BRPI0811035B1 - Composições de fibrina contendo compostos de estrôncio - Google Patents

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(54) Título: COMPOSIÇÕES DE FIBRINA CONTENDO COMPOSTOS DE ESTRÔNCIO (51) Int.CI.: A61L 24/00; A61L 27/22; A61P 19/08 (30) Prioridade Unionista: 23/04/2007 US 60/925,716 (73) Titular(es): BAXTER INTERNATIONAL INC.. BAXTER HEALTHCARE S.A.

(72) Inventor(es): JOHN J. BARRY; ANDREAS GOESSL; GERALD ZIMMER (85) Data do Início da Fase Nacional: 23/10/2009

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÕES DE FIBRINA CONTENDO COMPOSTOS DE ESTRÔNCIO.

[001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. N° 60/925.716 que foi depositado no dia 23 de abril de 2007 e está especificamente incorporado aqui por referência em sua totalidade.

Campo da Invenção [002] A presente invenção se refere geralmente a uma composição para uso na cicatrização óssea e regeneração óssea e especificamente a um gel de hidrogel viscoelástico ou formulação líquida compreendendo fibrinogênio, trombina e um componente inorgânico compreendendo um composto contendo estrôncio (Sr) e/ou possivelmente outro metal tal como um cálcio. O composto contendo estrôncio pode ser dissolvido nas soluções de trombina ou adicionado à composição em forma de particulado cristalina. Ao misturar os componentes, a gelificação ocorre para formar uma matriz.

Antecedentes da Invenção [003] A prática atual na regeneração e cicatrização óssea é preencher lacunas de osso com um enxerto de osso (auto ou aloenxerto), um cimento de osso tal como enchimentos de lacunas de sal de cálcio implantáveis ou injetáveis ou polimetilmetacrilato (PMMA). Autoenxertos são a escolha 'ouro-padrão' para este pedido, mas há questões com limitações de tecido doador, trauma, infecção e morbidez. Há vários problemas com aloenxertos, incluindo o risco de imunogenicidade e transmissão de doença. Tanto o auto quanto aloenxertos exibem a perda de propriedades biológicas e mecânicas devido à remodelagem secundária. São estas limitações que incitaram interesse em materiais alternativos para enxertos de osso (Parikh SN. 2002; J. Postgrad. Med. 48:142-148)

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2/38 [004] PMMA é um material polimérico não reabsorvível. Durante seu monômero não reagido de polimerização, catalisador e oligômeros de baixo peso molecular tornam-se capturados no polímero. Estas substâncias químicas têm o potencial de lixiviar-se fora do material que resulta em respostas citotóxicas e imunológicas localizadas. Polimerização de PMMA tem uma alta exotermia que pode causar potencialmente necrose por calor. Esta exotermia da mesma forma limita a capacidade de PMMA incorporar qualquer agente farmacológico ou quimioterapêutico. O vazamento de PMMA de um defeito pode resultar em complicações muito sérias incluindo a compressão de estruturas adjacentes (requerendo outra cirurgia) e/ou embolia.

[005] Matriz óssea no nano-nível (10^-9 m) é composta de fibras colagenosas nas quais cristais minúsculos de sais de cálcio são embutidos. Para simular a preparação natural do osso, sais de cálcio são frequentemente usados para reparar o osso. Há vários enchimentos de lacunas injetáveis com base em sal de cálcio conhecido. Uma complicação principal com cimentos de sal de cálcio é sua exigência quanto à colocação in vivo que é normalmente obtida por reação química. Desse modo, qualquer biologia incorporada no enchimento tais como células e agentes farmacológicos pode ser potencialmente danificada. Além disso, se o enchimento é muito líquido, ele pode vazar do defeito em espaços adjacentes que levam à compressão de estruturas e possíveis êmbolos. O vazamento de defeitos proximais para as articulações pode prejudicar potencialmente a função de articulações. [006] A hidroxiapatita de sal de fosfato de cálcio (CP) (HA estrutura Caw(PO4)e(OH)2) está mais próxima da fase mineral do osso e pode facilmente ser sintetizada na bancada. É da mesma forma possível preparar HA onde outros cátions (por exemplo, magnésio, sódio e estrôncio) ou ânions (cloreto, fluoreto e carbonato) são substituídos no cristal. Relativo à presente invenção é a substituição de íons de cálcio

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3/38 (Ca²⁺) com íons de estrôncio (Sr²⁺) nos cristais de CP. Estrôncio e cálcio pertencem igualmente aos elementos alcalinos-terrosos, e se assemelham a um ao outro em que mais do que 99% do cálcio total e estrôncio no corpo está localizado no osso. Estrôncio é o único elemento identificado ter uma relação positiva com resistência óssea, isto é, a resistência mecânica do osso aumenta com o teor de estrôncio crescente. Os efeitos terapêuticos potenciais do estrôncio foram conhecidos por algum tempo. Entretanto, foi sugerido na literatura que o potencial terapêutico pode ter sido negligenciado devido a confusão de Si²⁺ estável, normal (⁸⁴Sr, ⁸⁶Sr, ⁸⁷Sr e ⁸⁸Sr) com seus isótopos radioativos (⁸⁵Sr, ⁸⁶mSr, ⁸⁷Sr e ⁸⁸Sr) Dahl e outro, Bone; 28 (4) pp. 446-453. Recentemente, os efeitos terapêuticos de estrôncio foram realçados, e pesquisa demonstrou que sais de estrôncio estimulam a formação óssea e inibem a reabsorção óssea in vitro (até mesmo em baixas doses) e in vivo, como avaliado por histomorfometria de osso em roedores e pacientes osteoporóticos. Ferraro e outro, 1983; Calcif. Tissue Int. 35:258-60.

[007] Os efeitos anabólicos e antirreabsorventes poderosos de estrôncio têm levado ao desenvolvimento de um novo fármaco antiosteoporótico. O fármaco oralmente ativa (ingrediente ativo ranelato de estrôncio) foi mostrado para reduzir o risco de fraturas vertebrais e aumentar a densidade mineral do osso. Meunier PJ e outro, 2004; N_ Engl J Med. 350(5):459-68. O fármaco é composto de uma molécula de ácido ranélico ligado a dois átomos de estrôncio. O grupo ranelato foi escolhido como o veículo porque é bem tolerado no trato GI. No intestino, os íons de estrôncio são liberados do grupo ranelato que leva à absorção do estrôncio pela mucosa intestinal. Na absorção, o estrôncio exibe afinidade forte para tecido ósseo, e é incorporado na camada hidratada externa de hidroxiapatita. Uma quantidade menor integra no cristal do osso, onde a relação de átomos de estrôncio para

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4/38 cálcio não excede 1:10, de forma que nem a formação nem as propriedades fisicoquímicas do cristal são alteradas pela presença de estrôncio. Ranelato de estrôncio é sugerido ser o primeiro medicamento para desacoplar a formação óssea da reabsorção óssea. In vitro, ranelato de estrôncio aumenta a síntese de proteína de colágeno e nãocolágeno, realçando a diferenciação de pré-osteoblasto, inibindo a diferenciação de osteoclasto, reduzindo a função de osteoclasto e aumenta a apoptose de osteoclasto. Em modelos de animal, o aumento na densidade óssea está intimamente correlacionada a aumentos na resistência óssea biomecânica. Em modelos de rato, ranelato de estrôncio aumenta a massa óssea e melhora a microarquitetura e geometria do osso, resultando na resistência óssea aumentada. Em ratos ovariectomizados (um modelo para osteoporose), ranelato de estrôncio diminui a reabsorção óssea, mas mantém a formação óssea elevada. Todos os determinantes da resistência óssea são influenciados positivamente por tratamento com ranelato de estrôncio (massa óssea, dimensão, microarquitetura, e qualidade de tecido ósseo intrínseca). O incremento nas propriedades mecânicas do osso é caracterizado por um aumento na carga máxima mas também por uma melhoria dramática na energia ao fracasso, que é essencialmente devido a um incremento na energia de plástico. Kendler, 2006; Curr. Osteopor. Rep. 4(l):34-9; Marie, 2006; Curr. Opin. Rheum. 18 Suppll:S11-5; Ammann, 2006, Bone. 38(2 Supl 1): 15-8. Embora o modo de ação do estrôncio não seja entendido completamente, acredita-se que o aumento na osteogênese não seja associado a mudanças em níveis circulantes de 1,25(OH)2 vitamina D ou em efeitos de paratormônio. Estrôncio mostrou a eficácia antifratura em todos os sítios em um número grande de mulheres pós-menopausa. Close e outro, 2006; Expert Opin Pharmacother 7(12): 1603-15.

[008] A aplicação localizada de estrôncio na forma de um cimento

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5/38 ósseo contendo estrôncio foi da mesma forma investigada por outros investigadores Wong,Chi-Tak,2004, Osteoconduction and osseointegration of a stroncium-containing hydroxyapatite bioactive bone cement: in vitro and in vivo investigations. Publicador: University of Hong Kong (Pokfulam Road, Hong Kong); Zhao e outro, 2004; J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 69(1):79-86. O cimento de osso de Sr-HA não reabsorvente foi composto principalmente enchimentos de hidroxiapatita contendo estrôncio (Sr-HA) e resina de bisfenol A diglicidiléter dimetacrilato (BIS-GMA). Foi proposto que o material pode ser usado para vertebroplastia no estado em que se encontra, pode ser liberado por injeção e poderia ter tido propriedades fisico/mecânicas melhores do que PMMA. O cimento de osso de hidroxiapatita contendo estrôncio (Sr-HA) foi demonstrado ser bioativo tanto in vitro quanto in vivo. In vitro parece ser mais eficaz do que um cimento de osso de hidroxiapatita não-dopado (HA) para ligação de célula (SaOS-2) e mineralização do osso. In vivo o cimento ósseo de Sr-HA ligou-se com osso natural. [009] Nas Patentes U.S. N^os 5.736.132 e 5.549.904, ambas das quais estão por este meio incorporadas por referência, um adesivo de tecido suplementado com transglutaminase é referido para preferivelmente conter um íon de metal divalente tal como cálcio e estrôncio em uma quantidade na faixa de cerca de 0,5 mM a cerca de 100 mM em um pH de cerca de 7,0 a cerca de 8,5. É reivindicado que o adesivo suplementado com transglutaminase pode ser usado no tratamento de tecido em fraturas de articulação, defeitos condrais, defeitos condrais superficiais, defeitos de espessura total, osteocondrite dissecante, rompimentos meniscais, rompimentos de ligamento, rompimentos de tendão, lesões musculares, lesões de junção miotendinosas, transplante de cartilagem, transplante ósseo, transplante de ligamento, transplante de tendão, transplante condral, transplante condroósseo, fixação de enxerto de pele e vasos sanguíneos, enxertos vasculares

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6/38 improvisados e anastomose de vaso sanguíneo microvascular. O foco primário das patentes é a incorporação de transglutaminase em um adesivo.

[0010] Em comparação, a presente invenção não incorpora transglutaminase e é planejada para injeção em lacunas e defeitos ósseos para liberação local de estrôncio e ajudar na nova formação óssea. Dados de literatura mostram que estrôncio elementar pode estimular a formação óssea enquanto inibindo simultaneamente a reabsorção óssea.

Sumário da Invenção [0011] A presente invenção fornece uma composição que pode ser injetada em uma lacuna ou defeito ósseo ou no espaço da medula do tecido ósseo trabecular onde temporariamente substitui a medula óssea, para ajudar na nova formação óssea. Os dados mostram que estrôncio elementar é capaz de estimular a formação óssea enquanto simultaneamente inibindo a reabsorção óssea.

[0012] Em um aspecto, a invenção fornece uma composição para uso na cicatrização óssea e crescimento ósseo em que a composição compreende fibrina, trombina e um composto contendo estrôncio. A composição pode também compreender um composto contendo cálcio. Preferivelmente, a composição é uma composição injetável que está na forma de um gel injetável, betume injetável, pasta injetável ou forma líquida injetável.

[0013] Em outras modalidades, a composição pode compreender um ou mais agentes plasticizantes. Em certas modalidades, o plasticizante é um composto contendo iodo. Composto contendo iodo exemplar para uso como plasticizantes aqui inclui, mas não está limitado a compostos selecionados do grupo que consiste em diatrizoato, iodecol, iodixanol, iofratol, iogulamida, ioexol, iomeprol, iopamidol, iopromida, iotrol, ioversol, ioxagulato e metrizamida e misturas dos mesmos e

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7/38 álcoois polivalentes. Em outras modalidades, o plasticizante é um polietileno glicol, um álcool polivalente, glicerol, ou açúcar selecionado a partir do grupo que consiste em monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, polissacarídeos, e combinações dos mesmos. Em outras modalidades, o efeito plasticizante é obtido pelo ajuste da composição de compostos de baixo peso molecular tais como, entre outros, cloreto de sódio e agentes caotrópicos.

[0014] A composição pode estar em uma forma líquida ou em gel. Em certos aspectos, a composição pode ser liberada como um líquido ou um gel antes de ou durante a fase de gelificação ou como um gel pré-formado em defeitos de tecido.

[0015] Em outros aspectos da invenção, a composição contém um ou mais proteínas extracelulares selecionadas a partir do grupo que consiste em proteínas matriz tal como fibronectina, proteínas associadas celulares ou proteínas derivadas de plasma tais como fator de coagulação sanguínea XIII e proteases.

[0016] Em ainda outras modalidades, a composição pode também compreender um agente indutor de coagulação tal como protamina, veneno de cobra, transglutaminases, FXIIa, ou um sistema de tamponamento alcalino fisiologicamente aceitável.

[0017] Em modalidades específicas, a composição é tal que a composição é reabsorvida e substituída com tecido durante o processo de cicatrização.

[0018] O composto contendo estrôncio usado nas composições da invenção pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em cloreto de estrôncio, ranelato de estrôncio, acetato de estrôncio, glutamato de estrôncio, aspartato de estrôncio, malonato de estrôncio, maleato de estrôncio, ascorbato de estrôncio, treonato de estrôncio, lactato de estrôncio, fosfato de estrôncio, apatitas de estrôncio, piruvato de estrôncio, alfa-cetoglutarato de estrôncio e sucinato de estrôncio. Estes

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8/38 são compostos contendo estrôncio meramente exemplares e outros compostos que contêm estrôncio podem ser facilmente empregados nas composições da presente invenção.

[0019] A composição pode ser aquela que também compreende um coligante de estrôncio selecionado a partir do grupo que consiste em grupos calcimiméticos, osteocalcina, aminoácidos tal como Larginina, e, arginomiméticos e análogos de arginina.

[0020] Nas composições descritas aqui, o composto contendo estrôncio e/ou o composto contendo cálcio pode ser em uma forma sólida ou (micro)particulada. Em modalidades exemplares, a forma (micro)particulada contendo estrôncio ou contendo cálcio tem um tamanho de diâmetro de partícula que varia de 100 nanômetros a 500 mm. Em outras modalidades, os componentes contendo estrôncio ou contendo cálcio pode tomar a forma de sólidos porosos ou não-porosos com dimensões variando de, por exemplo, 0,5 a 50 milímetros. Preferivelmente, o tamanho de partícula está na faixa de 0,5 a 5 milímetros. [0021] Em modalidades específicas, o composto contendo cálcio é um fosfato de cálcio. O fosfato de cálcio pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em em fosfato de tricálcio, fosfato de alfatricálcio, fosfato de beta-tricálcio, polimorfos de fosfato de cálcio, hidroxiapatita, carbonato de cálcio, sulfato de cálcio e combinações dos mesmos.

[0022] Em certas modalidades, é considerado que algum cálcio é substituído com estrôncio para fornecer uma mistura de cálcio e sais de estrôncio.

[0023] Em modalidades específicas, a relação ou porcentagem de sais de estrôncio para sais de cálcio varia de 25% a 100%. Em certas modalidades, as composições da invenção podem também compreender uma proteína ou combinação de proteínas selecionadas a partir do grupo que consiste em proteínas morfogênicas ósseas, paratormônio

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9/38 (PTH), calcitonina, bisfosfonatos, fator de crescimento epidérmico, fatores de crescimento semelhantes à insulina e fatores de crescimento TGF. Quaisquer proteínas que tem um efeito promotor de ósseo ou de aumento ósseo podem ser usadas. Ainda em outras modalidades, o composto contendo estrôncio é feito adicionando-se estrôncio em um vidro bioativo para produzir um material de vidro bioativo contendo estrôncio.

[0024] Em certas outras modalidades, a composição é aquela em que a gelificação da composição ocorre ao misturar os vários componentes.

[0025] Em modalidades preferidas, os métodos da invenção compreendem tratar o osso infectado, ferido ou deficiente em um indivíduo vivo injetando-se no osso esponjoso do referido indivíduo uma composição que compreende uma composição contendo estrôncio da presente invenção. Vantajosamente, a injeção de uma tal composição no osso esponjoso causas uma taxa de cicatrização que é mais rápida do que a observada com a aplicação de uma composição semelhante que não contém estrôncio.

[0026] Também considerado aqui é um método de reparar um osso que tem um defeito que compreende: (a) fixar o osso mecanicamente ou porções do mesmo; e (b) preencher o defeito com uma composição da invenção em uma quantidade em que o efeito causa o reparo do referido defeito. Em modalidades exemplares, o defeito é uma fratura óssea e o referido reparo é a cicatrização do osso da referida fratura. Em aspectos específicos da invenção, a aplicação da referida composição causa uma taxa de cicatrização que é mais rápida do que a observada na ausência da aplicação da referida composição. Preferivelmente, a aplicação da referida composição causa uma taxa de cicatrização que é mais rápida do que a observada com a aplicação de uma composição semelhante que não contém estrôncio.

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10/38 [0027] Também considerado é um método de promover o novo crescimento ósseo no sítio de um defeito ósseo compreendendo contatar o referido sítio de defeito com uma composição da invenção. Preferivelmente, a taxa do referido crescimento ósseo é mais rápida na presença de estrôncio na referida composição quando comparada ao crescimento ósseo visto na presença de uma composição semelhante que não contém estrôncio.

Breve Descrição dos Desenhos [0028] Figura 1 mostra a proliferação celular para células humanas semelhantes a osteoblasto humano (SaOS-2) crescidas em coágulos contendo estrôncio. A anotação usada é Ca/Sr. Os valores citados são as concentrações no coágulo final. Para obter estas concentrações no coágulo final, a concentração no tampão é dobrada.

[0029] Figura 2 mostra um ensaio de DNA para células semelhantes a osteoblasto humanas (SaOS-2) crescidas em coágulos contendo estrôncio. A anotação usada é Ca/Sr. Os valores citados são as concentrações no tampão. Este valor é dividido no coágulo final.

[0030] Figura 3 mostra a produção de fosfatase alcalina durante 30 minutos para células semelhantes a osteoblasto humanas (SaOS2) crescidas em coágulos contendo estrôncio. Os valores citados são as concentrações no coágulo final. Para alcançar isto, a concentração no tampão é dobrada.

[0031] Figura 4 mostra a análise turbidimétrica de coágulos, onde o tampão de trombina é compreendido em uma mistura de cálcio, uma de cálcio/estrôncio ou estrôncio sozinho. A anotação usada é Ca/Sr. Os valores citados são as concentrações no tampão. Este valor é dividido no coágulo final.

[0032] Figura 5 mostra a porcentagem de sobrevivência (visto que medida por ensaio de proliferação de MTS) para coágulos crescidos em meios contendo 12,5 mM de Sr ou Ca.

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11/38 [0033] Figura 6 mostra o manchamento de células NHOst cultivadas em coágulos de fibrina e coágulos de fibrina contendo partículas de estrôncio. Manchamento de células NHOst Vivas (painel esquerda) Mortas (painel direito) manchando de cultivadas em coágulos de fibrina durante 14 dias (painel de Topo) ou coágulos de fibrina contendo partículas de estrôncio (painel de Base).

[0034] Figura 7 mostra seções transversais de coágulos de fibrina cultivados com células NHOst. Manchas de células verde (Vivas) e vermelho (Mortas). Coágulo de fibrina no topo. Coágulo de fibrina na base contendo partículas.

[0035] Figura 8 mostra uma representação gráfica de orifícios de perfuração completamente fechados (ambos os lados estão fechados). [0036] Figura 9 mostra o mCT de um côndilo femoral de coelho na presença de fibrina no material.

[0037] Figura 10 mostra a representação gráfica da formação óssea (avaliação: 1: baixa; 2: média; 3: formação óssea alta).

[0038] Figura 11 mostra o mCT de um côndilo femoral de coelho com 80% de material de Sr.

[0039] Figura 12 mostra uma seção fina manchada histológica de um defeito de côndilo femoral de coelho tratado com Fibrina.

[0040] Figura 13 mostra uma seção fina manchada histológica de um defeito de côndilo femoral de coelho tratado com Sr a 80% em um coágulo de fibrina.

[0041] Figura 14 mostra a Influência de SrCk na bioatividade de PTH.

Descrição Detalhada da Invenção [0042] A presente invenção é direcionada a uma composição de trombina, fibrina e/ou estrôncio em uma forma insolúvel ou solúvel e/ou um particulado inorgânico que pode ou não pode conter estrôncio e/ou um plasticizante de fibrina para uso na cicatrização óssea e regePetição 870180036296, de 03/05/2018, pág. 15/51

12/38 neração óssea. A alteração das quantidades de trombina, ou do teor de particulado inorgânico, permite o controle do período de gelificação como a aplicação ou tecido-alvo impõe. Um plasticizante de fibrina ou agente modificador pode ser usado para realçar as propriedades mecânicas da formulação ou também retardar o tempo de coagulação. Exemplos de plasticizantes incluem agentes de contraste contendo iodo tais como diatrizoato, iodecol, iodixanol, iofratol, iogulamida, ioexol, iomeprol, iopamidol, iopromida, iotrol, ioversol, ioxagulato e metrizamida e misturas dos mesmos e álcoois polivalentes.

[0043] A composição pode ser liberada como um líquido antes de ou durante a fase de gelificação ou como um gel pré-formado nos defeitos do tecido usando uma técnica minimamente invasiva. Pretendese que a formulação seja reabsorvida e substituída com o tecido durante o processo de cicatrização.

[0044] A solução de fibrinogênio é uma solução aquosa com fibrinogênio que varia de 5 a 200 mg/ml, preferivelmente na faixa de 50 a 100 mg/ml. A solução de fibrinogênio pode da mesma forma incluir proteínas matriz extracelulares (por exemplo, fibronectina, proteínas associadas celulares, outras proteínas derivadas de plasma [por exemplo, fator de coagulação sanguínea XIII e proteases]. A solução de fibrinogênio pode da mesma forma incluir monômero de fibrina, derivados e fibrina I.

[0045] O componente de trombina, pode também compreender compostos adicionais conhecidos na técnica bem como o composto de estrôncio. Não há limitação específica a respeito da quantidade de trombina usada. Em um exemplo da presente invenção, a quantidade de trombina no referido componente de trombina (b) é tal que é pelo menos cerca de 1 IU/ml na composição coagulada final até a quantidade de 30 IU/ml.

[0046] No lugar de ou além de trombina da presente invenção, ouPetição 870180036296, de 03/05/2018, pág. 16/51

13/38 tro agente de indução de gelificação ou de indução de coágulo para componente (a), tal como protamina, veneno de cobra, transglutaminases, FXIIa, um sistema de tamponamento alcalino fisiologicamente aceitável.

[0047] O tampão de trombina é uma solução aquosa contendo entre outras substâncias um cátion divalente. A concentração de cátion divalente no tampão pode variar de 5 a 50 mm. Preferivelmente, os cátions divalentes são escolhidos dos grupos cálcio e estrôncio e a relação pode ser de 0:1 a 0,975:0,025. Os íons de estrôncio divalentes podem ser adicionados na forma de cloreto de estrôncio ou qualquer outra sal de estrôncio solúvel em água tal como ranelato de estrôncio, glutamato de estrôncio, aspartato de estrôncio, malonato de estrôncio, maleato de estrôncio, ascorbato de estrôncio, treonato de estrôncio, lactato de estrôncio, piruvato de estrôncio, alfa-5 cetoglutarato de estrôncio ou sucinato de estrôncio. O tampão de trombina pode da mesma forma conter coligantes para um alvo molecular recentemente identificado de estrôncio (a G-protein-coupled receptor calciumsensing receptor, Pi e outro, J. Biol. Chem. 2005). Coligantes são selecionados dos grupos calcimiméticos, osteocalcina e aminoácidos. Preferivelmente, L-arginina, arginomiméticos ou análogos de arginina. O tampão de trombina contendo estrôncio pode da mesma forma ser usado junto com partículas inorgânicas contendo estrôncio.

[0048] O componente de particulado tem um diâmetro de tamanho de partícula na faixa de nano a menos que 3000 mm. e deve ser insolúvel na hora de aplicação. Preferivelmente, o tamanho de partícula está entre 100 nanômetros a 50 milímetros e mais preferivelmente entre 0,5mm a 50 mm. As partículas podem ser qualquer quelato de estrôncio que é insolúvel na hora da aplicação ou sais de cálcio substituídos por estrôncio que são da mesma forma insolúveis na hora da aplicação. O sal de cálcio para substituição pode ser selecionado a

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14/38 partir do grupo que consiste em fosfato de cálcio, fosfato de tricálcio, fosfato de alfa-tricálcio, fosfato de beta-tricálcio, polimorfos de fosfato de cálcio, hidroxiapatita, carbonato de cálcio, sulfato de cálcio e combinações dos mesmos. A substituição de estrôncio de cálcio das partículas pode variar de 0,25 a 100%. A mistura para obter o gel final pode ser obtida sobre uma faixa de temperaturas de 18 a 37°C, preferivelmente 37°C.

[0049] A solução de fibrinogênio é uma solução aquosa com fibrinogênio que varia de 5 a 200 mg/ml, preferivelmente na faixa de 50 a 100 mg/ml. A solução de fibrinogênio pode da mesma forma incluir monômero de fibrina, derivado e fibrina I. A solução de fibrinogênio pode da mesma forma incluir proteínas matriz extracelulares, por exemplo, fibronectina, proteínas associadas celulares, e outras proteínas derivadas de plasma tais como fator de coagulação sanguínea XIII (FXIII) e proteases.

[0050] A solução de trombina é uma solução aquosa com uma concentração final mínima de 0,1 IU/ml na composição coagulada final (ou gelificada). Esta solução pode da mesma forma ser tamponada e conter aminoácidos, proteínas ou aditivos (por exemplo, L-arginina, manitol e albumina).

[0051] O tampão de trombina é uma solução aquosa contendo entre outras substâncias um cátion divalente. A concentração de cátion divalente no tampão pode variar de 5 a 50 mm. Preferivelmente, os cátions divalentes são escolhidos dos grupos cálcio e estrôncio e a relação molar (pode ser de 1:0 a 0,975:0,025 de cálcio a estrôncio). [0052] As partículas podem ser qualquer quelato de estrôncio que é insolúvel na hora da aplicação ou sais de cálcio substituídos por estrôncio que são da mesma forma insolúveis na hora da aplicação. O sal de cálcio para substituição pode ser fosfato de cálcio, fosfato de tricálcio, fosfato de alfa-tricálcio, fosfato de beta-tricálcio, um polimorfo

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15/38 de fosfato de cálcio, hidroxiapatita, carbonato de cálcio, sulfato de cálcio e combinações dos mesmos. A substituição de estrôncio das partículas pode variar de 0,25 a 100% como uma relação das partículas substituídas.

[0053] O teor de partícula na composição varia de 2 a 100%, preferivelmente 30 a 50% (peso/volume) de proteínas coaguláveis. O componente de particulado tem um diâmetro de tamanho de partícula na faixa de submícron a menos do que 3000 mm, como requer a aplicação. A homogeneização para obter o gel final pode ser obtida em uma faixa de temperaturas de 18 a 37°C, preferivelm ente 37°C.

[0054] A eficácia das composições da presente invenção para ajudar no reparo do osso pode ser também melhorada incorporando-se as moléculas bioativas. Estas podem ser ligadas quimicamente à matriz, adsorvidas em componente particulado ou capturados na matriz de fibrina como uma molécula livre ou como um pó de fármaco. Estas moléculas podem ser usadas para estimular o metabolismo ósseo (anabolismo e ou catabolismo). Moléculas adequadas que foram identificadas incluem proteínas morfogênicas do osso (BMP), paratormônio (PTH), calcitonina, bisfosfonatos, fator de crescimento epidérmico, fatores de crescimento semelhantes à insulina e os fatores de crescimento da super familiares de TGF. Moléculas adequadas podem da mesma forma incluir outros fatores não relacionados ao ciclo de anabolismo/catabolismo de osso mas relacionados aos processos fisiológicos que ocorrem em paralelo à remodelagem/reparo do osso tal como estimuladores angiogênicos (fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e fatores de crescimento derivados de plaqueta [PDGFs] pode da mesma forma ser incorporados. Isto é de interesse particular visto que o modo de ação do estrôncio é acreditado que está separado dos agentes anabólicos 1,25(OH)2 vitamina D e paratireoide.

[0055] Um plasticizante pode da mesma forma ser misturado com

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16/38 a fibrina ou trombina para realçar as propriedades mecânicas da formulação ou para também retardar o tempo de coagulação. Exemplos de plasticizantes são selecionados a partir do grupo que consiste em agentes de contraste contendo iodo solúvel em água, polietileno glicóis, álcoois polivalentes tais como glicerol, mono, di, tri e polissacarídeos, e qualquer combinação dos mesmos. Meios de contraste contendo iodo adequados são detalhados no número de pedido de patente U.S. US 20050119746 (Lidgren e Nilson, 2004) que está por este meio incorporado por referência, exemplos dos quais são diatrizoato (meglumina), iodecol, iodixanol, iofratol, iogulamida, ioexol, iomeprol, iopamidol, iopromida, iotrol, ioversol, ioxaglato e metrizamida. Preferivelmente, o agente de contraste é não iônico, tem uma baixa osmolaridade e permite a montagem de fibrina ocorrer, por exemplo, iodixanol.

[0056] As composições da presente invenção podem ser usadas em métodos de cicatrizaçãos de osso úteis e em kits para uso em tais métodos. É considerado que a composição pode ser usada para promover o crescimento de osso ou especialmente a cicatrização em ossos longos. Especificamente, a presente invenção se refere a uma composição de reparo de osso contendo trombina, fibrina e estrôncio. A presença de estrôncio na composição leva à cicatrização do osso realçada e ou a geração de osso quando comparada a uma tal composição que não contém estrôncio.

[0057] As composições da invenção podem ser usadas no reparo e regeneração de ossos longos como o fêmur, tíbia, úmero, rádio ulna e similares.

[0058] O uso das composições da presente invenção será possível para restabelecer ou restabelecer parcialmente a competência mecânica, arquitetônica e estrutural em ossos que têm defeitos, enquanto fornecendo as áreas de superfície estruturais, que podem servir como

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17/38 substratos apropriados para o processo biológico que regula a regeneração e cicatrização óssea.

[0059] Como mostrado nos exemplos, a composição da invenção acelera os processos celulares e biológicos envolvidos em reparo do osso.

[0060] Como usado aqui a seguir, a frase osso longo se refere a um osso que tem um comprimento, que é pelo menos duas vezes mais longo que o diâmetro. Tipicamente, a frase se refere aos ossos das extremidades, isto é, tíbia, fíbula, fêmur, úmero, rádio, ulna, carpais, metacarpais, falanges, tarsais e metatarsais. Mais especificamente, a frase osso longo, como aqui usada, se refere aos quatro ossos principais das extremidades, isto é, a tíbia, o fêmur, o úmero e o rádio.

[0061] O defeito ósseo que pode ser curado por uso das composições da presente invenção pode ser alguma anormalidade no osso, incluindo, mas não limitada a, uma lacuna, uma cavidade, uma descontinuidade conformacional, uma fratura ou qualquer mudança estrutural produzida por dano, osteotomia, cirurgia, fraturas, cicatrização malformada, fraturas de não-união, deformações esqueléticas, envelhecimento, ou doença. As composições da presente invenção fornecem potencial terapêutico significante. Quando o osso esponjoso está doente, por exemplo, por causa de osteoporose, necrose avascular, ou câncer, o osso cortical circundante fica mais propenso ao colapso ou fratura por compressão. Isto é porque o osso esponjoso já não fornece apoio interior para o osso cortical circundante. As composições da invenção podem ser usadas no fortalecimento do osso em condições tal como osteoporose, osteonecrose ou necrose avascular bem como outra doença óssea que envolve o osso doente, osso com cicatrização inferior ou osso fraturado por vários traumas.

[0062] Outro aspecto da invenção fornece um kit para reparar um

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18/38 osso que tem um defeito. O kit inclui um dispositivo de fixação mecânico para fixar o osso ou porções do mesmo e composições da presente invenção. Exemplos de um dispositivo de fixação incluem, mas não são limitados a, flanges, varas, barras, arames, grampos, parafusos, suturas bem como vários aparelhos, mangas e similares, que são dispositivos de fixação tipicamente externos. Consequentemente, o kit da presente invenção preferivelmente inclui um dispositivo de fixação mecânico externo.

[0063] Outro aspecto da presente invenção é fornecer um método de tratar defeitos ósseos, tais como fraturas, lacunas de cavidades e similares compreendendo contatá-los com uma composição da presente invenção. Em algumas modalidades, o método pode envolver fixar mecanicamente o osso ou porções do mesmo antes de, ou depois de uma etapa de contatar o defeito com uma composição da presente invenção.

[0064] Vantajosamente, as composições da presente invenção podem ser usadas como composições injetáveis que são liberadas em um defeito ósseo (osso) ou lacuna ou no espaço da medula do tecido ósseo trabecular onde a composição substitui temporariamente a medula óssea, e/ou ajuda na nova formação óssea. As composições podem ser injetadas no tecido ósseo trabecular ou qualquer outro tecido ósseo usando técnicas bem-conhecidas por aqueles versados na arte. Tais técnicas exemplares e mecanismos para realizar tais técnicas são discutidos por exemplo, na Publicação de Patente U.S. N° 20080065091, Publicação de Patente U.S. N°. 20080058828, Publicação Patente U.S. N° 20070073307, Patentes U.S. N^os 4.969.888 e 5.108.404 entre outros (cada um destes documentos de patente está aqui incorporado por referência). Tipicamente, dispositivos de injeção semelhantes a uma pistola de calafetagem doméstica são usados para injetar as composições no osso. Um dispositivo de injeção de cimento

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19/38 ósseo típico tem um corpo em forma de pistola, que suporta um cimento ósseo contendo cartucho. Um gatilho aciona um aríete carregado de mola que força um volume de cimento ósseo em uma condição viscosa através de um bico adequado e no interior de um osso direcionado para tratamento. De acordo com os ensinos da Patente U.S. N^os 4.969.888 e 5.108.404, uma cavidade pode ser formada primeiro compactando-se o osso esponjoso dentro do osso, no qual o cimento ósseo é injetado.

[0065] Uma vantagem adicionada de incorporação de Sr nas composições injetáveis da invenção é que permite o processo de cicatrização e liberação ser monitorado usando uma técnica tal como fluoroscopia devido às propriedades conhecidas de estrôncio como um rádioopacificador. Como tal, o uso de Sr nas composições da presente invenção fornece uma função terapêutica e diagnóstica e não simplesmente apenas uma função de imageamento.

[0066] As composições da presente invenção podem ser usadas na forma de um gel injetável, uma pasta injetável, uma pasta, pasta aderente, ou uma forma seca por congelamento reidratável forma. Como aqui usado, o termo gel se refere a uma substância parcialmente líquida, macia, espessa, semelhante à geléia. Um gel pode ser extrusado através de uma agulha de seringa de pelo menos 0,001 polegada (13 gauge). Pasta como usado no presente pedido se se refere a uma substância macia, úmida tendo uma consistência entre um líquido e um sólido. Uma pasta da presente invenção é menos sólida do que um betume e mais sólida que um gel, e em algumas modalidades pode ser injetável.

[0067] O termo pasta aderente se refere uma composição de reparo de tecido semelhante à argila/semelhante à massa da presente invenção. Durante a aplicação, a substância pode ser batida a substância ou misturada à consistência da massa, e moldada em uma forPetição 870180036296, de 03/05/2018, pág. 23/51

20/38 ma que aproxima-se perto do sítio de implante.

[0068] Injetável se refere à capacidade da presente invenção ser introduzida em um sítio de implante sob pressão (como por introdução usando uma seringa). Uma composição injetável da presente invenção pode, por exemplo, ser introduzida entre elementos ou em um espaço limitado in vivo (isto é, entre pedaços de osso ou na interface entre um dispositivo protético e osso, entre outros).

[0069] Seringa se refere a qualquer dispositivo que pode ser usado para injetar ou retirar composições de reparo de tecido fluível da presente invenção, incluindo certos géis e pastas, entre outros.

[0070] A composição é injetada em osso cortical ou osso trabecular de um indivíduo (preferivelmente, o indivíduo é um indivíduo humano, símio, ovino, bovino, equino, porcino). Osso cortical, como usado no presente pedido, se refere ao osso compacto da diáfise de um osso que cerca a cavidade medular. Osso cortical é uma estrutura altamente densa composta de filamentos de hélice tripla de fibra de colágeno, reforçada com hidroxiapatita. O osso cortical é uma estrutura composta e é o componente de suporte de carga primária de ossos longos no corpo humano. O componente de hidroxiapatita é responsável pela alta resistência compressiva do osso enquanto o componente de fibra de colágeno contribui em parte à resistência à tração e torsional. As composições da invenção podem ser introduzidas em tais partes ósseas para dar um efeito de cicatrização óssea ou de aumento benéfico.

[0071] O osso trabecular é de composição semelhante ao osso cortical e é o componente estrutural primário de osso esponjoso e se refere ao osso adulto que consiste em fibras de colágeno paralelas regularmente ordenadas mineralizadas organizadas diferentemente do que no osso lamelar da diáfise de ossos longos adulto. Osso esponjoso é geralmente encontrado na extremidade de ossos longos cercados

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21/38 por osso cortical. O osso esponjoso tem espículas que formam uma treliça, com interstícios preenchidos com medula óssea. Pode da mesma forma ser referido como um osso trabecular, ou osso esponjoso. Em modalidades preferidas, as composições da invenção são liberadas no osso trabecular.

[0072] Os métodos de fixação ósseo da invenção da mesma forma podem incluir a etapa de reformar o defeito antes da fixação do osso ou contato com a composição da invenção. Tal reforma ou realinhamento do osso pode ser realizada com, por exemplo, brocas ou afiadores ou qualquer outro dispositivo utilizável para reformar o defeito. [0073] O dispositivo usado para fixar o osso dependerá do tipo de defeito a ser reparado e do tipo e colocação do osso. Tipicamente, o dispositivo de fixação é um dispositivo de fixação externa. Preferivelmente, um dispositivo de fixação externa tal como, por exemplo, um aparelho de gesso, é o único dispositivo de fixação utilizado no método da presente invenção, acompanhado com uma injeção da composição da presente invenção. Entretanto, em algumas circunstâncias pode ser necessário empregar procedimentos cirúrgicos mais invasivos usando um dispositivo de fixação interna que podem ser utilizados também. [0074] O reparo pode ser monitorado e no tempo devido, o dispositivo empregado para fixar o osso pode ser removido. Regeneração óssea no sítio do defeito pode ser avaliada por raios X do tecido macio (7,5 mA; 0,5 segundo) tirados imediatamente depois da cirurgia e em determinados intervalos de tempo pós-cirurgia. A regeneração óssea em animais de teste pode da mesma forma ser determinado na terminação das experiências avaliando-se a morfologia geral, varredura por tomografia computadorizada (CT) (65-80 kV; 20 segundos) e varredura por CT tridimensional (3-D) (Marconi, M.times.8.000). Estudos histológicos podem ser realizados para determinar o manchamento do osso do tecido.

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22/38 [0075] Nos métodos da invenção, as composições podem da mesma forma ser combinadas com células que podem ser usadas no reparo do osso, tal como por exemplo, células osteoprogenitoras. Células osteoprogenitoras, como são conhecidas na técnica, incluem uma subpopulação osteogênica das células estromais da medula, caracterizadas como células formadoras de osso. As células osteoprogenitoras utilizadas pelo método da presente invenção podem incluir células formadoras de osso osteogênico de per si e/ou células tronco embrionárias que formam as células osteoprogenitoras. As células osteoprogenitoras podem ser isoladas usando procedimentos conhecidos. Tais células são preferivelmente de uma fonte autológica e incluem, por exemplo, células-tronco embrionárias humanas, células osteoprogenitoras humanas ou de murino, células derivadas de medula osteoprogenitoras humanas ou de murino, células derivadas embrionárias osteoprogenitoras humanas ou de murino e e células embrionárias humanas ou de murino. Estas células também servir como células que segregam fatores de crescimento, como descrito por Robinson e Nevo (2001), que são definidas aqui anteriormente.

[0076] A composição da presente invenção pode da mesma forma compreender vários agentes terapêuticos ativos, que podem incluem agentes promotores de crescimento ósseo, células osteoprogenitoras ou uma combinação dos mesmos. As composições podem incluir pelo menos um fármaco, tal como, uma vitamina, um antibiótico, um agente anti-inflamatório e similares.

[0077] Em certas modalidades preferidas, o estrôncio é incorporado em um sal contendo cálcio usando técnicas conhecidas por aqueles de experiência na técnica para preparar compostos de cálcio substituídos por estrôncio. Além disso, estrôncio pode ser incorporado em vidros bioativos que são convencionalmente usados no reparo do tecido. Um vidro bioativo é qualquer vidro que exibe características de bioaPetição 870180036296, de 03/05/2018, pág. 26/51

23/38 tividade, é tipicamente um sólido amorfo que não é intrinsecamente adesivo e que é capaz de formar uma ligação coesiva com tecido duro e macio quando exposto à ambientes in vivo e in vitro apropriados, tal como fluido corporal simulado ou tampões de trishidroximetilaminometano. Uma ligação coesiva é obtida desenvolvendo-se uma camada de superfície de apatita de hidroxicarbonato sobre o vidro bioativo através da liberação de espécies iônicas do material de biovidro em volume. Há numerosas aplicações para vidros bioativos no campo de tratamentos cirúrgicos e ortopédicos bem como em cirurgia dental e foram descritos, por exemplo, no Pedido Patente Européia 1 405 647 e Pedido de Patente Européia 1 655 042, bem como em pedidos Internacionais WO 96/21628, WO 91/17777, WO 91/12032 e Publicação de Patente U.S. número 20080066495 (cada qual incorporado aqui por referência).

Exemplos:

[0078] Em uma modalidade da invenção, o composto contendo estrôncio é usado como o íon divalente em um tampão de diluição de trombina. A solução de trombina é preparada usando o tampão de diluição. A solução de fibrinogênio e a solução de trombina contendo estrôncio são misturadas para formar um gel.

[0079] Em outra modalidade da invenção, o composto contendo estrôncio é adicionado à formulação como uma partícula de sal. As partículas e solução de trombina são misturadas para preparar a solução de trombina modificada. A solução de fibrinogênio e a solução de trombina modificada são misturadas para formar um gel.

Exemplo I: Composto Contendo Estrôncio Dissolvidos na Solução de

Tampão.

[0080] Uma série de tampões foi preparada em água destilada dobrada. Para estes tampões, o cátion divalente no tampão de trombina foi Ca ou uma mistura de Ca + Sr tal que a concentração de cátion foi

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24/38 mantida constante em 40 mM (veja tabela abaixo para cloreto de estrôncio). A trombina foi diluída em uma concentração de 4IU no tampão de trombina.

CaCl240mM	CaCL30mM	CaCL20mM	CaCl210mM	CaCl2 0mM
SrCl2 0mM	SrCl2 10mM	SrCl2 20mM	SrCl2 30mM	SrCl2 40mM
[0081] O	Fibrinogênio foi em seguida misturado com trombina em

uma relação de 1:1 (portanto, a concentração de estrôncio no coágulo gelatinoso é dividida). Para isto, 2 ml da solução de trombina podem ser transferidos em uma seringa de 5ml. 2 ml de fibrinogênio (Tisseel, Baxter, Clottable Protein, [fibrinogen e fibronectin] 72-110 mg/ml) foram transferidos para uma seringa de 5 ml separada. As seringas contendo o fibrinogênio e a trombina podem ser conectadas em qualquer estado do misturador da técnica com a finalidade de combinação. [0082] Para experiências in vitro, os coágulos foram preparados pipetando-se 150 mL da solução de fibrinogênio às cavidades de uma placa de 24 cavidades. A placa foi colocada em agitador de placa para garantir uma distribuição uniforme sobre a base da cavidade. 150 ml da solução de trombina foram em seguida adicionados à cavidade e a placa foi colocada em um agitador de placa para garantir os coágulos homogêneos. Uma linhagem celular semelhante ao osteoblasto humano (Sao-2) foi cultivada nos coágulos durante até 7 dias para observar se quaisquer diferenças na diferenciação celular/proliferação celular podem ser observadas. Figura 1 mostra os resultados para proliferação (Alamar Blue) quando Cloreto de Estrôncio (SrCl2) é adicionado ao tampão de diluição de trombina. Resultados semelhantes estão disponíveis para Acetato de Estrôncio (SrAc).

[0083] O ensaio com Alamar Blue é um ensaio metabólico e é frequentemente usado para medir a proliferação. A adição de estrôncio resultou na proliferação aumentada significante nestes coágulos quanPetição 870180036296, de 03/05/2018, pág. 28/51

25/38 do comparada a um coágulo normal com 20 mM de CaCl2. Um resultado semelhante também foi da mesma forma observado quando a proliferação foi quantificada usando uma mancha de DNA (Figura 2). Depois de 7 dias, diferenças claras podem ser observadas entre as células crescidas em coágulos contendo uma mistura de cálcio estrôncio ou apenas cálcio. Desse modo, concluímos que estrôncio tem um efeito positivo sobre a proliferação de osteoblasto como células SaOS2.

[0084] Estas experiências iniciais foram projetadas para indicar que diferenças na proliferação celular não fornecem tempo suficiente para investigar a diferenciação de osteoblasto. A enzima fosfatase alcalina é um indicador precoce de diferenciação porém realmente níveis não atingem o pico até cerca de 10 a 14 dias. Um resultado preliminar mostra um aumento na expressão de fosfatase alcalina nos coágulos contendo estrôncio (figura 3). No caso de acetato de estrôncio, estes valores parecem não ser significantes. Estas experiências estão sendo repetidas com um período investigativo de 14 dias.

[0085] Além da observação de estudos celulares, análise turbidimétrica foi realizada para examinar se a estrutura de coágulo foi alterada como resultado do estrôncio (figura 4). A turvação do coágulo é diretamente proporcional a área de perfil média das fibras, portanto, quanto mais turvo o coágulo, maior o diâmetro da fibra.

[0086] Os dados da turbidimetria na figura 4 mostra que há pouquíssima diferença na cinética e absorvência para coágulos contendo estrôncio em comparação aos coágulos contendo cálcio. Isto pode ser explicado por observações que cálcio e estrôncio são capazes de ocupar sítios de ligação semelhantes, em particular o sítio de ligação FXIII.

[0087] Para as experiências iniciais, células foram semeadas na superfície dos coágulos. Um das razões para escolher este método de

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26/38 semeadura é que alguns tipos de célula quando semeadas dentro dos coágulos sofrem em grande parte de morte celular e há migração das células à superfície do coágulo. Uma possível explicação para este efeito pode ser explicada quando as células semelhantes a osteoblasto são cultivadas em um meio suplementado com CaCl2. Figura 5 mostra o resultado da cultura de célula SaOS-2 em plástico de cultura de tecido na presença de CaCl2 a 12,5 mM. Morte celular (visto que medida por um ensaio de MTS) ocorre para as células cultivadas na presença do cloreto de cálcio. Isto ocorre dentro das primeiras 24 horas da cultura celular. Em comparação, há apenas uma redução leve na proliferação de células cultivadas na presença de compostos contendo estrôncio. É importante mostrar que algumas células têm uma exigência para cálcio superior isto é, fibroblastos e ceratinócitos, e desse modo não afetada pela concentração de cálcio do coágulo.

Exemplo 2:

Nanopartículas de Fosfato de Cálcio Dopadas com Estrôncio/ Fibrina.

[0088] Trombina foi diluída em uma concentração de 4 IU no tampão de trombina. O fibrinogênio foi misturado com trombina em uma relação de 1:1. Para isto, 2 ml da solução de trombina podem ser transferidos em uma seringa de 5ml. 2 ml de fibrinogênio (Tisseel, Baxter, Clottable Protein, [fibrinogen e fibronectin] 72 a 110 mg/ml) foram transferidos em uma seringa de 5ml separada. As partículas (nanopartículas menores que 1 mm) são incorporadas como um peso em percentual do volume de coágulo final ((p/v). Estes são pesados e colocados em outra seringa de 5 ml.

[0089] As seringas contendo as partículas e a trombina são conectadas por um adaptador Luer e a trombina e partículas homogeneizadas transferindo-se os teores da seringa para a seringa. As seringas contendo a trombina/partículas e o fibrinogênio são conectadas por um adaptador Luer e os teores homogeneizados. O material permanece

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27/38 líquido durante aproximadamente 30 segundos durante este tempo ele pode ser injetado no defeito.

[0090] Para experiências in vitro, os coágulos são preparados pipetando-se 150 mL da solução de fibrinogênio às cavidades de uma placa de 24 cavidades. As partículas (nanopartículas menores que 1 mL) são adicionadas como peso em percentual do volume de coágulo final (p/v). A placa é colocada em agitador de placa para garantir uma distribuição uniforme sobre a base da cavidade. 150 mL da solução de trombina são em seguida adicionados à cavidade e o placa colocada em um agitador de placa para garantir coágulos homogêneos. Nos estudos preliminares, células semelhantes a osteoblasto humano (SaOS2 ou NHOst) foram cultivadas nos coágulos durante até 14 dias para observar se qualquer diferença na proliferação celular, diferenciação celular pode ser observada.

[0091] Análise qualitativa para células semeadas nos coágulos contendo partícula mostra boa biocompatibilidade, quando comparada a coágulos de fibrina normais (figura 6). Embora não quantificado, parece que as células nos coágulos de fibrina sem partículas são mais arredondadas na morfologia, enquanto aquelas nos coágulos contendo partícula são mais espalhadas. Evidência adicional disto pode ser vista em seções transversais dos coágulos (figura 7). Para isto, as células foram semeadas nos coágulos. Depois de alguns dias as células nos coágulos de fibrina migraram-se para a superfície do coágulo. Em comparação, as células nos coágulos contendo partículas permaneceram nos coágulos e espalhadas mostrando-se uma morfologia favorável.

Exemplo 3:

Uso de Hidroxiapatita Dopada com Estrôncio Em Modelo de Defeito de

Côndilo Femoral de Coelho.

[0092] Os estudos descritos acima sugerem que estrôncio estimuPetição 870180036296, de 03/05/2018, pág. 31/51

28/38 la a formação óssea e ao mesmo tempo reprime a reabsorção óssea. Estudos anteriores investigaram o efeito de SrCl2 em células semelhantes a osteoblasto e em osteoblastos primários. No curso da tentativa de identificar uma formulação que pode ser usada no aumento vertebral, uma hidroxil apatita modificada que foi dopada com estrôncio, foi testada em um modelo de defeito de côndilo femoral de coelho para avaliar o potencial de estrôncio para estimular a formação óssea. Hidroxil apatita de cálcio pode ser produzida na bancada agitando-se o nitrato de cálcio e fosfato de amônio juntamente em um valor de pH alto (ajustado com hidróxido de amônio). O precipitado resultante pode ser centrifugado, lavado, secado e calcinado para obter uma hidroxil apatita como substância. Combinando-se nitrato de cálcio com nitrato de estrôncio na porcentagem respectiva de substituição, é possível produzir partículas semelhantes à hidroxil apatita de estrôncio-cálcio que podem ser injetadas juntamente com fibrina em um defeito ósseo. [0093] Este exemplo mostra dados que mostram que partículas semelhantes à hidroxil apatita de cálcio substituída por estrôncio estimulam a nova formação óssea melhor do que fibrina sozinha ou partículas semelhantes à hidroxil apatita de cálcio puras. Estes resultados fornecem a confirmação in vivo dos dados obtidos durante a cultura celular preliminar.

Materiais e Métodos:

[0094] Os seguintes reagentes químicos foram usados nos estudos descritos no exemplo presente. Tetra-hidrato de nitrato de cálcio; 99% A.C.S.reagent [Sigma-Aldrich; 237124-500G; 30 FW: 236.15]; Nitrato de estrôncio p.A. >99% [Fluka; 85899 500g; Lot&Filling Code: 1086321, 53706181; FW: 211.63]; Fosfato de amônio bifásico p.A. [Riedel-de Haèn; 30402 500g; FW: 132.06]; Hidróxido de amônio [Sigma-Aldrich, 318612-2L; grupo N° 11103PD; FW: 35.05; 5N em H20]; EtOh 96%; Fibrinkleber [Baxter AG; Fibrinkleber TIM 3;

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08P6004H; 5 ml; 1500434]; Trombina [Baxter AG; B205553 thromb. SD TIM 5; 500IE; US 5ml]; Diidrato de cloreto de cálcio (min. 99%) [Sigma; C7902-1KG; grupo N° 044K0160]; e Cloreto de sódio [Merck, 1.06404.1000 1kg; Charge/Lote: K38062004 745; FW: 58.44.

[0095] As experiências empregaram várias soluções como segue: CaCl2+200mM de NaCl a 40mM: CaCl2 + 2,92g de NaCl a 1,47 g em 250ml de ddH2Ü; trombina liofilizada - reconstituída em 5ml de CaCl2+200mM de NaCl a 40mM e fibrinogênio liofilizado - reconstituído em 5ml de 3000 KIE/ml de Aprotinina.

[0096] Experiências foram realizada em 4 grupos de testes com 6 joelhos de coelho cada qual como segue:

Grupo 1. fibrina + trombina (8IU/ml de concentração final) Grupo 2. fibrina + trombina (8IU/ml de concentração final) +

Ca a 100% (0% de substituição de Sr)

Grupo 3. fibrina + trombina (8IU/ml de concentração final) +

Ca a 75% (25% de substituição de Sr)

Grupo 4. fibrina + trombina (8IU/ml de concentração final) +

Ca a 20% (80% de substituição de Sr).

Preparação de Materiais Teste:

[0097] Fibrinogênio foi reconstituído e aliquotado em seringas de 1 ml [Braun; omifix - 1ml; Luer] com 0,5ml de fibrinogênio por seringa. Trombina foi reconstituída e diluída com CaCb+200mM de NaCl a 40mM para 16 IU/ml. Isto foi da mesma forma aliquotado em seringas de 1ml, 0,5ml por seringa.

[0098] Os pós de hidroxil apatita foram produzidos agitando-se juntamente volumes iguais de solução de nitrato de cálcio a 2M (ou de acordo com a porcentagem de substituição de estrôncio da mesma forma nitrato de estrôncio, a solução resultante tem que ter 2M no total) e de solução de fosfato de amônio a 1,2M. Na adição de fosfato de amônio ao nitrato de cálcio, uma substância pastosa precipitou-se.

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Uma adição subsequente de um volume igual de hidróxido de amônio elevou o pH do precipitado para 11 e tornou o líquido precipitado pastoso. Depois da agitação completa, a mistura foi centrifugada, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi lavado duas vezes com álcool (etanol a 96%) e uma vez com ddH2O. Entre as etapas de lavagem, o precipitado foi sempre refinado, centrifugado e o sobrenadante foi descartado. Depois disso, o precipitado foi secado a 60°C sob vácuo durante um dia, moído e calcinado durante 1 hora a 1100°C.

[0099] Depois do resfriamento, as partículas semelhantes à hidroxil apatita foram esterilizadas com calor e aliquotadas em seringas de 1 ml, 0,3 g por seringa.

Tratamento de Coelhos [00100] 12 Coelhos foram usados para realizar a experiência principal. Eles foram sedados e um orifício de passagem (diâmetro de 4,5 mm) foi perfurado nos côndilos femorais. Estes orifícios perfurados foram preenchidos cada qual com um dos materiais de teste jorrando o componente de trombina com partículas e a seguir com fibrinogênio, ou apenas trombina com fibrinogênio como um controle. O cone das seringas de 1 ml ajustou-se perfeitamente nos orifícios perfurados, assim uma aplicação direta foi possível.

[00101] Depois da injeção do material respectivo (randomizado para os 24 joelhos), a pele foi suturada e o coelho foi mantido monitorado durante as 8 semanas seguintes.

Análise Pós-Operação [00102] Depois das 8 semanas, os coelhos tornaram-se eutanizados e os joelhos foram analisados por mCT 10 e seções finas foram histologicamente manchadas.

Resultados [00103] Análise por mCT: Devido à opacidade alta das amostras de estrôncio foi difícil obter resultados quantitativos, assim a análise foi

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31/38 feita semiquantitativamente avaliando-se os quadros de uCT com o olho e os quantificando. Avaliação da formação óssea foi realizada em três níveis (1: baixo; 2: médio; 3: alto). A avaliação de um orifício de perfuração fechado foi feita dando-se um + para um orifício de perfuração fechado e um - para um orifício de perfuração não fechado. Os dados são mostrados nos gráficos nas figuras 8 a 14. Todos os gráficos são médias de animais tratados avaliáveis, considerando que os quadros de mCT são disparos repentinos.

[00104] Figura 8 mostra a representação gráfica de orifícios de perfuração completamente fechados (ambos os lados estão fechados). Nenhum dos defeitos de côndilo de coelho avaliados preenchidos de fibrina foi fechado em ambos os lados, consequentemente os lados do orifício de perfuração completamente fechados em zero percentual são vistos na figura 8. A substituição de 25% de Sr nas partículas produziu o valor mais alto de 80% dos lados do orifício de perfuração fechado. [00105] Na figura 9, há o mCT de um côndilo femoral de coelho na presença de fibrina. O defeito ainda é visível, mas nenhum material residual (fibrina) é visível; um lado do orifício de perfuração ainda está aberto.

[00106] A adição de estrôncio produz efeitos marcados. Figura 11 mostra mCT de um côndilo femoral de coelho em 80% de material de Sr. Enquanto o defeito ainda for visível, a maioria do defeito está cheio; o material (Sr80%) é fortemente visível. Nova formação óssea é claramente identificável e ambos os lados do orifício de perfuração estão fechados.

[00107] Os resultados anteriores foram da mesma forma confirmados usando estudos histológicos. Figura 12 mostra uma seção fina manchada histológica de um defeito de côndilo femoral de coelho tratado com fibrina. Nenhuma substância teste está presente. Consequentemente nenhum sinal de inflamação é encontrado. Apenas alPetição 870180036296, de 03/05/2018, pág. 35/51

32/38 gumas trabéculas de osso esponjoso, curtos são encontradas dentro do orifício de perfuração. Na abertura do canal da broca, a substância óssea recentemente formada é de forma esponjosa. Vasos sanguíneos são quase distribuídos regularmente dentro da cavidade de perfuração, mostrando apenas algumas manchas que são menos vascularizadas. Vários vasos sanguíneos maiores estão nos arredores próximos à substância óssea em um lado da cavidade de perfuração. [00108] Nas amostras tratadas com 80% de estrôncio no coágulo de fibrina (figura 13), 40 a 70% do canal de perfuração estão preenchidos com a substância teste. A substância teste está em todas as amostras de forma alongada dentro da cavidade de perfuração. Em uma amostra é mais granular, enquanto as outras duas exibem uma substância de teste mais espessa. Em 2 de 3 amostras, fibrina está presente como emplastros grandes perto da substância teste. Inflamações são poucas em uma amostra, e varia de 3 a 10 inflamações grandes nos outros espécimes. Em uma amostra, a substância teste entra em contato direto ao tecido ósseo recentemente construído, considerando que ficam mais distantemente nas outras duas. Duas amostras têm vasos sanguíneos regularmente distribuídos dentro da cavidade de perfuração, enquanto a terceira tem uma vascularização mais agrupada.

Discussão [00109] Os dados de mCT mostram que formulações contendo partículas semelhantes à hidroxil apatita substituídas com 25% de Sr ativam um fechamento de um orifício de perfuração melhor do que as outras substâncias testadas, induzem uma formação óssea comparável a 80% de partículas substituída, enquanto sendo menos densas. [00110] Apenas fibrina ativa menos formação óssea e os orifícios de perfuração são fechados apenas em um lado. Formulações que contêm partículas semelhantes à hidroxil apatita de cálcio puras não

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33/38 são tão densas, mas parecem não induzir a formação óssea ou um fechamento dos buracos de perfuração.

[00111] A formulação de concentração de estrôncio alta é muito densa, induz a nova formação óssea, mas não significativamente mais do que Sr a 25%. Além disso, o fechamento do orifício de perfuração é pior comparado ao Estrôncio em uma concentração mais baixa, desse modo mesmo as concentrações baixas de estrôncio são suficientes para induzir a formação óssea.

[00112] Resultados histológicos sugerem que a substituição de estrôncio em partículas semelhantes à hidroxil apatita de cálcio induz à nova formação óssea. A vascularização, uma condição prévia para a imigração de osteoblastos e consequentemente a nova formação óssea, foi detectada em todas as amostras.

Exemplo 4: Estrôncio tem um efeito sinergístico com PTH em células de osteoblasto.

[00113] O presente exemplo descreve estudos in vitro em células de osteossarcoma de rato para investigar se uma combinação de paratormônio (PTH) e Estrôncio (usado como SrCl2) na ativação de fatores de formação óssea semelhantes aumentou a produção de cAMP aumentada em osteoblastos. Os estudos descritos aqui mostram que SrCl2 tem um efeito sinergístico positivo com PTH na geração de cAMP em células de osteoblasto. Nenhum tal efeito foi observado para células tratadas com CaCl₂. Como cAMP é conhecido induzir a formação óssea anabólica, os dados apresentados aqui suportam uma conclusão que uma terapia de combinação de Sr e PTH levará a formação óssea aumentada in vivo.

Materiais e Métodos [00114] A linhagem celular de osteossarcoma UMR-106 (NewLab Bioquality AG, Erkrath, Germany) foi usada para realizar o bioensaio. [00115] Os ensaios descritos abaixo usaram os seguintes meios:

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34/38 [00116] Meio de cultura celular: DMEM (Sigma, D6546; incl. 4500mg/l de Glicose, Na-Piruvato, Na2C03, supl. com 0,584g/l de Lglutamina); de FCS a 10%; L-Glu a 2mM.

Meio de fome: DMEM (Sigma, D6546; incl. 4500mg/l de Glicose, Na-Piruvati, Na2C03, supl. com 0,584g/l de L-glutamina); 2mM de L-Glu;

Meio de SI: 10 ml de meio de fome; IBMX a 2 mM mM de SrCl2 em meio de fome: 19,6 ml 0,4 ml de SrCL a 1M CaCl2 a 20 mM em meio de fome: 19,6 de meio 0,4 ml de CaCl2 a 1M.

Cultura Celular [00117] Células UMR-106 foram semeadas em meio de crescimento em uma densidade de 30000 células/cm² e incubadas a 37°C / CO 2 a 8,0%. Depois de 24 horas, o meio foi trocado com qualquer meio fresco, meio contendo SrCL a 20 mM ou meio contendo CaCL a 20 mM. As células foram também incubadas a 37°C / CO 2 a 8,0% durante 24 horas. As células foram colhidas de acordo com o seguinte procedimento:

[00118] As células foram lavadas duas vezes com HBSS e descartadas da superfície usando 6 mL de tripsina/EDTA durante 3min em temperatura ambiente. A digestão de tripsina foi interrompida com 12mL de meio de crescimento. Depois da centrifugação (3min, 1000rpm, RT), as células foram ressuspensas em 12ml de meio de fome e contadas com uma contadora de célula CASY. A taxa de células mortas estava abaixo de 10% em toda experiência. As células foram re-suspensas em uma concentração final de 1,6 x 10⁶ células/ml em meio de fome. 50 (L de suspensão celular foram transferidos em cada cavidade de uma placa de 96 cavidades e incubadas durante 30min a 37°C, CO 2 a 8,0%.

Tratamento de células com 264 (g/ml de amostras de TGplPTH em

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35/38 solução de fibrinogênio [00119] Amostras foram diluídas em meio de fome recentemente preparado contendo IBMX a 2mM (meio de SI). Para preparação de meio de SI, 30 mL de matéria de IBMX a 0,67M em DMSO foram adicionados a 10 ml de meio de fome.

[00120] Todas as diluições de amostra foram preparadas com este meio para inibir a atividade de fosfodiesterase em células UMR-106 (Janik, P., 1980; Chasin M. e Harris, D.N., 1976). 50 ml de amostras diluídas (como indicado nos resultados) foram adicionados às células depois da incubação de 30 min a 37°C. Para produção de cAMP, células foram incubadas durante 1h a 37°C, 8,0% de CO 2. Cada concentração de amostra foi adicionada às células pelo menos em duplicata seguinte análise de cAMP em duplicata.

Imunoensaio de Enzima Biotrak de cAMP [00121] Preparação de reagente para EIA de cAMP. Tampão de ensaio, reagente de lise 1A/1B, reagente de lise 2A/2B, cAMP padrão, antissoro, conjugado de cAMP Peroxidase e tampão de lavagem foram preparados de acordo com o manual do fabricante (kit cAMP Biotrak, GE Healthcare).1M de solução de interrupção de ácido sulfúrico foi preparada por diluição de H2SO4 a 53ml (concentração = 18,76M) com ddH2O a 947ml.

[00122] Lise celular e diluição de cAMP. Para extração de cAMP, 100 mL de suspensão celular contendo PTH foram incubados com 25 mL (diluição final 1:5) de reagente de lise solvente 1A que faz parte do kit cAMP Biotrak EIA (GE Healthcare). Para lise total, as células foram agitadas durante 15min em 500rpm em temperatura ambiente. O cAMP extraído foi diluído 1:20 finalmente com reagente de lise 1B (kit cAMP Biotrak EIA) (1:1 de diluição na placa de ensaio (125 mL de reagente de lise 1B foram adicionados) seguido por 1:10 de diluição na placa ELISA (90 mL de reagente de lise 1B + 10 mL de suspensão celuPetição 870180036296, de 03/05/2018, pág. 39/51

36/38 lar diluída).

[00123] Preparação de padrão de funcionamento de cAMP. cAMP liofilizado-padrão para ensaio não-acetilado (kit cAMP Biotrak EIA) foi resolvido em tampão de ensaio para obter uma concentração de 32pmol/ml. Uma série de diluição dupla foi preparada variando de 32pmol/ml a 0,5pmol/ml.

[00124] Controle interno. 100 pL de cada diluição de amostra e padrão foram transferidos para a cavidade apropriada e analisados em duplicata. Adicionalmente, dois controles internos diferentes, o controle de ligação não-específica (NSB) e um controle zero (0) foram necessários para mostrar a especificidade de ELISA de cAMP e foram realizados como recomendado pelo fabricante (GE Healthcare).

[00125] Procedimento de Imunoensaio de Enzima. 100 pL de antissoro foram adicionados a todas as cavidades exceto o controle de NSB. Reação de anticorpo foi realizada durante 2h a 4°C com agitação. Depois da incubação com 50 pL de conjugado de cAMP peroxidase durante 1h a 4°C com agitação, todas as cavidades foram lavadas quatro vezes com 300 (l de tampão de lavagem. Finalmente, 150 pL de TMB (3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina) foram adicionados a cada cavidade e a reação de substrato foi permitida durante 10 min em temperatura ambiente. A reação foi interrompida adicionando-se 100 mL de H2SO4 a 1M e a densidade óptica foi imediatamente determinado em uma leitora de placa em 450nm.

[00126] Análise de dados. A densidade ótica foi determinada em uma leitor de placa (Synergy HT) medindo-se a absorvência das amostras em 450nm usando o software KC4. Correções antecedentes, cálculos de valores médios, desvio-padrão, coeficientes de variação e geração de curvas-padrão foram realizados em Microsoft Excel 2000. Sigmaplot 9.0 foi usado para ajustes de 4 parâmetros e cálculos de EC50. PLA1.2 (Stegmann Systemberatung) foi usado para Análise de

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Linha Paralela e detecção de Potência Relativa.

[00127] Porcentagem de conjugado de cAMP peroxidase ligado. O percentual do conjugado de cAMP peroxidase ligado para cada padrão e amostra foi calculado usando a seguinte relação:

B/BO (%) = (ODamostra - ODnsb) x 100 (ODzero - ODnsb)

OD amostra OD450 de amostra específica

OD zero OD450 apenas cAMP conjugada de peroxidase

OD nsb OD450 sem anticorpo de cAMP [00128] Curva-padrão. A curva-padrão de cAMP foi gerada plotando-se o percentual de B/B0 (eixo y) como uma função do log c(cAMP) (eixo x).

[00129] Concentração de cAMP das amostras. Considerando-se o fator de diluição (20x), as quantidades de cAMP produzidas foram calculadas usando os parâmetros (declive e interrupção) da curvapadrão.

[00130] Linearidade. O coeficiente de correlação da curva-padrão do cAMP ELISA (R² > 0,95) foi avaliado.

[00131] Preparação de Amostras para Análise de Bioensaio. Para análise, amostras foram diluídas em meio de fome contendo inibidor de fosfodiesterase IBMX a 2mM (meio SI) em uma concentração final de TGplPTH a 2400nM (13,2 ug/ml de TGplPTH). Para todas as amostras 150ul das seguintes 8 diluições seriais foram preparados e 50 mL foram adicionados diretamente às células (volume total em células: 100 mL). Para todas as amostras e todas as diluições, valores médios de OD450, desvio-padrão, concentrações de cAMP e coeficientes de variações foram calculados.

C(TGpIPTH)nM	Preparação	C(TGpIPTH)mg/ml
2400nM (1200nM em células)	veja acima	13,2

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C(TGpIPTH)nM	Preparação	C(TGpIPTH)mg/ml
1200nM (600nM em células)	1:1 em meio de diluição	6,6
600nM (300nM em células)	1:1 em meio de diluição	3,3
300nM (150nM em células)	1:1 em meio de diluição	1,65
150nM (75nM em células)	1:1 em meio de diluição	0,83
75nM (38nM em células)	1:1 em meio de diluição	0,42
38nM (19nM em células)	1:1 em meio de diluição	0,21
19nM (10nM em células)	1:1 em meio de diluição	0,1

[00132] Tabela de Diluição Serial. Para a geração de uma curva de dose-resposta, sete etapas de diluição serial uma-a-uma foram realizadas para cada amostra e todas as diluições foram analisadas em triplicata;

Resultados [00133] A influência de SrCl2 e CaCl2 na bioatividade de PTH foi monitorada independentemente em cinco experiências diferentes (figura 14). Estes estudos mostraram que uma pré-incubação de 24h de células UMR-106 com SrCl2 a 20mM antes do tratamento de TGplPTH leva à bioatividade aumentada duplamente, considerando que CaCl2 não mostra mudança na bioatividade de PTH (figura 14). Estes resultados indicam que estrôncio e PTH têm um efeito sinergístico sobre a produção de cAMP e suportam a conclusão que uma combinação de PTH e estrôncio leva à formação óssea anabólica in vivo.

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Claims (23)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende fibrinogênio, trombina e um composto contendo estrôncio para uso na cicatrização óssea ou crescimento ósseo;

   sendo que o composto contendo estrôncio é selecionado a partir do grupo consistindo em cloreto de estrôncio, ranelato de estrôncio, acetato de estrôncio, glutamato de estrôncio, aspartato de estrôncio, malonato de estrôncio, maleato de estrôncio, ascorbato de estrôncio, treonato de estrôncio, lactato de estrôncio, fosfato de estrôncio, apatitas de estrôncio, piruvato de estrôncio, alfa-cetoglutarato estrôncio e sucinato de estrôncio; e sendo que o composto contendo estrôncio está presente na composição a uma concentração de 5 a 50 mM.
2. 2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que está em uma forma de gel, pasta aderente, pasta ou líquido.
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um plasticizante.
4. 4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o plasticizante é um composto contendo iodo.
5. 5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o composto contendo iodo é selecionado a partir do grupo consistindo em diatrizoato, iodecol, iodixanol, iofratol, iogulamida, ioexol, iomeprol, iopamidol, iopromida, iotrol, ioversol, ioxagulato e metrizamida e misturas dos mesmos e álcoois polivalentes.
6. 6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que pode ser liberada, como um líquido, pasta ou um gel antes de ou durante a fase de gelificação ou como um gel pré-formado, pasta ou pasta aderente em defeitos de tecido.

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7. 7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6, caracterizada pelo fato de que contém uma ou mais proteína extracelular selecionada a partir do grupo que consiste em proteínas matriz extracelulares como fibronectina, proteínas associadas celulares, proteínas derivadas de plasma como fator de coagulação sanguínea XIII, proteases e inibidores de protease.
8. 8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, 6 e 7, caracterizada pelo fato de que é reabsorvida e substituída com tecido durante o processo de cicatrização.
9. 9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agente indutor de coagulação tal como protamina, veneno de cobra, transglutaminases, FXIIa, ou um sistema de tamponamento alcalino fisiologicamente aceitável.
10. 10. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o composto contendo estrôncio está em uma forma granular, microparticulada solúvel ou em um forma sólida.
11. 11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o composto contendo estrôncio é feito adicionando-se estrôncio em um composto contendo cálcio para produzir um material que compreende sais contendo cálcio e estrôncio.
12. 12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o referido composto contendo cálcio é um fosfato de cálcio.
13. 13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o fosfato de cálcio é selecionado a partir do grupo consistindo em fosfato de tricálcio, fosfato de alfa-tricálcio, fosfato de beta tricálcio, polimorfos de fosfato de cálcio, hidroxiapatita, carbonato de cálcio, sulfato de cálcio e combinações dos mesmos.
14. 14. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracPetição 870180036296, de 03/05/2018, pág. 44/51

    3/4 terizada pelo fato de que os compostos contendo estrôncio ou contendo cálcio apresentam uma dimensão de partícula que varia de 100 nanômetros a 50 milímetros.
15. 15. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que compostos contendo estrôncio ou contendo cálcio apresentam uma dimensão de partícula de 0,5 a 5 milímetros.
16. 16. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a porcentagem de sal de estrôncio para sais de cálcio na referida composição varia de 0,25% a 100% de sais contendo estrôncio.
17. 17. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o composto contendo estrôncio é feito adicionando-se estrôncio em um vidro bioativo para produzir um material de vidro bioativo contendo estrôncio.
18. 18. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, 6, 8, 10, 11, 17 e 18, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um coligante de estrôncio selecionado a partir do grupo que consiste em grupos calcimiméticos, osteocalcina, aminoácidos tais como L-arginina, e, arginomiméticos e análogos de arginina.
19. 19. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o plasticizante é um polietileno glicol, um álcool polivalente, glicerol, ou açúcar selecionado a partir do grupo que consiste em monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, polissacarídeos, e combinações dos mesmos.
20. 20. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 9 a 13 e 15 a 19, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em proteínas morfogênicas ósseas, paratormônio (PTH), calcitonina, bisfosfonatos, fator de crescimento epidérmico, fatores de crescimento semelhantes à insulina e fatores de crescimento TGF.

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21. 21. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a gelificação da composição acontece ao misturar os vários componentes.
22. 22. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que é uma composição injetável.
23. 23. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 9 a 13 e 15 a 19, caracterizada pelo fato de que compreende ainda paratormônio (PTH).

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    Proliferação

    Unidades de Absorvência

    E3 Day 1 S Day 3 □ Day7 -3- rt * rt ri- [T b - — rf

    CaCI2- 20lmM] CaCI2- 15[mM] CaCI2- 10(mM] CaCI2- 5[mM] - - - - SrCI2- 5[mM) SrCI2- 10[mM] SrCI2- 15[mM] SrCI2- 20[mM] SrCI2- 10[mM] Media

    Concentrações médias t^mMl