CN101668549A

CN101668549A - 包含锶化合物的纤维蛋白组合物

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Publication number: CN101668549A
Application number: CN200880013518A
Authority: CN
Inventors: 约翰·J·巴里; 安德烈亚斯·格斯尔; 杰拉尔德·西默
Original assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc
Current assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc
Priority date: 2007-04-23
Filing date: 2008-04-18
Publication date: 2010-03-10
Anticipated expiration: 2028-04-18
Also published as: BRPI0811035B8; AR066245A1; KR101520114B1; US20080260714A1; BRPI0811035A2; JP2010525070A; EP2823829B1; CL2008001171A1; JP6012551B2; ES2573327T3; WO2008131154A2; CN103785058A; EP2142224B1; IL201480A0; CA2686820A1; CN103785058B; KR20100017158A; TWI556842B; JP2013216678A; CA2686820C

Abstract

本发明一般地涉及用于骨愈合和骨再生的组合物，其为粘弹性水凝胶凝胶或液体制剂形式，其包含纤维蛋白原、凝血酶和无机组分，所述无机组分包括含锶(Sr)化合物和/或可能包括另一种金属诸如含钙的化合物。含锶化合物可以结晶粒子形式被溶于凝血酶溶液中或被加入到凝结中。当混合各组分时，发生胶凝，从而形成基质。该组合物还可包含用作增塑剂的含碘化合物。

Description

包含锶化合物的纤维蛋白组合物

本专利申请要求被并入本文作为参考的2007年4月23日提交的美国临时专利申请No.60/925,716的优先权。

技术领域

本发明一般地涉及用于骨愈合和骨再生的组合物，特别地涉及粘弹性水凝胶凝胶或液体制剂，其包含纤维蛋白原、凝血酶和无机组分，所述无机组分包括含锶(Sr)的化合物和/或可能包括另一种金属诸如钙。含锶化合物可以结晶粒子形式被溶于凝血酶溶液中或被加入到组合物中。当混合各组分时，发生胶凝，从而形成基质。

背景技术

目前在骨愈合和再生中的实践是对骨空隙填充骨移植物(自体移植物或同种异体移植物)、骨水泥诸如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或可注射型或可移植型的钙盐空隙填充剂。自体移植物是用于这一应用的“金标准”，但是存在与供体组织受限、创伤、感染和罹病有关的问题。同种异体移植物存在许多问题，包括疾病传播和产生免疫性的风险。自体移植物和同种异体移植物二者都由于二次重建而表现出生物学性质或机械性质丧失。正是这些限制使得在骨移植物的可供选择的材料方面迅速产生兴趣(Parikh SN.2002；J.Postgrad.Med.48：142-148)。

PMMA是不可再吸收的聚合物材料。在其聚合期间，未反应的单体、催化剂和低分子量低聚物被截留在该聚合物中。这些化学品具有从所述材料浸出的可能性，导致局部的细胞毒性和免疫学应答。PMMA聚合是高度放热的，可能引起热坏死。这一放热还限制了PMMA被并入任何药理学试剂或化疗剂的能力。PMMA从缺损处渗漏可以导致非常严重的并发症，包括邻近结构受压(要求进一步手术)和/或栓塞。

处于纳米水平(10^-9m)的骨基质由其中包埋有微小的钙盐结晶的胶原纤维组成。为了模拟骨的天然组成，钙盐经常被用于骨的修复。有许多已知的基于钙盐的“可注射型空隙填充剂”。与钙盐骨水泥有关的一个主要并发症是它们要求在体内固化，这通常通过化学反应来实现。因此，有可能损害被并入到该填充剂中的生物学物质诸如细胞和药理学试剂。另外，如果填充剂“流动性”太强，则其可从缺损处泄漏到邻接空间内，导致结构受压并可能发生栓塞。从与关节邻近的缺损处的渗漏可能削弱关节的功能。

钙磷酸(CP)盐羟基磷灰石(HA结构Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)最接近于骨的矿物相并且可在实验室中容易地被合成。还可能制备其中其它的阳离子(例如镁、钠和锶)或阴离子(氯离子、氟离子和碳酸根)被置换进入结晶中的HA。与本发明有关的是，用锶(Sr²⁺)离子置换CP结晶中的钙(Ca²⁺)离子。锶和钙二者都属于碱土元素，并且彼此相似，因为体内超过99％的总的钙和锶集中于骨内。锶是唯一被鉴定的与骨强度具有积极关系的元素，即，骨的机械强度随着锶含量的增加而增加。锶的可能的治疗效果已被知晓有一段时间了。然而，在文献中暗示了这一治疗可能性由于常态稳定的Sr²⁺(⁸⁴Sr、⁸⁶Sr、⁸⁷Sr和⁸⁸Sr)及其放射性同位素(⁸⁵Sr、⁸⁶mSr、⁸⁷Sr和⁸⁸Sr)的混乱而被忽视。Dahl等人，Bone；28(4)，第446-453页。最近，锶的治疗效果已经突显，并且有研究显示了锶盐在体外(甚至在低剂量下)和体内刺激骨形成并抑制骨吸收，这通过在啮齿类和骨质疏松患者中的骨组织形态计量学进行评价得到。Ferraro等人，1983；Calcif Tissue Int.35：258-60。

锶的强大的同化代谢和抗吸收效果已经导致开发新型的抗骨质疏松药物。口服活性药物(活性成分雷奈酸锶)已显示降低椎骨骨折的风险并增加骨的矿物密度。Meunier PJ等人，2004；N Engl J Med.350(5)：459-68。该药物由与两个锶原子结合的一分子雷奈酸组成。雷奈酸基团被选择作为载体是因为其在胃肠道中被充分耐受。在内脏中，锶离子从雷奈酸基团中被释放，导致锶被内脏粘膜所吸收。当被吸收时，锶对骨组织表现出强的亲合性，并且被并入羟基磷灰石的最外层的水合层中。更小的量与骨结晶成为一体，其中锶∶钙原子的比不超过1∶10，从而使得结晶的形成和物理化学性质都不由于锶的存在而发生改变。雷奈酸锶被提议是使骨形成与骨吸收相脱离的首选药物治疗。在体外，雷奈酸锶增加胶原蛋白和非胶原蛋白的蛋白质合成，增强前成骨细胞分化，抑制破骨细胞分化，降低破骨细胞作用和增加破骨细胞的细胞程序死亡。在动物模型中，骨密度的增加与生物力学骨强度的增加密切相关。在大鼠模型中，雷奈酸锶增加骨质量并改善微体系结构和骨几何学，导致骨抗性增加。在切除卵巢的大鼠(用于骨质疏松症的模型)中，雷奈酸锶降低骨吸收，但是保持高度的骨形成。骨强度的所有的决定因素都受到雷奈酸锶治疗的积极影响(骨质量，大小，微体系结构，和固有的骨组织质量)。骨机械性质增加的特征为最大负荷增加，而且断裂能显著改善，这基本上是由于可塑能(plastic energy)增加所致。Kendler，2006；Curr.Osteopor.Rep.4(1)：34-9；Marie，2006；Curr.Opin.Rheum.18 Suppll：S11-5；Ammann，2006，Bone.38(2 Suppl1)：15-8。尽管不完全了解锶的作用方式，但是成骨作用的增加被认为与在1,25(OH)2维生素D的循环水平中或在甲状旁腺激素效果中的改变无关。在许多绝经后女性中，锶已经显示出在所有部位具有抗骨折效力。Close等人，2006；Expert Opin Pharmacother 7(12)：1603-15。

局部施用含锶骨水泥形式的锶还被其它研究人员所考察：Wong，Chi-Tak，2004，″Osteoconduction and osseointegration of astrontium-containing hydroxyapatite bioactive bone cement：in vitro and invivo investigations.Publisher：University of Hong Kong″(Pokfulam Road，Hong Kong)；Zhao等人，2004；J Biomed Mater Res B Appl Biomater.69(1)：79-86。非吸收性Sr-HA骨水泥主要由含锶羟基磷灰石(Sr-HA)填充剂和双酚A二缩水甘油基醚二甲基丙烯酸酯(BIS-GMA)树脂组成。有人提出该材料可被用于椎骨成型术，因为其可以通过注射被递送并且比PMMA具有更好的物理/机械性质。含锶羟基磷灰石(Sr-HA)骨水泥在体外和体内都被证明具有生物活性。在体外，其似乎比非掺杂型羟基磷灰石(HA)骨水泥在细胞粘附(SaOS-2)和骨矿化方面更有效。在体内，Sr-HA骨水泥与天然骨结合。

在美国专利5,736,132和5,549,904中，其二者都作为参考被并入本文，据说补充有转谷酰胺酶的粘附性组织粘合剂优选包含处在约0.5mM到约100mM范围内的二价金属离子诸如钙和锶，pH为约7.0到约8.5。其要求保护补充有转谷酰胺酶的粘合剂，其可被用于在关节折断、软骨缺损、浅表软骨缺损、全厚缺损，骨软骨脱离，半月板撕破，韧带撕破，腱撕破，肌肉病变，肌-腱连接病变，软骨移植，骨移植，韧带移植，腱移植，软骨移植，软骨-骨移植，皮肤移植物固定和血管、膜片血管移植物和微血管血管吻合术中的组织的治疗。该专利的主要发明点在于在粘合剂中引入转谷酰胺酶。

相比之下，本发明并不引入转谷酰胺酶并且计划用于注射进骨缺损或空隙内，用于局部递送锶和帮助新骨的形成。文献数据显示了元素锶能刺激骨形成并同时抑制骨吸收。

发明概述

本发明提供了组合物，其可被注射进骨缺损或空隙内或进入小梁骨组织的骨髓隙内，在那里该组合物暂时代替骨髓，以帮助新骨的形成。有数据显示了元素锶能刺激骨形成并同时抑制骨吸收。

在一个方面，本发明提供了用于骨愈合和骨生长的组合物，其中该组合物包含纤维蛋白、凝血酶和含锶化合物。该组合物还可包含含钙化合物。优选地，该组合物是可注射型组合物，其为可注射型凝胶、可注射型灰泥(putty)、可注射型糊剂(paste)或可注射型液体的形式。

在其它实施方案中，该组合物可包含一种或多种增塑剂。在一些实施方案中，增塑剂是含碘化合物。用作本文中的增塑剂的示例性的含碘化合物包括但不限于选自以下的化合物：泛影酯、碘的可(iodecol)、碘克沙醇、碘拉醇、碘谷胺(iogulamide)、碘海醇、碘美普尔、碘帕醇、碘普胺、碘曲伦(iotrol)、碘佛醇、碘克沙酸(ioxagulate)和甲泛葡胺及其混合物，和多元醇。在其它的实施方案中，增塑剂是聚乙二醇，多元醇，甘油或选自单糖、二糖、三糖、多糖及其组合的糖。在其它的实施方案中，增塑效果通过调节低分子量化合物诸如特别是氯化钠和离液剂的组成来完成。

该组合物可为凝胶或液体形式。在某些方面，该组合物可作为液体或凝胶(在胶凝阶段之前或期间)被递送进入或作为预形成的凝胶被递送进入组织缺损内。

在本发明的其它方面，该组合物包含一种或多种选自以下的细胞外蛋白质：基质蛋白诸如粘连蛋白、细胞相关蛋白或血浆由来蛋白诸如凝血因子XIII和蛋白酶。

在其它的实施方案中，该组合物还可包含凝固诱导剂诸如鱼精蛋白，蛇毒，转谷氨酰胺酶，FXIIa或生理学可接受的碱性缓冲液系统。

在特定实施方案中，该组合物为使得该组合物在愈合过程期间被组织再吸收和替换。

在本发明组合物中使用的含锶化合物可为选自以下之一：氯化锶、雷奈酸锶、乙酸锶、谷氨酸锶、天冬氨酸锶、丙二酸锶、马来酸锶、抗坏血酸锶、苏糖酸锶、乳酸锶、磷酸锶、锶磷灰石、丙酮酸锶、α-酮戊二酸锶和琥珀酸锶。这些化合物仅仅是示例性的含锶化合物，并且其它的含锶化合物可容易地被用在本发明的组合物中。

该组合物可以是这样的组合物，其还包含选自以下的锶共配体：拟钙剂(calcimimetics)、骨钙蛋白、氨基酸诸如L-精氨酸以及精氨酸模拟物(arginomimetics)和精氨酸类似物。

在本文所述的组合物中，含锶化合物和/或含钙化合物可为(微)粒子或固体形式。在示例性的实施方案中，含锶或含钙(微)的粒子形式具有的粒径为100纳米到500微米。在其它实施方案中，含锶或含钙的组分可采取多孔性或非孔性的固体形式，其具有例如0.5到50毫米的大小。优选地，粒径为0.5到5毫米。

在特定实施方案中，含钙化合物是钙磷酸盐。钙磷酸盐可选自：磷酸三钙，α-磷酸三钙，β-磷酸三钙，磷酸钙的多晶型物，羟基磷灰石，碳酸钙，硫酸钙及其组合。

在某些实施方案中，涵盖了一些钙被锶所置换以提供钙盐和锶盐的混合物。

在特定实施方案中，锶盐∶钙盐的比或百分数为25％到100％。在某些实施方案中，本发明的组合物还可包含选自以下的蛋白质或其组合：骨形态发生蛋白，甲状旁腺激素(PTH)，降钙素，双膦酸盐，表皮生长因子，胰岛素样生长因子和TGF生长因子。可使用任何具有骨生长促进效果或骨增强效果的蛋白质。在其它实施方案中，含锶化合物通过将锶加入到生物活性玻璃中以产生含锶的生物活性玻璃材料被制得。

在某些其它的实施方案中，该组合物是其中当混合各种组分时组合物发生胶凝的组合物。

在优选的实施方案中，本发明的方法包括通过将包括本发明的含锶组合物的组合物注射进活受试者的松质骨内来治疗所述受试者的患病的、受损的或有缺陷的骨。有利地，这种组合物被注射进受试者的松质骨引起愈合速率比施用不含锶的类似组合物所观察到的愈合速率更快。

本文还涵盖了修复具有缺损的骨的方法，包括：(a)机械固定骨或其部分；和(b)用实现修复所述缺损的量的本发明的组合物填充所述缺损。在示例性的实施方案中，所述缺损是骨折并且所述修复是所述骨折的骨愈合。在本发明的特定方面，施用所述组合物引起愈合速率比不施用所述组合物所观察到的愈合速率更快。优选地，施用所述组合物引起愈合速率比施用不含锶的类似组合物所观察到的愈合速率更快。

本文还涵盖了在骨缺损部位处促进新骨生长的方法，包括使所述缺损部位接触本发明的组合物。优选地，所述骨生长的速率在所述组合物中存在锶的条件下比在存在不含锶的类似组合物的条件下所观察到的骨生长速率更快。

附图说明

图1表示在包含锶的凝固物上生长的人成骨细胞样细胞(SaOS-2)的细胞增殖。使用的符号是Ca/Sr。所述值是在最终凝固物中的浓度。为了在最终的凝固物中实现这些浓度，在缓冲液中的浓度加倍。

图2表示在包含锶的凝固物上生长的人成骨细胞样细胞(SaOS-2)的DNA试验。使用的符号是Ca/Sr。所述值是在缓冲液中的浓度。该值在最终的凝固物中减半。

图3表示在包含锶的凝固物上生长的人成骨细胞样细胞(SaOS-2)在30分钟内的碱性磷酸酶生成。所述值是在最终凝固物中的浓度。为了达到这一浓度，在缓冲液中的浓度加倍。

图4表示当凝血酶缓冲液由钙、钙/锶或单独的锶组成时凝固物的浊度分析。使用的符号是Ca/Sr。所述值是在缓冲液中的浓度。该值在最终的凝固物中减半。

图5表示在包含12.5mM Sr或Ca的介质中生长的凝固物的存活百分数(通过MTS增殖试验测得)。

图6表示在纤维蛋白凝固物上和在包含锶粒子的纤维蛋白凝固物上培养的NHOst细胞的染色。在纤维蛋白凝固物上培养14天(上方图)或在包含锶粒子的纤维蛋白凝固物上培养14天(下方图)的NHOst细胞的活染色(左方图)和死染色(右方图)。

图7表示与NHOst细胞一起培养的纤维蛋白凝固物的横截面。细胞染色绿色(活)和红色(死)。上方图是纤维蛋白凝固物。下方图是包含粒子的纤维蛋白凝固物。

图8显示了完全闭合的钻孔(两侧闭合)的图解表示法。

图9表示在材料中存在纤维蛋白的条件下的兔股骨髁的μCT。

图10表示骨形成的图解表示法(评价等级：1：低的骨形成；2：中等的骨形成；3：高的骨形成)。

图11表示使用80％Sr材料的兔股骨髁的μCT。

图12表示用纤维蛋白处理的兔股骨髁缺损的组织染色薄切片。

图13表示用含Sr 80％的纤维蛋白凝固物处理的兔股骨髁缺损的组织学污染薄切片。

图14表示SrCl₂对PTH生物活性的影响。

发明详述

本发明涉及凝血酶、纤维蛋白组合物和/或为不溶或可溶形式的锶和/或可包含锶或可不包含锶的无机粒子和/或纤维蛋白增塑剂。用于骨愈合和骨再生。凝血酶的量或无机粒子含量的改变，允许随着所述应用或靶组织的不同来控制胶凝时间。可使用纤维蛋白增塑剂或改性剂来增强制剂的机械性质或进一步延迟凝固时间。增塑剂的实例包括含碘造影剂，诸如泛影酯，碘的可，碘克沙醇，碘拉醇，碘谷胺，碘海醇，碘美普尔，碘帕醇，碘普胺，碘曲伦，碘佛醇，碘克沙酸和甲泛葡胺，及其混合物，和多元醇。

使用侵入性最低的技术，该组合物可在胶凝阶段之前或期间作为液体被递送进入或作为预形成的凝胶被递送进入组织缺损内。该制剂计划在愈合过程期间被组织再吸收和替换。

纤维蛋白原溶液是具有5-200毫克/毫升、优选50-100毫克/毫升的纤维蛋白原的含水溶液。纤维蛋白原溶液还可包括细胞外基质蛋白(例如粘连蛋白，细胞相关蛋白，其它血浆由来的蛋白质[例如凝血因子XIII和蛋白酶])。纤维蛋白原溶液还可包括纤维蛋白单体、衍生物和纤维蛋白I。

凝血酶组分还可包含本领域已知的另外的化合物以及锶化合物。关于凝血酶的使用量没有特别限制。在本发明的一个实施例中，凝血酶在所述凝血酶组分(b)中的量为使得其在最终凝固的组合物中以至少约1IU/ml到最高30IU/ml的量存在。

代替本发明的凝血酶或者除了本发明的凝血酶之外，用于组分(a)的其它的胶凝诱导剂或凝固诱导剂为诸如鱼精蛋白，蛇毒，转谷氨酰胺酶，FXIIa，生理学可接受的碱性缓冲液系统。

凝血酶缓冲液是包含与其它物质在一起的二价阳离子的含水溶液。在缓冲液中二价阳离子的浓度可以5-50mM。优选地，该二价阳离子选自钙和锶并且它们的比可为0∶1到0.975∶0.025。二价锶离子可以氯化锶形式或任何其它的水溶性锶盐诸如雷奈酸锶、谷氨酸、天冬氨酸锶、丙二酸锶、马来酸锶、抗坏血酸锶、苏糖酸锶、乳酸锶、丙酮酸锶、α-酮戊二酸锶或琥珀酸锶的形式被加入。凝血酶缓冲液还可包含用于新鉴定的锶的分子靶标的共配体(a G-protein-coupled receptorcalcium-sensing receptor，Pi等人，J.Biol.Chem.2005)。共配体选自拟钙剂、骨钙蛋白和氨基酸。优选，L-精氨酸、精氨酸模拟物或精氨酸类似物。含锶的凝血酶缓冲液还可与含锶的无机粒子组合使用。

粒子组分具有的粒径为纳米到小于3000微米的范围，并且当施用时应当不溶。优选地，粒径为100纳米到50毫米，更优选为0.5毫米到50毫米。粒子可以是任何的当施用时不溶的锶螯合物，或者是当施用时同样不溶的被锶置换的钙盐。用于置换的钙盐可选自磷酸钙，磷酸三钙，α-磷酸三钙，β-磷酸三钙，磷酸钙的多晶型物，羟基磷灰石，碳酸钙，硫酸钙及其组合。粒子的钙的锶置换可为0.25-100％。为获得最终凝胶进行的混合可以在18-37℃，优选37℃的温度下完成。

纤维蛋白原溶液是具有5-200毫克/毫升、优选50-100毫克/毫升的纤维蛋白原的含水溶液。纤维蛋白原溶液还可包括纤维蛋白单体、衍生物和纤维蛋白I。纤维蛋白原溶液还可包括细胞外基质蛋白，例如粘连蛋白，细胞相关蛋白，其它血浆由来的蛋白质诸如凝血因子XIII(FXIII)和蛋白酶。

凝血酶溶液是在最终的凝固(或胶凝)组合物中具有最终浓度最低为0.1IU/ml的含水溶液。该溶液还可经过缓冲并包含氨基酸、蛋白质或添加剂(例如L-精氨酸、甘露醇和白蛋白)。

凝血酶缓冲液是包含与其它物质在一起的二价阳离子的含水溶液。在缓冲液中二价阳离子的浓度可为5-50mM。优选地，二价阳离子选自钙和锶并且(钙∶锶)摩尔比为1∶0到0.975∶0.025。

粒子可以是任何的当施用时不溶的锶螯合物，或者是当施用时同样不溶的被锶置换的钙盐。用于置换的钙盐可选自磷酸钙，磷酸三钙，α-磷酸三钙，β-磷酸三钙，磷酸钙的多晶型物，羟基磷灰石，碳酸钙，硫酸钙及其组合。粒子的锶置换作为被置换的粒子的比可为0.25-100％。

组合物中粒子的含量为2-100％、优选30-50％(重量/体积)的可凝固蛋白质。粒子组分具有的粒径根据应用的需要为亚微米到小于3000微米的范围。为获得最终的凝胶进行的匀浆化可在18-37℃，优选37℃的温度完成。

本发明的组合物帮助骨修复的效力还可通过并入生物活性分子得以改善。这些生物活性分子作为游离分子或作为药物粉末，可被化学连接于基质上，被吸附到粒子组分上或被截留在纤维蛋白基质中。这些分子可用于刺激骨代谢(合成代谢和/或分解代谢)。已被鉴定的适当的分子包括骨形态发生蛋白(BMP)，甲状旁腺激素(PTH)，降钙素，双膦酸盐，表皮生长因子，胰岛素样生长因子和TGF超家族生长因子。适当的分子还可包括其它与骨合成代谢/分解代谢循环无关、但与骨修复/重建过程平行发生的生理学过程相关的因子，诸如还可并入血管生成刺激物(血管内皮细胞生长因子(VEGF)和血小板衍生生长因子[PDGF]。当锶的作用方式被认为与合成代谢剂1,25(OH)2维生素D和甲状旁腺分开时具有特别的意义。

增塑剂还可与纤维蛋白或凝血酶混合以增强制剂的机械性质或进一步延迟凝固时间。增塑剂的实例选自：水溶性的含碘造影剂，聚乙二醇，多元醇诸如甘油，单糖、二糖、三糖和多糖，及其任意组合。适当的含碘造影剂在美国专利申请US 20050119746(Lidgren和Nilson，2004)中被详述，该文献作为参考被并入本文，其实例是泛影酯(葡甲胺)，碘的可，碘克沙醇，碘拉醇，碘谷胺，碘海醇，碘美普尔，碘帕醇，碘普胺，碘曲伦，碘佛醇，碘克沙酸和甲泛葡胺。优选地，造影剂是非离子型的，具有低的重量克分子渗透压浓度，并且允许纤维蛋白发生组装，例如碘克沙醇。

本发明的组合物可用于骨愈合方法和这种方法中所使用的试剂盒。还考虑了所述组合物可用于促进骨生长或愈合，特别是长骨的生长或愈合。具体地说，本发明涉及包含凝血酶、纤维蛋白和锶的骨修复组合物。锶在组合物中的存在导致与不含锶的所述组合物相比，增强骨愈合和/或骨生成。

本发明的组合物可用于修复和再生长骨，诸如股骨、胫骨、肱骨、挠骨、尺骨等等。

使用本发明的组合物，有可能修复或部分地修复具有缺损的骨的机械、建筑和结构能力，同时提供结构面区域，该结构面区域可以充当用于操控骨愈合和再生的生物学过程的适当的基底。

如实施例所示，本发明的组合物加速了牵涉骨修复的细胞和生物过程。

在下文中使用的措词“长骨”是指具有一定长度的骨，其长度为直径的至少两倍。典型地，措词“长骨”是肢端骨，即，胫骨，腓骨，股骨，肱骨，挠骨，尺骨，腕骨，掌骨，指骨，跗骨和跖骨。更具体地说，本文使用的措词“长骨”是指四种主要的肢端骨，即，胫骨，股骨，肱骨和挠骨。

可通过采用本发明的组合物进行补救的“骨缺损”可为任何的骨异常，包括但不限于，由于伤害、切骨、手术、骨折、畸形愈合、不连性骨折、骨骼变形、老化或疾病所产生的空隙、空穴、构造中断、骨折或任何结构改变。本发明的组合物提供了重要的治疗潜力。当松质骨患病时，例如，因为骨质疏松症、无血管形成性坏死或癌而患病时，周围的皮层骨变得更倾向于发生压缩性骨折或塌陷性骨折。这是因为松质骨不再为周围的皮层骨提供内部支撑所导致。本发明的组合物可用于强化在诸如骨质疏松症、骨坏死或无血管形成性坏死以及其它的牵涉骨感染、骨愈合不充分或由于重症创伤而骨折的骨疾病中的骨。

本发明的另一个方面提供了用于修复具有缺损的骨的试剂盒。该试剂盒包括用于固定骨或其部分的机械固定装置和本发明的组合物。固定装置的实例包括但不限于，凸缘，棒条，狭条，丝线，钉，螺钉，缝线以及各种铸件、套筒等，其是典型的外部固定装置。因此，本发明的试剂盒优选包括外部机械固定装置。

本发明的另一个方面提供了治疗骨缺损诸如骨折、空穴、空隙等的方法，包括使它们接触本发明的组合物。在一些实施方案中，所述方法可包括在使缺损接触本发明的组合物的步骤之前或之后机械固定骨或其部分。

有利地，本发明的组合物可作为可注射型组合物使用，该组合物被递送进骨质(骨)缺损或空隙内或进入小梁骨组织的骨髓隙内，在那里所述组合物暂时代替骨髓和/或帮助新骨形成。所述组合物可采用本领域技术人员公知的技术被注射进小梁骨组织或任何其它的骨组织内。所述技术以及用于实施这种技术的示例性实例在例如美国专利公报20080065091、美国专利公报20080058828、美国专利公报20070073307、美国专利4,969,888和5,108,404中讨论(其每一个专利文献作为参考被并入本文)。典型地，使用类似于家用填缝枪的注射装置将组合物注射进骨内。典型的骨水泥注射装置具有手枪形主体，其支持包含骨水泥的药筒。触发器开动簧压式撞头，该撞头推动一定体积的、处在粘性条件下的骨水泥通过适当的喷嘴并进入作为治疗靶标的骨的内部。根据美国专利4,969,888和5,108,404的教导，可首先通过将骨内部的松质骨压实而形成空穴，再向该空穴中注射骨水泥。

将Sr并入本发明的可注射型组合物中的附加优点是其使得允许采用诸如荧光技术的技术监控递送和愈合过程，因为锶的已知的作为放射遮光剂的性质。因此，在本发明的组合物中使用Sr提供了治疗功能和诊断功能，而不仅仅提供单独的成像功能。

本发明的组合物可以可注射型凝胶、可注射型糊剂、糊剂、灰泥或可水合的冻干形式被使用。本文使用的术语“凝胶”是指胶状的、浓稠的、柔软的、部分液体性物质。本发明的凝胶可被挤出通过至少13量规的注射器针头。本申请中使用的“糊剂”是指柔软的、潮湿的、具有介于液体和固体之间的稠度的物质。本发明的糊剂的固体性低于灰泥的固体性，但是高于凝胶的固体性，并且在一些实施方案中可为可注射的。

术语“灰泥”是指面团状的/粘土样的本发明的组织修复组合物。在施用期间，所述物质可经过搅打或揉捏以达到面团的稠度，并被成型为与植入部位的形状密切相似的形状。

“可注射”是指在植入部位处在压力下可被引入(使用注射器被引入)的本发明的组合物的能力。本发明的可注射型组合物例如可被引入到体内的部件之间或进入有限的空间(即，特别地被引入到骨碎片之间或进入在假体装置和骨之间的接触面内)。

“注射器”是指任何可被用来注射或撤走本发明的可流动的组织修复组合物(特别地包括某些凝胶剂和糊剂在内)的装置。

所述组合物被诸如注射进受试者的皮层骨或小梁骨内(受试者优选是人，猿，羊，牛，马，猪受试者)。本申请使用的“皮层骨”是指骨的围绕髓腔的轴的密质骨。皮层骨是由被羟基磷灰石增强的三链螺旋胶原纤维组成的高致密结构。皮层骨是复合结构并且是人体中长骨的负担主要负荷的部分。羟基磷灰石组分是骨的高抗压强度的原因，同时胶原纤维组分部分地是扭转强度和抗张强度的原因。本发明的组合物可被引入到这种骨部分内以赋予有益的骨愈合或骨加强效果。

小梁骨与皮层骨具有类似的组成并且是“松质骨”的主要构成部分，并且是指成熟骨，其包括矿化的、规则排列的平行胶原纤维，其与在成熟的长骨轴的板骨内的组构不同。松质骨一般在被皮层骨所包围的长骨末端被发现。松质骨具有与填满骨髓的空隙形成格子的骨针。其也被称为小梁骨或海绵骨。在优选的实施方案中，本发明的组合物被递送到小梁骨。

本发明的骨固定方法还可包括在骨固定或接触本发明的组合物之前的缺损改造步骤。这种改造或骨重排可以采用例如钻或研磨器或任何其它可用于缺损改造的装置来进行。

用于固定骨的装置将根据要修复的缺损的类型以及骨的类型和方位的不同而异。典型地，固定装置是外部固定装置。优选地，外部固定装置，诸如，例如，铸件(cast)，是在本发明方法中被使用的唯一的固定装置，并伴有本发明组合物的注射。然而，在一些情况下，可能有必要采用侵入性更大的、还采用内部固定装置的手术过程。

可以监控修复并且可及时地除去用于固定骨的装置。在缺损部位的骨再生可通过在术后立即获得的和在术后给定间隔所获得的软组织X线(7.5mA；0.5秒)进行评价。在供试动物中的骨再生还可在实验终止时通过评价一般形态学、计算机化形态学(CT)扫描(65-80kV；20秒)和三维(3-D)CT扫描(Marconi，M.times.8,000)来测定。可进行组织学研究以测定组织的骨染色。

在本发明的方法中，所述组合物还可与可被用于骨修复的细胞诸如例如骨祖细胞联合使用。骨祖细胞，如本领域已知的，包括骨髓基质细胞的成骨性亚集落，以成骨细胞作为特征。被本发明方法所采用的骨祖细胞可包括成骨性成骨细胞本身和/或形成骨祖细胞的胚胎干细胞。骨祖细胞可采用已知的过程被分离。这些细胞优选为自体同源的并包括例如人胚胎干细胞，鼠或人骨祖细胞，鼠或人骨祖细胞骨髓由来的细胞，鼠或人骨祖细胞胚胎由来的细胞，和鼠或人胚胎细胞。这些细胞可进一步充当细胞分泌生长因子，诸如Robinson和Nevo(2001)所述的，其在上文中被定义。

本发明的组合物还可包含各种活性治疗剂，其可包括骨生长增强剂、骨祖细胞或其组合。该组合物可包含至少一种药物，诸如维生素、抗生素、抗炎药等。

在某些优选的实施方案中，采用本领域技术人员已知技术将锶并入含钙的盐中以制备被锶置换的钙化合物。另外，可将锶并入被常规性用于组织修复中的生物活性玻璃中。“生物活性玻璃”是任何的显示生物活性特征的玻璃，其典型地是无定形固体，其不具有固有的粘性并且其当暴露于适当的体内和体外环境(诸如模拟的体液或三-羟基甲基氨基甲烷缓冲液)下时能够与硬组织和软组织二者都形成内聚性结合。内聚性结合通过在生物活性玻璃上通过从本体生物玻璃材料释放离子物质而形成羟基碳酸磷灰石的表层来实现。在手术和矫形治疗以及在牙科领域中存在许多关于生物活性玻璃的应用，并且已被描述在例如欧洲专利1 405 647和欧洲专利申请1 655 042以及国际申请WO96/21628，WO 91/17777，WO 91/12032和美国专利公报20080066495中(其各自作为参考被并入本文)。

实施例：

在本发明的一个实施方案中，含锶化合物被用作在凝血酶稀释缓冲液中的二价离子。凝血酶溶液使用稀释缓冲液被制得。纤维蛋白原溶液和含锶的凝血酶溶液经混合以形成凝胶。

在本发明的另一个实施方案中，含锶化合物作为盐粒子被加入到制剂中。凝血酶溶液和盐粒子混合以制备改性的凝血酶溶液。纤维蛋白原溶液和经改性的凝血酶溶液经混合以形成凝胶。

实施例1：溶于所述缓冲溶液中的含锶化合物

在重蒸馏水中制备了一系列缓冲液。对于这些缓冲液，在凝血酶缓冲液中的二价阳离子是Ca或Ca+Sr的混合物，从而使得阳离子浓度被保持在40mM不变(参见下表中的氯化锶)。在凝血酶缓冲液中将凝血酶稀释到4IU的浓度。

CaCl₂ 40mM	CaCl₂ 30mM	CaCl₂ 20mM	CaCl₂ 10mM	CaCl₂ 0mM
CaCl₂ 40mM	CaCl₂ 30mM	CaCl₂ 20mM	CaCl₂ 10mM	CaCl₂ 0mM	SrCl₂ 0mM	SrCl₂ 10mM	SrCl₂ 20mM	SrCl₂ 30mM	SrCl₂ 40mM

然后将纤维蛋白原与凝血酶以1∶1的比混合(从而，在胶凝的凝结物中锶浓度减半)。为此，可将2ml凝血酶溶液转移到5ml注射器中。将2ml纤维蛋白原(Tisseel，Baxter，可凝固蛋白，[纤维蛋白原和粘连蛋白]72-110mg/ml)转移到单独的5ml注射器中。可以将包含纤维蛋白原和凝血酶的注射器连接至任何现有技术的混合器，以用于合并目的。

对于体外实验，通过将150μl纤维蛋白原溶液移液到24孔板的孔中来制备凝固物。将板置于板振荡器上以确保在整个孔底范围内均匀分布。然后将150μl的凝血酶溶液加入到孔中，并将板置于板振荡器上以确保得到均匀的凝固物。将人成骨细胞样细胞系(SaoS-2)在凝固物上培养长达7天，以看看是否可以观察到在细胞增殖/细胞分化中有任何差异。图1表示当将氯化锶(SrCl₂)加入到凝血酶稀释缓冲液中时的增殖结果(四氮甲唑蓝)。对于乙酸锶(SrAc)而言获得了类似的结果。

四氮甲唑蓝试验是代谢试验并且常被用来测量增殖。当与使用20mM CaCl₂的正常凝固物相比时，锶的加入导致在这些凝固物上发生显著增加的增殖。当增殖用DNA染色定量表示时也观察到了类似的结果(图2)。在7天后，在包含钙锶混合物的凝固物上生长的细胞和在只包含钙的凝固物上生长的细胞之间可以观察到明显差异。因此，得出结论：锶对成骨细胞样SaOS-2细胞的增殖具有积极影响。

这些初始实验被设计用于考察细胞增殖差异，没有提供足够的时间来考察成骨细胞分化。碱性磷酸酶是分化的早期指示剂，但是水平直到约10-14天之后才能真正达到峰值。初步的结果显示了，在含锶的凝固物中，碱性磷酸酶表达增加(图3)。在乙酸锶的情况中，这些值似乎不显著。使用14天研究周期重复进行这些实验。

除了细胞研究观测结果之外，还进行了比浊分析以考察凝固物结构是否由于锶而发生改变(图4)。凝固物浊度与纤维的平均横截面积成正比，因此，凝固物约混浊，则纤维直径越大。

图4中的比浊数据表明，在含锶凝固物中的动力学和吸光度方面与含钙凝固物相比具有极少的差异。这可通过钙和锶能够占据类似的结合部位(特别是FXIII结合部位)的观测结果来说明。

对于初始的实验，将细胞接种到凝固物的表面上。选择这一接种方法的理由之一是当被接种在凝固物内部时一些细胞类型大规模地遭受细胞死亡并且发生细胞向凝固物表面的移动。对于这种效果的一个可能的解释可在成骨细胞样细胞在补充有CaCl₂的介质中进行培养时来说明。图5表示在12.5mM CaCl₂存在的条件下，在组织培养塑胶上进行的SaOS-2细胞培养的结果。在氯化钙存在的条件下经过培养的细胞发生细胞死亡(通过MTS试验测得)。这发生在细胞培养的前24小时内。相比之下，在含锶化合物存在的条件下，在经培养的细胞的增殖中只有微小降低。重要的是指出，一些细胞要求高钙，即成纤维细胞和角化细胞，并因此不受凝固物的钙浓度的影响。

实施例2：纤维蛋白/掺杂锶的磷酸钙纳米粒子

在凝血酶缓冲液中将凝血酶稀释到4IU的浓度。将纤维蛋白原与凝血酶以1∶1的比率混合。为此，可以将2ml的凝血酶溶液转移到5ml注射器中。将2ml纤维蛋白原(Tisseel，Baxter，可凝固蛋白，[纤维蛋白原和粘连蛋白]72-110mg/ml)转移到单独的5ml注射器中。将粒子(小于1μm的纳米粒子)以作为最终凝固物体积的一定的百分数(w/v)并入。将其称重并置于另一个5ml注射器中。

将包含粒子和凝血酶的注射器通过Luer适配器连接并通过将内容物从注射器转移到注射器中进行粒子的匀化处理。将包含凝血酶/粒子和纤维蛋白原的注射器通过Luer适配器连接并将内容物进行匀化处理。材料保持为液体历时约30秒，在此期间，可将其注射进缺损内。

对于体外实验，通过将150μl纤维蛋白原溶液移液到24孔板的孔中来制备凝固物。将粒子(小于1μm的纳米粒子)作为最终凝固物体积的一定的重量百分数(w/v)加入。将板置于板振荡器上以确保在整个孔底范围内进行均匀分布。然后将150μl的凝血酶溶液加入到孔中，并将板置于板振荡器上以确保均匀的凝固物。在初步的研究中，将人成骨细胞样细胞(SaOS-2或NHOst)在凝固物上培养长达14天，以看看是否可以观察到在细胞增殖、细胞分化中有任何差异。

当与正常的纤维蛋白凝固物相比时，对接种到包含粒子的凝固物上的细胞进行的定性分析显示了良好的生物适合性(图6)。尽管非定量表示，在不含粒子的纤维蛋白凝固物上的细胞在形态上似乎更圆，而在包含粒子的纤维蛋白凝固物上的细胞在形态上更加分散。其进一步的证据可在凝固物的横截面中可见(图7)。为此，将细胞接种在凝固物内。几天以后，在纤维蛋白凝固物内的细胞移动到凝固物表面上。通过比较，在包含粒子的凝固物内的细胞保留在凝固物内并且散开，显示了有利的形态学。

实施例3：在兔股骨髁缺损模型中掺杂锶的羟基磷灰石的使用

上述研究暗示了锶刺激骨形成并同时抑制骨吸收。先前的研究考察了SrCl₂对成骨细胞样细胞和对原代成骨细胞的影响。在试图鉴定可被用于椎骨加强的制剂的过程中，在兔股骨髁缺损模型中试验了掺杂锶的改性羟基磷灰石以评价锶刺激骨形成的潜力。可以在工作台上通过在高pH值下(用氢氧化铵调节)搅拌硝酸钙和磷酸铵来生产钙羟基磷灰石。得到的沉淀可以经过离心、洗涤、干燥和煅烧，以获得羟基磷灰石样物质。通过将硝酸钙以硝酸锶以各自的置换百分数进行合并，有可能生产锶-钙羟基磷灰石样粒子，其可与纤维蛋白一起被注射进骨缺损内。

该实施例显示的数据表明，被锶置换的钙羟基磷灰石样粒子刺激新骨形成好于单独的纤维蛋白或纯的钙羟基磷灰石样粒子。这些结果为初步细胞培养中所得的数据提供了体内证实。

材料和方法：

在本实施例中所述的研究中使用了以下的化学试剂。硝酸钙四水合物；99％A.C.S.试剂[Sigma-Aldrich；237124-500G；FW：236，15]；硝酸锶p.A.＞99％[Fluka；85899 500g；Lot&Filling Code：1086321，53706181；FW：211，63]；双相磷酸铵p.A.[Riedel-de

30402 500g；FW：132，06]；氢氧化铵[Sigma-Aldrich，318612-2L；batch#：11103PD；FW：35，05；5N的H₂O溶液]；EtOh 96％；Fibrinkleber[Baxter AG；Fibrinkleber TIM 3；08P6004H；5ml；1500434]；凝血酶[Baxter AG；B205553 thromb.SD TIM 5；500IE；US 5ml]；氯化钙二水合物(min.99％)[Sigma；C7902-1KG；batch#：044K0160]；和氯化钠[Merck，1.06404.10001kg；Charge/Lot：K38062004 745；FW：58，44。

实验使用如下的各种溶液：40mM CaCl₂+200mM NaCl：1.47gCaCl₂+2.92g NaCl，在250ml ddH₂O中；在5ml 40mM CaCl₂+200mMNaCl中重构的冻干凝血酶，和在5ml 3000KIE/ml抑肽酶中重构的冻干纤维蛋白原。

如下所示，在采用6个兔膝的4个试验组中进行实验：

组1.纤维蛋白+凝血酶(8IU/ml最终浓度)

组2.纤维蛋白+凝血酶(8IU/ml最终浓度)+100％Ca(0％Sr置换)

组3.纤维蛋白+凝血酶(8IU/ml最终浓度)+75％Ca(25％Sr置换)

组4.纤维蛋白+凝血酶(8IU/ml最终浓度)+20％Ca(80％Sr置换)。

试验材料的制备：

将纤维蛋白原重构并分小份与每注射器0.5ml纤维蛋白原一起被分配在1ml注射器[Braun；omifix-ImI；Luer]中。将凝血酶重构并用40mMCaCl₂+200mM NaCl稀释到16IU/ml。也将其分小份以每注射器0.5ml分配在1ml注射器中。

通过将等量的2M硝酸钙溶液(或根据锶置换百分数还有硝酸锶，所得溶液必需总共为2M)和1.2M磷酸铵溶液在一起搅拌以生产羟基磷灰石粉末。当向硝酸钙中加入磷酸铵时，有浆状物质沉淀出现。随后加入等量的氢氧化铵将沉淀物的pH升高到11，使浆状沉淀物呈液体性。在充分搅拌后，将混合物离心，丢弃上清液并将沉淀物用醇(乙醇96％)洗涤两次和用ddH₂O洗涤一次。在洗涤步骤之间沉淀物始终被淘选，离心并丢弃上清液。然后，将沉淀物在60℃真空干燥1天，研磨并在1100℃煅烧1小时。

在冷却后，将羟基磷灰石样粒子加热灭菌并以每注射器0.3g分装在1ml注射器中。

兔的治疗

12只兔用于进行主要实验。使其镇静并在股骨髁内转出钻孔(直径4.5mm)。通过将凝血酶组分与粒子迅速混合然后与纤维蛋白原混合，或者通过将凝血酶与纤维蛋白原混合(作为对照)，对这些钻孔各自填充试验材料。将1ml注射器的锥完好地配合到钻孔内，从而可能实施定向施用。

在注射各自的材料(对24个膝是随机化的)后，将皮肤缝合，并在随后的8周内对兔实施监控。

术后分析

在8周后，对兔实施安乐死，并通过μCT分析膝，薄切片经过组织学染色。

结果

μCT分析：由于锶样品的高的不透明度，难以获得定量结果，因此通过用眼睛对μCT照片进行评价并对其进行量化来进行半定量分析。骨形成的评价分三级(1：低；2：中等；3：高)来进行。通过对闭合钻孔给出“+”和对非闭合钻孔给出“-”来对闭合钻孔进行评价。数据如图8-14中的图表所示。所有图表是可评价的经过治疗的动物的平均数，而μCT照片是快照。

图8显示了完全闭合的钻孔(两侧闭合)的图解表示法。被评价的用纤维蛋白填充的兔缺损中没有一个在两侧闭合，因此，在图8中可见0％的完全闭合的钻孔边界。在粒子中，25％的Sr替换获得了最高值为80％的闭合钻孔边界。

在图9中，是在纤维蛋白存在的条件下的兔股骨髁的μCT。仍然可见该缺损，但是无可见的残余材料(纤维蛋白)；钻孔的一侧仍然开放。

锶的加入产生显著的影响。图11显示了在80％Sr材料中的兔股骨髁的μCT。尽管仍可见该缺损，但是大部分缺损被填充；所述材料(Sr80％)强烈可见。新骨形成可明显地被识别并且钻孔两侧闭合。

上述结果还采用组织学研究来证实。图12显示了用纤维蛋白处理的兔股骨髁缺损的组织染色薄切片。不存在供试物质。因此，未发现炎症迹象。在钻孔内部只发现少数的短的松质骨小梁。在打开转管时，新形成的骨质为海绵状。血管几乎规则分布在钻腔内，显示了只有少数斑点具有低的血管化。若干个更大的血管在钻腔一侧处与骨质邻接。

用含80％锶的纤维蛋白凝固物处理的样品中(图13)，40-70％的钻管充满供试物质。供试物质在钻腔内部全部为细长形的样品。在一个样品中，其更多地成粒状，而其它两个处显示为粗糙的供试物质。在3个样品的2个中，纤维蛋白作为靠近供试物质的大膜片存在。在一个样品中几乎没有炎症，与在其它样品中具有3-10个大型炎症是不同的。在一个样品中，供试物质直接接触新建的骨组织，而供试物质在另外两个样品中距离新建的骨组织较远。两个样品在钻腔内部具有规则分布的血管，而第三个样品具有更集束化的血管化。

讨论

μCT数据显示了包含Sr 25％置换的羟基磷灰石样粒子的制剂触发了钻孔的闭合好于另一个供试物质，诱导了可与80％置换粒子相比的骨形成，同时致密性较低。

单独的纤维蛋白触发更低的骨形成并且钻孔只在一侧上闭合。包含纯的钙羟基磷灰石样粒子的制剂不那么致密，但是似乎不诱导骨形成或钻孔闭合。

高锶浓度的制剂非常致密，其诱导新骨形成，但是不显著超过Sr25％。另外，与处在更低浓度下的锶相比，钻孔闭合更差，因此，即使低浓度的锶也足以诱导骨形成。

组织学结果暗示了在钙羟基磷灰石样粒子中进行锶替换诱导新骨形成。血管化，用于成骨细胞移动并由此导致新骨形成的先决条件，在所有样品中被观测到。

实施例4：锶与PTH对成骨细胞具有协同效应。

苯实施例描述了对大鼠骨肉瘤细胞进行体外试验以考察甲状旁腺激素(PTH)和锶(作为SrCl₂被使用)的组合是否在成骨细胞中激活骨形成因子如cAMP产生增加具有影响。本文所述的研究表明SrCl₂与PTH在成骨细胞中cAMP产生方面具有积极的协同效应。对于用CaCl₂处理的细胞未观察到这种效应。因为cAMP已知诱导合成代谢性骨形成，因此本文提供的数据支持了Sr和PTH的联合治疗将导致体内骨形成增加的结论。

材料和方法

使用骨肉瘤细胞系UMR-106(NewLab Bioquality AG，Erkrath，Germany)进行生物试验。

如下所述的试验使用以下的介质：

细胞培养介质：DMEM(Sigma，D6546；包含，4500mg/l葡萄糖，丙酮酸钠，Na₂CO₃，补充有0.584g/l L-谷氨酰胺)；10％FCS；2mM L-Glu。

饥饿介质：DMEM(Sigma，D6546；包含4500mg/l葡萄糖，丙酮酸钠，Na₂CO₃，补充有0.584g/l L-谷氨酰胺)；2mM L-Glu；

SI介质：10ml饥饿介质；2mM IBMX

在饥饿介质中的20mM SrCl₂：19,6ml介质，0,4ml 1M SrCl₂

在饥饿介质中的20mM CaCl₂：19,6ml介质，0,4ml 1M CaCl₂

细胞培养

将UMR-106细胞以30000个细胞/平方厘米的密度接种在生长培养基中并在37℃/8.0％CO₂中培养。在24小时后，将介质用新鲜的介质、包含20mM SrCl₂的介质或包含20mM CaCl₂的介质替换。细胞进一步在37℃/8.0％CO₂中培养24小时。根据以下过程收获细胞：

将细胞用HBSS洗涤两次并采用6ml胰酶/EDTA在室温下处理3分钟使其与表面分开。使用12ml生长培养基使胰蛋白酶消解终止。在离心(3分钟，1000rpm，室温)后，将细胞再悬浮在12ml饥饿介质中并用CASY细胞计数装置进行计数。在每个实验中，死细胞率低于10％。将细胞在饥饿介质再悬浮达到1.6×10⁶个细胞/毫升的最终浓度。将50μl的细胞悬浮液转移到96孔板的各孔中并在37℃、8.0％CO₂中培养30分钟。

用在纤维蛋白原溶液中的264μg/ml TGp1PTH样品处理细胞

将样品在新制备的包含2mM IBMX的饥饿介质(SI介质)中稀释。对于SI-介质的制备，将30μl的在DMSO中的0.67M IBMX储液加入到10ml的饥饿介质中。

采用该介质制备了所有的样品稀释物以抑制在UMR-106细胞中的磷酸二酯酶活性(Janik，P.，1980；Chasin M.和Harris，D.N.，1976)。在37℃培养30分钟后，将50μl的被稀释样品(如结果所示)加入到细胞中。对于cAMP产生，将细胞在37℃、8.0％CO₂中培养1小时。在进行一式两份的cAMP分析后，将每个样品以至少一式两份浓缩物加入到细胞中。

cAMP Biotrak酶免疫测定法

用于cAMP EIA的试剂制备。试验缓冲液，溶胞试剂1A/1B，溶胞试剂2A/2B，cAMP标准品，抗血清，cAMP过氧化物酶缀合物和洗涤缓冲液根据制造商手册来制备(cAMP Biotrak EIA kit，GEHealthcare)。通过用947ml ddH₂O稀释53ml H₂SO₄(浓度＝18.76M)制备1M的硫酸终止溶液。

cAMP的细胞溶解和稀释。对于cAMP的提取，将包含PTH的100μl的细胞悬液与25μl(最终稀释度为1∶5)溶胞试剂溶剂1A(其是cAMPBiotrak EIA试剂盒(GE Healthcare)的一部分)培养。对于总的溶胞，将细胞在室温下在500rpm下摇动15分钟。被提取的cAMP最后用溶胞试剂1B(cAMP Biotrak EIA试剂盒)以1∶20进行稀释(在试验板中以1∶1稀释(加入125μl的溶胞试剂1B)，然后在ELISA板上以1∶10稀释(90μl溶胞试剂1B+10μl被稀释的细胞悬液))。

CAMP工作标准品的制备。将用于非乙酰化试验的冻干cAMP标准品(cAMP Biotrak EIA试剂盒)溶解在试验缓冲液中以达到32pmol/ml的浓度。制备了从32pmol/ml到0.5pmol/ml的双稀释系列。

内部对照。将100μl的各标准品和样品稀释物一式两份转移到适当的孔中并进行分析。另外，两个不同的内部对照即非特异性结合(NSB)对照和零对照(0)对于显示cAMP ELISA的特异性是必要的，并根据制造商(GE保健)的推荐来进行。

酶免疫分析过程。将除了NSB对照之外的100μl抗血清加入到所有的孔中。在摇动的同时在4℃进行抗体反应历时2小时。在摇动的同时在4℃与50μl cAMP过氧化物酶缀合物培养1小时后，将所有的孔用300μl洗涤缓冲液洗涤四次。最后，将150μl TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)加入到各孔内并且在室温下进行底物反应历时10分钟。通过加入100μl的1M H₂SO₄使反应终止，并且立即在读板器中在450nm测定光密度。

数据分析。在读板器(Synergy HT)中通过使用软件KC4在450nm测量样品的吸光度来测定光密度。在Microsoft Excel 2000中进行背景校正、平均值的计算、标准偏差、变异系数和标准曲线的生成。使用Sigmaplot 9.0用于4参数拟合和EC₅₀计算。使用PLA1.2(StegmannSystemberatung)用于平行直线分析和相对功效的检测。

结合的cAMP过氧化物酶缀合物的百分数。使用以下关系式计算了每个标准品和样品的结合的cAMP过氧化物酶缀合物％：

B / B 0 (%) = \frac{(ODsample - ODnsb) \times 100}{(ODzero - ODnsb)}

OD sample……特定样品的OD450

OD zero……仅缀合有过氧化物酶的cAMP的OD450

OD nsb……没有cAMP抗体的OD450

标准曲线。通过将B/B0的百分数(纵座标)作为log c(cAMP)(横座标)的函数进行绘图生成cAMP标准曲线。

样品的cAMP浓度。考虑到稀释倍数(20倍)，使用标准曲线的参数(斜率和截距)计算产生的cAMP量。

线性度。评价的cAMP ELISA的标准曲线的相关系数(R²≥0.95)。

用于生物鉴定分析的样品的制备。对于分析，将样品在包含2mM磷酸二酯酶抑制剂IBMX(SI-介质)的饥饿介质中稀释到最终浓度为2400nM TGp1PTH(13,2μg/ml TGp1PTH)。对于所有样品，制备了150μl的以下8个系列稀释物，并将50μl直接加入到细胞中(细胞上的总体积：100μl)。对于所有的样品和所有的稀释物，计算了OD450平均值，标准偏差，cAMP浓度和变异系数。

C(TGp1PTH)nM	制备	c(TGp1PTH)μg/ml
C(TGp1PTH)nM	制备	c(TGp1PTH)μg/ml	2400nM(1200nM，在细胞上)	参见上文	13,2
1200nM{600nM，在细胞上)	1∶1，在稀释的介质中	6,6	2400nM(1200nM，在细胞上)	参见上文	13,2
1200nM{600nM，在细胞上)	1∶1，在稀释的介质中	6,6	600nM(300nM，在细胞上)	1∶1，在稀释的介质中	3,3
300nM(150nM，在细胞上)	1∶1，在稀释的介质中	1,65	600nM(300nM，在细胞上)	1∶1，在稀释的介质中	3,3
300nM(150nM，在细胞上)	1∶1，在稀释的介质中	1,65	150nM(75nM，在细胞上)	1∶1，在稀释的介质中	0,83
75nM(38nM，在细胞上)	1∶1，在稀释的介质中	0,42	150nM(75nM，在细胞上)	1∶1，在稀释的介质中	0,83
75nM(38nM，在细胞上)	1∶1，在稀释的介质中	0,42	38nM(19nM，在细胞上)	1∶1，在稀释的介质中	0,21
19nM(10nM，在细胞上)	1∶1，在稀释的介质中	0,1	38nM(19nM，在细胞上)	1∶1，在稀释的介质中	0,21

连续稀释表。对于剂量反应曲线的生成，对每个样品进行一对一的连续稀释步骤，并且对所有的稀释物一式三份进行分析。

结果。SrCl₂和CaCl₂对PTH生物活性的影响在五个不同的实验中独立进行监控(图14)。这些研究显示了在TGp1PTH处理前UMR-106细胞与20mM SrCl₂进行24小时的预培养导致生物活性增加两倍，而在PTH生物活性中CaCl₂显示无变化(图14)。这些结果表明了锶和PTH对cAMP产生具有协同效应，并且支持了PTH与锶的组合将导致体内合成代谢性骨形成的结论。

Claims

1.用于骨愈合或骨生长的、包含纤维蛋白、凝血酶和含锶化合物的组合物。

2.权利要求1的组合物，其中组合物是凝胶、灰泥、糊剂或液体形式。

3.权利要求1或2的组合物，还包括增塑剂。

4.权利要求3的组合物，其中增塑剂是含碘化合物。

5.权利要求4的组合物，其中含碘化合物选自：泛影酯，碘的可，碘克沙醇，碘拉醇，碘谷胺，碘海醇，碘美普尔，碘帕醇，碘普胺，碘曲伦，碘佛醇，碘克沙酸和甲泛葡胺，及其混合物，和多元醇。

6.权利要求1、2、3、4或5的组合物，其中组合物可以在胶凝阶段之前或期间作为液体、糊剂或凝胶被递送进入或作为预形成的凝胶、糊剂或灰泥被递送进入组织缺损内。

7.权利要求1、2、3、4、5或6的组合物，其中组合物包含一种或多种选自以下的细胞外蛋白质：细胞外基质蛋白诸如粘连蛋白，细胞相关蛋白，血浆由来蛋白诸如凝血因子XIII，蛋白酶和蛋白酶抑制剂。

8.权利要求1、2、3、4、6或7的组合物，其中组合物在愈合过程期间被组织再吸收和替换。

9.权利要求1、2、3、4、5、6、7或8的组合物，其中组合物还包含凝结诱导剂诸如鱼精蛋白，蛇毒，转谷氨酰胺酶，FXIIa或生理学可接受的碱性缓冲液系统。

10.权利要求1或2的组合物，其中含锶化合物为可溶性的微粒子形式、颗粒形式或为固体形式。

11.权利要求10的组合物，其中含锶化合物通过将锶加入到含钙化合物中以产生包含含钙和锶的盐的材料被制得。

12.权利要求11的组合物，其中所述含钙化合物是钙磷酸盐。

13.权利要求12的组合物，其中钙磷酸盐选自：磷酸三钙，α-磷酸三钙，β-磷酸三钙，磷酸钙的多晶型物，羟基磷灰石，碳酸钙，硫酸钙及其组合。

14.权利要求11的组合物，其中含锶化合物或含钙化合物具有的粒径为100纳米到50毫米。

15.权利要求11的组合物，其中含锶化合物或含钙化合物具有的粒径的0.5到5毫米。

16.权利要求11的组合物，其中在所述组合物中锶盐：钙盐的百分数为0.25％到100％的含锶的盐。

17.权利要求10的组合物，其中含锶化合物通过将锶加入到生物活性玻璃中以产生含锶的生物活性玻璃材料被制得。

18.权利要求1、2、3、6、8、10、11或17的组合物，其中含锶化合物选自：氯化锶，雷奈酸锶，乙酸锶，谷氨酸锶，天冬氨酸锶，丙二酸锶，马来酸锶，抗坏血酸锶，苏糖酸锶，乳酸锶，磷酸锶，锶磷灰石，丙酮酸锶，α-酮戊二酸锶和琥珀酸锶。

19.权利要求1、2、3、6、8、10、11、17或18的组合物，还包含选自以下的锶共配体：拟钙剂，骨钙蛋白，氨基酸诸如L-精氨酸，以及精氨酸模拟物和精氨酸类似物。

20.权利要求3的组合物，其中增塑剂是聚乙二醇，多元醇，甘油，或选自单糖、二糖、三糖、多糖的糖，及其组合。

21.权利要求1、2、3、4、5、6、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19或20的组合物，其还包含选自以下的蛋白质：骨形态发生蛋白，甲状旁腺激素(PTH)，降钙素，双膦酸盐，表皮生长因子，胰岛素样生长因子和TGF生长因子。

22.权利要求1的组合物，其中当混合各种组分时发生组合物的胶凝。

23.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物是可注射型组合物。

24.治疗受试者中的患病的、受损的或有缺陷的骨的方法，包括将包括权利要求23的组合物的组合物注射进所述受试者的松质骨内。

25.权利要求24的方法，其中将所述组合物注射进所述受试者的松质骨内引起愈合速率比施用不含锶的类似组合物所观察到的愈合速率更快。

26.修复具有缺损的骨的方法，包括：(a)机械固定骨或其部分；和(b)用实现修复所述缺损的量的权利要求1-23中任一项的组合物充填缺损。

27.权利要求26的方法，其中所述缺损是骨折并且所述修复是所述骨折的骨愈合。

28.权利要求27的方法，其中施用所述组合物引起愈合速率比不施用所述组合物所观察到的愈合速率更快。

29.权利要求27的方法，其中施用所述组合物引起愈合速率比施用不含锶的类似组合物所观察到的愈合速率更快。

30.权利要求25的方法，其中所述骨是选自股骨、胫骨、肱骨和挠骨的长骨。

31.促进骨缺损部位处的新骨生长的方法，包括使所述缺损部位接触权利要求1-23中任一项的组合物。

32.权利要求31的方法，其中所述骨生长的速率在所述组合物中存在锶的条件下比在存在不含锶的类似组合物的条件下所观察到的骨生长速率更快。