ES2371615B1

ES2371615B1 - Macrólidos polienos con actividad antimicrobiana y su procedimiento biotecnológico de obtención.

Info

Publication number: ES2371615B1
Application number: ES200930550A
Authority: ES
Inventors: Francisco Malpartida Romero; Maria Elena Seco Martin; Domingo Miranzo Navarro
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2009-07-31
Filing date: 2009-07-31
Publication date: 2013-01-24
Anticipated expiration: 2029-07-31
Also published as: ES2371615A1

Abstract

Macrolidos polienos con actividad antimicrobiana y su procedimiento biotecnológico de obtención.#La presente invención se engloba en el campo de la biología molecular y la biotecnología y se refiere a genes que codifican para la actividad amidotransferasa, implicados en la biosíntesis de macrolidos polienos, a una célula hospedadora que comprende estos genes y a un procedimiento de obtención de macrolidos polienos mediante dicha célula hospedadora. También se refiere a macrolidos polienos con actividad antibiótica obtenidos mediante este proceso biotecnológico.

Description

Macrólidos polienos con actividad antimicrobiana y su procedimiento biotecnológico de obtención.

Estado de la técnica anterior

En las últimas décadas se han producido progresos importantes en el área de la sanidad humana, se han desarrollado tratamientos satisfactorios para graves enfermedades, bien mediante técnicas quirúrgicas, con la aplicación de nuevos agentes químicos ó con ambos procedimientos simultáneamente. Particularmente dos áreas se han visto favorablemente inﬂuenciadas: tratamientos oncológicos y trasplantes de órganos. Paralelo al progreso conseguido en estos campos, se ha producido un notable incremento en ciertas enfermedades infecciosas, tales como micosis severas, ocasionadas por microorganismos “oportunistas”, que han encontrado un nuevo nicho en pacientes oncológicos o trasplantados sometidos a quimioterapias agresivas. El incremento de estas infecciones fúngicas constituyen una de las mayores amenazas para el éxito de las terapias aplicadas en las poblaciones de riesgo. A diferencia de los antibacterianos, el arsenal de compuestos antifúngicos disponibles es escaso. Tradicionalmente los compuestos macrolidos polienos vienen siendo utilizados, con eﬁcacia probada, desde hace 50 años; en los últimos años los derivados de azoles se han sumado al arsenal de compuestos antifúngicos. A diferencia de los macrolidos polienos, los azoles adolecen de un problema importante: incremento en la aparición de microorganismos resistentes que, en algunos casos los hacen inoperante como drogas antifúngicas. Esta situación contrasta fuertemente con el uso de macrolidos polienos, particularmente Anfotericina B, para la que la aparición de formas resistentes parece ser un evento muy raro. A pesar de la excelente eﬁcacia de Anfotericina B como agente fungicida, su uso clínico se ve fuertemente comprometido debido, fundamentalmente, a una considerable nefrotoxicidad y su muy baja solubilidad en agua. Por ello se han realizado por parte de diferentes laboratorios numerosos esfuerzos en la búsqueda de antifúngicos alternativos.

Varias han sido las aproximaciones para la obtención de polienos alternativos con menor toxicidad. Numerosos análogos se han obtenido tanto por vía semisintética como por ingeniería genética de rutas biosintéticas conocidas. Muchos derivados de Anfotericina B se han obtenido por síntesis orgánica, centrándose en la modiﬁcación del grupo carboxílico exocíclico ó en el grupo amino de la molécula del azúcar micosamina. Pese a que los cambios introducidos han servido para conocer las relaciones estructura-función y aspectos importantes para incrementar signiﬁcativamente la toxicidad selectiva hacia los microorganismos diana, ningún derivado nuevo de Anfotericina B ha salido al mercado. No obstante, el conocimiento adquirido con las nuevas estructuras obtenidas, sugieren que el cambio de carga en el grupo carboxilo tiene un efecto importante sobre la actividad hemolítica. Todo ello permitió establecer que el diseño de nuevos derivados podría orientarse a la modiﬁcación bien en el grupo carboxílico como en el amino del azúcar; de esta forma derivados catiónicos de Anfotericina B serían compuestos potencialmente más activos que los parentales. En ausencia de nuevos derivados catiónicos, las nuevas formulaciones de Anfotericina B, asociadas a liposomas han permitido lanzar al mercado preparaciones para su aplicación como antifúngico con una sustancial reducción en sus niveles de toxicidad. Pese a esa reducción en los niveles de toxicidad, la toxicidad remanente es aún muy alta y su uso queda reducido a situaciones extremas donde otros tratamientos son infructuosos. Todo ello permite establecer que la obtención de nuevos compuestos macrolidos polienos para sanidad humana supone un campo prometedor para incrementar la disponibilidad de nuevas drogas aprovechando las ventajas ofrecidas por los macrolidos polienos.

Descripción de la invención

La presente invención se basa en el aislamiento y caracterización de genes que han sido capaces de modiﬁcar tanto in vivo como in vitro compuestos antifúngicos del grupo de los polienos carboxilados para generar nuevos macrolidos polienos amidados. Las secuencias nucleotídicas de estos genes codiﬁcan para una actividad amidotransferasa, dependiente de ATP capaz de amidar polienos carboxilados convencionales para obtener los correspondientes derivados amidados con ciertas propiedades biológicas optimizadas respecto a los parentales. La utilización de los genes permite obtener recombinantes genéticos que incrementan la capacidad para la producción de los polienos amidados y facilitar el proceso de producción y puriﬁcación de los polienos amidados de interés; los recombinantes genéticos que se obtengan pueden ser usados industrialmente para la producción, con alta eﬁciencia, de macrolidos polienos amidados.

En un primer aspecto, la presente invención se reﬁere a un polinucleótido aislado, de ahora en adelante polinucleótido de la invención, capaz de traducirse a la secuencia aminoacídica que se selecciona de la lista que comprende:

a) laSEQIDNO:1,

b) laSEQIDNO:2,

o a una varianteoaun fragmento biológicamente activo de dichas secuencias.

Las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 presentan una identidad de aproximadamente un 87%, estando estructuralmente relacionadas, y tienen una actividad biológica común, la conversión del grupo carboxilo de ciertos polienos en sus amidas derivadas (actuando como polienos carboxamida sintasas).

La secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 3 engloba la secuencia parcial del gen pgm (nucleótidos 1 a 524), la secuencia del gen pcsA (nucleótidos 759 a 2606), del gen phoU (nucleótidos 3561 a 4238), del gen phoR (nucleótidos 4472 a 5746), y la secuencia parcial del gen phoP (nucleótidos 5800 a 6079), de Streptomyces diastaticus var. 108.

La secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 4 engloba la secuencia parcial del ORF1 (nucleótidos 1 a 323), la secuencia del gen pgm (nucleótidos 572 a 1333), la secuencia del gen pcsB (nucleótidos 1587 a 3434), del ORF2 (nucleótidos 3599 a 3922), del ORF3 (nucleótidos 3919 a 4620), del gen phoU (nucleótidos 5278 a 5958), y la secuencia parcial del gen phoR (nucleótidos 6155 a 7391), de Streptomyces sp. cepa RGU5.3.

El término “aislado”, tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a nucleótidos o péptidos que: 1) se encuentran sustancialmente libres de componentes que normalmente acompañan o interaccionan con él en la naturaleza, o 2) si se encuentran en su medio natural, han sido sintéticamente (no naturalmente) alterados por la intervención humana y/o introducidos en una célula que no los posee de forma nativa. Por ejemplo, un nucleótido natural se convierte en “aislado” si se ha alterado, o si proviene de un ADN que ha sido alterado por medio de la intervención humana (por medio de, por ejemplo pero sin limitarnos, mutagénesis dirigida, inserciones, deleciones, etc). De la misma manera, un nucleótido natural se convierte en “aislado” si se introduce por medios no naturales en un genoma no nativo a dicho nucleótido (transfección). Por tanto, el término “aislado” en este último caso, es equivalente al término “heterólogo”.

El término “identidad”, tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa GAG, incluyendo GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (WI); BLAST, BLASTP o BLASTN, y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1999).

En el sentido utilizado en esta descripción, el término “variante” se reﬁere a una secuencia aminoacídica sustancialmente homologa a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En general, una variante incluye adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos. El término “variante” incluye también a las proteínas resultantes de modiﬁcaciones postranslacionales como, por ejemplo, pero sin limitarse, glicosilación, fosforilación o metilación.

El término “homología”, tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la semejanza entre dos estructuras debida a una ascendencia evolutiva común, o a una función común, y más concretamente, a la semejanza entre dos o más secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Puesto que dos secuencias se consideran homologas si tienen el mismo origen evolutivo o si tienen función y estructura similares, en general, se asume que valores superiores de similitud o identidad del 30% indicarían homología. Tal como aquí se utiliza, una proteína es “sustancialmente homologa” a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, cuando su secuencia de aminoácidos presenta un buen alineamiento con dichas secuencias, respectivamente; es decir, cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2, respectivamente de, al menos, un 50%, típicamente de, al menos, un 80%, ventajosamente de, al menos, un 85%, preferentemente de, al menos un 90%, más preferentemente de, al menos, un 95%, y, aún más preferentemente de, al menos, un 99%. Las secuencias homologas a cualquiera de secuencias SEQ ID NO:1oSEQ ID NO:2 pueden ser identiﬁcadas fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias.

Un experto en la materia conoce que:

a) debido a la degeneración del código genético, varias secuencias nucleotídicas podrían dar lugar a una misma secuencia aminoacídica con la actividad biológica de interés,

b) variantes que comprenden sustituciones, adiciones o deleciones individuales de un ácido nucléico, péptido, polipéptido o proteína puede alterar, adicionar o delecionar un solo aminoácido o un grupo de aminoácidos, conservando la actividad biológica de dicho péptido, o una actividad similar (al menos un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% del péptido original), especialmente cuando se sustituye uno o varios aminoácidos por otros químicamente similares. Estas variantes serían funcionalmente equivalentes a las secuencias SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 2.

La expresión “funcionalmente equivalente”, tal como aquí se utiliza, signiﬁca que los péptidos o el/los fragmento/s de lo/s péptido/s en cuestión mantiene/n esencialmente las propiedades biológicas descritas en este documento. Dicha capacidad se puede determinar mediante métodos convencionales tales como los descritos en los ejemplos que acompañan a esta descripción.

En otro aspecto, la presente invención se reﬁere a una construcción genética de ADN o ARN, de ahora en adelante construcción genética de la invención, que comprende uno de los siguientes tipos de secuencias:

a. secuencia de nucleótidos, que comprende, al menos, un polinucleótido según descrito anteriormente, para su transcripción in vitro o in vivo,o

b. secuencia de nucleótidos, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende el polinucleótido de la invención, operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos, y opcionalmente con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar.

Los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico” se usan aquí de manera intercambiable, reﬁriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxiribonucleótidos (ADN ó DNA).

Un “vector” es un replicón, o un vector integrativo, al que se ha unido otro segmento polinucleótido, para realizar la replicación y/o expresión del segmento unido.

Un “replicón” es cualquier elemento genético que se comporta como una unidad autónoma de replicación polinucleotídica dentro de una célula; esto es, capaz de replicarse bajo su propio control.

Un vector integrativo es cualquier elemento genético que se integra y se mantiene estable en el genoma de una célula.

Como se usa aquí, el término “promotor” hace referencia a una región del ADN aguas arriba del punto de inicio de la transcripción, y en el particular, que es capaz de iniciar la transcripción en una célula, sea el origen del promotor un microorganismo o no. Ejemplos de promotores incluyen, pero no se limitan a promotores de Streptomyces conocidos en el estado de la técnica, como ermE*p o tipA. Por tanto, en una realización preferida de este aspecto de la invención, el promotor es ermE*p (Kieser et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich UK). En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el promotor es tipA (Kieser et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich UK). En otra realización aún más preferida, la construcción genética es el plásmido pHJL401 (Larson & Hershberger 1986, Plasmid 15:199-209). En otra realización aún más preferida, la construcción genética es el plásmido plJ941 (Lydiate et al, 1985, Gene 35:223-235).

En otro aspecto, la presente invención se reﬁere a una célula hospedadora, de ahora en adelante célula hospedadora de la invención, que comprende el polinucleótido de la invención, o la construcción genética de la invención, según se han descrito anteriormente.

Un “hospedador”, “célula hospedadora” ó “célula hospedante” como se emplea en esta memoria se reﬁere a un organismo, célula o tejido, particularmente a una célula bacteriana, que sirve como diana o recipiente de los elementos transfectados (por ejemplo, los polinucleótidos o las construcciones genéticas de la invención). Una célula hospedadora u hospedador puede indicar, también, una célula u hospedador que expresa una proteína recombinante de interés (por ejemplo, el producto de la expresión del polinucleótido de la invención) donde la célula hospedadora se transforma con un vector de expresión conteniendo el polinucleótido de la invención, o también, los promotores de la invención que dirigen la expresión de un gen de interés.

En una realización preferida, la célula hospedadora es una bacteria, más preferiblemente una bacteria perteneciente al género Streptomyces y aún más preferiblemente a la especie Streptomyces diastaticus var. 108.

Los organismos del género Streptomyces pertenecen al superreino Bacteria, phylum Actinobacteria, clase Actinobacteria, orden Actinomycetales y familia Streptomycetaceae.

En otro aspecto, la presente invención se reﬁere a un método de obtención de macrolidos polienos que comprende cultivar la célula hospedadora de la invención en un medio adecuado. Medios de cultivo adecuados son conocidos en el estado de la técnica, y dependerán de la célula hospedadora.

En otro aspecto, la presente invención se reﬁere al uso de la célula hospedadora según descrita anteriormente para la obtención de macrolidos polienos.

En la presente invención se entiende como “macrólido polieno” un compuesto formado por un anillo lactónico macrocíclico con un número de carbonos de entre 10 a 30, más preferiblemente entre 20 y 30, y que contiene varios enlaces dobles, al que se unen una o varios desoxiazúcares tales como, pero sin limitarse a, micosamina.

En otro aspecto, la presente invención se reﬁere a un compuesto de fórmula (I)

donde

R1 se selecciona entre -COOH ó -CONH2.

R2 se selecciona entre alquilo C1-C4.

El término “alquilo” se reﬁere, en la presente invención, a cadenas alifáticas, lineales o ramiﬁcadas, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, terc-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre1y4 átomos de carbono. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, azida, ácido carboxílico o un grupo sustituido o no sustituido seleccionado de entre amino, amido, éster carboxílico, éter, tiol, acilamino o carboxamido. Cuando el grupo alquilo está sustituido, lo está preferentemente por un o varios grupos amina, amida o éter, que a su vez pueden estar o no sustituidos por grupos alquilo, amida, cicloalquilo o éteres y estos a su vez, pueden estar igualmente sustituidos o no.

En una realización preferida, en el compuesto de fórmula (I) R1 es -CONH2. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el compuesto de fórmula (I) se encuentra en forma de sal, profármaco, derivado o análogo, o cualquiera de sus combinaciones.

Tal como aquí se utiliza, el término “derivado” incluye tanto a compuestos farmacéuticamente aceptables, es decir, derivados del compuesto de fórmula (I) que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento, como derivados farmacéuticamente no aceptables, ya que éstos pueden ser útiles en la preparación de derivados farmacéuticamente aceptables.

Asimismo, dentro del alcance de esta invención se encuentran los profármacos de los compuestos de fórmula (I). El término “profármaco” tal como aquí se utiliza incluye a cualquier compuesto derivado de un compuesto de fórmula (I), por ejemplo, ésteres, incluyendo ésteres de ácidos carboxílicos, ésteres de aminoácidos, ésteres de fosfato, ésteres de sulfonato de sales metálicas, etc., carbamatos, amidas, etc., que, cuando se administra a un individuo es capaz de proporcionar, directa o indirectamente, dicho compuesto de fórmula (I) en dicho individuo. Ventajosamente, dicho derivado es un compuesto que aumenta la biodisponibilidad del compuesto de fórmula (I) cuando se administra a un individuo o que potencia la liberación del compuesto de fórmula (I) en un compartimento biológico. La naturaleza de dicho derivado no es crítica siempre y cuando pueda ser administrado a un individuo y proporcione el compuesto de fórmula (I) en un compartimento biológico de un individuo. La preparación de dicho profármaco puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.

En otro aspecto, la presente invención se reﬁere al uso de un compuesto de fórmula (I) para la fabricación de un medicamento, o alternativamente al compuesto de fórmula (I) para su uso como medicamento.

Otro aspecto de la invención se reﬁere al uso de un compuesto de fórmula (I) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección, o alternativamente al compuesto de fórmula (I) para su uso en el tratamiento de una infección. Preferiblemente, dicha infección es producida por hongos.

El compuesto de fórmula (I) de la invención, puede formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Así, puede estar, sin limitarse, en disolución acuosa estéril o en ﬂuidos biológicos, tal como suero. Las disoluciones acuosas pueden estar tamponadas o no tamponadas y tienen componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales para modular la fuerza iónica, conservantes incluyendo, pero sin limitarse a, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, y similares, y nutrientes incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas y minerales. Alternativamente, el compuesto de fórmula (I) de la invención puede prepararse para su administración en forma sólida. El compuesto de fórmula (I) de la invención puede combinarse con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a; aglutinantes tales como celulosa microcristalina, goma tragacanto, o gelatina; excipientes tales como almidón o lactosa; agentes dispersantes tales como ácido algínico o almidón de maíz; lubricantes tales como estearato de magnesio, deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes tales como menta o salicilato de metilo.

El compuesto de fórmula (I) de la invención, preparaciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, intraperitoneal, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intracecal, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal

o dérmico.

La dosiﬁcación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores (como por ejemplo, la edad, peso, sexo, tolerancia, estado del sistema inmune, tipo de agente infeccioso y gravedad de la infección) del animal, preferiblemente mamífero, y más preferiblemente humano. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión “cantidad terapéuticamente efectiva” se reﬁere a la cantidad de compuesto de fórmula (I) de la invención, profármacos, derivados o análogos de dicho compuesto que produzcan el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichos profármacos, derivados o análogos y el efecto terapéutico a conseguir. Los “adyuvantes” y “vehículos farmacéuticamente aceptables” que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia.

En otro aspecto, la presente invención se reﬁere al uso de un compuesto de fórmula (I) como antibiótico, preferiblemente como antifúngico.

En otro aspecto, la presente invención se reﬁere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula (I) junto a un vehículo farmacéutico. En otro aspecto, la presente invención se reﬁere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula (I) y,adicionalmente, otro principio activo.

Como se emplea aquí, el término “principio activo”, “sustancia activa”, “sustancia farmacéuticamente activa”, “ingrediente activo” ó “ingrediente farmacéuticamente activo” signiﬁca cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modiﬁcada prevista que proporciona la actividad especíﬁca o el efecto.

Los términos “polinucleótido” y “ácido nucléico” se usan aquí de manera intercambiable, reﬁriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos como desoxiribonucleótidos.

Los términos “péptido”, “oligopéptido”, “polipéptido” y “proteína” se usan aquí de manera intercambiable, y se reﬁeren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codiﬁcantes o no codiﬁcantes, química o bioquímicamente modiﬁcados.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra “comprende” y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Descripción de las ﬁguras

Fig. 1. Muestra los dominios conservados en las diferentes Asparaginas sintasas, utilizados para el diseño de los oligonucleótidos degenerados que se citan en la parte experimental de la presente invención.

Fig. 2. Muestra el análisis comparativo, por cromatografía de HPLC, de producción de polienos de S. diastaticus var. 108 y su recombinante con copias adicionales del gen pcsA. Los cromatogramas visualiza la señal integrada a 304 nm. Los números sobre los picos cromatográﬁcos corresponden a: 1, CE-108B; 2, CE-108; 3, rimocidina B; 4, rimocidina; 5. CE-108E y 6, CE-108D.

Fig. 3. Perﬁl cromatográﬁco en HPLC de los caldos de fermentación de Streptomyces sp. RGU5.3 silvestre, (A) y recombinante con copias adicionales del gen pcsB. Los números corresponden a: 1, pimaricina; 2, AB-400; 3, deepoxipimaricina y 4, 4,5 deepoxiAB-400. Los cromatogramas visualiza la señal integrada a 304 nm.

Fig. 4. Alineamiento de las secuencias SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO: 2 de interés.

Ejemplos

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de maniﬁesto la especiﬁcidad y efectividad del método de obtención de macrolidos polienos descrito en la presente invención.

Dado que la actividad de amidotransferasa es una herramienta susceptible de introducir mejoras farmacológicas en compuestos polienos, se ha abordado el aislamiento de los genes responsable de la actividad amidotransferasa de

S. diastaticus var. 108yde Streptomyces sp RGU5.3. La diferencia en el reconocimiento de sustratos entre la amidotransferasa de S. diastaticus ylade Streptomyces sp. RGU5.3, valoradas a partir de los correspondientes extractos acelulares, abre la posibilidad para que una vez manipulado “in vitro” el gen correspondiente, sea posible incrementar el rango de reconocimiento de sustratos y facilitar la conversión de un mayor número de polienos carboxilados a sus correspondientes carboxamidas.

La estrategia utilizada para el aislamiento de ambos genes amidotransferasa (el de S. diastaticus var. 108 yelde Streptomyces sp. RGU5.3), se ha basado en “genética reversa”. Inicialmente se alinearon varios genes codiﬁcantes de amidotransferasas, pertenecientes a la familia de “asparagina sintetasa” Tipo II a la que con toda probabilidad, en base a los datos previos obtenidos a partir de las valoraciones de los extractos acelulares, pertenecerían ambos genes. A partir de los alineamientos obtenidos se estableció una secuencia consenso. Se localizaron diferentes regiones con un alto grado de conservación: una de ella localizada en el dominio “glutaminasa” y dos en el dominio “sintetasa” (Figura 1). De esa forma se diseñaron dos parejas de oligonucleóticos “degenerados”, adaptados al uso de codones de Streptomyces y que permitieran ampliﬁcación por la técnica de PCR. Las parejas de oligonucleótidos diseñados fueron:

AsnB-deg1/AsnB-deg3rev: SEQ ID NO: 5/ SEQ ID NO: 6

AsnB-deg2/AsnB-deg4rev: SEQ ID NO: 7/ SEQ ID NO: 8.

El DNA total de Streptomyces diastaticus var. 108 y Streptomyces sp. RGU5.3 se utilizó como molde para la ampliﬁcación mediante la técnica de PCR, utilizando los “primers” diseñados según se describe anteriormente y en las siguientes combinaciones: AsnB-deg1/AsnB-deg3rev; AsnB-deg1/AsnB-deg4rev; AsnB-deg2/AsnB-deg3rev; AsnBdeg2/AsnB-deg4rev. Se obtuvieron ampliﬁcaciones del DNA con los pares de “primers”: AsnB-deg1/AsnB-deg3rev y AsnB-deg2/AsnB-deg3rev. A partir de la pareja de “primers” AsnB-deg1/AsnB-deg3rev se obtuvo un fragmento de ampliﬁcación del DNA de S. diastaticus var. 108 de 1.143 pares de bases y a partir de la pareja de “primers” AsnBdeg2/AsnB-deg3rev se obtuvo un fragmento de ampliﬁcación, a partir del DNA de Streptomyces sp. RGU5.3, de 668 pares de bases.

Ambos fragmentos se clonaron separadamente en el sitio SmaI del plásmido de Escherichia coli pUC19. Para cada uno de ellos se obtuvieron diversos plásmidos recombinantes conteniendo distintos fragmentos que se agruparon primariamente en base al patrón de enzimas de restricción. El DNA de los distintos fragmentos se secuenció para determinar el gen codiﬁcante y posteriormente los fragmentos de DNA se clonaron independientemente en el vector actinofago PM1 para proceder a la disrupción de cada uno de ellos y así determinar cual de ellos codiﬁca para la amidotransferasa responsable de la amidación de los polienos de S. diastaticus var. 108 modiﬁcado genéticamente (rimocidina y CE-108 para sintetizar rimocidinaByCE-108B) yde pimaricina en Streptomyces sp. RGU5.3 (para generar AB-400). En ambos casos se identiﬁcó el fragmento del gen codiﬁcante de la actividad amidotransferasa, a los que se han llamado pcsA (para el gen procedente de S. diastaticus var. 108) y pcsB (para el gen procedente de Streptomyces sp. RGU5.3). Ambos genes completos se aislaron a partir de las librerías genómicas de S. diastaticus var. 108 ó Streptomyces sp. RGU5.3, utilizando como sonda, en cada caso, el respectivo fragmento obtenido por ampliﬁcación de PCR y, posteriormente, utilizado para la disrupción génica. La región cromosómica solapante a cada uno de los genes se ha identiﬁcado por secuenciación de un fragmento solapante, en cada caso, a cada uno de los genes (tanto de S. diastaticus var. 108 como de Streptomyces sp. RGU5.3). La región cromosómica procedente tanto de Streptomyces sp. RGU5.3 como de S. diastaticus var. 108 se analizó informáticamente para obtener las posibles fases de lecturas de los genes codiﬁcantes. Para ello se utilizó el paquete informático “EMBOSS Suite” utilizado en entorno WEB, (M. Sarachu & M. Colet 2005, Bioinformatics 21:540-541; P. Rice et al., 2000, Trends in Genetics 6:276-277), utilizando como Tabla para uso de codones la de Streptomyces coelicolor.

Para analizar “in vitro” la expresión de los dos genes codiﬁcantes para la amidotransferasa, tanto de S. diastaticus var. 108 como de Streptomyces sp. RGU5.3, se realizaron sendas ingenierías en los genes codiﬁcantes. La región promotora de ambos genes se sustituyó por promotores de Streptomyces conocidos, tales como ermE*p o tipA, de forma que la expresión de cada uno de los genes estuviera fuera del control de los promotores nativos. Los genes recombinantes, tanto pcsA ó pcsB, se clonaron en vectores adecuados de Streptomyces, bien en bajo o número alto de copias. Los plásmidos recombinantes se introdujeron por transformación en las estirpes correspondientes, productoras de los macrolidos polienos (bien S. diastaticus var. 108 ó Streptomyces sp RGU5.3). Las cepas transformantes, conteniendo los plásmidos con el gen de la amidotransferasa, se analizaron mediante HPLC para valorar los niveles de producción de los polienos amidados. En la Figura 3 se compara la producción de los polienos amidados producidos por S. diastaticus var. 108 en la cepa con el gen pcsA recombinante en un plásmido replicativo como pHJL401, respecto a la cepa silvestre, se observa una producción sustancialmente mayor en la cepa recombinante respecto a la silvestre. Los valores de producción de los polienos amidados son, incluso, superiores a la cepa de S. diastaticus var. 108alaque se ha introducido por transformación los plásmidos descritos previamente como inductores de la sobreproducción de polienos amidados tal como pSM784.

El análisis de los caldos de fermentación de las cepas recombinantes de S. diastaticus var. 108, con copias adicionales del gen pcsA en plásmidos replicativos (tales como pHJL401 ó plJ941) permiten incrementar los niveles de amidación en aquellas moléculas susceptibles de ser amidadas, por lo que se sintetizan nuevos compuestos, no identiﬁcados previamente, tal como CE-108E (pico número 5 en el cromatograma B de la Figura 3) en cantidades suﬁcientes para poder ser puriﬁcados y analizados. Los análisis previos utilizando espectros de masas, realizados con el compuesto CE-108E, puriﬁcado por HPLC, permitió establecer que es un macrólido polieno amidado derivado del compuesto señalado como pico 6 en el cromatograma. La utilización de técnicas habituales de RMN se pudo conﬁrmar la estructura química de ambos polienos que se representan a continuación:

Desde el punto de vista estructural ambos macrolidos polienos (CE-108D y CE-108E) parecen proceder de la incorporación de “metilmalonil-CoA” en el último ciclo de condensación de la poliquétido sintetasa del cluster biosintético de rimocidina y CE-108, en lugar de butiril-CoA. La actividad biológica como fungicida de CE-108E es sustancialmente mayor que la de CE-108D y, aunque la actividad fungicida de CE-108E es menor que la de otros macrolidos similares para la mayoría de los hongos ensayados, la actividad hemolítica de CE-108E es signiﬁcativamente menor, pudiendo tener una cierta ventaja terapéutica en relación a estos otros macrolidos en función de las distintas aplicaciones.

Similarmente el recombinante genético de Streptomyces sp. RGU5.3 obtenido al introducir copias adicionales del gen pcsB de Streptomyces RGU5.3, responsable de la amidación de pimaricina para generar su derivado amidado AB400 genera una cepa en la que AB-400 es sintetizado como macrólido polieno mayoritario, a diferencia de la cepa Streptomyces sp. RGU5.3 silvestre en la que la proporción de AB-400 producido es similar a pimaricina, sugiriendo una mayor bioconversión de la pimaricina a su derivado amidado en el microorganismo recombinante.

A diferencia de 4,5 deepoxipimaricina, el nuevo compuesto detectado en los caldos de fermentación del recombinante de Streptomyces sp. RGU5.3 portando copias adicionales del gen pcsB (4,5-deepoxiAB-400) retiene una actividad biológica como antifúngico próxima a la de pimaricina, en lugar de siete veces menor a la de pimaricina como ha sido descrito previamente para el polieno carboxilado 4.5-deepoxipimaricina (Mendes et al.,2001. Chem&Biol, 8:635644). La fórmula química de ambos compuestos es como se muestra a continuación:

Tanto PcsA como PcsB, en presencia de ATP, Mg y glutamina son capaces de amidar “in vitro” los polienos correspondientes, resultando en compuestos con mayor actividad biológica que la de los compuestos parentales. Pese a la diferente especiﬁcidad de sustratos valorados “in vitro” que muestran ambas proteínas (PcsA y PcsB), los alineamientos realizados entre ambas proteínas, utilizando el programa “Supermatcher” del paquete “EMBOSS Suite” referenciado más arriba, muestran una identidad a lo largo de toda la proteína del 87% con una similitud del 93.5%.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Polinucleótido aislado capaz de traducirse a la secuencia aminoacídica que se selecciona de la lista que comprende:

a.

laSEQIDNO:1,

b.

laSEQIDNO:2,

o a una varianteoaun fragmento biológicamente activo de dichas secuencias.
2. Construcción genética de ADN o ARN que comprende uno de los siguientes tipos de secuencias:

c.

secuencia de nucleótidos, que comprende, al menos, un polinucleótido según la reivindicación 1, para su transcripción in vitro o in vivo,o

d.

secuencia de nucleótidos, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1, operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos.
3.

Construcción genética según la reivindicación 2, donde el promotor es ermE*p.
4.

Construcción genética según la reivindicación 2, donde el promotor es tipA.
5.

Construcción genética según la reivindicación 2, que es el plásmido replicativo pHJL401.
6.

Construcción genética según la reivindicación 2, que es el plásmido replicativo pIJ941.
7.

Célula hospedadora que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1, o una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 2-6.
8.

Célula según la reivindicación 7 que es una bacteria.
9.

Célula según la reivindicación 8 que pertenece al género Streptomyces.
10.

Célula hospedadora según la reivindicación 8 que pertenece a la especie Streptomyces diastaticus.
11.

Método de obtención de macrolidos polienos que comprende cultivar la célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.
12.

Uso de la célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones7a10para la obtención de macrolidos polienos.
13. Compuesto de fórmula (I)

donde R1 se selecciona entre -COOH ó -CONH2. R2 se selecciona entre alquilo C1-C4.
14. Compuesto según la reivindicación 13 donde R1 es -CONH2.
15.

Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 13-14 en forma de sal, profármaco, derivado o análogo, o cualquiera de sus combinaciones.
16. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 13-15 para la fabricación de un medicamento.
17.

Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 13-15 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección.
18.

Uso según la reivindicación 17 donde la infección está producida por hongos.
19.

Uso del compuesto de fórmula (I) según las reivindicaciones 13-15 como antibiótico.
20.

Uso del compuesto de fórmula (I) según las reivindicaciones 13-15 como como antifúngico.
21.

Composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 13-15 junto a un vehículo farmacéuticamente aceptable.
22.

Composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 13-15 y, adicionalmente, otro principio activo.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Consejo Superior de investigaciones Cientíﬁcas (CSIC)

<120> Macrolidos polienos con actividad antimicrobiana y su procedimiento biotecnológico de obtención

<130> ES1641.434

<160> 8

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 615

<212> PRT

<213> Streptomyces diastaticus var. 108

<400> 1

ES 2 371 615 A1

<210> 2

<211> 615

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. RGU5.3

<400> 2

ES 2 371 615 A1

ES 2 371 615 A1

<210> 3

<211> 6079

<212> DNA

<213> Streptomyces diastaticus var. 108

<400> 3

ES 2 371 615 A1

ES 2 371 615 A1

<210> 4

<211> 7391

<212> DNA

<213> Streptomyces sp. RGU5.3

<400> 4

ES 2 371 615 A1

ES 2 371 615 A1

ES 2 371 615 A1

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artiﬁcial

<220>

<223> cebador AsnB-deg1

<400> 5

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artiﬁcial

<220>

<223> cebador AsnB-deg3rev

<400> 6

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Artiﬁcial

<220>

<223> cebador AsnB-deg2

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> nesa,c,g,tou

<400> 7 <210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artiﬁcial

<220>

<223> AsnB-deg4rev

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> nesa,c,g,tou

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> nesa,c,g,tou

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> nesa,c,g,tou

<400> 8

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.º solicitud: 200930550

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 31.07.2009

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

Documentos citados Reivindicaciones afectadas

X

WO 2006100330 A2 (CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS) 28.09.2006, página 7, línea 33 – página 8, línea 4; página 12, líneas 1-6; página 19, línea 15 – página 22, línea 10; página 25, línea 30 – página 29, línea 2; tabla 1; reivindicaciones 1-27. 13-22

X

ELENA M. SECO et al. "Two polyene amides produced by genetically modified Streptomyces diastaticus var. 108" CHEMISTRY & BIOLOGY, vol. 12, mayo 2005, páginas 535-543. Resumen, figura 1, tabla 1 y página 541. 13-22

X

ELENA M. SECO et al. "A tailoring activity is responsible for generating polyene amide derivatives in Streptomyces diastaticus var. 108" CHEMISTRY & BIOLOGY, vol. 12, octubre 2005, páginas 1093-1101. Figura 1, tabla 1, página 1098, columna derecha y página 1099. 13-22

X

ELENA M. SECO et al. "Starter unit choise determines the production of two tetraene macrolides, rimocidin and CE-108, in Streptomyces diastaticus var.108" CHEMISTRY & BIOLOGY, vol. 11, marzo 2004, páginas 357-366. Página 357; página 358, columna izquierda, segundo párrafo; página 364 y figura 6. 13-22

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe 07.12.2011

Examinador S. González Peñalba Página 1/5

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 200930550

CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD

C07H17/08 (2006.01) C12P19/62 (2006.01) C12N15/54 (2006.01) A61P31/00 (2006.01) A61P31/10 (2006.01) C12R1/465 (2006.01)

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

C07H, C12P, C12N, A61P, C12R

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)

INVENES, EPODOC, WPI, NPL, BIOSIS, MEDLINE, EMBASE, XPESP

Informe del Estado de la Técnica Página 2/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200930550

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 07.12.2011

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-22 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-12 13-22 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200930550

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

WO 2006100330 A2 (CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS) 28.09.2006

D02

ELENA M. SECO et al. "Two polyene amides produced by genetically modified Streptomyces diastaticus var. 108" CHEMISTRY & BIOLOGY, vol. 12, mayo 2005, páginas 535-543. Resumen, figura 1, tabla 1 y página 541.

D03

ELENA M. SECO et al. "A tailoring activity is responsible for generating polyene amide derivatives in Streptomyces diastaticus var. 108" CHEMISTRY & BIOLOGY, vol. 12, octubre 2005, páginas 1093-1101. Figura 1, tabla 1, página 1098, columna derecha y página 1099.

D04

ELENA M. SECO et al. "Starter unit choise determines the production of two tetraene macrolides, rimocidin and CE-108, in Streptomyces diastaticus var.108" CHEMISTRY & BIOLOGY, vol. 11, marzo 2004, páginas 357-366. Página 357; página 358, columna izquierda, segundo párrafo; página 364 y figura 6.
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

La presente solicitud de patente, tal y como ha sido redactada se refiere a genes que codifican para la actividad amidotransferasa, implicados en la biosíntesis de macrólidos polienos. Hace referencia concretamente a un polinucleótido aislado capaz de traducirse a la secuencia aminoacídica que se selecciona de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o a una variante o a un fragmento biológicamente activo de dichas secuencias (reivindicación 1). Se refiere también a una construcción genética de ADN o ARN que comprende dichas secuencias (reivindicación 2), en la que el promotor es ermE*p (reivindicación 3), o tipA (reivindicación 4), el plásmido replicativo es pHJL401 (reivindicación 5), o piJ941 (reivindicación 6). Además, reivindica una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido o dicha construcción genética (reivindicación 7); siendo dicha célula una bacteria (reivindicación 8), del género streptomyces (reivindicación 9) perteneciente a la especie Streptomyces diastaticus (reivindicación 10) y a su uso (reivindicación 12). Y por último, hace referencia al método de obtención de macrólidos polienos (reivindicación 11), a macrólidos polienos de fórmula (I) (reivindicaciones 13-15), al uso de dichos compuestos como medicamento (reivindicación 16), para el tratamiento de una infección (reivindicación 17), producida por hongos (reivindicación 18), como antibiótico (reivindicación 19) y como antifúngico (reivindicación 20) y a la composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula (I) junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable (reivindicación 21) y adicionalmente otro principio activo (reivindicación 22). NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA .LP ARTS. 6 Y 8 El documento D01 trata sobre polienos amidados de formula (I) en la R1 es alquilo C1-C3 y R2 es un grupo funcional elegido entre CH3 –ó CONH2 (véase página 12, líneas 1-6), y un compuesto de fórmula (I-1) derivado amidado del polieno de fórmula (I) (Véase página 12, línea 5), que tienen actividad biocida (véase página 7, línea 33-página 8, línea 4) y terapéutica (véase página 19, línea 15-página 22, línea 10)), obtenidos mediante manipulación genética de Streptomyces diastaticus var. 108, por transformación con vectores derivados de SCP2* que portan el gen de resistencia a eritromicina (ermE) (véase página 25, línea 30-página 29, línea 2 y Tabla 1 y reivindicaciones 1-27). El documento D02 hace referencia al estudio de Streptomyces diastaticus var. 108 como cepa productora de dos macrólidos (rimocidina y CE-108) y a un cluster de genes biosintético. Se detectaron dos macrolidos, no caracterizados previamente, cuando se sometíó a fermentación a la cepa productora modificada genéticamente mediante transformación con algunos vectores derivados de SCP2* que llevaban el gen ermE, y dichos macrólidos se caracterizaron químicamente como las amidas de los ácidos carboxílicos de los polienos parentales (véase resumen, figura 1, tabla 1 y página 541). El documento D03 caracteriza la rimocidina B (3b) y el compuesto CE-108B (4b) como dos polienos amidados con propiedades farmacológicas mejoradas, producidos por Streptomyces var. 108, genéticamente modificada. Mediante el análisis genético y bioquímico de la cepa productora se muestra que las dos amidas se obtienen a partir de los polienos parentales de rimocidina (3a) y CE-108 (4a) mediante modificación post-PKS de la cadena lateral libre de ácido carboxílico, esta modificación se lleva a cabo por medio de actividad aminotransferasa (véase figura 1; Tabla 1; página 1098, columna derecha y página 1099).

Informe del Estado de la Técnica Página 4/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200930550

El documento D04 describe como especies del género Streptomyces producen una gran variedad de metabolitos secundarios que son policétidos con actividades biológicas diferentes como antibacterianas, antifúngicas, inmunosupresoras, antirumorales, etc. De entre estos policétidos destacan ciertos polienos con actividad antifúngica (véase página 357). Así Streptomuces diastaticus var. 108 produce dos tetraenos muy relacionados entre sí: rimocidina y CE-108 (véase Figura 6). Además, en dicho artículo se indica que a partir de S.diastaticus var.108 mediante manipulación genética se podría crear un cluster de los dos polienos que podría servir como herramienta para modificar los genes de biosíntesis de los polienos y así obtener un nuevo compuesto bioactivo (véase página 358, columna izquierda, segundo párrafo, y página 364). A la vista de los documentos citados anteriormente, se considera que las reivindicaciones 1 -12 presentan novedad y actividad inventiva porque no se ha encontrado el polinucleótido aislado capaz de traducirse a la secuencia aminoacídica que se selecciona de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, ni la construcción genética de ADN o ARN que comprende dichos tipos de secuencias, ni la célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido. En cuanto a las reivindicaciones 13-22, se considera que tienen novedad pero carecen de actividad inventiva. Tienen novedad porque no se ha encontrado el compuesto de fórmula (I) de la invención, pero si se han encontrado en los documentos D01-D04 compuestos que sólo se diferencian en el radical alquilo que se encuentra en la posición 2 del anillo macrocíclico, tratándose en la presente solicitud de patente de un radical metilo, frente al radical etilo presente en el resto de los documentos. El radical de la posición 14 del anillo macrocíclico puede ser en todos los casos o un grupo carboxílico o amida, como el de la presente invención. Por lo que las reivindicaciones 13-15 se consideran que carecen de actividad inventiva ya que, el hecho de que un compuesto tenga un grupo metilo en lugar de un grupo etilo no le confiere actividad inventiva, sobretodo porque en dicha solicitud de patente no se indica que dicho grupo metilo confiera ninguna característica técnica especial al compuesto. En cuanto a las reivindicaciones de uso 16-20 y de composición 21-22, carecen igualmente de actividad inventiva ya que el uso del compuesto de la presente solicitud de patente es el mismo que el de los compuestos recogidos en los documentos D01-D04, y las composiciones farmacéuticas resultan evidentes para un experto en la materia. Por lo tanto, las reivindicaciones 1-12 son nuevas y tienen actividad inventiva y las reivindicaciones 13-22 son nuevas, pero carecen de actividad inventiva según los artículos 6 y 8 de la LP.

Informe del Estado de la Técnica Página 5/5