TWI556842B - 包含鍶化合物之纖維蛋白組合物 - Google Patents

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Description

包含鍶化合物之纖維蛋白組合物
本發明一般係關於用於骨癒合及骨再生之組合物且特別係關於黏彈性水凝膠或液體調配物，其包含纖維蛋白原、凝血酶及無機組份，該無機組份包含含鍶(Sr)化合物及/或含諸如鈣等另一可能金屬之化合物。可將含鍶化合物溶解於凝血酶溶液中或以晶態顆粒形式添加至組合物中。將組份混合後，發生膠凝作用而形成基質。
本申請案主張優先於在2007年4月23日申請之美國臨時專利申請案第60/925,716號之權利，且其全部內容明確地以引用方式併入本文中。
骨癒合及再生中之當前實踐係用骨移植物(自體移植物或異體移植物)、諸如聚甲基異丁烯酸酯(PMMA)等骨水泥、或可注射或可植入鈣鹽間隙填充劑來填充骨間隙。自體移植物係此應用之'金標準'選擇，但存在關於供體組織限制、創傷、感染及發病率之問題。對於異體移植物存在多種問題，包括疾病傳播風險及免疫原性。由於二次重建，自體移植物及異體移植物二者皆表現生物及機械特性缺失。正是該等限制促進了對骨移植物替代材料之關注(Parikh SN.2002；J.Postgrad.Med.48：142－148)。
PMMA係不可吸收性聚合材料。在其聚合期間，未反應單體、觸媒及低分子量寡聚物誘陷於聚合物中。該等化學物質可能自材料中浸出而導致局部細胞毒性及免疫反應。 PMMA聚合具有高放熱曲線，其可能導致熱壞死。此放熱曲線亦限制PMMA納入任何藥理學或化學治療藥劑之能力。PMMA自缺損洩漏可導致極嚴重併發症，包括相鄰結構之擠壓(需要進一步手術)及/或栓塞。
奈米級(10－9 m)之骨基質係由其中包埋鈣鹽之細微晶體之膠原纖維組成。為模擬骨之天然構成，通常使用鈣鹽來修復骨。存在多種基於鈣鹽之已知"可注射間隙填充劑"。使用鈣鹽水泥之一主要困難係其需要體內凝固，此通常係藉由化學反應來達成。因此諸如細胞及藥理性藥劑等納入填充劑中之任何生物製品皆可能被破壞。此外，若填充劑"流動性"過強，其可自缺損漏出至相鄰空間內而導致結構擠壓及可能的栓塞。自關節近端缺損洩漏可能會損害關節功能。
磷酸鈣(CP)鹽羥基磷灰石(HA，結構為Ca10 (PO4 )6 (OH)2 )係最接近骨之礦物相且可容易地在實驗臺上合成。亦可製備HA，其中使其他陽離子(例如鎂、鈉及鍶)或陰離子(氯離子、氟離子及碳酸根離子)取代入晶體中。與本發明相關者係在CP晶體中用鍶(Sr2＋ )離子取代鈣(Ca2十 )離子。鍶及鈣二者皆屬於鹼土金屬元素，且由於體內超過99%之總鈣及鍶皆位於骨內而彼此相似。鍶係經鑒定唯一與骨強度具有正相關性之元素，即骨之機械強度隨鍶含量之增加而增強。在一段時間前人們已知鍶具有有效治療效應。然而，文獻中已表明由於正常穩定Sr2＋ (84 Sr、86 Sr、87 Sr及88 Sr)與其放射性同位素(85 Sr、86 mSr、87 Sr及88 Sr)之混淆，人們可 能低估其治療潛力(Dahl等人，Bone；28(4)，第446－453頁)。近來，人們已揭示鍶之治療效應，且研究證實鍶鹽可刺激骨形成並抑制體外骨吸收(甚至在低劑量下)及體內骨吸收，如在齧齒動物及骨質疏鬆患者中藉由骨組織形態計量學所評估。Ferraro等人，1983；Calcif Tissue Int.35：258－60。
鍶之強效合成代謝效應及抗吸收效應已引導新抗骨質疏鬆藥物之研發。已顯示口服活性藥物(活性成份雷尼酸鍶(strontium ranelate))可降低脊椎骨折之風險且可提高骨礦物質密度。Meunier PJ等人，2004；N Engl J Med.350(5)：459－68。藥物係由與兩個鍶原子鍵接之一分子雷尼酸組成。因為雷尼酸基團在GI道中具有良好耐受性，所以選擇其作為載體。在腸中，自雷尼酸基團釋放鍶離子，此導致腸黏膜吸收鍶。吸收後，鍶表現對骨組織之強親和性，且被納入羥基磷灰石之最外層水合層中。少量鍶整合至骨晶中，其中鍶與鈣原子之比不超過1：10，以使得鍶之存在不改變晶體之形成及物理化學特性。已表明雷尼酸鍶係自解開骨形成與骨吸收偶聯之第一藥物。在體內，雷尼酸鍶可增強膠原及非膠原蛋白合成，促進前成骨細胞分化，抑制破骨細胞分化，減少破骨細胞功能且促使破骨細胞凋亡。在動物模型中，骨密度之增加與生物力學骨強度之增強密切相關。在大鼠模型中，雷尼酸鍶可增加骨質量並改良微結構及骨幾何結構，而導致增強骨耐力。在卵巢切除之大鼠(骨質疏鬆症模型)中，雷尼酸鍶可降低骨吸收但維持高骨 形成。雷尼酸鍶治療對骨強度之所有決定因素皆具有積極影響(骨質量、大小、微結構、及內在骨組織品質)。骨機械特性增強之特徵在於最大負荷之增加，亦在於斷裂能之顯著升高，此實質上係由於塑性應變能之升高而導致。Kendler,2006；Curr.Osteopor.Rep.4(1)：34－9；Marie,2006；Curr.Opin.Rheum.18增刊1：S1 1－5；Ammann,2006,Bone.38(2增刊1)：15－8。儘管仍未完全瞭解鍶之作用模式，但據信骨發生之增加與1,25(OH)2 維生素D之循環濃度中之變化或甲狀旁腺素效應中之變化無關。已顯示鍶在大量絕經後婦女中之所有位點皆具有抗骨折效力。Close等人，2006；Expert Opin Pharmacother 7(12)：1603－15。
其他研究者亦已研究呈含鍶骨水泥形式之鍶之局部施用，Wong,Chi－Tak,2004,"Osteoconduction and osseointegration of a strontium－containing hydroxyapatite bioactive bone cement： in vitro and in vivo investigations. Publisher： University of Hong Kong"(Pokfulam Road,Hong Kong)；Zhao等人，2004；J Biomed Mater Res B Appl Biomater.69(1)：79－86。非吸收性Sr－HA骨水泥主要係由含鍶羥基磷灰石(Sr－HA)填充劑及雙酚A二縮水甘油醚二甲基丙烯酸酯(BIS－GMA)樹脂組成。有人提出該材料可用於椎體成形術，因為其可藉由注射來遞送且具有較PMMA更佳之物理/機械特性。已證實含鍶羥基磷灰石(Sr－HA)骨水泥在體外及體內兩種環境中皆具有生物活性。在體外，對於細胞黏附(SaOS－2)及骨礦化作用其似乎較未經摻雜之羥基磷灰石(HA)骨水泥更有效。 在體內，Sr－HA骨水泥與天然骨結合。
在美國專利第5,736,132號及第5,549,904號(二者皆係以引用方式併入本文中)中，據闡述在約7.0至約8.5之pH下補加黏連組織黏合劑之轉麩胺醯胺酶較佳以約0.5 mM至約100 mM之量含有諸如鈣及鍶等二價金屬離子。據聲稱，補加黏合劑之轉麩胺醯胺酶可用於以下事件中之組織治療中：關節斷裂、軟骨缺損、表面軟骨缺損、全層缺損、剝脫性骨軟骨炎、半月板撕裂、韌帶撕裂、肌腱撕裂、肌肉損傷、肌腱連接損傷、軟骨移植、骨移植、韌帶移植、肌腱移植、軟骨移植、軟骨與骨移植、皮膚移植物固定及血管、血管補片移植及微血管吻合。患者之原發性病竈係存於黏合劑中之轉麩胺醯胺酶之納入。
相反，本發明不納入轉麩胺醯胺酶且意欲將本發明注射至骨缺損或間隙中以局部遞送鍶並幫助新骨形成。文獻數據顯示，元素鍶能刺激骨形成且同時抑制骨吸收。
本發明提供可注射至骨缺損或間隙中或注射至小樑骨組織之骨髓胺中之組合物，其中該組合物暫時替代骨髓以幫助新骨形成。數據顯示，元素鍶能刺激骨形成且同時抑制骨吸收。
在一態樣中，本發明提供用於骨癒合及骨生長之組合物，其中該組合物包含纖維蛋白、凝血酶及含鍶化合物。該組合物可另外包含含鈣化合物。該組合物較佳為可注射組合物，其係呈可注射凝膠、可注射油灰接合劑、可注射 糊劑或可注射液體形式。
在其他實施例中，組合物可包含一或多種增塑劑。在某些實施例中，增塑劑係含碘化合物。本文中用作增塑劑之實例性含碘化合物包括(但不限於)選自由以下組成之群之化合物：泛影酸鹽(diatrizoate)、碘地醇(iodecol)、碘克沙醇(iodixanol)、碘拉醇(iofratol)、碘格利醯胺(iogulamide)、碘海醇(iohexol)、碘美普爾(iomeprol)、碘帕醇(iopamidol)、碘普羅胺(iopromide)、碘曲侖(iotrol)、碘佛醇(ioversol)、碘格利酸鹽(ioxagulate)及甲泛葡胺(metrizamide)及其混合物及多元醇。在其他實施例中，增塑劑為聚乙二醇、多元醇、甘油、或選自由以下組成之群之糖：單醣、雙醣、參醣、多醣、及其組合。在其他實施例中，增塑效應尤其係藉由調節諸如氯化鈉及離液劑等低分子量化合物之組合物來達成。
組合物可呈凝膠或液體形式。在某些態樣中，可在膠凝階段之前或期間以液體或凝膠形式或以預形成凝膠形式將組合物遞送至組織缺損。
在本發明其他態樣中，組合物包含一或多種選自由以下組成之群之細胞外蛋白：諸如纖維網蛋白等基質蛋白、細胞結合蛋白或諸如血液凝固因子XIII及蛋白酶等血漿衍生蛋白。
在其他實施例中，組合物可另外包含凝血誘導劑，例如魚精蛋白、蛇毒液、轉麩胺醯胺酶、FXIIa、或生理上可接受之鹼性緩衝系統。
在具體實施例中，在癒合過程期間組合物可被再吸收且經組織替代。
用於本發明組合物中之含鍶化合物可為選自由以下組成之群之化合物：氯化鍶、雷尼酸鍶、乙酸鍶、麩胺酸鍶、天冬胺酸鍶、丙二酸鍶、馬來酸鍶、抗壞血酸鍶、蘇糖酸鍶、乳酸鍶、磷酸鍶、鍶磷灰石、丙酮酸鍶、α－酮戊二酸鍶及琥珀酸鍶。該等僅為實例性含鍶化合物且其他含鍶化合物可易於用於本發明組合物中。
組合物可為另外包含選自由以下類別組成之群之鍶共配體之組合物：擬鈣、骨鈣素、諸如L－精胺酸、及擬精胺酸及精胺酸類似物等胺基酸。
在本文所述組合物中，含鍶化合物及/或含鈣化合物可呈(微)顆粒或固體形式。在實例性實施例中，含鍶或含鈣(微)顆粒形式具有介於100奈米－500 μm之間之粒徑尺寸。在其他實施例中，含鍶或含鈣組份可採用多孔或非多孔形式，其尺寸介於(例如)0.5－50毫米之間。粒徑較佳介於0.5－5毫米之間。
在具體實施例中，含鈣化合物為磷酸鈣。磷酸鈣係選自由以下組成之群：磷酸三鈣、α－磷酸三鈣、β－磷酸三鈣、磷酸鈣之多晶型體、羥基磷灰石、碳酸鈣、硫酸鈣及其組合。
在某些實施例中，預計部分鈣可經鍶取代以提供鈣鹽與鍶鹽之混合物。
在具體實施例中，鍶鹽與鈣鹽之比或百分比介於.25%至 100%之間。在某些實施例中，本發明組合物可另外包含選自由以下組成之群之蛋白質或蛋白質之組合：骨形態發生蛋白、甲狀旁腺素(PTH)、降鈣素、雙膦酸鹽、表皮生長因子、胰島素樣生長因子及TGF生長因子。可使用任何具有骨生長促進效應或骨強化效應之蛋白質。在其他實施例中，含鍶化合物係藉由將鍶添加至生物活性玻璃中而產生含鍶生物活性玻璃材料來製備。
在某些其他實施例中，組合物係其中在混合各種組份後組合物發生膠凝作用之組合物。
在較佳實施例中，本發明方法包括在活個體中治療骨之患病、受傷或缺損，其係將包含本發明含鍶組合物之組合物注射至該個體之網狀質骨中來治療。有利地，將該組合物注射至個體之網狀質骨中所獲得之癒合速率比施用不含鍶之類似組合物時所觀察到之速率更快。
本文亦涵蓋修復具有缺損之骨之方法，其包括：(a)以機械方式固定骨或其部分；及(b)以修復該缺損有效量之本發明組合物填充缺損。在實例性實施例中，缺損係骨折且該修復係該骨折之骨癒合。在本發明具體態樣中，施用該組合物所獲得之癒合速率比不施用該組合物時所觀察到之速率更快。較佳地，施用該組合物所獲得之癒合速率比施用不含鍶之類似組合物時所觀察到之速率更快。
本發明亦涵蓋在骨缺損位點促進新骨生長之方法，其包括使該缺損位點與本發明組合物接觸。較佳地，與不含鍶之類似組合物所觀察到之骨生長相比，有鍶存在下之該組 合物之該骨生長速率較快。
本發明係關於凝血酶、纖維蛋白組合物及/或呈不可溶或可溶形式之鍶及/或可包含或不包含鍶及/或纖維蛋白增塑劑之無機顆粒，其用於骨癒合及骨再生。凝血酶或無機顆粒含量之量的改變使得可根據應用或靶組織要求來控制膠凝作用時段。纖維蛋白增塑劑或改性劑可用於增強調配物之機械特性或用於進一步延遲凝固時間。增塑劑之實例包括含碘造影劑，例如泛影酸鹽、碘地醇、碘克沙醇、碘拉醇、碘格利醯胺、碘海醇、碘美普爾、碘帕醇、碘普羅胺、碘曲侖、碘佛醇、碘格利酸鹽及甲泛葡胺及其混合物及多元醇。
可在膠凝階段之前或期間使用微創技術以液體形式或以預形成凝膠形式將組合物遞送至組織缺損。預計在癒合過程期間調配物被再吸收且經組織替代。
纖維蛋白原溶液係具有5－200 mg/ml、較佳50－100 mg/ml之纖維蛋白原之水性溶液。纖維蛋白原溶液亦可包括細胞外基質蛋白(例如纖維網蛋白)、細胞結合蛋白、其他血漿衍生蛋白[例如血液凝固因子XIII及蛋白酶]。纖維蛋白原溶液亦可包括纖維蛋白單體、衍生物及纖維蛋白I。
凝血酶組份可另外包含業內已知的額外化合物以及鍶化合物。對於所用凝血酶之量無具體限制。在本發明一實例中，在該凝血酶組份(b)中凝血酶之量使其在最終凝固組合物中之量至少為約1 IU/ml且最高為30 IU/ml。
對於組份(a)，本發明可包含其他膠凝誘導劑或凝血誘導劑，例如魚精蛋白、蛇毒液、轉麩胺醯胺酶、FXIIa、生理上可接受之鹼性緩衝系統，來代替凝血酶或與凝血酶共同存在。
凝血酶緩衝液為尤其包含二價陽離子物質之水性溶液。緩衝液中二價陽離子之濃度可係介於5－50 mM之間。二價陽離子較佳係選自基團鈣及鍶且其比率可為0：1至0.975：0.025。二價鍶離子可以氯化鍶或任何其他水溶性鍶鹽形式來添加，例如雷尼酸鍶、麩胺酸鍶、天冬胺酸鍶、丙二酸鍶、馬來酸鍶、抗壞血酸鍶、蘇糖酸鍶、乳酸鍶、丙酮酸鍶、α－酮戊二酸鍶或琥珀酸鍶。凝血酶緩衝液亦可包含最近鑒定之鍶之分子靶之共配體(a G－protein－coupled－receptor calcium－sensing receptor，Pi等人，J.Biol.Chem.2005)。共配體係選自類別擬鈣、骨鈣素及胺基酸。較佳為L－精胺酸、擬精胺酸或精胺酸類似物。含總凝血酶緩衝液亦可用於與含鍶無機顆粒結合。
顆粒組份之粒徑係在奈米級至小於3000 μm範圍內且在施用時應為不溶。粒徑較佳為100奈米至50毫米且更佳為0.5 mm至50 mm。顆粒可為在施用時不溶之任一鍶螯合物或在施用時亦不溶之鍶取代鈣鹽。用於取代之鈣鹽可係選自由以下組成之群：磷酸鈣、磷酸三鈣、α－磷酸三鈣、β－磷酸三鈣、磷酸鈣之多晶型體、羥基磷灰石、碳酸鈣、硫酸鈣及其組合。顆粒中鈣之鍶取代可介於0.25－100%之間。混合以獲得最終凝膠可在18－37℃之溫度範圍內、較 佳在37℃下來達成。
纖維蛋白原溶液係以5－200 mg/ml、較佳50－100 mg/ml之範圍具有纖維蛋白原之水性溶液。纖維蛋白原溶液亦可包括纖維蛋白單體、衍生物及纖維蛋白I。纖維蛋白原溶液亦可包括細胞外基質蛋白(例如纖維網蛋白)、細胞結合蛋白、及諸如血液凝固因子XIII(FXIII)及蛋白酶等其他血漿衍生蛋白。
凝血酶溶液係在最終凝固(或膠凝)組合物中具有0.1 IU/ml之最小終濃度之水性溶液。此溶液亦可具有緩衝性且包含胺基酸、蛋白質或添加劑(例如L－精胺酸、甘露糖醇及白蛋白)。
凝血酶緩衝液係尤其包含二價陽離子物質之水性溶液。緩衝液中二價陽離子之濃度可係介於5－50 mM之間。二價陽離子較佳係選自基團鈣及鍶且鈣與鍶之莫耳比可為1：0至0.975：0.025。
顆粒可為在施用時不溶之任一鍶螯合物或在施用時亦不溶之鍶取代鈣鹽。用於取代之鈣鹽可為磷酸鈣、磷酸三鈣、α－磷酸三鈣、β－磷酸三鈣、磷酸鈣之多晶型體、羥基磷灰石、碳酸鈣、硫酸鈣及其組合。對於顆粒之鍶取代而言，經取代顆粒之比可介於0.25－100%之間。
組合物中之顆粒含量為可凝固蛋白之2－100%、較佳為30－50%(重量/體積)。根據應用需要，顆粒組份之粒徑係在亞微米級至小於3000 μm範圍內。勻漿以獲得最終凝膠可在18－37℃之溫度範圍內、較佳在37℃下來達成。
本發明組合物促進骨修復之效力可藉由納入生物活性分子來進一步改良。該等分子可作為游離分子或藥物粉末以化學方式與基質連接、吸附於顆粒組份上或誘陷於纖維蛋白基質中。該等分子可用於刺激骨代謝(合成代謝及分解代謝)。已經鑒定之適宜分子包括骨形態發生蛋白(BMP)、甲狀旁腺素(PTH)、降鈣素、雙磷酸鹽、表皮生長因子、胰島素樣生長因子及TGF超家族生長因子。適宜分子亦可包括與骨合成代謝/分解代謝循環無關但與平行於骨修復/重建發生之生理性過程相關之其他因子，例如血管生成刺激劑(亦可納入血管內皮生長因子(VEGF)及血小板衍生生長因子[PDGF])。由於據信鍶之作用模式獨立於同化劑1,25(OH)2 維生素D及甲狀旁腺素，因此此尤其令人關注。
增塑劑亦可與纖維蛋白或凝血酶混合以增強調配物之機械特性或進一步延遲凝固時間。增塑劑之實例係選自由以下組成之群：水溶性含碘造影劑、聚乙二醇、諸如甘油等多元醇、單醣、雙醣、參醣及多醣、及其任一組合。適宜含碘造影介質詳述於美國專利申請案第US 20050119746號(Lidgren及Nilson，2004)中，其係以引用方式併入本文中，該等介質之實例為泛影酸鹽(葡甲胺)、碘地醇、碘克沙醇、碘拉醇、碘格利醯胺、碘海醇、碘美普爾、碘帕醇、碘普羅胺、碘曲侖、碘佛醇、碘格利酸鹽及甲泛葡胺。造影劑較佳為非離子型，其具有低滲透壓且容許發生纖維蛋白裝配，例如碘克沙醇。
本發明組合物可用於可用骨癒合方法中且可用於該等方 法中所用套組中。預計組合物可用於促進骨生長或癒合，尤其在長骨中。具體而言，本發明係關於包含凝血酶、纖維蛋白及鍶之骨修復組合物。與不含鍶之此一組合物相比，組合物中存在鍶可導致促進骨癒合及/或骨生成。
本發明組合物可用於長骨之修復及再生，例如股骨、脛骨、肱骨、橈骨、尺骨及諸如此類。
藉由使用本發明組合物可恢復或部分恢復具有缺損之骨之機械、建築及結構能力，同時提供結構性表面區域，其可用作生物過程管理之骨癒合及再生之適宜受質。
如實例中所示，本發明組合物促進骨修復中所涉及之細胞及生物過程。
下文中所用詞組"長骨"係指長度為直徑至少兩倍長之骨。詞組"長骨"通常係指四肢骨，即脛骨、腓骨、股骨、肱骨、橈骨、尺骨、腕骨、掌骨、指骨、跗骨及蹠骨。更具體而言，本文所用詞組"長骨"係指四根主要四肢骨，即脛骨、股骨、肱骨及橈骨。
可藉由使用本發明組合物來治療之"骨缺損"可為骨中之任何異常，其包括(但不限於)間隙、空腔、結構不連續性、斷裂或由損傷產生之任何結構性變化、截骨術、手術、骨折、畸形癒合、骨不連骨折、骨骼變形、老化、或疾病。本發明組合物提供顯著治療潛力。當網狀質骨由於(例如)骨質疏鬆、缺血性壞死或癌症而患病時，周圍骨皮質變得更易於擠壓斷裂或破碎。此係因為網狀質骨不再為周圍骨皮質提供內部支撐。本發明組合物可用於在諸如骨 質疏鬆、骨壞死或缺血性壞死等病況以及涉及受感染骨、癒合不足之骨、或由於嚴重創傷而斷裂之骨之其他骨疾病中使骨強化。
本發明另一態樣提供修復具有缺損之骨之套組。套組包括固定骨或其部分之機械固定裝置及本發明組合物。固定裝置之實例包括(但不限於)凸緣、桿、棒、金屬絲、U形釘、螺絲、縫線以及各種鑄件、套筒及諸如此類，其通常為外部固定裝置。因此，本發明之套組較佳包括外部機械固定裝置。
本發明之另一態樣提供治療骨缺損(例如骨折、空腔、間隙及諸如此類)之方法，其包括使該等骨缺損與本發明組合物接觸。在某些實施例中，該方法可包括在使缺損與本發明組合物接觸之步驟之前或之後以機械方式固定骨或其部分。
本發明組合物宜用作遞送至骨缺損或間隙中或遞送至小樑骨組織之骨髓腔中之注射組合物，其中組合物暫時替代骨髓，及/或幫助新骨形成。可使用熟習此項技術者熟知之技術將組合物注射至小樑骨組織或任何其他骨組織中。該等技術及實施該等技術之裝置之實例尤其論述於以下專利中：例如美國專利公開案第20080065091號、美國專利公開案第20080058828號、美國專利公開案第20070073307號、美國專利第4,969,888號及第5,108,404號(每個該等專利文件皆係以引用方式併入本文中)。通常，使用類似於家用填縫槍之注射裝置將組合物注射至骨中。典型骨水泥 注射裝置具有手槍形機身，其支撐包含骨水泥之藥筒。扳機觸動彈簧加載式撞錘，其在黏性條件下推動一定體積骨水泥穿過適宜噴嘴進入所靶向骨內部進行治療。根據美國專利第4,969,888號及第5,108,404號之教示，可首先壓緊骨內部網狀質骨而形成空腔，然後在其中注射骨水泥。
將Sr納入本發明注射組合物中之另一優勢在於鍶作為放射遮光劑之已知特性，因此可使用諸如螢光透視法等技術來監測遞送及癒合過程。因此，在本發明組合物中使用Sr既可提供治療功能亦可提供診斷功能且並非僅簡單的成像功能。
本發明組合物可以以下形式來使用：可注射凝膠、可注射糊劑、糊劑、油灰接合劑、或可再水合凍乾形式。本文所用術語"凝膠"係指濃稠柔軟且部分為液體之凍膠樣物質。本發明凝膠可經由至少13號注射器針頭擠出。本申請案中所用之"糊劑"係指密實度介於液體與固體之間之柔軟濕潤物質。本發明糊劑具有較油灰接合劑更低且較凝膠更高之固體性，且在某些實施例中可具有可注射性。
術語"油灰接合劑"係指本發明之麵團樣/黏土樣組織修復組合物。在施用期間可將該物質敲打或揉捏至麵團之密實度，且將其模製為與植入位點之形狀接近之形狀。
"可注射"係指本發明可在壓力下被引入植入位點之能力(例如使用注射器引入)。舉例而言，可將本發明可注射組合物引入體內之元件之間或經限定空間內(即尤其骨塊之間或修復裝置與骨之間之介面內)。
"注射器"係指可用於注射或吸出本發明流動性組織修復組合物(尤其包括某些凝膠及糊劑)之任一裝置。
將組合物注射至個體(個體較佳為人類、猿猴、羊、牛、馬、豬個體)之骨皮質或小樑骨中。本申請案中所用"骨皮質"係指圍繞骨髓腔之骨幹之骨密質。骨皮質係由膠原纖維之三螺旋鏈構成且經羥基磷灰石強化之高密度結構。在人體中骨皮質係複合結構且為長骨之主要承載組份。羥基磷灰石組份負資骨之高抗壓強度，同時膠原纖維組份貢獻部分抗扭強度及抗拉強度。可將本發明組合物引入該等骨部分中以賦予有利骨癒合或骨強化效應。
小樑骨與骨皮質具有類似組成且係"網狀質骨"之主要結構性組份，且係指由規則排列的礦化平行膠原纖維組成之成體骨，該等膠原纖維係以與成體長骨骨幹之板層骨中不同之方式來組織。網狀質骨一般存於由骨皮質圍繞之長骨末端。網狀質骨具有形成網格結構之交合刺，且其空隙經骨髓填充。其亦稱為小樑骨或海綿狀骨。在較佳實施例中，將本發明組合物遞送至小樑骨中。
本發明之骨固定方法亦可包括在骨固定或與本發明組合物接觸之前使缺損改形之步驟。該改形或骨重排可使用(例如)鑽孔機或研磨機或可用於使缺損改形之任何其他裝置來實施。
用於固定骨之裝置可取決於待修復缺損類型且取決於骨之類型及位置。固定裝置通常為外部固定裝置。較佳地，諸如鑄件等外部固定裝置係在本發明方法中伴隨本發明組 合物之注射所使用之唯一固定裝置。然而，在某些情況下可能必須採用較具創傷性的手術程序，其中亦可能使用內部固定裝置。
可監測修復且在預定進程中可移除用於固定骨之裝置。缺損位點之骨再生可藉由在手術後立即實施及在手術後給定時間間隔實施之軟組織X射線法(7.5 mA；0.5 sec)來評價。測試動物中之骨再生亦可在實驗終止後藉由評價一般形態、計算機層析成像(CT)掃描(65－80 kV；20 sec)及三維(3－D)CT掃描(Marconi,M.次8,000)來確定。可實施組織學研究以確定組織之骨染色。
在本發明方法中，組合物亦可與可用於骨修復之細胞組合，例如骨原細胞。業內已知之骨原細胞包括骨髓基質細胞之骨原性亞群，其特徵為骨形成細胞。本發明方法所用之骨原細胞可包括骨原性骨形成細胞自身及/或形成骨原細胞之胚胎幹細胞。骨原細胞可使用已知程序來分離。該等細胞較佳具有自體來源且包括(例如)人胚胎幹細胞、鼠或人骨原細胞、鼠或人骨原性骨髓衍生細胞、鼠或人骨原性胚胎衍生細胞及鼠或人胚胎細胞。該等細胞可進一步用作分泌上文所定義之生長因子之細胞，如Robinson及Nevo(2001)所述。
本發明組合物亦可另外包含各種活性治療藥劑，其可包括骨生長促進劑、骨原細胞或其組合。組合物可包括至少一種藥物，例如維生素、抗生素、消炎藥及諸如此類。
在某些較佳實施例中，使用熟習此項技術者已知之技術 將鍶納入含鈣鹽中以製備鍶取代鈣化合物。此外，可將鍶納入習用於組織修復之生物活性玻璃中。"生物活性玻璃"係任何表現生物活性特徵之玻璃，其通常為本質上無黏性之無定形固體，且其在暴露於適宜體內及體外環境(例如模擬體液或三－羥甲胺基甲烷緩衝液)中時能與硬組織及軟組織形成黏性結合。黏性結合係藉由在生物活性玻璃上經由自疏鬆生物玻璃材料釋放離子物質而形成碳酸羥基磷灰石表面層來達成。生物活性玻璃在外科手術及矯形外科治療以及牙科手術領域具有多種應用，且其已闡述於(例如)歐洲專利第1405647號及歐洲專利申請案第1655042號以及國際專利申請案WO 96/21628、WO 91/17777、WO 91/12032及美國專利公開案第20080066495號中(每個專利皆係以引用方式併入本文中)。
實例：
在本發明一實施例中，含鍶化合物係在凝血酶稀釋緩衝液中用作二價離子。凝血酶溶液係使用稀釋緩衝液來製備。將纖維蛋白原溶液及含鍶凝血酶溶液混合以形成凝膠。
在本發明另一實施例中，將含鍶化合物添加至呈鹽顆粒形式之調配物中。將凝血酶溶液與顆粒混合以製備改性凝血酶溶液。將纖維蛋白原溶液及改性凝血酶溶液混合以形成凝膠。
實例1：溶於緩衝溶液中之含鍶化合物。
在雙蒸水中製備一系列緩衝液。對於該等緩衝液，凝血 酶緩衝液中之二價陽離子係Ca或Ca十Sr混合物以使陽離子濃度恆定保持在40 mM(關於氯化鍶參見下表)。在凝血酶緩衝液中將凝血酶稀釋至濃度為4 IU。
然後以1：1之比將纖維蛋白原與凝血酶混合(由此使膠凝凝塊中之鍶濃度減半)。對於此步驟，可將2 ml凝血酶溶液轉移至5 ml注射器中。將2 ml纖維蛋白原(Tisseel,Baxter,Clottable Protein,[纖維蛋白原及纖維網蛋白]72－110 mg/ml)轉移至分開的5 ml注射器中。將含有纖維蛋白原及凝血酶之注射器與任一現有技術混合器連接以達成組合目的。
對於體外實驗，可藉由將150 μl纖維蛋白原溶液移液至24孔板之孔中來製備凝塊。將板置於板振蕩器上以確保孔底部之均勻分配。然後將150 μl凝血酶溶液添加至孔中且將板置於板振蕩器上以確保形成均勻凝塊。將人成骨細胞樣細胞系(SaoS－2)在凝塊上培養最多7天來瞭解是否可在細胞增殖/細胞分化中觀察到任何差異。圖1展示當將氯化鍶(SrCl2 )添加至凝血酶稀釋緩衝液中時的增殖結果(Alamar Blue)。對於乙酸鍶(SrAc)可獲得類似結果。
Alamar Blue分析係代謝分析且經常用於量測增殖。與具有20 mM CaCl2 之正常凝塊相比，在該等凝塊上添加鍶可導致增殖顯著增強。當使用DNA染色法定量增殖時亦觀察到類似結果(圖2)。7天後，可在含有鈣鍶混合物或僅含有 鈣之凝塊上生長之細胞之間觀察到顯著差異。由此吾等可推知，鍶對類似SaOS－2細胞之成骨細胞之增殖具有積極影響。
該等起始實驗設計為可觀察細胞增殖中之差異，但其未提供充足時間來研究成骨細胞分化。鹼性磷酸酶係分化之早期指示劑但其濃度直到大約第10－14天才真正達到峰值。初步結果顯示在含鍶凝塊中鹼性磷酸酶之表現增強(圖3)。在乙酸鍶情況下，該等值似乎不顯著。以14天之研究時段重複該等實驗。
除細胞研究觀察外，實施比濁分析來檢驗凝塊結構是否由於鍶而改變(圖4)。凝塊濁度與纖維之平均橫截面面積成正比，因此凝塊濁度愈高，纖維直徑愈大。
圖4中之比濁法數據顯示，含鍶凝塊與含鈣凝塊相比，其動力學及吸光度僅存在極小差異。此可藉由以下觀測情況來闡釋：鈣與鍶能佔據相似結合位點，尤其FXIII結合位點。
對於起始實驗，將細胞接種於凝塊表面上。選擇此接種方法之原因之一係當在凝塊內接種時某些細胞類型經歷大量細胞死亡且存在細胞向凝塊表面之遷移。當將成骨細胞樣細胞在補加有CaCl2 之培養基中培養時，可說明對此效應之一種可能闡釋。圖5展示在12.5 mM CaCl2 存在下於組織培養塑膠上培養SaOS－2細胞之結果。在氯化鈣存在下培養之細胞發生細胞死亡(如藉由MTS分析所量測)。此在細胞培養之最初24小時內發生。相反，在含鍶化合物存在下 培養之細胞之增殖中僅出現輕微降低。重要的係要指出，某些細胞(即成纖維細胞及角蛋白細胞)需要高濃度鈣，且由此不會受凝塊中鈣濃度之影響。
實例2：纖維蛋白/摻雜鍶之－磷酸鈣奈米顆粒。
在凝血酶緩衝液中將凝血酶稀釋至濃度為4 IU。以1：1之比將纖維蛋白原與凝血酶混合。出於此目的，可將2 ml凝血酶溶液轉移至5 ml注射器中。將2 ml纖維蛋白原(Tisseel,Baxter,Clottable Protein,[纖維蛋白原及纖維網蛋白]72－110 mg/ml)轉移至分開的5 ml注射器中。根據最終凝塊體積之百分比重量(w/v)納入顆粒(小於1 μm之奈米顆粒)。將該等顆粒稱重且將其置於另一5 ml注射器中。
使含有顆粒及凝血酶之注射器經由Luer接頭連接，且藉由將內容物在注射器之間轉移來將凝血酶與顆粒均質化。使含有凝血酶/顆粒及纖維蛋白原之注射器經由Luer接頭連接且將內容物均質化。使材料在約30秒內保持液態且在此期間可將其注射至缺損中。
對於體外實驗，藉由將150 μl纖維蛋白原溶液移液至24孔板之孔中來製備凝塊。根據最終凝塊體積之百分比重量(w/v)添加顆粒(小於1 μm之奈米顆粒)。將板置於板振蕩器上以確保孔底部之均勻分配。然後將150 μl凝血酶溶液添加至孔中且將板置於板振蕩器上以確保形成均勻凝塊。在初步研究中，在凝塊上將人成骨細胞樣細胞(SaOS－2或NHOst)培養最多14天以瞭解是否可在細胞增殖、細胞分化中觀察到任何差異。
與正常纖維蛋白凝塊相比，對接種於含顆粒凝塊上之細胞的定量分析顯示良好相容性(圖6)。儘管未經定量，但似乎無顆粒纖維蛋白凝塊上之細胞之形態更圓而含顆粒凝塊上之細胞更為伸展。對於此之其他證據可參見凝塊之橫切面(圖7)。出於此目的，將細胞接種於凝塊中。幾天後，纖維蛋白凝塊中之細胞已遷移至凝塊表面。與之相比，含顆粒凝塊中之細胞保持在凝塊中且已伸展開而顯示有利形態。
實例3：摻雜鍶之羥基磷灰石在兔股骨髁缺損模型中之應用。
上述研究表明，鍶可刺激骨形成同時抑制骨吸收。先前研究調查SrCl2 對成骨細胞樣細胞及對原代成骨細胞之效應。在意欲鑒定可用於椎體強化中之調配物之過程中，在兔股骨髁缺損模型中測試摻雜鍶之經修飾羥基磷灰石以評價鍶刺激骨形成之潛力。可在實驗臺上藉由在高pH值(用氫氧化銨調節)下一起攪拌硝酸鈣與磷酸銨來製造鈣羥基磷灰石。可將所得沈澱物離心、洗滌、乾燥且煆燒以獲得羥基磷灰石樣物質。藉由以各自的取代百分比合併硝酸鈣與硝酸鍶，可製造可與纖維蛋白一起注射至骨缺損中之鍶－鈣羥基磷灰石樣顆粒。
此實例展示顯示以下事實之數據：經鍶取代之鈣羥基磷灰石樣顆粒可較單獨使用纖維蛋白或純鈣羥基磷灰石樣顆粒更佳地刺激新骨形成。該等結果為在初步細胞培養期間獲得之數據提供了體內證據。
材料及方法： 在此實例所述研究中使用以下化學試劑。四水合硝酸鈣；99% A.C.S.試劑[Sigma－Aldrich；237124－500G；FW：236,15]；硝酸鍶p.A.>99%[Fluka；85899 500 g；Lot&Filling代碼：1086321、53706181；FW：211,63]；雙相性磷酸銨p.A.[Riedel－de Han；30402 500g；FW：132,06]；氫氧化銨[Sigma－Aldrich,318612－2L；批號：11103PD；FW：35,05；5N存於H2 O中]；EtOH 96%；Fibrinkleber[Baxter AG；Fibrinkleber TIM 3；08P6004H；5ml；1500434]；凝血酶[Baxter AG；B205553 thromb.SD TIM 5；500 IE；US 5 ml]；二水合氯化鈣(min.99%)[Sigma；C7902－1KG；批號：044K0160]；及氯化鈉[Merck,1.06404.1000 1 kg；Charge/Lot：K38062004 745；FW：58,44]。
實驗採用以下各種溶液：40 mM CaCl2 ＋200 mM NaCl；存於250 ml ddH2 O中之1.47 g CaCl2 ＋2.92 g NaCl；凍乾凝血酶－在5 ml 40 mM CaCl2 ＋200 mM NaCl中重建及凍乾纖維蛋白原－在5 ml 3000 KIE/ml抑肽酶(Aprotinin)中重建。
對下述每組具有6個兔膝部之4個測試組進行實驗： 組1.纖維蛋白十凝血酶(8 IU/ml終濃度) 組2.纖維蛋白＋凝血酶(8 IU/ml終濃度)＋100% Ca(0% Sr取代) 組3.纖維蛋白＋凝血酶(8 IU/ml終濃度)＋75% Ca(25% Sr取代) 組4.纖維蛋白＋凝血酶(8 IU/ml終濃度)＋20% Ca(80% Sr 取代)。
測試材料之製備： 使纖維蛋白原重建且將其等分於1 ml注射器[Braun；omifix－1 ml；Luer]中，每個注射器具有0.5 ml纖維蛋白原。使凝血酶重建且用40 mM CaCl2＋ 200 mM NaCl將其稀釋至16 IU/ml。亦將其等分於1 ml注射器中，每個注射器具有0.5 ml。
藉由一起攪拌等體積之2 M硝酸鈣溶液(或根據鍶取代之百分比亦添加硝酸鍶，所得溶液必須具有2 M之總濃度)與1.2 M磷酸銨溶液來製造羥基磷灰石粉末。將磷酸銨添加至硝酸鈣後，沈澱出糊狀物質。隨後添加等體積氫氧化銨使沈澱物之pH提高至11且使糊狀沈澱物變為液態。充分攪拌後將混合物離心，棄去上清液且將沈澱物用醇(乙醇96%)洗滌兩次並用ddH2 O洗滌一次。在洗滌步驟之間始終對沈澱物實施淘選、離心且棄去上清液。此後在60℃及真空下使沈澱物乾燥一天，將其研磨且在1100℃下煆燒1小時。
冷卻後對羥基磷灰石樣顆粒實施加熱滅菌且將其等分於1 ml注射器中，每個注射器具有0.3 g。
兔之治療 使用12隻兔來實施主實驗。使其服用鎮靜劑且在股骨髁上鑽孔(直徑4.5 mm)。藉由將凝血酶組份與顆粒旋轉混合且之後與纖維蛋白原旋轉混合、或僅將凝血酶與纖維蛋白原旋轉混合作為對照而各將一種測試材料填充於該等鑽孔 之每一者中。1 ml注射器之椎體可完全配合至鑽孔中，因此可直接施用。
注射各自材料(24個膝部隨機注射)後，縫合皮膚且在隨後8周內對兔子保持監測。
手術後分析 8周後，對兔子實施無痛致死且藉由μCT分析膝部並對薄切片實施組織學染色。
結果 μCT分析：由於鍶樣品之高不透明度而難以獲得量化結果，因此藉由用肉眼評價μCT圖像且將其量化來以半量化方式實施分析。以三種等級實施骨形成之評估(1：低；2：中；3：高)。藉由對已閉合鑽孔給予"＋"且對未閉合鑽孔給予"－"來實施對閉合鑽孔之評估。數據展示於圖8至14之圖中。所有圖皆係可評估經測試動物之平均值，其中μCT圖為快照。
圖8展示完全閉合鑽孔(兩側皆閉合)之圖示。所評估經纖維蛋白填充之兔髁缺損中無一係兩側閉合，因此在圖8中可見0%完全閉合鑽孔邊界。顆粒中之25% Sr取代產生80%閉合鑽孔邊界之最高值。
在圖9中，展示在纖維蛋白存在下兔股骨髁之μCT。缺損仍然可見，但無可見殘留材料(纖維蛋白)；鑽孔一側仍然開放。
添加鍶可產生顯著效應。圖11展示在80% Sr材料中之兔股骨髁之μCT。儘管缺損仍然可見，但大部分缺損已經填 充；材料(Sr 80%)係明顯可見。可明確識別新骨形成且鑽孔兩側皆閉合。
亦可使用組織學研究來證實上述結果。圖12展示經纖維蛋白治療之兔股骨髁缺損之組織學染色薄切片。不存在測試物質。因此未發現炎症迹象。僅在鑽孔內部發現少量短網狀質骨小樑。在鑽管開口處，新形成骨物質具有海綿狀形狀。血管幾乎皆規則分佈於鑽孔腔內部，據顯示僅幾個點血管化程度較低。在鑽孔腔一側，若干較大血管緊靠骨物質。
在經存在80%鍶之纖維蛋白凝塊治療之樣品中(圖13)，40－70%之鑽管經測試物質填充。測試物質存於鑽孔腔內部所有狹長形樣品中。在一樣品中其呈較細顆粒狀，而其他兩個樣品表現較粗測試物質。在3個樣品之2個中，纖維蛋白係以貼近測試物質之較大貼片形式存在。在一樣品中炎症部位很少，且在其他樣品中存在3－10處較大炎症部位。在一樣品中測試物質與新建骨組織直接接觸，而在另外兩個樣品中其距離較遠。兩個樣品在鑽孔腔內具有規則分佈之血管，而第三個樣品中血管化更集中。
討論 μCT數據顯示包含25%經Sr取代之羥基磷灰石樣顆粒之調配物可較其他測試材料更佳地觸發鑽孔之閉合，且誘發與80%經取代顆粒相當之骨形成，但密度較低。
單獨使用纖維蛋白可觸發較低程度之骨形成且鑽孔僅在一側閉合。包含純鈣羥基磷灰石樣顆粒之調配物並非如此 緻密，但似乎不能誘發骨形成或鑽孔之閉合。
高鍶濃度調配物密度極大，其可誘發新骨形成，但程度並不顯著大於Sr 25%。此外，與較低濃度鍶相比，其鑽孔閉合程度較低，因此甚至低濃度鍶即足以誘發骨形成。
組織學結果建議在鈣羥基磷灰石樣顆粒中以鍶取代可誘發新骨形成。在所有樣品中檢測血管化，其係成骨細胞遷入且由此形成新骨之必要條件。
實例4：對於成骨細胞鍶與PTH具有協同效應。
此實例闡述對大鼠骨肉瘤細胞之體外研究，其調查甲狀旁腺素(PTH)與鍶(作為SrCl2 使用)之組合是否可活化骨形成因子，例如增強成骨細胞中之cAMP產生。本文所述研究顯示，SrCl2 與PTH對於成骨細胞中之cAMP生成具有正協同效應。對於經CaCl2 治療之細胞未觀察到此效應。因為已知cAMP可誘發合成代謝骨形成，因此本文所列數據支持以下結論：在體內Sr與PTH之組合療法可增強骨形成。
材料及方法 使用骨肉瘤細胞系UMR－106(NewLab Bioquality AG,Erkrath,Germany)來實施生物分析。
下文所述分析使用以下培養基： 細胞培養基 ：DMEM(Sigma,D6546；包括4500 mg/l葡萄糖、丙酮酸Na、Na2 CO3 ，補加有0.584 g/l L－麩胺醯胺)；10% FCS；2 mM L－Glu。
饑餓培養基 ：DMEM(Sigma,D6546；包括4500 mg/l葡萄糖、丙酮酸Na、Na2 CO3 ，補加有0.584 g/l L－麩胺醯胺)；2 mM L－Glu； SI培養基 ：10 ml饑餓培養基；2 mM IBMX 存於饑餓培養基中之20 mM SrCl 2 ：19,6 ml培養基、0,4ml 1 M SrCl2 存於饑餓培養基中之20 mM CaCl 2 ：19.6 ml培養基、0.4 ml 1 M CaCl2 。
細胞培養 以30000細胞/cm2 之密度將UMR－106細胞接種於生長培養基中且將其在37℃/8.0% CO2 下培養。24小時後，用新鮮培養基、包含20 mM SrCl2 之培養基或包含20 mM CaCl2 之培養基來更換培養基。在37℃/8.0% CO2 下將細胞另外培養24小時。根據以下程序收穫細胞：用HBSS將細胞洗滌兩次，且藉由在室溫下使用6 ml胰蛋白酶/EDTA處理3 min來使細胞與表面分離。用12 ml生長培養基來終止胰蛋白酶消化。離心(3 min,1000 rpm,RT)後，使細胞懸浮於12 ml饑餓培養基中且用CASY細胞計數器來計數。在每個實驗中細胞死亡率低於10%。使細胞以1.6×106 細胞/ml之終濃度再懸浮於饑餓培養基中。將50 μl細胞懸浮液轉移至96孔板之各孔中且在37℃及8.0% CO2 下培養30 min。
用存於纖維蛋白原溶液中之264 μg/ml TGplPTH樣品處理細胞 將樣品稀釋於新製備之包含2 mM IBMX之饑餓培養基(SI培養基)中。為製備Si培養基，將30 μl存於DMSO中之0.67 M IBMX原液添加至10 ml饑餓培養基中。
所有樣品稀釋液皆係用此培養基來製備以抑制UMR－106細胞中之磷酸二酯酶活性(Janik,P.,1980；Chasin M.及Harris,D.N.,1976)。在37℃下培養30 min後將50 μl稀釋樣品(如結果中所示)添加至細胞中。對於cAMP生產，將細胞在37℃及8.0% CO2 下培養1 h。在重複兩次實施cAMP分析後，至少兩次將各樣品濃縮物添加至細胞中。
cAMP Biotrak酶免疫分析 用於cAMP EIA之試劑製備。 根據製造商手冊(cAMP Biotrak EIA套組，GE Healthcare)來製備分析緩衝液、溶解試劑1A/lB、溶解試劑2A/2B、cAMP標準品、抗血清、cAMP過氧化物酶偶合物及洗滌緩衝液。藉由用947 ml ddH2 O稀釋53 ml H2 SO4 (濃度＝18.76 M)來製備1 M硫酸終止溶液。
細胞溶解及cAMP之稀釋。 為提取cAMP，將100 μl包含PTH之細胞懸浮液與25 μl(最終稀釋度為1：5)溶解試劑溶劑1A(其為cAMP Biotrak EIA套組(GE Healthcare)之部分)一起培養。對於完全溶解，在室溫下以500 rpm將細胞振蕩15 min。用溶解試劑1B(cAMP Biotrak EIA套組)將所提取cAMP最終稀釋為1：20(在分析板(添加125 μl溶解試劑1B)中以1：1稀釋，之後在ELISA板(90 μl溶解試劑1B＋10 μl經稀釋細胞懸浮液)上以1：10稀釋)。
cAMP工作標準品之製備。 使用於非乙醯化分析(cAMP Biotrak EIA套組)之凍乾cAMP標準品溶解於分析緩衝液中且達到32 pmol/ml之濃度。製備濃度介於32 pmol/ml至0.5 pmol/ml之間之雙倍稀釋液系列。
內部對照。 將100 μl各標準品及樣品稀釋液轉移至適宜孔中且重複分析兩次。此外，兩種不同內部對照(非特異性結合(NSB)對照及空白對照(0))必須顯示對cAMP ELISA之特異性且係根據製造商(GE Healthcare)之建議來實施。
酶免疫分析程序。 將100 μl抗血清添加至除NSB對照外之所有孔中。在4℃下將抗體反應振蕩實施2 h。在4℃下與50 μl cAMP過氧化物酶偶合物一起震蕩培養1 h後，用300 μl洗滌緩衝液將所有孔洗滌四次。最終，將150 μl TMB(3,3',5,5'－四甲基聯苯胺)添加至各孔中且使受質反應在室溫下進行10 min。藉由添加100 μl 1 M H2 SO4 來終止反應且在板讀取器中於450 nm下立即測定光密度。
數據分析。 藉由使用軟件KC4在450 nm處量測樣品之吸光度來在板讀取器(Synergy HT)中測定光密度。在Microsoft Excel 2000中實施背景校正、平均值之計算、標準差、變異係數及標準曲線之生成。使用Sigmaplot 9.0來實施4－參數－擬合及EC50計算。使用PLA1.2(Stegmann Systemberatung)來實施平行線分析及相對功效之檢測。
經結合cAMP過氧化物酶偶合物之百分比。 使用以下關聯來計算每個標準品及樣品之經結合cAMP過氧化物酶偶合物百分比：
標準曲線。 cAMP標準曲線係藉由以百分比B/B0(y－軸)作為log c(cAMP)(x－軸)之函數繪圖來生成。
樣品之cAMP濃度。 考慮稀釋度因素(20x)，使用標準曲線之參數(斜率及截距)來計算所產生cAMP量。
線性。 評估cAMP ELISA(R2 0.95)之標準曲線之相關係數。
生物分析用樣品之製備。 出於分析目的，在包含2 mM磷酸二酯酶抑制劑IBMX之饑餓培養基(Si培養基)中將樣品稀釋至終濃度為2400 nM TGplPTH(13,2 μg/ml TGplPTH)。對於所有樣品，製備150 μl下述8組連續稀釋液且將50 μl直接添加至細胞中(細胞上之總體積：100 μl)。計算所有樣品及所有稀釋液之OD450之平均值、標準差、cAMP濃度及變異係數。
連續稀釋液表.為生成劑量反應曲線，對每個樣品實施7次一比一連續稀釋步驟，且將所有稀釋液重複分析三次。
結果 在五個不同實驗中獨立地監測SrCl2 及CaCl2 對PTH生物活性之影響(圖14)。該等研究顯示，在TGplPTH治療前的UMR－106細胞與20 mM SrCl2 之24 h預培養導致生物活性增長兩倍，而CaCl2 未顯示對PTH生物活性之改變(圖14)。該等結果表明，鍶與PTH對cAMP產生具有協同效應，且該等結果支持以下結論：PTH與鍶之組合可導致體內之合成代謝骨形成。
圖1展示在含鍶凝塊上生長之人成骨細胞樣細胞(SaOS－2)之細胞增殖。所用標誌為Ca/sr。所引用值為最終凝塊中之濃度。為在最終凝塊中達成該等濃度，使緩衝液中之濃度加倍。
圖2展示對在含鍶凝塊上生長之人成骨細胞樣細胞(SaOS－2)所實施之DNA分析。所用標誌為Ca/sr。所引用值為緩衝液中之濃度。此值在最終凝塊中減半。
圖3展示30分鐘內在含鍶凝塊上生長之人成骨細胞樣細胞(SaOS－2)之鹼性磷酸酶之產生。所引用值為最終凝塊中之濃度。為達成此濃度使緩衝液中之濃度加倍。
圖4展示凝塊之比濁分析，其中凝血酶緩衝液係由鈣、鈣/鍶混合物或鍶單獨組成。所用標誌為Ca/sr。所引用值 為緩衝液中之濃度。此值在最終凝塊中減半。
圖5展示在含有12.5 mM Sr或Ca之介質中生長之凝塊之百分比存活率(如藉由MTS增殖分析所量測)。
圖6展示在纖維蛋白凝塊及包含鍶顆粒之纖維蛋白凝塊上培養之NHOst細胞之染色，即在纖維蛋白凝塊上培養14天(上圖)或在包含鍶顆粒之纖維蛋白凝塊上培養(下圖)之NHOst細胞之活(左圖)、死(右圖)染色。
圖7展示與NHOst細胞一起培養之纖維蛋白凝塊之橫切面。細胞染為綠色(活)及紅色(死)。上圖為纖維蛋白凝塊。下圖為含顆粒之纖維蛋白凝塊。
圖8展示完全閉合之鑽孔(兩側皆閉合)之圖示。
圖9展示在材料中存在纖維蛋白之情況下兔股骨髁之μCT。
圖10展示骨形成之圖示(評估：1：低骨形成；2：中骨形成；3：高骨形成)。
圖11展示具有80% Sr材料之兔股骨髁之μCT。
圖12展示經纖維蛋白治療之兔股骨髁缺損之經組織學染色之薄切片。
圖13展示經存在80% Sr之纖維蛋白凝塊治療的兔股骨髁缺損之經組織學染色之薄切片。
圖14展示SrCl2 對PTH生物活性之影響。
(無元件符號說明)

Claims (39)

  1. 一種組合物，其包含纖維蛋白原、凝血酶及含鍶化合物，其用於骨癒合或骨生長，其中該含鍶化合物係以經結合之纖維蛋白原及凝血酶的30-50%(重量/體積)存在於該組合物中，且其中(i)該組合物另外包含含碘化合物作為增塑劑，該含碘化合物係選自由以下組成之群：泛影酸鹽(diatrizoate)、碘地醇(iodecol)、碘克沙醇(iodixanol)、碘拉醇(iofratol)、碘格利醯胺(iogulamide)、碘海醇(iohexol)、碘美普爾(iomeprol)、碘帕醇(iopamidol)、碘普羅胺(iopromide)、碘曲侖(iotrol)、碘佛醇(ioversol)、碘格利酸鹽(ioxagulate)及甲泛葡胺(metrizamide)及其混合物及多元醇；或(ii)該組合物另外包含鍶共配體，其係選自由以下組成之群：擬鈣、骨鈣素及胺基酸；或(iii)該組合物另外包含增塑劑，其係聚乙二醇、多元醇、甘油、或選自由以下組成之群之糖：單醣、雙醣、參醣、多醣、及其組合。
  2. 如請求項1之組合物，其中該組合物係呈凝膠、油灰接合劑、糊劑或液體形式。
  3. 如請求項1或2之組合物，其中可在膠凝階段之前或期間以液體、糊劑或凝膠形式或以預形成凝膠、糊劑或油灰接合劑形式將該組合物遞送至組織缺損。
  4. 如請求項1或2之組合物，其中該組合物包含一或多種選 自由以下組成之群之細胞外蛋白：細胞外基質蛋白、細胞結合蛋白及血漿衍生蛋白。
  5. 如請求項4之組合物，其中該細胞外基質蛋白為纖維網蛋白，且該血漿衍生蛋白為血液凝固因子XIII、蛋白酶及蛋白酶抑制劑。
  6. 如請求項1或2之組合物，其中在癒合過程期間該組合物被再吸收且被組織置換。
  7. 如請求項1或2之組合物，其中該組合物另外包含凝血誘導劑。
  8. 如請求項7之組合物，其中該凝血誘導劑為魚精蛋白、蛇毒液、轉麩胺醯胺酶、FXIIa、或生理上可接受之鹼性緩衝系統。
  9. 如請求項1或2之組合物，其中該含鍶化合物係呈可溶性微粒、顆粒形式或呈固體形式。
  10. 如請求項9之組合物，其中該含鍶化合物係藉由將鍶添加至含鈣化合物中而生成包含含鈣及鍶之鹽之材料來製備。
  11. 如請求項10之組合物，其中該含鈣化合物係磷酸鈣。
  12. 如請求項11之組合物，其中該磷酸鈣係選自由以下組成之群：磷酸三鈣、α-磷酸三鈣、β-磷酸三鈣、磷酸鈣之多晶型體、羥基磷灰石(hyroxyapatite)、碳酸鈣、硫酸鈣及其組合。
  13. 如請求項10之組合物，其中該等含鍶或含鈣化合物具有介於100奈米至50毫米之間之顆粒尺寸。
  14. 如請求項10之組合物，其中該等含鍶或含鈣化合物具有0.5-5毫米之顆粒尺寸。
  15. 如請求項10之組合物，其中該組合物中鍶鹽對鈣鹽之百分比係介於0.25%至25%之間。
  16. 如請求項9之組合物，其中該含鍶化合物係藉由將鍶添加至生物活性玻璃中而產生含鍶生物活性玻璃材料來製備。
  17. 如請求項1或2之組合物，其中該含鍶化合物係選自由以下組成之群：氯化鍶、雷尼酸鍶、乙酸鍶、麩胺酸鍶、天冬胺酸鍶、丙二酸鍶、馬來酸鍶、抗壞血酸鍶、蘇糖酸鍶、乳酸鍶、磷酸鍶、鍶磷灰石、丙酮酸鍶、α-酮戊二酸鍶及琥珀酸鍶。
  18. 如請求項1之組合物，其中該胺基酸為L-精胺酸、及擬精胺酸及精胺酸類似物。
  19. 如請求項1或2之組合物，其另外包含選自由以下組成之群之蛋白質：骨形態發生蛋白、甲狀旁腺素(PTH)、降鈣素、雙膦酸鹽、表皮生長因子、胰島素樣生長因子及TGF生長因子。
  20. 如請求項1之組合物，其中該組合物之膠凝作用係在混合各種組份後發生。
  21. 如請求項1、2及20中任一項之組合物，其中該組合物係可注射組合物。
  22. 一種如請求項21之組合物的用途，其係用於製造用以治療骨骼患病、受傷或缺損之藥劑，其中該藥劑係經注射 至網狀質骨中。
  23. 如請求項22之用途，其中將該藥劑注射至網狀質骨中所獲得之癒合速率比施用不含鍶之類似組合物時所觀察到之速率更快。
  24. 一種如請求項1至21中任一項之組合物的用途，其係用於製造用以修復具有缺損之骨之藥劑，其中該藥劑可用於：(a)以機械方式固定該骨或其部分；及(b)填充該缺損。
  25. 如請求項24之用途，其中該缺損係骨折，且該修復係該骨折之骨癒合。
  26. 如請求項25之用途，其中施用該組合物所獲得之癒合速率比不施用該組合物時所觀察到之速率更快。
  27. 如請求項25之用途，其中施用該組合物所獲得之癒合速率比施用不含鍶之類似組合物時所觀察到之速率更快。
  28. 如請求項23之用途，其中該骨係選自由以下組成之群之長骨：股骨、脛骨、肱骨及橈骨。
  29. 一種如請求項1至21中任一項之組合物的用途，其係用於製造用以在骨缺損位點促進新骨生長之藥劑，其中該缺損位點係與該藥劑接觸。
  30. 如請求項29之用途，其中有鍶存在下之該組合物造成之該骨生長速率比沒有鍶存在下之類似組合物所觀察到骨生長速率更快。
  31. 一種組合物，其包含纖維蛋白原、凝血酶及含鍶化合物，其用於骨癒合或骨生長，其中鍶在化合物中係以水 可溶鍶鹽中之二價鍶離子存在，該二價鍶離子在組合物中之濃度係介於2.5mM至25mM之間。
  32. 一種組合物，其包含纖維蛋白原、凝血酶及含鍶化合物，其用於骨癒合或骨生長，其中鍶在化合物中係以鍶螯合物或鍶取代鈣鹽存在，該鍶為可溶性顆粒，其具有小於1μm粒徑，且其中該鍶係以經結合之纖維蛋白原及凝血酶的30-50%(重量/體積)存在於該組合物中。
  33. 如請求項32之組合物，其中該鍶係以鍶螯合物存在。
  34. 如請求項32之組合物，其中該鍶係以鍶取代鈣鹽存在。
  35. 如請求項32之組合物，其中該顆粒包含25%之經鍶取代顆粒。
  36. 一種組合物，其包含纖維蛋白原、凝血酶及鍶，其用於骨癒合或骨生長，其中第一部分之鍶係以水可溶鍶鹽中之二價鍶離子存在；其中第二部分之鍶係以鍶螯合物或鍶取代鈣鹽存在，該第二部分之鍶係以不可溶顆粒存在；及其中該鍶係以經結合之纖維蛋白原及凝血酶的30-50%(重量/體積)存在於該組合物中。
  37. 如請求項36之組合物，其中該組合物另外包含甲狀旁腺素(PTH)。
  38. 如請求項36之組合物，其中該顆粒包含25%之經鍶取代顆粒。
  39. 一種組合物，其包含纖維蛋白原、凝血酶及含鍶化合物，其用於骨癒合或骨生長，其中該含鍶化合物係呈可溶性微粒、顆粒形式或呈固體形式，且係藉由將鍶添加 至含鈣化合物中而生成包含含鈣及鍶之鹽之材料來製備，其中該組合物中鍶鹽對鈣鹽之百分比係介於0.25%至25%之間。
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