스트론튬의 치료 효과가 부각되었으며, 설치류 및 골다공증 환자의 골 조직형태학 검사에 의해 평가했을 때, 스트론튬 염은 시험관내(낮은 투여량에서조차) 및 생체내에서 골 형성을 촉진하고 골의 재흡수를 억제한다는 것이 연구에 의해 입증되었다[Ferraro et al, 1983; Calcif Tissue Int. 35:258-60].
스트론튬의 강력한 동화작용성 및 항재흡수 효과는 신규 항골다공증 약의 개발로 이어졌다. 이 경구 활성 약(활성 성분: 스트론튬 라넬레이트)은 척추 골절의 위험을 낮추고 골 무기질 밀도를 높이는 것으로 나타났다[Meunier PJ et al, 2004; N Engl J Med . 350(5):459-68]. 이 약은 2개의 스트론튬 원자에 결합된 1개의 라넬산 분자로 구성된다. 라넬레이트기는 위장관에서 잘 견디므로 담체로서 선택되었다. 창자에서 스트론튬 이온이 라넬레이트기로부터 분리되어 창자 점막에 의한 스트론튬의 흡수로 이어진다. 흡수시, 스트론튬은 골 조직에 강한 친화력을 나타내며 히드록시애퍼타이트의 최외곽 수화 층으로 혼입된다. 보다 적은 양이 골 결정에 통합되며, 이 때 스트론튬과 칼슘 원자의 비율은 스트론튬의 존재에 의해 결정의 형성이나 물리화학적 특성이 변하지 않도록 1:10을 넘지 않는다. 스트론튬 라넬레이트는 골 형성을 골 재흡수로부터 떼어놓은 최초의 약물이라고 여겨진다. 시험관내에서, 스트론튬 라넬레이트는 콜라겐 및 비-콜라겐 단백질 합성을 증가시켜, 전구-골모세포(pre-osteoblast) 분화를 강화하고, 골파괴세포 분화를 억제하며, 골파괴세포 기능을 감소시키고, 골파괴세포의 세포자멸사를 증가시킨다. 동물 모델에서, 골 밀도의 증가는 생물기계적 골 강도의 증가와 밀접하게 연관된다. 랫트(rat) 모델에서, 스트론튬 라넬레이트는 골 질량을 증가시키고 미세구조 및 골 형태를 향상시켜, 골 저항의 증가를 유발한다. 난관절제 랫트(골다공증을 위한 모델)에서, 스트론튬 라넬레이트는 골 재흡수를 감소시키지만 높은 골 형성을 유지한다. 골 강도의 모든 결정인자들은 스트론튬 라넬레이트 치료에 의해 긍정적인 영향을 받는다(골 질량, 치수, 미세구조, 및 고유 골 조직 특성). 골 기계적 특성의 증가는 최대 하중의 증가뿐 아니라, 파괴 에너지의 극적인 향상을 특징으로 하는데, 이는 본질적으로 가소성(plastic) 에너지의 증가로 인한 것이다[Kendler, 2006; Curr . Osteopor. Rep. 4(1):34-9; Marie, 2006; Curr . Opin . Rheum. 18 Suppl1:S11-5; Ammann, 2006, Bone. 38(2 Suppl 1):15-8]. 스트론튬의 작용 방식이 완전히 이해된 것은 아니지만, 골발생의 증가는 1,25(OH)2 비타민 D의 순환 농도 또는 부갑상선 호르몬 효과의 변화와 연관된 것은 아니라고 생각된다. 스트론튬은 다수의 폐경후 여성의 모든 부위에서 항골절 효능을 나타내었다[Close et al, 2006; Expert Opin Pharmacother 7(12):1603-15].
스트론튬-함유 골 시멘트 형태의 스트론튬의 국소 적용은 다른 연구자들에 의해서도 조사되었다[Wong, Chi-Tak, 2004, "Osteoconduction and osseointegration of a strontium-containing hydroxyapatite bioactive bone cement : in vitro and in vivo investigations. Publisher: University of Hong Kong" (Pokfulam Road, Hong Kong); Zhao et al, 2004; J Boimed Mater Res B Appl Biometer. 69(1):79-86]. 비재흡수성 Sr-HA 골 시멘트는 주로 스트론튬-함유 히드록시애퍼타이트(Sr-HA) 충전물 및 비스페놀 A 디글리시딜에테르 디메타크릴레이트(BIS-GMA) 수지로 구성되었다. 이 물질은 주입에 의해 투여될 수 있고 PMMA보다 우수한 생리학적/기계적 특성을 가지므로 척추성형술에 사용될 수 있는 것으로 제안되었다. 스트론튬-함유 히드록시애퍼타이트(Sr-HA) 골 시멘트는 시험관내 및 생체내에서 모두 생물작용성인 것으로 입증되었다. 시험관내에서, 이것은 세포 부착(SaOS-2) 및 골 무기질화에 있어서 도핑되지 않은 히드록시애퍼타이트(HA) 골 시멘트보다 더욱 효능이 있는 것으로 나타났다. 생체내에서, Sr-HA 골 시멘트는 본래의 골과 결합되었다.
본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,736,132호 및 제5,549,904호에는, 트 랜스글루타미나제가 보강된 점착성 조직 접착제는 약 7.0 내지 약 8.5의 pH에서 약 0.5 mM 내지 약 100 mM 범위의 양으로 칼슘 및 스트론튬과 같은 2가 금속 이온을 함유하는 것이 바람직하다고 언급되어 있다. 상기 트랜스글루타미나제가 보강된 접착제는 관절 골절, 연골 결손, 표면 연골 결손, 전층 결손, 박리성 골연골염, 반월상 연골 파열(meniscal tears), 인대 파열, 힘줄 파열, 근육 병변, 근육힘줄 연결 병변, 연골(cartilage) 이식, 골 이식, 인대 이식, 힘줄 이식, 연골(chondral) 이식, 연골조직 이식, 피부 이식편 고정 및 혈관, 패칭(patching) 혈관 이식편, 및 미세혈관 혈관 연결의 조직 치료에 사용될 수 있다고 주장되었다. 상기 특허들의 주요 촛점은 트랜스글루타미나제를 접착제에 혼입하는 것이다.
이와 대조적으로, 본 발명은 트랜스글루타미나제를 혼입하지 않고, 스트론튬의 국소 투여를 위한 골 결손부 또는 공극에의 주입을 의도하며, 새로운 골 형성을 보조하기 위한 것이다. 문헌 데이터는 원소 스트론튬이 골 형성을 촉진하는 동시에 골 재흡수를 억제할 수 있음을 보여준다.
발명의 요약
본 발명은 골 결손부 또는 공극에 주입되거나 또는 지주골조직의 골수강에 주입되어 임시로 골수를 대체함으로써 새로운 골의 형성을 보조할 수 있는 조성물을 제공한다. 데이터는 원소 스트론튬이 골 형성을 촉진하는 동시에 골 재흡수를 억제할 수 있음을 보여준다.
한 측면에서, 본 발명은 섬유소, 트롬빈, 및 스트론튬-함유 화합물을 포함하는, 골 치유 및 골 성장에 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 조성물은 추가로 칼슘-함유 화합물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 주입형 겔, 주입형 퍼티(putty), 또는 주입형 액형의 형태인 주입형 조성물이다.
다른 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 가소제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 가소제는 요오드-함유 화합물이다. 본원에서 가소제로서 사용될 수 있는 예시적인 요오드-함유 화합물은 디아트리조에이트, 요오데콜, 요오딕사놀, 요오프라톨, 요오굴라미드, 요오헥솔, 요오메프롤, 요오파미돌, 요오프로미드, 요오트롤, 요오베르솔, 요오자굴레이트, 및 메트리자미드, 및 이들의 혼합물, 및 다가 알콜로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 다른 실시양태에서, 가소제는 폴리에틸렌 글리콜, 다가 알콜, 글리세롤, 또는 단당류, 이당류, 삼당류, 다당류, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 당이다. 다른 실시양태에서, 가소 효과는 특히 염화나트륨 및 무질서유발제(chaotropic agent)와 같은 저분자량 화합물의 조성물 조정에 의해 달성된다.
조성물은 겔 또는 액체 형태일 수 있다. 특정 측면에서, 조성물은 겔화 단계 이전이나 겔화 단계 동안에 액체 또는 겔로서, 또는 예비형성된 겔로서 조직 결손부에 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 조성물은 바탕질 단백질, 예를 들어 섬유결합소, 세포 관련 단백질, 또는 혈장 유래 단백질, 예를 들어 혈액 응고 인자 XIII, 및 단백분해효소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포외 단백질을 함유한다.
또 다른 실시양태에서, 조성물은 프로타민, 뱀독, 트랜스글루타미나제, FXIIa, 또는 생리학적으로 허용가능한 알칼리성 완충계과 같은 응고 유도제를 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 조성물은 치유 과정 동안 재흡수되고 조직으로 대체되도록 하는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용되는 스트론튬 함유 화합물은 스트론튬 클로라이드, 스트론튬 라넬레이트, 스트론튬 아세테이트, 스트론튬 글루타메이트, 스트론튬 아스파르테이트, 스트론튬 말로네이트, 스트론튬 말레에이트, 스트론튬 아스코르베이트, 스트론튬 트레오네이트, 스트론튬 락테이트, 스트론튬 포스페이트, 스트론튬 애퍼타이트, 스트론튬 피루베이트, 스트론튬 알파-케토글루타레이트, 및 스트론튬 숙시네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 이들은 단지 예시적인 스트론튬-함유 화합물이며, 스트론튬을 함유하는 다른 화합물을 본 발명의 조성물에 용이하게 사용할 수 있다.
조성물은 칼시미메틱(calcimimetic), 오스테오칼신(osteocalcin), 아미노산, 예를 들어 L-아르기닌, 및 아르기노미메틱(arginomimetic) 및 아르기닌 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 스트론튬 코-리간드(co-ligand)를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본원에 기재된 조성물에서, 스트론튬-함유 화합물 및/또는 칼슘-함유 화합물은 (마이크로)미립자 또는 고체 형태일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 스트론튬-함유 또는 칼슘-함유 (마이크로)미립자 형태는 100 나노미터 내지 500 ㎛ 범위의 입자 직경 크기를 갖는다. 다른 실시양태에서, 스트론튬 함유 또는 칼슘 함유 성분은 치수가 예를 들어 0.5 내지 50 밀리미터 범위인 다공질 또는 비다공질 고체의 형태를 띨 수 있다. 바람직하게는, 입자 크기는 0.5 내지 5 밀리미터의 범위이다.
특정 실시양태에서, 칼슘-함유 화합물은 칼슘 포스페이트이다. 칼슘 포스페이트는 트리칼슘 포스페이트, 알파-트리칼슘 포스페이트, 베타-트리칼슘 포스페이트, 칼슘 포스페이트의 다형체(polymorph), 히드록시애퍼타이트, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 술페이트, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 칼슘의 일부를 스트론튬으로 치환하여 칼슘과 스트론튬 염의 혼합물을 제공하는 것이 고려된다.
특정 실시양태에서, 칼슘 염에 대한 스트론튬 염의 비율 또는 백분율은 0.25％ 내지 100％ 범위이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 골 형태발생 단백질(bone morphogenic protein), 부갑상선 호르몬(PTH), 칼시토닌, 비스포스포네이트, 표피 성장 인자, 인슐린양 성장 인자, 및 TGF 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 또는 단백질들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 골 성장 촉진 또는 골 증가 효과를 갖는 임의의 단백질이 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 스트론튬-함유 화합물은 스트론튬을 생물활성 유리에 첨가하여 스트론튬-함유 생물활성 유리 재료를 생성함으로써 제조할 수 있다.
다른 특정 실시양태에서, 조성물은 다양한 성분들의 혼합시 조성물의 겔화가 일어나는 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 살아 있는 대상의 해면골 내에 본 발명의 스트론튬-함유 조성물을 포함하는 조성물을 주입함으로써 상기 대상의 병들거나 손상되거나 또는 결손된 골을 치료하는 것을 포함한다. 유리하게도, 그러한 조성물을 대상의 해면골 내에 주입하는 것은 스트론튬을 함유하지 않는 유사 조성물의 적용시에 관찰되는 것보다 더 빠른 치유 속도를 유발한다.
본원에서 또한 고려되는 것은 (a) 골 또는 골의 일부를 기계적으로 고정시키고; (b) 결손부를 이 결손부의 복구의 유발에 효과적인 양의 본 발명의 조성물로 채우는 것을 포함하는, 결손부를 갖는 골의 복구 방법이다. 예시적인 실시양태에서, 결손부는 골절이고, 상기 복구는 상기 골절의 골 치유이다. 본 발명의 특정 측면에서, 상기 조성물의 적용은 상기 조성물의 적용이 없는 경우에 관찰되는 것보다 더 빠른 치유 속도를 유발한다. 바람직하게는, 상기 조성물의 적용은 스트론튬을 함유하지 않는 유사 조성물의 적용시에 관찰되는 것보다 더 빠른 치유 속도를 유발한다.
또한 고려되는 것은 상기 결손 부위를 본 발명의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 골 결손 부위에서의 새로운 골 생성을 촉진하는 방법이다. 바람직하게는, 상기 골 성장의 속도는, 스트론튬을 함유하지 않는 유사 조성물의 존재시에 나타나는 골 성장에 비해, 상기 조성물에 스트론튬이 존재할 경우에 더욱 빠르다.
도 1은 스트론튬을 함유하는 응괴(clot)상에서 성장한 인간 골모세포양 세포(SaOS-2)의 세포 증식을 나타낸다. 사용된 표시법은 Ca/Sr이다. 언급된 값은 최종 응괴에서의 농도이다. 최종 응괴에서 이들 농도를 얻기 위해서는, 완충액 중 의 농도를 2배로 하였다.
도 2는 스트론튬을 함유하는 응괴에서 성장한 인간 골모세포양 세포(SaOS-2)에 대한 DNA 분석을 나타낸다. 사용된 표시법은 Ca/Sr이다. 언급된 값은 완충액에서의 농도이다. 이 값은 최종 응고체에서는 절반이 된다.
도 3은 스트론튬을 함유하는 응괴에서 성장한 인간 골모세포양 세포(SaOS-2)의 30분에 걸친 알칼리성 인산분해효소 생산을 나타낸다. 언급된 값은 최종 응괴에서의 농도이다. 이를 얻기 위해, 완충액 중의 농도를 2배로하였다.
도 4는 트롬빈 완충액이 칼슘, 칼슘/스트론튬 혼합물 또는 스트론튬 단독으로 구성된 응괴의 혼탁도 측정 분석을 나타낸다. 사용된 표시법은 Ca/Sr이다. 언급된 값은 완충액 중의 농도이다. 이 값은 최종 응괴에서 반감한다.
도 5는 12.5 mM Sr 또는 Ca를 함유하는 배지에서 성장한 응괴의 백분율 생존(MTS 증식 분석에 의해 측정함)을 나타낸다.
도 6은 섬유소 응괴 및 스트론튬 입자를 함유하는 섬유소 응괴에서 배양된 NHOst 세포의 염색 결과로, 14일 동안 섬유소 응괴(상부 패널) 또는 스트론튬 입자를 함유하는 섬유소 응괴(하부 패널) 상에서 배양한 NHOst 세포의 생존(좌측 패널) 및 사멸(우측 패널) 염색을 나타낸다.
도 7은 NHOst 세포와 함께 배양된 섬유소 응괴의 횡단면을 나타낸다. 세포는 녹색(생존) 및 적색(사멸)로 염색된다. 상부는 섬유소 응괴이다. 하부는 입자 함유 섬유소 응괴이다.
도 8은 완전히 막힌 드릴 구멍(양쪽이 모두 막힘)의 그래프를 나타낸다.
도 9는 재료 중 섬유소의 존재하에서의 토끼 대퇴 돌기의 μCT를 나타낸다.
도 10은 골 형성의 그래프를 나타낸다(평가: 1: 낮은 골 형성, 2: 중간 골 형성, 3: 높은 골 형성)
도 11은 80％ Sr 물질의 경우 토끼 대퇴 돌기의 μCT를 나타낸다.
도 12는 섬유소로 치료된 토끼 대퇴 돌기 결손부의 조직 염색 박편을 나타낸다.
도 13은 섬유소 응괴 중 80％ Sr로 치료된 토끼 대퇴 돌기 결손부의 조직 염색 박편을 나타낸다.
도 14는 PTH의 생물활성에 대한 SrCl2의 영향을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은, 트롬빈, 섬유소, 및/또는 불용성 또는 가용성 형태의 스트론튬, 및/또는 스트론튬을 함유하거나 또는 함유하지 않을 수 있는 무기 미립자, 및/또는 섬유소 가소제를 포함하는, 골 치유 및 골 재생에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다. 트롬빈 또는 무기 미립자의 함량의 변경은, 적용 또는 표적 조직에 의해 결정되는 대로 겔화 기간의 조절을 허용한다. 섬유소 가소제 또는 개질제는 제제의 기계적 특성을 향상시키거나 또는 응고 시간을 더욱 지연시키기 위해 사용할 수 있다. 가소제의 예는 요오드 함유 조영제, 예를 들어 디아트리조에이트, 요오데콜, 요오딕사놀, 요오프라톨, 요오굴라미드, 요오헥솔, 요오메프롤, 요오파미돌, 요오프로미드, 요오트롤, 요오베르솔, 요오자굴레이트, 및 메트리자미드, 및 이들의 혼 합물, 및 다가 알콜을 포함한다.
조성물은 겔화 단계 이전 또는 겔화 단계 동안에 액체로서, 또는 예비형성된 겔로서 최소 침습 기술을 사용하여 조직 결손부에 투여될 수 있다. 제제는 치유 과정 동안 재흡수되고 조직으로 대체되는 것을 목적으로 한다.
섬유소원 용액은 5 내지 200 mg/ml 범위, 바람직하게는 50 내지 100 mg/ml 범위의 섬유소원을 갖는 수용액이다. 섬유소원 용액은 또한 세포외 바탕질 단백질(예를 들어 섬유결합소, 세포 관련 단백질, 기타 혈장 유래 단백질(예: 혈액 응고 인고 XIII 및 단백분해효소))을 포함할 수 있다. 섬유소원 용액은 섬유소 단량체, 유도체 및 섬유소 I을 또한 포함할 수 있다.
트롬빈 성분은 스트론튬 화합물 뿐 아니라 당업계에 공지된 부가적인 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 사용되는 트롬빈의 양에 대해서는 특별히 제한이 없다. 본 발명의 한 실시예에서, 상기 트롬빈 성분 (b) 중의 트롬빈의 양은 최종 응고된 조성물에서 약 1 IU/ml 이상 내지 30 IU/ml 이하가 되도록 한다.
트롬빈을 대신하여 또는 트롬빈과 함께, 본 발명은 성분 (a)로서 다른 겔화 유도제 또는 응고 유도제, 예를 들어 프로타민, 뱀독, 트랜스글루타미나제, FXIIa, 생리학적으로 허용가능한 알칼리성 완충계를 포함할 수 있다.
트롬빈 완충액은 다른 물질들 중에 2가 양이온을 함유하는 수용액이다. 완충액 중의 2가 양이온의 농도는 5 내지 50 mM의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 2가 양이온은 칼슘 및 스트론튬의 군으로부터 선택되며, 비율은 0:1 내지 0.975:0.025일 수 있다. 2가 스트론튬 이온은 스트론튬 클로라이드의 형태, 또는 임의의 다른 수용성 스트론튬 염, 예를 들어 스트론튬 라넬레이트, 스트론튬 글루타메이트, 스트론튬 아스파레이트, 스트론튬 말로네이트, 스트론튬 말레에이트, 스트론튬 아스코르베이트, 스트론튬 트레오네이트, 스트론튬 락테이트, 스트론튬 피루베이트, 스트론튬 알파-케토글루타레이트, 또는 스트론튬 숙시네이트의 형태로 첨가될 수 있다. 트롬빈 완충액은 또한 스트론튬의 새로 확인된 분자 표적에 대한 코-리간드를 함유할 수도 있다(G-단백질-결합 수용체 칼슘-민감성 수용체 [Pi et al., J. Biol . Chem . 2005). 코-리간드는 칼시미메틱, 오스테오칼신, 및 아미노산의 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, L-아르기닌, 아르기노미메틱, 또는 아르기닌 유사체이다. 스트론튬 함유 트롬빈 완충액은 또한 스트론튬 함유 무기 입자와 함께 사용될 수 있다.
미립자 성분은 나노 내지 3,000 ㎛ 미만의 범위의 입자 크기 직경을 가지며, 적용 시점에서 불용성이어야 한다. 바람직하게는, 입자 크기는 100 나노미터 내지 50 밀리미터, 보다 바람직하게는 0.5 mm 내지 50 mm이다. 입자는 적용 시점에서 불용성인 임의의 스트론튬 킬레이트, 또는 역시 적용 시점에서 불용성인 스트론튬 치환 칼슘 염일 수 있다. 치환을 위한 칼슘 염은 칼슘 포스페이트, 트리칼슘 포스페이트, 알파-트리칼슘 포스페이트, 베타-트리칼슘 포스페이트, 칼슘 포스페이트의 다형체, 히드록시애퍼타이트, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 술페이트, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 입자의 칼슘에 대한 스트론튬 치환은 0.25 내지 100％의 범위일 수 있다. 최종 겔을 얻기 위한 혼합은 18 내지 37℃의 온도 범위에 걸쳐, 바람직하게는 37℃에서 달성될 수 있다.
섬유소원 용액은 5 내지 200 mg/ml 범위, 바람직하게는 50 내지 100 mg/ml 범위의 섬유소원을 갖는 수용액이다. 섬유소원 용액은 또한 섬유소 단량체, 유도체, 및 섬유소 I을 포함할 수 있다. 섬유소원 용액은 또한 세포외 바탕질 단백질, 예를 들어 섬유결합소, 세포 관련 단백질, 및 다른 혈장 유래 단백질, 예를 들어 혈액 응고 인자 XIII (FXIII) 및 단백분해효소를 포함할 수 있다.
트롬빈 용액은 최종 응고된 (또는 겔화된) 조성물에서 0.1 IU/ml의 최소 최종 농도를 갖는 수용액이다. 이 용액은 또한 완충될 수 있고, 아미노산, 단백질, 또는 첨가제(예를 들어, L-아르기닌, 만니톨, 및 알부민)를 함유한다.
트롬빈 완충액은 다른 물질들 중에 2가 양이온을 함유하는 수용액이다. 완충액 중의 2가 양이온의 농도는 5 내지 50 mM의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 2가 양이온은 칼슘 및 스트론튬의 군으로부터 선택될 수 있다(몰비는 칼슘:스트론튬 = 1:0 내지 0.975:0.025일 수 있음).
입자는 적용 시점에서 불용성인 임의의 스트론튬 킬레이트, 또는 역시 적용 시점에서 불용성인 스트론튬 치환된 칼슘 염일 수 있다. 치환을 위한 칼슘 염은 칼슘 포스페이트, 트리칼슘 포스페이트, 알파-트리칼슘 포스페이트, 베타-트리칼슘 포스페이트, 칼슘 포스페이트의 다형체, 히드록시애퍼타이트, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 술페이트, 및 이들의 조합일 수 있다. 입자의 스트론튬 치환은 치환된 입자의 비율로서 0.25 내지 100％의 범위일 수 있다.
조성물 중의 입자 함량은 응고성 단백질의 2 내지 100％, 바람직하게는 30 내지 50％(중량/부피) 범위이다. 미립자 성분은 적용상 필요에 따라 서브-마이크 로미터 내지 3,000 ㎛ 미만 범위의 입자 크기 직경을 갖는다. 최종 겔을 얻기 위한 균질화는 18 내지 37℃의 온도 범위에 걸쳐, 바람직하게는 37℃에서 달성될 수 있다.
골 복구를 보조하는 본 발명의 조성물의 효능은 생물활성 분자를 도입함으로써 더욱 향상될 수 있다. 생물활성 분자는 바탕질에 화학적으로 부착되거나, 미립자 성분상에 흡착되거나, 또는 자유 분자로서 또는 약물 분말로서 섬유소 바탕질 내에 갇힐 수 있다. 이들 분자는 골 대사(동화대사 및/또는 이화대사)를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 것으로 확인된 분자는 골 형태발생 단백질(BMP), 부갑상선 호르몬(PTH), 칼시토닌, 비스포스포네이트, 표피 성장 인자, 인슐린양 성장 인자, 및 TGF 상과(super family) 성장 인자를 포함한다. 적합한 분자는 또한 골 동화대사/이화대사와 무관하지만 골 복구/재형성과 병행하여 발생하는 생리학적 과정에 관련된 다른 인자, 예컨대 혈관형성 자극 인자를 포함할 수 있다(혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 혈소판 유도 성장 인자(PDGF)도 포함될 수 있음). 이것은, 스트론튬의 작용 방식이 동화작용제 1,25(OH)2 비타민 D 및 부갑상선과는 독립적인 것으로 여겨지므로 특히 흥미롭다.
가소제는 제제의 기계적 특성을 향상시키거나 또는 응고 시간을 더욱 지연시키기 위해 섬유소 또는 트롬빈과 함께 혼합될 수 있다. 가소제의 예는 수용성 요오드 함유 조영제, 폴리에틸렌 글리콜, 다가 알콜, 예를 들어 글리세롤, 단량류, 이당류, 삼당류 및 다당류, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택 된다. 적합한 요오드 함유 조영 매질은 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제20050119746호(리드그렌(Lidgren) 및 닐슨(Nilson), 2004)에 상술되어 있으며, 그의 예는 디아트리조에이트(메글루민), 요오데콜, 요오딕사놀, 요오프라톨, 요오굴라미드, 요오헥솔, 요오메프롤, 요오파미돌, 요오프로미드, 요오트롤, 요오베르솔, 요오자글레이트, 및 메트리자미드이다. 특히 조영제는 비이온성이고, 낮은 몰랄 삼투압 농도를 가지며, 섬유소 조립의 발생을 허용하고, 예를 들어 요오딕사놀이다.
본 발명의 조성물은 유용한 골 치유 방법 및 그러한 방법에 사용하기 위한 키트에 사용될 수 있다. 조성물을 특히 장골에서의 골 성장 또는 치유의 촉진에 사용하는 것이 고려될 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 트롬빈, 섬유소, 및 스트론튬을 함유하는 골 복구 조성물에 관한 것이다. 조성물 중의 스트론튬의 존재는 스트론튬을 함유하지 않는 그러한 조성물에 비해 향상된 골 치유 및/또는 골 생성으로 이어진다.
본 발명의 조성물은 대퇴골, 경골, 상완골, 요골, 척골 등과 같은 장골의 복구 및 재생에 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물을 사용하여, 결손부를 갖는 골에 기계적, 건축적 및 구조적 능력을 복구하거나 또는 부분적으로 복구하는 한편, 골 치유 및 재생을 관장하는 생물학적 과정을 위한 적당한 기질로서 기능할 수 있는 구조적 표면 영역을 제공하는 것이 가능할 것이다.
실시예에서 나타나는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 골 복구에 관계된 세포 적 및 생물학적 과정을 가속화한다.
이후 사용되는 "장골"이라는 용어는 직경보다 2배 이상 더 긴 길이를 갖는 골을 가리킨다. 전형적으로, "장골"이라는 용어는 팔다리의 골, 즉, 경골, 비골, 대퇴골, 상완골, 요골, 척골, 손목뼈, 손허리뼈, 손가락뼈, 발목뼈, 발허리뼈를 가리킨다. 보다 구체적으로, 본원에 사용되는 "장골"이라는 용어는 팔다리의 4개의 주요 골, 즉, 경골, 대퇴골, 상완골, 및 요골을 가리킨다.
본 발명의 조성물의 사용에 의해 치료될 수 있는 "골 결손부"는 공극, 공동, 입체형태적 불연속, 골절, 또는 손상, 절골술, 수술, 골절, 기형 치유, 불유합 골절, 골격 변형, 노화 또는 질병에 의해 생성된 임의의 구조적 변화를 포함하나 이에 한정되지는 않는 임의의 골 이상일 수 있다. 본 발명의 조성물은 상당한 치유 능력을 제공한다. 해면골이 예를 들어 골다공증, 무혈관 괴사, 또는 암 때문에 병든 경우, 주위의 피질골은 압축 골절 또는 붕괴를 일으키기가 보다 쉬워진다. 이것은 해면골이 더 이상 주위의 피질골에 대한 내부 지지를 제공하지 않기 때문이다. 본 발명의 조성물은 골다공증, 골괴사, 또는 무혈관 괴사 뿐 아니라, 감염된 골, 불량하게 치유된 골, 또는 심한 외상에 의해 골절된 골을 포함한 다른 골 질병과 같은 상태에 있는 골을 강화하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 결손부를 갖는 골을 복구하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 골 또는 그의 일부를 고정하기 위한 기계적 고정 장치, 및 본 발명의 조성물을 포함한다. 고정 장치의 예는 플랜지(flange), 막대, 바, 와이어, 스테이플, 스크류, 봉합사 뿐 아니라 다양한 석고붕대(cast), 슬리브(sleeve) 등(이들은 전형적으로 외부 고정 장치임)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 따라서, 본 발명의 키트는 바람직하게는 외부 기계적 고정 장치를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서는, 골 결손부, 예컨대 골절, 공동, 공극 등을 본 발명의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 상기 골 결손부의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 결손부를 본 발명의 조성물과 접촉시키는 단계 이전에 또는 이후에 골 또는 골의 일부를 기계적으로 고정하는 것을 포함할 수 있다.
유리하게도, 본 발명의 조성물은 골(뼈) 결손부 또는 공극 내로 또는 지주골조직의 골수강 내로 투여되어 일시적으로 골수를 대체하고/거나 새로운 골의 형성을 보조하는 주입형 조성물로서 사용될 수 있다. 조성물은 지주골조직 또는 임의의 다른 골 조직 내에 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 주입될 수 있다. 그러한 기술 및 그러한 기술을 수행하기 위한 장치의 예는 예를 들어 특히 미국 특허 출원 공개 제20080065091호, 미국 특허 출원 공개 제20080058828호, 미국 특허 출원 공개 제20070073307호, 미국 특허 제4,969,888호 및 제5,108,404호(이들 각 특허 문헌은 본원에 참조로 포함됨)에 논의되어 있다. 전형적으로, 가정용 코킹 건(caulking gun)과 유사한 주입 장치가 조성물을 골 내에 주입하는데 사용된다. 전형적인 골 시멘트 주입 장치는 권총형 몸체를 가지며, 이것이 골 시멘트를 함유하는 카트리지를 지지한다. 방아쇠가 스프링 장치된 램(ram)을 작동시키고, 이것이 일정 부피의 점성 상태의 골 시멘트를 적합한 노즐을 통해 치료의 표적이 되는 골의 내부로 밀어넣는다. 미국 특허 제4,969,888호 및 제5,108,404호의 교시에 따르면, 먼저 해면골을 골 내측으로 압착함으로써 공동이 생성될 수 있으며, 그 안으로 골 시멘트가 주입된다.
본 발명의 주입형 조성물 내로의 Sr의 도입의 추가 이점은 그것이 스트론튬의 방사선 비투과제로서 공지된 특성으로 인해 투시검사와 같은 기술을 사용한 투여 및 치유 과정의 모니터링을 허용한다는 것이다. 이와 같이, 본 발명의 조성물에 Sr을 사용하는 것은 치료적 및 진단적 기능을 모두 제공하며, 단지 영상화 기능만을 제공하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 주입형 겔, 주입형 페이스트, 페이스트, 퍼티, 또는 재수화가능한 동결건조 형태의 형태로 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "겔"이라는 용어는 젤리 같이 농후하고 부드러운 부분적으로 액상인 물질을 가리킨다. 본 발명의 겔은 적어도 13 게이지 주사기 바늘을 통해 압출될 수 있다. 본원에 사용되는 "페이스트"라는 용어는 액체와 고체 사이의 컨시스턴시(consistency)를 가지는 부드럽고 습윤된 물질을 가리킨다. 본 발명의 페이스트는 퍼티보다는 덜 고상이며, 겔보다는 더 고상이고, 일부 실시양태에서는 주입가능할 수 있다.
"퍼티"라는 용어는 본 발명의 반죽같은/점토같은 조직 복구 조성물을 가리킨다. 적용시에, 이 물질은 반죽의 컨시스턴시로 두들기거나 주물러서 이식 부위의 모양과 매우 닮은 모양으로 성형할 수 있다.
"주입형"이라는 용어는 본 발명이 가압하에(주사기를 사용한 도입에서와 같이) 이식 부위에 도입될 수 있는 능력을 가리킨다. 본 발명의 주입형 조성물은 예를 들어 생체내 요소들의 사이로 또는 한정된 공간 내로(즉, 특히 뼛조각 사이 또 는 인공 기구와 뼈 사이에) 도입될 수 있다.
"주사기"라는 용어는, 특히 특정 겔 및 페이스트를 비롯한 본 발명의 유동성 조직 복구 조성물을 주입하거나 빼내기 위해 사용될 수 있는 임의의 장치를 가리킨다.
조성물은 대상의 피질골 또는 지주골 내로 주입된다(바람직하게는, 대상은 인간, 원숭이, 양, 소, 말, 돼지 대상임). 본원에 사용되는 "피질골"이라는 용어는 골수강을 둘러싸는 골간의 치밀한 골을 가리킨다. 피질골은 콜라겐 섬유의 삼중 나선으로 구성되고 히드록시애퍼타이트로 강화된 매우 치밀한 구조이다. 피질골은 복합 구조이며, 인체의 장골의 하중을 견디는 주요 성분이다. 히드록시 애퍼타이트 성분은 골의 높은 압축 강도의 원인이 되며, 콜라겐 섬유 성분은 부분적으로 비틀림 및 인장 강도에 기여한다. 본 발명의 조성물은 그러한 골 부분 내로 도입되어 이로운 골 치유 또는 골 증가 효과를 부여할 수 있다.
지주골은 피질골과 유사한 조성을 가지며, "해면골"의 주요 구조 성분이고, 성인 장골의 골간의 층판골과 다르게 조직된 무기질화된 규칙적으로 정돈된 평행 콜라겐 섬유들로 구성된 성인 골을 가리킨다. 해면골은 일반적으로 피질골로 둘러싸인 장골의 말단에서 발견된다. 해면골은 격자 구조를 형성하는 침골을 가지며, 틈새기에 골수가 채워져 있다. 이것은 또한 지주골 또는 스폰지골이라고도 부를 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 지주골 내로 투여된다.
본 발명의 골 고정 방법은 또한 골 고정 또는 본 발명의 조성물과의 접촉 전에 결손부를 재성형하는 단계를 포함할 수도 있다. 그러한 재성형 또는 골 재정렬 은 예를 들어 드릴 또는 그라인더, 또는 결손부의 재성형에 활용가능한 임의의 다른 장치로 수행할 수 있다.
골을 고정하는데 사용되는 장치는 복구하려는 결손부의 종류 및 골의 종류 및 배치에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 고정 장치는 외부 고정 장치이다. 바람직하게는, 예를 들어 석고붕대 같은 외부 고정 장치는 본 발명의 방법에서 본 발명의 조성물의 주입과 함께 사용할 수 있는 유일한 고정 장치이다. 그러나, 일부 환경에서는, 내부 고정 장치를 사용하는 보다 침습적인 수술 절차를 사용하는 것이 필요할 수도 있다.
복구는 모니터링될 수 있으며, 적당한 때에 골의 고정에 사용된 장치를 제거할 수 있다. 결손 부위에서의 골 재생은 수술 직후 및 수술 후 소정의 시간 간격으로 찍은 연질 조직 X선(7.5 mA; 0.5초)에 의해 평가할 수 있다. 시험 동물에서의 골 재생은 또한 실험 종료 후에 일반적 형태, 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔(65~80 kV; 20초), 및 3차원(3-D) CT 스캔(Marconi, M.times.8,000)의 평가에 의해 측정할 수도 있다. 조직학 연구를 수행하여 조직의 골 염색을 측정할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 조성물은 골 복구에 사용될 수 있는 세포, 예를 들어 골 조상 세포와 배합될 수도 있다. 골 조상 세포는 당업계에 공지된 바와 같이 골 형성 세포로서 규정되는 골수 간질 세포의 골원성 특정생물형군(subpopulation)을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 사용되는 골 조상 세포는 골원성 골 형성 세포 그 자체 및/또는 골 조상 세포를 형성하는 배아 줄기 세포를 포함할 수 있다. 골 조상 세포는 공지된 절차를 사용하여 단리할 수 있다. 그러한 세포는 바람직하게 는 오토로지컬 소스(autological source)의 것이며, 예를 들어 인간 배아 줄기 세포, 뮤린 또는 인간 골 조상 세포, 뮤린 또는 인간 골 조상 골수 유래 세포, 뮤린 또는 인간 골 조상 배아 유래 세포, 및 뮤린 또는 인간 배아 세포를 포함한다. 이들 세포는 로빈슨(Robinson) 및 네보(Nevo)에 의해 기술된 바와 같이(2001년), 성장 인자를 분비하는 세포로서 추가로 기능할 수 있으며, 이는 상기 정의되었다.
본 발명의 조성물은 또한 골 성장 촉진제, 골 조상 세포, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 다양한 활성 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 하나 이상의 약물, 예를 들어 비타민, 항생제, 항염증제 등을 포함할 수 있다.
특정 바람직한 실시양태에서, 당업계의 숙련자에게 공지된 기술을 사용하여 스트론튬을 칼슘 함유 염에 도입하여 스트론튬 치환된 칼슘 화합물을 제조한다. 또한, 스트론튬은 조직 복구에 통상적으로 사용되는 생물활성 유리에 도입될 수도 있다. "생물활성 유리"라는 용어는 생물활성의 특징을 보이는 임의의 유리이며, 전형적으로 고유적으로는 접착성이 아니며 적당한 생체내 및 시험관내 환경, 예를 들어 인공 체액 또는 트리스-히드록시메틸아미노메탄 완충액에 노출시에 경질 및 연질 조직 둘 다와 점착성 결합을 형성할 수 있는 무정형 고체이다. 점착성 결합은 벌크 생물유리 물질로부터의 이온종의 방출을 통해 생물활성 유리상에 히드록시카르보네이트 애퍼타이트의 표층이 형성됨으로써 달성된다. 외과 및 정형외과 치료 뿐 아니라 치외과의 분야에서 생물활성 유리의 다양한 적용 분야가 있으며, 이것은 예를 들어 유럽 특허 제1,405,647호 및 유럽 특허 출원 제1,655,042호 뿐 아니라 국제 공개 WO 96/21628, WO 91/17777, WO 91/12032 및 미국 특허 출원 공개 제20080066495호(각각 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 스트론튬-함유 화합물을 트롬빈 희석 완충액 중의 2가 이온으로서 사용한다. 트롬빈 용액은 희석 완충액을 사용하여 제조한다. 섬유소원 용액 및 스트론튬 함유 트롬빈 용액을 혼합하여 겔을 형성한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 스트론튬-함유 화합물을 염 입자로서 제제에 첨가한다. 트롬빈 용액 및 입자를 혼합하여 개질된 트롬빈 용액을 제조한다. 섬유소원 용액 및 개질된 트롬빈 용액을 혼합하여 겔을 형성한다.
실시예 I: 완충액 용액에 용해된 스트론튬 함유 화합물
일련의 완충액을 2중증류수에 제조하였다. 이들 완충액에서, 트롬빈 완충액 중의 2가 양이온은 Ca 또는 Ca+Sr 혼합물이었으며, 양이온 농도가 40 mM로 일정하게 유지되도록 하였다(스트론튬 클로라이드에 대해서 하기 표 참조). 트롬빈을 트롬빈 완충액 중에 4IU의 농도로 희석하였다.
CaCl2 40 mM CaCl2 30 mM CaCl2 20 mM CaCl2 10 mM CaCl2 0 mM
SrCl2 0 mM SrCl2 10 mM SrCl2 20 mM SrCl2 30 mM SrCl2 40 mM
이어서, 섬유소원을 트롬빈과 1:1 비율로 혼합하였다(따라서, 겔화된 응괴 중의 스트론튬 농도는 반감하였다). 이를 위해, 트롬빈 용액 2 ml를 5 ml 주사기에 옮길 수 있다. 섬유소원 2 ml(티씰(Tisseel), 백스터(Baxter), 응고성 단백질[섬유소원 및 섬유결합소] 72~110 mg/ml)을 별도의 5 ml 주사기에 옮겼다. 섬유소원 및 트롬빈을 함유하는 주사기들을 배합을 위해 임의의 공지된 혼합기에 연결할 수 있다.
시험관내 실험을 위해, 섬유소원 용액 150 ㎕를 24 웰 플레이트의 웰에 피펫팅하여 응괴를 제조하였다. 플레이트를 플레이트 진탕기상에 두어 웰 바닥 전체에 고른 분포를 보장하였다. 이어서, 트롬빈 용액 150 ㎕을 웰에 첨가하고, 플레이트를 플레이트 진탕기상에 두어 균질 응괴를 보장하였다. 인간 골모세포양 세포주(SaOS-2)를 응괴에서 7일까지 배양하여 세포 증식/세포 분화에서 어떤 변화가 관찰되는지를 보았다. 도 1은 스트론튬 클로라이드(SrCl2)를 트롬빈 희석 완충액에 첨가했을 때 증식에 대한 결과(알라마르 블루(Alamar Blue))를 보여준다. 유사한 결과를 스트론튬 아세테이트(StAc)에 대해서 얻을 수 있다.
알라마르 블루 분석은 대사 분석이며, 증식 측정에 종종 사용된다. 스트론튬의 첨가는 이들 응괴에서, 20 mM CaCl2을 갖는 정상 응괴에 비해 현저히 증가된 증식을 유발하였다. DNA 염색을 사용하여 증식을 정량화한 경우에도 유사한 결과가 관찰되었다(도 2). 7일 후, 칼슘 스트론튬 혼합물 또는 스트론튬 단독을 함유하는 응괴에서 성장한 세포들 사이에 명확한 차이를 관찰할 수 있었다. 따라서, 본 발명자들은 스트론튬이 골모세포양 SaOS-2 세포의 증식에 대해 긍정적인 효과를 갖는 것으로 결론지었다.
이들 초기 실험은 세포 증식에서의 차이를 보기 위해 설계된 것이었으며, 골모세포 분화를 조사하기에 충분한 시간을 제공하지는 않았다. 효소 알칼리성 인산분해효소는 분화의 조기 지시약이지만, 약 10~14일까지는 수준이 실제로 정점에 오르지는 않는다. 예비 결과는 스트론튬을 함유하는 응괴에서 알칼리성 인산분해효 소 발현의 증가를 보여주었다(도 3). 스트론튬 아세테이트의 경우, 이 값은 유의하지 않은 것으로 나타났다. 이러한 실험을 14일 조사 기간으로 반복하였다.
세포 연구 관찰 외에, 스트론튬의 결과로서 응괴 구조가 변경되었는지를 조사하기 위해 혼탁도 측정 분석을 실시하였다(도 4). 응괴 혼탁도는 섬유의 평균 단면적에 직접 비례하므로, 응괴가 혼탁할수록 섬유 직경은 크다.
도 4의 혼탁도 측정 데이터는 칼슘 함유 응괴와 비교한 스트론튬 함유 응괴의 동력학 및 흡광도의 차이가 매우 적음을 보여준다. 이것은 칼슘과 스트론튬이 유사한 결합 부위, 특히 FXIII 결합 부위를 점유할 수 있다는 관찰에 의해 설명될 수 있다.
초기 실험에 있어서, 세포를 응괴의 표면상에 시딩(seeding)하였다. 이러한 시딩법을 선택한 이유 중 하나는 일부 세포종은 응괴 내부에 시딩하면 대부분 세포 사멸을 겪게 되고, 세포가 응괴 표면으로 이주하기 때문이다. 이 효과에 대한 한 가지 가능한 설명은 골모세포양 세포를 CaCl2가 보강된 배지에서 배양할 경우에 설명될 수 있다. 도 5는 12.5 mM CaCl2의 존재하에 조직 배양 플라스틱상에서의 SaOS-2 세포 배양의 결과를 보여준다. 세포 사멸(MTS 분석으로 측정함)은 칼슘 클로라이드의 존재하에 배양된 세포에서 발생하였다. 이것은 세포 배양의 최초 24시간 이내에 발생하였다. 대조적으로, 스트론튬 함유 화합물의 존재하에 배양된 세포의 증식은 단지 경미한 감소만이 있었다. 일부 세포, 즉 섬유모세포 및 각질세포는 고칼슘 요건을 가지므로, 응괴의 칼슘 농도에 의해 영향을 받지 않을 것임을 지적하는 것이 중요하다.
실시예 2: 섬유소/스트론튬 도핑된 칼슘 포스페이트 나노입자
트롬빈을 트롬빈 완충액 중에서 4IU의 농도로 희석하였다. 섬유소원을 트롬빈과 1:1 비율로 혼합하였다. 이를 위해, 트롬빈 2 ml을 5 ml 주사기에 옮길 수 있다. 섬유소원 2 ml(티쎌, 백스터, 응고성 단백질[섬유소원 및 섬유결합소] 72~110 mg/ml)을 별도의 5 ml 주사기에 옮겼다. 입자(1 ㎛ 미만의 나노입자)를 최종 응괴 부피에 대한 백분율 중량(w/v)으로서 도입하였다. 이것을 칭량하고 또 다른 5 ml 주사기에 넣었다.
입자 및 트롬빈을 함유하는 주사기들을 류어(Luer) 어댑터를 통해 연결하고, 트롬빈 및 입자를 주사기에서 주사기로 내용물을 전달함으로써 균질화하였다. 트롬빈/입자 및 섬유소원을 함유하는 주사기들을 류어 어댑터를 통해 연결하고 내용물을 균질화하였다. 물질은 약 30초 동안 액상으로 유지되었으며, 이 시간 동안 결손부에 주입될 수 있었다.
시험관내 실험을 위해, 섬유소원 용액 150 ㎕을 24 웰 플레이트의 웰에 피펫팅하여 응괴를 제조하였다. 입자(1 ㎛ 미만의 나노입자)를 최종 응괴 부피에 대한 백분율 중량(w/v)으로서 첨가하였다. 플레이트를 플레이트 진탕기상에 두어 웰 바닥 전체에 고른 분포를 보장하였다. 이어서, 트롬빈 용액 150 ㎕을 웰에 첨가하고, 플레이트를 플레이트 진탕기상에 두어 균질 응괴를 보장하였다. 예비 연구에서, 인간 골모세포양 세포주(SaOS-2 또는 NHOst)를 응괴에서 14일까지 배양하여 세포 증식, 세포 분화에서 어떤 변화가 관찰되는지를 보았다.
입자 함유 응괴에 시딩된 세포에 대한 정성 분석은, 정상 섬유소 응괴와 비교할 때, 양호한 생체적합성을 나타내었다(도 6). 정량화되지는 않았지만, 입자가 없는 섬유소 응괴의 세포들은 형태에 있어서 보다 모여 있는 반면, 입자 함유 응괴의 세포들은 보다 퍼져 있었다. 이에 대한 추가의 증거는 응괴의 횡단면에서 볼 수 있다(도 7). 이를 위해, 세포를 응괴 내에 시딩하였다. 며칠 후, 섬유소 응괴 내의 세포가 응괴의 표면으로 이주되어 있었다. 이에 비해, 입자 함유 응괴 내의 세포는 응괴 내에 머물렀고, 넓게 퍼져서 바람직한 형태를 나타내었다.
실시예 3: 토끼 대퇴 돌기 결손 모델에서의 스트론튬 도핑된 히드록시애퍼타이트의 사용
상술한 연구는 스트론튬이 골 형성을 촉진하는 동시에 골 재흡수를 억제한다는 것을 시사한다. 앞의 연구는 골모세포양 세포 및 1차 골모세포에 대한 SrCl2의 효과를 조사하였다. 척추 증강에 사용될 수 있는 제제를 확인하려는 시도의 과정에서, 스트론튬으로 도핑된 개질 히드록실 애퍼타이트를 토끼 대퇴 돌기 결손부에 사용하여 스트론튬의 골 형성 촉진 능력을 평가하였다. 칼슘 히드록실 애퍼타이트는 칼슘 니트레이트와 암모늄 포스페이트를 높은 pH 값(암모늄 히드록시드로 조정함)에서 함께 교반함으로써 실험실에서 제조할 수 있다. 생성된 침전물을 원심분리하고 세척하고 건조시키고 하소시켜 히드록실 애퍼타이트 유사 물질을 얻을 수 있다. 칼슘 니트레이트와 스트론튬 니트레이트를 각각의 치환 백분율로 배합함으로써, 섬유소과 함께 골 결손부에 주입될 수 있는 스트론튬-칼슘 히드록실 애퍼타 이트 유사 입자를 제조하는 것이 가능하였다.
이 실시예는 스트론튬 치환된 칼슘 히드록실 애퍼타이트 유사 입자가 섬유소 단독 또는 순수 칼슘 히드록실 애퍼타이트 유사 입자보다 새로운 골 형성을 보다 우수하게 촉진하는 것을 나타내는 데이터를 보여주었다. 이러한 결과는 예비 세포 배양 동안에 얻어진 데이터의 생체내 확증을 제공한다.
재료 및 방법:
이 실시예에 기술된 연구에 하기 화학 시약을 사용하였다. 칼슘 니트레이트 사수화물; 99％ A.C.S.시약[시그마-알드리치(Sigma-Aldrich); 237124-500G; FW 236.15]; 스트론튬 니트레이트 p.A.>99％ [플루카(Fluka); 85899 500g; 로트 및 필링 코드: 1086321, 53706181; FW: 211.63]; 암모늄 포스페이트 이상(biphasic) p.A. [리델-데 핸(Riedel-de Haen); 30402 500g; FW 132.06]; 암모늄 히드록시드 [시그마-알드리치, 318612-2L; 배치#: 11103PD; FW:35.05; H2O 중 5N]; EtOH 96％; 피브린클레버(Fibrinkleber) [백스터 아게(Baxter AG); 피브린클레버 TIM 3; 08P6004H; 5 ml; 1500434]; 트롬빈 [백스터 아게; B205553 thromb. SD TIM 5; 500IE; US 5 ml]; 칼슘 클로라이드 이수화물 (최소 99％) [시그마; C7902-1KG; 배치#:044K0160]; 및 염화나트륨 [머크(Merck), 1.06404.1000 1kg; 차지/로트: K38062004 745; FW: 58.44].
이 실험에는 다음과 같은 다양한 용액을 사용하였다: 40 mM CaCl2 + 200 mM NaCl; 250 ml ddH2O 중 2.92 g NaCl + 1.47 CaCl2; 40 mM CaCl2 + 200 mM NaCl 5 ml 중에 재구성된 동결건조 트롬빈; 및 3000 KIE/ml 아프로티닌 5 ml 중에 재구성된 동결건조 섬유소원.
실험은 하기와 같이 4개의 시험군에 대해 각각 6마리 토끼의 무릎에 대해 수행하였다:
1군: 섬유소 + 트롬빈 (8IU/ml 최종 농도)
2군: 섬유소 + 트롬빈 (8IU/ml 최종 농도) + 100％ Ca (0％ Sr 치환)
3군: 섬유소 + 트롬빈 (8IU/ml 최종 농도) + 75％ Ca (25％ Sr 치환)
4군: 섬유소 + 트롬빈 (8IU/ml 최종 농도) + 20％ Ca (80％ Sr 치환)
시험 재료의 준비:
섬유소원을 재구성하고, 1 ml 주사기[Braun; omifix - 1 ml; Luer]에 주사기마다 섬유소원 0.5 ml를 분취하였다. 트롬빈을 재구성하고, 40 mM CaCl2 + 200 mM NaCl로 16 IU/ml로 희석하였다. 이것을 또한 1 ml 주사기에 주사기마다 0.5 ml를 분취하였다.
동일 부피의 2M 칼슘 니트레이트 용액(또는 스트론튬 치환 백분율에 따라서는 스트론튬 니트레이트도 포함, 생성된 용액은 총 2M이어야 함) 및 1.2M 암모늄 포스페이트 용액을 함께 교반하여 히드록실 애퍼타이트 분말을 제조하였다. 암모늄 포스페이트를 칼슘 니트레이트에 첨가하자, 페이스트형 물질이 침전되었다. 동일 부피의 암모늄 히드록시드의 후속 첨가는 침전물의 pH를 11로 상승시켰고 페이스트형 침전물을 액체가 되게 하였다. 철저한 교반 후, 혼합물을 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 침전물을 알콜(에탄올 96％)로 2회, ddH2O로 1회 세척하였다. 세척 단계 사이에서는 항상 침전물을 깨끗이 세척하고 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 그 후에, 침전물을 60℃, 진공에서 1일 동안 건조시킨 후 분쇄하고 1시간 동안 1100℃에서 하소시켰다.
냉각 후 히드록실 애퍼타이트 유사 입자를 가열 멸균하고 1 ml 주사기에 주사기마다 0.3 g을 분취하였다.
토끼의 치료
주 실험을 수행하기 위해 12 마리의 토끼를 사용하였다. 토끼들을 진정제로 진정시킨 후, 대퇴 돌기에 드릴로 보어 구멍(bore hole)(직경 4.5 mm)을 만들었다. 이 드릴 구멍을, 입자를 갖는 트롬빈 성분을 분사한 후 섬유소원을 분사하거나, 또는 대조군으로서 트롬빈만을 섬유소원과 함께 분사함으로써, 시험 재료 중의 하나로 각각 채웠다. 1 ml 주사기의 원추는, 직접 적용이 가능하도록 드릴 구멍에 완벽히 들어맞았다.
각 재료의 주입 후(24개의 무릎에 대해 무작위로 함)에 피부를 봉합하고, 이 토끼들을 이후 8주 동안 모니터링하였다.
수술 후 분석
8주 후, 토끼들을 안락사시키고, 무릎을 μCT로 분석하고, 박편을 조직학적으로 염색하였다.
결과
μCT 분석: 스트론튬 샘플의 높은 불투명도로 인해, 정량적 결과를 얻는 것이 어려웠으므로, μCT 사진을 육안으로 평가하고 그를 정량화함으로써 반정량적으로 분석을 실시하였다. 골 형성의 평가는 3개의 수준으로 수행하였다(1: 저; 2: 중; 3: 고). 막힌 드릴 구멍의 평가는, 막힌 드릴 구멍에 대해 "+"를, 막히지 않은 드릴 구멍에 대해 "-"를 부여함으로써 실시하였다. 데이터를 도 8 내지 14의 그래프에 나타내었다. 모든 그래프는 평가가능한 치료된 동물의 평균이며, μCT 사진은 스냅 사진이다.
도 8은 완전히 막힌 드릴 구멍(양쪽이 막힘)의 그래프를 나타낸다. 평가된 섬유소로 채워진 토끼 돌기 결손부 중 어느 것도 양쪽이 막히지 않았으므로, 완전히 막힌 드릴 구멍 경계가 0％임을 도 8에서 볼 수 있다. 입자 중 25％ Sr의 치환은 막힌 드릴 구멍 경계가 80％의 최댓값을 나타내었다.
도 9는 섬유소 존재하에 토끼 대퇴 돌기의 μCT이다. 결손부를 여전히 볼 수 있으나 잔류 물질(섬유소)은 전혀 보이지 않으며, 드릴 구멍의 한쪽은 여전히 열려 있다.
스트론튬의 첨가는 뚜렷한 효과를 발생시킨다. 도 11은 80％ Sr 재료에서 토끼 대퇴 돌기의 μCT를 보여준다. 결손부를 여전히 볼 수 있으나, 결손부의 대부분이 채워져 있으며, 재료(Sr 80％)가 강하게 보인다. 새로운 골 형성이 명확히 식별가능하며, 드릴 구멍의 양쪽이 막혀 있다.
상기 결과는 또한 조직학 연구를 사용하여 확인되었다. 도 12는 조직학적 염색처리된 섬유소로 치료된 토끼 대퇴 돌기 결손부의 박편을 보여준다. 시험 물 질은 존재하지 않는다. 따라서, 염증의 징후는 발견되지 않았다. 단지 소수의 짧은 해면골 지주가 드릴 구멍의 내부에서 발견된다. 버 커널(bur canal)의 개구에서, 새로 형성된 골 물질은 해면 형상이다. 혈관은 드릴 공동 내부에 거의 규칙적으로 분포되어 있으며, 단지 소수의 덜 혈관화된 지점이 나타났다. 다수의 보다 큰 혈관이 드릴 공동의 한쪽에서 골 물질에 매우 근접하여 있다.
섬유소 응괴 중 80％ 스트론튬으로 치료된 샘플에서는(도 13), 드릴 관의 40~70％가 시험 물질로 채워졌다. 시험 물질은 모든 샘플에서 드릴 공동 내부에서 기다란 모양을 가졌다. 한 샘플에서는 보다 과립상이지만, 다른 2개는 보다 불규칙한(coarse) 물질을 나타내었다. 3개의 샘플 중 2개에서, 섬유소는 시험 물질에 가까운 큰 패치로서 존재하였다. 염증은 한 샘플에서는 거의 없었고, 다른 시편들에서는 3 내지 10개의 큰 염증이 있었다. 한 샘플에서, 시험 물질은 새로 구축된 골 조직에 직접 접촉된 상태였으나, 다른 2개에서는 보다 멀리 위치하였다. 2개의 샘플은 드릴 공동 내부에 혈관이 규칙적으로 분포되어 있었으나, 세번째 것에서는 혈관화가 보다 군집화되어 있었다.
논의
μCT 데이터는 Sr 25％ 치환 히드록실 애퍼타이트 유사 입자를 함유하는 제제가 다른 시험된 물질보다 양호하게 드릴 구멍의 폐쇄를 촉발하고, 덜 치밀하지만 80％ 치환 입자와 유사한 골 형성을 유도함을 보여준다.
섬유소 단독은 보다 적은 골 형성을 촉발하며, 드릴 구멍이 단지 한쪽에서만 막혔다. 순수 칼슘 히드록실 애퍼타이트 유사 입자를 함유하는 제제는 그렇게 치 밀하지 않았으나, 골 형성을 유도하거나 드릴 구멍의 폐쇄를 유도하지 않은 것으로 보인다.
높은 스트론튬 농도의 제제는 매우 치밀하며, 새로운 골 형성을 유도하지만, Sr 25％보다 현저히 높지는 않았다. 또한, 드릴 구멍 폐쇄는 낮은 농도의 스트론튬에 비해 나빴으므로, 낮은 농도의 스트론튬도 골 형성을 유도하기에는 충분하다.
조직학 결과는 칼슘 히드록실 애퍼타이트 유사 입자 중의 스트론튬의 치환은 새로운 골의 형성을 유도함을 시사한다. 골모세포의 이주 및 그에 따른 새로운 골 형성의 필요조건인 혈관화가 모든 샘플에서 감지되었다.
실시예 4: 스트론튬은 골모세포 세포에 대해 PTH 와 상승효과를 가진다
본 실시예는 부갑상선 호르몬(PTH)과 스트론튬(SrCl2로서 사용됨)의 조합이 골모세포에서 증가된 cAMP 생산과 같은 골 형성 인자의 활성화에 대해 효과가 있는지를 조사하기 위한 랫트 골육종 세포에 대한 시험관내 연구를 기술한다. 여기에 기술된 연구는 SrCl2가 골모세포 세포에서의 cAMP의 생성에 있어서 PTH와 긍정적인 상승효과를 가짐을 보여준다. 그러한 효과는 CaCl2로 치료된 세포에서는 관찰되지 않았다. cAMP는 동화작용성 골 형성을 유도하는 것으로 알려져 있으므로, 여기에서 제시되는 데이터는 Sr과 PTH의 조합 요법이 생체내 골 형성의 증가로 이어진다는 결론을 뒷받침한다.
재료 및 방법
골육종 세포주 UMR-106 (뉴랩 바이오퀄러티 아게(NewLab Bioquality AG), 독 일 에르크라트)을 사용하여 생물학적 분석을 수행하였다.
하기 분석은 다음 배지를 사용하였다:
세포 배양 배지: DMEM (시그마, D6546; 4500 mg/l 글루코스, Na-피루베이트, Na2CO3 포함; 0.584 g/l L-글루타민이 보강됨); 10％ FCS; 2 mM L-Glu.
스타베이션 ( starvation ) 배지: DMEM (시그마, D6546; 4500 mg/l 글루코스, Na-피루베이트, Na2CO3 포함; 0.584 g/l L-글루타민이 보강됨); 2 mM L-Glu.
SI 배지: 10 ml 스타베이션 배지; 2 mM IBMX
스타베이션 배지 중 20 mM SrCl 2 : 19.6 ml 배지 0.4 ml 1M SrCl2
스타베이션 배지 중 20 mM CaCl 2 : 19.6 ml 배지 0.4 ml 1M CaCl2
세포 배양
UMR-106 세포를 성장 배지에 30,000 세포/㎠의 밀도로 시딩하고 37℃/8.0％ CO2에서 인큐베이션하였다. 24시간 후, 배지를 새로운 배지, 20 mM SrCl2를 함유하는 배지, 또는 20 mM CaCl2를 함유하는 배지로 교환하였다. 세포를 37℃/8.0％ CO2에서 24시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 하기 절차에 따라 세포를 수집하였다:
세포를 HBSS로 2회 세척하고 6 ml 트립신/EDTA을 실온에서 3분 동안 사용하여 표면으로부터 탈리시켰다. 트립신 소화를 12 ml 성장 배지로 중단시켰다. 원심분리(3분, 1,000 rpm, RT) 후에, 세포를 12 ml의 스타베이션 배지에 재현탁시키 고, CASY 세포 계수 장치로 계수하였다. 사멸 세포의 비율은 매 실험시 10％ 미만이었다. 세포를 스타베이션 배지 중에서 1.6 × 106 세포/ml의 최종 농도로 재현탁시켰다. 50 ㎕의 세포 현탁액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 옮기고 37℃/8.0％ CO2에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
섬유소원 용액 중 264 ㎍/ ml TGplPTH 샘플을 이용한 세포의 치료
샘플들을 새로 제조한 2 mM IBMX를 함유하는 스타베이션 배지(SI 배지)에 희석시켰다. SI-배지의 제조를 위해 DMSO 중 0.67M IBMX 원액 30 ㎕를 스타베이션 배지 10 ml에 첨가하였다.
모든 샘플 희석액은 UMR-106 세포 중의 포스포디에스테라제 활성을 억제하기 위해 이 배지로 제조하였다[Janik, P., 1980; Chasin M. and Harris, D.N., 1976]. 희석된 샘플 50 ㎕(결과에 나타낸 바와 같음)를 37℃에서 30분 인큐베이션한 후에 세포에 첨가하였다. cAMP 생산을 위해, 세포를 37℃/8.0％ CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각 샘플 농축액을 2개조의 cAMP 분석 후에 적어도 2개조로 세포에 첨가하였다.
cAMP 바이오트랙( Biotrak ) 효소 면역 분석
cAMP EIA 를 위한 시약 제조. 분석 완충액, 용해(lysis) 시약 1A/1B, 용해 시약 2A/2B, cAMP 표준물, 항혈청, cAMP 과산화효소 접합체, 및 세척 완충액을 제조업자의 매뉴얼(cAMP 바이오트랙 EIA 키트, 지이 헬쓰케어(GE Healthcare))에 따라 제조하였다. 53 ml H2SO4 (농도 = 18.76M)을 947 ml ddH2O로 희석하여 1M 황산 정지액을 제조하였다.
세포 용해 및 cAMP 의 희석. cAMP의 추출을 위해, PTH를 함유하는 세포 현탁액 100 ㎕를 cAMP 바이오트랙 EIA 키트(지이 헬쓰케어)의 일부인 용해 시약 용매 1A 25 ㎕(최종 희석 1:5)와 함께 인큐베이션하였다. 전체 용해를 위해, 세포를 실온에서 500 rpm으로 15분 동안 진탕하였다. 추출된 cAMP를 최종적으로 용해 시약 1B(cAMP 바이오트랙 EIA 키트)로 1:20으로 희석하였다 (분석 플레이트에서 1:1로 희석(125 ㎕의 용해 시약 1B를 첨가)한 후 ELISA 플레이트상에서 1:10으로 희석(90 ㎕의 용해 시약 1B + 10 ㎕의 희석 세포 현탁액)하였음).
cAMP 작업 표준물의 제조. 비-아세틸화 분석을 위한 동결건조 cAMP 표준물(cAMP 바이오트랙 EIA 키트)을 분석 완충액에 용해시켜 32 pmol/ml의 농도를 얻었다. 32 pmol/ml 내지 0.5 pmol/ml 범위에서 연속 2배 희석액을 제조하였다.
내부 대조물 . 각 표준물 및 샘플 희석액 100 ㎕을 적당한 웰에 옮기고 2개조로 분석하였다. 또한, 2개의 상이한 내부 대조물인 비특이적 결합(NSB) 대조물 및 제로 대조물(0)이 cAMP ELISA의 특이성을 나타내기 위해 필요하였고 제조업자(지이 헬쓰케어)에 의해 권장된 대로 수행하였다.
효소 면역 분석 절차. 항혈청 100 ㎕를 NSB 대조물을 제외한 모든 웰에 첨가하였다. 항체 반응을 4℃에서 진탕하면서 2시간 동안 수행하였다. 50 ㎕의 cAMP 과산화효소 접합체와 함께 진탕하면서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 모든 웰을 세척 완충액 300 ㎕로 4회 세척하였다. 마지막으로, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 150 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 기질 반응을 실온에서 10분 동안 허 용하였다. 1M H2SO4 100 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시키고, 플레이트 판독기에서 450 nm에서 광학 밀도를 즉시 측정하였다.
데이터 분석. 광학 밀도는, 소프트웨어 KC4를 사용하여 450 nm에서 샘플의 흡광도를 측정함으로써 플레이트 판독기(시너지(Synergy) HT)에서 결정하였다. 백그라운드 보정, 평균 값, 표준편차, 변동계수의 계산, 및 표준 곡선의 생성은 마이크로소프트 엑셀 2000에서 수행하였다. 시그마플롯(Sigmaplot) 9.0을 4-파라미터-피트 및 EC50 계산에 사용하였다. PLA1.2(스테그만 시스템베라퉁(Stegmann Systemberatung))을 평행선 분석(Parallel Line Analysis) 및 상대 효능(Relative Potency)의 검출에 사용하였다.
결합된 cAMP 과산화효소 접합체의 백분율. 각 표준물 및 샘플의 결합된 cAMP 과산화효소 접합체의 백분율은 하기 관계식을 이용하여 계산하였다:
Figure 112009071245529-pct00001
표준 곡선. cAMP 표준 곡선은 B/B0 백분율(y축)을 log c(cAMP)(x축)의 함수로서 플로팅하여 생성하였다.
샘플의 cAMP 농도. 희석 비율(20×)을 고려하여, 생성된 cAMP의 양을 표준 곡선의 파라미터(기울기 및 절편)를 이용하여 계산하였다.
직선성 . cAMP ELISA의 표준 곡선의 상관계수(R2 ≥ 0.95)를 평가하였다.
생물학적 분석을 위한 샘플의 제조. 분석을 위해, 샘플을 2 mM 포스포디에스테라제 억제제 IBMX를 함유하는 스타베이션 배지(SI-배지) 내에 2400 nM TGplPTH (13.2 ㎍/ml TGplPTH)의 최종 농도로 희석하였다. 모든 샘플에서, 하기 8개의 연속 희석액을 제조하고, 50 ㎕를 직접 세포에 첨가하였다(세포에 대한 총 부피: 100 ㎕). 모든 샘플 및 모든 희석액에 대해, OD450, 표준편차, cAMP 농도, 및 변동계수의 평균치를 계산하였다.
c(TGplPTH) nM 제조 c(TGplPTH) ㎍/ml
2400 nM (세포에 대해 1200 nM) 상기 참조 13.2
1200 nM (세포에 대해 600 nM) 희석 배지 중 1:1 6.6
600 nM (세포에 대해 300 nM) 희석 배지 중 1:1 3.3
300 nM (세포에 대해 150 nM) 희석 배지 중 1:1 1.65
150 nM (세포에 대해 75 nM) 희석 배지 중 1:1 0.83
75 nM (세포에 대해 38 nM) 희석 배지 중 1:1 0.42
38 nM (세포에 대해 19 nM) 희석 배지 중 1:1 0.21
19 nM (세포에 대해 10 nM) 희석 배지 중 1:1 0.1
연속 희석의 표. 투여량 반응 곡선의 생성을 위해, 7개의 1:1 연속 희석 단계를 각 샘플에 대해 수행하였고, 모든 희석액을 3중으로 분석하였다.
결과
PTH 생물활성에 대한 SrCl2 및 CaCl2의 영향을 5개의 상이한 실험에 대해 독립적으로 모니터링하였다(도 14). 이들 연구는 TGplPTH 처리 전에 20 mM SrCl2와 함께 UMR-106 세포를 24시간 예비-인큐베이션한 것은 2배의 생물활성 증가로 이어진 반면, CaCl2는 PTH 생물활성의 변화를 나타내지 않음을 보여주었다(도 14). 이 러한 결과는 스트론튬 및 PTH가 cAMP 생산에 대해 상승효과를 가짐을 나타내며, PTH와 스트론튬의 조합이 생체내 동화작용성 골 형성으로 이어질 것이라는 결론을 뒷받침한다.

Claims (39)

  1. 섬유소원, 트롬빈, 및 스트론튬-함유 화합물을 포함하며, 상기 스트론튬-함유 화합물은 입자로 존재하고, 상기 입자는 섬유소원과 트롬빈 합의 30 내지 50％(중량/부피)로 조성물 중에 존재하는, (i) 골 공극, (ii) 골 공동, (iii) 골에서의 입체형태적 불연속, (iv) 골절, 또는 (v) 손상, 절골술, 골 수술, 불유합 골절을 비롯한 골절, 골의 기형 치유, 골격 변형, 노화 또는 골 질병에 의해 발생하는 임의의 구조적 변화의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 겔, 퍼티(putty), 페이스트, 또는 액체 형태인 의약 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가소제를 추가로 포함하는 의약 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 가소제가 요오드-함유 화합물인 의약 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 요오드-함유 화합물이 디아트리조에이트, 요오데콜, 요오딕사놀, 요오프라톨, 요오굴라미드, 요오헥솔, 요오메프롤, 요오파미돌, 요오프로미드, 요오트롤, 요오베르솔, 요오자굴레이트, 및 메트리자미드, 및 이들의 혼합물, 및 다가 알콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 의약 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 겔화 단계 이전에 액체로서, 겔화 단계 동안에 액체, 페이스트 또는 겔로서, 또는 예비형성된 겔, 페이스트 또는 퍼티로서 조직 결손부(defect)에 투여될 수 있는 의약 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포외 바탕질 단백질(extracellular matrix protein), 세포 관련 단백질, 혈장 유래 단백질, 단백분해효소 및 단백분해효소 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포외 단백질을 함유하는 의약 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 치유 과정 동안 재흡수되고 조직으로 대체되는 의약 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 응고 유도제를 추가로 포함하는 의약 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 스트론튬-함유 화합물이 가용성 마이크로미립자, 과립 형태, 또는 고체 형태인 의약 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 스트론튬-함유 화합물이 스트론튬을 칼슘-함유 화합물에 첨가하여 칼슘 및 스트론튬 함유 염을 포함하는 물질을 생성함으로써 제조되는 의약 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 칼슘-함유 화합물이 칼슘 포스페이트인 의약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 칼슘 포스페이트가 트리칼슘 포스페이트, 알파-트리칼슘 포스페이트, 베타-트리칼슘 포스페이트, 칼슘 포스페이트의 다형체(polymorph), 히드록시애퍼타이트, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 술페이트, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 의약 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 스트론튬-함유 또는 칼슘-함유 화합물이 100 나노미터 내지 1 ㎛ 범위의 입자 치수를 갖는 의약 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 스트론튬-함유 또는 칼슘-함유 화합물이 0.5 내지 5 밀리미터의 입자 치수를 갖는 의약 조성물.
  16. 제11항에 있어서, 조성물 중의 칼슘 염에 대한 스트론튬 염의 백분율이, 0.25％ 내지 100％(몰 기준) 스트론튬-함유 염 범위인 의약 조성물.
  17. 제10항에 있어서, 스트론튬-함유 화합물이 스트론튬을 생물활성 유리(bioactive glass)에 첨가하여 스트론튬-함유 생물활성 유리 재료를 생성함으로써 제조되는 의약 조성물.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 스트론튬-함유 화합물이 스트론튬 클로라이드, 스트론튬 라넬레이트, 스트론튬 아세테이트, 스트론튬 글루타메이트, 스트론튬 아스파르테이트, 스트론튬 말로네이트, 스트론튬 말레에이트, 스트론튬 아스코르베이트, 스트론튬 트레오네이트, 스트론튬 락테이트, 스트론튬 포스페이트, 스트론튬 애퍼타이트, 스트론튬 피루베이트, 스트론튬 알파-케토글루타레이트, 및 스트론튬 숙시네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 의약 조성물.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 칼시미메틱(calcimimetic), 오스테오칼신(osteocalcin), 아미노산, 아르기노미메틱(arginomimetic) 및 아르기닌 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 스트론튬 코-리간드(co-ligand)를 추가로 포함하는 의약 조성물.
  20. 제3항에 있어서, 가소제가 i) 폴리에틸렌 글리콜, ii) 다가 알콜, iii) 글리세롤, 또는 iv) 단당류, 이당류, 삼당류, 다당류, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 당인 의약 조성물.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서, 골 형태발생 단백질, 부갑상선 호르몬(PTH), 칼시토닌, 비스포스포네이트, 표피 성장 인자, 인슐린양 성장 인자, 및 TGF 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 추가로 포함하는 의약 조성물.
  22. 제1항에 있어서, 섬유소원, 트롬빈, 및 스트론튬-함유 화합물을 포함하는 성분들의 혼합시에 겔화가 일어나는 의약 조성물.
  23. 제1항, 제2항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 주입형(injectable) 조성물인 의약 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 살아 있는 대상의 해면골을 치료하기 위한 의약 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 조성물을 상기 대상의 해면골 내에 주입하는 것이 스트론튬을 함유하지 않는 조성물의 적용시에 관찰되는 것보다 더 빠른 치유 속도를 유발하는 의약 조성물.
  26. 제1항, 제2항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 골 또는 골의 일부를 기계적으로 고정시키고; (b) 결손부를 이 결손부의 복구의 유발에 효과적인 양의 조성물로 채우는 것에 의해 결손부를 갖는 골을 복구하기 위한 의약 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 조성물의 적용이 상기 조성물의 적용의 부재시에 관찰되는 것보다 더 빠른 치유 속도를 유발하는 의약 조성물.
  28. 제26항에 있어서, 상기 조성물의 적용이 스트론튬을 함유하지 않는 조성물의 적용시에 관찰되는 것보다 더 빠른 치유 속도를 유발하는 의약 조성물.
  29. 제25항에 있어서, 상기 골이 대퇴골, 경골, 상완골, 및 요골로 이루어진 군으로부터 선택된 장골인 의약 조성물.
  30. 제1항, 제2항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 골 결손부를 조성물과 접촉시키는 것에 의해 골 결손부에서의 새로운 골 성장을 촉진하기 위한 의약 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 골 성장의 속도가, 스트론튬을 함유하지 않는 조성물의 존재하에서 나타나는 골 성장에 비해, 상기 조성물 중의 스트론튬의 존재시에 더 빠른 의약 조성물.
  32. 제1항에 있어서, 스트론튬-함유 화합물이 적용 시점에서 조성물 중에 2.5 mM 내지 25 mM의 농도로 존재하고, 상기 스트론튬-함유 화합물은 수용성 스트론튬 염의 2가 스트론튬 이온을 포함하는 의약 조성물.
  33. 제1항에 있어서, 스트론튬-함유 화합물이 스트론튬 킬레이트 또는 스트론튬 치환 칼슘 염을 포함하고, 입자는 적용 시점에서 트롬빈 용액에 불용성인 의약 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 입자가 입자 중 25％(몰 기준) 스트론튬 치환 입자를 포함하는 의약 조성물.
  35. 제1항에 있어서, 일정량의 부갑상선 호르몬(PTH)을 추가로 포함하는 의약 조성물.
  36. 제1항에 있어서, 조영제를 추가로 포함하는 의약 조성물.
  37. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물이 섬유 결합소 또는 혈액 응고 인자 XIII을 포함하는 의약 조성물.
  38. 제9항에 있어서, 응고 유도제가 프로타민, 뱀독, 트랜스글루타미나제, FXIIa, 또는 생리학적으로 허용가능한 알칼리성 완충제를 포함하는 의약 조성물.
  39. 제19항에 있어서, 스트론튬 코-리간드가 L-아르기닌을 포함하는 의약 조성물.
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