ES2323397B1

ES2323397B1 - Macrolidos polienos metilados, procedimiento para su obtencion y sus aplicaciones.

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Publication number: ES2323397B1
Application number: ES200501952A
Authority: ES
Inventors: Francisco Malpartida Romero; Elena Maria Seco Martin
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2005-08-03
Filing date: 2005-08-03
Publication date: 2010-04-23
Anticipated expiration: 2025-08-03
Also published as: ES2323397A1

Abstract

Macrólidos polienos metilados, procedimiento para su obtención y sus aplicaciones.

Procedimiento de obtención de dos nuevos polienos rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib) mediante manipulación genética del cluster implicado en la biosíntesis de los dos antibióticos macrólidos polienos rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb), los cuales presentan propiedades farmacológicas claramente mejoradas respecto a los tetraenos nativos.

La ventaja farmacológica de los polienos metilados de la invención rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib) está basada en una mayor toxicidad selectiva hacia membranas que contienen ergosterol, bien hongos o parásitos, que hacia membranas celulares humanas, lo que reduce notablemente su toxicidad.

Otro objeto adicional de la invención lo constituye el uso de una composición biocida que contiene el compuesto de la invención para el tratamiento de enfermedades infecciosas en el campo sanitario humano y animal, agrario y alimentario.

Description

Campo de la invención

La invención se relaciona con dos polienos metilados, el procedimiento para su obtención, caracterización de actividades biológicas y posibles aplicaciones, por ejemplo terapéuticas, agrícolas y agroalimentarias.

Antecedentes de la invención

El tratamiento de infecciones fúngicas ha cobrado especial interés en los últimos años debido al aumento de pacientes inmunodeprimidos. Sin embargo, la disponibilidad de fármacos en el mercado para combatir infecciones sistémicas causadas por hongos es altamente escasa, siendo dos los grupos de fármacos comúnmente utilizados como agentes terapéuticos: azoles y polienos.

Los antifúngicos del grupo de los azoles (cuya diana es el metabolismo de lípidos de los microorganismos patógenos), aunque son eficaces en la mayoría de las infecciones fúngicas, su utilización, a veces, se ve restringida por la aparición frecuente de patógenos resistentes que invalidan su uso. Por el contrario, en el grupo de los polienos (cuya diana es la integridad funcional de la membrana de los microorganismos patógenos) la aparición de formas resistentes es muy escasa, aunque adolecen de una alta toxicidad debido a interacciones con las membranas de las células de mamíferos sometidas a tratamiento. Los inconvenientes en uno y otro grupo ha motivado que la disponibilidad de agentes antifúngicos es peligrosamente escasa y se hace necesario ampliar el número de estos agentes terapéuticos disponibles.

En términos generales, los polienos son un grupo de macrólidos policetónicos muy interesantes debido a su actividad antifúngica. Contienen un anillo de macrolactona con varios dobles enlaces conjugados, formando cromóforos con un espectro característico en la zona del ultravioleta/visible que es dependiente del número de dobles enlaces conjugados; estas características son las responsables de sus propiedades físicas y químicas (gran absorción de luz, fotolabilidad y escasa solubilidad en agua). A pesar de la importancia de algunos macrólidos poliénicos tales como la anfotericina B como fármacos antifúngicos, su mecanismo de acción preciso no se entiende bien todavía; no obstante, la actividad antifúngica parece deberse a interacciones entre las moléculas de polieno y las membranas que contienen esterol. Esta interacción proporciona un canal de iones y las membranas se hacen permeables causando la destrucción de gradientes electroquímicos y la consecuente muerte celular. Estos compuestos muestran una afinidad significativamente mayor a las membranas que contienen ergosterol (el principal esterol presente en las membranas de hongos y algunos parásitos como Trypanosoma y Leishmania) que a las membranas que contienen colesterol (células de mamíferos). Sin embargo, la interacción entre los polienos y las membranas que contienen colesterol no es insignificante y ello es la causa de efectos secundarios, lo que unido a la baja solubilidad, hace que el compuesto no sea totalmente satisfactorio para tratar infecciones sistémicas fúngicas. A pesar de estas propiedades indeseables y los efectos secundarios tóxicos de la anfotericina B, este antiguo fármaco ha sido empleado durante más de 40 años y sigue siendo el agente antifúngico preferido para tratar la mayoría de las infecciones sistémicas; de hecho, se admite que no hay mejores alternativas disponibles para luchar contra las enfermedades fúngicas emergentes. Algunos de los efectos indeseables pueden minimizarse mediante la liberación del fármaco en una formulación liposomal; ésto reduce la toxicidad de la anfotericina B y ha permitido su aplicación sistémica como antifúngico (micosis) y como antiparasitario (ej., frente a leishmaniasis y trypanosomiasis, entre otras infecciones), organismos cuyas membranas celulares contienen ergosterol (Berman et al., 1992, Antimicrob. Agents Chemother 36:1978-1980; Herwaldt, (1999), The Lancet. 354: 1191-1199; Yardley et al., 1999, Am. J. Trop. Med. Hyg. 61: 163-197).

Por esta razón, el descubrimiento de nuevos fármacos antifúngicos o la mejora de las propiedades farmacológicas de los ya existentes constituye un reto apasionante. Con este objetivo, y empleando aproximaciones racionales de modelos moleculares, se han generado y ensayado varios derivados semi-sintéticos de anfotericina B como fármacos antifúngicos eficaces. Para efectuar las modificaciones estructurales se han considerado, entre otros, dos blancos principales: el grupo carboxílico de la cadena lateral y el grupo amino del azúcar. Aunque algunos de estos derivados semi-sintéticos todavía mostraban la misma toxicidad, otros presentaban características farmacológicas mejoradas comparadas con la molécula de anfotericina B: mayor actividad antifúngica, mayor solubilidad en agua, mayor especificidad por membranas que contienen ergosterol y menor actividad hemolítica, lo que sugería una mayor especificidad por las membranas que contienen ergosterol. Aunque la mayor actividad antifúngica le confiere alguna ventaja a estos compuestos, sorprendentemente estas modificaciones estructurales no están comúnmente representadas dentro de los polienos naturales aislados procedentes de microorganismos. De hecho, todos los polienos descritos hasta la fecha como fármacos mejorados son derivados semi-sintéticos, generados por síntesis orgánica en lugar de por biotranformaciones.

Recientemente se han descrito nuevos polienos amidados sintetizados, de forma natural, por manipulación genética de Streptomyces diastaticus var. 108 (Seco et al., 2005, Chem. Biol. 12: 535-543). Los compuestos [rimocidina B y CE-108B] se caracterizan por una actividad fungicida alta, mayor solubilidad en agua y reducida citotoxicidad. Ambos polienos amidados fueron obtenidos al transformar la cepa silvestre S. diastaticus var. 108 con vectores derivados de SCP2* que portan el gen de resistencia a eritromicina (ermE) (Seco et al., 2005, Chem. Biol. 12:535-543). La tecnología de DNA recombinante y la disponibilidad de los genes biosintéticos de antibióticos permiten abordar manipulaciones genéticas y obtener compuestos naturales que habitualmente no son producidos por los microorganismos parentales. Este planteamiento nos ha llevado a abordar la obtención de nuevos macrólidos polienos por manipulación de genes biosintéticos de los antibióticos rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb) producidos por S. diastaticus var. 108 (Seco et al. 2004, Chem. Biol. 11:357-366).

Compendio de la invención

En esta invención se describe la obtención de dos nuevos polienos rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib) mediante manipulación genética del cluster implicado en la biosíntesis de los dos antibióticos macrólidos polienos rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb) (Seco et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366), los cuales presentan propiedades I farmacológicas claramente mejoradas respecto a los tetraenos nativos.

En base al modelo propuesto para la biosíntesis de los tetraenos nativos rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb) (Seco et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366), en el módulo 7 de la poliquétido sintetasa (PKS) se incorpora metilmalonamil-CoA como unidad de elongación, que es responsable de la presencia de un grupo metilo en el anillo macrocíclico que, posteriormente, mediante una modificación post-PKS específica de sitio se oxidaría para dar lugar al grupo carboxilo libre presente en rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb). Está descrito que una citocromo P450 monooxigenasa esté implicada en esta oxidación, y se encuentra codificada en los clusters biosintéticos de polienos descritos hasta el momento (Aparicio et al., 2003, Appl Microbiol Biotechnol 61: 179-188). En el caso de la biosíntesis de rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb), debido a la similitud de su secuencia y a que sólo se precisa de una única citocromo P450 monooxigenasa en el modelo biosintético, se propuso que RimG fuera la citocromo P450 monooxigenasa implicada en la oxidación del grupo metilo para originar el grupo carboxilo (Seco et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366).

Para la formación del grupo amida presente en los polienos amidados rimocidina B y CE-108B, en un principio, se propusieron dos mecanismos posibles: (a) incorporación de unidades malonamil-CoA durante el ensamblaje de la cadena policetónica en lugar de unidades metilmalonil-CoA propuestas para la formación de rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb) ó (b) actividad amidotransferasa actuando una vez que el grupo metilo lateral del anillo de macrolactona es oxidado a grupo carboxilo.

Esta invención provee la elucidación del mecanismo para la formación del grupo amida de estos polienos amidados para lo cual, una interrupción o deleción del gen rimG con objeto de bloquear la formación del grupo carboxilo fue crucial. Una vez bloqueada la formación del grupo carboxilo, si la formación del grupo amida tiene lugar durante el ensamblaje de la cadena policetónica, al transformar la cepa disruptante con un plásmido inductor de la biosíntesis de los tetraenos amidados (Seco et. al., 2005, Chem. Biol. 12:535-543) éstos deberían detectarse en el caldo de fermentación. En caso negativo, se concluiría que la formación del grupo amida tiene lugar mediante una actividad amidotransferasa sobre el grupo carboxilo libre, una vez que éste se ha formado.

Se eligió la disrupción génica inactivante como alternativa para mutagenizar el gen rimG. No obstante, en estas primeras condiciones, y de forma inesperada la disrupción en el gen rimG realizada tal como se indica más arriba, genera un recombinante incapaz de producir polienos. Esto se interpretó en el sentido de que el promotor utilizado para la disrupción era incapaz de prevenir efectos polares probablemente sobre el gen rimA situado a continuación del punto de inserción. A continuación, una interrupción de este gen rimG en el cromosoma en una cepa donde está presente el plásmido pSM743B (capaz de complementar un efecto polar en el gen rimA situado corriente abajo en el cromosoma, además de inducir la formación de los tetraenos amidados), permitió el aislamiento de un polieno metilado, y más concretamente de dos nuevos polienos metilados a los que se ha dado los nombres de rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib), los cuales presentan una sustitución del grupo carboxilo libre por un grupo metilo como consecuencia de la interrupción del gen rimG. La ausencia de tetraenos amidados en el caldo de fermentación de la cepa resultante (Streptomyces diastaticus var. 108::PM1-768/743B) (nº depósito DSM 17482) permitió concluir que la formación del grupo amida en rimocidina B (IVa) y CE-108B (IVb) tiene lugar mediante una modificación post-PKS específica de sitio una vez que el anillo macrocíclico y el grupo carboxilo lateral libre se han formado, y no durante la elongación de la cadena policetónica, y que se debe a una actividad "de adorno" debida probablemente a una
amidotransferasa.

Por otro lado, ensayos de actividad biológica frente a varias estirpes de hongos (Penicillium chrysogenum, Candida krusei, Aspergillus niger, Candida albicans, Cryptococcus neoformans) y algunos ensayos de toxicidad in vitro mostraron que la modificación química presente en los nuevos compuestos confiere una clara ventaja farmacológica respecto a los polienos nativos de los cuales proceden (Tabla 4, Ejemplo 1).

Por tanto, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un polieno metilado de fórmula (I), en adelante compuesto de la invención, útil como antifúngico y antiparasitario, y como objetos particulares dicho polieno se describe los siguientes polienos metilados identificados más adelante en esta descripción como rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib).

La invención se relaciona, en otro aspecto, con un procedimiento, en adelante procedimiento de producción del compuesto de la invención, para la producción de dichos polienos metilados que comprende cultivar el microorganismo disruptante productor de dichos compuestos bajo condiciones que permitan la producción de dichos polienos metilados, y, si se desea, aislar y purificar dichos compuestos. En concreto, se incluye Streptomyces diastaticus var. 108::PM1-768/743B (número de depósito DSM 17482; microorganismo de la invención), productor de rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib), el cual constituye un aspecto adicional de esta invención así como el empleo de éste o similares microorganismos disruptantes en la obtención de dichos polienos metilados.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de la interrupción de genes implicados en la misma modificación química propuesta para RimG (algunos de los cuales ya han sido descritos) en otros clusters biosintéticos de polienos con objeto de producir los correspondientes derivados metilados.

La ventaja farmacológica de los polienos metilados de la invención rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib) está basada en una mayor toxicidad selectiva hacia membranas que contienen ergosterol, bien hongos o parásitos, que hacia membranas celulares humanas, lo que reduce notablemente su toxicidad. Composiciones biocidas, por ejemplo, composiciones farmacéuticas y/o composiciones antifúngicas para uso sanitario, agrícola o agroalimentario que contengan dichos polienos metilados, constituyen un aspecto adicional de esta invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra, en el panel A, un esquema de la transcripción de los genes en esta región concreta del cromosoma deducido mediante ensayos de protección a endonucleasa Si llevados a cabo con diferentes fragmentos de ADN (Seco et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366). Los transcritos se representan por flechas discontinuas correspondientes al policistrón de los genes rimE, rimF, rimG, rimH y rimA. El fragmento de ADN utilizado para la inserción inactivante de los genes rimG y rimE se indica con una línea gris; los números entre paréntesis se corresponden con los rangos de nucleótidos utilizados para la disrupción de los correspondientes genes (rimE o rimG) de la secuencia de ADN depositada bajo el número de acceso AY442225. En el panel B de esta figura se muestra el cromatograma correspondiente al caldo de fermentación de S. diastaticus var. 108::PM1-768/743B, donde a y b se corresponden con CE-108C (Ib) y rimocidina C (Ia) respectivamente.

Descripción detallada de la invención 1. Nuevos polienos metilados

En un primer aspecto, la invención se relaciona con un nuevo polieno metilado de fórmula (I)

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en donde R es alquilo C_{1}-C_{3}

o un isómero, derivado o solvato del mismo.

Los compuestos de la presente invención representados por la fórmula (I) anteriormente descrita pueden incluir isómeros, dependiendo de la presencia de enlaces múltiples (por ejemplo, Z, E), incluyendo isómeros ópticos o enantiómeros, dependiendo de la presencia de centros quirales. Los isómeros, enantiómeros o diastereoisómeros individuales y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de la presente invención. Los enantiómeros o diastereoisómeros individuales, así como sus mezclas, pueden separarse mediante técnicas convencionales.

Tal como aquí se utiliza, el término "derivado" incluye tanto compuestos farmacéuticamente aceptables, es decir, derivados del compuesto de fórmula (I) que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento, como derivados farmacéuticamente no aceptables ya que éstos pueden ser útiles en la preparación de derivados farmacéuticamente aceptables. La naturaleza del derivado farmacéuticamente aceptable no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable.

Asimismo, dentro del alcance de esta invención se encuentran los profármacos de los compuestos de fórmula (I). El término "profármaco" tal como aquí se utiliza incluye a cualquier compuesto derivado de un compuesto de fórmula (I), por ejemplo, ésteres, incluyendo ésteres de ácidos carboxílicos, ésteres de aminoácidos, ésteres de fosfato, ésteres de sulfonato de sales metálicas, etc., carbamatos, amidas, etc., que, cuando se administra a un individuo es capaz de proporcionar, directa o indirectamente, dicho compuesto de fórmula (I) en dicho individuo. Ventajosamente, dicho derivado es un compuesto que aumenta la biodisponibilidad del compuesto de fórmula (I) cuando se administra a un individuo o que potencia la liberación del compuesto de fórmula (I) en un compartimento biológico. La naturaleza de dicho derivado no es crítica siempre y cuando pueda ser administrado a un individuo y proporcione el compuesto de fórmula (I) en un compartimento biológico de un individuo. La preparación de dicho profármaco puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.

Los compuestos de la invención pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos y se pretende que ambas formas están dentro del alcance de la presente invención. En este sentido, el término "solvato", tal como aquí se utiliza, incluye tanto solvatos farmacéuticamente aceptables, es decir, solvatos del compuesto de fórmula (I) que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento, como solvatos farmacéuticamente no aceptables, los cuales pueden ser útiles en la preparación de solvatos o sales farmacéuticamente aceptables. La naturaleza del solvato farmacéuticamente aceptable no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, el solvato es un hidrato. Los solvatos pueden obtenerse por métodos convencionales de solvatación bien conocidos por los técnicos en la materia.

Para su aplicación en terapia, los compuestos de fórmula (I), sus isómeros, sales, profármacos o solvatos, se encontrarán, preferentemente, en una forma farmacéuticamente aceptable o sustancialmente pura, es decir, que tiene un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable excluyendo los aditivos farmacéuticos normales tales como diluyentes y portadores, y no incluyendo material considerado tóxico a niveles de dosificación normales. Los niveles de pureza para el principio activo son preferiblemente superiores al 50%, más preferiblemente superiores al 70%, más preferiblemente superiores al 90%. En una realización preferida, son superiores al 95% del compuesto de fórmula (I), o de sus sales, solvatos o profármacos.

A menos que se indique lo contrario, los compuestos de la invención también incluyen compuestos que difieren sólo en la presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, compuestos que tienen dicha estructura, a excepción de la sustitución de un hidrógeno por un deuterio o por tritio, o la sustitución de un carbono por un carbono enriquecido en ^{13}C o ^{14}C o un nitrógeno enriquecido en ^{15}N, están dentro del alcance de esta invención.

En una realización particular, dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona del grupo formado por los compuestos identificados en esta descripción como "rimocidina C", de fórmula (Ia), y "CE-108C", de fórmula (Ib).

Los dos nuevos polienos metilados [rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib)] han sido denominados así porque son polienos derivados de los compuestos naturales rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb) en los que el grupo lateral carboxilo está sustituido por un metilo.

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sus isómeros, derivados, profármacos o solvatos.

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En otro aspecto adicional, la invención se relaciona con un procedimiento para la producción de un compuesto de fórmula (I), que comprende las siguientes etapas:

-: cultivo del microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108::PM1-768/743B bajo condiciones que permitan la producción de compuestos de fórmula (I),

-: obtención del caldo de fermentación y, si se desea,

-: el aislamiento y purificación de dichos compuestos de fórmula (I).

En una realización particular, el procedimiento se lleva a cabo para la obtención de los compuestos de fórmula (I) que se seleccionan entre rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas.

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El medio de cultivo de dicho microorganismo recombinante comprende, en general, una o más fuentes de carbono, una o más fuentes de nitrógeno, una o más sales inorgánicas asimilables por el microorganismo, y, si es necesario, uno o más nutrientes orgánicos, tales como vitaminas y aminoácidos, disueltos en un medio acuoso. Dichos medios, al igual que las condiciones apropiadas (aireación/agitación, temperatura y tiempo de fermentación, etapas, etc.), son conocidos por los expertos en la materia. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de los medios y condiciones para crecer dicho microorganismo recombinante se mencionan en el Ejemplo de la invención.

El caldo de fermentación de dichos microorganismos recombinantes Streptomyces diastaticus var. 108::PM1-768/743B o sus equivalentes funcionales comprende un compuesto seleccionado entre un compuesto de fórmula (I), por ejemplo, rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas, y puede utilizarse como tal o bien puede ser tratado posteriormente para separar el compuesto de interés, los cuales pueden aislarse por métodos convencionales. A modo ilustrativo, en una realización particular, el cultivo celular se centrifuga para separar el sobrenadante y el extracto celular y el sobrenadante se utiliza para aislar y, si se desea, purificar, el polieno, amidado o no-amidado, de interés. El estudio de las características físico-químicas de dichos compuestos permite diseñar a un técnico medio un procedimiento para su purificación a partir del sobrenadante.

El microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108::PM1-768/743B, o cualquier otro equivalente funcional forman parte de la presente invención. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108::PM1-768/743B o equivalentes funcionales útiles para llevar a cabo el procedimiento de obtención de los compuestos de fórmula (I) y proporcionar un cultivo de estos microorganismos. Una realización particular de la invención lo constituye el microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108::PM1-768/743B (número de depósito: DSM 17482) productor de los polienos metilados rimocidina C y CE-108C.

Tal como se utiliza en la presente invención el término "equivalente funcional" se refiere a un elemento -ya sea un microorganismo, vector, construcción genética, o fragmento de un gen, procedimiento de disrupción de un gen, de transformación genética de una célula o microorganismo, según el caso- que puede ser desarrollado por un técnico medio en la materia con las distintas alternativas existentes y que posee características idénticas u homólogas al elemento original referido.

Así, en este contexto y a título ilustrativo, por "equivalente/s funcional/es" se entienden aquellos microorganismos recombinantes que pueden ser obtenidos bien por deleción cromosómica del gen rimG, en lugar de inserción inactivante o con cualquier otra técnica; dicha deleción puede ser fácilmente realizada mediante el empleo de vectores convencionales bien plásmidos no replicativos o siendo replicativos con origen de replicación termosensible. Estas deleciones o inserciones pueden ser realizadas por un técnico con cierta experiencia en el campo.

Asimismo, la invención se relaciona con el empleo de los microorganismos Streptomyces diastaticus var. 108::PM1-768/743B o sus equivalentes funcionales para la obtención de un compuesto de fórmula (I). En una realización particular, el compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas.

Para determinadas aplicaciones el caldo de fermentación así obtenido con el procedimiento de la invención puede ser utilizado directamente para la elaboración de determinadas soluciones biocidas, sin necesidad de purificar los compuestos de la presente invención. Así, el caldo de fermentación de los microorganismos Streptomyces diastaticus var. 108::PM1-768/743B o sus equivalentes funcionales indicados más arriba, que comprende un compuesto de fórmula (I), puede ser potencialmente útil como biocida y constituye un aspecto adicional de esta invención.

La presente invención se relaciona con un procedimiento de obtención de la cepa de la invención productora de polienos metilados S. diastaticus var. 108::PM1-768/743B o sus equivalentes en el que la cepa resultante está exclusivamente afectada en la expresión del gen rimG y porque comprende las siguientes etapas:

a): Obtención de un mutante en el gen rimG del microorganismo S. diastaticus var. 108 o de sus equivalentes funcionales mediante la disrupción o deleción de dicho gen, incapaz de producir polienos, y

b): su posterior transformación con un vector, preferentemente un plásmido, capaz de complementar la disrupción del gen rimA en el cromosoma en dicho mutante.

De una forma más concreta, la invención se relaciona con un procedimiento de obtención del microorganismo de la invención en el que el mutante del paso a) se obtiene mediante el uso del fago recombinante PM1-768 ó cualquier otro sistema inactivante que funcionalmente sea equivalente para generar disrupción ó delección del gen rimG de la cepa S. diastaticus var. 108 y en el que el paso b) se realiza con el plásmido pSM743B (o vector funcionalmente equivalente como se indica más arriba) para complementar el posible efecto polar del gen rimA en el cromosoma del recombinante.

Además de la realización concreta anterior, la invención se relaciona, en otro aspecto, con la interrupción del gen rimG en el cromosoma de Streptomyces diastaticus var. 108 por cualquier método convencional y utilizando cualquier vector apropiado. Dicha interrupción podrá llevarse a cabo utilizando un promotor fuerte para evitar un efecto polar como pudiera ser el promotor ermE_{p}* (Kieser et al. (2000) Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, UK), que será responsable de la producción de los polienos metilados rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib) directamente en la cepa disruptante; o bien, complementando el efecto polar sobre el gen rimA mediante la expresión de dicho gen rimA bajo el control de un promotor exógeno utilizando cualquier vector como herramienta.

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2. Utilidades de los nuevos polienos metilados

Como parte de la invención ha sido caracterizada la estructura química de los polienos metilados de la invención mediante diversas técnicas al igual que su actividad biológica (por ejemplo, espectrometría, RMN, antibiogramas, actividad hemolítica, etc). La sustitución del grupo carboxilo libre, presente en el anillo de macrolactona de la rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb), por un grupo metilo determina una mayor especificidad hacia membranas con ergosterol (tales como, la de hongos y, otros organismos como los parásitos Trypanosoma y Leishmania) que hacia membranas con colesterol (presente en las células animales). Esta modificación química incrementa la toxicidad selectiva de estos polienos hacia hongos lo que constituye una clara ventaja de cara a su aplicación clínica. Los ensayos de actividad fungicida de estos polienos metilados revelaron que la sustitución del grupo carboxilo libre por un grupo metilo en rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib) no conduce a ningún cambio significativo en la actividad fungicida respecto a los polienos nativos rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb) (datos no mostrados). Sin embargo, los ensayos de toxicidad frente a células animales (eritrocitos) (Tabla 4) revelan una menor toxicidad hacia células humanas para los metilados rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib) respecto a los parentales rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb) que se ha estimado en alrededor de 2.5 a 5 veces inferior. Ambos ensayos (actividades fungicidas y toxicidad frente a células humanas) permiten concluir una mayor toxicidad selectiva hacia los hongos de polienos metilados respecto a los tetraenos parentales rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb). Semejante especificidad es aplicable a otros organismos con ergosterol en sus membranas, tales como los parásitos Leishmania y Trypanosoma, por lo que pueden ser utilizados como medicamentos antifúngicos/antiparasitarios para el tratamiento de infecciones sistémicas.

Los compuestos de fórmula (I) tienen, en general, actividad biocida, y, en particular, actividad biocida frente a organismos que poseen una membrana celular que contiene ergosterol, por lo que son potencialmente útiles como biocidas. Tal como se utiliza en esta descripción, un "biocida" es una sustancia química que detiene el crecimiento o mata a distintos tipos de seres vivos.

Asimismo, la expresión "organismos que poseen una membrana celular que contiene ergosterol" incluye a cualquier organismo provisto de una membrana celular que contiene ergosterol, por ejemplo, hongos, parásitos, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de dichos organismos incluyen los parásitos de los géneros Trypanosoma y Leishmania; así como hongos tales como Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea (fitopatógenos), Candida albicans, Candida krusei, Aspergillus niger, Cryptococcus neoformans (patógenos humanos), entre otros.

Por tanto, dichos compuestos de fórmula (I), en particular, los compuestos rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib) son potencialmente útiles como biocidas frente a dichos organismos que poseen una membrana celular que contiene ergosterol. En una realización particular, dichos compuestos son más útiles como agentes antiparasitarios o como agentes antifúngicos que los correspondientes polienos carboxilados. El término "antifúngico" incluye tanto fungicidas como fungistáticos.

En consecuencia, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición biocida que comprende un compuesto de fórmula (I), junto con un vehículo inerte. En una realización particular, dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona del grupo formado por rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas. Dicha composición biocida es particularmente útil frente a organismos que poseen membranas celulares que contienen ergosterol, aunque no limitado a ellos. En una realización particular, dicha composición biocida es una composición antifúngica que comprende un compuesto de fórmula (I), tal como un compuesto seleccionado entre los compuestos rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas, junto con, opcionalmente, uno o más vehículos inertes.

Tal como se utiliza en esta descripción, el término "inerte" significa que dicho vehículo no tiene una actividad biocida significativa.

Si se desea, dicha composición biocida puede contener, además, otros biocidas, naturales, recombinantes o sintéticos, que, eventualmente, potencien la acción biocida de dicho compuesto de fórmula (I), por ejemplo, de los compuestos rimocidina C (Ia) y/o CE-108C (Ib) o bien que incrementen su espectro de acción.

2.1 Aplicaciones terapéuticas

Un campo importante donde encuentra aplicación los compuestos de fórmula (I), en particular, los compuestos rimocidina C (Ia) y/o CE-108C, es en Sanidad humana y animal. Por tanto, en una realización particular, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I), junto con, opcionalmente, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre los compuestos rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye adyuvantes, sólidos o líquidos, disolventes, tensioactivos, etc.

Si se desea, dicha composición farmacéutica puede contener, además, uno o más agentes terapéuticos que, eventualmente, potencien la acción terapéutica de dicho compuesto de fórmula (I), por ejemplo, de los compuestos rimocidina C (Ia) y/o CE-108C (Ib), o bien que incrementen su espectro de acción.

Dicha composición farmacéutica puede ser utilizada para prevenir y/o tratar infecciones causadas por organismos patógenos de humanos o animales que poseen membranas celulares que contienen ergosterol, por ejemplo, parásitos y hongos patógenos de humanos o animales.

Por tanto, en una realización concreta, dicha composición farmacéutica es una composición antiparasitaria y puede ser utilizada en la prevención y/o el tratamiento de infecciones causadas por parásitos cuyas membranas celulares contienen ergosterol, aunque no limitados a ellos, por ejemplo, Trypanosoma, Leishmania, etc. Si se desea, dicha composición antiparasitaria puede contener, además, uno o más agentes antiparasitarios que, eventualmente, potencien la acción terapéutica de dicho compuesto de fórmula (I), por ejemplo, de los compuestos rimocidina C (Ia) y/o CE-108C (Ib), o bien que incrementen su espectro de acción.

En otra realización concreta, dicha composición farmacéutica es una composición antifúngica y puede ser utilizada en la prevención y/o el tratamiento de infecciones causadas por hongos (cuyas membranas celulares contienen ergosterol). Si se desea, dicha composición antifúngica puede contener, además, uno o más agentes antifúngicos que, eventualmente, potencien la acción antifúngica de dicho compuesto de fórmula (I), por ejemplo, rimocidina C (Ia) y/o CE-108C (Ib), o bien que incrementen su espectro de acción. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos agentes antifúngicos incluyen polienos, tales como. anfotericina B, nistatina, AB-400 (IIIb), alilaminas (ej., terbinafina, naftifina, etc.), amorolfia, tolnaftalato, etc.; azoles, tales como clotrimazol, miconazol, ketoconazol, fluconazol, itraconazol, etc.; benzofuranos, por ejemplo, griseofulvina, etc.; pirimidinas, por ejemplo, fluocitosina, etc.

El compuesto de fórmula (I) estará presente en la composición farmacéutica en una cantidad terapéuticamente eficaz, es decir, en una cantidad apropiada para ejercer su efecto terapéutico. En una realización particular, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención, contiene entre 0,01% y 99,99% en peso de un compuesto de fórmula (I), tal como un compuesto seleccionado entre los compuestos rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas, y puede presentarse en cualquier forma farmacéutica de administración apropiada en función de la vía de administración elegida, por ejemplo, oral, parenteral o tópica. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de sus procedimientos de preparación puede encontrarse, por ejemplo, en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, 1ª. edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.

Por tanto, la invención también se relaciona con el empleo de un compuesto de fórmula (I) en la elaboración de un medicamento útil para la prevención y/o el tratamiento de la infección causada por organismos patógenos de humanos o animales cuyas membranas celulares contienen ergosterol, por ejemplo, parásitos de humanos o animales o bien hongos patógenos de humanos o animales. En una realización particular, dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas.

Asimismo, en otro aspecto, la invención también proporciona un método para prevenir y/o tratar infecciones causadas por organismos patógenos de humanos o animales cuyas membranas celulares contienen ergosterol, por ejemplo, parásitos de humanos o animales o bien hongos patógenos de humanos o animales, que comprende la etapa de administrar a un animal o a un ser humano, en necesidad de tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica proporcionada por esta invención.

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2.2 Aplicaciones agrícolas

Otro sector importante en el que encuentran aplicación los compuestos de fórmula (I), en particular, los compuestos rimocidina C (Ia) y/o CE-108C (Ib), es en el sector agrícola. En este sentido, la invención proporciona una composición antifúngica útil para controlar la infección causada por hongos fitopatógenos (tales como Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia meloni, Ustilago maydis, entre otros) cuyas membranas celulares contienen ergosterol, que comprende un compuesto de fórmula (I), tal como un compuesto seleccionado entre los compuestos rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas, junto con, opcionalmente, uno o más vehículos inertes agrícolamente aceptables. La aplicación se extiende a tratamiento, fundamentalmente preventivo, para evitar o controlar infecciones fúngicas en condiciones de almacenamiento de productos agroalimentarios (infecciones post-cosecha), causadas por diversos hongos cuyas membranas contienen ergosterol.

Tal como aquí se utiliza, el término "controlar" incluye la inhibición, reducción o paralización de la germinación de las esporas y/o del crecimiento del micelio de hongos que puede resultar en la eliminación de dichos hongos o en la disminución de los daños causados por éstos.

La expresión "vehículo inerte agrícolamente aceptable" tal como aquí se utiliza se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector agrícola, utilizadas para vehiculizar compuestos de interés, e incluye adyuvantes, sólidos o líquidos, diluyentes, disolventes, tensioactivos, etc.

En una realización particular, dicha composición antifúngica comprende, además de dicho compuesto de fórmula (I), por ejemplo, un compuesto seleccionado entre rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas, uno o más compuestos con actividad antifúngica, por ejemplo, uno o más compuestos que alteran la membrana celular de los hongos, o uno o más compuestos que inhiben la síntesis de ergosterol, tales como los compuestos mencionados previamente, o bien uno o más compuestos con actividades enzimáticas requeridas para la modificación o degradación de paredes celulares, por ejemplo, una o más enzimas líticas capaces de modificar o degradar paredes celulares de hongos, tales como enzimas con actividad celulolítica, mananolitica, quitinolítica o proteolítica (ej., celulasas, \alpha-(1,3)-glucanasas, \beta-(1,6)-glucanasas, \beta-(1,3)-glucanasas, mananasas, endo- o exo-quitinasas, quitosanasas, proteasas, \alpha- o \beta-manosidasas, etc.

El compuesto de fórmula (I) estará presente en dicha composición antifúngica en una cantidad antifúngica eficaz, es decir, en una cantidad apropiada para controlar la infección causada por hongos fitopatógenos. En una realización particular, la composición antifúngica útil para controlar hongos fitopatógenos proporcionada por esta invención, contiene entre 0,01% y 100% en peso de dicho compuesto de fórmula (I), por ejemplo, de dichos compuestos rimocidina C (Ia) y/o CE-108C (Ib). Dicha composición puede prepararse por métodos convencionales y puede presentarse en forma líquida o sólida, por ejemplo, en forma de un granulado. Adicionalmente, dicha composición puede contener aditivos, por ejemplo, conservantes y estabilizantes que prolonguen la conservación y estabilidad de la misma.

Dicha composición antifúngica puede ser usada, por ejemplo, para controlar infecciones causadas por hongos fitopatógenos en plantas y/o en frutos. Por tanto, la invención proporciona un método para controlar la infección causada por un hongo fitopatógeno en una planta, en particular, un hongo fitopatógeno cuya membrana celular contiene ergosterol, que comprende aplicar a dicha planta, o al medio que la rodea, dicha composición para controlar dicho hongo fitopatógeno. En una realización particular, dicho método comprende la aplicación de dicha composición, en una cantidad adecuada, sobre las partes aéreas de la planta con el fin de prevenir y/o tratar una infección fúngica causada por un hongo fitopatógeno.

La invención también proporciona un método para controlar la infección causada por hongos fitopatógenos en un fruto, en particular, un hongo fitopatógeno cuya membrana celular contiene ergosterol, que comprende aplicar a dicho fruto dicha composición para controlar hongos fitopatógenos. En una realización particular de dicho método, la aplicación de dicha composición, en una cantidad eficaz, sobre el fruto se realiza antes de la recogida del mismo (pre-cosecha) mientras que en otra realización alternativa la aplicación de la composición se efectúa sobre el fruto ya recogido (post-cosecha).

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2.3 Aplicaciones agroalimentarias

Los compuestos de fórmula (I), en particular rimocidina C (Ia) y/o CE-108C (Ib), tienen también aplicación en el sector agroalimentario. En este sentido, la invención proporciona una composición antifúngica útil para el control de hongos que eventualmente puedan desarrollarse sobre preparados alimentarios, por ejemplo, sobre la superficie de preparados alimentarios, tales como derivados lácteos, por ejemplo, quesos, etc., que comprende un compuesto de fórmula (I), tal como un compuesto seleccionado entre los compuestos rimocidina C (Ia), CE- 108C (Ib) y sus mezclas, junto con, opcionalmente, uno o más vehículos inertes aceptables desde el punto de vista agroalimentario, tales como suspensiones liposómicas, en agua, etc., entre otras.

El término "control" incluye la inhibición, reducción o paralización de la germinación de esporas y/o el crecimiento del micelio de hongos que puede resultar en una notable disminución de los daños causados por éstos; de este modo se puede prevenir o tratar el expolio de alimentos causado por el crecimiento de hongos.

El término "vehículo inerte aceptable desde el punto de vista agroalimentario" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector agroalimentario, utilizadas para vehiculizar compuestos de interés, e incluye adyuvantes, sólidos o líquidos, diluyentes, disolventes, tensioactivos, etc.

En una realización particular, dicha composición antifúngica comprende, además de dicho compuesto de fórmula (I), por ejemplo, un compuesto seleccionado entre rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas, uno o más compuestos con actividad antifúngica, por ejemplo, uno o más compuestos que alteran la membrana celular de los hongos, o uno o más compuestos que inhiben la síntesis de ergosterol, tales como los compuestos mencionados previamente, o bien uno o más compuestos con actividades enzimáticas requeridas para la modificación o degradación de paredes celulares, por ejemplo, una o más enzimas líticas capaces de modificar o degradar paredes celulares de hongos, tales como enzimas con actividad celulolítica, mananolítica, quitinolítica o proteolítica (ej., celulasas, \alpha-(1,3)-glucanasas, \beta-(1,6)-glucanasas, \beta-(1,3)-glucanasas, mananasas, endo- o exo- quitinasas, quitosanasas, proteasas, \alpha- o \beta-manosidasas, etc.

El compuesto de fórmula (I) estará presente en dicha composición antifúngica en una cantidad antifúngica eficaz, es decir, en una cantidad apropiada para controlar la infección causada por hongos susceptibles de desarrollarse sobre preparados alimentarios. En una realización particular, dicha composición antifúngica útil para controlar hongos capaces de desarrollarse sobre preparados alimentarios proporcionada por esta invención, contiene entre 0,01% y 100% en peso de dicho compuesto de fórmula (I), por ejemplo, de dichos compuestos rimocidina C (Ia) y/o CE-108C (Ib). Dicha composición puede prepararse por métodos convencionales y puede presentarse en forma líquida o sólida, por ejemplo, en forma de un granulado. Adicionalmente, dicha composición puede contener aditivos, por ejemplo, conservantes y estabilizantes que prolonguen la conservación y estabilidad de la misma.

Dicha composición antifúngica puede ser usada para controlar infecciones causadas por hongos susceptibles de desarrollarse en preparados alimentarios, por ejemplo, sobre la superficie de preparados alimentarios. Por tanto, la invención también proporciona un método para controlar la infección causada por un hongo capaz de desarrollarse en un preparado alimentario, en particular, un hongo susceptible de desarrollarse en un preparado alimentario cuya membrana celular contiene ergosterol, que comprende aplicar a dicho preparado alimentario, o al medio que la rodea, dicha composición antifúngica para controlar dicho hongo capaz de desarrollarse en un preparado alimentario. En una realización particular, dicho método comprende la aplicación de dicha composición, en una cantidad adecuada, sobre la superficie del preparado alimentario con el fin de prevenir y/o tratar el expolio de alimentos debido al crecimiento fúngico. Dicha composición antifúngica se aplica externamente sobre la superficie del preparado alimentario.

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Ejemplos de realización Ejemplo 1 Producción y caracterización de rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib) I. Procedimientos experimentales Procedimientos genéticos

La cepa E. coli JM101 se creció y transformó usando protocolos descritos previamente (Maniatis et. al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, N.Y). Las cepas de Streptomyces se manipularon tal como se ha descrito previamente (Kieser T. et al., 2000, citado supra). La conjugación intraespecífica se llevó a cabo como se ha descrito previamente (Seco E.M. et al., 2005, citado supra). Las manipulaciones de ADN se llevaron a cabo como ha sido descrito previamente por Maniatis et al. , 1982 (citado supra).

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Ensayos para la producción de tetraenos

La producción de tetraenos se analizó tal como se ha descrito previamente (Seco E.M. et al., 2004, citado supra). Los análisis por HPLC se llevaron a cabo en las mismas condiciones descritas previamente (Pérez-Zúñiga F.J., et al., 2004, citado supra).

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Ensayos de HPLC-MS

Los espectros de masas se determinaron en un equipo 1100MSD HPLC conectado a un detector cuadrupolo Agilent Technology, usando electrospray como fuente y un modo de ionización positiva. Las condiciones cromatográficas fueron las mismas que las descritas previamente (Pérez-Zúñiga F.J., et al., 2004, citado supra).

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Análisis de RMN

Los espectros de RMN fueron medidos en un espectrómetro Varian Inova 600 (5999.740 MHz). Los espectros de masa ESI fueron grabados en un equipo Finnigan LCQ con bomba cuaternaria Rheos 4000 (Flux Instrument). Los espectros de masas HR ESI fueron medidos en un espectrómetro Bruker FTICR 4.7 T.

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Purificación de los polienos metilados

Streptomyces diastaticus var. 108::PM1-768/743B se cultivó en medio SYM2 sólido (Pérez-Zúñiga F.J., et al., 2004, citado supra) suplementado con tiostreptona (50 \mug/ml) y eritromicina (25 \mug/ml) para la correcta selección de la inserción del fago PM1-768 en el cromosoma y la presencia de plásmido pSM743B, respectivamente. Después de 6 días, el medio sólido completo donde se cultivaron los microorganismos, fue fragmentado y procesado tal y como se describió previamente (Seco E.M. et al., 2005, citado supra). CE-108C (Ib) y rimocidina C (Ia) fueron purificados por HPLC usando una columna semipreparativa (Supelcosil PLC-8, 250 x 21.2 mm); el gradiente aplicado fue similar al descrito previamente para fraccionamiento analítico (Seco E.M. et al., 2005, citado supra) y controlado por un controlador de gradiente automático (Waters Automated Gradient). Las fracciones que llevaban los polienos puros se juntaron, se sometieron a una etapa de desalinización usando cartuchos Sep-Pak (Waters) y, finalmente, se liofilizaron dos veces. Este método puede ser utilizado para purificar cualquier polieno metilado a partir del cultivo del correspondiente microorganismo genéticamente modificado.

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Ensayos de actividad hemolítica

Los ensayos se llevaron a cabo sobre sangre humana enriquecida en eritrocitos tal como se ha descrito previamente (Seco E.M. et al., 2005, citado supra).

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II. Resultados

Los compuestos de fórmula (I), en particular, los compuestos rimocidina C (Ia) y/o CE-108C (Ib) están presentes en el caldo de fermentación del microorganismo identificado en esta descripción como Streptomyces diastaticus var. 108::PM1-768/743B, obtenido por disrupción del gen rimG mediante recombinación homóloga con el fago recombinante PM1-768 (ver Tabla 1) y por la transferencia del plásmido pSM743B por conjugación desde la cepa Streptomyces diastaticus var. 108/743B (Seco et al., 2005, Chem. Biol. 12:535-543) tal y como se recoge en la Tabla 1. Esta cepa fue depositada en Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH (DSMS), Braunschweig, Alemania, con el número de acceso DSM 17482. Tanto el fragmento para generar la disrupción del gen rimG, como el fragmento conteniendo el gen rimA completo para evitar efectos polares pueden ser obtenidos fácilmente por personas con cierta habilidad en el campo, mediante técnicas convencionales de amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN). Para las correspondientes amplificaciones puede ser utilizada la cepa depositada en Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH (DSMS), Braunschweig, Alemania (número de acceso DSM 17187), correspondiente al microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108/784, cepa silvestre S. diastaticus var. 108 a la que se ha introducido el plásmido pSM784. Los correspondientes vectores pueden ser introducidos por técnicas convencionales (transformación, transfección, conjugación, etc.) en la cepa DSM 17187 indicada más arriba.

En esta invención, se generó un mutante por disrupción en el gen rimG utilizando como vector el actinofago PM1 (Malpartida et. al., 1986, citado supra). Para evitar posibles efectos polares sobre genes situados corriente abajo del rimG (ver Figura 1), un fragmento de 0.6 kpb SacII interno a rimG (coordenadas 8267-8847 de la secuencia depositada en GeneBank AY442225) se clonó a continuación del fragmento conteniendo el promotor del gen ermE_{p} y el conjunto en el fago PM1. El actinofago recombinante PM1-768 se utilizó para infectar esporas de S. diastaticus var. 108 dando lugar a lisógenos S. diastaticus var. 108::PM1-768. Estos lisógenos no produjeron ningún polieno, lo que sugirió una menor expresión del promotor ermE_{p} respecto al promotor nativo. Intentos de interrumpir el gen rimG utilizando un promotor más fuerte como el ermE_{p}* (Kieser et. al., 2000, citado supra) no han sido satisfactorios. Dos son los genes situados por debajo del punto de inserción: rimH y rimA. Dado que rimH codifica una ferredoxina cuyo papel se ha propuesto que sea el de mediar el transporte electrónico requerido por RimG (Seco et. al., 2004, citado supra), es razonable pensar que una apropiada expresión del gen rimA sería probablemente el parámetro crítico para restaurar la producción de polienos. Por ello, el plásmido pSM743B, capaz de complementar la disrupción de rimA e inducir la formación de los polienos amidados (Seco et al. 2005, citado supra), se transfirió por conjugación intraespecífica desde la cepa silvestre S. diastaticus var. 108/743B al lisógeno S. diastaticus var. 108::PM1-768, siendo S. diastaticus var. 108::PM1-768/743B el recombinante resultante.

Streptomyces diastaticus var. 108 y sus derivados fueron cultivados en medio SYM2 (Atlas R.M., Microbiological Media. CRC Press, 1993, Boca Ratón, Florida). Streptomyces lividans TK21 fue utilizado para la propagación de fagos y como cepa hospedadora, y se creció en un medio sólido R5 y en medio líquido YEME tal como se describe en manuales del campo (Kieser T., et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics, Norwich).

La cepa E. coli JM101 fue crecida en medio Luria-Bertani (LB) o en caldo LB según se describe en la literatura especializada (Maniatis T. et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Penicillium chrysogenum ATCC10003 fue utilizado para ensayar la actividad antifúngica y se creció en medio MPDA (composición: 2% de extracto de malta, 2% de glucosa, 0,1% de Bactopeptona).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Cepas bacterianas y vectores utilizados en la invención

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Los caldos de fermentación se analizaron para la producción de polienos. Dos compuestos mayoritarios fueron detectados en los caldos fermentativos; los análisis por HPLC y espectros de masas determinaron que éstas eran de 709 y 737 unidades de masa (30 unidades menos que las de CE-108 (IIb) y rimocidina (IIa) respectivamente). Los datos sugerían que se trataba de tetraenos derivados de CE-108 (IIb) y rimocidina (IIa) donde el carboxilo lateral del anillo macrolactona había sido sustituido por un grupo metilo como consecuencia de la disrupción de rimG. Los compuestos se han llamado rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib).

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Elucidación de las estructuras químicas de rimocidina C (Ia) (Tabla 2) y CE-108C (Ib) (Tabla 3)

Con objeto de elucidar las estructuras químicas de los nuevos tetraenos rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib), ambos fueron purificados desde el caldo de fermentación de S. diastaticus var. 108::PM1-768/743B usando una columna de sílice C8 de fase reversa (ver Procedimientos Experimentales).

El compuesto rimocidina C (Ia) se obtuvo como un polvo amarillo, el cual manifestó la existencia de iones pseudo-moleculares a m/z 738 ([M+H]) y 760 [(M+Na^{+}]), que corresponde a la fórmula molecular C_{39}H_{63}NO_{12} mediante alta resolución (encontrado 738,442217, calculado 738,442300 para [M+H]). Comparado con rimocidina (IIa) (C_{39}H_{61}NO_{14}), este compuesto se corresponde con la pérdida de dos átomos de oxígeno y la adicción de dos protones en rimocidina C (Ia), que formalmente puede ser interpretado como una sustitución del grupo carboxilo en el carbono C-14 por un residuo metilo.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Datos de ^{1}H RMN (600 MHz) y ^{13}C RMN- (150.8 MHz) de Rimocidina C (Ia) en [D_{4}]-Metanol

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El espectro de ^{1}H-RMN fue muy similar al de rimocidina (IIa) y mostró tres señales en el rango de sp^{2}, un doblete de doblete (dd) a \delta 6.30, un multiplete a \delta 6.05-6.18, y un segundo dd a \delta 5.90 (Tabla 2). Los protones del azúcar aparecieron en el rango de \delta 3.25-4.62. La región alifática del espectro ^{1}H-RMN exhibió también similitudes con la de rimocidina (IIa), especialmente con respecto a cinco patrones multiplete complejos en el rango de \delta 1.30-2.50. Cuatro grupos metilo en lugar de tres como en rimocidina (IIa) aparecieron como dos tripletes y dos dobletes a \delta 0.90, 0.95, y 1.26, 1.00, respectivamente. La mayor diferencia entre rimocidina (IIa) y rimocidina C (Ia) fue la presencia del doblete metilo a \delta 1.00, el cual mostró una señal H,H cross en el espectro COSY con el 14-H a \delta 1.22 (\delta_{c} 43.8).

El espectro de resonancia magnética ^{13}C-RMN indicó 39 señales de carbono como en rimocidina (IIa), tal como exige la fórmula molecular. Ésta y las similitudes de los espectros de protones permitieron concluir que rimocidina (IIa) y rimocidina C (Ia) poseen el mismo esqueleto de carbono incluyendo el azúcar micosamina, siendo la única diferencia la presencia de sólo dos grupos carbonilo en lugar de tres como en rimocidina (IIa). Las señales a \delta 211.6 y 174.5 fueron atribuidas a un grupo cetona y un carbonilo lactona, respectivamente. El acoplamiento HMBC ^{3}J del protón a \delta 5.03 (C-27) al carbonilo a 174.5 confirmaron la lactona, así que rimocidina C (Ia) debe ser 14-decarboxi-14-metil-rimocidina (Ia).

El polvo amarillo de CE-108C fue fácilmente solubilizado en metanol. En este caso también, el espectro de ^{1}H-RMN exhibió similitudes con los de rimocidina C (Ia) y CE-108 (IIb) (Tabla 3; valores desde ref. 13) principalmente en la región aromática y del azúcar. La región alifática exhibió las señales de cuatro grupos metilo así como tres dobletes a \delta 1.25, 1.23, 0.99 y un triplete a 0.90, en lugar de las tres señales metilo como en CE-108 (IIb). El espectro de masas (+)-ESI NS determinó el peso molecular de CE-108C como m/z 709, que corresponde a la fórmula molecular C_{37}H_{59}NO_{12} mediante alta resolución (encontrado 710.410905, calculado 710,411000 para [M+H]^{+}). El espectro de resonancia magnética ^{13}C-RMN confirmó la presencia de 37 señales de carbono como en CE-108 (IIb), tal como exige la fórmula molecular. La comparación con el espectro de resonancia magnética ^{13}C-RMN de CE-108 (Seco E.M., et al, 2005, Chem. Biol. 12: 535-543) reveló la presencia de sólo dos señales carbonilo a \delta 211.3 y 174.3 atribuidas de nuevo a un grupo cetona y un carbonilo lactona. La mayor diferencia en este caso fue la ausencia de ácido carboxílico, el cual apareció a \delta 179.3 en CE-108 (IIb), y la presencia de una señal metilo adicional a 13.7 en CE-108C perteneciente al doblete metilo a \delta 0.99 en el espectro de ^{1}H-RMN. Una comparación cuidadosa de los datos de CE-108 (IIb) y CE-108C (Ib) (Tabla 3) indicó claramente que también en este tetraeno, el grupo carboxilo del C-14 de CE-108 (IIb) fue reemplazado por un grupo metilo, lo que identifica CE-108C (Ib) como el derivado 14-decarboxi-metil-CE-108.

TABLA 3 Datos de ^{1}H y ^{13}C RMN de CE-108 (polieno parental) y CE-108C (Ib) en [D_{4}]-Methanol. La intensidad de señal, multiplicidad y constantes de acoplamiento se dan entre paréntesis

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^{a} Las señales se solapan parcialmente por el solvente; * asignadas tentativamente.

Actividades biológicas de los nuevos tetraenos

La actividad antifúngica de los nuevos tetraenos no carboxilados rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib) fue medida frente a Penicillium chrysogenum, Candida albicans, Aspergillus niger, Candida krusei y Criptococcus neoformans comparada con la de los tetraenos nativos rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb). Las actividades antifúngicas de los dos intermediarios, rimocidina C (Ia) y CE-108 (Ib), medidas conforme a Seco et al.,2005, Chem. Biol 12:535-543, no fueron significativamente diferentes de las de los productos finales rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb).

Para medir si otras propiedades farmacológicas de los nuevos tetraenos eran diferentes, ensayos de actividad hemolítica fueron llevados a cabo y comparados con los compuestos parentales. Eritrocitos humanos fueron usados para esos ensayos. Los resultados de los ensayos de actividad hemolítica de rimocidina, rimocidina C y CE-108 se muestran en la Tabla 4. Los resultados de los ensayos de actividad hemolítica de CE-108C no se muestran en la Tabla 4 al no haberse alcanzado el 100% de actividad hemolítica con la máxima cantidad de compuesto empleada (600 nmoles), debido a la baja toxicidad mostrada por el tetraeno. Es de destacar que aunque las actividades antifúngicas de rimocidina (IIa) y rimocidina C (Ia) fueron similares, sus toxicidades (medidas en términos de actividad hemolítica) fueron 2.5-5 veces más bajas para rimocidina C (Ia) que para rimocidina (IIa). Cantidades crecientes hasta alcanzar los 600 nmoles de CE-108C (Ib) fueron usadas para los ensayos hemolíticos; la hemólisis detectada fue inferior al 20%, sugiriendo una menor toxicidad del tetraeno no carboxilado CE-108C (Ib) que para cualquiera de los restantes tetraenos. Esto sugiere una interesante mejora en las propiedades farmacológicas.

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TABLA 4 Actividad hemolítica comparativa de rimocidina (IIa), rimocidina C (Ia) y CE-108 (IIb)

Las cantidades aplicadas para cada tetraeno se expresan en nanomoles (columna izquierda). Los valores de las correspondientes actividades hemolíticas se expresan como porcentajes respecto a hemólisis total.

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Depósito de material biológico

Un cultivo del microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108/784, correspondiente a la cepa silvestre S. diastaticus var. 108 a la que se ha introducido el plásmido pSM784, fue depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Alemania, el 14 de Marzo de 2005. Su número de acceso es DSM 17187. La cepa contiene la ruta completa para producir rimocidina (IIa) y CE-108 (IIb), siendo además capaz de producir los correspondientes amidados rimocidina B (IVa) y CE-108B (IVb).

Un cultivo del microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108::PM1-768/743B, correspondiente a la cepa silvestre S. diastaticus var. 108 con el gen rimG delecionado a la que se le ha añadido el vector pSM743B conteniendo el gen rimA, fue depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Alemania, el 18 de Julio de 2005. Su número de acceso es DSM 17482. Esta cepa es productora de los polienos metilados rimocidina C y CE-108C.

Las técnicas habitualmente utilizadas para la manipulación genética del género Streptomyces y el depósito de genes/promotores para su acceso público pueden permitir generar las construcciones que se describen en esta invención u otras funcionalmente equivalentes. Los vectores utilizados para ello son de uso público y son utilizados rutinariamente en los laboratorios en los que se trabaja habitualmente en Streptomyces.

La secuencia del ADN codificante para los genes que se hacen mención en esta invención se encuentra depositado y es públicamente accesible en las bases de datos de GeneBank bajo el número de acceso AY442225.

Claims

1. Un compuesto de fórmula (I)

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en donde R es alquilo C_{1}-C_{3}, sus isómeros, sales o solvatos.

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2. Compuestos según la reivindicación 1, seleccionados entre los compuestos identificados como rimocidina C (Ia) y CE-108C (Ib):

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3. Una composición biocida que comprende un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, junto con un vehículo inerte.

4. Composición según la reivindicación 3, en la que dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas.

5. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1 junto con, opcionalmente, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

6. Composición según la reivindicación 5, en la que dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, que comprende, además, uno o más agentes terapéuticos.

8. Empleo de un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la infección causada por organismos patógenos de humanos o animales, pertenecientes al siguiente grupo: hongos, microorganismos del género Trypanosoma y microorganismos del género Leishmania, comprendiendo todos ellos ergosterol en su membrana.

9. Empleo según la reivindicación 8, en la que dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas.

10. Una composición antifúngica que comprende un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, junto con, opcionalmente, uno o más vehículos inertes.

11. Composición según la reivindicación 10, en la que dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas.

12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 ú 11, que comprende, además, uno o más agentes antifúngicos.

13. Un método para controlar la infección causada por hongos fitopatógenos en una planta que comprende aplicar a dicha planta, o al medio que la rodea, una composición antifúngica según cualquiera de las reivindicaciones
10 a 12.

14. Un método para controlar la infección causada por hongos fitopatógenos en un fruto que comprende aplicar a dicho fruto una composición antifúngica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.

15. Un método para controlar la infección causada por un hongo capaz de desarrollarse en un preparado alimentario que comprende aplicar a dicho preparado alimentario una composición antifúngica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.

16. Procedimiento para la producción de un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1 caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

-: obtención del caldo de fermentación y, si se desea,

-: el aislamiento y purificación de dichos compuestos de fórmula (I).

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17. Procedimiento según la reivindicación 16 caracterizado por que el compuesto de fórmula (I) pertenece al siguiente grupo: rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas.

18. Un microorganismo Streptomyces diastaticus var. 108::PM1-768/743B (número de depósito: DSM 17482) productor de los polienos metilados de fórmula general (I) rimocidina C, CE-108C y sus mezclas.

19. Empleo de un microorganismo según la reivindicación 18 para la obtención de un compuesto de fórmula (I).

20. Empleo según la reivindicación 19 caracterizado por que el compuesto de fórmula (I) se selecciona entre rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas.

21. Caldo de fermentación obtenido en el procedimiento según las reivindicaciones 16 y 17 que comprende un compuesto seleccionado entre un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, rimocidina C (Ia), CE-108C (Ib) y sus mezclas.

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22. Procedimiento de obtención de un microorganismo según la reivindicación 18 caracterizado por que en la cepa resultante está exclusivamente bloqueada la expresión del gen rimG y por que comprende las siguientes etapas:

a): Obtención de un mutante en el gen rimG del microorganismo S. diastaticus var. 108 mediante la disrupción o deleción de dicho gen, incapaz de producir polienos, y

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23. Procedimiento de obtención según la reivindicación 22 caracterizado por que la cepa resultante es la cepa S. diastaticus var. 108::PM1-768/743B y comprende las siguientes etapas:

a): Obtención de un mutante en el gen rimG del microorganismo S. diastaticus var. 108 mediante la disrupción de dicho gen, incapaz de producir polienos, y

b): su posterior transformación con el plásmido pSM743B, capaz de complementar la disrupción del gen rimA en el cromosoma en dicho mutante.