KR20070116254A - 폴리엔 항생물질, 이 항생물질을 함유하는 조성물, 이것을얻는데 사용되는 방법 및 미생물, 그리고 그 적용 - Google Patents

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로메로 프란시스코 말파르티다
마르틴 엘레나 마리아 세코
벨라스코 트리니다드 쿠에스타
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콘세호수페리오르데인베스티가시오네스시엔티피카스
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Abstract

본 발명은 일반식(Ⅰ)을 갖는 신규의 폴리엔에 관한 것이고, 여기서 R1은 C1-C3의 알킬을 나타내고; 또한 R2는 CH3- 또는 CONH2- (메틸- 또는 1차 아미드-)에서 선택되는 관능기를 나타낸다. 상술한 폴리엔은 진균 또는 기생충 등의 에르고스테롤를 함유하는 세포막을 포함하는 유기체 상에 살생 활성을 갖는다. 상기 화합물은 그 제조를 할 수 있는 조건하에서 생산 미생물의 배양으로 이루어진 방법을 사용하여 얻을 수 있다. 또한, 본 발명은 ATP/Mg++ 및 아미드기 공여체 화합물(바람직하게는 글루타민)의 존재하에서 그 생산자의 무세포 추출물(또는 단백질성 단편)로 카르복실화 폴리엔을 배양하는 것으로 이루어진 아미드화 폴리엔의 체외 제조를 위한 메커니즘에 관한 것이다.
폴리엔 항생 물질

Description

폴리엔 항생물질, 이 항생물질을 함유하는 조성물, 이것을 얻는데 사용되는 방법 및 미생물, 그리고 그 적용{POLYENE ANTIBIOTICS, COMPOSITIONS CONTAINING SAID ANTIBIOTICS, METHOD AND MICRO-ORGANISMS USED TO OBTAIN SAME AND APPLICATIONS THEREOF}
본 발명은 신규의 아미드화 및 메틸화 폴리엔, 이것을 얻는 방법, 생물학적 활성 및 적용, 예를 들면 치료, 농업 및 식품에 관한 것이다. 또한 본 발명은 (a)각 생산 유기체와 동일한 방법으로 얻어진 다른 폴리엔의 메틸화 유도체; (b)아미드화 폴리엔의 재조합체 생산 미생물 뿐만 아니라, (c)상기 미생물을 얻는데 유용한 벡터 및 (d)아미드화 폴리엔 마크로라이드의 생산자로부터 얻어지는 무세포 추출물 또는 단백질성 단편을 사용한 아미드화 폴리엔을 얻는 방법에 관한 것이다.
과거, 진균 감염은 전염성 질병의 개관에서 상당히 미미한 위치를 차지하였다. 그럼에도 불구하고, 그 개관은 지난 20년 동안 급속히 변화해 왔다. 면역 결핍 환자, 골수 이식 및 장기 이식의 증가, 암환자, 화학요법 치료의 증가, 선천적 방어체계를 변경시키는 다른 약 및 AIDS 전염에 따른 면역억제제 및 광범위한 향균제의 사용에 의해 이 변화가 모두 초래되었다. 진균종에 의한 병원성 감염이 보다 중요해지고 있고, 또한 심재성 사상균병과 조합한 진균종도 보다 많아지고 있다.
항진균약의 필요성에도 불구하고, 전신 감염증을 치료하기 위한 시판의 의약품의 수는 위험할 정도로 적다. 최근 세포벽의 특정 구성 요소를 타겟으로 하는 항진균약(에키노칸딘(echinocandins))이 개발되었지만, 암모테리신 B를 포함한 아졸 및 폴리엔 등의 이들 대부분은 진균막의 구조적 완결정을 타겟으로 한다.
폴리엔은 그들의 항진균 활성으로 인해 매우 흥미로운 폴리케톤 마크로라이드의 군이다. 이들 화합물은 자외선/가시광선 영역에서 특징적인 스펙트럼으로 발색단을 형성하는 다수의 콘쥬게이트된 이중결합을 가진 거대 락톤환을 포함하고; 이들 특성은 이들의 물리적 화학적 특성(높은 광흡수, 광방출 및 물에서의 낮은 용해도)에 기인한다. 항진균 약으로서 암포테리신 B 등의 이들의 중요성에도 불구하고, 이들의 정확한 작용 메커니즘은 아직 잘 이해되지 않고 있고; 그렇지만, 항진균 활성은 폴리엔 분자와 스테롤을 함유하는 막 사이의 상호작용에 의한 것으로 보인다. 이 상호작용은 이온의 채널을 형성하고, 그 막이 투과성으로 되어 전기화학적 구배가 파괴되어 그 결과 세포 죽음을 초래한다. 이들 화합물은 콜레스테롤을 함유하는 막(포유동물의 세포)보다 에르고스테롤(트리파노소마(Trypanosoma) 및 리슈마니아(Leishmania) 등의 기생충 및 진균의 막에 존재하는 주요 스테롤)을 함유하는 막에 대하여 상당히 큰 친화성을 나타낸다. 그렇지만, 폴리엔과 콜레스테롤을 함유하는 막 사이의 상호작용은 무의미하지 않아서 저용해도와 함께 부작용을 유발하여, 상기 화합물은 전신성 진균 감염 치료에 전체적으로 만족스럽지 않은 수단이다. 이들 바람직하지 않은 특성 및 암포테리신 B의 독성 부작용에도 불구하고, 이 오래된 약은 40년 이상 사용되어 왔고, 대부분의 전신 감염증을 치료하는데 바람직 한 항진균제로 계속되고 있다; 사실, 최근 생겨난 진균 감염에 대항하는데 사용할 수 있는 더 좋은 대안이 없었다고 할 수 있다. 일부 바람직하지 않는 효과는 리포솜 제제에서 상기 약을 빼는 것에 의해 최소화할 수 있다; 이것에 의해서 암포테리신 B의 독성을 감소시게 되어, 세포벽이 에르고스테롤을 함유하는 유기체의 항진균제(사상균병) 및 항기생충제(예를 들면, 다른 기생충 중에서 리슈만편모충증(leichmaniasis) 및 트리파노소마증(trypanosimiasis)에 대항)로서, 그것의 전신 적용을 할 수 있다(Berman et al., 1992, Antimicrob. Agents Chemother 36: 1978-1980; Herwaldt (1999), The Lancet. 354: 1191-1199; Yardley et al., 1999, Am. J. Trop. Med. Hyg. 61: 163-197).
이러한 이유로, 신규의 항진균약의 발견 또는 이미 존재하는 것들의 약제학적 특성의 개선은 흥미로운 과제로 된다. 이 목적과 함께, 분자 모델의 합리적 접근을 이용하여, 수개의 암포테리신 B의 반합성 유도체를 생성하여, 유효한 항진균 약으로서 시험되었다. 구조적 변형을 행하기 위해서, 특히 측쇄의 카르복실기 및 당류 내의 아미노기의 2개의 타겟이 고려되었다. 이들 몇몇의 반합성 유도체는 아직 동일한 독성을 나타내지만, 다른 것들은 암포테리신 B의 분자에 비하여 개선된 약제학적인 특성을 나타내었다: 항진균 활성이 클수록 물에서의 용해도가 좋고, 에르고스테롤을 함유하는 막의 선택성이 보다 크고 용혈 활성이 낮아서, 에르고스테롤을 함유하는 막에 대하여 보다 큰 선택성을 시사한다. 항진균 활성이 클수록 이들 화합물에 어느 정도의 이점을 주지만, 놀랍게도 이들 구조적 변형은 미생물로부터 분리된 천연 폴리엔 내에 통상적으로 존재하지 않는다. 사실, 개선된 약이라고 개신된 모든 폴리엔은 반합성 유도체이고, 생체내 변화에 의해서 보다는 유기 합성에 의해 생성된다.
각종의 비폴리엔 항진균제가 사용가능하지만, 이들 약의 사용은 이들에 대하여 내성균의 선택 및 친화를 촉진시킴으로써, 미래에 항진균 치료를 위한 이들 화합물의 효과를 손상시킬 수 있다. 그래서, 신규의 항진균약의 연구 및 기존의 것의 약제학적 특성의 개선에 폭넓은 관심이 존재한다.
본 발명의 발명자들은 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스(Streptomyces diastaticus) var. 108의 유전자 조작에 의해서, 2개의 천연 폴리엔 이외에 폴리엔 마크로라이드 항생물질 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)의 산생균 (Perez-Zuniga et al. (2004), J. Antibiot, (Tokyo) 57: 197-204)도 발견하였고, 신규 폴리엔 마크로라이드는 화학적으로 특징지어진 후에 카르복실산의 아미드화 물인, 각각 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)에서 유래한 폴리엔의 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b), 및 일반식(Ⅲ)의 메틸화물, 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)로 되는 재조합 균주의 발효 배양에서 얻어지고, 이들은 모두 일반식(Ⅰ)에 포함된다. 생물학적 활성 및 체외 독성 시험에 의해면, 신규의 화합물에 존재하는 화학적 변성이 유도체에 비하여 개선된 생물학적 특성을 나타낸다는 것을 알 수 있다(실시예 1 및 실시예 2 참조).
보다 구체적으로, 본 발명의 발명자들은 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108의 유전자 조작에 의하여, 바람직하게는 에리스로마이신 내성 유전자 (ermE)를 운반하는 SCP2*에서 유래되는 벡터로 형질 전환(Uchitama et al., (1985), Gene 38: 103-110)에 의해서, 2개의 천연 폴리엔 이외에 폴리엔 마크로라이드 항생물질 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)의 산생균 (Perez-Zuniga et al. (2004), J. Antibiot, (Tokyo) 57: 197-204)도 발견하였고, 신규 폴리엔 마크로라이드는 화학적으로 특징지어진 후에 각각 카르복실산의 아미드화 물인, 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)에서 유래한 폴리엔의 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b)로 되는 재조합 균주의 발효 배양에서 얻어진다. 생물학적 활성 및 체외 독성 시험에 의하면, 신규의 화합물에 존재하는 화학적 변성(카르복실산 대신에 아미드)이 유도체에 비하여 개선된 생물학적 특성을 나타낸다는 것을 알 수 있다 (표 2a, 실시예 1).
본 발명에 있어서, 또한 생합성 메커니즘은 상술한 이들 아미드화 폴리엔 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b)의 형성을 설명하고, 2개의 폴리엔 마이크로라이드 항생물질 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)(Seco et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366)의 생합성에 관련된 클러스터의 유전자 조작에 의해 2개의 신규 폴리엔 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)(메틸화 폴리엔, 실시예 2)를 얻는 방법을 설명한다. 신규 메틸화 폴리엔은 아미드화된 것과 같이 천연 테트라엔에 대하여 명백히 개선된 약제학적 특성을 나타낸다.
천연 테트라엔 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108C(Ⅲb)(Seco et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366)의 생합성을 위해 제안된 모델을 기초로 하여, 폴리케티드 합성효소 (PKS)의 모듈 7을, 나중에 특정 부위 포스트-PKS 변성에 의해서 산화되어 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108C(Ⅲb)에 존재하는 유리 카르복실기를 부여하는 마이크로환 중에 메틸기가 존재하도록 하는 연장 단위로서 메틸말론아밀-CoA에 조합시킨다. 시토크롬 P-450 모노옥시제나아제는 이 산화에 관련되어 있고, 지금까지 설명한 폴리엔의 생합성 클러스터에서 암호화된다는 것을 설명한다(Aparicio et al., 2003, Appl Microbiol Biotechnol 61: 179-188). 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108C(Ⅲb)의 생합성의 경우, 그 순서의 유사성 및 생합성 모델에 단독의 시토크롬 P-450 모노옥시제나아제가 필요하다는 사실에 의해, RimG는 카르복실기를 발생시키기 위한 메틸기의 산화에 관련된 시토크롬 P-450 모노옥시제나아제라는 것이 제안되었다(Seco et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366).
아미드화 폴리엔 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108(Ⅰ-1b)에 존재하는 아미드기를 형성하기 위해서, 2개의 가능한 메커니즘: (a) 리모디신(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)의 형성을 위해 제안된 메틸말로닐-CoA 단위 대신에 폴리케톤쇄를 어셈블리시 말론아밀-CoA 단위의 조합하거나, 또는 (b) 거대 락톤환 측면 메틸기가 카르복실기로 산화된 다음 아미도트랜스퍼라제가 활성화된다는 이론이 최초로 제안되었다.
본 발명은 본 명세서에서 나중에 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1a)로서 특정되는 2개의 아미드화 폴리엔 및 나중에 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108(Ⅲb)로서 특정되는 2개의 메틸화 폴리엔에 관한 것이고; 이들의 제조방법 및 적용은 본 발명의 추가적인 형태를 구성한다.
상기 화합물은 진균 또는 기생충 중 어느 하나의 에르고스테롤을 함유하는 세포막을 갖는 유기체에 대해 일반적으로 보다 선택적인 살생 활성을 갖는다. 살생물제 조성물, 예를 들면 상기 아미드화 또는 메틸화 폴리엔을 함유하는 농업 또는 식품 용도의 약제학적 조성물 및/또는 항진균성 조성물은 본 발명의 추가적인 형태를 구성한다. 인간 또는 동물 용도의 위생상의 목적을 갖는 약제학적 조성물 및/또는 농업 또는 식품 용도의 항진균성 조성물에 있어서, 아미드화되거나 또는 메틸화된 이러한 폴리엔의 사용은 본 발명의 다른 형태를 구성한다.
또 다른 형태에 있어서, 본 발명은 스트렙토마이세스 sp. RGU5.3으로부터 분리되고 본 발명의 초점인 화합물의 시험 결과를 기초로 하여, 폴리엔 AB-400(Ⅳb), 피마리신(Ⅳa) (Canedo L. M. et al. 2000, J., Antibiot. (Tokyo) 53: 623-626)의 상응하는 아미드의 적용에 관한 것이다.
또 다른 형태에 있어서, 본 발명은 pSM784 또는 pSM743B 등과 같은 에리스로마이신 내성 유전자 (ermE)를 함유하는 SCP2*로부터 유래된 벡터의 사용에 관한 것으로, 이하에 상세하게 설명한다. 유리 카르복실기를 갖는 폴리엔 마크로라이드의 생산 미생물로부터 시작하여 카르복실기 대신에 아미드기를 갖는 폴리엔 마크로라이드의 재조합체 생산 미생물을 생성하기 위한 상기 벡터의 사용은 본 발명의 다른 형태를 구성한다.
본 발명의 다른 형태에 있어서, 본 발명은 상기 폴리엔의 제조를 가능하게 하는 조건하에서 상기 화합물의 재조합체 생산 미생물을 배양하고, 아미드화 또는 메틸화하고, 또한 필요에 따라 이들 화합물을 분리 및 정제하는 것으로 이루어진 상기 아미드화 폴리엔의 제조방법에 관한 것이다. 이러한 재조합체 미생물의 실례로는 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/743B 및 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B (실시예 참조)가 열거되고, 이들의 사용 또는 상기 아미드화 폴리엔에서 얻어지고 필요에 따라 카르복실기를 갖는 폴리머와 이들의 혼합물에서 얻어지는 유사한 재조합체 미생물과 함께 본 발명의 추가적인 형태를 구성한다.
다른 형태에 있어서, 본 발명은 카르복실기의 형성을 억제하기 위한 목적으로 유전자 rimG의 분절 또는 결실이 중요한 아미드화 폴리엔의 아미드기의 형성을 위한 메커니즘을 설명하는 것에 관한 것이다. 카르복실기의 형성이 차단된 다음, 아미드기의 형성이 폴리케톤쇄의 어셈블리시 일어나면, 상기 아미드화 테트라엔의 생합성의 유도 플라스미드로 분열 균주를 형질 전환하는 경우에는, 후자가 발효 배양시 검출될 수 있다. 반대의 경우, 후자가 형성된 다음 유리 카르복실기에 아미도트랜스퍼라제 활성에 의해서 아미드기의 형성이 일어난다고 결론낼 수 있다.
비활성 유전자 분열은 유전자 rimG의 돌연변이에 대한 대안으로서 선택되었다. 그렇지만, 이 최초 조건에서는, 예상외로 상술한 바와 같은 유전자 rimG에서의 분열이 일어나서 폴리엔의 제조가 불가능한 재조합체가 생성되었다. 이것은 분열에 사용되는 프로모터가 아마도 삽입부위 이후에 위치하는 유전자 rimA에 대한 극성 효과를 억제할 수 없다는 것을 의미하는 것이었다. 그 후, 플라스미드 pSM743B가 존재하는 (아미드화 테트라엔의 형성을 유도하는 것 이외에도, 염색체 하류에 위치하는 유전자 rimA에서 극성 효과를 보완할 수 있는) 균주에서의 염색체 내의 유전자 rimG에서의 분절에 의해서 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)로 명명된 2개의 신규 메틸화 폴리엔의 분리를 가능하게 하여, 유전자 rimG의 분절의 결과로서 메틸기에 대한 유리 카르복실기의 치환이 나타난다. 얻어진 균주(스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B)(기탁 번호: DSM 17482)의 발효 배양시 아미드화 테트라엔이 존재하지 않음으로써, 폴리케톤쇄의 연장시가 아니라 대환상 환 및 측면 유리 카르복실기가 형성된 다음, 부위 특정 포스트 PKS 변성에 의해서 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b)을 생성할 수 있고, 이것은 아마도 아미도트랜스퍼라제에 의한 "수식" 활성에 의한 것이라는 결론을 내릴 수 있다.
또한, 각종 진균의 균주(페니실리움 크리소제늄(Penicillium chrysogenum), 캔디다 크루세이(Candida krusei), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans))에 대한 생물학적 활성의 시험 및 일부 체외 독성 시험에 의하면 신규 화합물에 존재하는 화학적 변형은 유래되는 천연 폴리엔에 대하여 명확한 약제학적 이점을 부여한다는 것을 알 수 있다(표 2b, 실시예 2).
그러므로, 본 발명은 항진균제 및 항기생충제로서 유용한 본 발명의 화합물인 일반식(Ⅲ)의 메틸화 폴리엔에 관한 것이고, 상기 폴리엔의 특정물로서 하기 메틸화 폴리엔이 본 명세서에서 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)로서 명기하여 나타낸다.
본 발명은 상기 메틸화 폴리엔을 제조할 수 있는 조건 하에서 이들 화합물의 분열 생산 미생물을 배양하고, 필요에 따라 이들 화합물을 분리 및 정제하는 것을 포함하는 상기 일반식(Ⅲ)의 메틸화 폴리엔의 제조방법에 대한 다른 형태에 관한 것이다. 특히, 이것은 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B (기탁 번호: DSM 17482, 본 발명의 미생물), 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)의 생산자를 포함하고, 그 용도에 따라 또는 상기 메틸화 폴리엔의 제조에 있어서 유사 분열 미생물에 따라 본 발명의 추가적인 형태를 구성한다.
다른 형태에 있어서, 본 발명은 상응하는 메틸화 유도체를 제조할 목적으로 폴리엔의 다른 생합성 클러스터의 RimG에 대해 제안된 것과 동일한 화학 변성(이미 설명한)에 관련된 유전자의 분절의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 메틸화 폴리엔 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)의 약제학적 이점은, 인간의 세포막에 대한 것 보다 진균 또는 기생충의 에르고스테롤을 함유하는 막에 대한 선택적 독성이 더 큰 것을 기초로 하여, 그 독성이 현저히 감소한 것이다. 이들 메틸화 폴리엔을 함유하는 살생성 조성물, 예를 들면 위생용도의 약제학적 조성물 및/또는 항진균 조성물, 농업 또는 식품으로의 적용은 본 발명의 추가적인 형태를 구성한다.
본 발명의 다른 추가적인 형태는 인간 및 동물, 농업 및 영양의 분야에서의 전염성 질병의 치료에 본 발명의 살생물질 조성물을 사용하는 것이다.
또한, 아미드화 폴리엔(S. 디아스타티쿠스 var. 108/743B, S. 디아스타티쿠스 var. 108/784)의 생산자의 무세포 추출물과 기질로서 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)를 사용한 체외 아미드화 시험에 의해, 아미드기의 형성이 아미드기 공여체로서 글루타민을 사용할 수 있는 ATP/Mg++ 의존 아미도트랜스퍼라제 활성에 의한 것이라고 결론낼 수 있다(실시예 2, 단락 B). 스트렙토마이세스 sp. RGU5.3의 무세포 추출물로 행한 동일한 시험은 폴리엔 AB-400(Ⅳb), 피마리신(Ⅳa)의 아미드가, 피마리신의 유리 카르복실기 상에서 ATP/Mg++ 의존성인 반응으로 이것을 아미드기로 변환하기 위해서 작용하는 S. 디아스타티쿠스 var. 108과 매우 유사한 아미도트랜스퍼라제 활성에 의해서 발생한다는 것을 확인할 수 있다.
또한, 유전자 재조합체 S. 디아스타티쿠스 var. 108의 무세포 추출물에 존재하는 아미도트랜스퍼라제 활성은, 천연 기질 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)을 이들의 상응하는 아미드 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b)에서 변성시킬 수 있을 뿐만 아니라 피마리신(Ⅳa)과 같은 이종 기질을 인식할 수도 있는 기질에 대하여 완화된 선택성을 부여한다는 결론이 가능하다. 여기서는, 상기 시험 조건 하에서 기질로서 피마리신(Ⅳa) 만을 인식할 수 있는 스트렙토마이세스 sp. RGU5.3의 아미도트랜스퍼라제 활성에 대해서는 발생하지 않았다.
유리 카르복실기는 암포테리신 B, 니스타틴, 피마리신, 캔디시딘과 같은 대표 폴리엔의 대부분에서 매우 잘 보존된다. 아미드기에 대한 이들 카르복실기의 치환에 의해서 개선된 약제학적 특성을 가진 아미드화 폴리엔이 생성될 수 있다. 그러므로, 이 형태에 있어서, 본 발명은 카르복실화 폴리엔을 상응하는 아미드화 폴리엔으로 변환하기 위해서, 생산자 또는 화합물에서 직접 선택하거나, 또는 일정한 배양 조건하에서 기질에서 출발하는 고정된 조직의 분야의 기술을 적당한 지지체 상에 고정된 무세포 추출물을 사용하는 효소법, 이하 본 발명의 효소법을 제공한다.
다른 형태에 있어서, 본 발명은 아미드화 폴리엔의 생산자의 무세포 추출물, "체외"에서 카르복실화 폴리엔을 본 발명의 효소법을 시작하는데 필요한 이들의 상응하는 아미드로 변환시킬 수 있는 아미도트랜스퍼라제 활성의 담체에 관한 것이다.
다른 특정 형태에 있어서, 본 발명은 미생물 S. 디아스타티쿠스 var. 108/743B, 및 S. 디아스타티쿠스 var. 108/784의 무세포 추출물 - 이들 모두 아미드화 폴리엔 CE-108B(Ⅰ-1b) 및 리모시딘 B(Ⅰ-1a)의 생산자 - 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb) 이외에 다른 이종 기질도 그들의 상응하는 아미드로 변환시킬 수 있는 능력을 지닌 아미도트랜스퍼라제의 담체; 및 미생물 스트렙토마이세스 sp. RGU5.3의 무세포 추출물, 시험 조건하에서 적어도 피마리신(Ⅳa)을 이것의 상응하는 아미드화 폴리엔 AB-400(Ⅳb)로 변환할 수 있는 아미드화 폴리엔 AB-400(Ⅳb)의 생산자에 관한 것이다.
도 1은 재조합체 플라스미드 pSM743B (pIJ922에 도입된 유전자 rimA) [도 1a] 및 pSM784 (pIJ941에 도입된 유전자 ermE) [도 1b]의 물리적 지도의 개략도를 나타낸다. 이들 도 1a 및 도 1b에서, xysAp: 프로모터 zysA; rimA: CE-108 및 리모시딘의 생합성 경로에 포함되는 PKS Type I; Ti: 메틸레노마이신 내성 유전자의 종결부위; ermE , tsr 및 hyg: 에리스로마이신, 티오스트렙톤 및 하이그로마이신에 대 한 각각의 내성 유전자; rimI * : N-말단이 잘려진 rimI을 나타낸다. 도 1c는 유전학적으로 변성된 균주 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/743B의 발효 배양균의 크로마토그래피 프로파일(HPLC)를 나타낸다. 상기 도 1c에서, 숫자 1-4에 있어서 1: CE-108B(I-1b); 2: CE-108(Ⅱb); 3: 리모시딘 B(I-1a) 및 4: 리모시딘(Ⅱa)을 나타낸다.
도 2는 S. 디아스타티쿠스 var. 108/743B에 의해 제조된 4개의 테트라엔의 항진균 활성을 나타낸다. 상기 도면에서, A: 리모시딘(Ⅱa), B: 리모시딘 B(I-1a), C: CE-108B(Ⅱb), D: CE-108B(I-1b)을 나타낸다. 각 안티바이오그램에 나타낸 숫자는 각 폴리엔의 적용량을 의미하고 나노몰로 표시하였다. 타켓 유기체는 P. 크리소제늄, C. 크루세이, A. 나이거, C. 알비칸스 및 C. 네오포르만스이었다(표 1a, 실시예 1 참조).
도 3은 스트렙토마이세스 sp, RGU5.3으로부터 분리된 폴리엔 피마리신(Ⅳa) 및 AB-400(Ⅳb)의 생물학적 활성을 나타낸다. 이것은 탄소원으로서 각각 아세테이트(도 3a) 또는 글루코스(도 3b)의 배지에서 성장된 스트렙토마이세스 sp. RGU5.3으로부터 유래한 발효 배양균의 HPLC 분석(크로마토그램)을 나타낸다. 도 3c는 P. 크리소제늄에 대한 피마리신(Ⅳa) 및 AB-400(Ⅳb)의 항진균 활성을 나타내고; 적용된 폴리엔의 샘플은 (1): 시판의 피마리신 (Calbiochem 5279962), (2): 글루코스 배지에서 성장된 S. sp. RGU5.3의 발효 배양균의 총 추출물; (3) S. sp RGU5.3으로부터 유래한 정제된 AB-400 및 (4): S. sp. RGU5.3으로부터 유래한 피마리신이고; 총 200ng을 각 시험에 첨가했다. 도 3d는 피마리신(Calbiochem 527962, 순도 98.8%) 및 AB-400 (실험방법에 나타낸 바와 같이 HPLC에 의해 정제함)에 대한 용혈 활성을 나타내고; 각 폴리엔의 값은 나노몰로 표시하였고(좌측 컬럼) 또한 상응 용혈 활성은 총 용혈 활성의 백분율로서 제공한다(실험방법에 대한 부분 참조).
도 4는, 도 4a에서는 다른 DNA의 단편으로 행한 엔도뉴클레아제 S1에 대한 보호 분석법에 의해 추론한 염색체의 특정 영역에서의 유전자 전사의 다이어그램을 나타낸다(Seco et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366). 전사는 유전자 rimE , rimF, rimG , rimH 및 rimA의 폴리시스트론에 상응하는 파선의 화살표로 표시하였다. 유전자 rimG 및 rimE의 불활성 삽입에 대하여 추론된 전사는 회색선으로 표시하였고; 괄호 안의 숫자는 액세스 번호 AY442225하에 위치한 DNA 서열에 상응한다. 본 도면의 도 4b는 S. 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B의 발효 배양균에 상응하는 크로마토그램을 나타내고, 여기서 a 및 b는 각각 CE-108C(Ⅲb) 및 리모시딘 C(Ⅲa)에 상응한다.
도 5는 좌측 부분에서, S. 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-702B/743B의 발효 배양균의 크로마토그램을 나타낸다. 크로마토그램의 우측은 크로마토그래프에서 검출된 화합물로부터 추론한 화학 구조이다. 이 화학 구조는 질량 분광분석법 분석을 기초로 하여 추론하였다.
도 6은 S. 디아스타티쿠스 var. 108/784의 무세포 추출물로 행한 체외 아미도트랜스퍼라제 시험의 HPLC 분석을 나타낸다. 좌측 및 우측 컬럼의 크로마토그램은 각각 0 및 60초의 배양시간에 대한 반응을 나타낸다. 피크는: a. CE-108B; b. CE-108B; c. 리모시딘 B; d. 리모시딘; e. 피마리신; f. AB-400이다.
A. CE-108(Ⅱb)의 그 아미드 CE-108(I-1b)로의 효소적 변환. 피크 a 및 별표모양으로 표시된 피크는 각각 CE-108B(I-1b) 및 리모시딘 B(I-1a)에 상응하고, 이것은 무세포 추출물로부터 완전히 제거할 수 없었다.
B. 리모시딘(Ⅱa)의 그 아미드 리모시딘 B(I-1a)로의 효소적 변환. 피크 c 및 별표모양으로 표시된 피크는 각각 리모시딘 B(I-1a) 및 CE-108B(I-1b)에 상응하고, 무세포 추출물에 존재한다.
C. 피마리신(Ⅳa)의 그 아미드 AB-400(Ⅳb)로의 효소적 변환. 별표모양으로 표시된 피크는 무세포 추출물에 존재하는 리모시딘 B(I-1a)에 상응한다. S. 디아스타티쿠스 var. 108/784의 무세포 추출물에 존재하는 아미도트랜스퍼라제에 의한 기질 인식에 대한 완화된 선택성에 의해서 이종 기질 (피마리신)을 그것에 상응하는 아미드 (AB-400)로 변환시킬 수 있다.
도 7은 S. sp. RGU5.3의 무세포 추출물로 행한 피마리신(Ⅳ)에 대한 체외 아미드화 시험의 HPLC 분석을 나타낸다. 좌측 및 우측 컬럼의 크로마토그램은 각각 0 및 60분의 배양시간에 대한 반응을 나타낸다. 피크 a는 S. sp. RGU5.3의 무세포 추출물에 존재하는 AB-400(Ⅳb)에 상응하는 시간 0에서 존재하고, 이것은 완전히 제거할 수 없었다. 피마리신(Ⅳa) (피크 a)의 그 상응하는 아미드 AB-400(Ⅳb) (피크 b)로의 명백한 변환을 말한다.
본 발명에 있어서의 일반식(Ⅰ)으로 표시되는 신규의 폴리엔 마크로라이드 화합물에 대해서 설명한다:
Figure 112007073855098-PCT00001
여기서
R1은 C1-C3의 알킬이고;
R2는 CH3- 또는 CONH2-(메틸- 또는 1차 아미드-) 중에서 선택되는 관능기, 이것의 이성질체, 염, 프로드러그 또는 용매 화합물이다.
상술한 일반식(Ⅰ)으로 표시되는 본 발명의 화합물은 다중 결합(예를 들면, Z, E)의 존재에 따라서 이성질체를 포함하고, 키랄 중심의 존재에 따라서 광학 또는 거울상 이성질체를 포함할 수 있다. 각 이성질체, 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체 및 이들의 혼합물은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 각 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체 및 이들의 혼합물은 종래 기술에 의해 분리될 수 있다.
여기서 사용되는 용어 "염"은 약제학적으로 허용가능한 염, 즉 약의 제조에 사용할 수 있는 일반식(Ⅰ)의 화합물의 염과, 약제학적으로 허용할 수 없는 염도 약제학적 허용가능한 염의 제조에 사용할 수 있으므로 모두 포함된다. 약제학적으로 허용가능한 염의 성질은 그것을 약제학적으로 허용할 수 있으면 항상 중요한 것 은 아니다. 일반식(Ⅰ)의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염은 산부가염이어도 좋고, 이것은 적당한 산과 화학량론적으로 적당량으로 일반식(Ⅰ)의 화합물을 반응시킴으로써 당업자에게 잘 알려진 종래 방법을 사용하여 유기 또는 무기산으로부터 시작하여 얻을 수 있다. 상기 산부가염을 얻는데 사용할 수 있는 산의 예로는 유기산류, 예를 들면 아세트산, 아스코르브산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 메탄술폰산, 옥살산, 숙신산, 타르타르산, p-톨루엔술폰산 등, 또는 무기산류, 예를 들면 브롬화수소산, 염화산, 인산, 질산, 황산 등이 열거되지만, 여기에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 범위 내에서 일반식(Ⅰ)의 화합물의 프로드러그가 포함된다. 여기서 사용하는 용어 "프로드러그"로는 일반식(Ⅰ)의 화합물로부터 유래되는 임의의 화합물, 예를 들면 카르복실산의 에스테르, 아미노산의 에스테르, 포스페이트 에스테르, 금속염의 술포네이트 에스테르 등을 포함하는 에스테르류, 카바메이트류, 아미드류 등이 열거되고, 이들은 개체에 투약되는 경우 상기 개체 중에서 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물을 직접 또는 간접적으로 운반될 수 있다. 유리하게도, 상기 유도체는 생물학적 구획에서 일반식(Ⅰ)의 화합물의 생물학적 이용가능성을 증가시키는 화합물이다. 상기 유도체의 성질은 그것이 개체에 투여되어 개체의 생물학적 구획에서 일반식(Ⅰ)의 화합물을 운반할 수 있으면 항상 중요한 것은 아니다. 상기 프로드러그의 제조는 당업자에게 알려진 종래의 방법을 사용하여 행할 수 있다.
본 발명의 화합물은 유리 화합물로서 또는 용매 화합물로서 결정체 형태일 수 있고, 두가지 형태 모두 본 발명의 범위 내가 되는 것이 목적이다. 이것에 관하여, 여기서 사용하는 용어 "용매 화합물"은 약제학적으로 허용가능한 용매 화합물, 즉 약의 제조에 사용할 수 있는 일반식(Ⅰ)의 화합물의 용매 화합물과, 약제학적으로 허용할 수 없는 용매 화합물도 약제학적 허용가능한 용매 화합물 또는 염의 제조에 사용할 수 있으므로 모두 포함된다. 약제학적으로 허용가능한 용매 화합물의 성질은 그것이 약제학적으로 허용할 수 있으면 항상 중요한 것은 아니다. 특히 실시형태에 있어서, 용매 화합물은 수화물이다. 용매 화합물은 당업자에게 잘 알려진 종래의 방법에 의해 얻을 수 있다.
이들을 치료에 적용하기 위해서, 일반식(Ⅰ)의 화합물, 이들의 이성질체, 염, 프로드러그 또는 용매 화합물은 바람직하게는 약제학적으로 허용가능하게 되거나 또는 실질적으로 순수한 형태로 될 수 있는 것이 바람직하고, 즉 이것은 희석제 또는 담체 등의 일반 약제학적 첨가제를 제외하고, 독성으로 생각되는 물질을 일반 투약량 수준으로 함유하지 않는 약제학적으로 허용가능한 순도를 갖는다. 작용 원리를 위한 순도는 50%를 초과하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 70%를 초과하는 것이고, 더욱 바람직하게는 90%를 초과하는 것이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 이들은 일반식(Ⅰ)의 화합물, 또는 그 염, 용매 화합물 또는 프리드러그의 95%를 초과한다.
다른 언급이 없으면, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 동위원소적으로 농축된 원자의 존재만이 다른 화합물도 포함한다. 예를 들면, 듀트륨 또는 트리튬에 대 한 수소의 치환, 또는 13C 또는 14C에 농축된 탄소 또는 15N에 농축된 질소에 대한 탄소의 치환을 제외한 구조를 갖는 화합물은 본 발명의 범위 내에 있다.
다른 형태에 있어서, 본 발명은 일반식(Ⅰ-1)의 화합물, 일반식(Ⅰ)의 본 발명의 폴리엔의 아미드화 유도체에 관한 것이다:
Figure 112007073855098-PCT00002
여기서
R은 NH2이고; 또한
R1은 C1-C3의 알킬,
또는 그 이성질체, 염, 프로드러그 또는 용매 화합물이다.
특정 실시형태에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ-1)의 화합물은 본 명세서에서 일반식(Ⅰ-1a)의 "리모시딘 B" 및 일반식(Ⅰ-1b)의 "CE-108B"로 특정된 화합물로 이루어진 군에서 선택된다:
Figure 112007073855098-PCT00003
이들의 이성질체, 염, 프로드러그 또는 용매 화합물.
이들 2개의 신규 아미드화 폴리엔, 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b)는 천연 화합물 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)의 상응하는 아미드화물이기 때문에 이렇게 명명되었다.
Figure 112007073855098-PCT00004
이들 화합물의 화학 구조는 이들의 생물학적 활성에 따라 각종의 기술(예를 들면, 분광분석법, NMR, 안티바이오그램, 용혈 활성 등)에 의해 특징지어져 왔다. 아미드기에 대한 리모시딘 및 CE-108의 거대 락톤환에 존재하는 유리 카르복실기의 치환에 의해서 콜레스테롤을 지닌 막(동물 세포에 존재)에 대해서 보다 에르고스테롤(진균, 및 기생충 트리파노소마와 리슈마니아와 같은 다른 유기체의 것)을 지닌 막에 대하여 친화성이 더욱 커지는 것으로 보인다. 이 화학 변성은 진균에 대한 이들 폴리엔의 선택적 독성을 증가시켜서, 이들의 임상 적용에 있어서 명확한 이점으 로 된다. 사실상, 동물 세포(적혈구)에 대한 살균제 활성 시험(도 2) 및 독성 시험(표 2a, 실시예 1)은 동물 세포에 대하여 매우 유사한 독성값을 나타내지만 이들의 생물학적 활성이 매우 현저히 증가하고, 이것은 부모 테트라엔 리모시딘 및 CE-108 보다 진균에 대하여 보다 큰 선택적 독성을 유발한다. 유사한 선택성을 기생충 리슈마니아 및 트리파노소마 등과 같은 막에 에르고스테롤을 지닌 다른 유기체에 적용할 수 있다. 아미드화 테트라엔도 이들의 상응하는 부모 화합물 보다 더 가용인 것으로 나타났다. 유사한 시험을 AB-400(Canedo L. M. et al. 2000, J., Antibiot. (Tokyo) 53: 623-626) (도 3)을 사용하여 행하였고, 그들의 용해도가 증가하는 것 이외에 비아미드화 동족체(피마리신)에 대하여 그 약제학적 특성이 증가된 것으로 나타났고, 따라서 이것은 조직 감염의 치료를 위한 항진균/항기생충 약으로서 사용될 수 있다.
다른 점에 있어서, 본 발명은 일반식(Ⅲ)의 화합물, 일반식(Ⅰ)의 본 발명의 폴리엔의 메틸화 유도체에 관한 것이다:
Figure 112007073855098-PCT00005
여기서 R은 C1-C3의 알킬, 또는 그 이성질체, 염, 프리드러그 또는 용매 화합물이 다.
특정 실시형태에 있어서, 상기 일반식(Ⅲ)의 화합물은 본 명세서에서 일반식(Ⅲa)의 "리모시딘 C" 및 일반식(Ⅲb)의 "CE-108"로서 특정되는 화합물로 이루어진 군에서 선택된다.
Figure 112007073855098-PCT00006
2개의 신규 메틸화 폴리엔, 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)는 카르복실기측이 메틸기로 치환된 천연 화합물 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)로부터 유래되는 메틸화 폴리엔이므로 이렇게 명명하였다.
이들 화합물의 화학 구조는 이들의 생물학적 활성에 따라서 여러가지 기술(예를 들면, 분광분석법, NMR, 안티바이오그램, 용혈 활성 등)에 의해 특징지어진다. 아미드화 폴리엔과는 달리, 항진균 활성이 부모 화합물 리미디신 및 CE-108에 비해서는 증가하지 않지만; 용혈의 관점에서 평균 독성은 화합물 리미디신 및 CE-108 보다 낮고, 이것은 천연 폴리엔에 비하여 진균막에 대한 선택 독성이 증가한다는 것을 함축한다(실시예 2).
신규의 아미드화 및 메틸화 폴리엔의 적용
일반식(Ⅰ)의 화합물, 및 이들 중에서 일반식(Ⅰ-1) 및 (Ⅲ)의 화합물은 일반적으로 살생물 활성, 특히 에르고스테롤을 함유하는 세포막을 보유하는 유기체에 대한 살생물 활성을 가지므로, 이들은 잠재적으로 살생물제로서 유용하다. 본 명세서에서 사용되는 "살생물제"는 다른 종류의 생명체의 성장을 정지시키거나 또는 죽이는 화학 물질이다.
또한, 표현 "에르고스테롤을 함유하는 세포막을 보유하는 유기체"는 에르고스테롤을 함유하는 세포막을 가진 유기체, 예를 들면 진균, 기생충 등이 열거된다. 이러한 유기체의 예로서는 Fusarium oxypsorium , Botrytis cinerea (phytopathogens), Candida albicans , Candida cruzei , Aspergillus nigeer , Cryptococcus neoformans (인간 병원체) 등의 진균과 함께 Trypanosoma , Leishmania 등의 기생충 등이 열거되지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
그러므로, 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물, 및 이들 중에서 일반식(Ⅰ-1) 및 (Ⅲ)의 화합물, 특히 화합물 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b), 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)는 잠재적으로 에르고스테롤을 함유하는 세포막을 보유하는 상기 유기체에 대항하는 살생물제로서 유용하다. 특정 실시형태에 이어서, 상기 화합물은 상응하는 비아미드화 폴리엔보다 항기생충제 또는 항진균제로서 보다 유용하다. 용어 "항진균"은 살균제 및 정균제 모두를 포함한다.
결과적으로, 다른 형태에 있어서, 본 발명은 일반식(Ⅰ)의 화합물, 및 그 중에서 일반식(Ⅰ-1) 및 (Ⅲ)의 화합물을 불활성 매체와 함께 포함하는 살생물제 조성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물은 일반식(Ⅰ-1)의 군에서 선택되고, 바람직하게는 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b) 및 이들의 혼합물에서 선택되고; 다른 실시형태에 있어서, 상기 일반식(Ⅲ)의 화합물은 일반식(Ⅲ)의 군에서 선택되고, 바람직하게는 리모시딘 C(Ⅲa), CE-108C(Ⅲb) 및 이들의 혼합물에서 선택된다. 상기 살생물제 조성물은 에르고스테롤을 함유하는 세포막을 보유하는 유기체에 대하여 특히 유용하다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 살생물제 조성물은 화합물 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b), 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb) 중에서 선택되는 화합물 및 이들의 혼합물 등의 일반식(Ⅰ)의 화합물을, 선택적으로 하나 이상의 불활성 매체와 함께 함유하는 항진균 조성물이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "불활성"은 상기 매체가 중요한 살생 활성을 갖지 않는 것을 의미한다.
필요에 따라, 상기 조성물은 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물, 예를 들면 화합물 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및/또는 CE-108B(Ⅰ-1b), 리모시딘 C(Ⅲa), CE-108(Ⅱb) 및 이들의 혼합물의 살생 활성을 강화시키거나 또는 활성의 범위를 증가시킬 수 있는 천연, 재조합 또는 합성 살생물질을 더 함유할 수 있다.
1.-치료상 적용
일반식(Ⅰ)의 화합물, 특히 화합물 리모시딘 B, CE-108B, 리모시딘 C 및 CE- 108C이 적용되는 중요 분야는 인간 및 동물의 건강이다. 그러므로, 특정 실시형태에 있어서, 본 발명은 일반식(Ⅰ)의 화합물, 및 이들 중에서 일반식(Ⅰ-1) 또는 (Ⅲ)의 화합물 또는 이들의 혼합물을, 선택적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 첨가제와 함께 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물은 화합물 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b) 및 이들의 혼합물에서 선택되고, 또한 일반식(Ⅲ)의 화합물은 리모시딘 C(Ⅲa), CE-108C(Ⅲb) 및 이들의 혼합물 중에서 선택된다.
본 명세서에서 사용되는 의미에 있어서, 표현 "약제학적으로 허용가능한 첨가제"는 약제학적 분야에 공지되어 있고, 투약의 약제학적 형태를 제조하는데 사용되고, 또한 보조제, 고체 또는 액체, 용제, 계면활성제 등을 함유하는 물질 또는 물질의 조합을 말한다.
필요에 따라, 상기 약제학적 조성물은 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물, 예를 들면 화합물 리모시딘 B 및/또는 CE-108B, 리모시딘 C, CE-108C 및 이들의 혼합물의 치료 작용을 강화시키거나 또는 이들 작용의 범위를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 치료제를 더 함유할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 에르고스테롤을 함유하는 세포막을 보유하는 인간 또는 동물의 병원성 유기체, 예를 들면 인간 또는 동물의 병원체인 기생충 및 진균에 의해 발생되는 감염을 예방 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다.
그러므로, 특정 실시형태에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 항기생충성 조성물이어서, 에르고스테롤을 함유하는 세포막을 보유하는 인간 또는 동물의 병원성 유기체, 예를 들면 트리파노소마, 리슈마니아 등에 의해 유발되는 감염의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다. 필요에 따라, 상기 항기생충성 조성물은 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물, 예를 들면 화합물 리모시딘 B, CE-108B, 리모시딘 C, CE-108C의 치료 작용을 강화시키고 이들의 작용 범위를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 항기생충제를 더 함유할 수 있다.
다른 특정 실시형태에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 항진균 조성물이고, 진균(세포막이 에르고스테롤을 함유)에 의해 유발되는 감염의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다. 필요에 따라, 상기 항진균 조성물은 일반식(Ⅰ)의 화합물, 예를 들면 리모시딘 B, CE-108B, 리모시딘 C, CE-108C의 치료 작용을 강화시키거나 또는 이들 작용의 범위를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 항진균제를 더 함유할 수 있다. 상기 항진균제의 예로는 암포테리신 B, 니스타틴, AB-400, 알릴아민(예를 들면, 테르비나핀, 나프타핀 등), 아모롤핀, 톨나프탈레이트 등의 폴리엔, 클로트리마졸, 미코나졸, 케트코나졸, 플루코나졸, 이트라코나졸 등의 아졸, 벤조푸란, 예를 들면 글리세오플라빈 등, 피리미딘, 예를 들면 플루오시토신 등이 열거되지만, 여기에 한정되는 것은 아니다.
일반식(Ⅰ)의 화합물, 및 이들 중에서 일반식(Ⅰ-1) 및 (Ⅲ)의 화합물은 치료학적으로 유효량, 즉 그것의 치료 효과를 발휘하는데 적절한 양으로 약제학적 조성물 중에 존재할 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 본 발명에 의해 제공되는 약제학적 조성물은 화합물 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b), 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)중에서 선택되는 화합물 및 이들의 혼합물과 같은, 일반식(Ⅰ)의 화합 물을 0.01중량% 내지 99.99중량%로 함유하고, 선택한 투약 경로, 예를 들면, 구강, 비경구 또는 국소에 따라 적절한 약제학적 투여 형태로 존재할 수 있다. 약의 약제학적 투약의 다른 형태 및 이들의 제조방법은, 예를 들면 Tratado de Farmacia Galenica, C. Fauli i Trillo, 제1판, 1993년, Luzan 5, S. A. de Ediciones에 기재되어 있다.
그러므로, 본 발명은 세포막이 에르고스테롤을 함유하는 인간 또는 동물의 병원성 진균, 예를 들면 인간 또는 동물 기생충 또는 인간 또는 동물의 병원성 진균에 의해 유발되는 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 약의 제조에 있어서, 일반식(Ⅰ) 및/또는 (Ⅲ)의 화합물을 사용하는 것에 관한 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ) 및/또는 (Ⅲ)의 화합물은 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b), 리모시딘 C(Ⅲa), CE-108C(Ⅲb) 및 이들의 혼합물 중에서 선택된다.
또한, 다른 형태에 있어서, 본 발명은 에르고스테롤을 함유하는 세포막을 보유하는 인간 또는 동물의 병원성 유기체, 예를 들면 인간 또는 동물의 병원체인 진균 및 기생충에 의해 유발되는 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법으로서, 본 발명에 의해 제공된 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 치료가 필요한 동물 또는 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.
2.-농업의 적용
일반식(Ⅰ)의 화합물, 및 이들 중에서 일반식(Ⅰ-1) 또는 (Ⅲ)의 화합물이 적용되는 다른 중요한 부문은 농업 부문으로의 적용이다. 이것에 관하여, 본 발명은 세포막이 에르고스테롤을 함유하는 식물병원균(Botrytis cinerea , Fusarium , oxysporum, Rhizoctonia solana , Rhizoctonia meloni , Ustilago maydis 등)에 의해 유발되는 감염을 억제하는데 유용한 항진균 조성물로서, 세포막이 에르고스테롤을 함유하는 각종 진균에 의해 발생되는 농산물의 보관 조건하에서의 진균 감염(수확 후 감염)을 예방 또는 억제하기 위해서, 화합물 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b), 리모시딘 C(Ⅲa), CE-108C(Ⅲb) 및 이들의 화합물 중에서 선택되는 화합물 등의 일반식(Ⅰ) 및/또는 (Ⅲ)의 화합물을, 하나 이상의 농업적으로 허용가능한 불활성 매체와 함께 함유하는 항진균 조성물을 제공한다.
여기서 사용되는 용어 "억제"는 상기 진균의 제거 또는 이들에 의해 발생된 손상을 적게할 수 있는 포자의 발아 및/또는 진균 균사체의 성장을 저해, 감소 또는 정지시키는 것을 포함한다.
여기서 사용되는 표현 "농업적으로 허용가능한 불활성 매체"는 첨가제, 고체 또는 액체, 용매, 계면활성제 등을 포함하고, 대상의 화합물을 운반하는데 사용되는 농업 부문에서 알려진 물질 또는 물질의 조합을 말한다.
특정 실시형태에 있어서, 상기 진균성 조성물로는 상기 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅲ)의 화합물인 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b), 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb) 중에서 선택되는 화합물 및 이들의 혼합물 이외에, 항진균 활성을 지닌 하나 이상의 화합물, 예를 들면 진균의 세포막을 변경시키는 하나 이상의 화합물, 또는 상술한 화합물 등의 에르고스테롤의 합성을 저해하는 하나 이상의 화합물, 또는 세포벽의 변성 또는 열화에 필요한 효소 활성을 지닌 하나 이상의 화합물, 예를 들면 셀룰로오스 분해 활성, 만나놀 분해 활성, 키틴 분해 활성 또는 단백질 분해 활성을 가진 효소와 같은 진균의 세포벽을 변성 또는 열화시킬 수 있는 하나 이상의 용해 효소(예를 들면, 셀룰라제, α-(1,3)-글루카나제, β-(1,6)-글루카나제, β-(1,3)-글루카나제, 만나나제, 엔도- 또는 엑소-키티나제, 키토사나제, 프로테아제, α- 또는 β- 만노시다제 등)이 열거된다.
일반식(Ⅰ) 및/또는 일반식(Ⅲ)의 화합물은 유효한 항진균량, 즉 병원성 진균에 의해 유발되는 감염을 억제하는데 적절한 양으로 항진균 조성물에 존재할 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 본 발명에 의해 제공된 유용한 항진균 조성물은 상기 일반식(Ⅰ) 및/또는 (Ⅲ)의 화합물, 예를 들면 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b), 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)를 0.01중량% 내지 100중량% 함유한다. 상기 조성물은 종래의 방법에 의해 제조할 수 있고, 액체 또는 고체 형태, 예를 들면 과립상으로 존재할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 첨가제, 예를 들면 그것의 보존 및 안정성을 연장시키는 보존제 및 안정화제를 함유할 수 있다.
상기 항진균 조성물은, 예를 들면 식물 및/또는 과일에 있어서의 병원성 진균에 의해 유발되는 감염을 억제하는데 사용할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 식물에 있어서의 병원성 진균, 특히 세포막이 에르고스테롤을 함유하는 병원성 진균에 의해 유발되는 감염을 억제하는 방법으로서, 상기 조성물을 상기 식물 또는 그것을 둘러싼 매개체에 적용하여 병원성 진균을 억제하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 방법은 상기 조성물을 병원성 진균에 의한 진균 감염을 예방 및/또는 치료할 목적으로 식물의 지상부에 적당량으로 적용하는 것을 포함한다.
본 발명은 과일에 있어서의 병원성 진균, 특히 세포막이 에르고스테롤을 함유하는 병원성 진균에 의해 유발되는 감염을 억제하는 방법으로서, 상기 과일에 상기 조성물을 적용하여 병원성 진균을 억제하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 조성물의 적용은 채집 전(수확 전)에 과일에 적당량으로 행하는 반면, 또 다른 실시형태에서는 상기 조성물의 적용을 이미 채집한(수확 후) 과일에 행한다.
3.-식품으로의 적용
일반식(Ⅰ) 및/또는 일반식(Ⅲ)의 화합물, 특히 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b), 리모시딘 C(Ⅲa), CE-108C(Ⅲb)는 식품 부문에도 적용한다. 이것에 관하여, 본 발명은 가공식품, 예를 들면 치즈 등의 유제품과 같은 가공 식품의 표면에서 발현할 수 있는 진균을 억제하는데 유용한 항진균 조성물로서, 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b), 리모시딘 C(Ⅲa), CE-108C(Ⅲb) 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 화합물 등의 일반식(Ⅰ)의 화합물을, 필요에 따라 리포좀 현탁액, 수중 현탁물 등의 식품의 관점에서 하나 이상의 허용가능한 불활성 매체와 함께 함유하는 항진균 조성물을 제공한다.
용어 "억제"는 포자의 발아 및 진균 균사체의 성장을 저해, 감소 또는 정지시키는 것을 포함하며, 이것은 이들에 의한 손상을 현저히 적게 할 수 있고; 이 방법으로 진균의 성장에 의한 식품의 부패를 방지 또는 처리할 수 있다.
용어 "식품의 관점에서 허용가능한 불활성 매체"는 첨가물, 고체 또는 액체, 용제, 계면활성제 등을 포함하고 대상의 화합물을 운반하는데 사용되는 식품 부문 에서 알려진 물질 또는 물질의 조합을 말한다.
특정 실시형태에 있어서, 상기 향진균 조성물로는, 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물인 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b), 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb) 중에서 선택되는 화합물 및 이들의 혼합물 이외에, 하나 이상의 항진균 활성을 갖는 화합물, 예를 들면 진균의 세포막을 변경시키는 하나 이상의 화합물, 또는 상술한 화합물 등의 에르고스테롤의 합성을 저해하는 하나 이상의 화합물, 또는 세포벽의 변성 또는 열화에 필요한 효소 활성을 지닌 하나 이상의 화합물, 예를 들면 셀룰로오스 분해 활성, 만나놀 분해 활성, 키틴 분해 활성 또는 단백질 분해 활성을 지닌 효소 등의 진균의 세포벽을 변성 또는 열화시킬 수 있는 하나 이상의 용해 효소(예를 들면, 셀룰라아제, α-(1,3)-글루카나제, β-(1,6)-글루카나제, β-(1,3)-글루카나제, 만나나제, 엔도- 또는 엑소-키티나제, 키토사나제, 프로테아제, α- 또는 β- 만노시다아제 등)가 열거된다.
일반식(Ⅰ)의 화합물은 유효한 항진균량, 즉 가공식품에 발현할 수 있는 진균에 의해 유발되는 감염을 억제하는데 적절한 양으로 항진균 조성물 중에 존재할 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 본 발명에 의해 제공된 가공 식품에 발현할 수 있는 진균에 의해 유발되는 감염을 억제하는데 유용한 상기 항진균 조성물은 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물, 예를 들면 상기 화합물 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b), 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)를 0.01중량% 내지 100중량% 함유한다. 상기 조성물은 종래의 방법에 의해 제조될 수 있고, 액상 또는 고상, 예를 들면 과립상으로 존재할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 첨가제, 예를 들면 그것의 보존 및 안정성을 연장시키는 보전제 및 안정화제를 함유할 수 있다.
상기 항진균 조성물은 가공 식품, 예를 들면 가공 식품의 표면에 발현할 수 있는 진균을 억제하는데 사용할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 가공 식품에 발현할 수 있는 진균에 의해 유발되는 감염, 특히 세포막이 에르고스테롤을 함유하는 가공 식품에 발현할 수 있는 진균에 의해 유발되는 감염을 억제하는 방법으로서, 상기 조성물을 상기 가공 식품 또는 그것을 둘러싼 매개체에 적용하여 가공 식품에 발현할 수 있는 진균을 억제하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 방법은 진균의 성장에 의해 발생하는 식품의 부패를 예방 및/또는 처리할 목적으로 가공 식품의 표면 상에 상기 조성물을 적용하는 것을 포함한다. 상기 항진균 조성물은 가공 식품의 표면에 외용된다.
신규의 아미드화 폴리엔을 얻는 방법
일반식(Ⅰ)의 화합물, 및 이들 중에서 일반식(Ⅰ-1)의 화합물, 보다 구체적으로 화합물 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및/또는 CE-108B(Ⅰ-1b)은, 본 설명에 첨부된 실시예 1에 설명되고 표 1a에 열거한 바와 같이, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108 (Perez-Zuniga F.J., et al. (2004), J. Antibiot. (Tokyo) 57: 197-204)를 본 명세서에서 각각 pSM743B 및 pSM784로 특정되는 플라스미드로 형질 전환시켜서 얻어지는, 본 명세서에서 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/743B 및 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784로서 특정되는 재조합체 미생물, 또는 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/PM1-500(Seco E.M., et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366)을 pSM743B로 특정되는 플라스미드로 형질 전환시켜서 얻 어지는 본 명세서에서 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B로 특정되는 재조합체 미생물의 발효 배양균에 존재한다. 상기 화합물은 이들 발효 배양균으로부터 직접 얻을 수 있어서, 비교적 간편한 종래의 방법, 예를 들면 이온교환 컬럼 및/또는 소수성 상호작용 또는 역상 컬럼을 사용하여 용이하게 정제할 수 있다.
플라스미드 pSM743B (표 1a, 실시예 1) (도 1a)는 플라스미드 pIJ922로부터 유래하고, 유전자 rimA 및 에리트로마이신 내성 유전자(ermE)를 포함한다. 플라스미드 pSM748 (표 1a, 실시예 1) (도 1b)는 플라스미드 pIJ941로부터 유래하고, 에리트로마이신 내성 유전자 (ermE)를 포함한다.
상기 플라스미드 pIJ922 및 pIJ941 (Lydiate D.J. et al., 1985, Gene 35: 223-235)는 복제단위 SCP2*로부터 유래된 벡터이고, 스트렙토마이세스 코엘리컬러(coelicolor)로부터 유래하는 복제수가 적은 플라스미드이다.
그러므로, 다른 형태에서, 본 발명은 일반식(Ⅰ)의 화합물의 제조가 가능한 조건하에서 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/743B, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B, 및 이들의 조합 중에서 선택된 미생물을 배양하고, 필요에 따라 이들 화합물을 분리 및 정제하는 것을 포함하는 일반식(Ⅰ-1)의 화합물의 제조방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 일반식(Ⅰ)의 화합물은 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b)에서 선택되는 화합물 및 이들의 혼합물이다.
상술한 바와 같이, 폴리엔에 있어서의 아미드기의 형성은 아미도트랜스퍼라제에 의한 "수식" 활성에 기인한다. 기질로서 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)를 사용하여 아미드화 폴리엔의 생산자의 무세포 추출물로 체외 아미드화 시험에 의해서, 아미드기의 형성은 사실상 ATP/Mg++ 의존 아미도트랜스퍼라제 활성에 의한 것이고, 아미드기의 공여체로서 글루타민을 사용할 수 있다고 결론낼 수 있다(실시예 2 및 단락 B 참조). 스트렙토마이세스 sp. RGU5.3의 무세포 추출물로 행한 동일한 시험에 의해서, AB-400(Ⅳb), 피마리신(Ⅳa)의 아미드화가 피마리신(Ⅳa)의 유리 카르복실기 상에서 작용하여 이것을 ATP/Mg++ 의존성인 반응에서 아미드기로 변환시키는, S. 디아스타티쿠스 var. 108과 매우 유사한 아미도페라아제 활성에 의해서 발생하는 것을 확인할 수 있다.
또한, S. 디아스타티쿠스 var. 108의 유전자 재조합의 무세포 추출물에 존재하는 아미도트랜스퍼라제 활성은, 천연 기질 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)를 이들의 상응하는 아미드 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b)으로 변성시킬 수 있을 뿐만 아니라 피마리신(Ⅳa)과 같은 이종 기질도 인식할 수 있는 기질에 대하여 완화된 선택성을 나타낸다. 이것은 상기 시험 조건하에서 기질로서 피마리신(Ⅳa)만을 인식할 수 있었던 스트렙토마이세스 sp. RGU5.3의 아미도트랜스퍼라제 활성에 대해서는 일어나지 않았다.
유리 카르복실기는 암포테리신 B, 니스타틴, 피마리신(Ⅳa), 칸디시딘 등의 대표적인 폴리엔의 대부분에 있어서 매우 잘 보존된다. 아미드기에 대한 이들 카르 복실기의 치환은 물에서 용해도가 크고, 항진균 활성이 높고 용혈 활성이 낮은 약제학적 특성이 개선된 아미드화 폴리엔을 생성할 수 있다. 간단히 말해서, 상기 화합물은 진균에 대하여 보다 큰 선택적 독성을 나타낸다.
그러므로, 이 형태에 있어서, 본 발명은 하기 단계에 의해서 아미드화 폴리엔의 산생균의 무세포 추출물을 사용하여 거대 락톤환에서 유리 카르복실화된 기를 가진 폴리엔으로부터 아미드화 폴리엔을 얻기 위한 효소법, 이하 본 발명의 효소법을 제공한다:
a) 정제되거나 또는 정제되지 않은 유리 카르복실화기를 가진 폴리엔 또는 수종의 혼합물로 이루어진 기질과 산생균 또는 아미드화 폴리엔의 균주으로부터 유래한 단백질 추출물의 혼합물을 준비하는 단계,
b) ATP/Mg++ 의존성이고 아미드기 공여체로서 글루타민을 사용할 수 있는 조건하에서 a)의 혼합물을 반응시키는 단계,
c) 아미드화 폴리엔을 정제시키는 단계.
본 발명의 특정 목적은, 얻어지는 아미드화 폴리엔이 CE-108B(Ⅰ-1b), 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 또는 이들의 혼합물이고, a)의 기질 폴리엔은 정제되거나 또는 정제되지 않은 CE-108(Ⅱb), 리모시딘(Ⅱa) 또는 이들의 혼합물이고, 또한 a)의 추출물은 하기 균주: S. 디아스타티쿠스 var. 108/784 및 S. 디아스타티쿠스 var. 108/743B로부터 얻어지는 본 발명의 효소법으로 이루어진다.
본 발명의 다른 특정 목적은, 얻어지는 아미드화 폴리엔이 AB-400(Ⅳb)이고, a)의 기질 폴리엔은 정제되거나 또는 정제되지 않은 피마리신(Ⅳa)이고, 또한 a)의 추출물은 하기 균주: S. 디아스타티쿠스 var. 108/784 및 S. 디아스타티쿠스 var. 108/743B로부터 얻어지는 본 발명의 효소법으로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 특정 목적은, 얻어지는 아미드화 폴리엔이 AB-400(Ⅳb)이고, a)의 기질 폴리엔은 정제되거나 또는 정제되지 않은 피마리신(Ⅳa)이고, 또한 a)의 추출물이 균주 스트렙토마이세스 sp. RGU5.3으로부터 얻어지는 본 발명의 효소법으로 이루어진다.
다른 형태에 있어서, 본 발명은 "체외"에서 카르복실화 폴리엔을 본 발명의 효소법을 시작하는데 필요한 그 상응하는 아미드로 변환시킬 수 있는, 아미드화 폴리엔의 생산자이고 아미도트랜스퍼라제의 활성 담체의 무세포 추출물에 관한 것이다.
무세포 추출물은 여러 기계적 방법(취급 단백질의 분야에 통상 적용됨)에 의해 세포의 균질화로부터의 추출물이고, 후에 여과 또는 원심분리에 의해 분획되어 대부분의 세포 성분을 현탁액 또는 용액으로 함유하는 정제된 생성물을 갖는다.
다른 특정 형태에 있어서, 본 발명은 아미드화 폴리엔 CE-108B(Ⅰ-1b) 및 리모시딘 B(Ⅰ-1a)의 생산자이고, 다른 이종 기질 뿐만 아니라 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)을 그 상응하는 아미드로 변환시키는 능력을 지닌 아미도트랜스퍼라제 활성 담체인 미생물 S. 디아스타티쿠스 var. 108/743B, S. 디아스타티쿠스 var. 108/784(DSM 17187)의 무세포 추출물 및 시험 조건하에서 적어도 피마리딘(Ⅳa)을 그 상응하는 아미드화 폴리엔 AB-400(Ⅳb)으로 변환시킬 수 있는 아미드화 폴리엔 AB-400(Ⅳb)의 생산자인 미생물 스트렙토마이세스 sp. RGU5.3의 무세포 추출물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 효소법은 당업자에게 알려진 고정계의 분야의 기술에 따라 그 상응하는 유동상과 반응하는 성분을 유동시키는 고체 지지체 상에 고정된 무세포 효소계(본 발명의 무세포 추출물)를 사용하는 종래 방법을 사용하여 행할 수 있다.
신규의 메틸화 폴리엔을 얻기 위한 방법
일반식(Ⅲ)의 화합물, 특히 화합물 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)는 재조합 파지 PM1-768 (표 1b, 실시예 2 참조)으로 이종 재조합체를 사용한 유전자 rimG의 분열에 의해서 또한 표 1a, 실시예 1에 나타낸 바와 같이 균주 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/743B로부터 접합에 의한 플라스미드 pSM743B의 전이에 의해서 얻어지는 본 명세서에서 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B로 특정되는 재조합체 미생물의 발효 배양균에 존재한다. 유전자 rimG의 분열을 발생시키기 위한 단편과 극성 효과를 피하기 위한 완전한 유전자 rimA에 포함된 단편 모두를 데옥시리보핵산(DNA)을 증폭시키는 종래 기술을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 얻을 수 있다. 상응하는 증폭을 위해서 Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultren GmbH (DSMS), Braunschweig, Germany (액세스 번호 DSM 17187)에 위치한 균주을 사용할 수 있다. 상응하는 벡터는 상술한 균주 DSM 17187에 종래 기술(형질 전환, 트랜스펙션, 접합 등)을 사용하여 도입할 수 있다.
본 발명에 있어서, 재조합 파지 PM1-768은 파지 PM1으로부터 얻었고, 이것은 극성이 하류에 위치한 유전자에 영향을 미치는 것을 회피하기 위해서, 그 단편은 유전자 rimG 내부에 복제되었고 프로모터 ermE p 가 도입되었고(프로모터는 유전자 발현을 위한 스트렙토마이세스의 취급시 널리 사용된다: Kieser et al. 2000, Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, UK); 최종 구성에 도달할 때 까지의 중간 복제가 실시예 2의 표 1b에 기재되어 있고, 상술한 바와 같이 스트렙토마이세스 분야의 당업자에 의해 용이하게 얻을 수 있다.
상기 화합물 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)는 미생물 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B의 발효 배양균으로부터 직접 얻을 수 있고, 비교적 간편한 종래 기술, 예를 들면 소수성 상호작용 또는 역상 컬럼에 의해서 용이하게 정제된다.
그러므로, 다른 형태에 있어서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 일반식(Ⅲ)의 화합물의 제조방법에 관한 것이다:
- 일반식(Ⅲ)의 화합물을 제조할 수 있는 조건하에서 미생물 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B을 배양하는 단계;
- 발효 배양균를 얻는 단계, 필요에 따라,
- 이들 화합물 일반식(Ⅲ)을 분리 및 정제하는 단계.
특정 실시형태에 있어서, 이 방법은 리모시딘 C(Ⅲa), CE-108C 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 일반식(Ⅲ)의 화합물을 얻기 위해서 행한다.
재조합체 미생물을 위한 배양 배지는 일반적으로 하나 이상의 탄소원, 하나 이상의 질소원, 미생물에 의해 동화될 수 있는 하나 이상의 무기염 및, 필요에 따라 수용성 배지에 용해되는 비타민 및 아미노산 등의 하나 이상의 영양소로 이루어진다. 적절한 조건(폭기/교반, 온도 및 발효 시간, 단계 등)을 지닌 상기 배지는 당업자에게 알려져 있다. 이들 재조합체 미생물을 성장시키기 위한 매체 및 조건은 본 발명의 실시예 2에 설명되어 있지만("실험 방법" 부분), 이것에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합체 미생물 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B의 발효 배양균 또는 이들의 기능적 등가물은 일반식(Ⅲ)의 화합물, 예를 들면 리모시딘 C(Ⅲa), CE-108C(Ⅲb) 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 화합물을 함유하고, 그대로 사용하거나, 또는 종래 방법으로 더 처리하여, 분리될 수 있는 대상 화합물을 분리할 수 있다. 그 예로서, 특히 실시형태에 있어서, 세포 배양균은 원심분리되어 상청액과 세포 추출물로 분리되고, 상기 상청액을 사용하여 아미드화 또는 비아미드화된 목적하는 폴리엔을 분리하고, 필요에 따라 정제한다. 이들 화합물의 물리화학적 특성의 연구는 당업자가 상청액으로부터 이들의 정제 시작하는 방법을 설계할 수 있게 한다.
재조합체 미생물 및 적용
1. 아미드화 폴리엔을 얻는데 관련된 재조합체 미생물 및 적용
재조합체 미생물 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/743B, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784 및 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B는 본 발명의 일부를 형성한다. 그러므로, 다른 형태에 있어서, 본 발명은 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/743B, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784 및 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B 중에서 선택되는 미생물에 관한 것이고, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/743B, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784 및 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B 및 이들의 조합 중에서 선택되는 미생물의 배양균을 제공한다.
또한, 본 발명은 일반식(Ⅰ)의 화합물, 바람직하게는 일반식(Ⅰ-1)의 화합물을 얻는 것에 있어서, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/743B, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784 및 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B 및 이들의 조합에서 선택되는 미생물, 또는 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/743B, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784 및 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B 및 이들의 조합에서 선택되는 상기 미생물의 배양균의 사용에 관한 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 일반식(Ⅰ-1)의 화합물은 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b) 및 이들의 혼합물에서 선택된다.
또한, 본 발명자에 의해 행해진 시험은 상기 재조합체 미생물 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/743B, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784 및스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B의 발효 배양균은 아미드화 폴리엔 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및/또는 CE-108B(Ⅰ-1b) 이외에, 유리 카르복실기를 갖는 비아미드화 폴리엔 리모시딘(Ⅱa) 및/또는 CE-108(Ⅱb)도 함유한 다는 것을 발견하였다.
그러므로, 다른 형태에 있어서, 본 발명은 일반식(Ⅰ)의 화합물, 리모시딘(Ⅱa), CE-108(Ⅱb) 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 화합물의 제조방법으로서, 일반식(Ⅰ)의 화합물, 리모시딘(Ⅱa), CE-108(Ⅱb) 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 화합물을 제조할 수 있는 조건하에서 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/743B, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784 및 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B 중에서 선택되는 미생물 및 이들의 조합을 배양하고, 필요에 따라 상기 화합물을 분리 및 정제하는 것으로 이루어지는 제조방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 일반식(Ⅰ)의 화합물은 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b) 및 이들의 혼합물 중에서 선택된다.
스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/743B, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784 및 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B 및 이들의 조합중에서 선택되는 미생물의 발효 배양균은 일반식(Ⅰ)의 화합물, 리모시딘(Ⅱa), CE-108(Ⅱb) 및 이들의 혼합물에서 선택되는 화합물로 이루어지고, 잠재적으로 살생물제로서 유용할 수 있으며 본 발명의 추가적인 형태를 구성한다. 특정 실시형태에 있어서, 일반식(Ⅰ)의 화합물은 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b) 및 이들의 혼합물 중에서 선택된다.
상기 재조합체 미생물의 배양 배지는 일반적으로 하나 이상의 탄소원, 하나 이상의 질소원, 미생물에 의해 동화될 수 있는 하나 이상의 무기염 및, 필요에 따라 수용성 매체에 용해되는 비타민 및 아미노산 등의 하나 이상의 영양소로 이루어 진다. 적절한 조건(폭기/교반, 온도 및 발효 시간, 단계 등)을 지닌 상기 매체는 당업자에게 알려져 있다. 이들 재조합체 미생물을 성장시키기 위한 매체 및 조건은 실시예 2("실험 방법" 부분)에 설명되어 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/743B, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784 및 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B 및 이들의 조합 중에서 선택되는 상기 재조합체 미생물의 발효 배양균은 일반식(Ⅰ)의 화합물, 예를 들면 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b), 리모시딘(Ⅱa), CE-108(Ⅱb) 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 화합물을 함유하고, 그대로 사용하거나, 또는 더 처리하여 종래 방법으로 분리될 수 있는 대상 화합물을 분리하기 위한 처리를 할 수 있다. 예로서, 특정 실시형태에 있어서, 세포 배양균은 원심분리되어 상청액과 세포 추출물을 분리되고, 그 상청액을 사용하여 아미드화 또는 비아미드화된 목적하는 폴리엔을 분리하고, 필요에 따라 정제한다. 이들 화합물의 물리화학적 특성의 연구는 당업자가 상청액으로부터 이들의 정제 시작 방법을 설계할 수 있게 한다.
2. 메틸화 폴리엔을 얻는데 관련된 재조합체 미생물 및 적용
미생물 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B 또는 다른 기능적 등가물은 본 발명의 일부를 형성한다. 그러므로, 다른 형태에 있어서, 본 발명은 일반식(Ⅲ)의 화합물을 얻는 방법을 수행하는데 유용하고, 이들 미생물의 배양균을 제공하는 미생물 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B 또는 기능적 등가물에 관한 것이다. 본 발명의 특정 실시형태는 메틸화 폴리엔 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)의 생산자인 미생물 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B(기탁 번호: DSM 17482)로 이루어 진다.
본 발명에서 사용되는 용어 "기능적 등가물"은 구성 요소인 미생물, 벡터, 유전자 구성 또는 유전자 단편이고, 경우에 따라 유전자의 분열 방법, 세포 또는 미생물의 유전자 형질 변형 방법을 말하고, 달리 존재하는 대안으로 당업자에 의해 개발될 수 있고 본래 언급한 구성 요소와 동일 또는 상응하는 특성을 갖는다.
그래서, 본 설명 및 예에 있어서, "기능적 등가물"은 불활성 삽입 대신에 유전자 rimG의 염색체 결실 또는 다른 기술에 의해 얻을 수 있는 재조합체 미생물일 수 있다: 상기 결실은 비복제성 플라스미드 또는 본래의 열민감성 복제를 갖는 복제성 플라스미드 중 어느 하나의 종래 벡터를 사용함으로써 용이하게 행할 수 있다. 이들 결실 또는 삽입은 당업자에 의해 행할 수 있다.
또한, 본 발명은 일반식(Ⅲ)의 화합물을 얻기 위해, 미생물 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B 또는 이것의 기능적 등가물을 사용하는 것에 관한 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 일반식(Ⅲ)의 화합물은 리모시딘 C(Ⅲa), CE-108C(Ⅲb) 및 이들의 혼합물에서 선택된다.
소정의 적용에 있어서, 본 발명의 방법으로 얻어진 발효 배양균은 본 발명의 화합물 정제를 필요로 하지 않고 일정한 살생물질 용액을 제조하는데 직접 사용할 수 있다. 그래서, 일반식(Ⅲ)의 화합물을 함유하는 상술한 미생물 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B 또는 이것의 기능적 등가물의 발효 배양균은 잠재적으로 살생물질로서 유용하고 본 발명의 추가적 형태를 구성한다.
벡터 및 적용
1. 아미드화 폴리엔의 도입에 관련된 벡터 및 적용
에리스로마이신 내성 유전자가 복제된 벡터 pIJ941로부터 유래된 플라스미드 pSM784를 S. 디아스타티쿠스 var. 108에 도입하는 경우, 이것은 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb) 뿐만 아니라 신규의 아미드화 폴리엔 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b)의 생산자인 균주(S. 디아스타티쿠스 var. 108/784)가 생성된다.
또한, 유전자 ermE 및 담체 뿐만 아니라 스트렙토마이세스 할스테디(Streptomyces halstedii) JM8의 자일라나제의 유전자의 프로모터 xysA ( xysAp ) (Ruiz-Arribas A., et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol, 63: 2983:2988)와 같은 내재성 또는 외재성 프로모터 하에서 발현되는 클러스터 rim(유전자 rimA 포함)의 단편의 벡터 SCP2*로부터 유래된 플라스미드 pSM743B를 S. 디아스타티쿠스 var. 108 또는 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500에 도입하는 경우, 아미드화 폴리엔[리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b)]과 비아미드화 폴리엔 [리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)] 모두의 총 생산에 있어서 증가가 관찰된다. 이 사실은 상기 폴리엔의 다른 생산 유기체에서 카르복실기를 가진 폴리엔 및/또는 아미드화 폴리엔의 총 생산을 증가시키는데 사용할 수 있다.
그러므로, 다른 형태에 있어서, 본 발명은 하기 중에서 선택되는 벡터, 이하 본 발명의 벡터에 관한 것이다:
a) SCP2*의 복제 기점 및 에리스로마이신 내성 유전자 ermE를 포함하는 벡터 SCP2* 또는 이것의 단편으로부터 유래한 벡터;
b) (ⅰ) 벡터 SCP2*의 복제 기점; (ⅱ) 유전자 ermE, 및 (ⅲ) 벡터 SCP2*의 단편을 포함하는 벡터;
c) (ⅰ) 복제 기점, (ⅱ) 유전자 ermE, 및 (ⅲ) 벡터 SCP2*의 단편을 포함하고, 상기 복제 기점이 SCP2*의 복제 기점과 다른 벡터;
d) 복제 기점이 결여되어 있고, 유전자 ermE 및 벡터 SCP2*의 단편을 포함하는 벡터;
e) (ⅰ) 복제 기점, (ⅱ) 유전자 ermE, 및 (ⅲ) 폴리엔의 전체 생합성 클러스터 또는 상기 클러스터의 단편을 포함하는, 벡터 SCP2*로부터 유래한 벡터;
f) (ⅰ)복제 벡터 SCP2와 동일하거나 다른 복제 기점, (ⅱ) 유전자 ermE, 및 (ⅲ) 벡터 SCP2*의 단편; 및 (ⅳ) 폴리엔의 전체 생합성 클러스터 또는 상기 클러스터의 단편을 포함하는, 벡터 SCP2*로부터 유래한 벡터;
g) 복제 기점이 결여되어 있고, 유전자 ermE 및 폴리엔의 전체 생합성 클러스터 또는 상기 클러스터의 단편을 포함하는 벡터; 및
h) 복제 기점이 결여되어 있고, (ⅰ) 유전자 ermE, (ⅱ) 벡터 SCP2*의 단편, 및 (ⅲ) 폴리엔의 전체 생합성 클러스터 또는 상기 클러스터의 단편을 포함하는 벡 터.
특히 벡터 SCP2*에서 유래한 벡터, 예를 들면 pIJ922, pIJ941 등의 어느 것을 사용해도 좋다. 유전자 ermE는 공지된 유전자이다(Uchiyama et al. (1985) Gene 38: 103-110). 여기서 사용하는 표현 "벡터 SCP2*의 단편"은 아미드화 폴리엔의 형성을 유도하는데 충분한 하나 이상의 SCP2*의 단편으로 이루어진 핵산을 말하고, 본 발명자에 의해 행해진 시험에서 유전자 ermE과 함께 하나 이상의 벡터 SCP2*의 단편으로 이루어진 핵산은 아미드화 폴리엔이 재조합체 미생물에서 생성될 수 있을 정도로 필요충분하다는 것을 발견하였다.
특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 벡터는 SCP2*의 복제 기점을 포함하는 SCP2*로부터 유래한 복제 벡터이고, 또한 유전자 ermE의 담체, 예를 들면 pSM784이다. 상기 플라스미드는 상응하는 아미드화 폴리엔의 제조를 목적으로 유리 카르복실기를 갖는 폴리엔 마크로라이드의 미생물(예를 들면 암포테리신 B, 니스타틴, 피마리신, 캔디시딘 등)의 생산에 있어서 종래의 방법(예를 들면 형질 전환, 전기천공법, 접합 등)에 의해 도입될 수 있다. 이러한 미생물의 실례로는 S. 노르우세이, S. 알비더스, S. 리모수스 S. 노도수스 S. 나탈렌시스, S. 카타노오겐시스, S. 그리세우스 등이 열거되지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.
다른 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 벡터는 SCP2*의 복제 기점, 유전자 ermE 및 벡터 SCP2*의 단편을 포함하는 복제 벡터이다.
다른 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 벡터는 SCP2*의 복제 기점과 다른 복제 기점, 유전자 ermE, 및 벡터 SCP2*의 단편을 포함하는 복제 벡터이다.
다른 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 벡터는 복제 기점이 없고 유전자 ermE 및 벡터 SCP2*의 단편을 포함하는 통합 또는 비복제 벡터이다.
다른 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 벡터는 SCP2*의 복제 기점과 동일하거나 다른 복제 기점, 유전자 ermE 및 폴리엔의 전체 생합성 클러스터 또는 상기 클러스터의 단편을 포함하는 복제 벡터이다.
다른 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 벡터는 SCP2*의 복제 기점, 유전자 ermE, 벡터 SCP2*의 단편 및 폴리엔의 전체 생합성 클러스터 또는 상기 클러스터의 단편을 포함하는 복제 단편이다.
다른 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 벡터는 복제 기점이 없고 유전자 ermE, 및 폴리엔의 전체 생합성 클러스터 또는 상기 클러스터의 단편을 포함하는 통합 또는 비복제 벡터이다.
다른 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 벡터는 복제 기점이 없고 유전자 ermE, 벡터 SCP2*의 단편, 및 폴리엔의 전체 생합성 클러스터 또는 상기 클러스터의 단편을 포함하는 통합 또는 비복제 벡터이다.
유리 카르복실기를 갖는 폴리엔의 미생물을 형질 전환하여 생산하기 위해 폴리엔의 전체 생합성 클러스터 또는 이것의 단편을 포함하는 본 발명의 벡터가 사용되는 경우, 상기 벡터는 폴리엔의 유기체 생산에 있어서 카르복실기를 갖는 폴리엔 및/또는 아미드화 폴리엔의 총 생산을 증가시키는데 사용할 수 있으므로, 아미드화 폴리엔의 생산 및/또는 아미드화 폴리엔과 비아미드화 폴리엔 모두의 총 생산의 증가가 관찰된다.
실질적으로 어느 생합성 클러스터 또는 그 단편이 본 발명의 벡터에 존재할 수 있지만, 특정 실시형태에 있어서, 상기 벡터는 리모시딘의 전체 생합성 클러스터 rim를 포함한다(Seco E.M., et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366). 클러스터 rim의 어느 단편을 사용해도 좋지만, 특정 실시형태에 있어서, 상기 클러스터 rim의 단편은 클러스터 rim의 유전자 rimA을 포함한다.
상기 폴리엔의 생합성 클러스터 또는 그 단편은 프로모터의 조절하에서 선택적으로 형성될 수 있다(즉, 상기 프로모터가 유전자의 발현을 조절하도록 하는 방식으로 유효하게 결합됨). 상기 프로모터는 내재성 또는 외재성이어도 좋다. 나중에 벡터와 함께 형질 전환하기 위해 미생물에서 기능하는 어느 외재성 프로모터를 실질적으로 사용할 수 있지만, 특정 실시형태에 있어서, 상기 외재성 프로모터는 스트렙토마이세스 할스테디 JM8의 자일라나제의 유전자의 프로모터 xysA ( zysAp ) 등의 스트렙토마이세스 sp.에 기능적인 프로모터이다(Ruiz-Arribas, A., et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol, 63: 2983-2988). 이러한 형태의 본 발명의 벡터의 예로는 플라스미드 pSM743B이 열거된다.
본 발명의 벡터는 당업자에게 알려진 종래 방법에 의해 얻을 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1998).
본 발명의 벡터는 유리 카르복실기를 갖는 벡터의 미생물을 생산함에 있어서 아미드화 또는 비아미드화 폴리엔을 생성하는데 사용할 수 있다. 또한, 한편으로는 (ⅰ) 클러스터 rim 등의 폴리엔의 생합성 클러스터 또는 그 단편을 포함하는 벡터, 및 다른 한편으로는 (ⅱ) 유전자 ermE를 포함하는 상기 SCP2*로부터 유래한 벡터, 또는 SCP2*와 다른 복제 기점, 유전자 ermE 및 벡터 SCP2*의 단편을 포함하는 벡터를 포함하는 벡터의 조합을, 폴리엔의 생산 마크로라이드의 미생물에 도입하여 상기 미생물에서 아미드화 또는 비아미드화 폴리엔을 생성한다.
그러므로, 다른 형태에 있어서, 본 발명은 상응하는 생성된 재조합체 미생물로부터 시작하는 상응하는 아미드화 폴리엔을 제조할 목적으로 종래의 방법으로 유리 카르복실기를 갖는 폴리엔 마크로라이드(예를 들면, 암포테리신 B, 니스타틴, 리모시딘, 피마리신, 캔디시딘 등)에 도입되는 본 발명의 벡터의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 벡터의 숙주로서 적절히 사용되는 미생물은 스트렙토마이세스 노도수스, 암포테리신 B의 천연 생산자, 스트렙토마이세스 리모수스, 리모시딘의 생산자, 스트렙토마이세스 그리세우스, 캔디시딘의 생산자; 스트렙토마이세스 나탈렌시스, 피마리신의 생산자; 스트렙토마이세스 노우르세이, 니스타틴의 생산자 등의 카르복실기가 존재하는 폴리엔의 미생물 생산에서 발견될 수 있다.
다른 형태에 있어서, 본 발명은 유리 카르복실기를 갖는 폴리엔 마크로라이드의 생산 미생물에 본 발명의 벡터를 도입하는 것으로 이루어지는 아미드기를 갖는 폴리엔 마크로라이드의 재조합체 생산 미생물을 얻기 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 아미드기를 갖는 폴리엔 마크로라이드의 재조합체 생산 미생물은, 유리 카르복실기를 갖는 폴리엔 마크로라이드의 생산 미생물에 도입하여 미생물에서 아미드화 또는 비아미드화 폴리엔을 발생할 수 있는, 한편으로는 (ⅰ) 클러스터 rim 등의 폴리엔의 생합성 클러스터 또는 그 단편을 포함하는 벡터, 및 다른 한편으로는 (ⅱ) 유전자 ermE를 포함하는 SCP2*로부터 유래한 벡터, 또는 SCP2*와 다른 복제 기점, 유전자 ermE 및 벡터 SCP2*의 단편을 포함하는 벡터의 조합을 유리 카르복실기를 갖는 폴리엔 마크로라이드의 생산 미생물에 도입함으로써 얻을 수 있다. 상기 본 발명의 벡터 또는 그 벡터의 조합을 미생물에 도입하는 것은 당업자에게 알려진 종래 기술, 예를 들면 형질 전환, 전기천공법, 접합 등에 의해 행할 수 있다. 유리 카르복실기를 갖는 폴리엔 마크로라이드의 생산 미생물의 실례로는 각종 스트렙토마이세스, 예를 들면 S. 노우르세이, S. 리모수스, S. 노도수스, S. 나탈렌시스, S. 그리세우스 등이 열거되지만, 여기에 한정되지 않는다.
상술한 바와 같이 얻어진 재조합체 미생물, 이하 본 발명의 재조합체 미생물은 본 발명의 일부를 구성하는 그 추가적인 형태를 구성한다.
다른 형태에 있어서, 본 발명은 상기 폴리엔 마크로라이드를 제조할 수 있는 조건하에서 본 발명의 재조합체 미생물을 배양하고, 필요에 따라 화합물을 분리 및 정제하는 것을 포함하는 폴리엔 마크로라이드의 제조방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 폴리엔 마크로라이드는 유리 카르복실기를 갖는 폴리엔 마크로라이드, 아미드기를 갖는 폴리엔 마크로라이드 및 이들의 혼합물 중에서 선택된다. 상기 아미드기를 갖는 폴리엔 마크로라이드 중 어느 하나는 화합물 AB-400(Ⅳb) 및 일반식(Ⅰ-1b)의 화합물, 예를 들면 화합물 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b), 및 이들의 혼합물에서 발견될 수 있다. 상술한 방법에 따라 얻을 수 있는 폴리엔 마크로라이드의 실례로는 일반식(Ⅰ)의 화합물, 예를 들면 피마리신(Ⅳa), AB-400(Ⅳb), 리모시딘(Ⅱa), 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108(Ⅱb), CE-108(Ⅰ-1a) 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 화합물이 열거되지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합체 미생물은 미생물의 발효를 위한 어느 적절한 배지에서 배양되고, 이들은 일반적으로 하나 이상의 탄소, 하나 이상의 질소원, 미생물에 의해 동화될 수 있는 하나 이상의 유기염, 및 필요에 따라 비타민 및 아미노산 등의 수성 배지에 용해되는 영양소를 함유하고, 미생물의 성장 및 폴리엔 마크로라이드의 생산을 위해 적절한 조건(폭기/교반, 온도 및 발효 시간, 단계 등)이 적용될 것이다. 얻어지는 폴리엔 마크로라이드는 필요에 따라 세포 추출물을 수집하게 전에 종래의 기술, 예를 들면 크로마토그래피법에 의해 회수될 수 있는 배양 배지에 유리하게 기밀된다. 목적하는 폴리엔 마크로라이드(s)는 그것/그들의 물리화학적 특정을 기초로 분리할 수 있고, 이것은 발효 공정 후의 배양 배지로부터 시작하는 정제를 설계할 수 있는 방법을 가능하게 한다.
2. 메틸화 폴리엔의 도입에 관련된 벡터 및 적용
또한 본 발명은 유전자 rimG 내부에 대한 DNA의 단편이 프로모터 ermE p 와 함께 복제된 액티노파지PM1 (Malpartida and Hopwood (1986) Mol. Gen. Genet. 205:66-73)에서 유래한 재조합 파지 PM1-768B의 사용에 관한 것이고; 유전자에 대한 내부 단편 앞의 프로모터는 삽입부 이후에 위치하는 유전자에 대한 극성효과를 피할 수 있다. 또한, DNA의 단편은 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)의 생산자의 염색체 DNA의 증폭에 의해 얻어지는 유전자 rimG에 대한 내부 단편 앞에 복제된 다른 스트렙토마이세스를 위한 프로모터 작용 기능을 포함하여 사용할 수 있고; 얻어진 구성체는 이 분야에서 사용되고 당업자에게 접근가능한 방법론에 따라 벡터 PM1 또는 스트렙토마이세스에 비복제성인(또는 복제성이지만 열민감성 복재 개시점의 플라스미드 등의 벡터가 복제되지 않는 배양 조건을 필요로 하는) 다른 벡터에 동일하게 복제될 수 있다. 비활성 삽입은 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)의 합성효소 폴리케티드의 모듈 7에 의해 도입된 메틸기측의 산화를 종료하기 위한 재조합능에만 영향을 주기 때문에, 재조합체 균주(스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/PM1-768) (또는 상술한 방법에 의해 생성될 수 있는 기능적 등가물)는 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)를 위한 생합성 경로의 매개 화합물의 생산자이어야 한다(상기 Seco et al. 2004, Chem. Biol). 그렇지만, 이들 개시 조건 하에서, 예상치 못한 방식으로, 유전자 rimG의 분열에 의해 폴리엔을 제조할 없는 재조합이 발생된다. 이것은 아마도 분열에 사용된 프로모터가 삽입부 다음에 위치한 유전자 rimA에 대한 극성 효과를 억제할 수 없는 것을 의미한다. 이러한 이유로, 유전자 rimA에 극성 효과가 없음을 확보하기 위해서, 상기 분열자는 염색체에 유전자 rimA의 분열을 보완할 수 있는, 플라스미드 pSM743B 또는 다른 기능적 등가물 벡터로 보완되어야 한다. 이렇게 하여 얻어진 유전자 재조합체는 분열 유전자 rimG의 다음에 위치하는 염색체 이외에, 플라스미드 pSM743B (또는 다른 기능적 등가물 벡터)에 유전자 rimA의 추가적인 복제물을 포함할 수 있다. 삽입의 결과로서 유전자 rimA의 염색체 복제물에 대한 임의의 극성 효과는 유전자 rimG에서 독점적으로 영향을 받는 재조합물을 발생시키는(거대 락톤환의 측면 메틸기의 산화) pSM743B(또는 다른 기능적 등가물 벡터)에서 복제된 다른 염색체 복제물에 의해 보완될 수 있다. 플라스미드 pSM743B (또는 다른 기능적 등가물 벡터)는 스트렙토마이세스의 취급에 통상 사용할 수 있는 다른 기술(원형질의 형질 전환, 주입, 접합 등)을 이용하여 이동할 수 있다. 상기 얻어진 균주(스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B 또는 상술한 바와 같은 다른 기능적 등가물)의 발효 배양균의 HPLC 분석에 의해, 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108(Ⅲb)의 생성은 확인하였지만, 부모 테트라엔스 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)는 확인되지 않았다. 필요에 따라, 유전자 rimG의 돌연변이는 스트렙토마이세스의 취급에 사용되는 종래 기술에 따라 유전자에 대한 rimG 내부 단편의 결실에 의해 행할 수 있다.
그래서, 본 발명은 메틸화 폴리엔 S. 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B 또는 그 등가물을 위한 본 발명의 산생균를 얻는 방법에 관한 것이고, 얻어진 균주가 유전자 rimG의 발현에 독점적으로 영향을 받고 하기 단계를 포함한다:
a) 미생물 S. 디아스타티쿠스 var. 108 또는 그것의 기능적 등가물의 유전자 rimG에서 상기 유전자의 분열 또는 결실에 의해 폴리엔을 제조할 수 없는 돌연변이를 얻는 단계, 및
b) 그 후에 상기 돌연변이의 염색체에서 유전자 rimA의 분열을 보완할 수 있는 벡터, 바람직하게는 플라스미드로 형질 전환하는 단계.
보다 구체적으로, 본 발명은 단계 a)의 돌연변이가 재조합 파지 PM1-768 또는 균주 S. 디아스타티쿠스 var. 108의 유전자 rimG의 분열 또는 결실을 발생시키기 위한 기능적 등가물인 다른 비활성계에 의해서 얻어지고, 재조합의 염색체에서 유전자 rimA의 가능한 극성 효과를 보완하기 위해서 단계 b)를 플라스미드 pSM743B (상술한 바와 같이 기능적 등가물 벡터)를 사용하여 행하는 본 발명의 미생물을 얻는 방법에 관한 것이다.
상기 특정 실시형태 이외에, 본 발명은 임의의 종래에 방법에 의해 다른 적절한 벡터를 사용하여 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108의 염색체에서 유전자 rimG의 분절에 대한 다른 형태에 관한 것이다. 상기 분절은 분열된 균주에서 직접 메틸화 폴리엔 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)를 생산할 수 있는 프로모터 ermEp * (Kieser et al. (2000) Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, UK) 등의 극성 효과를 피하기 위한 강한 프로모터를 사용하거나; 또는 임의의 벡터를 사용하여 외재성 프로모터의 조절하에서 상기 유전자 rimA의 발현에 의해서 유전자 rimA에 극성 효과를 보완하여 행할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 형태는 메틸화 유도체를 얻을 목적으로, 동일한 산화(상응하는 폴리엔의 메틸기로부터의 카르복실기의 형성)에 관련된 시토크롬 P450 모노옥시제나제를 위한 복제 유전자의 폴리엔의 다른 생산자 분열에 관한 것이다. 이것은 시토크롬 P450 모노옥시제나아제가 산화에 관련되어 있고, 지금까지 설명한 폴리엔의 생합성 클러스터에 암호화되어 있는 것을 설명한다 (Aparicio et al., 2003, Appl Microbiol Biotechnol 61: 179-188). 이 산화에 관련된 유전자에 대해서는 설명하였고, 피마리신, 암포테리신, 니스타틴 및 캔디시딘의 생합성을 위해 유전자 pimG (Aparicio et al., 2003, Chem. biol. 7: 895-905), amphN (Caffrey, et al., 2001, Chem. Biol. 8: 713-723), nysN (Brautaset et al., 2000, Chem. Biol. 7: 395-403) 및 canC (Campelo et al., 2000, Microbiology 148: 51-59)를 각각 언급할 수 있다. 이들 화합물의 메틸화 유도체는 본 발명의 리모시딘 C 및 CE-108C에서 설명한 메틸화 화합물의 개선된 기능, 즉 적은 독성 및 진균 및 기생충에 대한 보다 큰 선택성을 나타낸다.
그러므로, 다른 형태에 있어서, 본 발명은 종래의 방법(형질 전환, 접합, 전기 천공법, 감염 등)을 사용하여 유리 카르복실기를 갖는 폴리엔 마크로라이드의 생산 미생물에서, 유리 카르복실기의 형성에 관련된 시토크롬 P450 모노옥시제나아제를 위한 암호화 유전자 - 다른 균주에서 본 발명 rimG에서 설명한 유전자와 일치하는 유전자 - 를 분절하는 단계를 포함하는 메틸화 폴리엔 마크로라이드의 생산 미생물을 얻는 방법에 관한 것이다.
또한, 다른 형태에 있어서, 본 발명은 유리 카르복실기를 갖는 폴리엔 마크 로라이드의 생산 미생물에서 유리 카르복실기의 형성에 관련된 시토크롬 P450 모노옥시제나아제를 위한 암호화 유전자의 분열을 행하기 위한 임의의 벡터의 사용에 관한 것이고, 상응하는 메틸화 폴리엔을 제조할 목적에서, 그 예로는 암포테리신 B, 니스타틴, 리모시딘, 파미리신 및 캔디시딘 등이 열거되고, 본 발명의 범위가 이것에 한정하는 것은 아니다. 메틸기의 카르복실기로의 산화에 관련된 시토크롬 P450 모노옥시제나아제를 위한 암호화 유전자의 분절 결과로서 메틸화 폴리엔의 제조를 위해 사용하기에 적합한 미생물 중의 하나는, 실례로서 스트렙토마이세스 노도수스, 암포테리신 B의 천연 생산자, 스트렙토마이세스 리모수스, 리모시딘의 생산자, 스트렙토마이세스 그리세우스, 캔디시딘의 생산자; 스트렙토마이세스 나탈렌시스, 피마리신의 생산자; 스트렙토마이세스 노우르세이, 니스타틴의 생산자가 열거되지만, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한 본 발명은 매체로서 임의의 벡터(복제 플라스미드, 통합 플라스미드, 액티노파지 등)을 사용하여 임의의 종래 방법(형질 전환, 접합, 전기천공법, 감염 등)에 의해 도입되는 상응하는 유전자의 분열을 행하는 경우 극성 효과에 의해 영향을 받는 유전자의 적절한 발현에 관한 것이다. 유리 카르복실기를 갖는 폴리엔 마크로라이드의 생산 미생물의 실례로는 스트렙토마이세스의 종, 예를 들면 S. 노르우세이, S. 리모수스, S. 노도수스 S. 나탈렌시스 및 S. 그리세우스가 열거되지만, 여기에 한정되는 것은 아니다.
상술한 바와 같이 유전학적으로 취급되는 미생물, 이하 유전학적으로 취급되는 본 발명의 메틸화 폴리엔 마크로라이드의 동족 생산 미생물은, 본 발명의 일부 를 형성하고 그 추가형태를 구성한다.
다른 형태에 있어서, 본 발명은 상기 메틸화 폴리엔을 제조할 수 있는 환경하에서 유전학적으로 취급되는 본 발명의 미생물을 배양하고, 필요에 따라 상기 화합물을 분리 및 정제하는 것을 포함하는 메틸화 폴리엔 마크로라이드의 제조방법에 관한 것이고, 실례로서 하기 기: 메틸화 암포테리신 B, 메틸화 니스타틴, 메틸화 피마리신 및 메틸화 캔디시딘이 열거되지만, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 발명의 다른 목적은 이들 신규의 메틸화 폴리엔, 메틸화 암포테리신 B, 메틸화 니스타틴, 메틸화 피마리신 및 메틸화 캔디시딘으로 이루어지고, 이들은 리모시딘 C 및 CE-108C의 경우와 같은 약제학적 조성물 및 살생물제의 제조에 사용할 수 있다.
상기 유전학적으로 취급되는 미생물은 이들 미생물의 발효에 적합한 임의의 배지에서 배양되고, 일반적으로 하나 이상의 탄소원, 하나 이상의 질소원, 미생물에 의해 동화될 수 있는 하나 이상의 무기염, 필요에 따라 비타민 및 아미노산 등의 수성 배지에 용해되는 하나 이상의 영양소를 포함하고, 또한 미생물의 성장 및 폴리엔 마크로라이드의 제조를 위해 적절한 조건(폭기/교반, 온도 및 발효시간, 단계 등)이 적용될 것이다. 얻어지는 폴리엔 마크로라이드는 필요에 따라 세포 추출물을 수집하기 전에 종래의 기술, 예를 들면 크로마토그래피법에 의해 회수될 수 있는 배양 배지에 유리하게 기밀된다. 목적하는 폴리엔 마크로라이드(s)는 그것/그들의 물리화학적 특정을 기초로 분리할 수 있고, 이것은 발효 공정 후에 배양 배지로부터 시작하는 정제를 설계할 수 있는 방법을 가능하게 한다.
화합물 AB-400(Ⅳb)
화합물 AB-400(Ⅳb)인 피미라신 (Ⅳa)에 상응하는 아미드는 스트렙토마이세스 코스타에(Streptomyces costae) (Canedo L. M. et al. 2000, J., Antibiot. (Tokyo) 53: 623-626)에서 유래한 공지된 천연물이다.
AB-100(Ⅳb) 및 피미라신(Ⅳa)으로 발명자들이 행한 시험에서 인간 적혈구에 대하여 용혈 활성을 일으키지 않고 실질적으로 증가된 항진균 활성을 보이는 AB-400을 발견하였고, 이것은 비아미드화 동족 피미라신 (Ⅳa) 보다 에르고스테롤을 포함하는 막에 대하여 보다 큰 선택 독성을 보인다는 것을 설명할 수 있다.
본 발명자들에 의해 행해진 다른 시험은 아미드화 폴리엔이 이들의 비아미드화 동족체 보다 확실히 더 물에 대해 가용성은 것을 발견하였다. 상술한 약제학적 특성과 함께 이 특성은 본 화합물이 사상균병 또는 기생충의 국소 또는 조직의 치료를 위한 임상 용도 및 식품 산업에도 적합하다는 것을 의미한다.
그러므로, 다른 형태에 있어서, 본 발명은 선택적으로 하나 이상의 약제학적 허용가능한 추출물과 함께 화합물 AB-400(Ⅳb)을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 필요에 따라, 상기 약제학적 조성물은 상기 화합물 AB-400(Ⅳb)의 치료활성을 촉진시킬 수 있고 그 활성의 범위를 향상시킬 수 있는 하나 이상의 치료제를 더 함유할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 에르고스테롤을 함유하는 세포막을 보유하는 인간 또는 동물의 병원성 유기체, 예를 들면 인간 또는 동물의 기생충 및 유해 진균에 의해 유발되는 감염을 예방 및/또는 치료하는데 사용할 수 있다.
그러므로 다른 특정 실시형태에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 항기생충 조성물이고, 세포막이 에르고스테롤을 함유하는 기생충, 예를 들면 Trypsanoma , Leichmania 등에 의해 유발되는 감염의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다. 필요에 따라, 상기 항기생충 조성물은 상기 화합물 AB-400(Ⅳb)의 치료활동을 촉진시킬 수 있고 그 활동의 범위를 향상시킬 수 있는 하나 이상의 치료제를 더 함유할 수 있다.
다른 특정 실시 형태에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 항진균 조성물이고, 진균 (세포막이 에르고스테롤을 함유)에 의해 유발되는 감염의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다. 필요에 따라, 상기 항진균 조성물은 상기 화합물 AB-400(Ⅳb)의 치료 작용을 강화시킬 수 있거나 또는 그것의 작용 범위를 증가시키는 하나 이상의 항진균제를 더 함유할 수 있다. 상기 항진균제의 실례로는 암포테리신 B, 니스타틴, AB-400(Ⅳb), 알릴아민 (예를 들면, 테르비나핀, 나프타핀 등), 아모로피아(amorofia), 톨나프탈레이트 등의 폴리엔, 클로트라마졸(chlotrimazol), 미코나졸, 케트코나졸(ketconazol), 플루코나졸, 이트라코나졸 등의 아졸, 벤조푸란, 예를 들면 글리세오플라빈(griseofilvin) 등, 피리미딘, 예를 들면 플루오시토신 등이 열거되지만, 여기에 한정되는 것은 아니다.
화합물 AB-400(Ⅳb)는 상기 약제학적 조성물에 치료상의 유효량, 즉 그것의 치료 효과를 발휘하기 위한 적당량으로 존재할 것이다. 특정 실시 형태에 있어서, 본 발명에 의해 제공되는 약제학적 조성물은 0.01중량% 내지 99.99중량%의 AB-400(Ⅳb)의 화합물을 함유하고 선택한 투약 경로, 예를 들면 경구, 비경구 또는 국 소에 따라 어느 적당한 약제학적 투약 형태로 존재할 수 있다. 약의 다른 약제학적 투약 형태 및 이들의 제조방법의 검토는, 예를 들면 Tratado de Famacia Galenica, C. Fauli iTrillo, 1st edition, 1993, Luzan 5, S. A. de Ediciones에서 찾을 수 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 세포막이 에르고스테롤을 함유하는 인간 또는 동물의 병원성 진균, 예를 들면 인간 또는 동물 기생충 또는 인간 또는 동물의 병원성 진균에 의해 유발되는 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 약의 제조에 있어서 AB-400(Ⅳb)의 용도에 관한 것이다.
또한, 다른 형태에 있어서, 본 발명은 에르고스테롤을 함유하는 세포막을 보유하는 인간 또는 동물의 병원성 유기체, 예를 들면 인간 또는 동물의 병원체인 기생충 및 진균에 의해 유발되는 감염의 예방 및/또는 치료 방법으로서, 치료가 필요한 동물 또는 인간에게 화합물 AB-400(Ⅳb)를 함유하는 본 발명에 의해 제공되는 약제학적 조성물의 치료상 유효량을 제공하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다.
Figure 112007073855098-PCT00007
Figure 112007073855098-PCT00008
하기 실시예에 의해 본 발명을 설명하지만 그 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시형태의 실시예
실시예 1. 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108(Ⅰ-1b)의 제조 및 특성
Ⅰ. 실험 방법
박테리아 균주 및 성장 조건
박테리아 균주 및 플라스미드를 표 1a에 나타낸다.
스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108 및 유전자 변성에 의한 그것의 유도체를, 테트라엔의 제조의 분석을 위한 액체 및 고체 배지 SYM2(Atlas R.M., Microbiological Media. CRC Press, Boca Raton, Florida)에서, 또한 플라스미드 및 총 DNA의 추출을 위한 액체 배지 TSB(Oxoid사 제품)에서 통상의 방법으로 성장시켰다.
스트렙토마이세스 리비칸스(livikans) TK21을 복제를 위한 일반 숙주로서 사용하였고, 그 필드의 매뉴얼(Kieser T et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics, Norwich)에 기재되어 있는 바와 같이 고체 배지 R5 및 액체 배지 YEME에서 성장시켰다.
전문 문헌 (Maniatis T. et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y.)에 기재되어 있는 바와 같이 E. coli의 균주를 Luria-Bertani(LB) 한천에서 또는 LB 배양균에서 성장시켰다.
P. 크리소제늄, C. 크루세이, A. 나이거., C. 알비칸스 및 C. 네오포르만스, 항진균 활성 시험에 사용되는 진균을 MPDA 배지(조성: 2% 맥아 추출물, 2% 글루코스, 0.1% 박토펩톤(Bactopeptone))에서 성장시켰다.
본 발명에 사용한 박테리아 균주 및 플라스미드
균주 또는 플라스미드 특성 참조
스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108 야생주, 리모시딘 및 CE-108의 생산자 (a)
S. 디아스타티쿠스 var. 108/922 야생 S. 디아스타티쿠스 var. 108을 플라스미드 pIJ922로 형질변환시켜서 유래한 균주(대조) 본 발명
S. 디아스타티쿠스 var. 108/PM1-500 파지 PM1-500의 융합에 의해 분절되는 유전자 rimA를 갖는 야생으로부터 유래한 균주; 테트라엔에 의한 비생산자 (b)
S. 디아스타티쿠스 var. 108/743B 플라스미드 pSM743B에 의한 형질변환에 의해 야생으로부터 유래한 균주; CE-108, 리미시딘 CE-108B 및 리모시딘 B의 생산자 본 발명
S. 디아스타티쿠스 var.::PM1-500/743B 파지 PM1-500의 융합에 의해 분절되고 플라스미드 pSM743B로 형질변환된 유전자 rimA를 갖는 야생으로부터 유래되된 균주; CE-108, 리미시딘 CE-108B 및 리모시딘 B의 생산자 본 발명
S. 디아스타티쿠스 var. 108/784 플라스미드 pSM743B에 의한 형질변환에 의해 야생으로부터 유래한 균주; CE-108, 리미시딘 CE-108B 및 리모시딘 B의 생산자 본 발명
S. sp RGU5.3 야생주, 피마리신 및 AB-400의 생산자 본 발명
E. coli JM101 일반 복제 숙주 (c)
S. 리비칸스 TK21 일반 복제 숙주 (d)
페니실리움 크리소제늄 ATCC10003 항진균 활성 시험 ATCC
캔디다 알비칸스 ATCC10231 항진균 활성 시험 ATCC
캔디다 크루세이 ATCC 14243 항진균 활성 시험 ATCC
아스퍼질러스 나이거 ATCC1004 항진균 활성 시험 ATCC
크립토코쿠스 네오포르만스 ATCC10226 항진균 활성 시험 ATCC
pIJ922 레플리콘 SCP2*, tsr, 24 kb를 기초로 한 벡터 (c)
pIJ941 레플리콘 SCP2*, tsr, hyg, 25 kb를 기초로 한 벡터 (d)
pNAe-1 pUK21에 복제된 유전자 ermE 본 발명
pHis1 프로모터 자일레나제 xyzA ( xyzAp ), ApR, 3.7 kb를 운반하는 E. coli 복제 벡터 (f)
pSM736 pIJ2925의 부위 sacI/BamHI에 동시에 복제되는 rimA를 함유하는 1.2 kb SacI-DraIII 및 4.9 kb DraIII-BgIII의 단편 본 발명
pSM738 pHisl의 부위 SmaI/SphI에 동시에 복제되는 pSM736(유전자 rimA)의 6.1 kb BgIII-PstI의 단편 및 pNAe-1(내성 유전자 ermE)의 1.7 kb PstI-SphI의 단편 본 발명
pSM743B pIJ922의 부위 EcoRV에 복제되는 pSM738(xysAp, rimA 및 ermE를 함유)의 8.4 kb BgIII의 단편 (도 1 참조) 본 발명
pGAe-1 pSL1180에 복제되는 ermE 유전자 본 발명
pSM784 pIJ941의 부위 EcoRV에 복제되는 pGAe-1(내성 유전자 ermE)의 1.8 kb Sspl-EcoRV의 단편 (도 1 참조) 본 발명
Ap. 암피실린(amphicilin); Km. 카나마이신(kanamycin); ermE , tsr 및 hyg: 에리스로마이신, 티오스트렙톤 및 하이그로마이신 B의 내성 유전자
(a) Perez-Zuniga, F.J., et al., 2004, J. Antibiot. (Tokyo) 57: 197-204
(b) Seco E. M., et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366
(c) Yanisch-Perron C. et al., 1985 Gene 33: 103-119
(d) Kieser T et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics, Norwich
(e) Lydiate D. J., et al., 1985 Gene 34: 223-235
(f) Rulz-Arrivas, A., 1997, Appl. Environ. Microbiol, 63: 2983:2988
유전적 방법
Maniatis et al. (1982)에 기재된 바와 같이 E. coli의 균주를 성장시키고 형질변환시켰다. 상기에 기재된 바와 같이 스트렙토마이세스의 균주를 처리했다(상기 Dieser T., et al., 2000.). 선택 없이 고체 배지 R5에서 공여체 및 수용체를 공동으로 성장시키고 나중에 플라스미드의 항생물질 및 유전자 표지에 대한 상응하는 내성을 기초로 하여 선택하여 종내 접합을 행하였다. 상술한 바와 같이 DNA의 처리를 행하였다(상기 Maniatis T, et al., 1982).
테트라엔의 생산에 대한 시험
상술한 바와 같이 메탄올로 배양균의 일정량 모두를 추출하여 테트라엔의 생산물을 분석했다(상기 Seco E.M., et al., 2004). 추출물을 여과하고 Waters 996 PDA가 장착된 Waters 600S Controller 장치로 HPLC 분석을 실시하였고; 그 정량 측정 및 크로마토그래피 조건은 상술한 바와 동일하였다(상기 Perez-Zuniga F. J. et al., 2004).
HPLC - MS 시험
소스로서 전기스프레이 및 포지티브 이온화 모드를 사용하여 4중극 검출기, Agilent Technology detector가 연결된 장치 1100MSD HPLC로 집단 스펙트럼을 결정했다. 크로마토그래피 조건은 상술한 바와 같았다(상기 Perez-Zuniga F.J. et al., 2004).
신규 화합물의 정제
스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784 또는 아미드화 폴리엔을 제조할 수 있는 구조로 변성가능한 미생물 (상술함)을 고체 또는 액체 배지 SYM2에서 배양했다(상기 Perez-Zuniga F.J. et al., 2004). 6일 후에, 미생물을 배양한 완성 고체 배지를 전단가공하여 단편화하고 50mL의 시린지에 통과시키고; 이렇게 단편화한 고체 배지를 미리 25mM 포름산으로 산성화한 4배량의 메탄올로 추출했다. 액체 배지로부터의 배양을 메탄올로 유사 추출을 행하기 전에 냉동건조했다. 현탁액 내의 고체 입자를 제거하기 위해서 수성 현탁액을 1시간 동안 교반하고 20분 동안 5,000g에서 원심분리했다. 304nm의 파장에서 측정한 ㎕ 당 10-20×106유닛으로 회전 증발시켜 투명한 상청액을 농축했다. 그 다음 시료를 사용할 때 까지 80% 메탄올/물에 저장했다. 액체 세포 배양균의 200mL, 또는 배양균을 5배량의 메탄올로 미리 추출한 플레이트(24×24cm)는 아미드화 테트라엔의 혼합물을 최대 40mg 생산하였다. 석출된 물질을 제거하기 위해서 메탄올로 추출된 시료를 20% 메탄올, 물에 취하여 여과하였다. 그 여액을 미리 동일한 용액을 균형을 맞춘 SP-세파로스(Sepharose), Phast Flow (Pharmacia) 등의 미리 이온 교환 수지로 충전된 옴니피트(Omnifit) 컬럼 (250×25mm)에 천천히 여과하였다. 이들 조건 하에서 리모디신 및 CE-108을 컬럼 충전물에 부착되지 않은 앞부분과 함께 배양균으로부터 유래하는 피그먼트와 같이 용출하였고; 잔존하는 상응하는 아미드화 폴리엔 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b)가 완전히 체류하였다. SP 세파로스 충전물과 상호반응하지 않는 화합물을 제거하기 위해서 고체상으로 체류하는 목적하는 화합물을 함유하는 컬럼을 동일한 용액으로 철저히 세정하였다. 컬럼과 상호작용하여 유지된 아미드화 폴리엔 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE108B (Ⅰ-1b)를 20% 메탄올에서 pH 5로 300mM 암모늄 아세테이트 용출하여 분획을 일정한 시간에 회수하였다. 용출된 분획 중에서 목적하는 아미드의 혼합물을 함유하는 것을 선택하고; 이들을 함께 조합하고 Sep-Pak 카트리지(Waters 제품)를 사용하여 탈염의 물리적 공정을 실시하였다. 마지막으로, 탈염 분획을 20% 메탄올에 용해하였다. 탈염된 아미드화 폴리엔의 혼합물(15mg)을 함유하는 분획을 마지막으로 HPLC로 분별하고(아미드화 폴리엔을 분리할 목적으로); 이것을 위해 유사한 예비 컬럼(Supelcosil PLC-8, 250×21.2mm)을 사용했다. 자동 구배 조절기(Waters Automated Gradient Controller)로 조절되는 크로마토그래피 파라미터 및 이동상은: 100% B로 12분 (20mM 암모늄 아세테이트 pH 5, 20% 에탄올), 최대 50%의 A (메탄올) 및 50%의 B (Waters chromatographic controller에 지정된 곡선 6)의 2차 구배에서 43분; 최대 100%의 A (곡선 8, 상술한 바와 동일한 조절기)의 2차 구배에서 35분, 및 5mL/min의 일정한 유속이었다. 상술한 바와 같이 분획을 일정한 간격(분획 당 5mL)으로 회수하였고, 이 정제된 분리 화합물을 함유하는 것은 추가적인 탈염의 단계를 행하였고, 마지막으로 2번 냉동 건조하였다. AB-400도 상술한 바와 같이 스트렙토마이세스 sp. RGU5.3의 액체 배양균으로부터 시작하여 정제하였다(Canedo L.M. et al. 2000, J., Antibiot. (Tokyo) 53: 623-626).
용혈 활성의 시험
Gomez-Gomez et al. (Gomez-Gomez, J.M. et al., 1996, Mol. Microbiol. 19: 909-910)에 기재된 방법에 따라 상기 시험을 행했다. 폴리엔의 시료를 먼저 건조한 다음 10 내지 30mg/mL의 측정 농도에서 DMSO에 용해하였다. 폴리엔의 양을 다르게 하여 증가시켜 DMSO 100㎕의 최종 부피로 하고, 2.5%의 인간 혈액, 또는 말의 혈액을 함유하는 500㎕의 PBS 완충제와 서서히 교반하였다(상기 Gomez-Gomez, J.M. et al., 1996). 교반하지 않고 30분 동안 37℃에서 배양한 후에, 원심분리하여 세포를 침전시키고 545nm에서 흡수를 측정하여 용혈 활성을 조사하였다. 증류수 중의 2.5% 말의 혈액의 현탁액을 사용하여 총 용혈 활성에 상응하는 값을 측정하였다. 인간 혈액(본질적으로 적혈구)은 지역 혈액 은행 (Hospital ramon y cajal, Madrid)에서 얻었고; 말의 혈액은 Oxoid사 제품(탈선유소 혈액)이었다. 암포테리신 B 및 니스타틴은 Sigma사 제품(카탈로그 번호는 각각 A-4888 및 N-3503)이었고, 피마리신은 Calbiochem사 제품(527962)이었다. 이들 모든 폴리엔은 시판의 시료로부터 추가적인 정제 없이 직접 시험하였다.
Ⅱ. 결과
재조합 유전자 rimA 의 발생
폴리시스트론 mRNA 내에서 암호화된 유전자 rimA (Seco E.M. et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366)를 스트렙토마이세스 할스테디(halstedii) JM의 자일라나제의 유전자의 프로모터 xysA ( xysAp )의 조절하에서 복제하였다(Ruiz-Arribas, A., 1997, Appl. Environ. Microbiol, 63: 2983-2988). 이를 위해서, 프로모터 xysAp의 전방 위치에 위치하는 메틸레노마이신 내성 유전자의 종결자(T1: Adham S.A. et al, 2001, arch. Microbiol. 177: 91-97)를 운반하는 염기의 547쌍의 단편 BgII/SmaI로서 pHis1에서 시작하는 프로모터 xysAp를 회수하였다. 표 1에 설명한 여러가지 단계 후에, 통상의 DNA 복제 과정에 따라서, 유전자 rimA 및 유전자 rimI의 3' 말단을 포함하는 DNA의 단편(도 1에 표시한 바와 같이, 액세스 번호 AY442225 하에서 GeneBank에 배치된 서열로부터 시작하는 염기의 위치 9336-15445 쌍)을 프로모터 xysAp(재조합 유전자 rimA) 하에서 발현되는 rimA을 허용하는 적절한 환경에서 xysAp와 융합하였다. 마지막으로 최종 구조에서 죄측부터 우측으로: 프로모터 xysAp의 조절하에서 유전자 rimA, 유전자 rimI의 단편 및 최종적으로 완성된 유전자 ermE를 포함하는 DNA의 단편(도 1a 참조)을 발생시키기 위해서, pNAe-1의 유전자 ermE(표 1a)를 플랭킹(flanking) 효소로 동화시켜서 회수하고 얻어진 DNA의 단편을 "재조합 rimA" 유전자 다음 중간 단계에서 복제하였다. 얻어진 DNA의 단편을 스트렙토마이세스 벡터 pIJ922의 티오스트렙톤 내성 유전자 내에 위치한 특정 제한 부위 EcoRV에서 분자생물학의 통상 기술에 따라 블런트 말단(blunt end)을 통해 복제하였다. 얻어진 플라스미드(pAM743B, 도 1a)는 상술한 DNA 단편의 삽입에 의해 분절된 상응하는 티오스트렙톤 내성 유전자를 가지므로 티오스트렙톤이 아닌 에리스토마이신에 대한 내성을 나타낸다.
본래 유전자 rimA의 분열에 의해 이미 발생한 스트렙토마이세스의 돌연변이(이미 언급한 Seco, E.M. et al., 2004에 설명되어 있는 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/PM1-500)에 플라스미드 pSM743B을 도입함으로써 상기 나타낸 pSM743B에 복제된 재조합 유전자 rimA의 기능적 교정을 확인하였다. 얻어진 유전자 재조합체(이미 분절된 유전자 rimA로 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108의 돌연변이에 플라스미드 pSM743B의 도입에 의해 발생됨)는 천연 마크로라이드 폴리엔(리모시딘 및 CE-108) 및 신규의 마크로라이드 폴리엔(리모시딘 B 및 CE-108B)을 생산할 수 있다. 또한, 야생주에 도입된 플라스미드 pSM743B는 4개의 테트라엔(아미드화 및 카르복실화)의 생산을 유도하지만, 대개 클러스터 rim의 생합성 유전자의 발현에 의해 폴리엔의 총생산을 증가시킨다. 이것과 마찬가지로, 플라스미드 pSM784를 형성한다. 이를 위해서, 분자생물학의 통상 기술에 따라서, 다음 단계에서 블런트 말단으로 DNA 단편으로서 회수할 수 있는 완전한 유전자 ermE를 얻기 위한 Escherichia coli의 적절한 벡터로 유전자 ermE를 복제하였다. 마지막으로 블런트 말단을 가진 DNA 단편 중의 유전자 ermE를 포함하는 DNA 단편을 벡터 pIJ941의 특정 제한 부위 EcoRV에서 복제하였다. 얻어진 벡터는 유전자 ermE의 단편의 불활성 삽입에 의해 분절되는 것에 대한 대항 내성 유전자를 가지므로 티오트렙톤에 대하여 민감성이지만 에리스로마이신 및 하이그로마이신 B에 대한 내성을 나타낸다(도 1b 참조). 플라스미드 pSM784를 야생주 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108에 도입하는 경우, 얻어진 재조합체 미생물은 신규의 아미드 폴리엔 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108(Ⅰ-1b)과 리모시딘 B(Ⅱa) 및 CE-108B(Ⅱb)도 생산할 수 있다.
그러므로, 도 1c에 나타낸 바와 같이, HPLC에서 분석한 유사한 크로마토그래피 프로파일을 사용하여, 벡터 pSM743B 또는 벡터 pSM784를 포함하는 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108의 변성 유전자는 천연의 폴리엔(리모시딘 및 CE-108) 및 새로운 아미드화 폴리엔(CE-108B 및 리모시딘 B)을 모두 제조할 수 있다. 양자의 유전자 재조합은 정량적으로 동일한 폴리엔을 제조한다는 사실에도 불구하고, 이들의 생산율은 유전자 rimA 및 에리스로마이신 유전자(플라스미드 pSM743B)를 포함하는 재조합보다 현저히 크다.
두 테트라엔(리모시딘 및 CE-108)의 생산물은 분절된 유전자 rimA를 가진 돌연변이 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108로 복구되고, 플라스미드 pSM743B을 도입하는 경우, 재조합 유전자 rimA는 기능성인 것을 나타낸다. 그렇지만, 폴리엔의 생산율은 동일한 플라스미드 pSM743B(표 1a)의 야생 담체 균주보다 이 돌연변이에서 현저히 낮고; 이 낮은 생산율은 배지에 글루코스 또는 자일렌 중 어느 하나를 첨가하는 경우 크게 변화되지 않았다. 이 결과는 rimA의 발현이 폴리엔의 생산율을 한정하는 단계라는 것을 시사하는 것으로 생각되고; 이 한정 단계는 유전자량의 증가에 의해 완전히 극복된다.
이 결과는 SCP2*에서 유래한 벡터에서 유전자 ermE가 신규의 폴리엔을 발생하는데 본질적인 역활을 하는 것을 나타낸다. 이것은 pHJL401 (Larson J.L. et al., (1986) Plasmid 15. 199-209) 등의 다른 벡터에서 복제된 에리트로마이신 내성 유전자 (ermE) 또는 SCP2*에서 독립적으로 유래한 벡터 모두는 신규의 구조를 생산하는데 충분하지 않다는 것을 강조한다.
신규의 폴리엔의 특성
HPLC-MS 분석
S. 디아스타티쿠스 var. 108/743B 및 S. 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B의 발효 배양균의 질량 분석과 함께 HPLC 분석을 행하였고; 2개의 신규 테트라엔에 대하여 유추한 질량은 각각 최저 및 최고 체류 시간에 대하여 738 및 766이었다. 두 경우에서, 신규의 폴리엔의 질량은 근접한 체류 시간, CE-108(739) 및 리모시딘(767)으로 폴리엔보다 낮은 단위이다. 질량차와 크로마토그래피 이동성 모두는 신규의 폴리엔이 천연 마크로라이드로부터 유래한다는 의견을 뒷받침한다.
화학 구조의 설명:
화학 구조를 설명하기 위해서, 신규의 폴리엔은 이들의 정제를 위한 방법을 개발하기 위한 모의 기준으로 하였다. 두 화합물은 C8 및 C18로서 역상에서 실리카겔 뿐만 아니라 SP-Sepharose 등의 이온 교환 수지와도 상호작용하지 않아서, 이들 화합물은 접근가능한 포지티브 전하를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이 중요한 특징은 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/pSM743B 또는 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784의 발효 배양균으로부터 시작하여 설계되는 간편한 정제 방법을 가능하게 한다(실험 방법과 관련된 부분 참조).
화학물 CE-108B(Ⅰ-1b)를 CE-108(Ⅱb)와 동일하게 테트라엔의 대표적 가시 스펙트럼 (λmax = 317, 302, 289 nm)을 가진 분말로 얻었다(Perez-Zuniga F.J., et al. 2004, J. Antibiot. (Tokyo) 57: 197-204). δ 6.25 (dd, 14.9, 10.9 Hz)에서 sp 2 범위의 3중선 신호, δ 6.00-6.15에서 다중선 및 δ 5.87 (15.2, 8.4 Hz)에서 이중선 이중선을 갖는 1H-NMR의 스펙트럼은 CE-108의 것과 유사했다. 2개의 교환가능한 양성자가 넓은 단일선으로서 δ 7.30 및 6.83에 나타났다. δ 1.40-2.50의 알파 범위에서, 스펙트럼은 복잡한 다중선 패턴을 보이고, 3개의 메틸- 3중선 및 이중선의 신호는 각각 δ 1.17, 1.15 및 0.83에서 나타났다. 질량 스펙트럼 (+)-ESI MS는 고분해능을 사용하여 분자식 C37H58N2O13에 상응하는 m/z 739 ([M+H]+) 및 761 ([M+H]+)에서 유사 분자 이온의 존재를 나타내었다 (739.40110으로 발견됨, [M+H]+에 대하여 739.401715로 계산됨). 자기 공명 스펙트럼 13C-NMR은 분자 일반식에 의해 알 수 있듯이 CE-108에서와 같은 37 탄소를 나타냈다. CE-108 및 CE-108B에 대한 13C-NMR 데이터는 근접하게 관련되어 있고 CE-108과 CE-108B는 아미노-당류를 포함하는 동일한 탄소 골격을 보유한다는 결론을 가능하게 한다. 이 데이터에 의하면, 두번째 질소는 아미드 관능기에 의한 것이고, 이것은 CE-108(Ⅱb)의 아미드로서 CE-108B(Ⅰ-1b)를 특정한다.
리모시딘 B(Ⅰ-1a) 분말을 DMSO에 용해했다. 질량 스펙트럼 (+)-ESI MS는 고분해능을 사용하여 분자 일반식 C39H62N2O13에 상응하는 리모시딘 B(Ⅰ-1a)의 분자량이 766이 되는 것으로 결정했다 (767.43254으로 발견됨, [M+N]+에 대하여 767.43301로 계산됨). 1H-NMR의 스펙트럼은 CE-108B(Ⅰ-1b)의 것과 동일하였고 δ7.30 및 6.83에서 2개의 교환가능한 양성자 H/D, δ 6.40-5.80 구간에서 2개의 이중선 이중선 및 다중선을 보였다. 알파 영역은 낮은 분해능 때문에 매우 복잡하였지만, δ 1.83 및 1.16에서 메틸-신호의 성질인 이중선 및 삼중선이 쉽게 구별되었다. 스펙트럼 13C-NMR은 39 탄소의 존재를 나타내었다. 208.8, 172.1에서 3개의 카르보닐 신호의 존재를 나타내는 CE-108B(Ⅰ-1b)와 비교하여, 구간 136.7-128.3에서 8 탄소 원자의 sp 2 신호 이외에, 2개의 아세탈기의 신호가 나타났다. CE-108B(Ⅰ-1b)와 근접한 유사성이 이 화합물을 최종적으로 본 명세서에서 리모시딘 B(Ⅰ-1a)로서 특정된 리모시딘의 아미드로서 특정하였다.
신규의 아미드화 폴리엔 화합물의 생물학적 활성
항진균 활성 시험:
신규의 아미드화 테트라엔 [리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b)]의 항진균 활성을 각종 진균: 페니실루움 크리소제늄, 캔디다 알비칸스, 아스퍼질러스 나이거, 캔디다 크루세이 및 크립토코쿠스 네오포르만스에 대하여 시험했다. 메탄올에 용해한 다른 테트라엔의 증가량을 종이 디스크 (직경 9mm)에 적용하고; 용도에 따라 디스크를 건조하고 상응 시험 진균이 이미 도포되어 있는 생물학적 정량 플레이트에 놓았다. 이들 아미드화 테트라엔의 작용을 모든 시험한 진균에서 유래한 (도 2) 상응하는 테트라엔의 것보다 아미드화 폴리엔의 생물학적 활성이 실질적으로 보다 큰 것으로 보이는 [리모시딘 B(Ⅱa) 및 CE-108B(Ⅱb)]에서 유래한 분자의 작용과 비교하였다. 모든 경우에, 아미드기에 대한 유리 카르복실기의 치환도가 항진균 활성을 약 4배 증가시켰다.
독성 시험
상기 실험에서 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108의 유전자 재조합에 의해 제조된 신규의 아미드화 폴리엔의 변성은 높은 항진균 활성을 지닌 화합물을 발생시킨다는 것이 명백하다. 독성이 증가되었는지 여부를 결정하기 위해서, 야생주에 의해 제조된 화합물과 비교하여 신규 아미드화 폴리엔의 용혈 활성의 측정을 행했다. 인간 적혈구를 본 연구를 위한 세포 모델로서 사용하였다 (Cybulska B, et al., 2000, Acta Biochim, Pol. 47: 121:131; Gomez-Gomez, J.M. et al., 1996, Mol. Microbiol. 19: 909-910). 신규 화합물의 용혈 활성은 리모시딘 및 CE-108에 대하여 조사하였고(실험 방법에 관한 부분 참조); 암포테리신 B 및 니스타틴 A도 포함되었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 아미드화 테트라엔 [리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b)]의 용혈 활성은, 이들의 항진균 활성은 명백히 더 크지만, 유래되는 상응하는 테트라엔과 현저히 다른지 않다. 이것은 리모시딘(Ⅱa) 및 리모시딘 B(Ⅰ-1a)와 함께 CE-108(Ⅱb)와 CE-108B(Ⅰ-1b) 사이에서 관찰되는 독성의 차이를 강조할 만하고; 50%의 용혈 활성이 최후의 2개 폴리엔에 대하여 40~60나노몰로 달성되는 반면, 동일한 정도의 용혈 활성을 달성하기 위해서 CE-108의 농도가 6 또는 7배 더 큰 아미드가 필요하다. 그러므로, 아미드화 폴리엔 CE-108B의 약제학적 특성은 현저히 개선된다: CE-108은 낮은 항진균 활성을 나타내는 반면, 이것의 상응하는 아미드화 유도체 (CE-108B)는 항진균 활성이 거의 리모시딘 만큼 높은 수준으로 높아지는 한편, 이것의 용혈 활성은 6 또는 7배 낮아진다. 이들 시도는 말의 혈액으로도 행하였고 동일한 결과가 나타났다(데이터는 나타내지 않음).
피마리신(Ⅳa) 및 이것의 아미드화 유도체 AB-400(Ⅳb)에 필적하는 동일한 결과를 얻었다. 실험 방법 부분에 나타낸 바와 같이 두 화합물을 분리된 균주 스트렙토마이세스 sp. RGU5.3으로부터 시작하여 정제를 행했다. 균주를 글루코스와 소듐 아세테이트로 채워진 배지에서 배양하고, 소듐 아세테이트가 배양균에 추가되었을 때 아미드화 유도체의 생산율이 매우 향상된다는 것을 발견하였다. 이 방법에서, 소듐 아세테이트가 아닌 탄소원으로서 글루코스를 함유하는 발효 배양균을 사용하여, 피마린신/AB-400 비율은 70/30이고; 동일한 배지를 소듐 아세테이트로 채운 경우에는, 제조된 주요 폴리엔 화합물이 AB-400(Ⅳb)인 생산 프로파일이 반전된다. 이 효과는 일반적으로 변성된 균주 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108에 의해 제조된 아미드화 폴리엔의 제조에서는 관찰되지 않았다. 아미드화 폴리엔은 이 배지로부터 시작하여 정제되었고 항진균 및 용혈 활성 모두를 시험하였다. 그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108의 유전자 재조합에서 얻어지는 아미드화 폴리엔으로 앞서 관찰된 결과와 동일하다: 시험한 농도에서 피마리신(Ⅳa)에 대하여 항진균 활성이 관찰되지 않았지만, 동일량의 AB-400(Ⅳb)는 매우 활동적이었고; 페니실리움 크리소제늄을 사용했을 때 최대에 가까운 작용의 차이가 관찰되었다. 그렇지만, AB-400(Ⅳb) 및 시판의 피마리신으로 행한 용혈 활성은 두 폴리엔 사이에서 현저한 차이를 보이지 않았다. 이 모든 데이터로, 피마리신의 아미드화 유도체는 카르복실화 피마리신을 넘는 약제학적 장점을 부여한다는 것으로 결론내릴 수 있다.
Figure 112007073855098-PCT00009
Ⅲ. 검토
주로 2개의 비아미드화 폴리엔: 리모시딘 및 CE-108의 천연 생산 유기체의 유전자 조작을 사용하여 제조된 카르복실기를 변화시켜서 2개의 신규 아미드화 폴리엔의 생합성을 설명한다.
스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108, 2개의 천연 테트라엔 (리모시딘 및 CE-108)은, 유전자 재조합을 사용하여 적절히 변형되면 상응하는 아미드 (리모시딘 B 및 CE-108B)를 주요 화합물로서 자연적으로 제조하는 능력을 획득한다. 다른 반합성 폴리엔 유도체와 같이, 유리 카르복실기의 아미드기로의 변환은 이들의 약제학적 특성의 명백한 개선을 수반하여(용혈 활성은 아니지만 항진균 활성의 실질적 증가), 천연 테트라엔과 비교하여 항진균제로서 두드러진 이점을 제공한다. 두 유도체에서의 화학 변성은 조성물이 에르고스테롤을 함유하는 유기체의 막에 대한 선택적 독성의 증가를 수반한다. 본 발명자들은 피라미신 (Ⅳa) 및 AB-400(Ⅳb)로 동일한 결과가 얻어지고, 이것은 아미드기에 대한 폴리엔의 카르복실기의 치환도가 다른 폴리엔의 선택적 독성도 증가시킬 것이라는 의견을 뒷받침한다는 것을 강조한다.
이들 신규의 아미드화 폴리엔의 생합성을 위해서, 적어도 2개의 가능한 메커니즘을 가정할 수 있다: (a) 아미드가 아글리콘의 폴리케톤쇄의 조합에 이어서 일어나는 아미도트랜스퍼라제 활성의 결과일 수 있고 "수식" 작용 또는 포스트-PKS 변성), 이것은 본 발명에서 상술한 실험 조건하에서 활성화될 수 있거나, 또는 (b) 말론아밀-CoA 트랜스퍼라제 활성이 상응 PKS의 축합 모듈 7 을 사용하여 (Seco E.M., et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366), CE-108 및 리모시딘의 제조를 위한 생합성 모델에 제안된 바와 같이 메틸말로닐-CoA 대신에 말론아밀-CoA를 조합시킬 수 있다. 후자의 경우, 생합성 티올라아제에 존재하는 바와 같이 (Heath & Rock, 2002, Nat. Prod. Rep. 19: 581-596), Claysen형 비-디카르복실화 축합이 폴리케톤쇄에 말론아미드의 조합에 필요할 수 있고; 이 경우 축합 단위로서 말론아미드의 체내 이용가능성이 폴리케톤 쇄의 성장에 양호한 조합을 위해 중요할 수 있다. 폴리케톤쇄에 대하여 "유발자" 단위로 가정되는 산생균 생합성 옥시테트라사이클린은 말론아미드라고 강조할 만하다. 그래서 이 균주에서, 이 대사산물은 옥시테트라시클린 뿐만 아니라 다른 2차 대사산물의 생산에 용이하게 사용가능할 수 있다.
CE-108B 및 리모시딘 B의 제조를 주도하는 유전자 메커니즘은 알려지지 않았지만, 적어도 SCP2*에서 유래되는 플라스미드 (pIJ922 또는 pIJ941 등) 및 유전자 ermE가 필요하다는 것은 명백해 보인다. 에리스로마이신의 서브-저해 농도가 박테리아 전사를 조절할 수 있다는 것이 최근 설명되었다 (Goh et al., Proc. Nat., Acad, Sci. USA 99: 17025-17030). 그렇지만, 아미드는 에리스로마이신을 첨가하지 않은 배양균에서도 검출되었으므로 에리스로마이신이 폴리엔의 유기체 생산 가능한 아미드화 단계를 수행하는 가능한 전사 조정자의 발현을 조절할 수 있다는 가능성은 포기할 수 있다. 이것은 유전자 ermE (메틸라아제)의 생산물이 SCP2*에서 유래한 플라스미드 (pIJ922 또는 pIJ941)의 DNA 내에 암호화된 다른 중간 유전자에 작용할 수 있다는 가능성, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108의 천연 폴리엔 (리모시딘 및 CE-108)의 아미드화의 원인이 되는 염색체 유전자의 활동이 되는 결과를 낳는다. 본 발명은 유전적으로 변성된 균주에 의해 생체내 변화를 사용하여 신규의 아미드화 폴리엔을 발생하는 시스템을 제공한다. 시판의 폴리엔의 생합성 경로에 만족하게 적용되는 이 공정이 개선된 약제학적 화합물의 제조를 위한 간편한 공정이 되는 것은 확실하다. 본 발명에 관련된 폴리엔 구조의 복잡성, 아미드화 폴리엔 화합물을 발생하기 위해 본 발명에서 제안된 생체내 변화는 반합성 구조를 발생하기 위해 유기 합성을 사용하는 지금까지 설명된 것보다 보다 확실히 효과적인 공정을 구성한다.
실시예 2.- 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)의 제조 및 특성
1. 실험 방법
박테리아 균주, 복제 벡터 및 성장 조건
박테리아 균주 및 플라스미드를 표 1b에 나타낸다.
스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108 및 그 유도체는 배지 SYM2에서 배양하였다 (Atlas R.M., Microbiological Cedia. CRC Press, Boca Raton, Florida). 스트렙토마이세스 리비단스 TK21은 숙주 균주로서 파지의 증식에 사용하였고, 그 분야 매뉴얼 (Kieser T et al., 2000, Practical Strepomyces Genetics, Norwich)에 설명되어 있듯이 고체 배지 R5 및 액체 배지 YEME에서 성장하였다.
균주 E. coli JM101은 전문 문헌 (Manialtis T. et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y.)에 기재되어 있듯이 Luria-Bertani (LB) 한천 또는 LB 배양균에서 성장하였다.
페니실리움 크리소제늄 ATCC10003을 항진균 활성 시험에 사용하였고, MPDA 배지 (조성: 2% 맥아 추출물, 2% 글루코스, 0.1% 박토펩톤)에서 성장하였다.
본 발명에서 사용한 박테리아 균주 및 플라스미드
균주, 플라스미드 또는 파지 특성 참조
E. coli JM101 일반 복제 숙주 a
페니실리움 크리소제늄 항진균 시험에 사용되는 균주 ATCC1000 3
S. 리비단스 TK21 스트렙토마이세스 내의 일반 복제 숙주 b
S. 디아스타티쿠스 var. 108 야생주, 리모시딘 및 CE-108의 생산자 c
S. 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768 파지 PM1-768의 삽입에 의해 분절된 유전자 rimG를 가진 야생 S. 디아스타티쿠스 var. 108의 유도체 본 발명
S. 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B 플라스미드 pSM743B가 도입된 이전의 균주; 리모시딘 C 및 CE-108C의 생산자 본 발명
S. 디아스타티쿠스 var. 108/743B 플라스미드 pSM743B가 도입된 야생 S. 디아스타티쿠스 var. 108의 유도체 본 발명 (실시예 1)
S. 디아스타티쿠스 var. 108/PM1-702B 파지 PM1-702B의 융합에 의해 분절된 유전자 rimE를 가진 야생 S. 디아스타티쿠스 var. 108의 유도체 본 발명
S. 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-702B/743B 플라스미드 pSM743B가 도입된 이전의 균주 본 발명
S. 디아스타티쿠스 var. 108/784 플라스미드 pSM784가 도입된 야생 S. 디아스타티쿠스 var. 108의 유도체 본 발명 (실시예 1)
S. 디아스타티쿠스 var. 108/PM1-500 파지 PM1-500의 융합에 의해 분절된 유전자 rimA를 가진 야생 S. 디아스타티쿠스 var. 108의 유도체 d
S. 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/784 벡터 pSM784가 도입된 이전의 균주 본 발명
pHJL401 복제용 벡터; 이것은 리플리콘 SCP2* 및 pUC19를 포함하고; 이것은 티오스트렙톤에 대한 내성 유전자를 포함한다. 두가지 기능의 E. coli /스트렙토마이세스 e
pEL-1 벡터 pHJL401의 부위 EcoR1-HindIII에 복제된 프로모터 ermE p * (ref. b)에 상응하는 pIJ4090의 DNA 단편 EcoR1-HindIII 본 발명
PM1 φC31(att')hyg, tsr에서 유래한 액티노파지, f
pSM743B pIJ922에서 유래하고, 자일라나제 프로모터 XysA의 조절하에서 유전자 rimA를 포함하는 제조합 벡터 본 발명 (실시예 1)
pCNB5006 프로모터 ermE p * 를 포함하는, pIJ2925에서 유래한 벡터 d
pSM721 pIJ2925의 부위 HincII에 복제된 유전자 rimG 내부의 0.7 kb (SacII)의 DNA 단편 본 발명
pSM768 pCNB5006의 부위 BamHI-XbaⅠ에 복제된 벡터 pSM721의 0.7 kb HindII-Xba Ⅰ의 DNA 단편 본 발명
PM1-768 파지 PM1의 부위 BamHI-Xba Ⅰ에 복제된 벡터 pSM768의 1.0 kb의 DNA 단편 BgIII-PstⅠ 본 발명
pEL-1/702 벡터 pEL-1의 부위 BamHI에 복제된 유전자 rimE 내부의 0.8 kb의 DNA 단편 SaII 본 발명
PM1-702B 파지 PM1의 부위 Ecl136II에 복제된 벡터 pEL-1/702의 1.1 kb의 DNA 단편 EcoRI-XbaⅠ 본 발명
a. Yanisch-Perron et al., 1985 Gene 33: 103-119
b. Kieser et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics, Norwich
c. Perez-Zuniga, et al., 2004, Chem. Biol 11:357-366
e. Laron et al., 1986, Plasmad. 15: 199209
f. Malpartida et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 205:66-77
유전적 방법
E. coli 균주 JM101를 성장시키고 상술한 프로토콜을 사용하여 형질 전환시켰다 (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y.). 스트렙토마이세스의 균주를 상술한 바와 같이 취급하였다 (상기 Kieser T. et al., 2000). 실시예 1에서 설명한 바와 같이 종내 접합을 행하였다. Maniatis et al., 1982 (앞서 언급함)에 의해 상술한 바와 같이 DNA의 취급을 행하였다.
테트라엔의 생산에 대한 시험
실시예 1에서 설명한 바와 같이 테트라엔 생산물을 분석하였다. 상술한 바와 동일한 조건하에서 HPLC 분석을 행하였다 (상기 Perez-Zuniga F.J. et al., 2004).
HPLC - MS 시험
소스로서 전기스프레이 및 포지티브 이온화 모드를 사용하여 4중극 Agilent Technology Detector가 연결된 장치 1100MSD HPLC로 집단 스펙트럼을 결정했다. 크로마토그래피 조건은 상술한 바와 같았다(상기 Perez-Zuniga F.J. et al., 2004).
NMR 분석
Varian Inova 600 분광계 (5999.740 MHz)에서 NMR 스펙트럼을 측정했다. ESI 집단 스펙트럼을 Rheos 4000 쿼터너리(quaternary) 펌프 (Flux Instrument)가 장착된 Finnigan LCQ에 기록했다. HR ESI 집단 스펙트럼을 Bruder FTICR 4.7 T 분광계로 측정했다.
신규 화합물의 정제
염색체 및 플라스미드 pSM743B의 존재에서 각각 파지 PMI-768의 삽입의 정확한 선택을 위해 티오스트렙톤 (50㎍/㎖) 및 에리스로마이신 (25㎍/㎖)로 채워진 고체 배지 SYM2에서 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B (상기 Perez-Zuniga F.J. et al., 2004)을 배양했다. 6일 후에, 미생물을 배양한 완성 고체 배지를 실시예 1에서 상술한 바와 같이 단편화했다. CE-108C(Ⅲb) 및 리모시딘 C(Ⅲc)를 유사한 예비 컬럼 (Supelcosil PLC-8, 250×21.2mm)을 사용하는 HPLC로 정제하고; 적용된 구배는 분석 분획화 (앞서 언급함)를 위해 상술한 것과 동일하였고 자동 구배 조절기(Waters Automated Gradient Controller)로 조절하였다. 폴리엔을 함유하는 분획은 함께 조합되어 Sep-Pak 카트리지 (물)를 사용하는 탈염 단계로 수행되었고, 마지막으로 두번 냉각하였다. 이 방법은 상응하는 유전학적으로 변성된 미생물의 배양으로부터 시작하는 어느 메틸화 폴리엔을 정제하는데 사용할 수 있다.
용혈 활성의 시험
실시예 1에서 상술한 바와 같이 적혈구가 농축된 인간 혈액에 대하여 시험을 행했다.
무세포 추출물의 제조 및 "체외" 아미드화 시험
무세포 추출물을 제조하기 위해서, 아미드화 폴리엔의 생산자인 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784 및 스트렙토마이세스 sp. RGU5.3의 유전자 재조합을 50밀리리터의 배지 SYM2 (Atlas et al., Microbiological Media. CRC Press, Boca Raton, Florida)에서 3일 동안 성장시켰다. 10분 동안 5,000g, 4℃에서 원심분리에 의해 균사체를 회수하고; 이것을 20% 글리세롤의 용액으로 세정하고 20% 글리세롤 용액 15ml에 재현탁시켰다. 500마이크로리터의 분취액을 사용할 때 까지 -20℃에서 보관했다. 사용시, 상술한 바와 같이 원심분리로 회수하고 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5mM EDTA, 5% 글리세롤, 5mM NaCl, 0.5mM PMSF 및 1mM의 베타-메르캅토에탄올의 완충액 (TEPM 완충액)에 재현탁시켰다. 재현탁한 세포를 초음파로 분열시키고; 호모제네이트를 4℃에서 15분 동안 5,000g에서 2번 원심분리하여 정화했다. 무세포 호모제네이트를 함유하는 폴리엔을 Sep-Pak 카트리지 C18을 통해 상청액을 통과시켜서 부분적으로 제거하였다. 이들 분획을 암모니아 술페이트로 분획화하고 이들을 연속해서 45% 및 60% 포화시켰다. 60% 포화 상태로부터의 침전물을 원래 농도에 대하여 4배의 농도에서 용해시키고 아미도트랜스퍼라제의 평가에 사용했다. 상술한 용액 100마이크로리터를 함유하는 200마이크로리터에서 아미도트랜스퍼라제 시험을 행했다, 다른 폴리엔, 2.5mM의 글루타민, 25mM의 NaCl, 10mM의 MgCl2, 4mM의 ATP 및 125mM의 TES 완충액을 함유하는 용액의 340nm에서 측정한 광학 밀도의 단위 4×106. 반응물을 30℃에서 60분 동안 배양하고 1배량의 메탄올을 첨가하여 정지하였고; 4,000g에서 원심분리하여 침전물을 제거하고 상기 Perez-Zuniga, et al., 2004에 설명된 바와 같이 HPLC로 분석하였다.
Ⅱ. 결과
a) 신규의 메틸화 폴리엔
a.1.- 폴리엔 아미드의 생합성 메커니즘의 결정
리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b)의 생합성의 2가지 가능한 대안 메커니즘을 앞서 제안하였다: (a) 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)의 형성을 위해 제안된 메틸말로닐-CoA 단위 대신에 모듈 7에서 말론아밀-CoA 연장 단위의 축합, 및 (b) 리모시딘(Ⅱa) 및/또는 CE-108(Ⅱb)의 측면 카르복실로부터 시작하는 아미드를 발생시키는 "수식" 작용 (아미도트랜스퍼라제 등). 상기와 다른 메커니즘 사이에서 결정하기 위해서, 유전자 rimG의 역활이 중요하였다: 유전자 rimG의 분열은, 메커니즘이 (a)이면 아미드화 테트라엔의 형성의 도입에 포함되는 플라스미드의 담체가 되므로 상응하는 아미드를 제조할 수 있거나 또는 가능성 (b)의 경우에 이것을 할 수 없는 돌연변이를 유발할 수 있다.
그래서, 돌연변이는 벡터로서 액티노파지 PM1을 사용하여 유전자 rimG에서 분열에 의해 발생되었다 (상기 Malpartida et al., 1986). rimG의 하류에 위치한 유전자에 가능한 극성 효과를 방지하기 위해서 (도 4 참조), rimG의 내부 0.6kpb Sacll의 단편 (GeneBank AY442225에 위치한 서열의 8267-8849 조합)을 유전자 ermE p 의 프로모터를 포함하는 단편 및 파지 PM1의 조합 다음에 복제하였다. 리소겐 S. 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768을 발생시키는 S. 디아스타티쿠스 var. 108의 스포어를 감염시키는데 재조합 액티노파지 PM1-768B를 사용하였다. 이들 리소겐은 어떤 폴리엔도 제조하지 않았고, 이것은 본래 프로모터와 비교하여 프로모터 ermE p 의 적은 발현을 시사한다. ermE p * 등의 보다 강력한 프로모터를 사용하여 유전자 rimG을 중지시키는 시도(상기 Kieser et al., 2000)는 만족스럽지 않았다. 삽입 부위 다음에 위치한 2개의 유전자가 있다: rimH 및 rimA. rimH가 RimG (상기 Seco et al., 2004)에 의해 필요한 전자 수송을 중재하는 역활을 하는 것으로 제시된 페로독신(ferrodoxin)을 암호화하면, 유전자 rimA의 적절한 발현이 폴리엔의 제조를 복원하기 위한 결정적 파라미터가 될 수 있다는 생각이 타당하다. 이러한 이유로, rimA의 분열을 완성할 수 있고 아미드화 폴리엔의 형성을 유도할 수 있는 플라스미드 pSM743B (앞서 언급함)는 얻어진 재조합이 되는 S. 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B와 함께, 야생주 S. 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B로부터 리소겐 S. 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768으로 종내 접합에 의해 전달된다. 한번 상응하는 유전자형을 확인하였고, 폴리엔의 생산물을 위해 발효 배양균을 분석하였다. 발효 배양균에서 주로 검출된 2개의 화합물이 있었다: HPLC 및 질량 스펙트럼 분석은 이들이 709 및 737 질량 단위(각각 CE-108(Ⅱb) 및 리모시딘(Ⅱa)의 것보다 30단위 적음)라는 것을 결정하였다. 이 데이터는 이들이 거대 락톤환의 측면 카르복실기가 rimG의 분열 결과로서 메틸기로 치환된 CE-108(Ⅱb) 및 리모시딘(Ⅱa)로부터 유래한 테트라엔이라는 것을 시사한다. 상기 화합물은 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)라고 불린다. 아미드화 폴리엔 CE-108B(Ⅰ-1b) 및 리모시딘 B(Ⅰ-1b)의 제조가 유도된 조건하에서 이들의 부재는 아미드화 유도체의 형성은 측면 카르복실기의 형성이 먼저 필요하다는 것과 아미드기의 형성은 폴리케티드 신타아제의 모듈 7에서 말론아밀-coA 단위의 축합의 존재하에서 "수식" 작용에 의한 것이라는 것을 명백히 시사한다. 이 "수식" 작용은 아마도 아미도트랜스퍼라제에 의한 것이다.
a.2.- 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)의 화학 구조의 설명
신규의 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)를 설명할 목적으로, 역상 실리카 C8 컬럼을 사용하여 S. 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B의 발효 배양으로부터 이들을 모두 정제했다 (실험 방법 참조).
화합물 리모시딘 C(Ⅲa)를 고분해능을 사용하여 m/z 738 ([M+H]) 및 760 ([M+Na]+)에서 분자 일반식 C39H63NO12에 상응하고 pseudo-분자 이온의 존재를 나타내는 황색 분말로서 얻었다 (738.442217 발견되었고, [M+H]에 대하여 738.442300 산출됨). 리모시딘(Ⅱa) (C39H61NO14)와 비교하여, 이 화합물은 리모시딘 C(Ⅲa)에서 두개의 산소원자의 손실 및 두개의 양성자의 첨가에 상응하고, 이것은 형식적으로 메틸 잔기에 대하여 탄소 C-14에서 카르복실기의 치환으로서 해석될 수 있다.
1H-NMR의 스펙트럼은 리모시딘(Ⅱa)의 것과 매우 유사하고 sp 2 범위에서 3개의 신호, δ 6.30에서 이중선 이중선 (dd), δ 6.05-6.18에서 삼중선, 및 δ 5.90에서 두번째 dd가 나타났다 (표 2a). 당류 양성자는 범위 δ 3.25-4.62에서 나타났다. 스펙트럼 1H-NMR의 알파 영역에서도 리모디신 (Ⅱa)의 것, 특히 δ 1.30-2.50 범위에서 5개의 복합 삼중선 패턴에 대하여 유사하게 나타났다. 리모시딘(Ⅱa)에서와 같은 3개가 아닌 4개의 메틸기가 δ 0.90, 0.95 및 1.26, 1.00에서 2개의 삼중선 및 2개의 이중선으로 각각 나타났다. 리모시딘(Ⅱa) 및 리모시딘(Ⅲa)의 가장 큰 차이는 신호 H를 나타내는 메틸- 이중선 δ 1.00의 존재이고, H는 δ 1.22 (δC 43.8)에서 14-H와 함께 COSY 스펙트럼에 교차한다.
스펙트럼 13C-NMR은 분자 일반식이 필요로 하는 바와 같이 리모시딘(Ⅱa)에서와 같은 13 탄소 신호를 가리켰다. 이것과 양성자 스펙트럼의 유사성은 리모시딘(Ⅱa) 및 리모시딘 C(Ⅲa)가 당류 마이코사민을 포함하는 동일한 탄소 골격을 보유하고, 리모시딘(Ⅱa)에서 3개가 아닌 2개의 카르복시기가 존재한다는 것만 다르다는 결론을 내릴 수 있게 한다. 신호 δ 211.6 및 174.5는 각각 케톤기 및 락톤 카르보닐에 기인하였다. 174.5에서 카르보닐기에 대하여 δ 5.03 (C-27)에서 양성자의 커플링 HMBC 3 J는 락톤을 확인하였고, 그래서 리모시딘 C(Ⅲa)는 14-디카르복시-14-메틸- 리모시딘(Ⅰ-1a)가 되어야 한다.
CE-108C (Ⅲ)의 황색 분말은 메탄올에 쉽게 용해되었다. 이 경우 모두, 1H-NMR의 스펙트럼은 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108(Ⅱb)의 것과 유사하게 나타났다. 알파 영역은 CE-18C (Ⅱb)에서와 같은 3개의 메틸- 신호가 아닌, δ 1.25, 1.23 및 0.99에서 3개의 이중선 및 0.90에서 삼중선과 함께 4개의 메틸기의 신호가 나타났다. 질량 스펙트럼 (+)-ESI NS는 고분해능을 사용하여 분자 일반식 C37H59NO12에 상응하는 m/z 709가 되는 바와 같이 CE-108C(Ⅲb)의 분자량을 결정한다 (710.410905 발견되었고, [M+H]+에 대하여 710.411000 산출됨). 자기 공명 스펙트럼 13C-NMR은 분자 일반식이 필요로 하는 바와 같은 CE-108(Ⅱb)에서와 같은 37 탄소 신호를 확인하였다. δ 211.3 및 174.3에서 단지 2개의 카르보닐 신호의 존재만 나타난 CE-108B(Ⅰ-1b)에 대한 자기 공명 스펙트럼 13C-NMR과의 비교는 다시 케톤기 및 락톤 카르보닐에 기인한다. 이 경우에 가장 큰 차이는 CE-108C(Ⅲb)에서 δ 179.3에서 나타나는 카르복실기의 존재, 및 1H-NMR의 스펙트럼에서 δ 0.99에서의 메틸- 이중선에 속하는 13.7에서의 추가적 메틸- 신호의 존재이다. CE-108(Ⅱb) 및 CE-108C(Ⅲb) 데이터의 신중한 비교는, 이 테트라엔에서도, CE-108(Ⅱb)의 C-14의 카르복실기가 유도체 10-디카르복실-메틸-CE-108로서 CE-180C (Ⅲb)를 특정하는 메틸기에 의해 대체되었다는 것을 분명히 나타낸다.
신규의 아미드화 폴리엔 화합물의 생물학적 활성
신규의 비카르복실화 테트리엔 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)의 항진균 활성은 천연 테트라엔 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)의 것과 비교하여, 페니실리움 크리소제늄, 캔디다 알비칸스, 아스퍼질러스 나이거, 캔디다 크루세이 및 크립토코쿠스 네오포르만스에 대하여 측정했다. 실시예 1에서 상술한 바와 같이 측정한 2개의 매개체, 리모시딘 C(Ⅱa) 및 CE-108C(Ⅲb)의 항진균 활성은 최종 생성물 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)의 것과 현저히 다르지 않다.
신규의 테트라엔의 다른 약제학적 특성이 다른지를 결정하기 위해서, 용혈 활성 시험을 행하였고 부모 화합물과 비교하였다. 이들 시험에 인간 에리트로사이트(eritrocyte)를 사용했다. 결과를 표 2a에 나타낸다. 리모시딘(Ⅱa) 및 리모시딘(Ⅲa)의 항진균 활성이 동일하여도, 이들의 독성 (용혈 활성의 관점에서 측정)은 리모시딘(Ⅱa) 보다 리모시딘 C(Ⅲa)에 대하여 2.5-5배 낮았다는 것을 알 수 있다. CE-108C(Ⅲb)의 600nmol에 도달할 때 까지의 증가량을 용혈 시험에 사용했고; 용혈 활성은 20% 미만이었고, 비카르복실화 테트라엔 CE-108 C (Ⅲb)의 독성이 다른 테트라엔의 것보다 낮다는 것을 시사한다. 이것은 흥미로운 약제학적 특성의 개선을 시사한다.
Figure 112007073855098-PCT00010
b) 아미도트랜스퍼라제 활성의 기질의 결정
b.1.- 유전자 rimE 의 분열
"수식" 작용의 기질 또는 추정되는 아미도트랜스퍼라제를 결정할 목적으로, 당류 마이코심(mycosime)을 거대 락톤환에 조합시키는 글리콜실트랜스퍼라제(glycolsyltransferase)를 암호화하는 유전자 rimE를 분열시켰다.
유전자 rimE이 유전자 rimF , rimG , rimH 및 rimA를 수용하는 약 9 kb의 폴리시스트론에 전사되는 사실 때문에 (Seco. E.M. et al., 2004, Chem. Biol. 11: 357-366) (도 1a), 염색체에서 하류에 위치하는 유전자 상에 극성 효과를 방지하는 것이 필요했다. 분열을 행하기 위해서, 유전자 rimE (GeneBank AY442225에 위치한 서열의 좌표 5629-6484)에 대한 내부 0.8 kpb sall의 단편의 앞에 강력한 프로모터 ermEp* (상기 Kieser et al., 2000)를 전령 RNA의 나머지의 전자를 허용하기 위한 정확한 배향으로 복제하였다. 얻어진 구조물을 표 1b에 설명한 여러 단계로 파지 PM1에 복제하였다. 얻어진 재조합 상 (PM1-702B)를 리소겐 S. 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-702B의 분리를 행할 수 있는 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108의 포자 감염에 사용했다. Southern blotting 기술을 사용하여 염색체로의 정확한 융합을 확인했다. HPLC에 의한 발효 배양균의 분석 및 질량 스펙트럼 분석으로 CE-108 및 리모시딘의 글리콘 및 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)의 글리콘에 상응하는 4개의 주요 화합물의 존재를 결정했다. 아미드 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b)를 야생 S. 디아스타티쿠스 var. 108로 유도할 수 있는 플라스미드 pSM743B를 이 리소겐에 접합으로 도입했을 때, 아미드화 글리콘의 형성이 전혀 관찰되지 않았다. 이 데이터는 가능한 아미도트랜스퍼라제 활성의 기질은 실제로 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)가 될 수 있고 이들의 글리콘은 아니라는 것을 설명한다.
2.- 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)의 "체외" 아미드화 시험
상술한 모든 데이터를 바탕으로, 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)의 이들의 상응하는 아미드로의 변환은 완전히 형성된 테트라엔 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)모두를 기질로서 사용하는 아미도트랜스퍼라제 "수식" 작용에 의해 행해지는 것으로 보인다. 이 작용의 존재를 결정하기 위해서, 아미도트랜스퍼라제 활성 시험을 기질로서 정제된 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)를 사용하여 HPLC에 의해 행했다. 상기 시험을 행하기 위해서, 무세포 추출물을 얻을 목적으로 실시예 1에서 언급한 균주 S. 디아스타티쿠스 var. 108/784를 실험 방법에서 설명한 바와 같이 액체 배지 SYM2에서 3일 동안 성장시켰다. 다른 파라미터를 처음으로 시험했다: 기질, 효소 공동 인자, 아미드기의 공여체, 반응의 최적 pH. 반응 생성물을 HPLC로 분석하였고, 상기 평가를 이 분야에서 생화학 연구에 사용하는 표준 조건에 따라 행한 효소 시험을 위해 암모늄 술페이트와의 여러가지 분별법의 침전물을 사용하여 활용했다. 마지막으로, 아미도트랜스퍼라제 활성의 평가를 위해 찾은 최적 조건을 실험 방법 부분에서 설명한다. 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb) 모두 이들의 상응하는 아미드 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b)로 각각 명백히 변환된 것을 관찰하였다 (도 6a 및 6b 참조). 관찰된 화합물의 동일성을 질량 분석법 분석으로 결정했다. 이 데이터로 "수식" 작용이 실제로 아미드기의 공여체로서 글루타민을 사용한 ATP 의존 아미도트랜스퍼라제 활성이라는 것을 결정할 수 있다. 이 작용은 S. 디아스타티쿠스 var. 108/784 [리모시딘(Ⅱa), 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108(Ⅱb) 및 CE-108B(Ⅰ-1b)의 생산자]의 추출물 뿐만 아니라 스트렙토마이세스 sp. RGU5.3 [피마리신(Ⅳa) 및 AB-400(Ⅳb)의 생산자]의 추출물에서도 감지될 수 있었고, 아미도트랜스퍼라제 활성은 S. 디아스타티쿠스 var. 108/784와 동일한 것으로 판명되었다.
아미도트랜스퍼라제 활성에서 기질 선택성을 결정하기 위해서, 암포테리신 B 및 피마리신(Ⅳa) 등의 이종 기질에 대하여 S. 디아스타티쿠스 var. 108/784의 무세포 추출물을 시험하였지만, 결과는 기질로서 피마리신(Ⅳa)를 사용한 것만 만족스러웠다. 도 6c에 나타낸 바와 같이, S. 디아스타티쿠스 var. 108/784의 무세포 추출물은 피마리신(Ⅳa)을 이것의 상응하는 아미드 AB-400(Ⅳb)로 변환할 수 있었다. 그렇지만, 기질로서 리모시딘(Ⅱa), CE-108(Ⅱb) 또는 암포테리신 B를 사용한 스트렙토마이세스 sp. RGU5.3의 무세포 추출물의 아미도트랜스퍼라제 활성을 검출할 수 없었고, 아미드화할 수 있는 화합물만이 피마리신(Ⅳa)이었다 (도 7). 이 데이터로 S. 디아스타티쿠스 var. 108/784의 아미도트랜스퍼라제 활성은 스트렙토마이세스 sp. RGU5.3 보다 넓은 기질 인식 범위를 갖는다는 결론을 도출할 수 있다.
생물학적 재료의 기탁
플라스미드 pSM784가 도입된 야생주 S. 디아스타티쿠스 var. 108에 상응하는 미생물 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784의 배양균을 2005년 3월 14일에 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Germany에 기탁하였다. 이것의 액세스 번호는 DSM 17187이다. 이 균주는 리모시딘(Ⅱa) 및 CE-108(Ⅱb)를 생산하기 위한 완전한 경로를 포함하고, 또한 상응하는 아미드화 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b)를 제조할 수 있다.
미생물 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B의 배양균은 2005년 7월 18일에 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Germany에 기탁하였다. 이것의 액세스 번호는 DSM 17482이다. 이 균주는 메틸화 폴리엔 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)의 생산자이다.
이 기술은 통상적으로 유전자 스트렙토마이세스의 유전학적 취급에 사용되었고, 이들의 공공 입수를 위한 유전자/프로모터의 기탁은 본 발명에 기재된 구성물 또는 다른 기능적 등가물을 발생시킬 수 있다. 사용된 벡터는 공공에 사용되고 통상적으로 스트렙토마이세스로 연구하는 실험실에서 일상적으로 사용된다.
본 발명에서 설명한 유전자를 위한 암호화 DNA의 서열는 액세스 번호 AY442225하에서 GeneBank 데이터베이스에 기탁되었고 공공에 입수가능하다.

Claims (80)

  1. 일반식(Ⅰ)으로 표시되는 것을 특징으로 하는 폴리엔 마크로라이드 화합물.
    Figure 112007073855098-PCT00011
    (여기서
    R1은 C1-C3의 알킬이고;
    R2는 CH3- 또는 CONH2- (메틸- 또는 1차 아미드-) 중에서 선택되는 관능기, 그것의 이성질체, 염, 프로드러그 또는 용매 화합물이다.)
  2. 제 1 항에 있어서, 일반식(Ⅰ-1)으로 표시되는 것을 특징으로 하는 폴리엔 마크로라이드 화합물.
    Figure 112007073855098-PCT00012
    (여기서
    R은 NH2이고; 또한
    R1은 C1-C3의 알킬, 그것의 이성질체, 염, 프로드러그 또는 용매 화합물이다.)
  3. 제 2 항에 있어서, 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 및 CE-108B(Ⅰ-1b)로 특정되는 일반식(Ⅰ)에 속하는 아미드화 화합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리엔 마크로라이드 화합물.
    Figure 112007073855098-PCT00013
  4. 제 1 항에 있어서, 일반식(Ⅲ)으로 표시되는 것을 특징으로 하는 폴리엔 마크로라이드 화합물.
    Figure 112007073855098-PCT00014
    (여기서:
    R1은 C1-C3의 알킬, 그것의 이성질체, 염, 프리드러그 또는 용매 화합물이다.)
  5. 제 4 항에 있어서, 리모시딘 C(Ⅲa) 및 CE-108C(Ⅲb)로서 특정되는 일반식(Ⅲ)에 속하는 화합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리엔 마크로라이드 화합물.
    Figure 112007073855098-PCT00015
  6. 제 1 항에 기재된 일반식(Ⅰ)의 화합물을 불활성 매체와 함께 함유하는 것을 특징으로 하는 살생물제 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물은 제 2 항에 기재된 일반식(Ⅰ-1)의 화합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 살생물제 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ-1)의 화합물은 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b) 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 살생물제 조성물.
  9. 제 6 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물은 제 4 항에 기재된 일반식(Ⅲ)의 화합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 살생물제 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅲ)의 화합물은 리모시딘 C(Ⅲa), CE-108C(Ⅲb) 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 살생물제 조성물.
  11. 제 1 항에 기재된 일반식(Ⅰ)의 화합물을 필요에 따라 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 첨가제와 함께 함유하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물은 제 2 항에 기재된 일반식(Ⅰ-1)의 화합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ-1)의 화합물은 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b) 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물은 제 2 항에 기재된 일반식(Ⅲ)의 화합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  15. 제 12 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅲ)의 화합물은 리모시딘 C(Ⅲa), CE-108C(Ⅲb) 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  16. 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 치료제를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  17. 제 1 항에 기재된 일반식(Ⅰ)의 화합물을, 세포막이 에르고스테롤을 함유하거나 또는 이것을 함유하지 않고 폴리엔 마크로라이드에 대하여 민감성인 병원성 유기체에 의해 유발되는 인간 또는 동물 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 약의 제조에 사용하는 것을 특징으로 하는 일반식(Ⅰ)의 화합물의 용도.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물은 제 2 항에 기재된 일반식(Ⅰ-1)의 화합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 일반식(Ⅰ)의 화합물의 용도.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ-1)의 화합물은 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b) 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 일반식(Ⅰ)의 화합물의 용도.
  20. 제 17 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물은 제 4 항에 기재된 일반식(Ⅲ)의 화합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 일반식(Ⅰ)의 화합물의 용도.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅲ)의 화합물은 리모시딘 C(Ⅲa), CE-108C(Ⅲb) 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 일반식(Ⅰ)의 화합물의 용도.
  22. 제 1 항에 기재된 일반식(Ⅰ)의 화합물을 필요에 따라 하나 이상의 불활성 매체와 함께 함유하는 것을 특징으로 하는 항진균 조성물.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물은 제 2 항에 기재된 일반식(Ⅰ-1)의 화합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항진균 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ-1)의 화합물은 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b) 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항진균 조성물.
  25. 제 22 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물은 제 4 항에 기재된 일반식(Ⅲ)의 화합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항진균 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅲ)의 화합물은 리모시딘 C(Ⅲa), CE-108C(Ⅲb) 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항진균 조성물.
  27. 제 22 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항진균제를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 항진균 조성물.
  28. 식물에서 식물병원성 진균에 의해 유발되는 감염을 억제하는 방법으로서: 상기 식물 또는 그것을 둘러싼 매개체에 제 22 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 항진균 조성물을 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 과일에 있어서의 식물병원성 진균에 의해 유발되는 감염을 억제하는 방법으로서: 상기 과일에 제 22 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 항진균 조성물을 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 가공 식품에서 발현할 수 있는 진균에 의해 유발되는 감염을 억제하는 방법으로서: 상기 가공 식품에 제 22 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 항진균 조성물을 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 2 항에 기재된 일반식(Ⅰ-1)의 화합물의 제조방법으로서: 상기 일반식(Ⅰ -1)의 화합물을 제조할 수 있는 조건하에서 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/743B, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B 및 이들의 조합에서 선택되는 미생물을 배양하고, 필요에 따라 상기 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 일반식(Ⅰ-1)의 화합물의 제조방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 제조되는 일반식(Ⅰ-1)의 화합물은 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b) 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 일반식(Ⅰ-1)의 폴리엔 마크로라이드, 바람직하게는 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b) 또는 이들의 혼합물과 함께, 출발 폴리엔 리모시딘(Ⅱa), CE-108(Ⅱb) 또는 이들의 혼합물을 동시에 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 4 항에 기재된 일반식(Ⅲ)의 화합물의 제조방법으로서:
    일반식(Ⅲ)의 화합물을 제조할 수 있는 조건하에서 미생물 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B을 배양하는 단계;
    발효 배양균을 얻는 단계; 필요에 따라,
    이들 일반식(Ⅲ)의 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 일반식(Ⅲ)의 화합물의 제조방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅲ)의 화합물은 리모시딘 C(Ⅲa), CE-108C(Ⅲb) 및 이들의 혼합물의 군에 속하는 것을 특징으로 하는 일반식(Ⅲ)의 화합물의 제조방법.
  36. 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 행하는데 필요한 재조합체 미생물로서: 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/743B, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784 (DSM 17187) 및 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합체 미생물.
  37. 제 34 항 또는 제 35 항에 기재된 방법을 행하는데 필요한 재조합체 미생물로서: 상기 미생물은 제 4 항에 기재된 일반식(Ⅲ)의 화합물을 생산하고, 또한 유전자 rimG 또는 동족 유전자의 발현에 독점적으로 영향을 받는 것을 특징으로 하는 재조합체 미생물.
  38. 제 37 항에 있어서, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B(기탁 번호: DSM 17482)이고, 일반식(Ⅲ) 리모시딘 C, CE-108C 및 이들의 혼합물의 메틸화 폴리엔의 생산자인 것을 특징으로 하는 미생물.
  39. 제 38 항에 있어서, 기능적으로 미생물 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B(기탁 번호: DSM 17482)와 등가인 미생물인 것을 특징으로 하는 미생물.
  40. 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/743B, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108:::PM1-768B/743B 및 이들의 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미생물의 배양균.
  41. 제 36 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 기재된 미생물 또는 제 40 항에 기재된 미생물의 배양균을 사용하여 제 1 항에 기재된 일반식(Ⅰ)의 화합물을 얻는 것을 특징으로 하는 미생물 또는 배양균의 용도.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ-1) 및 (Ⅲ)의 화합물은 리모시딘 B(Ⅰ-1a) 또는 CE-108B(Ⅰ-1b) 중에서, 리모시딘 C(Ⅲa) 또는 CE-108C(Ⅲb) 중에서 각각 선택되거나, 또는 이들 화합물의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미생물의 용도.
  43. 제 36 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 기재된 미생물의 발효 배양균으로서: 일반식(Ⅰ)의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 발효 배양균.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 미생물은 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/743B, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108/784, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-500/743B 및 이들의 조합의 군에 속하고, 또한 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b) 및 이들의 혼합물의 군에 속하는 제 2 항에 기재된 일반식(Ⅰ-1)의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 발효 배양균.
  45. 제 43 항에 있어서, 상기 미생물은 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108:::PM1-768B/743B이고, 또한 리모시딘 C(Ⅲa), CE-108C(Ⅲb) 및 이들의 혼합물의 군에 속하는 제 4 항에 기재된 일반식(Ⅲ)의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 발효 배양균.
  46. 제 36 항에 기재된 아미드기를 갖는 폴리엔 마크로라이드의 재조합체 생산 미생물을 얻는 방법으로서:
    유리 카르복실기를 갖는 폴리엔 마크로라이드의 생산 미생물에, 유리 카르복실기를 갖는 폴리엔 마크로라이드의 발현 벡터 생산 미생물을 도입하거나, 한편으로는 (ⅰ) 폴리엔의 생합성 클러스터 또는 그것의 단편을 포함하는 벡터, 및 다른 한편으로는 (ⅱ) 유전자 ermE을 포함하는 SCP2*에서 유래한 벡터, 또는 상기 SCP2*와 다른 복제 기점, 유전자 ermE 및 벡터 SCP2*의 단편을 포함하는 벡터를 포함하는 벡터의 조합을 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 37 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 기재된 미생물을 얻는 방법으로서:
    얻어지는 균주가 유전자 rimG의 발현에 독점적으로 영향을 받고, 또한
    a) 미생물 S. 디아스타티쿠스 var. 108 또는 그것의 등가물의 유전자 rimG에서 상기 유전자의 분열 또는 결실에 의해 폴리엔을 제조할 수 없는 돌연변이를 얻는 단계, 및
    b) 그 후에 상기 돌연변이의 염색체에서 유전자 rimA의 분열을 보완할 수 있는 벡터, 바람직하게는 플라스미드로 형질변환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 46 항에 있어서, 얻어지는 균주가 균주 S. 디아스타티쿠스 var. 108::PM1-768/743B인 것을 특징으로 하는 미생물을 얻는 방법.
  49. 제 37 항에 있어서, 얻어지는 균주가 동족 유전자 rimG의 발현에 독점적으로 영향을 받고, 또한
    a) 최초의 미생물의 동족 유전자에서 상기 유전자의 분열 또는 결실에 의해 폴리엔을 제조할 수 없는 돌연변이를 얻는 단계, 및
    b) 그 후에 상기 돌연변이의 염색체에서 그 유전자의 분열을 보완할 수 있는 벡터, 바람직하게는 플라스미드로 형질변환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하 는 미생물을 얻는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서, 상기 유전자 rimG의 동족 유전자는 하기 유전자 pimG , amphN, nysN , canC에 속하는 시토크롬 P450 모노옥시제나아제 활성을 가진 유전자인 것을 특징으로 하는 미생물을 얻는 방법.
  51. 제 46 항 또는 제 50 항에 있어서, 상기 최초의 미생물은 방선균인 것을 특징으로 하는 미생물을 얻는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 방선균이 스트렙토마이세스 sp.인 것을 특징으로 하는 미생물을 얻는 방법.
  53. 제 52 항에 있어서, 상기 스트렙토마이세스 sp.는 스트렙토마이세스 노우르세이, 스트렙토마이세스 알비더스, 스트렙토마이세스 리모수스, 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 var. 108, 스트렙토마이세스 노도수스, 스트렙토마이세스 나탈렌시스, 스트렙토마이세스 카타노오겐시스 및 스트렙토마이세스 그리세우스로 이루어진 군에 속하는 것을 특징으로 하는 미생물을 얻는 방법.
  54. 제 46 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합체 미생물.
  55. 제 46 항에 기재된 발현 벡터로서:
    a) SCP2*의 복제 기점 및 에리스로마이신 내성 유전자 ermE를 포함하는 벡터 SCP2* 또는 이것의 단편으로부터 유래한 벡터;
    b) (ⅰ) 벡터 SCP2*의 복제 기점; (ⅱ) 유전자 ermE, 및 (ⅲ) 벡터 SCP2*의 단편을 포함하는 벡터;
    c) (ⅰ) 복제 기점, (ⅱ) 유전자 ermE, 및 (ⅲ) 벡터 SCP2*의 단편을 포함하고, 상기 복제 기점이 SCP2*의 복제 기점과 다른 벡터;
    d) 복제 기점이 결여되어 있고, 유전자 ermE 및 벡터 SCP2*의 단편을 포함하는 벡터;
    e) (ⅰ) 복제 기점, (ⅱ) 유전자 ermE, 및 (ⅲ) 폴리엔의 전체 생합성 클러스터 또는 상기 클러스터의 단편을 포함하는, 벡터 SCP2*로부터 유래한 벡터;
    f) (ⅰ) 복제 벡터 SCP2와 동일하거나 다른 복제 기점, (ⅱ) 유전자 ermE, 및 (ⅲ) 벡터 SCP2*의 단편; 및 (ⅳ) 폴리엔의 전체 생합성 클러스터 또는 상기 클러스터의 단편을 포함하는, 벡터 SCP2*로부터 유래한 벡터;
    g) 복제 기점이 결여되어 있고, 유전자 ermE 및 폴리엔의 전체 생합성 클러스터 또는 상기 클러스터의 단편을 포함하는 벡터; 및
    h) 복제 기점 결여되고 있고, (ⅰ) 유전자 ermE, (ⅱ) 벡터 SCP2*의 단편, 및 (ⅲ) 폴리엔의 전체 생합성 클러스터 또는 상기 클러스터의 단편을 포함하는 벡터 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  56. 제 55 항에 있어서, 벡터 SCP2* 및 에리스로마이신 내성 유전자 (ermE)의 담체에서 유래되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  57. 제 56 항에 있어서, 플라스미드 pSM784인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  58. 제 55 항에 있어서, SCP2*의 복제 기점, 에리스로마이신 내성 유전자 (ermE) 및 벡터 SCP2*의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  59. 제 54 항에 있어서, SCP2*의 복제 기점과 다른 복제 기점, 에리스로마이신 내성 유전자 (ermE) 및 벡터 SCP2*의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  60. 제 55 항에 있어서, 유전자 ermE 및 폴리엔의 전체 생합성 클러스터 또는 상 기 클러스터의 단편을 포함하는 프로모터의 조절하에 있는 SCP2*의 유도체인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  61. 제 57 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 전체 클러스터 rim 또는 상기 클러스터의 단편을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  62. 제 61 항에 있어서, 플라스미드 pSM743B인 것을 특징으로 하는 발현 벡터
  63. 거대 락톤환에서 유리 카르복실화기를 갖는 폴리엔으로부터 아미드화 폴리엔을 얻는 효소법으로서:
    아미드화 폴리엔의 산생균의 무세포 추출물을 사용하고, 또한
    a) 정제되거나 또는 정제되지 않은 유리 카르복실화기를 갖는 폴리엔으로 이루어진 기질을 가진 혼합물 또는 이들 복수의 혼합물, 및 산생균 또는 아미드화 폴리엔의 균주로부터 유래하는 단백질 추출물을 조정하는 단계,
    b) ATP/Mg++과 글루타민 또는 그 밖의 아미드기 공여체의 존재의 조건하에서 a)의 혼합물을 반응시키는 단계, 및
    c) 아미드화 폴리엔을 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소법.
  64. 제 63 항에 있어서, 상기 얻어지는 아미드화 폴리엔은 CE-108B(Ⅰ-1b), 리모 시딘 B(Ⅰ-1a) 또는 이들의 혼합물이고, a)의 기질 폴리엔은 정제되거나 정제되지 않은 CE-108(Ⅱb), 리모시딘(Ⅱa) 또는 이들의 혼합물이고, 또한 a)의 추출물은 S. 디아스타티쿠스 var. 108/784 및 S. 디아스타티쿠스 var. 108/743B로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 효소법.
  65. 제 63 항에 있어서, 상기 얻어지는 아미드화 폴리엔은 AB-400(Ⅳb)이고, a)의 기질 폴리엔은 정제되거나 정제되지 않은 피마리신(Ⅳa)이고, 또한 a)의 추출물은 S. 디아스타티쿠스 var. 108/784 및 S. 디아스타티쿠스 var. 108/743B로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 효소법.
  66. 제 63 항에 있어서, 상기 얻어지는 아미드화 폴리엔은 AB-400(Ⅳb)이고, a)의 기질 폴리엔은 정제되거나 정제되지 않은 피마리신(Ⅳa)이고, 또한 a)의 추출물은 균주 스트렙토마이세스 sp. RGU5.3로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 효소법.
  67. 아미드화 폴리엔의 생산자에 대하여 제 63 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 기재된 효소법을 시작하는데 필요한 무세포 추출물로서:
    카르복실화 폴리엔을 그에 상응하는 아미드로 "체외"에서 변환시킬 수 있는 아미도트랜스퍼라제 활성을 수반하고, 또한 아미드화 폴리엔의 산생균에서 유래하는 것을 특징으로 하는 무세포 추출물.
  68. 제 67 항에 있어서, S. 디아스타티쿠스 var. 108/743B, S. 디아스타티쿠스 var. 108/784 (DSM 17187) 및/또는 스트렙토마이세스 sp. RGU5.3 등의 미생물이 얻어지는 것을 특징으로 하는 무세포 추출물.
  69. 메틸화 암포테리신 B, 메틸화 니스타틴, 메틸화 피마리신 및 메틸화 캔디시딘의 군에 속하는 것을 특징으로 하는 메틸화 폴리엔 화합물.
  70. 제 69 항에 기재된 메틸화 폴리엔을 살생물제 및 약제학적 조성물을 제조에 사용하는 것을 특징으로 하는 메틸화 폴리엔의 용도.
  71. 제 54 항에 기재된 재조합체 미생물을 상기 화합물을 생산할 수 있는 조건하에서 배양하고, 필요에 따라 상기 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리엔 마크로라이드의 제조방법.
  72. 제 71 항에 있어서, 상기 폴리엔 마크로라이드는 유리 카르복실기를 갖는 폴리엔 마크로라이드, 유리 아미드기를 갖는 폴리엔 마크로라이드 및 이들의 혼합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리엔 마크로라이드의 제조방법.
  73. 제 72 항에 있어서, 상기 유리 카르복실기를 갖는 폴리엔 마크로라이드는 암포테리신 B, 니스타틴, 리모시딘, 피마리신, 캔디시딘 및 이들의 혼합물 중에서 선 택되는 것을 특징으로 하는 폴리엔 마크로라이드의 제조방법.
  74. 제 72 항에 있어서, 상기 아미드기를 갖는 폴리엔 마크로라이드는 화합물 AB-400(Ⅳb) 및 제 1 항에 기재된 일반식(Ⅰ)의 화합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제 74 항에 있어서, 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물은 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108B(Ⅰ-1b) 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리엔 마크로라이드의 제조방법.
  76. 제 72 항에 있어서, 상기 폴리엔 마크로라이드는 피마리신(Ⅳa), AB-400(Ⅳb), 리모시딘(Ⅱa), 리모시딘 B(Ⅰ-1a), CE-108(Ⅱb), CE-108B(Ⅰ-1b) 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리엔 마크로라이드의 제조방법.
  77. 화합물 AB-400(Ⅳb)를 필요에 따라 하나 이상의 약제학적 허용가능한 첨가제와 함께 함유하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  78. 상기 화합물 AB-400(Ⅳb)를 세포막이 에르고스테롤을 함유하는 병원성 유기체에 의해 유발되는 인간 또는 동물 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 약을 제조하는데 사용하는 것을 특징으로 하는 화합물 AB-400(Ⅳb)의 용도.
  79. 제 78 항에 있어서, 상기 세포막이 에르고스테롤을 함유하는 인간 또는 동물 병원성 유기체는 기생충 및 진균에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 AB-400(Ⅳb)의 용도.
  80. 제 78 항 및 79 항에 기재된 약의 용도로서: 세포막이 에르고스테롤을 함유하는 병원성 유기체에 의해 유발되는 인간 또는 동물 개체 감염의 치료를 위한 것을 특징으로 하는 약의 용도.
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