KR101462301B1 - 나이스타틴의 유도체 및 항진균제로서 그것의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 C28 및 C29 사이에 존재하는 부가적인 이중결합을 가지고, 마이코사민의 하나 또는 그 이상의 C5, C9, C10, C16 위치에서 또는 아미노기에서 나이스타틴과 관련하여 더 변경된 나이스타틴 유도체인 화합물을 제공한다.

Description

나이스타틴의 유도체 및 항진균제로서 그것의 용도{DERIVATIVES OF NYSTATIN AND THEIR USE AS ANTIFUNGAL AGENTS}

본 발명은 나이스타틴(nystatin)의 새로운 유도체 및 그것들의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 약에서, 특히 항진균제(anti-fungal agents)로서의 신규한 나이스타틴 유도체의 용도에 관한 것이다.

나이스타틴은 그람 양성 박테리아인 스트렙토마이세스 노우르세이(Streptomyces noursei) 균주로부터 생산된 항진균 물질의 천연(naturally occurring) 복합체이다. 나이스타틴의 주요 성분은 하기에 나타낸 구조를 가지는 폴리엔 마크로라이드(polyene macrolide)인 나이스타틴 A₁이다:

나이스타틴은 피부 및 점막(mucous membranes)의 칸디다증(candidiasis)을 치료하는 데 사용하기 위한 다수의 독점 제조물(proprietory preparations)(예를 들어, 인페스타트(Infestat), 나이스페스(Nyspes), 나이스타몬트(Nystamont), 나이스탄(Nystan), 마이코스타틴(Mycostatin) 및 닐스타트(Nilstat))로 존재하는 활성제이다. 그것은 비록 위장관으로부터 또는 피부 및 막을 통하여 흡수되기 어려움에도 불구하고, 주로 경구적(orally) 또는 국부적(topically)으로 투여된다. 그것은 비경구적으로 주어질 경우 독성이 있기 때문이다.

나이스타틴은 폴리엔 마크로라이드 항생제 계열에 속한다. 상기 계열의 다른 물질들은 피마리신(pimaricin), 리모시딘(rimocidin), 칸디시딘(candicidin), 아우레오파신(aureofacin), 레보린(levorin) 및 암포테리신(amphotericin)을 포함한다. 암포테리신은 일반적으로 가장 효과적이라고 여겨지고 있기 때문에 가장 널리 사용되는 항진균제이다. 그것은 넓은 항진균 활성 스펙트럼을 가지지만, 나이스타틴과 같이 투여 방법 및 사용될 수 있는 용량을 제한하는 독성이 있다는 큰 단점을 가진다.

따라서, 마크로라이드 폴리케타이드 항상제에 대한 연구는 암포테리신 및 특히, 독성이 낮은 새로운 암포테리신 유사체(analogues)의 확인에 초점을 맞추고 있다. 일반적으로 두 가지의 개별적인 접근법이 적용되고 있다. 첫번째 접근법에서, 연구자들은 독성을 감소시키고/감소시키거나 암포테리신의 항진균 활성을 향상시키기 위하여 화학적 변형(chemical modification)을 사용해 왔다. 암포테리신의 전합성(total synthesis)은 경제적으로 실현가능하지는 않지만, 시료 물질은 주로 스트렙토마이세스 노도수스(Streptomyces nodosus) 배양으로부터 얻어진 암포테리신 B이다. 그 결과, 화학적 변형은 암포테리신 B 고리상에 존재하는 기능기(functional groups)의 유도체화(derivatisation)에 집중되어 왔다.

가장 최근에는, 연구자들은 서로 다른 효소의 생산 라인으로 구성된 암포테리신의 생합성 경로를 타겟으로 하는 다른 접근법을 적용해 왔다. 암포테리신의 탄소 사슬은 모듈러(타입 1) 폴리케타이드 신타아제(modular(type 1) polyketide synthases)에 의하여 아세테이트 및 프로피오네이트 유닛으로부터 만들어지고, 그 결과 생성된 마크로라이드는 그 후 산화(oxidation), 당화(glycosylation) 및 수산화(hydroxylation)를 일으키는 다른 효소에 의해 변경된다. 이러한 생합성에 관련된 효소를 암호화하는 유전자들이 확인되었으므로, 연구자들은 예를 들어, 유전자를 제거(removing), 삽입(adding) 또는 변경(modifying)함으로써 천연 생합성 경로에 변화를 도입하여 상기 생합성에 관련된 효소를 제거하고, 삽입하거나 변경할 수 있었다. 최종 결과물은 변경된 암포테리신 분자들이다.

따라서, 다수의 변경된 암포테리신 분자들, 특히 화학적으로 변경된 유도체들이 만들어지고 테스트되었다. 그러나, 이러한 노력들에도 불구하고, 약제학적 특성의 적절한 균형, 즉 높은 항진균성 활성, 저독성 및 수용성을 가지는 유망한 약품 후보물질들은 거의 확인되지 않았다. 그러므로, 감염성 질환 및 특히, 발병률이 증가하고 있는 급성 전신성 진균증(acute systemic fungal infections)을 치료하기 위한 새로운 항생제에 대한 필요성이 여전히 남아있다. 이러한 필요성은 존재하는 항진균제의 발달에 대한 내성 때문에 더욱 더 절박해질 것이다.

나이스타틴을 변경하는 것에 대한 연구는 아마도 암포테리신과 비교하여 암포테리신보다 낮은 활성을 가지며 여전히 독성과 불수용성의 동일한 단점을 가지기 때문에 거의 이루어지고 있지 않다. 그 결과, 그것은 이러한 작업에 대한 흥미로운 시작 물질로서 고려되고 있지 않다.

최근의 연구에서(Organic Letters, 2006, 8(9), 1807-1809), 마이코사민(mycosamine)의 아미노기의 환원성 알킬화(reductive alkylation)에 의해 두 개의 나이스타틴 유도체를 제조하였다. 생성된 유도체들은 나이스타틴보다 더 높은 항진균 활성을 가지지만, 동일한 방법으로 제조된 암포테리신 B 유도체보다는 활성이 작다는 것을 발견하였다. 따라서, 암포테리신 B의 변경은 더욱 유망한 것으로 고려되었고, 테스트된 이 유도체들의 독성은 모분자(parent molecule)와 비교하여 현저하게 낮게 나타났다.

WO01/59126에는 폴리케타이드 신타아제 및 나이스타틴 합성을 담당하는 다른 효소를 암호화하는 유전자 클러스터의 클로닝(cloning) 및 시퀀싱(sequencing)이 기재되어 있다. WO01/59126은 또한 이론적으로 변경된 나이스타틴의 구조를 제공하기 위하여, 유전자 클러스터 상에서 수행될 수 있는 다수의 가능성이 있는 조작을 계속해서 제안하고 있다. 이것들은 나이스타틴의 폴리엔 단편으로부터 이중 결합을 제거하거나 첨가하기 위한 변경, C16 카르복실기를 제거하거나 재배치(reposition)하기 위한 변경, 하이드록시기를 더 추가하는 변경 및 마크로락톤 고리(macrolactone ring)를 절단(truncate)하기 위한 변경을 포함한다.

WO01/59126에 제안된 하나 또는 그 이상의 변경을 수행함으로써 다수의(대략 10¹⁷) 서로 다른 변경된 나이스타틴의 구조들이 제조될 수 있다는 것이 상기에 기재한 것들로부터 즉시 명백해질 것이다. 추가의 화학적 변경과 함께 유전자 조작에 의해 생성된 임의의 화합물을 그 후 더 변경할 가능성은 10¹⁸(quintillion)의 화합물들이 이론적으로 가능하다는 것을 의미한다. 그러나, 나이스타틴에 대한 연구가 너무 적게 수행되었기 때문에, 이러한 다수의 화합물들이 나이스타틴 및/또는 암포테리신(즉, 현재 사용되는 활성제들)에 비하여 더욱 낮은 독성을 나타낼 수 있다는 것을 암시할 수 있는 데이터가 없다.

그러나, 지금 놀랍게도 나이스타틴의 특정 유도체들이 암포테리신보다 현저하게 더욱 낮은 독성을 가진다는 것을 발견하였으며, 유리하게도 동일한 유도체들이 또한 유용한 항진균 활성을 나타낸다는 것을 발견하였다. 제조된 대다수의 변경된 암포테리신 화합물들과는 달리, 현재 확인된 나이스타틴 유도체들은 "제2세대(second generation)" 유도체들이다. 달리 말하면, 이 화합물들은 나이스타틴 유도체의 유도체들이므로, 나이스타틴 A₁의 구조에 관련된 두개 또는 그 이상의 변경을 포함한다.

따라서, 첫번째 양상에서 보면, 본 발명은 C28 및 C29 사이에 존재하는 부가적인 이중결합을 가지고, 마이코사민의 하나 또는 그 이상의 C5, C9, C10, C16 위치에서 또는 아미노기에서 나이스타틴과 관련하여 더 변경된 나이스타틴 유도체인 화합물 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

다른 양상에서 보면, 본 발명은 C28 및 C29 사이에 존재하는 부가적인 이중결합을 가지고, 마이코사민의 하나 또는 그 이상의 C5, C7, C9, C10, C11, C16 위치에서 또는 아미노기에서 나이스타틴과 관련하여 더 변경된 나이스타틴 유도체인 화합물 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

본 발명의 바람직한 화합물은 화합물 (II)

또는 화합물 마이코헵틴(하기에 나타냄)

이 아니라는 것을 조건으로 하는, 일반식 I의 화합물

또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염이고, 여기에서,

R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 수소 원자, 하이드록시기, 알콕시기, 아실옥시기 또는 알킬기를 나타내거나, 함께 카보닐기를 형성하고(예를 들어, R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 하이드록시기를 나타내거나, 함께 카보닐기를 형성한다);

R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 수소 원자, 하이드록시기, 알콕시기, 아실옥시기 또는 알킬기를 나타내거나, 함께 카보닐기를 형성하고(예를 들어, R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 하이드록시기를 나타내거나, 함께 카보닐기를 형성한다);

R⁵ 및 R⁶는 각각 독립적으로 수소 원자, 하이드록시기, 알콕시기, 아실옥시기 또는 알킬기를 나타내고(예를 들어, 수소 원자 또는 하이드록시기);

R⁷은 수소 원자, COOH, 알킬기, 알콕시기, 카르복실산 에스테르기 또는 아미드기를 나타내고(예를 들어, COOH, 알킬기, 카르복실산 에스테르기 또는 아미드기);

R⁸ 및 R⁹는 각각 독립적으로 수소 원자, 알킬 아미노기, 당기(sugar group) 또는 아실기를 나타낸다.

또한 상기 조건에 영향을 받는 본 발명의 보다 바람직한 화합물은 일반식 (I)의 화합물이지만, 여기에서 탄소 7 및/또는 탄소 11에서 -OH기는 예를 들면, 옥소기로 전환된다. 이것은 일반식 (I'), 즉

이고, 여기에서 모든 치환기들은 일반식 (I)에 정의된 것과 같으며, R^1', R^2', R^3' 및 R^4'는 각각 독립적으로 R¹-R⁴로 각각 정의된 것과 같고, 일반식 (I')의 화합물은 칸디딘(candidin, 하기에 나타냄)이 아니라는 것을 조건으로 한다.

다른 양상에서 보면, 본 발명은

(i) C28 및 C29 사이에 이중 결합을 가지는 나이스타틴 유도체를 만들기 위하여, 나이스타틴 합성에 관련되는 폴리케타이드 신타아제 시스템을 암호화하는 유전자 클러스터를 변경하고;

(ii) 마이코사민의 하나 또는 그 이상의 C5, C9, C10, C16 위치에서 또는 아미노기에서 더 변경된 나이스타틴 유도체를 만들기 위하여, 상기 유전자 클러스터를 부가적으로 변경하고; 또는

(iii) 화학 반응에 의하여 마이코사민의 하나 또는 그 이상의 C5, C9, C10, C16 위치에서 또는 아미노기에서, 상기에서 만들어진 유도체를 변경하는 것,

을 포함하는 상기에 기재된 것과 같은 화합물을 만들기 위한 방법을 제공한다.

다른 양상에서 보면, 본 발명은

(i) C28 및 C29 사이에 이중 결합을 가지는 나이스타틴 유도체를 만들기 위하여, 나이스타틴 합성에 관련되는 폴리케타이드 신타아제 시스템을 암호화하는 유전자 클러스터를 변경하고;

(ii) 마이코사민의 하나 또는 그 이상의 C5, C7, C9, C10, C11, C16 위치에서 또는 아미노기에서 더 변경된 나이스타틴 유도체를 만들기 위하여, 상기 유전자 클러스터를 부가적으로 변경하고; 또는

(iii) 화학 반응에 의하여 마이코사민의 하나 또는 그 이상의 C5, C7, C9, C10, C11, C16 위치에서 또는 아미노기에서, 상기에서 만들어진 유도체를 변경하는 것,

을 포함하는 상기에 기재된 것과 같은 화합물을 만들기 위한 방법을 제공한다.

여전히 다른 양상에서 보면, 본 발명은 상기에 기재된 것과 같은 화합물 및 담체, 희석제 또는 첨가제를 포함하는 조성물을 제공한다.

또 다른 양상에서 보면, 본 발명은 치료에 사용하기 위한 상기에 기재된 것과 같은 화합물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양상은 진균 감염 치료를 위한 조성물의 제조를 위한 상기에 기재된 것과 같은 화합물의 용도이다.

본 발명의 여전히 다른 양상은 상기에 기재된 것과 같은 화합물을 동물(예를 들어, 인간)에 투여하는 것을 포함하는 동물에서의 진균 감염의 치료 방법이다.

본원에서 사용된 상기 용어 "나이스타틴 유도체(nystatin derivative)"는 조건으로서 지정된 특정 변경을 제외하고는 나이스타틴 A₁에 대해 동일한 구조를 가지는 화합물을 포함하는 것으로 한다. 따라서, 바람직한 유도체들은 C28 및 C29에 부가적인 이중 결합을 제외하고는 나이스타틴과 같은 동일한 마크로락톤 고리를 가지고, 마이코사민의 하나 또는 그 이상의 C5, C7, C9, C10, C11, C16 위치에서 또는 아미노기에서의 변경을 제외하고는 나이스타틴과 같은 동일한 기능기를 가진다. 따라서, 바람직한 유도체들은 하기에 나타낸 당화된 마크로락톤 고리 골격(glycosylated macrolactone ring skeleton)을 포함한다:

또는

또는

이 화학식들에서, 마이코사민의 C5, C9, C10, C16 및 N 상에 변경이 있을 수 있음을 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 나타낸 것은 존재해야만 하는 원소들 뿐이다. 이 도면들은 존재할 수 있는 화학 골격을 나타낸다.

본원에서 사용된 상기 용어 "폴리케타이드 신타아제 시스템(polyketide synthase system)"은 폴리케타이드 합성 및 변경에 관련되는 효소의 집합을 의미한다. 이것은 폴리케타이드 신타아제(polyketide synthases), 모노옥시게나아제(monooxygenases), 글리코실트랜스퍼라아제(glycosyltransferase) 및 아미노트랜스퍼라아제(aminotransferase)를 포함한다.

상기 용어 "알킬기(alkyl group)"는 본원에서 고리형(cyclic) 또는 비고리형(acyclic), 직쇄(straight-chained) 또는 분지쇄(branched)의, 포화 탄화수소기(saturated hydrocarbon group)를 나타내기 위하여 사용된다. 이러한 기들은 20개 이하의 탄소 원자를 포함할 수 있지만, 기들은 1 내지 12개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 것이 바람직하다.

알킬기는 비치환되거나 치환될 수 있다. 치환된 알킬기에 존재할 수 있는 치환기는 하이드록시, 알콕시, 아실옥시 및 아미노를 포함한다.

알킬기는 또한 하나 또는 그 이상의 기, 예를 들면, (Ph와 같은) -아릴-, -O-, -NR¹²- 또는 -S-에 의해 중단될 수 있고, 여기에서 R¹²는 수소 원자 또는 C_{1 -6} 알킬기를 나타낸다.

상기 용어 "알콕시(alkoxy)"는 본원에서 -OR¹³ 기를 나타내기 위하여 사용되며, 여기에서 R¹³은 상기에 정의된 것과 같은 알킬기이다. 바람직한 알콕시기에서, R¹³은 1 내지 6개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함한다. 바람직한 알콕시기는 -OC_{1 -6}, 예를 들면 -OCH₃이다.

상기 용어 "아실옥시(acyloxy)"는 본원에서 -OCOR¹⁴ 기를 나타내기 위하여 사용되며, 여기에서 R¹⁴는 상기에 정의된 것과 같은 알킬기이다. 바람직한 아실옥시기에서, R¹⁴는 1 내지 6개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함한다. 바람직한 아실옥시기는 -OCOC_{1 -6}, 예를 들면 -OCOCH₃이다.

상기 용어 " 카르복실산 에스테르기(carboxylic acid ester group)"는 본원에서 -COOR¹⁵ 기를 나타내기 위하여 사용되며, 여기에서 R¹⁵는 상기에 정의된 것과 같은 알킬기이다. 바람직한 카르복실산 에스테르기에서, R¹⁵는 1 내지 6개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소원자를 포함한다. 바람직한 카르복실산 에스테르기는 -COOC_{1 -6}, 예를 들면 -COOCH₃이다.

상기 용어 "아미드기(amide group)"는 본원에서 일반식 III의 기를 나타내기 위하여 사용되며:

여기에서, R¹⁰ 및 R¹¹은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 상기에 기재된 것과 같은 선택적으로 치환된 알킬기 또는 함께 상기에 기재된 것과 같은 알킬 고리를 형성하는 것을 나타낸다.

상기 용어 "알킬아미노기(alkylamino group)"는 본원에서 -(CH₂)_xNR¹⁶R¹⁷ 기를 나타내기 위하여 사용되며, 여기에서 x는 1 내지 10, 바람직하게는 2 내지 6(예를 들어, 3)이고, R¹⁶ 및 R¹⁷은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C_{1 -6} 알킬기를 나타낸다.

상기 용어 "당(sugar)"은 본원에서 당류(saccharides), 특히 다당류(oligosaccharides) 및 단당류(monosaccharides)를 나타내기 위하여 사용된다. 본 발명의 화합물에 존재하는 당은 임의의 수의 당류 유닛(saccharides units)을 포함할 수 있지만, 바람직한 화합물은 1 내지 10개의 당류 유닛, 예를 들어 1 내지 2개의 당류 유닛을 포함한다.

상기 용어 "아실(acyl)"은 본원에서 -COR¹⁸ 기를 나타내기 위하여 사용되며, 여기에서 R¹⁸는 상기에 기재된 것과 같은 알킬기이다. 바람직한 아실기에서, R¹⁸는 치환된 알킬기, 예를 들어 아미노 치환된 알킬기이다. 특히 바람직한 아실기는 아미노아실기이다.

상기에 기재된 것과 같이, 본 발명의 화합물은 C28 및 C29 사이에 존재하는 부가적인 이중 결합을 가지고, 마이코사민의 하나 또는 그 이상의 C5, C7, C9, C10, C11, C16 위치에서 또는 아미노기에서 나이스타틴과 관련하여 더 변경된 나이스타틴 유사체이다.

본 발명의 바람직한 화합물은 나이스타틴과 관련된 C5에서 변경된다. 나이스타틴에서, C5는 하이드록시기 및 수소 원자로 치환되며, C5는 R 입체중심(R stereocenter)이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 화합물에서 C5는 하이드록시기 및 수소 원자를 제외한 기로 치환되고/되거나 C5는 S 입체중심이다. 바람직한 화합물에서, 서로 다른 기가 C5에 존재하며, 예를 들어 C5는 두개의 하이드록시기 또는 두개의 수소 원자로 치환될 수 있다. 특히 바람직한 화합물에서, C5는 카보닐기로 치환된다.

본 발명의 다른 바람직한 화합물은 나이스타틴과 관련된 C16에서 변경된다. 나이스타틴에서, C16은 카르복실산 및 수소 원자로 치환되며, R16은 R 입체중심이다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 화합물에서 C16은 카르복실산기 및 수소 원자를 제외한 기로 치환되고/되거나 C16은 S 입체중심이다. 바람직한 화합물에서, 서로 다른 기, 예를 들어 알킬기(예를 들면, 메틸) 및 수소 원자 또는 아미드기 및 수소 원자가 존재한다. 특히 바람직한 화합물에서, C16은 메틸기 및 수소 원자로 치환된다. 바람직한 화합물에서 C16은 R 입체중심이다.

본 발명의 더욱 바람직한 화합물은 나이스타틴과 관련된 C9에서 변경된다. 나이스타틴에서 C9는 두개의 수소 원자로 치환된다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 화합물에서, C9는 두개의 수소 원자를 제외한 기로 치환된다. 바람직한 화합물에서, 서로 다른 기, 예를 들어 하이드록시기 및 수소 원자 또는 카보닐기가 존재한다.

본 발명의 더욱 바람직한 화합물은 나이스타틴과 관련된 C7에서 변경될 수 있다. 나이스타틴에서 C7은 하이드록실로 치환된다. 그러므로, 본 발명의 어떤 화합물에서, C7은 하이드록실을 제외한 기로 치환된다. 바람직한 화합물에서, 카보닐기가 존재한다. 카보닐이 존재할 경우, 또한 상기에 묘사된 화합물 칸디딘을 제외하기 위하여 존재할 나이스타틴에 관련되는 마이코사민의 C5, C7, C9, C10, C11, C16 에서 또는 N에서 화합물을 더 변경할 필요가 있을 것이다.

본 발명의 더욱 바람직한 화합물은 나이스타틴과 관련된 C11에서 변경될 수 있다. 나이스타틴에서 C11은 하이드록실로 치환된다. 그러므로, 본 발명의 어떤 화합물에서, C11은 하이드록실을 제외한 기로 치환된다. 바람직한 화합물에서, 카보닐기가 존재한다.

본 발명의 여전히 더욱 바람직한 화합물은 나이스타틴과 관련된 C10에서 변경된다. 나이스타틴에서 C10은 하이드록시기 및 수소 원자로 치환되며, C10은 R 입체중심이다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 화합물에서, C10은 하이드록시기 및 수소 원자를 제외한 기로 치환되고/되거나 C10은 S 입체중심이다. 바람직한 화합물에서, 서로 다른 기, 예를 들어 두개의 수소 원자 또는 카보닐기가 존재한다. 특히 바람직한 화합물에서, C10은 두개의 수소 원자로 치환된다.

본 발명의 더 바람직한 화합물은 나이스타틴과 관련되는 마이코사민의 아미노기에서 변경된다. 나이스타틴에서 마이코사민의 아미노기는 비치환되며, 즉 그것은 -NH₂이다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 화합물에서, 마이코사민의 아미노기는 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 알킬아미노기 또는 당 기로 치환된다.

본 발명의 화합물이 C5 또는 C7에 카보닐을 가지는 경우, 만일 나이스타틴에 관련된 마이코사민의 C5, C7, C9, C10, C11, C16에서 또는 N에서 화합물의 추가 변경이 또 존재한다면 특히 바람직하다. 예를 들면, 마이코사민의 아민은 수소를 제외한 적어도 하나의 치환기 R⁸/R⁹를 운반하기 위하여 기능화될 수 있다.

본 발명의 화합물은 S44HP와 같은 공지의 물질과 관련된 단지 하나의 변화(change)만을 포함하고, C10, C11, C16에서 또는 N에서 두개의 변화를 포함할 것이다. 바람직한 화합물은 나이스타틴과 관련된 마이코사민의 C5, C7, C9, C10, C11, C16 또는 N에서 세개의 변화를 포함할 수 있다. 더욱 바람직한 화합물은 S44HP에 관련된 마이코사민의 C5, C7, C9, C10, C11, C16 또는 N에서 적어도 두개의 변화를 포함할 것이다. 다른 바람직한 화합물은 마이코헵틴에 관련된 마이코사민의 C5, C7, C9, C10, C11, C16에서 또는 N에서 적어도 두개의 변화를 포함할 것이다. 더욱 바람직한 화합물은 칸디딘과 관련된 마이코사민의 C5, C7, C9, C10, C11, C16에서 또는 N에서 적어도 두개의 변화를 포함할 것이다.

특히 바람직한 화합물은 모든 나이스타틴, S44HP, 마이코헵틴 및 칸디딘에 관련된 마이코사민의 C5, C7, C9, C10, C11, C16에서 또는 N에서 적어도 두개의 변화를 포함할 것이다.

본 발명의 특히 바람직한 화합물은 상기에 설명한 것과 같은 일반식 (I) 또는 (I')의 화합물이다.

일반식 (I)의 바람직한 화합물에서, R¹은 수소 원자, 하이드록시기, 알콕시기, 아실옥시기 또는 알킬기를 나타낸다. 여전히 더욱 바람직하게는, R¹은 수소 원자, 하이드록시기 또는 알콕시기(예를 들어, -OC_{1 -6} 기), 특히 수소 원자 또는 하이드록시기(예를 들어, 하이드록시기)이다. 바람직한 화합물에서, R²는 수소 원자이다. 대안적인 바람직한 화합물에서, R¹ 및 R²는 함께 카보닐기를 형성한다. C5가 입체중심인 경우, 바람직하게는 그것은 R 중심이다.

일반식 (I)의 바람직한 화합물은 또한 R³가 수소 원자, 하이드록시기, 알콕시기, 아실옥시기 또는 알킬기를 나타내는 것이다. 여전히 더욱 바람직하게는, R³는 수소 원자, 하이드록시기 또는 알콕시기(예를 들어, -OC_{1 -6} 기), 특히 수소 원자 또는 하이드록시기(예를 들어, 수소 원자)를 나타낸다. 바람직한 화합물에서, R⁴는 수소 원자이다. 대안적인 바람직한 화합물에서, R³ 및 R⁴는 함께 카보닐기를 형성한다. C9가 입체중심일 경우, 바람직하게는 그것은 R 중심이다.

일반식 (I)의 더욱 바람직한 화합물은 R⁵가 수소 원자, 하이드록시기, 알콕시기, 아실옥시기 또는 알킬기를 나타내는 것이다. 여전히 더욱 바람직하게는, R⁵는 수소 원자, 하이드록시기 또는 알콕시기(예를 들어, -OC_{1 -6} 기), 특히 수소 원자 또는 하이드록시기(예를 들어, 하이드록시기)를 나타낸다. 바람직한 화합물에서, R⁶는 수소 원자이다. C10이 입체중심인 경우, 바람직하게는 그것은 R 중심이다.

일반식 (I)의 여전히 더욱 바람직한 화합물은 R⁷이 COOH, 알킬기, 카르복실산 에스테르기 또는 아미드기를 나타내는 것이다. 바람직한 카르복실산 에스테르기는 -COOC_{1 -6}, 더욱 바람직하게는 -COOC_{1 -4}, 예를 들면 -COOCH₃ 이다.

일반식 (I)의 특히 바람직한 화합물은 R⁷이 알킬기 또는 아미드기인 것이다. 바람직한 알킬기는 C_{1 -6} 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸, 특히 메틸이다.

바람직한 아미드는 상기에 기재된 것과 같은 일반식 III인 것들이다. 특히 바람직한 아미드는 R¹⁰ 및 R¹¹이 각각 독립적으로 수소 원자 또는 선택적으로 하이드록실, 카르복실산 에스테르 또는 아미노기로 치환되고 선택적으로 산소 또는 질소 원자로 중단된 C_{1 -10} 분지된 또는 비분지된 C_{1 -10} 알킬기를 나타내거나, R¹⁰ 및 R¹¹이 함께 선택적으로 하이드록시, 아실옥시 또는 아미노기로 치환되고 선택적으로 산소 또는 질소 원자로 중단된 C_{1 -8} 고리형 알킬기를 형성하는 것이다.

어떤 바람직한 아미드에서, R¹⁰은 수소이다. 더욱 바람직한 아미드에서, R¹¹은 일반식 IV의 기이다:

여기에서, R¹⁸는 수소 또는 6개 이하의 탄소 원자를 포함하는 알킬기(예를 들어, 메틸 또는 CH(CH₃)₂)이고;

y는 1 내지 6, 바람직하게는 2-4, 예를 들어 3이고;

Z는 OH, NR¹⁹R²⁰ 또는 COOR²¹, 여기에서 R¹⁸, R¹⁹ 및 R²¹은 각각 독립적으로 수소 또는 C_{1 -6} 알킬(예를 들어, 메틸)이다.

특히 바람직한 아미드에서, R¹⁸는 수소이다.

다른 바람직한 아미드에서, R¹⁰ 및 R¹¹은 함께 고리형 알킬기, 바람직하게는 일반식 V의 고리형 알킬기를 형성하며,

여기에서, a, b 및 c는 각각 독립적으로 1 내지 6, 바람직하게는 2 내지 4, 예를 들어, 2를 나타내고; Z는 일반식 IV에 관련하여 상기에 정의된 것과 같다.

일반식 III의 특히 바람직한 아미드기의 대표예는 하기에 나타낸 것들이다:

아미드기 4, 6, 7, 8 및 10, 특히 아미드기 7 및 10이 특히 바람직하다.

일반식 (I)의 보다 바람직한 화합물은 R⁸이 수소 원자, 알킬아미노기, 당기 또는 아실기를 나타내는 것이다. 바람직한 화합물에서, R⁹는 R⁸과 동일하거나 수소 원자이고, 예를 들어 R⁹는 수소 원자이다.

바람직한 알킬아미노기는 일반식 -(CH₂)_xNH₂인 것들이고, 여기에서 x는 2 내지 6(예를 들어, 3) 또는 그것들의 알킬화된 유사체 -(CH₂)_xNC_{1 - 6}알킬₂, 예를 들어 -(CH₂)_xNMe₂이다. 다른 바람직한 기는 라이신 잔기 COCH[(CH₂)₄NH₂]NH₂이고, 바람직한 당기는 1 내지 5개의 당류 유닛, 더욱 바람직하게는 2 또는 3개의 당류 유닛을 포함한다.

당기가 단당류인 경우, 그것은 선형(linear), 고리형(cyclic) 또는 선형과 고리형의 형태 이성질체(conformers)의 혼합물로서 존재할 수 있다. 당기가 하나 이상의 당류 유닛을 포함하는 경우, 각 단당류는 고리형, 선형 또는 고리형과 선형의 형태 이성질체의 혼합물일 수 있다. 더욱이, 상기 당류 유닛은 동일하거나 서로 다르게 존재할 수 있다.

일반식 (I)의 화합물에서, 바람직한 단당류는 펜토오스(pentose) 및 헥소오스(hexoses), 예를 들어 글루코오스(glucose), 갈락토오스(galactose), 글루코피라노오스(glucopyranose), 만노피라노오스(mannopyranose), 갈락토피라노오스(galactopyranose), 프룩토피라노오스(fructopyranose) 및 타고토피라노오스(tagotopyranose)이다. 바람직한 이당류 및 올리고당류는 락토오스(lactose), 멜리비오스(melibiose), 수크로오스(sucrose), 말토오스(maltose) 및 셀로비오스(cellobiose)를 포함한다. D-글루코오스, D-갈락토오스 및 락토오스가 특히 바람직하다.

(R⁸에 대하여) 더욱 바람직한 아실기는 -(CH₂)Ph(CH₂)_xNH₂ 또는 -(CH₂)Ph(CH₂)xNMe₂를 포함하고, 여기에서 x는 0/1이다.

본 발명의 특히 바람직한 화합물은 일반식 I의 화합물들이며, 여기에서 R¹ 및 R²는 함께 카보닐기를 형성한다. 더욱 바람직하게는, R¹ 및 R²가 카보닐기를 형성하는 경우, R³, R⁴ 및 R⁶은 수소 원자이고, R⁵는 하이드록시기이다. 이와 같은 화합물에서, 바람직하게는 적어도 하나의 R⁸ 및 R⁹(예를 들어, R⁸과 R⁹ 모두)는 수소 원자이다. 특히 바람직하게는 C10은 R 입체중심이다.

본 발명의 다른 특히 바람직한 화합물은 일반식 I의 화합물들이며, 여기에서 R⁷은 C_{1 -6} 알킬(예를 들어, 메틸)이다. 더욱 바람직하게는, R⁷이 C_{1 -6} 알킬(예를 들어, 메틸)인 경우, 적어도 하나의 R⁸ 및 R⁹(예를 들어, R⁸과 R⁹ 모두)는 수소 원자이다. 이와 같은 화합물에서, R⁵는 바람직하게는 하이드록시기이고, R⁶는 수소 원자이다. 여전히 더욱 바람직하게는, R³ 및 R⁴는 수소 원자이다. 특히 바람직하게는, C10은 R 입체중심이다.

본 발명의 여전히 더욱 바람직한 화합물은 일반식 I의 화합물들이고, 여기에서 R⁷은 아미드기이며, 바람직하게는 일반식 III의 아미드기는 앞서 기재된 것이다. 더욱 바람직하게는, R⁷이 아미드기인 경우, 적어도 하나의 R⁸ 및 R⁹(예를 들어, R⁸과 R⁹ 모두)는 수소 원자이다. 이와 같은 화합물에서, R⁵는 바람직하게는 하이드록시기이고, R⁶는 수소 원자이다. 여전히 더욱 바람직하게는, R³ 및 R⁴는 수소 원자이다. 특히 바람직하게는, C10은 R 입체중심이다.

본 발명의 여전히 더욱 바람직한 화합물은 일반식 I의 화합물들이며, 여기에서 R⁸은 상기 기재된 것과 같은 당기 또는 알킬아미노기이다. 더욱 바람직하게는, R⁸이 당기 또는 알킬아미노기인 경우, R⁹는 수소 원자이다. 이와 같은 화합물에서, R⁷은 바람직하게는 COOH이다. 여전히 더욱 바람직하게는, R⁵는 하이드록시기이고, R⁶는 수소 원자 및/또는 R³ 및 R⁴는 수소 원자이다. 특히 바람직하게는, C10은 R 입체중심이다.

일반식 (I')의 화합물에 대하여, 바람직한 선택(option)은 일반식 (I)과 관련하여 상기에 설명한 화합물들이다. 게다가, 일반식 (I')의 바람직한 화합물에서, R^1'는 하이드록실을 나타내고, R^2'는 수소 원자이거나 R^1' 및 R^2'는 함께 카보닐기를 형성한다. C7이 입체중심인 경우, 바람직하게는 그것은 R 중심이다.

바람직하게는, 단지 R^1'/R^2' 또는 R^3'/R^4' 중의 하나만이 카보닐을 나타낸다.

본 발명의 바람직한 대표예를 도 1에 나타내었다. 특히 바람직한 화합물은 화합물 번호 1, 2, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21 및 22, 특히 화합물 번호 1, 2, 9, 11, 12, 13, 14, 21 및 22, 예를 들어, 화합물 번호 1 및 11이다.

보다 바람직한 화합물은 C16 카르복시기가 디메틸에틸아미드로 전환된 화합물이다. 동일한 카르복시기가 메틸기로 전환된 화합물 또한 바람직하다. 특히 바람직한 화합물은 상기 C16 변경(alteration) 중의 하나를 가질 뿐만 아니라 폴리올 영역(C5-C11)에서의 변화를 가지는 화합물을 포함한다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 화합물은 약제학적으로 허용가능한 염의 형태를 취할 수 있다. 이와 같은 염은 생리학적으로 허용가능한 유기산 또는 무기산을 이용한 산 부가염을 포함한다. 이와 같은 염을 형성하기에 적절한 산의 예는 아세트산(acetic acid), 아스파르트산(aspartic acid), 벤젠술폰산(benzenesulfonic acid), 벤조산(benzoic acid), 바이카르본산(bicarbonic acid), 바이술폰산(bisulfuric acid), 바이타르타르산(bitartaric acid), 부티르산(butyric acid), 칼슘 에데테이트(calcium edetate), 캄시르산(camsylic acid), 탄산(carbonic acid), 클로로벤조산(chlorobenzoic acid), 시트르산(citric acid), 에데트산(edetic acid), 에디실산(edisylic acid), 에스톨산(estolic acid), 에실산(esylic acid), 포름산(formic acid), 푸마르산(fumaric acid), 글루셉틱산(gluceptic acid), 글루콘산(gluconic acid), 글루탐산(glutamic acid), 글리콜릴아르사닐산(glycollylarsanilic acid), 헥산산(hexamic acid), 헥실레조르시논산(hexylresorcinoic acid), 하이드라밤산(hydrabamic acid), 하이드로브롬산(hydrobromic acid), 하이드로클로린산(hydrochloric acid), 하이드로이오딘산(hydroiodic acid), 하이드록시나프토인산(hydroxynaphthoic acid), 이세티온산(isethionic acid), 젖산(lactic acid), 락토바이온산(lactobionic acid), 말레산(maleic acid), 말산(malic acid), 말론산(malonic acid), 만델산(mandelic acid), 메탄술폰산(methanesulfonic acid), 메탄니트르산(methanenitric acid), 메틸 황산(methylsulfuric acid), 무스산(mucic acid), 뮤콘산(muconic acid), 납실산(napsylic acid), 질산(nitric acid), 옥살산(oxalic acid), p-니트로메탄술폰산(p-nitromethanesulfonic acid), 파모인산(pamoic acid), 판토텐산(pantothenic acid), 인산(phosphoric aicd), 인산 일수소산(monohydrogen phosphoric acid), 인산 이수소산(dihydrogen phosphoric acid), 프탈산(phthalic acid), 폴리갈락토우론산(polygalactouronic acid), 프로피온산(propionic acid), 살리실산(salicylic acid), 스테아린산(stearic acid), 석신산(succinic acid), 설파민산(sulfamic acid), 설파닐산(sulfanilic acid), 술폰산(sulfonic acid), 황산(sulfuric acid), 타닌산(tannic acid), 타르타르산(tartaric acid), 테오클린산(teoclic acid) 및 톨루엔술폰산(toluenesulfonic acid)을 포함한다. 글루탐산 염(glutamate salts)이 특히 바람직하다. 대안적인 염은 염기를 이용하여 만들어질 수 있다. 이와 같은 염을 형성하기 위한 적절한 염의 예는 1차, 2차 및 3차 아민, 자연적으로 생성된 치환 아민(naturally occurring substituted amines), 시클릭 아민(cyclic amines), 아르기닌(arginine), 베타인(betaine), 카페인(caffeine), 콜린(choline), N,N-디벤질에틸렌디아민(N,N-dibenzylethylenediamine), 디에틸아민(diethylamine), 2-디에틸아미노에탄올(2-diethylaminoethanol), 2-디메틸아미노에탄올(2-dimethylaminoethanol), 에탄올아민(ethanolamine), 에틸렌디아민(ethylenediamine), N-에틸몰포린(N-ethylmorpholine), N-에틸피페리딘(N-ehtylpiperidine), 글루카민(glucamine), 글루코사민(glucosamine), 히스티딘(histidine), 하이드라바민(hydrabamine), 이소프로필아민(isopropylamine), 리신(lysine), 메틸글루카민(methylglucamine), 몰포린(morpholine), 피페라진(piperazine), 피페리딘(piperidine), 폴리아민 수지(polyamine resins), 프로카인(procaine), 퓨린(purines), 테오브로민(thobromine), 트리에틸아민(triethylamine), 트리메틸아민(trimethylamine) 및 트리프로필아민(tripropylamine)을 포함하는 치환된 아민을 포함한다. 상기 약제학적으로 허용가능한 염은 수화된 형태일 수 있다. 이와 같은 염으로 일반식 (I)의 화합물을 전환하기 위한 방법은 당업계에 일반적이다.

본 발명의 매우 바람직한 화합물은 하기의 골격으로부터 유래될 수 있다(위치 16 또는 아미노기 상에서 COOH 기는 원하는 대로 기능화된다, 예를 들어, COOH가 R7로 대체됨). 일반적으로, 수소 원자는 이 골격들 상에 표시되지 않는다는 것에 유의하라. 이것들이 여전히 존재한다는 것을 확인할 수 있을 것이다(즉, -O 원자 상에서 하이드록시기를 형성하기 위하여):

예시의 화합물 1

S44HP(위치 16 또는 N기 상에서 COOH기가 기능화된 경우)

본 발명의 화합물에는 다수의 변수가 있다는 것을 확인할 수 있을 것이다. 불확실함을 피하기 위하여, 변수들의 정의에 대한 각 개시는 명세서의 다른 변수들의 모든 정의와 관련되어 기재되는 것으로 간주됨을 강조한다. 따라서, 특히 각 변수에 대한 바람직한 선택들은 임의의 다른 변수들에 대하여 덜 바람직한 및 바람직한 선택과 함께 조합될 수 있다.

본 발명의 화합물은 기존의 합성 화학(synthetic chemistry), 유전자 조작(genetic manipulation) 또는 그것들의 조합을 포함하는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 양상은

(i) C28 및 C29 사이의 이중 결합을 가지는 나이스타틴 유도체를 만들기 위하여, 나이스타틴 합성에 관련되는 폴리케타이드 신타아제 시스템을 암호화하는 유전자 클러스터를 변경하고;

(ii) 마이코사민의 하나 또는 그 이상의 C5, C7, C9, C10, C11, C16 위치에서 또는 아미노기에서 더 변경된 나이스타틴 유도체를 만들기 위하여, 상기 유전자 클러스터를 부가적으로 변경하고; 또는

(iii) 화학 반응에 의하여 마이코사민의 하나 또는 그 이상의 C5, C7, C9, C10, C11, C16 위치에서 또는 아미노기에서, 상기에서 만들어진 유도체를 변경하는 것;

을 포함하는 상기에 기재된 것과 같은 화합물을 만들기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 방법은 단계 (i) 및 (ii), 즉 C28 및 C29 사이에 이중 결합을 가지는 나이스타틴 유도체를 만들기 위하여 나이스타틴 합성에 관련되는 폴리케타이드 신타아제 시스템을 암호화하는 유전자 클러스터를 변경하고, 마이코사민의 하나 또는 그 이상의 C5, C7, C9, C10, C11, C16 위치에서 또는 아미노기에서(즉, 하나 또는 그 이상의 C5, C9, C10 또는 C16 위치) 나이스타틴과 관련하여 더 변경하는 것을 포함한다.

본 발명의 두번째 바람직한 방법은 단계 (i) 및 (iii)을 포함한다. 나이스타틴 합성에 관련되는 폴리케타이드 신타아제 시스템을 암호화하는 유전자 클러스터의 변경은 예를 들면, WO01/59126에 기재된 것과 같은 기존의 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 나이스타틴 폴리케타이드 신타아제 유전자 클러스터는 각 폴리케타이드 사슬의 합성에서 하나의 응축 사이클(condensation cycle)과 관련되는 다수의 반복 유닛(모듈)을 암호화한다. 폴리케타이드 사슬 합성의 개시(initiation)를 위한 "스타터(starter)" 유닛(카르복실산)의 특성을 결정하는 로딩 모듈(loading module)(nysA)과 "익스텐더(extender)" 유닛(사슬 상에 첨가되는 다음의 카르복실산)이 더 통합된(사슬 상에 응축됨) 18 "익스텐션(extension)" 모듈이 있다. 따라서, 각각의 이와 같은 모듈은 분자를 합성하는 다수의 효소적 활성(예를 들어, 효소)을 암호화하고; 상기 모듈은 개별적으로 이와 같은 활성을 암호화하는 도메인을 포함한다. 따라서, 모듈은 전형적으로 합성을 위한 아실트랜스퍼라아제(acyltransferase; AT) 도메인, 아실 운반 단백질(acyl carrier protein; ACP) 도메인, 베타-케토아실 신타아제(β-ketoacyl synthase; KS) 도메인과 통합된 스타터/익스텐더 유닛의 감소된 상태를 결정하는 익스텐션(케토리덕타아제(ketoreductase; KR), 디하이드라타아제(dehydratase; DH) 및 에놀 리덕타아제(enoyl reductase; ER)) 도메인을 포함할 수 있다. 상기 유전자 클러스터는 나이스타틴 생합성에 관련된 다른 효소(또는 효소적 활성)를 암호화하는 유전자(또는 오픈 리딩 프레임(open reading frames, ORFs))를 더 포함한다. 따라서, 티오에스테라아제(thioesterase; TE)는 PKS로부터 폴리케타이드를 방출하게 할 수 있다. 게다가, 유전자 클러스터에서 유전자 또는 유전자 서열들은 합성된 분자들(폴리케타이드 사슬)을 더 변경할 수 있는 효소 또는 효소적 활성(예를 들면, 모노옥시게나아제(예를 들어, nysN 또는 nysL)에 의한 수산화(hydroxylation) 또는 글루쿠로노실 트랜스퍼라아제 활성(예를 들어, nys D1)에 의한 당화(glycosylation))을 암호화할 수 있다.

따라서, PKS 유전자 클러스터의 모듈 및/또는 도메인들은 그것의 활성을 바꾸기 위하여, 예를 들면 삽입(insertion), 삭제(deletion) 또는 불활성(inactivation)에 의하여, 또는 도메인 또는 모듈의 치환에 의하여, 또는 도메인 또는 모듈의 돌연변이(mutation)에 의하여 변경될 수 있다. 따라서, 다수의 모듈 및/또는 도메인들이 그들의 활성을 바꾸기 위하여 변경(modified or altered)될 수 있다. 다른 효소 활성, 예를 들면 모노옥시게나아제 또는 글리코실트랜스퍼라아제를 암호화하는 다른 유전자 또는 유전자 서열들 또한 변경될 수 있다. 전형적으로, "환원성(reductive)" 도메인(예를 들어, ER, DH 및/또는 KR)이 하나 또는 그 이상의 모듈에서 변경(예를 들어, 불활성화)될 수 있거나, 모노옥시게나아제 활성을 암호화하는 유전자 서열(예를 들어, NysL, NysN)이 변경(예를 들어, 불활성화)될 수 있다.

C28 및 C29 사이의 이중 결합은 예를 들어, WO01/59126의 실시예 2에 기재된 것과 같이 폴리케타이드 신타아제의 모듈 5에서 ER 도메인의 불활성화에 의해 도입될 수 있다.

예를 들어, 하나 또는 그 이상의 C5, C9, C10 또는 C16 위치에서의 나이스타틴과 관련되는 추가 변경은 폴리케타이드 신타아제 시스템을 암호화하는 유전자 클러스터에 대한 다른 변경에 의해 도입될 수 있다. 상기 유전자 클러스터에 대하여 추가 변경이 되는 경우, 그것들은 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 C5, C9, C10 또는 C16에서 나이스타틴과 관련되는 변경을 만든다.

C5에서의 나이스타틴 구조의 변경은 나이스타틴 폴리케타이드 신타아제의 모듈 17에서 케토리덕타아제 도메인의 불활성화, 예를 들면 실시예에 기재된 방법에 의하여 유발될 수 있다.

C9에서의 나이스타틴 구조의 변경은 나이스타틴 폴리케타이드 신타아제의 모듈 15에서 케토리덕타아제 도메인의 불활성화, 예를 들면 실시예에 기재된 방법에 의하여 유발될 수 있다.

C10에서의 나이스타틴 구조의 변경은 C10 수산화에 관련되는 NysL 모노옥시게나아제에 대한 유전자의 불활성화, 예를 들면 실시예에 기재된 방법에 의하여 유발될 수 있다.

C7에서의 나이스타틴 구조의 변경은 KR16 도메인의 불활성화에 의하여 유발될 수 있다.

C11에서의 나이스타틴 구조의 변경은 KR14 도메인의 불활성화에 의하여 유발될 수 있다.

C16에서의 나이스타틴 구조의 변경은 P450 모노옥시게나아제를 암호화하는 유전자 nysN의 불활성화, 예를 들면 실시예에 기재된 방법에 의하여 유발될 수 있다.

화학 반응에 의하여 마이코사민의 하나 또는 그 이상의 C5, C7, C9, C10, C11, C16 위치에서 또는 아미노기에서 단계 (i) 및 선택적으로 단계 (ii)로부터 생성된 화합물의 추가 변경은 임의의 공지된 방법에 의하여 수행될 수 있다. 기존의 보호기 화학(protecting group chemistry) 또한 필요할 때마다 사용할 수 있다. 추가 변경이 화학 반응에 의해 도입되는 경우, 그것들은 바람직하게는 마이코사민의 C16 위치 및/또는 아미노기에서 나이스타틴에 관련되는 변경을 만든다.

바람직한 화학 반응은 C16에서의 아미드 형성이다. 나이스타틴 COOH기의 아미드로의 전환은 선택적으로 활성제(예를 들어, PyBOP)의 존재하에서 적절한 아민을 사용하여 나이스타틴 유도체를 반응시킴으로써 수행될 수 있다.

다른 바람직한 화학 반응은 마이코사민 아미노기에서의 환원성 알킬화(reductive alkylation)이다. 환원성 알킬화는 이민(imine)을 형성하기 위하여 적절한 알데히드를 사용하여 나이스타틴 유도체를 반응시키고, 바람직하게는 현장에서(in situ) 환원제를 첨가하여 이민을 환원시킴으로써 수행될 수 있다. 바람직한 환원제는 NaBH₃CN이다.

더욱 바람직한 화학 반응은 마이코사민 아민기에서의 아마도리 반응(Amadori reaction)이다. 상기 아마도리 반응은 적절한 환원당(reducing sugar)을 사용하여 나이스타틴 유도체를 반응시킴으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 방법은 상기에 기재된 것과 같은 일반식 (I)의 화합물을 제공한다. 이와 같은 방법에서, C5 위치에서의 변경은 나이스타틴과 관련되는 R¹ 및/또는 R²를 변경하고, C9에서의 변경은 나이스타틴과 관련되는 R³ 및/또는 R⁴를 변경하고, C10에서의 변경은 나이스타틴과 관련되는 R⁵ 및/또는 R⁶를 변경하고, C16에서의 변경은 나이스타틴과 관련되는 R⁷을 변경한다. 마이코사민의 아미노기에서의 변경은 나이스타틴과 관련되는 R⁸ 및 R⁹를 변경한다. 바람직한 방법은 일반식 I의 화합물에 관련하여 바람직한 것으로서 본원에 특정된 R¹-R⁹를 만들어내는 방법이다.

상기 화합물은 임의의 기존의 기술, 예를 들어 결정화, 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다. 본 발명의 일반식 I의 화합물은 다수의 키랄 중심(chiral centres)을 포함하며, 보통 말하는 서로 다른 입체이성질체 형태(stereoisomeric forms)로 존재한다. 특히 바람직한 화합물을 도 1에 나타내었다.

본 발명의 화합물은 진균류의 성장을 저해하거나 죽이기 위하여 다양한 용도로 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 살균제(disinfectants) 또는 (예를 들어, 식료품 및 화장품에서) 방부제(preservatives)로서 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 양상은 살균제 또는 방부제로서의 본 발명의 화합물의 용도이다.

살균제 또는 방부제로서의 용도에 대하여, 본 발명의 화합물은 단독 또는 다른 항진균제 및/또는 항균제와 조합하여 사용될 수 있다. 상기 화합물은 그 자체로(per se) 또는 더욱 바람직하게는 담체, 희석제 또는 첨가제와 함께 혼합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 진균 감염의 치료 또는 예방에 특히 적합하다. 본 발명의 화합물 및 약제학적 조성물은 신체의 내부 및 외부의 진균 감염의 치료 또는 예방에 특히 적합하다. 치료될 수 있는 신체 부분의 예는 피부, 입, 질 및 위장관을 포함한다. 상기 화합물 및 조성물은 침습성(invasive)(예를 들어, 전신성) 진균 감염의 치료에 특히 적합하다.

이상적으로는, 본 발명의 화합물은 넓은 스펙트럼 활성을 가지지만, 칸디다(Candida), 크립토코커스(Cryptococcus), 아스퍼질러스(Aspergillus), 콜레토트리쿰(Colletotrichum), 지오트리쿰(Geotrichum), 호모네마(Hormonema), 레시토포라(Lecythophora), 패실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움(Penicillium), 로도토룰라(Rhodotorula), 후자리움(Fusarium), 사카로마이세스(Saccharomyces), 트리코더마(Trichoderma), 트리코피톤(Trichophyton) 및 스코풀라리옵시스(Scopulariopsis) 종, 특히 칸디다 및 크립토코커스 종(예를 들어, 칸디다 종)에 의해 유발된 진균 감염의 치료에 특히 적합하다.

이와 같은 치료에 사용하기 위하여, 상기 화합물은 하나 또는 그 이상의 담체, 첨가제 및/또는 희석제를 사용하여 임의의 기존의 방법으로 약제학적 제형으로서 제형화될 수 있다. 특정의 약제학적 제형은 원하는 투여의 형태에 의존할 수 있으며, 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 적합한 담체, 첨가제 및 희석제의 예는 물, 에탄올, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 소디움 클로라이드, 소디움 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 당(예를 들어, 글루코오스, 수크로오스 또는 락토오스), 전분(예를 들어, 옥수수(corn or maize) 전분), 마이크로크리스탈린 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 검(gums)(예를 들어, 검 트래거캔스), 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 스테아르산 마그네슘(magnesium stearate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 지방산(예를 들어, 스테아린산), 지방, 왁스, 칼슘 카보네이트, 칼슘 클로라이드 및 시트르산을 포함한다.

이와 같은 약제학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 습윤제(wetting agents), 감미제(sweetening agents)(예를 들어, 설탕, 아스파탐 또는 사카린), 윤활제(lubricating agents), 안정화제(stabilising agents), 에멀젼화제(emulsifying agents), 현탁제(suspending agents), 방부제(preserving agents), 향미제(flavouring agents)(예를 들어, 바닐린, 페퍼민트 오일 또는 과일 향미) 및/또는 흡수 강화제(absorption enhancers)를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물은 만일 원한다면 추가로(예를 들면, 하나, 두개 또는 세개) 약제학적으로 활성을 가지는 물질과 함께 병용투여될 수 있다. 본 발명의 화합물과 추가(예를 들면, 하나) 활성 물질과의 조합 사용에 관련된 이점은 그것이 약제로서 사용하기에 적합한 조성물에 대한 질병의 범위를 넓힐 수 있다는 것이다. 부가적으로 또는 대안적으로는, 유리하게도 본 발명의 화합물 및/또는 추가 활성 물질의 투약량을 낮출 수 있을 것이다. 이와 같은 추가 활성 물질이 알려진 부작용과 연관되어 있는 경우 특히 유리하다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 추가 활성 물질은 다른 항진균제 및 항생제를 포함한다. 대표적인 항진균제는 아졸(azoles) 및 이카이노칸딘스(echinocandins)이다. 대표적인 항생제는 데메클로시클린(demeclocycline), 트리암시놀론 아세토나이드(triamcinolone acetonide), 네오마이신 설페이트(neomycin sulfate), 그라미시딘(gramicidin), 옥시테트라시클린(oxytetracycline) 및 에리트로마이신(erythromycin)을 포함한다.

본 발명에 따라 사용되는 약제학적 조성물은 경구적으로, 직장으로(예를 들면, 좌약을 사용하여), 국부적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 방법의 선택은 예를 들면, 질병 및/또는 치료될 환자에 의해 좌우될 것이지만, 경구 및 전신 투여를 위한 조성물이 바람직하다.

상기 조성물은 선택된 투여 방법에 사용하기에 적합한 임의의 형태로 존재할 수 있다. 경구 투여에 적합한 형태는 예를 들면, 일반적인(plain) 또는 코팅된(coated) 정제, 서방형 정제, 씹어먹는 정제(chewable tablet), 연질 캡슐(soft capsules), 경질 캡슐(hard capsules), 현탁제(suspensions) 및 시럽(syrups)을 포함한다. 본 발명에 따라 사용하기에 바람직한 형태는 정제, 현탁액 및 시럽, 특히 정제이다.

전신 투여에 적합한 형태는 예를 들면, 피부내(intradermal), 복강내(intraperitoneal) 또는 정맥내(intravenous) 주사(injection) 또는 주입(infusion)을 위한 제형일 수 있다. 정맥내 주사를 위한 제형이 특히 바람직하다.

국부 투여에 적용하기 위한 형태는 피부 및 점막에 투여하기 위한 조성물(예를 들어, 겔, 크림, 스프레이, 로션, 연고 및 에어로졸)을 포함한다. 상기 화합물은 또한 좌약(suppositories) 또는 저류 관장제(retention enemas)와 같은 직장 또는 질 조성물로 제형화될 수 있다.

임의의 적용에 사용될 본 발명의 화합물의 양은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있을 것이다. 예를 들면, 살균제 또는 방부제로서 사용하기 위하여 요구되는 화합물의 양은 표적 진균의 성장을 저해하거나 표적 진균에 치명적인 양이다. 한편, 실제 양은 살균제 또는 방부제로서 사용하기 위한 특정 표적 진균 및 적용에 좌우될 것이며, 본 발명의 화합물은 전형적으로 살균 용액 또는 보존될 물질의 0.5 내지 5 중량%, 더욱 바람직하게는 1 내지 3 중량%의 양으로 사용된다.

진균 감염을 치료하기 위하여, 본 발명의 화합물 뿐만 아니라 그것과 함께 혼합물로 존재하는 임의의 다른 선택적 활성 물질의 양은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 임의의 선택적 추가 활성 물질의 특성, 투여 방법, 치료될 질병 및 피험자의 체중을 포함하는 몇몇의 인자에 의해 좌우될 것이다. 그러나, 일반적으로는 본 발명의 화합물은 조성물의 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 1 내지 20 중량%의 양으로 사용될 수 있다.

본 발명은 지금 하기의 비제한 실시예 및 도면을 참조하여 설명할 것이다:

나이스타틴의 특정 유도체들은 암포테리신보다 현저하게 더욱 낮은 독성을 가지며 유용한 항진균 활성을 나타낸다.

도 1은 다수의 본 발명의 화합물의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 S44HP 및 화합물 1을 생산하는, ER5 및 NysN이 불활성화된 돌연변이체로부터 얻은 DMSO 추출물의 UV-아이소플롯(isoplots)을 나타낸 것이다.
도 3은 ER5 및 NysN이 불활성화된 돌연변이체의 DMSO 추출물로부터 얻은 주 폴리엔 피크(main polyene peak)의 TOF 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 S44HP를 생산하는 균주 GG5073SP(대조 균주) 및 화합물 2를 생산하는, ER5 및 KR17이 불활성화된 돌연변이체로부터 얻은 DMSO 추출물의 UV-아이소플롯을 나타낸 것이다.
도 5는 ER5 및 KR17이 불활성화된 돌연변이체의 DMSO 추출물로부터 얻은 주 폴리엔 피크의 TOF 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 S44HP를 생산하는 균주 GG5073SP(대조 균주) 및 화합물 3을 생산하는, ER5, KR17 및 NysN이 불활성화된 돌연변이체로부터 얻어진 DMSO 추출물의 UV-아이소플롯을 나타낸 것이다.
도 7은 ER5, KR17 및 NysN이 불활성화된 변이체의 DMSO 추출물로부터 얻은 주 폴리엔 피크의 TOF 스펙트럼을 나타낸 것이다. m/z=980 및 1034를 가지는 피크가 내부 대조군(internal references)이다.
도 8은 S44HP를 생산하는 균주 GG5073SP(대조 균주) 및 화합물 4를 생산하는, ER5 및 KR15가 불활성화된 돌연변이체로부터 얻어진 DMSO 추출물의 UV-아이소플롯을 나타낸 것이다.
도 9는 화합물 1 및 11의 생체 내 항진균 활성 테스트의 결과를 나타낸 것이다.
도 10 내지 16은 본 발명의 여러가지 화합물의 제조에 대한 반응식이다.
도 17은 파종성 칸디다증(disseminated candidiasis)의 호중구감소성 마우스 모델(neutropenic mouse model)에서의 본 발명의 신규한 화합물의 생체 내 테스트 결과를 나타낸 것이다.

화합물의 제조

표 1에 열거된 화합물들을 제조하였다. 각각의 이 화합물들의 정확한 입체화학을 도 1에 나타내었다.

* 글루탐산 염으로서

S44HP 의 합성

이 화합물을 보르고스 등에 기재된 것과 같이 제조하였다(Borgos S.E. et al., Arch Microbial. 2006 Apr; 185(3):165-71).

화합물 1-4의 합성

나이스타틴 생합성 유전자 클러스터에서 하기 조합의 부위-특이적 돌연변이(site-specific mutations)를 사용하는 유전자 조작에 의해 화합물 1-4를 제조하였다(서열 - brautaset에서, T., et al ,. Chem Biol. 2000 Jun; 7(6):395-403):

화합물 1 ER5 + NysN에서 돌연변이

화합물 2 ER5 + KR17에서 돌연변이

화합물 3 ER5 + KR17 + NysN에서 돌연변이

화합물 4 ER5 + KR15에서 돌연변이

보르고스 등에 기재된 것과 같은 ER5 불활성 벡터를 사용하였다(Borgos S.E. et al., Arch Microbial. 2006 Apr; 185(3):165-71).

하기의 구성을 설계하였고, 출원인에 의해 제조하였다:

NysN :

nysN 에 돌연변이 CL346ST 및 CL346AS 를 각각 도입하기 위한 벡터 pSOK201nysN4.1-CL346ST 및 pSOK201nysN4 .1- CL346AS

재조합 람다 클론 N95(Brautaset, T., et al., Chem Biol. 2000 Jun; 7(6):395-403)의 4.1kb의 NcoI/XbaI 단편을 플라스미드 pLITMUS28에 대응하는 부위 안으로 클로닝하였다. 그 결과 생성된 구조로부터 총 4.1kb의 삽입체(insert)를 EcoRI/HindIII로 절단하고, pGEM11zf(+)의 대응되는 부위 안으로 클로닝하였다. 그 결과 생성된 pGEM11nysN4.1로 표시하는 플라스미드로부터, NysN 활성 부위를 포함하는 1.5kb의 영역을 하기의 프라이머들을 사용하여 PCR 증폭시켰다:

conA-1F : 5'-ttttgaaTTCTTCAAGCCGATGAGCC-3'(정배열(sense)), 및

conA-1R : 5'-ttttaagctTGGTCGAACAGGTCCGG-3'(역배열(antisense)

상기 프라이머를 pGEM11zf(+)의 대응되는 부위 안으로 얻어진 PCR 단편을 클론하는 데 사용되는 EcoRI 및 HindIII 부위(밑줄친 부위)로 도입하여 플라스미드 pGEM11nysN1.5를 얻었다. 하기의 변이도입용 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 후자의 플라스미드를 부위 지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)(QuickChange kit, Stratagene을 사용)를 위한 주형으로서 사용하였다.

돌연변이 CL346ST :

CL346ST-F : 5'-CTACGGTGTCCACCAGT CGAC GGGCCAGAACCTGGTGC-3'

CL346ST-R : 5'-GCACCAGGTTCTGGCCC GTCG ACTGGTGGACACCGTAG-3'

돌연변이 CL346AS :

CL346AS-F : 5'-TCGGCTACGGTGTCCAC GCTA GCCTGGGCCAGAACCTGG-3'

CL346AS-R : 5'-CCAGGTTCTGGCCCAGGC TAGC GTGGACACCGTAGCCGA-3'

서열 내에 변이된 뉴클레오티드는 굵게 표시하였고, 한편 도입된 새로운 제한 부위(돌연변이 CL346ST에 대하여 SalI; 변이 CL346AS에 대하여 NheI)에는 밑줄을 그었다. SalI 또는 NheI 제한 분석을 이용하여 돌연변이를 확인하였고, 정확하게 돌연변이된 벡터의 완전한 삽입체를 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 상기 생성된 플라스미드로부터의 돌연변이된 1.3kb FspAI/Bpu1102I 단편을 플라스미드 pGM11nysN4.1의 대응하는 단편을 치환하는 데 사용하여, 플라스미드 pGM11nysN4.1-CL346ST 및 pGM11nysN4.1-CL346AS를 얻었다. 후자의 구조로부터 돌연변이된 nysN 유전자를 포함하는 4.1kb의 삽입체를 EcoRI/HindIII를 이용하여 절단하고, pSOK201의 3.1kb EcoRI/HindIII 백본(backbone)에 연결시켜 nysN 불활성 플라스미드 pSOK201nysN4.1-CL346ST 및 pSOK201nysN4.1-CL346AS를 얻었다.

화합물 1을 생산하는 균주에서의 nysN의 불활성화를 위하여, 구성체(construct) pSOK201nysN4.1-CL346ST를 사용하였다. 화합물 3을 생산하는 균주에서의 nysN의 불활성화를 위하여, 구성체 pSOK201nysN4.1-CL346AS를 사용하였다.

KR17 :

NysJ 의 KR17 에 돌연변이 YA5145FE 를 도입하기 위한 벡터 pKR17m

플라스미드 pL98E의 4.0kb PmII/BamHI 단편(Brautaset, T., et al., Chem Biol. 2000 Junl 7(6):395-403)을 절단하고, 벡터 pGEM3zf(+)의 HincII/BamHI 부위 내로 연결하여 플라스미드 pBB4.0을 얻었다. KR17 활성 부위 영역을 포함하는 1.5kb의 DNA 단편을 하기의 프라이머들을 이용하여 pBB4.0으로부터 PCR 증폭하였다:

KR17-F : 5'-ttttctgCAGGCCGCGGTGCGCGC-3'(정배열), 및

KR17-R : 5'-TCCGGCATGGTCCGTGAAACC-3' (역배열)

상기 PCR 생성물을 PstI(상기 프라이머에서 밑줄친 인식 부위) 및 SacI(증폭된 DNA 단편에서의 인식 부위)로 말단을 절단(end-digested)하고, 1.4kb의 단편을 pLITMUS28의 대응하는 부위 안으로 연결하였다. 그 결과 생성된 플라스미드 pLIT1.4를 하기의 돌연변이 도입용 올리고뉴클레오티드를 사용하는 부위 지정 돌연변이를 위한 주형으로서 사용하였다:

KR17-mut1 : 5'-GCCCCGGCCAGGGCAACT T CG AA GCCGGCAACACGTTCC-3'

KR17-mut2 : 5'-GGAACGTGTTGCCGGC TT CG A AGTTGCCCTGGCCGGGGC-3'

상기 서열에서 변이된 뉴클레오티드를 굵게 나타내었고, 한편 도입된 새로운 BstBI 제한 부위에 밑줄을 그었다. 정확한 돌연변이를 BstBI 절단을 사용하여 확인하였고, 돌연변이된 플라스미드의 총 삽입체를 DNA 시퀀싱을 이용하여 확인하였다. 그 결과 생성된 플라스미드 pLIT1.4m로부터, 1072bp BclI/AccIII 단편을 절단하고, 플라스미드 pBB4.0의 대응하는 단편을 치환하는 데 사용하여 플라스미드 pBB4.0m을 얻었다. pBB4.0m의 총 4.0의 삽입체를 EcoRI+HindIII를 사용하여 절단하고, 플라스미드 pSOK201의 3.0kb EcoRI/HindIII 백본과 함께 연결하여 KR17 불활성 벡터 pKR17m을 얻었다.

KR15 :

NysJ 의 KR15 에 돌연변이 YA1888FE 를 도입하기 위한 벡터 pKR15m

pL20X의 3.6kb KpnI/PmlI 단편(Brautaset, T., et al., Chem Biol. 2000 Junl 7(6):395-403)을 절단하고, pGEM3zf(+)의 KpnI/HincII 부위 내로 연결하여 pKP3.6을 얻었다. 후자의 플라스미드를 하기의 프라이머들을 사용하여 1.1kb DNA 단편의 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다:

KR15-F1 : 5'-ttttgaaTTCCCGACGGCCTCTCCTACC-3' (정배열), 및

KR15-R1 : 5'-ttttaagCTTGCCGAGTCGGTTGCGC-3' (역배열)

그 결과 생성된 PCR 생성물을 EcoRI/HindIII(상기 프라이머에서 밑줄친 인식 부위)로 말단을 절단(end-digested)하고, pLITMUS28의 대응하는 부위 안으로 연결하여 pKIEH1.1을 얻었다. 상기 후자의 플라스미드를 하기의 돌연변이 도입용 올리고뉴클레오티드를 사용하는 부위 지정 돌연변이를 위한 주형으로서 제공하였다:

mutKR15-1F : 5'-CCGGGCCAGGCCAACT T CG AA GCCGGCAACACCTTCCTCG-3'

mutKR15-1R : 5'-CGAGGAAGGTGTTGCCGGC TT CG A AGTTGGCCTGGCCCGG-3'

변이된 뉴클레오티드를 굵게 표시하였고, 도입된 새로운 BstBI 부위에는 밑줄을 그었다. 정확한 돌연변이를 BstBI 절단에 의하여 확인하였고, 돌연변이된 플라스미드의 총 삽입체를 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 돌연변이된 플라스미드로부터, 1045bp FspA1/AccIII-단편을 절단하고, pKP3.6의 대응하는 부위를 치환하기 위하여 사용하여 pKP3.6mut를 얻었다. 그 후, pKP3.6mut의 총 3.6kb의 삽입체를 EcoRI/HindIII로 절단하고, pSOK201의 3.2kb EcoRI/HindIII 단편과 함께 연결하여 KR15 불활성 벡터 pKR15m을 얻었다.

스트렙토마이세스 노우르세이 균주로의 치환용 벡터의 도입:

제조된 모든 불활성 벡터로 대장균 ET12567(pUZ8002)을 형질전환시키고, 그 결과 생성된 재조합 균주들을 앞서 기재한 것과 같은 스트렙토마이세스 노우르세이 균주 내로의 불활성 벡터의 접합에 사용하였다(Brautaset, T., et al ., Chem Biol. 2000 Jun; 7(6):395-403);

- 서던 블롯(Southern Blot) + PCR에 의한 1차 교차의 확인

- 2차 교차 후보의 선별(아프라마이신(apramycin)-민감성)

- pNA0을 가지는 올바른 2차 교차 돌연변이의 상보성(complementation)

상호보완된 재조합 균주들을 발효시키고, 대응하는 분자들의 생산을 HPLC 및 MS-TOF 분석을 통하여 확인하였다.

화합물 1

UV 아이소플롯( UV isoplots )

S44HP 표준물질(standard) 및 ER5 및 NysN이 불활성화된 스트렙토마이세스 노우르세이 돌연변이체로부터의 DMSO 추출물을 도 2에 아이소플롯으로 나타내었다.

LC-MS 아이소플롯:

컬럼 : Zorbax SB-C18 2.1x100mm, 3.5μm(Agilent Technologies)

이동상 A : 10mM 암모늄 아세테이트(Riedel-de-Haёn #25008), pH 조정되지 않음, 이동상 B : 100% 아세토니트릴(Rathburn, HPLC grade)

시간 %B

0.00 27

6.50 65

7.30 65

7.40 27

12.00 27

유동(flow) : 0.22 mL/분

컬럼 온도 : 주변 온도(ambient)

TOF-MS 매개변수:

음성 API-ES 이온화(negative API-ES ionization)

건조 가스 : 10 l/분

분무 압력 : 40 psig

건조 가스 온도 : 350℃

모세관(capillary) 전압 : 3000V

단편화(fragmentor) 전압: 200V

TOF-MS 스펙트럼

TOF-MS 스펙트럼을 도 3에 나타내었고, 여기에서 m/z=966, 980 및 1034 피크는 내부 질량 대조군(internal mass references)이다. 화합물 1(C₄₇H₇₅NO₁₅)의 이론적 m/z(음이온)는 892.5063이다. 이 m/z는 고정확도를 가지며, 헵탄 UV-피크와 매우 관련이 있는 것으로 관찰되었다. 화합물 1의 이온화 동안의 물의 손실(1 및 2 분자) 또한 각각 Δm/z=-18 및 Δm/z=-36을 가지는 질량 피크(mass peak)를 산출하였다.

분리용 LC ( preparative LC )에 의한 정제

분리용 역상 컬럼 상에서 정제를 수행하였다.

분리 방법:

컬럼 : Agilent Prep-C18 50x250mm, 10μm(Agilent Technologies).

이동상 : 10mM 암모늄 아세테이트(Riedel-de-Haёn #25006), 아세트산으로 pH를 4.0으로 조정함(JT Baker #6002), 이동상 B : 100% 메탄올(Lab-Scan, HPLC grade)

시간 %B

0.00 78

6.00 78

6.20 100

11.00 100

11.20 78

유동(flow) : 85 mL/분

컬럼 온도 : 주변 온도(ambient)

분리용 LC에 의한 정제 후, 화합물 1은 UV 및 MS 데이터에 의해 측정된 것과 같이 샘플에서 > 97%의 폴리엔 마크로라이드 구성을 나타내었다.

LC-MS 방법:

컬럼 : Zorbax Bonus-RP 2.1x50mm, 3.5μm(Agilent Technologies).

이동상 : 10mM 암모늄 아세테이트(Riedel-de-Haёn #25006), 아세트산으로 pH를 4.0으로 조정함(JT Baker #6002), 이동상 B : 100% 아세토니트릴(Rathburn, HPLC grade)

시간 %B

0.00 27

10.00 53

10.10 27

15.00 27

유동(flow) : 0.3 mL/분

컬럼 온도 : 주변 온도(ambient)

카르복시기가 없는 폴리엔에 대하여(특히 화합물 1), 높은 pH는 카르복실 이온화 가능기(carboxyl ionisable group)를 가지는 폴리엔과 가지지 않는 폴리엔을 좀 더 잘 분리하도록 해주므로, 상기 방법 또한 이동상 A로서 아세트산으로 pH를 7.0으로 조정한 20mM 암모늄 바이카보네이트를 사용하여 진행하였다.

MS 매개 변수:

음성 API-ES 이온화(negative API-ES ionization)

건조 가스 : 12 l/분

분무 압력 : 35 psig

건조 가스 온도 : 350℃

모세관(capillary) 전압 : 3000V

화합물 2

UV 아이소플롯

(S44HP를 생산하는) 균주 GG5073SP 및 ER5 및 KR17 도메인이 불활성화된 돌연변이체의 DMSO 추출물을 도 4에 아이소플롯으로 나타내었다.

LC-MS 방법 및 TOF-MS 매개 변수 : 화합물 1과 동일함

TOF-MS 데이터

TOF-MS 스펙트럼을 도 5에 나타내었다. 화합물 2(C₄₇H₇₁NO₁₇)의 이론적 m/z(음이온)은 920.4649이다. 이 m/z는 용인가능한 정확도(<3 ppm 에러)를 가지며, 헵탄 UV-피크와 매우 관련이 있는 것으로 관찰되었다.

분리용 LC 에 의한 정제

분리용 역상 컬럼 상에서 정제를 수행하였다.

분리 방법:

컬럼 : Agilent Prep-C18 50x250mm, 10μm(Agilent Technologies).

이동상 : 10mM 암모늄 아세테이트(Riedel-de-Haёn #25006), 아세트산으로 pH를 4.0으로 조정함(JT Baker #6002), 이동상 B : 100% 메탄올(Lab-Scan, HPLC grade)

시간 %B

0.00 70

15.00 70

15.20 100

19.00 100

19.20 70

22.00 70

유동(flow) : 100 mL/분

컬럼 온도 : 주변 온도(ambient)

분리용 LC에 의한 정제 후, 화합물 2는 UV 및 MS 데이터에 의해 측정된 것과 같이 샘플에서 > 95.2%의 폴리엔 마크로라이드 구성을 나타내었다.

LC-MS 방법 : 화합물 1과 같다.

화합물 3

UV 아이소플롯

(S44HP를 생산하는) 균주 GG5073SP 및 ER5와 KR17 도메인 및 NysN이 불활성화된 돌연변이체의 DMSO 추출물을 도 6에 아이소플롯으로 나타내었다.

LC-MS 방법:

TOF-MS 데이터

TOF-MS 스펙트럼을 도 5에 나타내었다. 화합물 2(C₄₇H₇₁NO₁₇)의 이론적 m/z(음이온)은 920.4649이다. 이 m/z는 용인가능한 정확도(<3 ppm 에러)를 가지며, 헵탄 UV-피크와 매우 관련이 있는 것으로 관찰되었다.

분리용 LC 에 의한 정제

분리용 역상 컬럼 상에서 정제를 수행하였다.

분리 방법:

컬럼 : Agilent Prep-C18 50x250mm, 10μm(Agilent Technologies).

이동상 : 10mM 암모늄 아세테이트(Riedel-de-Haёn #25006), 아세트산으로 pH를 4.0으로 조정함(JT Baker #6002), 이동상 B : 100% 메탄올(Lab-Scan, HPLC grade)

시간 %B

0.00 70

15.00 70

15.20 100

19.00 100

19.20 70

22.00 70

유동(flow) : 100 mL/분

컬럼 온도 : 주변 온도(ambient)

분리용 LC에 의한 정제 후, 화합물 2는 UV 및 MS 데이터에 의해 측정된 것과 같이 샘플에서 > 95.2%의 폴리엔 마크로라이드 구성을 나타내었다.

LC-MS 방법 : 화합물 1과 같다.

컬럼 : Zorbax SB-C18 2.1x100mm, 3.5μm(Agilent Technologies)

이동상 A : 10mM 암모늄 아세테이트(Riedel-de-Haёn #25006), 아세트산으로 pH를 4.0으로 조정함(JT Baker #6002), 이동상 B : 100% 아세토니트릴(Rathburn, HPLC grade)

시간 %B

0.00 27

6.50 65

7.30 65

7.40 27

12.00 27

유동(flow) : 0.3 mL/분

컬럼 온도 : 주변 온도(ambient)

TOF-MS 매개 변수 : 화합물 1과 같다.

상기 TOF-MS 스펙트럼을 도 7에 나타내었으며, 여기에서 m/z = 980 및 1034의 피크는 내부 질량 대조군이다. 화합물 3(C₄₇H₇₃NO₁₅)의 이론적 m/z는 890.4907이다. 이 m/z는 고정확도를 가지며(질량 스펙트럼을 참조), 헵탄 UV-피크와 매우 관련이 있는 것으로 관찰되었다. 화합물 3의 이온화 동안의 수분 손실(1 및 2 분자) 또한 각각 Δm/z = -18 및 Δm/z = -36을 가지는 질량 피크를 산출하였다. 또한, 카르복실화된 유사체(MS 스펙트럼에서 m/z = 920.4644를 가지는 것으로 나타남)는 상당한 크로마토그래피성 공용리(chromatographic co-elution)를 나타낸다. 카르복실화된 화합물들은 음성 MS 모드에서 현저하게 높은 이온화 능력을 가지기 때문에, 상대적 정량화는 나타낸 MS 스펙트럼에서의 시그널 강도에 기초하지 않으면 안되는 것으로 알려져 있다.

화합물 4

UV 아이소플롯

(S44HP를 생산하는) 균주 GG5073SP 및 ER5 및 KR17 도메인이 불활성화된 돌연변이체의 DMSO 추출물을 도 8에 아이소플롯으로 나타내었다.

LC-MS 방법 : 화합물 3과 동일함.

화합물 5-23의 합성

일반

CHCl₃:MeOH:H₂O:HCOOH(13:6:1:0.1)의 용매 시스템에서, 머크 실리카 겔 60F254(Merck Silica Gel 60F254) 플레이트 상의 TLC에 의해 반응을 관찰하였다. 그 결과 생성된 산물들의 순도를 HPLC에 의해 측정하였으며, 순도는 80-90%였다. 20μL의 주입 부피와 408nm의 파장에서, 크로마실 100-C18 컬럼(4 x 250mm, 입자 크기 6μm) 상의 LC 10 시리즈의 시마즈 HPLC 기계로 분석용 역상 HPLC를 수행하였다. 상기 용매 시스템은 pH 2.4의 0.01M H₃PO₄ 및 아세토니트릴을 포함한다. 아세토니트릴의 비율은 1.0mL/min의 유속을 사용하여 30분 동안 30%에서 70%로 변경하였다.

화합물 5-16의 합성

S44HP(18mg, 0.02mmol) 및 0.3mL의 DMSO에 용해시킨 0.06mmol의 적절한 아민 하이드로클로라이드의 혼합물에 pH를 8-8.5로 조정하기 위하여 Et₃N을 일정비율로(portion-wise) 첨가하고, 후에 15분 동안 0.03mmol의 PyBOP 시약을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 그 후, 상기 반응 혼합물에 디에틸 에테르(~3mL)를 첨가하여 유성 잔류물(oily residue)이 생성되면, 디에틸 에테르(3mL x 2)를 넣어 계속 흔들어 주었다. 이 오일에 5mL의 아세톤을 첨가한 후, 노란색의 아미드 침전물이 만들어졌다. 상기 침전물을 여과하고, 아세톤으로 세척한 후 진공하에서 건조하였다. 모든 샘플들이 90% 이상의 수율로 얻어졌다. 이 화합물들에 대한 분석 데이터를 하기의 표 2에 요약하였다.

화합물 17-19의 합성

DMF(2mL)에 용해시킨 S44HP(40mg, 0.043mmol)의 용액에 적절한 단당류(D-글루코오스 또는 D-갈락토오스) 또는 이당류(락토오스)(0.086mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 20시간 동안 37℃에 방치한 후, 상기 용액을 디에틸 에테르(50mL)에 한 방울 씩 첨가하였다. 그 결과 생성된 침전물을 여과하고, 디에틸 에테르로 세척하고 건조하였다. 상기 얻어진 노란색 침전물을 플래쉬 크로마토그래피(CHCl₃:MeOH:H₂O:HCOOH(13:6:1:0.1))로 정제하였다. 원하는 화합물을 포함하는 분획을 수집하고, 상기 용액을 농축하였다. 디에틸 에테르를 첨가하여 노란색 침전을 얻은 후 여과하고, 디에틸 에테르로 세척하고 진공하에서 건조하였다. 모든 샘플들이 40-45%의 수율로 얻어졌다. 이 화합물들의 분석 데이터는 하기의 표 2에 요약하였다.

화합물 20의 합성

DMF(2mL)에 용해시킨 4-N,N-디메틸아미노벤즈알데히드(0.065mmol) 및 S44HP(20mg, 0.022mmol) 용액에 NaBH₃CN(4.1mg, 0.065mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 20시간 동안 37℃에 방치하였다. 디에틸 에테르(10mL)를 첨가하여 유성 잔류물이 생성되면, 디에틸 에테르(10mL x 2)를 넣어 계속 흔들어 주었다. 아세톤(10mL)을 첨가한 후 노란색 침전물이 형성되었다. 상기 침전물을 여과하고, 디에틸 에테르로 세척하고 건조하였다. 상기 얻어진 고체를 컬럼 크로마토그래피용 머크 실리카 겔(0.040-0.063mm) 상에서 플래쉬 크로마토그래피(CHCl₃:MeOH:H₂O:HCOOH(13:6:1:0.1))로 정제하였다. 원하는 화합물을 포함하는 분획을 수집하고, 상기 용액을 농축하여 디에틸 에테르를 첨가하고, 여과하고 디에틸 에테르로 세척하고 진공하에서 건조시켜 노란색 침전물을 얻었다.

화합물 21 및 22의 합성

DMF(3mL)에 용해시킨 N-(9-플루오레닐메톡시카보닐)-3-아미노프로피온알데히드(N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-3-aminopropionaldehyde)(160mg, 0.054mmol) 및 S44HP(100mg, 0.011mmol) 용액에 NaBH₃CN(34mg, 0.054mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 20시간 동안 37℃에 방치한 후, 디에틸 에테르(20mL)를 한 방울 씩 첨가하였다. 상기 화합물의 혼합물의 노란색 침전물을 여과하고, 각각의 화합물들을 분리하고, 선형 그라디언트(linear gradient) 시스템 CHCl₃:MeOH:HCOOH(3:1:0.01) → CHCl₃:MeOH:H₂O:HCOOH(13:6:1:0.1)로 컬럼 크로마토그래피용 머크 실리카 겔(0.040-0.063mm) 상에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여, 노란색 고체로서 N-[N-(9-플루오레닐메톡시카보닐)-3-아미노프로필]-S44HP(N-[N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-3-aminopropyl]-S44HP) 및 N,N-디-[N-(9-플루오레닐메톡시카보닐)-3-아미노프로필]-S44HP(N,N-di-[N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-3-aminopropyl]-S44HP를 얻었다.

DMSO(3mL)에 용해시킨 N-[N-(9-플루오레닐메톡시카보닐)-3-아미노프로필]-S44HP 또는 N,N-디-[N-(9-플루오레닐메톡시카보닐)-3-아미노프로필]-S44HP 용액에 피페리딘(0.1mL)을 첨가하였다. 2시간 동안 상온에 방치한 후, 디에틸 에테르(~7mL)을 첨가하고, 유성 잔류물이 형성되면 디에틸 에테르(7mL x 2)를 넣어 계속 흔들어 주었다. 아세톤(10mL)을 첨가한 후 여과하고, 디에틸 에테르로 세척하고 진공하에서 건조시켜 노란색 고체의 화합물 21 및 화합물 22를 얻었다. 상기 생성된 화합물 21 및 22에 대한 분석 데이터를 하기의 표 2에 요약하였다.

화합물 23의 합성

건조 DMF(2mL)에 용해시킨 S44HP(100mg, 0.11mmol) 용액에 N^α, N^ε-디-(9-플루오레닐메톡시카보닐)-L-라이신 N-옥시석신이미드 에스테르(N^α, N^ε-di-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-lysine N-oxysuccinimide ester)(221mg, 0.33mmol) 및 Et₃N(15.3μl, 0.11mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 1시간 동안 37℃에 방치한 후 H₂O(5ml)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 n-BuOH(3 x 5mL)로 추출하였다. 상기 유기 분획을 결합시키고, 0.01N HCl(1 x 5mL)과 H₂O(3 x 5mL)로 세척하였다. 상기 용액을 농축하고, 디에틸 에테르를 첨가하여 여과하고 디에틸 에테르로 세척하여 노란색 침전물을 얻고, 실리카 겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피(CHCl₃:MeOH:H₂O:HCOOH(13:4:0.5:0.01))로 정제하였다. 원하는 화합물을 포함하는 분획을 수집하고, 상기 용액을 농축하고, 디에틸 에테르를 첨가하여 노란색 침전물을 얻고, 이를 여과하고, 디에틸 에테르로 세척하고 진공하에서 건조하였다.

DMSO(3mL)에 용해시킨 상기 분리된 노란색 고체(30mg)에 피페리딘(0.1mL)을 첨가하였다. 상온에서 2시간 후, 디에틸 에테르(~7mL)을 첨가하여 유상 잔류물이 형성되었고, 여기에 디에틸 에테르(7mL x 2)를 넣어 계속 흔들어주었다. 아세톤(10mL)을 첨가하여 노란색 침전물을 얻고, 여과하고 디에틸 에테르로 세척하고 진공하에서 건조시켰다.

화합물 5-23에 대한 TLC(Rf), HPLC(Rt), MALDI 질량 스펙트럼 및 용해도 데이터

	분자식	Rf*	Rt*	MALDI MS 정밀 질량		수용성
				계산값	found [M+Na]+
5	C49H78N2O17	0.30	10.71	966.15	989.70	+
6	C49H76N2O16	0.38	11.60	936.52	959.69	+
7	C49H78N2O17	0.27	11.52	922.50	923.07##	-
8	C48H76N2O16	0.62	16.83	1036.57	1058.15	-
9	C57H88N2O18	0.47	14.33	1008.54	1032.09	+
10	C51H80N2O18	0.37	13.47	1008.54	1031.99	_
11	C52H85N3O16	0.14	7.65	1007.59	1008.60##	+
12	C50H80N2O17	0.38	10.86	980.55	981.55##	±
13	C51H80N2O19	0.58	11.55	1024.54	1025.57##	+
14	C51H80N2O19	0.58, 0.54	12.66, 13.22	1024.54	1025.48##	+
15	C53H85N3O17	0.55	7.43	1035.59	1059.16	+
16	C53H84N2O21	0.12	9.35	1084.56	1085.48##	±
17	C53H83NO22	0.22	11.54	1085.54	1109.15	±
18	C53H83NO22	0.22	13.98#	1085.54	1109.00	±
19	C59H93NO27	0.16	11.64	1247.59	1271.12	±
20	C65H95N3O17	0.63	14.35	1189.67	1212.72	-
21	C50H80N2O17	0.14	9.78	980.55	981.58	±
22	C53H87N3O17	0.09	7.40	1037.60	1038.54	±
23	C53H85N3O18	0.06	7.70	1051.58	1052.65	+

^* 용매 시스템 CHCl₃:MeOH:H₂O:HCOOH(13:6:1:0.1)에서 머크 실리카 겔 60F254 플레이트 상에서의 TLC

^** 20μL의 주입 부피와 408nm의 파장에서, 크로마실 100-C18 컬럼(4x250mm, 입자 크기 6μm) 상의 LC 10 시리즈의 시마즈 HPLC 기계에서 HPLC를 수행하였다. 시스템은 pH 2.6의 0.01M H₃PO₄ 및 아세토니트릴을 포함한다. 아세토니트릴의 비율은 유속 1.0mL/min으로 30분간 30%에서 70%로 변경하였다.

^# HPLC 등용매 시스템(HPLC isocratic system) - 35% MeCN

^## [M+H]⁺¹

수용성 : + 수용성, ± 약간 수용성, - 불용성

상기 또는 하기에 상세히 설명한 합성 원칙에 따라 화합물 24 내지 29를 또한 합성하였다. 게다가, 하기의 또 다른 화합물들을 도 10-16에 설명하고 거기에 반응식화하고 하기에 서술한 합성 프로토콜에 기초하여 제조하였다.

화합물 28은 화합물 48의 글루탐산염이다.

S44HP 및 화합물 1의 유도체의 특성 : TLC(Rf), HPLC(Rt), MALDI 질량 스펙트럼 및 용해도 데이터

항진균 활성의 초기 테스트를 위하여 얻어진 유사체의 순도는 85-95%이다.

* 용매 시스템에서 머크 실리카 겔 60F254 플레이트 상에서의 TLC : I - CHCl₃:MeOH:H₂O:HCOOH(13:6:1:0.1), II - CHCl₃:MeOH:H₂O:HCOOH(7:1:0.01:0.01), III - CHCl₃:MeOH:H₂O:NH₄OH 농축(13:6:0.7:0.01), IV - AcOEt;n-ProOH:NH₄OH 농축(15:10:10).

** 유속 1.0mL/min으로 20μL의 주입 부피와 408nm의 파장에서, 크로마실 100-C18 컬럼(4x250mm, 입자 크기 6μm) 상의 LC 10 시리즈의 시마즈 HPLC 기계에서 분석용 역상 HPLC를 수행하였다. 상기 용매 시스템은 A - 0.2% HCOONH₄ pH 4.5 및 MeCN, MeCN의 비율은 10분간 30에서 70%로 변경되고, B - 0.2% HCOONH₄ pH 4.5 및 MeCN: 40분간 25 → 65%; C - 0.2% HCOONH₄ pH 4.5 및 MeCN: 30분간 30 → 90%, 10분간 90 → 90%; D - 등용매 시스템 - 35% MeCN.

*** 하이드로클로라이드. 수용성 : + 수용성, ± 약간 수용성, - 불용성

# [M+H]⁺¹;

##[M-H₂O+Na]+1

다른 S44HP 유도체(화합물 30 내지 48)의 합성

일반

용매 시스템 : I - CHCl₃:MeOH:H₂O:HCOOH(13:6:1:0.1), II - CHCl₃:MeOH:H₂O:HCOOH(7:1:0.01:0.01), III - CHCl₃:MeOH:H₂O:NH₄OH 농축(13:7:1:0.1), IV - AcOEt;n-ProOH:NH₄OH 농축(15:10:10)에서, 머크 실리카 겔 60F254 플레이트 상에서의 TLC에 의하여 반응을 관찰하였다.

유속 1.0mL/min으로 20μL의 주입 부피와 408nm의 파장에서, 크로마실 100-C18 컬럼(4x250mm, 입자 크기 6μm) 상의 LC 10 시리즈의 시마즈 HPLC 기계에서 분석용 역상 HPLC를 수행하였다. 상기 용매 시스템은 A - 0.2% HCOONH₄ pH 4.5 및 MeCN, MeCN의 비율은 10분간 30에서 70%로 변경되고, B - 0.2% HCOONH₄ pH 4.5 및 MeCN: 40분간 25 → 65%; C - 0.2% HCOONH₄ pH 4.5 및 MeCN: 30분간 30 → 90%, 10분간 90 → 90%; D - 등용매 시스템 - 35% MeCN; E - pH 2.6에서 0.01M H₃PO₄ 및 MeCN, 30분간 30 → 70%, F - pH 2.6에서 0.01M H₃PO₄ 및 MeCN, 30분간 40 → 80%.

S44HP 의 di - 변경된 유도체

N-프룩토실 S44HP N,N-디메틸아미노프로필 아미드(N-Fructosyl S44HP N,N-methylaminopropyl amide; DMAP), -하이드록시프로필아미드(-hydroxypropylamide; HP) 또는 -N,N-디메틸아미노에틸(-N,N-dimethylaminoethyl) 아미드(각각 화합물 30, 36, 41); N-타가토피로노실 S44HP DMAP 아미드(N-tagatosylpyronosyl S44HP DMAP amide)(화합물 31) 또는 N-타가토피로노실 S44HP DMAE 아미드(N-tagatosylpyronosyl S44HP DMAE amide)(화합물 42) (반응식 1, 왼쪽)

1 단계( 아미드화 ) - S44HP DMAP 아미드(화합물 11), HP 아미드(화합물 12) 또는 DMAE 아미드(화합물 48)

0.6mL의 DMSO에 용해시킨 S44HP(36mg, 0.04mmol) 및 0.12mmol의 적절한 아민 하이드로클로라이드의 혼합물에 pH를 8-8.5로 조정한 Et₃N을 일정비율로 첨가한 후, 15분 동안 0.06mmol의 PyBOP-시약을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 그 후 상기 반응 혼합물에 디에틸 에테르(~5mL)를 첨가하여 유상 잔류물이 생성되면, 디에틸 에테르(5mL x 2)를 넣어 계속하여 흔들어 주었다. 이 오일에 8mL의 아세톤을 첨가한 후, 아미드의 노란색 침전물이 형성되었다. 상기 침전물을 여과하고, 아세톤으로 세척한 후 진공하에서 건조하였다. 조(crude) 아미드(HPLC 데이터에 의하면 85-90%의 순도, 염을 포함함)를 세파덱스 G-25(Sephadex G-25; Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 물을 이용하여 컬럼을 수행하였다. 분획의 순도는 HPLC로 조절하였으며, 적절한 표적 S44HP 아미드 순도는 HPLC에 의하여 92% 이상이 되었다.

2 단계(아미드의 아마도리 전위( Amadori rearrangement )) : DMF(2mL)에 용해시킨 적절한 S44HP 아미드(화합물 11, 12, 48)(0.040mmol) 용액에 D-글루코오스 또는 D-갈락토오스(0.086mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 20시간 동안 37℃에 방치하였다. 그 후, 상기 반응 혼합물을 디에틸 에테르(50mL)에 한 방울 씩 첨가하였다. 그 결과 생성된 침전물을 여과하고, 디에틸 에테르로 세척하고 건조하였다. 조(crude) 화합물(HPLC 데이터에 의하면 85-90%의 순도를 가지며, 염을 포함함)을 세파덱스 G-25(Sephadex G-25; Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 물을 이용하여 컬럼을 수행하였다. 분획의 순도는 TLC, 시스템 IV로 조절하였다. 원하는 화합물을 포함하는 분획들을 수집하고, 상기 용액을 농축하였다. 아세톤을 첨가하여 노란색 침전물을 얻고, 여과하고 아세톤으로 세척한 후 진공하에서 건조하였다. 상기 화합물 41을 하이드로클로라이드로서 얻었다. 메탄올에 용해시킨 화합물 41의 용액에 0.1N HCl-메탄올을 첨가하여 pH를 ~4로 만들었다. 디에틸 에테르를 첨가하여 노란색 침전물을 얻었고, 여과하고 디에틸 에테르로 세척하여 진공하에서 건조하였다. 상기 N-알킬 유도체 S44HP 아미드의 순도는 92% 이상이었다. 이 화합물들(30. 36, 41, 31. 42)의 분석용 데이터를 상기 표 4에 나타내었다.

N-(4-N,N-디- 메틸아미노벤질 ) S44HP DMAP 아미드(N-(4-N,N- di -methylaminobenzyl) S44HP DMAP amide ), - HP 아미드 또는 - DMAE 아미드(각각 화합물 32, 37, 43) (반응식 1 (도 10), 오른쪽)

1 단계( 아미드화 ). S44HP DMAP 아미드(화합물 11), HP 아미드(화합물 12) 또는 DMAE 아미드(화합물 48)를 화합물 30에 대하여 상기에 기재된 것(1 단계)과 같이 얻었다.

2 단계(아미드의 환원성 N-알킬화). DMF(2mL)에 용해시킨 4-N,N-디메틸아미노벤즈알데히드(0.065mmol) 및 적절한 S44HP 아미드(화합물 11, 12 또는 48)(0.022mmol)의 용액을 2시간 동안 37℃에서 방치한 후, NaBH₃CN(4.1mg, 0.065mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 20시간 동안 37℃에서 방치하였다. 디에틸 에테르(10mL)을 첨가하여 유상 잔류물이 생성되었고, 디에틸 에테르(10mL x 2)를 넣어 계속하여 흔들어 주었다. 상기 침전물을 여과하고, 디에틸 에테르로 세척한 후 건조하였다. 염을 포함하는 조 화합물을 시스템 CHl₃:MeOH:H₂O;HCOOH(13:6:1:0.1)을 사용하여 머크 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 상기 분획의 순도를 TLC, 시스템 I으로 조절하였다. 원하는 화합물을 포함하는 분획을 수집하고, 상기 용액을 농축하였다. 아세톤을 첨가하여 노란색 침전물을 얻었고, 이를 여과하고 아세톤으로 세척한 후 진공하에서 건조하였다. 적절한 S44HP 아미드의 N-알킬 유도체의 순도는 92% 이상이었다. 이 화합물들의 분석 데이터를 표 4에 요약하였다.

N-(N,N- 디메틸글리실 )- S44HP DMAE 아미드, - HP 아미드 또는 - DMAP 아미드(각각 화합물 30, 45, 34)(아미드의 N- 아미노아실화 , 반응식 2(도 11, 왼쪽)

N,N-디메틸글리신(0.04mmol) 및 0.5mL의 DMSP에 용해시킨 적절한 S44HP DMAE 아미드(화합물 48), -HP 아미드(화합물 12) 또는 -DMAP 아미드(화합물 11)(반응식 1을 참조)의 혼합물에 pH를 8로 조정하기 위하여 Et₃N을 첨가한 후, 0.03mmol의 PyBOP-시약을 15분 동안 일정비율로 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 그 후 상기 반응 혼합물에 디에틸 에테르(~3mL)를 첨가하여 유상 잔류물이 생성되었고, 이를 디에틸 에테르(3mL x 2)로 계속하여 흔들어 주었다. 이 오일에 5mL의 아세톤을 첨가한 후, 아미드의 노란색 침전물이 생성되었다. 상기 침전물을 여과하고 아세톤으로 세척한 후 진공하에서 건조하여 N-(N,N-디메틸글리실) S44HP DMAE 아미드, -HP 아미드 또는 -DMAP 아미드(화합물 39, 45, 34)를 얻었다. 이 화합물들에 대한 분석 데이터는 상기의 표 4에 요약하였다.

N-(N-L-L- Lysyl ) S44HP 아미드 및 - DMAE 아미드(각각 화합물 38 및 44)(반응식 2, 오른쪽)

1 단계 : (N-[N- 플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-아미노] 아실화 ( N-[N-Fmoc-amino]acylation ) -- N-(N ^α ,N ^ε -디- 플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-L- 리실 ) S44HP .

건조 DMF(1.2mL)에 용해시킨 N^α,N^ε-디-(9-플루오레닐메톡시카보닐)-L-라이신(N^α,N^ε-di-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-L-lysine)(180mg, 0.33mmol), N-하이드록시벤조트리아졸(N-hydroxybenzotriazole)(54mg, 0.4mmol) 용액을 ~+5℃로 냉각시키기 위하여 DCC(62mg, 0.3mmol)을 첨가하였고, 상기 반응 혼합물을 1시간 동안 ~+5℃에서 교반하였다. DCU의 잔류물을 여과하고, 얻어진 용출액을 DMF(1.0mL)에 용해시킨 S44HP(184mg, 0.2mmol)에 첨가하였다. 그 후, 교반하에서 상기 반응 혼합물에 (i-Pro)₂EtN(0.1mL, 0.81mmol)를 10분 동안 한 방울 씩 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 시스템 : CHCl₃:MeOH:H₂O:HCOOH(6:1:0.01:0.01)에서 TLC 제어하에 2시간 동안 상온에서 교반한 후, 20mL의 에틸 에테르를 첨가하였다. 얻어진 침전물을 여과하고, 에틸 에테르:아세톤(1:1, 10ml x 3)의 혼합물로 세척하고 진공에서 건조시켜 202mg의 노란색 파우더를 얻었다. 상기 조(crude) 화합물을 실리카 겔 머크 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 컬럼을 시스템 : CHCl₃:MeOH:H₂O:HCOOH(9:1:0.01:0.02 → 7:1:0.01:0.02)를 사용하여 수행하였다. 분획의 순도는 시스템 II에서 TLC에 의해 조절하였다. 원하는 화합물을 포함하는 분획을 수집하고, 상기 용액을 농축하였다. 아세톤을 첨가하여 노란색 침전물을 얻었고, 여과하여 아세톤으로 세척하고 진공하에서 건조시켜 60mg의 순수한 N-[N^α,N^ε-디-(9-플루오레닐메톡시카보닐)-L-리실] S44HP(>96%, HPLC, Rt=22.80, 시스템 B)를 얻었다. MALDI 질량 스펙트럼. Found:1500.542 [M-H₂O+Na]⁺¹. Calculated for C₈₃H₁₀₅N₃O₂₂ 1495.72(정밀 질량).

2 단계 (N-(N ^α ,N ^ε -디- 플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-L- 리실 ) S44HP 의 아미드화 - N-(N ^α ,N ^ε -디- 플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-L- 리실 ) S44HP HP 아미드 또는 - DMAE 아미드:

N-(N^α,N^ε-디-플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-L-리실) S44HP(0.02mmol) 및 0.3mL의 DMSO에 용해시킨 0.06mmol의 3-하이드록시프로필 아민 하이드로클로라이드 또는 4-(N,N-디메틸아미노)프로필 아민 디하이드로클로라이드의 혼합물에 pH를 7-7.5로 조정하기 위하여 Et₃N을 일정 비율로 첨가한 후, 0.03mmol의 PyBOP-시약을 15분 동안 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 시스템 CHCl₃:MeOH:H₂O:NH₄OH conc.(5:1:0.01:0.01)에서 TLC 조절하에 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 그 후, 상기 반응 혼합물에 디에틸 에테르(~3mL)을 첨가하여 유상 잔류물이 생성되었고, 이를 디에틸 에테르(3mL x 2)로 계속 흔들어 주었다. 이 오일에 5mL의 아세톤을 첨가한 후, 아미드의 노란색 침전물이 생겼다. 상기 침전물을 여과하고, 아세톤으로 세척한 후 진공하에서 건조시켜, 시스템 CHCl₃:MeOH:H₂O:NH₄OH conc.(5:1:0.01:0.01)에서 HPLC 데이터 : 각각 Rt=21.43(C) 및 20.39(B), TLC 데이터 : 각각 Rf=0.47 및 Rf=0.43에 의해 ~90%의 순도를 가지는 적절한 N-(N^α,N^ε-디-플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-L-리실) S44HP-아미드 또는 (N^α,N^ε-디-플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-L-리실) S44HP-DMAE 아미드를 얻었다.

3 단계( 플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드 제거). 적절한 N-(N^α,N^ε-디-플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-L-리실) S44HP 아미드(30mg)을 DMSO(3mL)에 용해시키고, 피페리딘(0.1mL)을 첨가하였다. 상온에서 2시간 후, 디에틸 에테르(~7mL)를 첨가하여 유상 잔류물이 형성되어 디에틸 에테르(7mL x 2)로 계속 흔들어 주었다. 아세톤(10mL)을 첨가하여 노란색 침전물을 얻고, 이를 여과하고 디에틸 에테르로 세척하여 진공하에서 건조시켰다. 상기 화합물 화합물 44를 하이드로클로라이드로서 얻었다. pH를 ~4로 조정하기 위하여 메탄올에 용해시킨 화합물 44 용액에 0.1N HCl-메탄올을 첨가하였다. 디에틸 에테르를 첨가하여 노란색 침전물을 얻었고, 이를 여과하고 디에틸 에테르로 세척하고 진공하에서 건조시켰다. 이 두개의 화합물들에 대한 분석 데이터는 상기 표 4에 요약하였다.

N-(4- 아미노메틸벤조일 ) S44HP DMAP 아미드, - HP 아미드, - DMAE 아미드(각각 화합물 35, 40, 46)(반응식 3, 도 12, 왼쪽)

1 단계(N-[4- 플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드] 벤조일화 ) - N-(4- 플루오 레닐메틸옥시카보닐 클로라이드- 아미노메틸벤조일 ) S44HP : 화합물 38에 대한 것에서와 같은 조건에서(1 단계) 유도체를 얻었다. 4-N-플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-아미노메틸벤조산(80mg, 0.022mmol)와 DMSO(3mL)에 용해시킨 S44HP 용액에 pH를 7로 조정하기 위한 Et₃N과 PyBOP(90mg, 0.165mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 20분간 상온에 방치한 후, 디에틸 에테르(200mL)를 한 방울 씩 첨가하였다. 노란색 침전물을 여과하고, 시스템 CHCl₃:MeOH:HCOOH(3:1:0.01)에서 컬럼 크로마토그래피용 머크 실리카 겔(0.040-0.063mm)로 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, HPLC 데이터(Rt=18.18, 시스템 B), TLC(Rf=0.61, I)에 의해 ~95%의 순도를 가지는 N-(4-N-플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-아미노메틸)벤조일 S44HP(화합물 47)을 얻었다.

2 단계(N-[4- 플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드] 벤조일 S44HP 의 아미드 화) - N-(4- 플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드- 아미노메틸벤조일 ) S44HP DMAP 아미드, - HP 아미드, 또는 - DMAE 아미드.

N-(4-플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-아미노메틸벤조일) S44HP 및 적절한 DMAP-, HP- 또는 DMAE 아민으로부터 시작하고 PyBOP 시약을 사용하여, 화합물 38에 대한 것과 같은 조건에서 유도체를 얻었다. 상기 반응 혼합물을 4시간 동안 교반하였다. HPLC 데이터: N-(4-플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-아미노메틸벤조일) S44HP DMAP 아미드(Rt=15.88, B; Rf=0.25, I), N-(4-플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-아미노메틸벤조일) S44HP HP 아미드(화합물 12)(Rt=17.14, B; Rf=0.60, I) 또는 N-(4-플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-아미노메틸벤조일) S44HP DMAE 아미드(Rt=15.95, B; Rf=0.24, I)에 의해 순도는 85~93%였다.

3 단계( 플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-제거). N-(4-플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-아미노메틸벤조일) S44HP DMAP 아미드, -HP 아미드 또는 -DMAE 아미드로부터 시작하는, 화합물 38에 대한 것과 같은 조건(3 단계)에서 유도체를 얻었다. 이 세가지 화합물들에 대한 분석 데이터는 하기 표 2에 요약하였다.

N-L- 리실 S44HP DMAP -아미드(화합물 33)(반응식 3, 오른쪽)

1 단계( 아미드화 ) - S44HP DMAP -아미드(화합물 11): 화합물 33에 대한 것과 같이(반응식 1, 왼쪽) S44HP DMAP 아미드를 얻었다. 순도는 ~90%(HPLC) 였다.

2 단계( DMAP 아미드의 N-[N- 플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-아미노] 아실화 ) - N-(N ^α ,N ^ε -디- 플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-L- 리실 ) S44HP DMAP -아미드: DMSO(0.5mL)에 용해시킨 S44HP DMAP 아미드(0.02mmol) 용액에 N^α,N^ε-디-플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-L-라이신(0.04mmol)과 Et₃N을 첨가한 후(pH 7-7.5), 15분 동안 0.03mmol의 PyBOP-시약을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 그 후, 상기 반응 혼합물에 디에틸 에테르(~3mL)를 첨가하여 유상 잔류물이 생성되어 디에틸 에테르(3mL x 2)를 넣어 계속 흔들어 주었다. 이 오일에 5mL의 아세톤을 첨가한 후, 아미드의 노란색 파우더가 만들어졌다. 상기 침전물을 여과하고, 아세톤으로 세척한 후 진공하에서 건조시켜, HPLC 데이터(Rt=22.01, 시스템 B)에 의해 순도 ~95%를 가지는 N-(N^α,N^ε-디-플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-L-리실) S44HP DMAP 아미드를 얻었다.

3 단계( 플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-제거). N-(N^α,N^ε-디-플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-L-리실) DMAP 아미드로부터 시작하는 화합물 38에 대한 것과 같은 조건에서(3 단계) 유도체를 얻었다. 이 두개의 화합물에 대한 분석 데이터를 상기 표 4에 요약하였다.

S44HP 의 단일-변경 유도체

(반응식 3, 1 단계에 따라 얻은) N-(4-플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-아미노메틸벤조일) S44HP로부터 시작하는 화합물 38에 대한 것과 같은 조건에서(3 단계), N-(4- 아미노메틸벤조일 ) S44HP(화합물 47)(반응식 4, 도 13, 플루오레닐메 틸옥시카보닐 클로라이드 제거를 참조)를 얻었다. 이 두개의 화합물에 대한 분석 데이터는 상기 표 4에 요약하였다.

N-N- 디메틸아미노에틸 ( DMAE ) S44HP 아미드(화합물 48)(대안적 방법, 반응식 5, 도 14)

1 단계( 플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드-도입). N- Fmoc - S44HP . 6mL DMF:MeOH(5:1)에 용해시킨 500mg(0.5mmol)의 조(crude) S44HP의 교반된 용액에 0.057mL(0.65mmol) 피리딘과 360mg(1.0mmol)의 FmocOSu를 일정비율로 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 4시간 동안 상온에서 교반하였다. 그 후, 상기 반응 혼합물에 디에틸 에테르(20mL)을 첨가하여 N-Fmoc-S44HP의 노란색 침전물이 생성되었다. 상기 침전물을 여과하고 디에틸 에테르로 세척하여 건조시켰다. 상기 조 N-Fmoc-S44HP를 시스템 CHCl₃:MeOH:H₂O:HCOOH(13:6:1:0.05)에서 머크 실리카 겔 상의 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, HPLC(Rt=20.49, 시스템: pH 2.6에서 0.01M H₃PO₄ 및 MeCN, 40 → 80%, 30분), TLC 0.39(III)에 의해 94%의 순도를 가지는 N-Fmoc-S44HP를 30%의 수율로 얻었다.

2 단계( 아미드화 ) N- Fmoc - S44HP DMAE 아미드. 2ml DMSO에 용해시킨 115mg(0.10mmol)의 N-Fmoc-S44HP의 교반된 용액에 37mg(0.30mmol)의 N,N-디메틸아미노에틸아민 하이드로클로라이드와 pH를 7-7.5로 조정하기 위한 Et₃N을 첨가하고, 78mg(0.15mmol)의 PyBOP를 일정비율로 첨가하였다; 반응 혼합물의 pH는 Et₃N을 첨가함으로써 7-7.5를 유지하였다. 상기 반응 혼합물을 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 그 후, 상기 반응 혼합물에 디에틸 에테르(5mL)을 첨가하여 유상 잔류물이 생성되었고, 여기에 디에틸 에테르(5mL)을 사용하여 계속 흔들어 주었다. 아세톤(10mL)을 첨가하여 노란색의 침전물을 얻고, 여과하여 아세톤으로 세척하고 건조시켜, HPLC 데이터(Rt=14.50, 시스템 A)에 의해 ~92%의 순도를 가지는 N-Fmoc-S44HP DMAE 아미드를 얻었다.

3 단계( Fmoc -제거). N-Fmoc-S44HP DMAE 아미드로부터 시작하는 화합물 38에 대한 것과 같은 조건에서(3 단계) 유도체 - (화합물 48)을 얻었다. 이 화합물에 대한 분석 데이터는 상기 표 4에 요약하였다.

순수 화합물 1 : 조 화합물 1의 샘플로부터 시작하는 화합물 1의 정제 (반응식 6, 도 15)

1 단계( Fmoc -도입 및 정제)

N- Fmoc -화합물 1. 40mL의 DMSO에 용해시킨 2000mg(2.0mmol)의 (HPLC 데이터, 시스템 B에 의하여, 화합물 1 - 81.5%, S44HP - 8.27% 및 알려지지 않은 불순물 ~10%를 포함하는) 조 화합물 1의 교반 용액에 pH를 7-7.5로 조정하기 위하여 Et₃N을 첨가하고, 1400mg(4.0mmol)의 FmocOSu를 일정비율로 첨가하였다; 상기 반응 혼합물의 pH는 Et₃N을 첨가함으로써 7-7.5로 유지하였다. 상기 반응 혼합물을 2시간 동안 상온에서 교반하였다. 그 후, 상기 반응 혼합물에 디에틸 에테르(200mL)을 첨가하여 유상 잔류물이 생성되었고, 디에틸 에테르(150mL x 3)를 사용하여 계속 흔들어 주었다. 이 잔류물에 50mL의 아세톤을 첨가한 후, 디에틸 에테르(50mL)을 첨가하여 노란색 침전물이 생성되었다. 상기 침전물을 여과하여 디에틸 에테르로 세척한 후 진공하에서 건조시키고, HPLC(Rt=18.44, 시스템 C)에 의해 86%의 순도를 가지는 650mg(~30%)의 N-Fmoc-화합물 1을 얻기 위하여, 시스템 CHCl₃:MeOH:H₂O:25%NH₄OH(13:6:1:0.05)에서 머크 실리카 겔 상의 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 2200mg의 조 N-Fmoc-화합물 1을 얻었다.

2 단계( Fmoc -제거).

Fmoc-화합물 1(400mg)을 DMSO(60mL)에 용해시키고, 15℃에서 피페리딘(0.2mL)을 첨가하였다. 15℃에서 2시간 후 디에틸 에테르(~50mL)를 첨가하고; 형성된 유상 잔류물에 디에틸 에테르(50mL x 3)를 넣어 계속 흔들어 주었다. 아세톤(10mL)과 디에틸 에테르(20mL)을 첨가하여 노란색 침전물을 얻고, 이를 여과하여 디에틸 에테르로 세척하고 진공하에서 건조시켜 300mg의 순수한 화합물 1을 얻었다. HPLC에 대하여 순수한 화합물 1의 일부분은 하이드로클로라이드로서 얻어졌다. 메탄올에 용해시킨 화합물 1(염기) 용액에 0.1N HCl-메탄올을 첨가하여 pH를 ~4로 조정하였다. 디에틸 에테르를 첨가하고 여과하여 디에틸 에테르로 세척하고 진공하에서 건조시켜 HPLC 데이터(하이드로클로라이드, Rt=11.37, 시스템 A)에 의하여 92.1%의 순도를 가지는 노란색 침전물을 얻었다.

화합물 1의 단일-변경 유도체. ( 반응식 7, 도 16 )

N- 프룩토피라노실 -화합물 1(화합물 49)( 아마도리 전위):

DMF(2mL)에 용해시킨 화합물 1(0.040mmol) 용액에 D-글루코오스(0.086mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 20시간 동안 37℃에 방치하였다. 그 후, 상기 반응 혼합물에 디에틸 에테르(50mL)를 한 방울씩 첨가하였다. 그 결과 생성된 침전물을 여과하여 디메틸 에테르로 세척하고 건조시켰다. 조 화합물(HPLC 데이터에 의해 85-90%의 순도를 가지며 염을 포함함)을 세파덱스 G-25(Sephadex G-25; Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden) 상의 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 컬럼은 물을 사용하여 수행하였다. 분획의 순도는 TLC, 시스템 IV에 의해 조절하였다. 원하는 화합물을 포함하는 분획을 수집하고, 상기 용액을 농축하였다. 아세톤을 첨가하여 노란색 침전물을 얻고, 여과하여 아세톤으로 세척하고 진공하에서 건조시켰다. 상기 화합물 41은 하이드로클로라이드로서 얻어졌다. 메탄올에 용해시킨 화합물 49 용액에 0.1N HCl-메탄올을 첨가하여 pH ~4로 조정하였다. 디에틸 에테르를 첨가하여 여과하고, 디에틸 에테르로 세척하고 진공하에서 건조시켜 노란색 침전물을 얻었다. N-프룩토피라노실-화합물 1(화합물 49)에 대한 분석 데이터는 하기의 표 2에 요약하였다.

N-(4-N,N-디- 메틸아미노벤질 ) 화합물 1(화합물 50)( 환원성 N-알킬화 )

DMF(2mL)에 용해시킨 4-N,N-디메틸아미노벤즈알데히드(0.065mmol)와 화합물 1(0.022mmol) 용액에 NaBH₃CN(4.1mg, 0.065mmol)을 첨가한 후, 2시간 동안 37℃에 방치하였다. 상기 반응 혼합물을 20시간 동안 37℃에 방치하였다. 디에틸 에테르(10mL)를 첨가하여 유상 잔류물이 생성되면, 디에틸 에테르 (10mL x 2)로 계속 흔들어 주었다. 아세톤(10mL)을 첨가한 후 노란색 침전물이 형성되었다. 상기 침전물을 여과하여 디에틸 에테르로 세척하고 건조시켰다. 염을 포함하는 조 화합물을 시스템 CHCl₃:MeOH:H₂O:HCOOH(13:6:1:0.1)을 사용하여 실리카 겔 머크 상의 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 분획의 순도를 TLC, 시스템 I으로 조절하였다. 원하는 화합물을 포함하는 분획을 수집하고, 상기 용액을 농축하였다. 아세톤을 첨가하여 여과하고, 아세톤으로 세척하여 진공하에서 건조시켜 노란색 침전물을 얻었다. N-(4-N,N-디-메틸아미노벤질) 화합물 1(화합물 50)의 분석 데이터는 상기 표 4에 요약하였다.

N-L- 리실 -화합물 1 (화합물 51)

1 단계(N-[N- Fmoc -아미노] 아실화 ). 건조 DMF(1mL)에 용해시킨 화합물 1(50mg, 0.055mmol) 용액을 10℃에서 냉각시킨 후, Et₃N(7.5μl, 0.055mmol)과 N^α,N^ε-디-Fmoc-L-라이신 N-옥시석신이미드 에스테르(57mg, 0.083mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 1시간 동안 이 온도에서 교반하였다. 반응의 흐름을 용매 CHCl₃-MeOH(6:1)의 시스템에서 TLC로 조절하였다. 상기 반응 혼합물에 디에틸 에테르(~5mL)을 첨가하여 여과하고, 디에틸 에테르로 세척하고 진공하에서 건조시켜 노란색 침전물을 얻고, 실리카 겔 상의 컬럼 크로마토그래피(MeOH의 기울기가 0 → 10%인 시스템 CHCl₃-MeOH)에 의해 정제하였다. 원하는 화합물을 포함하는 분획을 수집하고, 상기 용액을 농축하여 디에틸 에테르를 첨가하고, 여과하고 디에틸 에테르로 세척하고 진공하에서 건조시켜 노란색 침전물을 얻었다. TLC: Rf=0.6(CHCl₃-MeOH 6:1). HPLC: Rt=13.08(0.2% HCOONH₄ PH 4.5 및 MeCN: 75 → 90%, 20분, 90 → 90%, 10분).

2 단계( Fmoc -제거).

DMSO/MeOH 10:1(1mL)에 용해시킨 분리된 노란색 고체(22mg, 0.015mmol)에 피페리딘(4.5μl, 0.045mmol)을 첨가하였다. 상온에서 30분간 교반한 후, 디에틸 에테르(~3mL)를 첨가하여 유상 잔류물이 형성되면 디에틸 에테르(3mL x 2)를 사용하여 계속 흔들어 주었다. 아세톤(2mL)을 첨가하여 여과하고, 디에틸 에테르로 세척하고 진공하에서 건조시켜 노란색 침전물을 얻었다. N-L-리실-화합물 1(화합물 51)에 대한 분석 데이터는 상기 표 4에 요약하였다.

N,N-디-(3-아미노프로필)-화합물 1(화합물 52)

1 단계(환원성 N-알킬화) DMF(3mL)에 용해시킨 N-Fmoc-3-아미노프로피온알데히드(160mg, 0.054mmol)와 화합물 1(100mg, 0.011mmol) 용액에 NaBH₃CN(34mg, 0.054mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 20시간 동안 37℃에 방치한 후, 디에틸 에테르(200mL)를 한 방울씩 첨가하였다. 노란색 침전물을 여과하고, 선형 기울기 시스템 CHCl₃:MeOH:HCOOH(3:1:0.01) → CHCl₃:MeOH:H₂O:HCOOH(13:6:1:0.1)에서 컬럼 크로마토그래피용 머크 실라키 겔(0.040-0.063mm) 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여, 노란색 침전물의 N,N-디-(N-Fmoc-3-아미노프로필) 화합물 1을 얻었다. HPLC 데이터: Rt=27.43(C).

2 단계( Fmoc -제거).

DMSO(3mL)에 용해시킨 N,N-디-[3-(N-Fmoc)-아미노프로필]-S44HP 용액에 피페리딘(0.1mL)을 첨가하였다. 상온에서 2시간 후, 디에틸 에테르(~7mL)을 첨가하여 형성된 유상 잔류물에 디에텔 에테르(7mL x 2)를 넣어 계속 흔들어 주었다. 아세톤(10mL)을 첨가하여 노란색 침전물을 얻고, 이를 여과하여 디에틸 에테르로 세척하고 진공하에서 건조시켰다. N,N-디-(3-아미노프로필) 화합물 1(화합물 52)에 대한 분석 데이터를 상기 표 4에 요약하였다.

화합물 1의 염

L- 아스파테이트 (55), 화합물 1 L- 글루타메이트 (29), D- 글루타메이트 (54)

화합물 1(13mg, 0.015mmol)을 0.2ml DMSO에 용해시킨 후, 0.1ml 물에 용해시킨 아미노산(0.015mmol)과 대응하는 용액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 15분간 상온에서 방치하였다. 상기 반응 혼합물에 디에틸 에테르(~2mL)을 첨가하여 유상 잔류물이 생성되면 디에틸 에테르(2ml x 2)를 넣어 계속 흔들어 주었다. 이 오일에 3ml의 아세톤을 첨가한 후, 노란색 침전물의 염이 형성되었다. 상기 침전물을 여과하고 아세톤으로 세척한 후 진공하에서 건조하였다.

메틸설포네이트 (56), 디클로로아세테이트 (57)

대응하는 산(0.015mmol)을 0.1ml DMSO에 용해시킨 후, 0.1ml DMSO에 용해시킨 화합물 1(13mg, 0.015mmol) 용액에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 5분간 상온에 방치하였다. 상기 반응 혼합물에 디에틸 에테르(~2mL)을 첨가하여 유상 잔류물이 형성되면 디에틸 에테르(2ml x 2)을 넣어 계속 흔들어 주었다. 이 오일에 3ml의 아세톤을 첨가한 후, 노란색 침전물의 염이 형성되었다. 상기 침전물을 여과하여 아세톤으로 세척하고 진공하에서 건조하였다.

화합물 1 하이드로클로라이드 (53)

0.2ml DMSO에 용해시킨 화합물 1(13mg, 0.015mmol) 용액에 0.15ml(0.015mmol)의 0.1N HCl 수용액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 5분간 상온에 방치하였다. 상기 반응 혼합물에 디에틸 에테르(~2mL)을 첨가하여 유상 잔류물이 형성되면 디에틸 에테르(2mL x 2)을 넣어 계속 흔들어 주었다. 이 오일에 3ml의 아세톤을 첨가한 후, 노란색 침전물의 염이 형성되었다. 상기 침전물을 여과하여 아세톤으로 세척하고 진공하에서 건조하였다. 모든 샘플들은 약 90%의 수율로 얻어졌으며, 수용성이었다.

항진균 활성 및 독성의 측정

항진균 민감성( antifungal susceptibility ) 연구 (1)

적절하게 NCCLS 문헌 M27-A[Reference method for Broth Dilution Antifungal Susceptability Testing of Yeasts, IBSN 1-56238-328-0, Pennsylvania, 1997] 및 M38-A[Reference method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi : Approved Standard, IBSN 1-56238-470-8, Pennsylvania, 2002]에 기재된 배지 미량희석법(broth microdilution method)을 사용하여 효모(yeast) 및 곰팡이(filamentous fungi, moulds)의 항진균 민감성 테스트를 하였다.

배지 및 버퍼. 소디움 바이카보네이트를 제외하고 L-글루타민 및 페놀 레드를 포함하고, 0.2% 글루코오스(ICN, Biomedicals Inc., Ohio, USA)를 첨가하고, 0.165M 몰포린프로판설폰산(morpholinepropanesulfonic acid, MOPS; ACROS ORGANICS, New Jersey, USA)으로 완충된 배지 RPMI 1640을 연구에 사용하였다.

항진균제. 처음으로 상기 화합물들을 1600μg/mL의 시작농도에서 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 가용화시켰다. 동일한 용매를 이용하여 저장 용액(stock solution)으로부터 일련의 희석물(1600 내지 3.13μg/mL)을 제조하였다. 그 후, 이 DMSO 용액을 시험 배지(test medium)로 50배(처음에 10배, 그 후 5배) 희석하였다. 마지막으로, 그것들을 배양할 때 2배로 희석하여 최종 용매 농도를 1%로 감소시켰다(항진균제의 최종 농도는 16 내지 0.13μg/mL). 상기 용액을 사용하기 바로 전에 제조하였다.

미생물. 민감성 테스트에 사용된 미생물들은 칸디다 알비칸스 ATCC 14053(Candida albicans ATCC 14053), 크립토코커스 후미콜러스 ATCC 9949(Cryptococcus humicolus ATCC 9949), 아스퍼질러스 나이거 ATCC 16404(Aspergillus niger ATCC 16404) 및 후사리움 옥시스포럼 VKM F-140(Fusarium oxysporum VKM F-140)(=CMI, IMI90473)이었다. 미생물들을 감자 한천사면배지(potato dextrose agar slant) 상에 저장하고, 이를 -70℃에서 50% 글리세롤 용액에 저장하였다. 효모의 배양은 사브로우드 덱스트로오스(Sabouraud dextrose; SAB) 한천배지 상에서 2차 배양하였고, 35℃에서 24시간 동안(칸디다 알비칸스) 또는 25℃에서 48시간 동안(크립토코커스 후미콜러스) 배양하여 새롭게 자란 순수 배양물을 얻었다. 곰팡이의 배양은 감자 한천배지 상에서 2차 배양하였고, 35℃에서 7일간(아스퍼질러스 나이거) 또는 35℃에서 2일간 배양한 후 25℃에서 5일간 배양(후사리움 옥시스포럼)하여 포자의 형성을 최대화시켰다.

접종원(inoculum)의 제조

효모에 대하여, 0.85%의 멸균 식염수에 배양 콜로니를 현탁하여 시작 접종원을 제조하였다. 그 결과 생성된 현탁액을 볼텍싱하고, 0.5% 맥파랜드(0.5 McFarland)(1 x 10⁶ 내지 5 x 106 CFU/mL)로 표준탁도를 맞추기 위하여 530nm에서 스펙트로포토미터를 사용하여 조정하였다. 2배의 시험 접종원을 얻기 위하여, 상기 저장 효모 현탁액을 배지를 사용하여 1:1000으로 희석하였다.

곰팡이에 대하여, 잘 발육한 곰팡이 콜로니에 0.85%의 멸균 식염수를 채우고 부드럽게 긁어 저장 현탁액을 제조하였다. 아스퍼질러스 접종원을 제조하기 위하여 1%(v/v)의 습윤제 트윈 20(Tween 20)을 식염수에 첨가하였다. 마지막으로, 세포의 덩어리를 깨기 위하여 상기 현탁액을 15초간 볼텍싱한 후, 4겹의 멸균된 거즈로 여과하였다. 분생자 포자(conidial spore) 현탁액의 밀도를 530nm에서 측정하고, 아스퍼질러스 나이거에 대하여 0.09-0.11로, 후사리움 옥시스포럼에 대하여 0.15-0.17로 조정하였다. 이 현탁액들을 표준 배지를 사용하여 1:50으로 희석하였다. 2 x 밀도에 대응하는 1:50 접종 희석물들은 대략 0.4 x 104 내지 5 x 104 CFU/mL을 필요로 하였다.

접종원의 정량은 밀리리터 당 CFU의 가시 숫자(viable number)를 측정하기 위하여, 사보우라우드 한천배지 상에 접종원의 희석물을 접종(plating)하여 수행하였다.

미량희석 기술

실험을 위해 멸균된 바닥이 평평한 96-웰 미세역가 플레이트(96-well flat-bottomed microtitration plates)를 사용하였다. 100μl의 희석된 접종원을 100μl의 이중희석된 화합물이 담겨있는 각각의 미세역가 웰에 현탁시켰다. 약물을 포함하지 않고 효모/곰팡이를 포함하지 않는 대조군을 포함하였다. 미세역가 트레이를 교반하지 않고 35℃(칸디다 알비칸스 및 곰팡이) 또는 25℃(크립토코커스 후미콜러스)에서 배양하고, 가시적인 성장의 여부를 관찰하였다. 하기의 등급을 사용하여 각 웰에 0 내지 5의 수치 점수를 주었다: 0 = 광학적으로 깨끗함 또는 성장 없음, 1 = 약간 성장함(성장 대조군의 25%), 2 = 성장의 현저한 감소(성장 대조군의 50%), 3 = 성장의 약간의 감소(성장 대조군의 75%), 4 = 성장의 감소 없음. 최소 저해 농도(Minimal inhibitory concentrations; MICs)는 48시간에서 나타났다.

화합물의 항진균 활성

	MIC μg/mL*
화합물	칸디다 알비칸스 ATCC 14053	크립토코커스 후미콜러스 ATCC 9949	아스퍼질러스 나이거 ATCC 16404	후사리움 옥시스포럼 VKM F-140
AmB	1	1	1	4
S44HP	1	1	1	4
1	1	1	1	2
5	2	4	4	4
6	2	2	4	4
7	2	1	2	8
8	2	2	4	8
9	1	1	2	4
10	2	2	4	8
11	1	1	2	2
12	1	1	2	2
13	1	1	1	4
14	1	1	2	4
15	1	2	2	4
16	1	1	2	8
17	1	1	2	8
18	1	1	2	8
19	2	2	2	8
20	2	2	4	>16
21	2	4	4	4
22	1	1	1	1
23	4	4	8	8

* 최소 저해 농도는 임의의 가시적인 성장을 방지하는 시약의 가장 낮은 농도로서 측정되었다. 상기 실험의 결과를 재연하였다. 얻어진 데이터가 모두 일치하는 경우, 상기 최소 저해 농도를 단일 숫자로서 나타내었다.

상기 결과는 본 발명의 화합물이 항진균 활성을 가진다는 것을 나타낸다. 더욱 상세하게는, 이 실험들은 다수의 나이스타틴 유도체들이 암포테리신 B 및 S44HP(예를 들어, 화합물 번호 1, 9, 11, 12, 13, 14 및 22)과 동등한 항진균 활성을 가진다는 것을 암시한다.

항진균 민감성 연구 (2)

몇몇의 나이스타틴 유도체의 항진균 활성을 더 연구하였다. 연구 (1)에서 사용된 방법은 항진균 활성을 실험하는 데 국제적으로 인정된 방법이지만, 매우 민감하지는 않기 때문에 유사한 활성의 화합물들을 구별하는 것은 쉽지 않다. 따라서, 다수의 나이스타틴 유도체의 항진균 활성은 더욱 민감하게 설계된 방법으로 측정하였다.

폴리엔 마크로라이드 생활성의 추가 실험을 위해 사용된 실험 미생물은 NaCl을 첨가하지 않은 120μl의 표준 M19 배지(각 웰 당 1000 cfu의 접종원을 접종함)에서 자란 칸디다 알비칸스 ATCC 10231 및 30μl의 희석된 폴리엔 마크로라이드 샘플이다. 실험 미생물을 저해하지 않는 완벽한 성장 저해 범위로부터 산출된 스펙트럼 농도를 보장하도록 상기 항생제를 순차적으로 MeOH로 희석하였다. 항생제 희석물을 이용한 실험 미생물 배양물을 30℃에서 진탕하지 않고 96-웰 미세역가 플레이트에서 배양하고, 성장을 스펙트라맥스 플러스 미세역가 플레이트 측정기(SpectraMax Plus microtiter plate reader) 상에서 12시간, 14시간 및 16시간 후 OD₄₉₀로서 측정하였다. OD를 항생제 농도에 대하여 그래프로 나타내고, MIC50을 50%의 성장 저해에서 회귀곡선(regression curve)으로부터 추정하였다.

그 결과를 하기의 표 6에 나타내었다.

상기 결과들은 본 발명의 다수의 나이스타틴 유사체가 실제로 암포테리신 B 및 S44HP 모두에 비하여 향상된 항진균 활성을 가지는 것으로 확인되었다.

화합물 1의 염의 항진균 활성(표 7)

하기의 수용성 염을 테스트하였다.

화합물 1 하이드로클로라이드(53),

화합물 1 L-글루타메이트(29),

화합물 1 D-글루타메이트(54)l,

화합물 1 디클로로아세테이트(57)

미생물	화합물 번호 / MIC(μg/ml)
	55	29	53	54	57	1	S44HP
칸디다 알비칸스 ATCC 14053	2	1	2	2	2	1	1
크립토코커스 후미콜러스 ATCC 9949	2	1	2	2	2	1	1
아스퍼질러스 나이거 ATCC 16404	2	2	4	2	2	2	1
후사리움 옥시스포럼 VKM F-140	2	2	4	2	2	2	4

화합물 1 L-글루타메이트(29)가 화합물 1의 가장 활성이 있는 염이다.

화합물 유도체들의 항진균 활성(표 8 및 9)

화합물 50		p-디메틸아미노벤질-화합물 1
화합물 51		N-(L-L-리실)-화합물 1
미생물	MIC (μg/ml)
	화합물 50	화합물 51	화합물 1
칸디다 알비칸스 ATCC 14053	2	1	1
크립토코커스 후미콜러스 ATCC 9949	2	1	1
아스퍼질러스 나이거 ATCC 16404	2	1	2
후사리움 옥시스포럼 VKM F-140	8	2	2

화합물 51은 이 시리즈에서 모 항생제(parent antibiotic) 보다 약간 더 높은 항진균 활성을 가지는 가장 활성이 있는 유도체이다.

시험관 내 독성 연구

여러가지 나이스타틴 유도체의 독성을 2μg/mL 및 5μg/mL 및 25μM에서 실험하였다.

화합물들을 DMSO에 용해시키고, 서로 다른 농도를 가지는 5mg/mL 및 0.1mL의 샘플을 DMSO에 용해시켜 제조하였다. 상기 샘플들을 2.5% 말 혈액(PBS-HBl; 얼음에 보관)을 포함하는 0.9mL PBS 완충액과 혼합하고, 교반 없이 30분간 37℃에서 배양하였다.

세포들을 5분간 5000rpm으로 원심분리하여 펠릿화시킨 후, OD₅₄₅를 측정하여 용혈반응(haemolysis)을 평가하였다. 100%의 용혈반응은 증류수와 2.5% 말 혈액의 현탁액으로부터 얻은 OD₅₄₅ 값으로 정의하였다.

그 결과를 하기의 표 10-12에 나타내었다.

2μg/mL 및 5μg/mL 항생제의 작용하에서 인간 혈액 적혈구의 용혈반응

혈액 샘플 #	농도 μg/ mL	Amp B	S44HP	13	14	16	DMSO
1	5	30	34.6	15.5	4.8	3.1	2.2
2		29.5	39.7	14	4.5	2.9	1.7
3		31.5	50.4	14.2	5.3	3.4	1.4
평균± SE		30.3±0.6	41.6±4.6	14.5±0.5	4.9±0.2	3.1±0.14	1.7±0.2
1	2	4.4	12.3	3.3	2.7	2.3
2		5.9	6.4	3.0	2.5	2.2
3		8.0	7.5	4.9	2.5	2.6
평균± SE		6.1±1.0	8.7±1.8	3.7±0.6	2.5±0.07	2.4±0.12

5μg/mL 항생제의 작용하에서 적혈구의 용혈반응(M±SEM, %)

혈액 샘플 #	Amp B	S44HP (92%)	7	15	11	12	DMSO
1	39	73	5.8	2.8	3	5	1.4
2	38	64	5.0	2.4	3.4	4.3	2.2
3	42	56	5.0	2.7	3.3	4.0	1.5
평균±SE	39.7±1.2	64.3±4.9	5.2±0.2	2.6±0.1	3.2±0.1	4.4±0.3	1.7±0.25

25μM 항생제의 작용하에서 적혈구의 용혈반응(M±SEM, %)

혈액 샘플 #	5	6	7	9	17	18
	2	2	0.9
	1.8	2.4
	2.1	3.3	1.9		4.8	5.3
	1.0	7	1.9	12.2
	1	3.7	1.7	18.0	1.7	3.0
	1.9	4.3	1.3	16.7	1.7	3.2
			1.9	22.4	2.1	9.7
	1.3	3.2	1.0	25	0.8	1.0
				16.2	3.3	1.5
평균± S.E.M	1.6±0.2	3.7±1.6	1.5±0.17	18.4±1.9	2.4±0.6	3.9±1.3
M	7	7	7	6	6	6
P	<0.001	<0.01	<0.001	<0.001	<0.001	<0.05

이 결과들은 본 발명의 화합물들이 S44HP 또는 암포테리신 B에 비하여 현저하게 낮은 독성을 가진다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 화합물들은 부작용 없이 더욱 많은 양으로 사용할 수 있기 때문에 매우 유리하다.

화합물 1 및 11 등의 생체 내 실험

동물. 러시아 국립과학 아카데미(Russin Academies of Medical Science; RAMS)의 "크루코보(Kryukovo)" 중앙 농장으로부터 받은 체중 20-22g의 1세대 잡종 수컷 마우스 (C57B1/6xDBA/2)F1 B6D2F1을 사용하였다. 동물들을 물을 마시기 위해 쉽게 접근할 수 있고(마음대로, ad libitum) 벽돌형 표준 식이가 놓인 (환경적으로 제어된 환경(24±1℃, 12/12 시간의 밝기/어둡기 사이클)에서 경재 잠자리(hardwood bedding)를 가지는) 플라스틱 케이스의 동물 사육장에서 사육하였다. 2주간의 격리 기간 후, 건강한 동물들을 실험에 사용하였다.

감염성 인자. 칸디다 알비칸스(ATCC 14053 균주)를 사용하였다.

항진균제. 화합물 1 및 11(등)의 용액을 "즉석에서(extempore)" 제조하고, 빛이 들어가는 걸 피하기 위하여 어두운 유리 바이알에 보관하였다. 상기 용액을 하기와 같이 제조하였다: 멸균된 유리 바이알 내에서 건조 항생 물질(5mg)을 건조 소디움 데옥시콜레이트(4.1mg)와 혼합하였다. 혼합하기 위하여 10mL의 포스페이트 완충용액(NaH₂PO₄ - 1.59g; Na₂HPO₄ - 0.96g; H₂O - 100mL이 될 때까지)을 첨가하고, 상기 현탁액을 즉시 균질한 현탁액이 형성될 때까지 10분간 강하게 흔들어 주었다. 상기 얻어진 현탁액(2mL)을 새로운 유리 바이알에 넣고, 6mL의 5% 중성 멸균 글루코오스 용액을 첨가하여 얻은 용액(0.125mg/mL)을 정맥 투여용으로 사용하였다.

암포테리신 B 및 S44HP의 제조물 또한 동일한 방법으로 제조하였다.

급성 독성

화합물 1 및 11(등) 뿐만 아니라 암포테리신 B 및 S44HP의 급성 독성을 측정하였다.

항생제 제조물을 용액을 제조한 후 1-1.5시간 내에 마우스의 꼬리 정맥으로 따로따로 주사하였다. 주사 속도는 분당 0.5mL을 넘지 않는다. 각각의 항생제를 0% 내지 100% 치사율을 일으키는 범위의 용량과 최소한의 3개의 중간 용량(intermediate doses)으로 사용하였다. 독성이 있다고 간주하는 용량(Toxicity-characterizing doses) MTD 및 LD₅₀을 통계 분석 프로그램(statistical analysis program) "StatPlus-3.5.0.-2005"로 리치필드-윌콕손(Litchfield-Wilcoxon., J Pharmacol Exp Ther 96:99)에 따라 "프로빗 분석(probit analysis)" 방법을 사용하여 계산하였다. 그 결과를 하기의 표 13에 나타내었다.

급성 독성

화합물	LD50(mg/kg)	MTD (mg/kg)
암포테리신 B	2.8	2.01
S44HP	2.05	0.64
1	15.4	7.8
11	16.4	11.9
29	17.8	11.0
51	5.3	4.48
41	38.6	21.2
48	32.2	25.9
25	50.8	42.8
26	50.0	43.1
27	20.6	10.8
28	22.1	14.7

생체 내 항진균 활성

1.0 million CFU/마우스(부피 0.1mL)의 용량으로 칸디다 알비칸스 배양물을 정맥내 주사하여 동물들을 감염시켰다. 감염 30분 후, 항진균제를 0.2mL의 부피로 다양한 용량으로 (0.2mL/30초의 속도로) 마우스에 정맥내 주사하였다. 각각의 용량은 감염일을 포함하여 4일간 매일 투여하였다(0, 1, 2 및 3일).

대조군으로서 (칸디다 알비칸스를 이용하여 동일한 방법으로 감염시킨) 치료하지 않은 마우스군이 있다. 또한, 0.2mL의 용매(인산 완충용액 + 5% 글루코오스(1:1))를 (항진균제 제조물과 같은 동일한 부피로) 정맥내로 투여한 감염되지 않은 "플라시보(placebo)" 군이 있다.

임의의 "플라시보" 군에서는 어떠한 활성도 확인되지 않았다. 또한, 감염되지 않은 동물들에서 칸디다 알비칸스는 전혀 발견되지 않았다.

실험 5일째, 마우스의 체중을 재고 경추탈골시켜 안락사시켰다. 그 후, 멸균 상태에서, 신장으로부터 얻은 가시적 균질현탁액을 집계하여 각각의 마우스의 칸디다 알비칸스의 존재량을 측정하였다. 신장을 무균적으로 제거하고 무게를 잰 후, 멸균 커런덤(corundum)을 이용한 막자사발로 빻았다. 그 결과 생성된 현탁액의 희석물을 제조하고, 사부로 한천을 이용한 페트리 디쉬 상에 도말하고, 35℃의 온도에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 칸디다 알비칸스의 성장한 콜로니 수를 세고, 그것들의 양을 1g의 신장 조직을 기초로 하여 계산하였다.

마이크로소프트 엑셀 2003을 이용하여 통계 분석을 수행하였다. 현저한 차이는 스튜던트의 t 검정(Student t-criterion)에 의한 비교에서 P≤0.05를 가진다.

그 결과를 하기의 표 14 및 도 9에 나타내었다.

칸디다성 패혈증을 가진 마우스 모델에서의 화합물 29, 51, 41, 48의 특이적 활성 연구

동물. 러시아 국립과학 아카데미(Russin Academies of Medical Science; RAMS)의 "크루코보(Kryukovo)" 중앙 농장으로부터 받은 체중 18-20g의 1세대 잡종 암컷 마우스 (C57B1/6xDBA/2)F1 (B6D2F1)을 실험에 사용하였다. 동물들을 물을 마시기 위해 쉽게 접근할 수 있고(마음대로, ad libitum) 벽돌형 표준 식이가 놓인 (환경적으로 제어된 환경(24±1℃, 12/12 시간의 밝기/어둡기 사이클)에서 경재 잠자리(hardwood bedding)를 가지는) 플라스틱 케이스에서 기관의 동물 사육장에 사육하였다. 2주간의 격리 기간 후, 건강한 동물들을 실험에 사용하였다.

감염성 인자로서 사용한 것은 칸디다 알비칸스(균주 ATCC 14053). 실험된 제조물들은 화합물 29, 51, 41, 48이었다. 비교 제조물들은 암포테리신 B(순수)였다. 실험된 제조물들의 용액은 고객에 의해 특정된 기술에 의해 상황에 맞게(ex tempore) 제조되었다.

실험의 보고서

동물들을 3마리씩 사육하였고, 0.1ml 부피의 1.0 million CFU/마우스의 용량으로 칸디다 알비칸스 배양물을 정맥내 주사에 의해 감염시켰다. 상기 용량의 칸디다 알비칸스는 모든 실험에서 계속해서 남는다는 것에 유의할 필요가 있다. 마우스에 감염시킨 30분 후, 0.2ml 부피의 대응하는 용량으로 실험된 제조물의 첫번째 정맥 주입을 수행하였다(0.2ml/30초의 속도로).

실험은 각 실험에 하나의 용량(암포테리신 B를 사용한 것과 테스트된 제조물들 모두), 상기 용량은 감염시킨 날부터 4일 내(0, 1, 2 및 3일)에 이래 각각의 용량은 4일 내에 매일 투여한다. 각각의 실험에서 칸디다 알비칸스로 감염되고 치료되지 않은 동물군이 있다. 또한, 0.2ml의 용매 - 인산 완충용액 + 5% 글루코오스(1:1)를 정맥내로 주사한 (감염되지 않은) 정상(intact) 동물인 "플라시보"군이 있다. "플라시보"의 활성 데이터상에는 어떠한 활성도 나타나지 않았다. 감염되지 않은 동물에서 칸디다 알비칸스는 전혀 발견되지 않았다.

실험 5일 째에 마우스의 체중을 재고 경추탈골시켜 안락사시켰다. 그 후, 멸균 상태에서, 마우스의 칸디다 알비칸스의 존재량을 신장으로부터 얻은 균질현탁액의 가시적 집계에 의해 측정하였다. 신장을 무균적으로 제거하고 무게를 잰 후, 멸균 커런덤(corundum)을 이용한 막자사발로 빻았다. 그 결과 생성된 현탁액의 희석물을 제조하고, 사부로 한천을 이용한 페트리 디쉬 상에 도말하고, 35℃의 온도에서 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 칸디다 알비칸스의 성장한 콜로니 수를 세고, 그것들의 양을 1g의 신장 조직을 기초로 하여 재계산하였다. 1차 희석은 10^-1이었다. 이 배양에서의 결과 없음은 5 CFU/g으로 받아들였다.

연구된 제조물의 평가의 기본 척도에 대하여, 암포테리신 B의 최대 효과를 사용하였다(유효량(effective dose; ED)).

마이크로소프트 엑셀 2003을 이용하여 통계 분석을 수행하였다. 스튜던트의 t 검정(Student t-criterion)에 의한 비교에서 P≤0.05에서의 평균 차이는 현저하다고 받아들여진다.

얻어진 결과를 표 15에 나타내었다. 암포테리신 B는 그것의 연구된 가장 높은 용량에서 활성의 척도로 받아들여지는 가장 효과적인 활성을 나타내었다(1.25mg/kg/d, MTD로부터

62%).

< 마우스의 칸디다성 패혈증 모델에서 암포테리신 B(순수)과 비교한 화합물 29, 51, 41, 48의 활성 >

참고 : 비치료/Dataq로부터의 현저한 차이를 평균±표준오차로 나타냄

n - 마우스의 숫자

유전자 조작에 기초한 추가 화합물의 합성

다양한 추가 조작이 가능한 백본 구조들을 제조하였다. 상기의 화학적 성질을 이용하여, 여러가지 기능기들이 유리 COOH 및 아민기에 부착될 수 있다. 이 염기 구조들은 모두 본 발명의 더욱 바람직한 화합물들을 형성한다(H 원자는 나타내지 않음).

나이스타틴 PKS에서 ER5 및 DH15 도메인의 불활성화, C-10 수산화 없음

나이스타틴 PKS에서 ER5 및 KR16 도메인의 불활성화.

나이스타틴 PKS에서의 ER5, DH15 도메인 및 NysN 모노옥시게나아제의 불활성화, C-10 수산화 없음.

나이스타틴 PKS에서의 ER5 도메인과 NysN 및 NysL 모노옥시게나아제의 불활성화.

나이스타틴 PKS에서의 ER5와 KR14 도메인 및 NysN 모노옥시게나아제의 불활성화.

나이스타틴 PKS에서의 ER5 도메인 및 NysL 모노옥시게나아제의 불활성화.

나이스타틴 PKS에서의 ER5와 KR16 도메인 및 NysL 모노옥시게나아제의 불활성화.

돌연변이체 B2의 제조

KR16 의 불활성화를 위한 유전자 치환 백터의 제조

재조합 파지 N20(Brautaset et al., 2000)의 총 14kb의 삽입체를 XbaI으로 절단하고 플라스미드 pGEM-3zf 안으로 클로닝하여 pL20X를 얻었다. 이 플라스미드로부터, 3.7kb의 BamHI 단편을 절단하고 pGEM-3zf에 연결하여 플라스미드 pGEMB 3.7을 얻었다. 그 후, (KR16 활성 부위 잔기 Y3404를 포함하는) 0.8kb의 DNA 단편을 하기의 프라이머들을 이용하여 pGEMB3.7로부터 PCR 증폭하였다.

KR16-F1 : 5'-ttttctgCAGCCGACCGGCACCGTCC-3' (정배열) 및

KR16-1R : 5'-ttttaaGCTTCCTGGACCGCGCGGG-3' (역배열)

상기 PCR 산물을 PstI 및 HindIII(두개의 PCR 프라이머에서 밑줄친 새로운 인식 부위)로 말단을 절단(end-digested)하고, pLITMUS28의 대응하는 부위 안으로 클로닝하여 pLITPH0.8을 얻었다. 후자의 플라스미드를 하기의 돌연변이 도입용 올리고뉴클레오티드를 사용하여 KR16 활성 부위의 부위 지정 돌연변이를 위한 주형으로서 사용하였다:

mutKR16-1F : 5'-CCCCGGCCAGGCCGGCT T CG AA GCCGCCAACGCGGTCC-3' (정배열)

mutKR16-1R : 5'-GGACCGCGTTGGCGGC TT CG A AGCCGGCCTGGCCGGGG-3' (역배열)

변이된 뉴클레오티드를 굵게 표시하였고, 도입된 새로운 BstBI 인식 부위에밑줄을 그었다. 이 두개의 올리고뉴클레오티드를 이용함으로써, KR16 활성 부위 Tyr을 Phe로 치환함과 동시에 다음의 하위(downstream) Ala를 Glu로 치환하여 이중 돌연변이체 YA3404FE를 얻었다. 올바른 돌연변이를 가지는 플라스미드를 BstBI 절단으로 확인하고, 임의의 다른 바람직하지 않은 해명하기 위하여 완전히 클론된 삽입체를 시퀀싱하였다. 정확하게 돌연변이된 플라스미드로부터 627bp의 Bpu102I/Bpu10I 단편을 절단하고, 플라스미드 pGEMB 3.7에 대응하는 단편으로 치환하는 데 사용하여 플라스미드 pGEMB3.7m을 얻었다. 후자의 플라스미드로부터, 전체 3.7kb의 삽입체를 EcoRI/HindIII로 절단하고 pSOK201의 3.1kb EcoRI/HindIII 백본과 함께 연결하여 유전자 치환 벡터 pKR16m을 얻었다.

유전자 치환

상기 벡터를 이중 상동성 재조합(double homologous recombination)에 의해 nysA가 결여된 스트렙토마이세스 노우르세이 돌연변이체 GG5073SP(Borgoset al., 2006) 안으로 도입하였다. 폴리엔 생성이 브라우타셋 등(Brautaset et al., 2003)에 기재된 것과 같이 트랜스로(in trans) nysA 유전자를 도입하여 복구되기 전에, 정확한 염색체 KR16 돌연변이체를 PCR+BstBI 절단 뿐만 아니라 서던 블롯을 이용하여 확인하였다. 그 결과 생성된 돌연변이체를 B2로 표시하였다.

변이체 B7의 제조

플라스미드 pKOnysN-CL346AS(PNAS-manus를 참조)를 이중 상동성 재조합에 의해 nysA가 결여된 B2 안으로 도입하였다. 폴리엔 생성이 브라우타셋 등(Brautaset et al., 2003)에 기재된 것과 같이 트랜스로(in trans) nysA 유전자를 도입하여 복구되기 전에, 정확한 염색체 nysN 돌연변이체를 PCR 및 NheI 절단 뿐만 아니라 서던 블롯을 이용하여 확인하였다. 그 결과 생성된 돌연변이체를 B7로 표시하였다.

변이체 B5의 제조

KR14 불활성화를 위한 유전자 치환 벡터의 제조

플라스미드 pL20X(상기 B2의 방법을 참조)의 4.0 BclI/EcoRI 단편을 절단하고, BamHI/EcoRI으로 절단된 pGEM-3zf 안으로 연결하여 pBE4.0을 얻었다. 1kb의 단편을 하기의 프라이머를 이용하여 상기 플라스미드로부터 PCR 증폭하였다:

KR14-F1 : 5'-TTCGGCGGCGTAATCTCC-3' (정배열), 및

KR14-R1 : 5'-ttttaaGCTTCCACGGCGAGGTGC-3' (역배열)

PCR 단편을 SacI 및 HindIII(새로운 인식 부위는 프라이머에서 밑줄 친 부분)로 절단하고 pLITMUS28로 연결하여 pLITHS1.0을 얻고, 상기 플라스미드를 하기의 돌연변이용 올리고뉴클레오티드를 이용하여 KR14 활성 부위의 부위 지정 돌연변이를 위한 주형으로서 사용하였다:

KR14-mut1 : 5'-CCCGGGCCAGGCCAACT T CG AA GCTGCCAACGCCGTCCTG-3' (정배열)

KR14-mut2 : 5'--CAGGACGGCGTTGGCAGC TT CG A AGTTGGCCTGGCCCGGG-3' (역배열)

변이된 뉴클레오티드를 굵게 표시하였고, 도입된 새로운 BstBI 인식 부위에는 밑줄을 그었다. 이 두개의 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써, Kr14 활성 부위 Tyr을 Phe로 치환함과 동시에 다음의 하위 Ala를 Glu로 치환하여 이중 돌연변이체 YA9197FE를 얻었다. 정확한 돌연변이를 가지는 플라스미드를 BstBI 절단으로 확인하고, 임의의 다른 원하지 않는 돌연변이를 해명하기 위하여 전체의 클론된 삽입체를 시퀀싱하였다. 정확하게 돌연변이된 플라스미드로부터 0.7kb의 FseI/AscI 단편을 잘라내고, 플라스미드 pBE4.0의 대응하는 단편으로 치환하는데 사용하여 pBE4.0mut를 얻었다. 상기 플라스미드로부터 전체 4.0kb의 삽입체을 EcoRI/HindIII로 잘라내고 pSOK201의 3.1kb의 EcoRI/HindIII 백본과 함께 연결하여 유전자 치환 벡터 pKR14m을 얻었다.

유전자 치환

상기 벡터를 이중 상동성 재조합(double homologous recombination)에 의해 nysA가 결여된 스트렙토마이세스 노우르세이 돌연변이체 GG5073SP(Borgoset al., 2006) 안으로 도입하였다. 폴리엔 생성이 브라우타셋 등(Brautaset et al., 2003)에 기재된 것과 같이 트랜스로(in trans) nysA 유전자를 도입하여 복구되기 전에, 정확한 염색체 KR16 돌연변이체를 PCR+BstBI 절단 뿐만 아니라 서던 블롯을 이용하여 확인하였다. 그 결과 생성된 돌연변이체를 BSG015로 표시하였다.

다음으로, nysN 불활성 벡터 pKOnysN-CL346AS(PNAS-manus 참조)를 이중 상동성 재조합에 의해 nysA가 결여된 BSG015 안으로 도입하였다. 폴리엔 생성이 브라우타셋 등(Brautaset et al., 2003)에 기재된 것과 같이 트랜스로(in trans) nysA 유전자를 도입하여 복구되기 전에, 정확한 염색체 nysN 돌연변이체를 PCR 및 NheI 절단 뿐만 아니라 서던 블롯을 이용하여 확인하였다. 그 결과 생성된 돌연변이체를 B5로 표시하였다.

돌연변이체 B4의 제조

nysL 불활성화를 위한 유전자 치환 벡터의 제조

리딩 프레임이 보존된(in-frame deletion) nysL 유전자 치환 플라스미드 pNLD1은 볼로칸 등(Volokhan et al., 2006) 등에 기재되어 있고, 이 플라스미드의 4.2kb의 클론된 삽입체는 스트렙토마이세스 노우르세이의 nysN 코딩 영역을 포함한다. nysN-CL346ST 돌연변이체의 백본 내로 nysL 돌연변이를 도입하기 위하여, 이 nysN 돌연변이 뿐만 아니라 이 플라스미드를 변경해야만 한다. 이를 하기와 같이 수행하였다: 플라스미드 pSOK201nysN4.1-CL346ST의 1011bp AgeI/FspaI 단편(Biosergen patent application May 2007을 참조)을 잘라내고, 플라스미드 pNLD1에 대응하는 단편으로 치환하는 데 사용하여 유전자 치환 플라스미드 pNLD2를 얻었다.

유전자 치환

플라스미드 pNLD2를 상기 벡터를 이중 상동성 재조합(double homologous recombination)에 의해 nysA가 결여된 화합물 1 안으로 도입하였다. 폴리엔 생성이 브라우타셋 등(Brautaset et al., 2003)에 기재된 것과 같이 트랜스로(in trans) nysA 유전자를 도입하여 복구되기 전에, 정확한 염색체 nysL 돌연변이체를 PCR 및 NheI 절단 뿐만 아니라 서던 블롯을 이용하여 확인하였다. 그 결과 생성된 돌연변이체를 B4로 표시하였다.

B1 및 B3

NysJ 의 DH15 활성 부위 His966 의 불활성화

목적: nysJ DH15 활성 부위 내로 부위 지정 돌연변이를 도입하여 DH15 도메인에서의 치환 돌연변이 H966F를 만드는 것이다.

방법:

- BclI+SphI으로 pL20X를 절단하고, BamHI/SphI로 절단한 pGEM11-zf 안으로 3.3kb의 단편을 클로닝 = pDH15-A

- EcoRI+HindIII로 pDH15-A를 절단하고, 대응 부위 pGEM3-zf 안으로 3.35kb의 단편을 클로닝 = pDH15-B

- pDH15-B 주형 및 하기의 돌연변이용 올리고뉴클레오티드를 사용하여 부위 지정 돌연변이를 수행.

Mut - DH15 -1 : 5'-CACCCCTGGCTCGCCGAC TTC GTCGTCGGCGGCATGGTC-3'

Mut - DH15 -2 : 5'-GACCATGCCGCCGACGAC GAA GTCGGCGAGCCAGGGGTG-3'

- 돌연변이된 뉴클레오티드를 굵게 표시하였다. 상기 돌연변이는 이 위치에서 본래의 BrtI 부위를 파괴한다.

- BrtI 절단을 이용하여 정확한 돌연변이를 확인하고 DNA 시퀀싱을 한다 = pDH15 - Bmut .

- pDH15-B의 1.6kb의 EcoRI/SacI 단편; pDH15-B로부터 1.1kb의 HindIII/Bg1II 단편-2 및 pDH15-Bmut로부터 SacI/Bg1II 단편-3을 분리하고, 3.1kb의 pSOK201 EcoRI/HindIII 백본과 함께 세개의 모든 단편을 연결; pDH15 -123

- 스트렙토마이세스 노우르세이 안으로 유전자 치환을 진행.

- 정확한 스트렙토마이세스 노우르세이 DH15 돌연변이의 확인.

- 총 DNA의 NotI 절단 후 프로브로서 표지된 pDH15-A의 3.33 삽입체를 사용하여, 서던 블롯에 의해 1차 교차 돌연변이체를 확인할 수 있다. 야생형은 5.2 + 8kb의 신호를 나타낼 수 있는 반면, 정확한 1차 교차 돌연변이체(이론상의 변이체 모두)는 5.2 + 6.4 + 8kb의 신호를 나타낼 것이다.

- 2차 교차 돌연변이체는 하기의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 분석될 수 있다:

o DH15 -F : 5'-CCTTCCTCGAACTCGGCC-3'

o DH15 -R : 5'-GCGTAGATCTCGGTGTCG-3'

- 상기 2차 교차 돌연변이체는 817bp의 생성물일 것이다. 모균주(parent strain)로부터의 PCR 생성물은 BtrI으로 절단할 수 있고, 392bp 및 425bp의 단편을 나타내는 반면, 상기 돌연변이체로부터의 PCR 생성물은 BtrI으로 절단할 수 없다. 게다가, 2차 돌연변이체는 또한 프로브로서 표지된 817bp PCR 생성물을 사용하여 서던 블롯에 의해 확인될 수 있다. 상기의 BtrI으로 절단된 모균주 DNA는 0.95kb + 0.45kb의 혼성화된 단편(hybridizing fragment)을 나타낼 수 있는 반면, 상기 돌연변이체로부터 BtrI-절단된 DNA는 하나의 1.4kb의 혼성화된 단편을 나타낼 수 있다.

돌연변이체 B1의 제조

DH15 돌연변이를 NysA가 결여된 GG5073SP 균주 안으로 도입한 후, 정확한 돌연변이를 트랜스로(in trans) nysA 유전자로 보완하였다.

돌연변이체 B3의 제조

nysN-CL346ST 돌연변이를 nysA가 결여된 B1-S1 유전적 배경(genetic background) 안으로 도입하고, 그 결과 얻은 정확한 돌연변이 균주를 트랜스로(in trans) nysA 유전자로 보완하여 돌연변이체 B3-1S를 얻었다.

파종성 칸디다증의 호중구감소성 마우스 모델에서 암포테리신 B 및 신규한 S44HP 유사체의 생체 내 효능

감염 하루 전 체중의 2 x 100 mg/kg의 시클로포스파미드 모노하이드레이트(cyclophosphamide monohydrate; Fluka, Biochemika, Sigma-Aldrich, Switzerland)를 복강으로 주사하여 호중구를 감소시켰다.

항생제 치료를 시작하기 2시간 전에 호중구감소성 마우스의 측면 꼬리 정맥을 통하여 3 x 10⁵ CFU/mg의 접종원을 주사함으로써, 칸디다 알비칸스의 파종성 감염을 유발시켰다. 칸디다 알비칸스 감염을 제거하는 데 있어서의 항생제의 효능을 치료(하루 한번) 4일 후 신장에서의 진균의 양(fungal load)을 측정함으로써 측정하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다.

암포테리신 B를 2mg/kg의 가장 높은 양으로(MTD 바로 아래) 투여하였다.

화합물 28 및 화합물 29는

1) ca 5-7배 더 낮은 급성 독성을 보이고;

2) 호중구감소성 마우스 모델에서 파종성 칸디다증의 치료에 5-10배 더 나은 효능을 나타내고;

3) 5% 글루코오스(>10mg/ml)에 녹지만, 암포테리신 B의 용해도는 <1mg/ml이므로,

이 결과들은 화합물 28 및 화합물 29가 암포테리신 B보다 매우 낫다는 것을 명확하게 보여준다.

비록 화합물 25 및 화합물 26이 칸디다증의 호중구감소성 마우스 모델에서 암포테리신 B보다 활성이 낮지만, 그것들은 아주 낮은 급성 독성(암포테리신보다 ca 20배 더 낮음)을 나타내므로 여전히 흥미로운 후보물질로서 고려된다.

Claims (32)

1. 일반식
   

   

   
   의 화합물 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염.
2. 제1항에 있어서,
   아세트산(acetic acid), 아스파르트산(aspartic acid), 벤젠술폰산(benzenesulfonic acid), 벤조산(benzoic acid), 바이카르본산(bicarbonic acid), 바이술폰산(bisulfuric acid), 바이타르타르산(bitartaric acid), 부티르산(butyric acid), 칼슘 에데테이트(calcium edetate), 캄시르산(camsylic acid), 탄산(carbonic acid), 클로로벤조산(chlorobenzoic acid), 시트르산(citric acid), 에데트산(edetic acid), 에디실산(edisylic acid), 에스톨산(estolic acid), 에실산(esylic acid), 포름산(formic acid), 푸마르산(fumaric acid), 글루셉틱산(gluceptic acid), 글루콘산(gluconic acid), 글루탐산(glutamic acid), 글리콜릴아르사닐산(glycollylarsanilic acid), 헥산산(hexamic acid), 헥실레조르시논산(hexylresorcinoic acid), 하이드라밤산(hydrabamic acid), 하이드로브롬산(hydrobromic acid), 하이드로클로린산(hydrochloric acid), 하이드로이오딘산(hydroiodic acid), 하이드록시나프토인산(hydroxynaphthoic acid), 이세티온산(isethionic acid), 젖산(lactic acid), 락토바이온산(lactobionic acid), 말레산(maleic acid), 말산(malic acid), 말론산(malonic acid), 만델산(mandelic acid), 메탄술폰산(methanesulfonic acid), 메탄니트르산(methanenitric acid), 메틸 황산(methylsulfuric acid), 무스산(mucic acid), 뮤콘산(muconic acid), 납실산(napsylic acid), 질산(nitric acid), 옥살산(oxalic acid), p-니트로메탄술폰산(p-nitromethanesulfonic acid), 파모인산(pamoic acid), 판토텐산(pantothenic acid), 인산(phosphoric aicd), 인산 일수소산(monohydrogen phosphoric acid), 인산 이수소산(dihydrogen phosphoric acid), 프탈산(phthalic acid), 폴리갈락토우론산(polygalactouronic acid), 프로피온산(propionic acid), 살리실산(salicylic acid), 스테아린산(stearic acid), 석신산(succinic acid), 설파민산(sulfamic acid), 설파닐산(sulfanilic acid), 술폰산(sulfonic acid), 황산(sulfuric acid), 타닌산(tannic acid), 타르타르산(tartaric acid), 테오클린산(teoclic acid) 및 톨루엔술폰산(toluenesulfonic acid)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 생리학적으로 허용가능한 유기산 또는 무기산을 이용하여 형성된 염의 형태인 것을 특징으로 하는 화합물.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   글루탐산 염(glutamate salt)의 형태인 것을 특징으로 하는 화합물.
5. (i) C28 및 C29 사이에 이중 결합을 가지는 나이스타틴 유도체를 만들기 위하여, 폴리케타이드 신타아제(polyketide synthase)의 모듈 5에서 ER 도메인의 불활성화에 의해 나이스타틴 합성에 관련되는 폴리케타이드 신타아제 시스템(polyketide synthase system)을 암호화하는 유전자 클러스터를 변경하는 것;
   (ii) C16에서 변경된 나이스타틴 유도체를 만들기 위하여, P450 모노옥시게나아제를 암호화하는 유전자 nysN의 불활성화에 의해 유전자 클러스터를 부가적으로 변경하는 것; 또는
   (iii) 환원성 알킬화(reductive alkylation)에 의해 C16 위치에서 만들어진 유도체를 변경하는 것
   을 포함하는 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항에 청구된 것과 같은 화합물을 제조하기 위한 방법.
6. 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항에 청구된 것과 같은 화합물, 및 담체, 희석제 또는 첨가제를 포함하는 진균 감염(fungal infections) 치료용 약제학적 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   진균 감염의 치료를 위하여 비-인간 동물에게 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
8. 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   살균제(disinfectants) 또는 방부제(preservatives)로서 사용되는 것을 특징으로 하는 화합물.
9. 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항의 화합물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 비인간 동물에게서 진균 감염을 치료하기 위한 방법.
10. 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항에 청구된 것과 같은 화합물을 포함하는 진균 감염(fungal infections) 치료용 약제학적 조성물.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
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24. 삭제
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28. 삭제
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31. 삭제
32. 삭제

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