KR101422457B1

KR101422457B1 - 페닐알라닌을 함유하는 흡입용 분말

Info

Publication number: KR101422457B1
Application number: KR1020097001500A
Authority: KR
Inventors: 토르슈텐 슐츠-파뎀레히트; 파트리크 가리델; 카롤리네 베히톨트-페터스; 베아테 피셔
Original assignee: 베링거 잉겔하임 파르마 게엠베하 운트 코 카게
Priority date: 2006-06-29
Filing date: 2007-06-28
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2027-06-28
Also published as: US8226982B2; ATE454135T1; JP5534581B2; EP2037883B1; DK2037883T3; EP2037883A2; ES2335711T3; TWI392506B; KR20090024287A; CA2654264A1; JP2009541446A; US20080089849A1; DE502007002570D1; CA2654264C; WO2008000780A2; WO2008000780A3; TW200810781A; DE102006030164A1

Abstract

본 발명은 페닐알라닌 부분이 적어도 30% (w/w) 또는 적어도 40% (w/w)에 이르는 단백질 및 페닐알라닌 함유 분말에 관한 것이다. 페닐알라닌을 함유하는 분말은 특히 분무 건조 후 공기역학적 작용 및 단백질 안정화 측면에서, 개선된 공기역학적 특징을 갖는 분말 또는 단백질 조성물을 제조하는데 매우 적합한 것으로 나타났다. 주요 구성분은 페닐알라닌이고, 임의의 다른 구성분은 보조제, 바람직하게는 페닐알라닌에 비해 매우 수용성인 당 또는 폴리올이다.

흡입 분말, 단백질 안정화, 공기역학적 특징, 페닐알라닌

Description

페닐알라닌을 함유하는 흡입용 분말{Inhalant powder containing phenylalanine}

본 발명은 적어도 페닐알라닌과 단백질을 함유하고, 단백질이 바람직하게는 활성 물질, 특히 약제학적 활성 물질인 페닐알라닌-함유 분말, 특히 분무-건조 분말에 관한 것이다. 본 발명의 분말은 적어도 30% (w/w), 바람직하게는 40% (w/w)의 페닐알라닌 분획 및 임의로 단백질 안정성을 증진시키는 하나 이상의 제2 약제학적으로 허용되는 부형제, 즉 당 (sugar)을 함유한다. 추가로, 본 발명은 상기 페닐알라닌-함유 분말의 제조방법 뿐만 아니라 특히 흡입성 약제학적 조성물로서의 이의 용도에 관한 것이다. 바람직한 단백질은 기도의 국소 치료 또는 전신 치료를 위한 항체, 항체의 일부, 항체 또는 항체의 일부를 갖는 융합 단백질, 호르몬, 성장 인자, 효소, 사이토카인, 인터페론 등과 같은 약제학적 활성 물질이다.

수용액으로 제형화된 단백질 제제 또는 활성 물질/활성 물질 제제는 몇몇 경우에 불안정화되는 경향이 있어, 효율 또는 생활성을 감소시키고 독성 또는 부적합성을 증가시킬 수 있다. 이것은 통상의 약제 및 단백질, 특히 펩타이드 또는 단백질 함유 활성 물질 둘 다에 적용된다. 단백질 또는 약제학적 활성 물질의 안정성은 구조를 변화시키거나 (내부적) 또는 적합한 부형제를 가함으로써 (외부적) 유리하게 영향을 받을 수 있다.

단백질 또는 약제학적 활성 물질을 외부적으로 안정화시키는 통상적인 방법은 적합한 부형제를 사용하는 것이다. 부형제는 대략 다음의 카테고리로 나눌 수 있다: 당 및 폴리올, 아미노산, 아민, 염, 중합체 및 계면활성제.

당 및 폴리올은 비-특이적 안정화제로서 종종 사용된다. 단백질 또는 생물학적 활성 물질에 있어서의 이들의 안정화 효과는 주로 "우선 배제 (preferential exclusion)"에 기인한다 (문헌 참조; Xie and Timasheff, 1997, Biophysical Chemistry, 64(1-3), 25-43; Xie and Timasheff, 1997, Protein Science, 6(1), 211-221; Timasheff, 1998, Advances in Protein chemistry, 51, 355-432). 당을 선택할 때에는, 단백질 또는 생물학적 활성 물질의 경우에 환원당은 통상적으로 피한다. 비환원당인 사카로즈 및 트레할로즈가 바람직하게 사용된다. 적합한 부형제의 추가의 예는 글루코즈, 소르비톨, 글리세롤 (문헌 참조; Boctor and Mehta, 1992, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 44 (7), 600-3; Timasheff, 1993, Annual review of biophysics and biomolecular structure, 22, 67-97; Chang et al., 1993, Pharmaceutical Research, 10(10), 1478-83) 및 만니톨 (문헌 참조; Hermann et al., 1996, Pharmaceutical Biotechnology, 9 (Formulation, Characterization, and Stability of Protein Drugs) 303-328; Chan et al., 1996, Pharmaceutical Research, 13(5), 756-761)이다. 또한, 모든 종류의 중합체가 단백질 또는 약제학적 활성 물질, 예를 들면, 항체에 대해 안정화 효과를 갖는다는 것은 공지되어 있다. 과거에 종종 사용되었던 사람 혈청 알부민 (HAS)은 실제로 매우 양호한 안정성을 갖지만, "혈액-매개 (blood-borne)" 병원체로의 오염 가능성으로 인해, 한동안 적합하지 않았다. 지금까지 공지된 중합체 중에서, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 (HP-β-CD)이, 안전하게 비경구 투여될 수 있기 때문에 특히 적합한 것으로 판명되었다. 또 다른 예는 고분자 덱스트란 (18 내지 82kD), 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 헤파린, 타입 A 및 B 젤라틴 뿐만 아니라 하이드록시에틸-전분 (HES), 헤파린, 덱스트란 설페이트, 폴리인산, 폴리-L-글루탐산, 폴리-L-리신이다.

당 및 폴리올 이외에, 아미노산을 또한 자체로 또는 다른 부형제와 함께 안정화제로서 사용할 수 있다. 바람직하게는 아미노산은 단백질을 안정화시키는 데 사용된다. 예를 들면, 히스티딘, 글리신, 나트륨-아스파르테이트 (Na-Asp), 글루타메이트 및 리신 하이드로클로라이드 (Lys-HCl)의 첨가는 5% 만니톨과 함께 10mM 나트륨 포스페이트 완충액 (pH 7.0) 속에서 rhKGF의 응집을 억제한다 (문헌 참조; Zhang et al., 1995, Biochemistry, 34 (27), 8631-41). 아미노산과 프로필렌글리콜과의 배합물은, 예를 들면, rhCNTF의 구조적 안정성을 개선시킨다 (문헌 참조; Dix et al, 1995, Pharmaceutical Research (Supplement), 12, S97). 리신 및 아르기닌은 IL-1R의 열안정성을 증가시키는 반면 (Tm 증가), 글리신 및 알라닌은 불안정화 효과를 갖는다 (문헌 참조; Remmele et al., 1998, Pharmaceutical Research, 15(2), 200-208).

더욱이, 단백질 또는 약제학적 활성 물질을 함유하는 분말의 안정성은 다양한 건조 공정에 의해 증가될 수 있다. 건조는 단백질 또는 활성 물질의 안정성을 유지하고 건조 분말의 특성을 개선시키는 부형제의 존재하에서 통상적으로 수행된다. 건조에 의해 안정화시키는 데 있어서의 중대한 요인은 무정형 매트릭스에서의 단백질 또는 활성 물질의 고정화이다. 무정형 상태는 높은 점도와 낮은 분자 이동성 및 낮은 반응성을 갖는다. 따라서, 유리한 부형제는 단백질 또는 활성 물질이 매봉되는, 가능한 최고의 유리 전이 온도를 갖는 무정형 매트릭스를 형성할 수 있어야 한다. 따라서, 부형제의 선택이 특히 이의 안정화 특성을 좌우한다. 그러나, 또한, 부형제의 약제학적 허용성 및 입자 형성, 분산성 및 유동 특성에 미치는 이의 영향과 같은 요인들이 특히 분무-건조 공정에서 결정적인 역할을 한다.

분무-건조는 단백질 또는 펩타이드/단백질 유형의 약제학적 활성 물질의 화학적 및 물리적 안정성을 증가시키는 데 특히 적합한 공정이다 (문헌 참조; Maa et al., 1998, Pharmaceutical Research, 15(5), 768-775). 특히 폐질환 치료 분야에서, 흡입에 의한 투여가 현재 전신 질환 치료에 있어서의 대안이기 때문에 (국제 공개공보 제WO 99/07340호 참조), 분무 건조의 사용이 점점 더 증가하고 있다 (문헌 참조; 미국 특허 제5,626,874호; 미국 특허 제5,972,388호; Broadhead et al., 1994, J. Pharm Pharmacol., 46(6), 458-467). 이를 위한 필수 요건은, 입자가 폐 깊숙이 침투하여 혈류로 도입될 수 있도록 분말 입자의 평균 공기역학적 입자 크기 (MMAD = 질량 중위 공기역학적 직경)가 1 내지 10㎛, 바람직하게는 1 내지 7.5㎛여야 한다는 것이다. 예를 들면, 독일 공개특허공보 제DE-A-179 22 07호는 상응하는 분무 건조 분말의 제조를 기재하고 있다. 반면에, 상응하는 분말을 제조하는 다수의 방법들이 기재되어 있다 (문헌 참조; 국제 공개공보 제WO 95/31479호; 제WO 96/09814호; 제WO 96/32096호; 제WO 96/32149호; 제WO 97/41833호; 제WO 97/44013호; 제WO 98/16205호; 제WO 98/31346호; 제WO 99/66903호; 제WO 00/10541호; 제WO 01/13893호; Maa et al., 1998, supra; Vidgren et al., 1987, Int. J. Pharmaceutics, 35, 139-144; Niven et al., 1994, Pharmaceutical Research, 11(8), 1101-1109).

당 및 이의 알콜, 예를 들면, 트레할로즈, 락토즈, 사카로즈 또는 만니톨, 및 각종 중합체가 부형제로서 적합한 것으로 판명되었다 (문헌 참조; Maa et al., 1997, Pharm. Development and Technology, 2(3), 213-223; Maa et al., 1998, supra; Dissertation Adler, 1998, University of Erlangen; Costantino, et al., 1998, J. Pharm. Sci., 87(11), 1406-1411).

그러나, 주로 사용되는 부형제는 다양한 단점이 있다. 예를 들면, 트레할로즈 및 만니톨의 첨가는 분무-건조 제형의 유동 특성을 손상시킨다 (문헌 참조; C. Bosquillon et al., 2001 Journal of Controlled Release, 70(3), 329-339). 분무-건조 트레할로즈는 종종 생성된 입자의 심각한 끈적거림을 야기한다 (문헌 참조; L. Mao et. al., 2004 Respiratory Drug Delivery IX, S. 653-656). 이것은 분말의 수율 및 공정의 경직성과 관련된 기술상의 가공 문제 뿐만 아니라, 수득될 수 있는 미립자 분획 (fine particle fraction)의 감소에 의해 야기되는, 폐 적용 분말의 생체이용효율의 저하와 관련된다. 더욱이, 만니톨은 20중량% 이상의 양에서 재결정화되는 경향이 있으며 (문헌 참조; Costantino et al., 1998, supra), 그 결과로 이의 안정화 효과가 크게 감소된다. 종종 사용되는 부형제인 락토즈는 분무-건조 제형의 유동 특성은 증가시키지만 (문헌 참조; C. Bosquillon et al., 2001, supra), 락토즈가 이의 환원 특성의 결과로서 펩타이드/단백질과의 불안정한 마일라드 반응 (Mailard reaction)에 도입될 수 있기 때문에 특히 단백질 또는 펩타이드/단백질-함유 활성 물질의 제형화에 있어서 문제가 된다.

그러나, 부형제를 사용한 단백질 안정화 이외에, 분무-건조 분말의 물리화학적 특성을 최적화하는 것이 레시피 개발의 초점이다. 특히, 분말, 특히 분무-건조 분말은 응집 및 접착 특성을 갖는 경향이 있다. 이의 중요한 이유 중의 하나는 폐투여에 필요한 10㎛ 미만의 입자 크기이다. 이러한 작은 입자 크기에서, 입자 상호작용, 예를 들면, 반데르 발스 힘, 모세관 힘, 쌍극자 상호작용 및 정전기 상호작용이 중력보다 우세하다[문헌 참조; I. Zimmermann, Pharmazeutische Industrie, Springer-Verlag]. 수증기 응축에 의해 야기되는 모세관 힘은 감소된 습도에서 분말의 적당한 저장에 의해 조절될 수 있는 반면에, (분무-건조) 입자들 사이의 반데르 발스 힘 및 정전기 상호작용은 중대한 문제인 것으로 판명되었다.

입자간 상호작용은 입자 표면을 소수성으로 되게 하여 감소시킬 수 있다. 이것은 첨가제로서 소수성 물질을 단백질 또는 활성 물질 및 기타의 적합한 부형제와 용해시키고 이들을 분무-건조함으로써 수행할 수 있다. 표면에 소수성을 부여하는 기술 양상은 특히 소수성 아미노산 L-류신으로 이루어진다 (문헌 참조; L. Mao et. al., 2004 Respiratory Drug Delivery IX, S. 653-656, AR.Najafabadi et al., 2004, Int J Pharm. 2004 Nov 5;285(1-2):97-108.). 이 공정에서는 표면 피복물만이 개질되기 때문에, 필요한 L-류신의 양은 단지 5-10중량% (% w/w)이다. 아미노산의 비율을 증가시키면, 종종 바람직하지 않은 결정화 효과를 야기하여 단백질을 손상시킨다 (문헌 참조; Dissertation by Richard Fuhrherr, 2005, LMU Uni, Munich). 단백질 및 바람직하게는 분무 용액에, 예를 들면, DL-아스파라긴, DL-아르기닌, DL-메티오닌, DL-페닐알라닌 및 DL-트립토판과 같은 다른 아미노산 (문헌 참조; N.Y.K. Chew et. al, 2002 Respiratory Drug Delivery VIII, S. 743-745)을 첨가하는 것은 입자의 공기역학적 특징에 유리한 영향을 미칠 수 있다. 소수성 물질을 단백질 및 특히 분무 용액에 직접 첨가하는 것 이외에, 분말 입자를 추가의 단계에서 첨가제로 피복할 수 있다. 이를 위해 특히 적합한 물질은 L-류신, 인지질 및 Mg-스테아레이트 (국제 공개공보 제WO2004093848호)이다. 가능한 피복 방법은 중력 혼합기, 예를 들면, 텀블 혼합기 (미국 특허 제2005152849호) 뿐만 아니라 기계적 혼합법, 예를 들면, 제트 그라인딩 (jet grinding) (국제 공개공보 제WO2004093848호)을 사용한다.

단백질 및 펩타이드를 투여하는 통상적인 방법은 비경구 투여에 의한 것이다. 활성 물질은, 예를 들면, 정맥내, 근육내 및 피하로 제공될 수 있다. 기술 양상은 캐뉼라, 예를 들면, 시린지와 조합된 캐뉼라, 펜을 통해 또는 주입백 (infusion bag)을 사용한 주입으로서 약제를 투여하는 것이다. 이의 단점은 투여하기 전에 분말 제형을 액체 속에서 재구성해야 한다는 것이다. 더욱이, 비경구 투여는 일반적인 호소인 주사침 공포증 (needle phobia) 때문에 환자들에게 인기가 없다. 이러한 이유로, 비경구 치료는 종종 의사에 의해 제공되어야 한다. 이와 반대로, 전신성 흡입 제형은 환자 자신이 투여할 수 있다.

단백질/펩타이드는 폐를 통한 수동 확산 또는 능동 수송에 의해 혈류로 도입될 수 있다. 수동 수송시, 흡수율은 활성 물질의 분자의 크기의 함수이다[문헌 참조; J.S. Patton, Nature Biotechnology, 16, 141ff, 1998].

예를 들면, 인슐린과 같은 작은 단백질의 경우에는 우수한 생체이용효율이 밝혀진데 반해 (문헌 참조; J.S. Patton, 1999 Advanced Drug Delivery Review, 35, 235-247), 보다 큰 단백질 및 특히 항체는 일반적으로 매우 낮은 흡수율을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 효율적인 형태의 약제를 개발하기 위해서는, 보다 큰 단백질이 특정 메카니즘에 의해 폐 상피를 통해 능동적으로 수송되어야 한다.

폐 상피를 통해 항체를 능동적으로 수송하기 위한 한 가지 가능성은 신생아 Fc-수용체 (neonatal Fc-receptor)이다 (문헌 참조; A. Bitonti, 2004, Respiratory Drug Delivery IX .79-85). 이들 수용체는 신생아 뿐만 아니라 어린이 및 성인의 폐에 충분히 많은 수로 존재하며 활성 물질을 능동 수송하는 데 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

의료 용도를 위해 단백질을 함유하는 분말, 특히 분무-건조 분말 또는 단백질 조성물을 제조하는 경우, 특정한 도전은, 우수한 단백질 안정성 이외에, 분말 또는 이의 입자, 특히 분무-건조 분말 및 입자가 폐 깊숙이 침투하여 혈류로 쉽게 도입될 수 있도록 가장 유리한 공기역학적 특징을 가능한 한 달성하는 것이다.

각종 질환을 치료하기 위해 최근 점점 더 많은 흡입성 약제가 개발되고 있거나[제조원 (inhalable insulin as a development product made by Messrs Aradigm, Mannkind or Kos, K. Corkery, Respiratory Care, 45, 831ff, 2000)에 의해 제조된 개발품으로서의 흡입성 인슐린], 이미 시판중이다[예를 들면, 재조합 사람 데옥시리보뉴클레아제 I (rhDNase)의 흡입 형태로서의 풀모자임 (Pulmozyme)^R 또는 사람 인슐린의 흡입 형태로서의 엑수베라 (Exubera), 미국 특허 제5997848호 참조]. 특정 약제는 폐에서 폐포를 통해 직접 혈류로 쉽게 흡수되는 것으로 밝혀졌다. 흡입에 의한 투여는 다른 경로 (예를 들면, 경구)로 투여하기 곤란한 거대분자, 예를 들면, 단백질, 폴리펩타이드 및 헥산을 투여하는 데 특히 유망하다. 이러한 흡입에 의한 투여는 폐의 전신 질환 및 국소 질환 둘 다에 효과적으로 사용될 수 있다.

폐 약물 투여는 다양한 방법으로, 예를 들면, 액체 분무기 (liquid nebulizers), 분사제계 흡입기 (propellant-based inhalers) (에어로졸계 계량식 흡입기 (aerosol-based metered-dose inhalers = MDI)) 및 건조 분말 분산 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 분사제계 제형의 개발은 광범위한 문제와 관련된다. 따라서, 기존의 클로로플루오로카본 (CFC)은 오존-손상 특성 때문에 더 이상 사용할 수 없다. 대체품으로서, 또 다른 분사제 가스가 사용될 수 있다 (HFA-143a/HFA227). 그러나, 또 다른 분사제 가스는 종종 CFC와 비교하여 감소된 활성 물질의 용해도를 나타낸다. 또한, 현탁액을 제조하는 경우에 현탁액의 안정성이 중요하며, 그 결과로 분사제 가스와 입자 사이의 매개체로서 추가의 부형제가 요구된다. 종종 항체에서 요구되는 바와 같은 고용량 세팅은 MDI를 사용해서는 달성하기가 어렵다. 이러한 요인은 MDI가 펩타이드 및 단백질 레시피를 위해 점점 더 바람직해지고 있음을 의미한다. 분사제 가스 에어로졸 기술에 의존하지 않는 건조 분말 분산 장치가, 건조 분말로서 용이하게 제형화될 수 있는 약제의 분야에서 유망하다.

다수의 다른 불안정한 거대분자는 자체로 또는 적합한 부형제와 함께 분말, 특히 동결건조되거나 분무-건조된 분말 형태로 안정화될 수 있다. 그러나, 건조 분말로서 약제학적 조성물을 투여할 수 있는 능력은 자체의 문제가 있다. 다수의 약제학적 조성물의 계량이 종종 중요하다. 이러한 이유로, 건조 분말을 투여하기 위한 모든 시스템은 의도된 용량을 정확하고 정밀하고 신뢰성있게 투여하는 것이 필수적이다. 이것은 지금까지 공지된 시스템으로는 신뢰성있게 보장되지 않는다. 또한, 다수의 약제는 매우 고가이다. 따라서, 건조 분말은 효율적으로 전달될 수 있어야 한다는 것이 중요하다. 또한, 분말은 적합한 분포 및 시스템 흡수를 보장하도록 환자에 의해 흡입되기 전에 용이하게 분산 가능한 (비행할 수 있는) 것이 중요하다. 이러한 점은 단백질 또는 약제학적 활성 물질을 함유하는 대부분의 통상의 분말에서는 이상적으로 충족되지 않는다.

따라서, 다량의 단백질을 함유하는 지금까지 사용되어온 분말, 특히 약제학적 활성 물질을 갖는 분무-건조 분말 또는 단백질 조성물에서는, 효율적이고 최적의 폐 투여가 가능하지 않다는 문제가 야기된다. 분명히, 지금까지 사용되어온 분말에서는 우수한 단백질 안정성은 달성할 수 있지만 최적의 공기역학적 특징은 달성할 수 없었다. 예를 들면, 분말, 특히 분무-건조 분말 중의 다량의 항체는 1차 입자의 심각한 덩어리화 (clumping)를 야기한다. 이러한 덩어리는 분산시키기가 곤란하며, 이것은 공기역학적 특징에 불리한 영향을 미친다 (문헌 참조; doctoral thesis of Stefanie Schule, Uni LMU 2005).

따라서, 투여하고자 하는 단백질 또는 약제학적 활성 물질은, 사용되는 활성 물질 중의 단지 소량만이 폐에서 표적 부위에 도달하기 때문에, 실제로 필요한 것보다 상당히 많은 양으로 투여되어야 한다. 부작용의 위험 또한 투여가 효율적인 경우보다 더 크다.

따라서, 충분한 단백질 안정성 이외에 또한 매우 우수하거나 개선된 공기역학적 특징을 갖는 대체 분말, 특히 분무-건조 분말 또는 단백질 조성물을 제공하는 데에는 문제가 야기된다.

본 발명의 추가의 목적은 흡입에 의해 사용하기 위한, 특히 약제학적 또는 의학적 용도를 위한, 상응하는 대체 분말, 특히 분무-건조 분말 또는 단백질 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 근거로 하는 문제는 하기의 양태 및 청구의 범위에 기재된 목적 및 방법에 의해 해결된다.

발명의 개요

본 발명은 적어도 30% (w/w) 페닐알라닌, 바람직하게는 적어도 40% (w/w) 페닐알라닌을 함유함을 특징으로 하는, 단백질 및 페닐알라닌 뿐만 아니라 임의의 당을 함유하는 분말, 특히 분무-건조 분말에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 적어도 30% (w/w) 페닐알라닌, 바람직하게는 적어도 40% (w/w) 페닐알라닌을 함유함을 특징으로 하는, 단백질 및 페닐알라닌 뿐만 아니라 임의로 추가의 부형제, 예를 들면, 당 또는 폴리올을 함유하는 약제학적 조성물, 특히 분무-건조 조성물에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은

a) 페닐알라닌 용액을 제조하는 단계,

b) 하나 이상의 단백질 및 임의로 하나 이상의 추가의 부형제, 예를 들면, 당 또는 폴리올을 가하는 단계,

c) 수득된 용액 또는 현탁액을 바람직하게는 90 내지 200℃의 유입 온도 및 바람직하게는 40 내지 150℃의 유출 온도에서 분무하는 단계, 및

d) 형성된 입자를 건조 가스로부터 분리하는 단계를 특징으로 하는, 분말의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 약제, 특히 흡입 약제로서의 상기한 분말의 용도 및 호흡기병 또는 전신 질환, 예를 들면, 폐암, 폐 염증, 다낭성 섬유증, COPD (만성 폐색성 폐 질환), 천식, 항-염증 질환, 예를 들면, 호흡기 합포체 바이러스 (respiratory-syncytial virus; RSV)에 의해 야기되는 질환의 치료용 약제를 제조하기 위한 상기한 분말의 용도에 관한 것이다.

단백질을 함유하는 2원 및 3원 분말은, 분무-건조 후의 이의 공기역학적 특징 및 단백질 안정화 측면에서, 뛰어난 공기역학적 특징을 갖는 대체물, 바람직하게는 분무-건조 분말 또는 단백질 조성물을 제조하는 데 매우 적합한 것으로 나타났다. 주 성분은 페닐알라닌이고, 임의의 추가 성분은 페닐알라닌에 비해 수용해 도가 우수한 부형제, 예를 들면, 당 또는 폴리올이다.

높은 비율의 페닐알라닌은 분말을 제조하는 데 있어 중요하다. 페닐알라닌의 낮은 용해도 및 높은 소수성의 결과로, 페닐알라닌은 입자의 표면에 축적되며, 이에 따라, 표면 구조 및 입자 형태에 기여한다. 따라서, 용이하게 물에 용해되는 성분, 예를 들면, 당 락토수크로즈 (LS90P) 또는 사카로즈 및 단백질은 주로 코어내에 침전되고 무정형 매트릭스를 형성해야 한다.

또한, 소수성 및 용해도 측면에서 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산 (예를 들면, 발린, 류신 또는 이소류신)은 상응하게 우수한 분말의 공기역학적 특징을 초래하지 않으며, 따라서 적어도 30% (w/w) 페닐알라닌, 바람직하게는 적어도 40% (w/w) 페닐알라닌 또는 언급된 다른 페닐알라닌 % (w/w) 함량을 함유하는 분말 제형을 제조하는 데 부적합한 것으로 나타났다.

또한, 입자 형태는 분무-건조 분말 중의 페닐알라닌의 함량에 크게 의존하는 것으로 나타났다. 50% (w/w), 40% (w/w) 및 30% (w/w)의 페닐알라닌 함량에서는, 매우 주름진 건포도형 입자가 수득된다 (도 10a 내지 10c 참조). 페닐알라닌 함량이 20%로 저하되는 경우, 주름 (creasing) 강도는 급격하게 감소한다. 입자 형태의 변화는 분말의 공기역학적 특징의 저하와 상관성이 있다. 이것은 분무 용액의 분무 건조시 페닐알라닌의 긍정적인 효과는 단지 30% (w/w) 이상에서 자명해짐을 의미한다.

다른 방향족 아미노산을 사용한 시험은 다음과 같은 결과를 초래하였다.

티로신은 수용해도가 너무 낮아서 제형화 성분으로 간주되지 않는다.

트립토판의 경우 단지 20% 트립토판 함량을 갖는 분말 제형이 제조될 수 있다. 이러한 소량으로는, 분무-건조시, 특히 공기역학적 특징에 있어서 트립토판의 기술상의 잇점이 탐지될 수 없다.

히스티딘-함유 분말은 페닐알라닌-함유 분말에 비해 공기중 습도에 매우 민감하다. 따라서, 히스티딘-함유 분말을 능가하는 페닐알라닌-함유 분말의 주요 잇점은 이의 낮은 습기-민감성이다. 히스티딘-함유 분말의 FPF는 50% 상대 습도에 노출시킨 후에 분해되는 반면, 페닐알라닌-함유 분말의 경우에는 습기에 노출시킨 후에도 FPF가 향상된다. 상응하는 특징은 배출량 (expelled mass)에 대해서도 관찰할 수 있다. 히스티딘-함유 분말의 경우, 배출량은 습기에 노출시 감소하는데 반해, 페닐알라닌-함유 분말의 경우에는 배출량이 증가한다.

요약하자면, 분무-건조에 대한 페닐알라닌의 긍정적인 특성들은 다른 방향족 아미노산을 사용해서는 달성할 수 없다고 할 수 있다.

추가로, HSA와 같은 결정화 억제제가 분말의 입자 특성을 개선시킬 수 있다. 결정화 억제제는 당 및 단백질과 같은 쉽게 물에 용해되는 성분이 위치하는 입자의 코어내에서 무정형 매트릭스의 형성을 도와준다.

또한, 부형제의 능숙한 선택에 의해, 분무 건조 공정에 대한 페닐알라닌의 긍정적인 효과가 더욱 개선될 수 있는 것으로 나타났다. 추가의 부형제는 하나의 카테고리의 물질에 제한되지 않는다. 이것은, 실시예에서와 같이, 당 또는 당 알콜, 아미노산 또는 중합체일 수 있다. 추가의 부형제의 사용에 중요한 것은 분무 건조 동안의 단백질의 안정화이다. 또 다른 부형제를 첨가함으로써, 페닐알라닌과 IgG1의 2원 혼합물에 비해 단백질을 안정화시킬 수 있다는 것이 또한 자명하다.

본 발명은 선행 기술로부터 기인하지 않는다.

특히 분무건조법에 의한 폐 투여를 위한 약제학적 분말의 입자 특성을 개선시키기 위해, 예를 들면, 미국 특허 제6,372,258호 및 제US2005/0152849호에 입자 표면에 소수성을 부여하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 미국 특허 제6,372,258호에서는 분무-건조 분말을 제조하기 위해 페닐알라닌을 포함한 소수성 아미노산을 사용한다.

상기 방법에서는, 단백질 또는 활성 물질 이외에 소수성 아미노산을 분무 용액에 가하고, 용해된 형태로 분무시키고 건조시킨다. 아미노산의 소수성 특성의 결과로서, 분무된 점적 (drop) 중의 아미노산이 당해 점적의 표면에 풍부하므로, 궁극적으로 입자 표면 상에서 풍부해진다. 소수성 피막은 분말에 대한 수분 친화도를 감소시킨다. 이것은 낮은 수증기 응축에 의해 야기되는 모세관 힘의 감소 및 쌍극자 상호작용의 감소와 관련된다.

그러나, 미국 특허 제6,372,258호에는 류신 또는 트립토판과 같은 다른 소수성 아미노산과 비교하여 30% (w/w) 또는 40% (w/w)의 최소량에서의 페닐알라닌의 특히 유리한 공기역학적 효과 및 30% (w/w), 바람직하게는 40% (w/w) 페닐알라닌, 추가의 부형제, 바람직하게는 당 또는 폴리올 및 단백질, 특히 단백질 활성 물질의 3원 복합체의 특히 유리한 효과에 대해 기재되어 있지 않다.

국제 공개공보 제WO970364호 또는 제US2005/0152849호에서, 요지는 활성 물질을 소위 접착방지제와 혼합하는 것이다. 상기 출원들은 특히 서로 엉기는 것을 방지하도록 입자를 피복시키는 데 사용되는 접착방지제 물질로서의 류신의 사용을 기재하고 있다. 그러나, 제US2005/0152849호에 따르면, 분말의 10% 이하가 부형제로 이루어져야 한다.

유럽 특허 제0913177호는 통상의 건조, 특히 분무건조에 의해 생물학적 활성 물질을 함유하는 건조, 무정형 생성물을 제조하는 방법을 기재하고 있다. 그러나, 단백질 (EPO), 당 및 아미노산 (몇몇 경우에 트윈 20 포함)의 상술한 혼합물에서, 당의 비율이 아미노산의 비율보다 항상 더 크다. 또한, 2개의 아미노산이 항상 사용된다. 추가로, 유럽 특허 제0913177호에서의 실험과 달리, 본 발명에서는 아미노산이 이의 등전점으로 적정되지 않는다. 본 발명에 따르는 분말의 특히 유리한 공기역학적 특징 (FPF, 배출량)은 페닐알라닌의 등전점으로 제한되지 않는다. 상이한 pH 값에서 제조된 분말은 각각의 경우 부분적으로 결정성이다. 따라서, 분무 용액의 pH는 분말의 특성 (분산성/흡입성) 및 페닐알라닌의 분무 특성에 중요하지 않다. 단백질 안정성은 실제로 분무 용액의 pH에 좌우되지만 (사용되는 항체는 낮은 pH 값에서 더 안정하다), 단백질 안정화는 특히 2원 조성물에 비해 9.0의 높은 pH 값에서도 달성될 수 있다.

국제 공개공보 제WO0033811호에서는 특히 저밀도 (0.1g/㎤ 이하)를 갖는 아미노산-함유 입자가 제조된다. 한가지 가능한 방법은 분무건조이다. 그러나, 한편으로, 아미노산 함량이 20% 마크를 초과하지 않고, 다른 한편으로 국제 공개공보 제WO0033811호의 핵심은 류신이다. 페닐알라닌은 국제 공개공보 제WO0033811에 언급되어 있지 않다.

일본 특허 제JP62281847호에서는, 분무건조를 순수한 페닐알라닌을 사용하여 수행하였다. 그러나, 흡입에 초점을 맞추지 않았다. 따라서, 수득된 입자 크기는 상당히 더 크다.

또한, 선행 기술에서는 아미노산 아스파라긴, 아르기닌, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판을 단백질로 분무하는 것이 교시되어 있다 (문헌 참조: N.Y.K. Chew et. al, 2002 Respiratory Drug Delivery VIII, S. 743-745). 아미노산 함량은 일반적으로 5% (w/w)였다. 류신은 예외인데, 이것은 추가의 10% (w/w) 아미노산 함량이 분무되었다. 유량 및 장치에 따라, 모든 아미노산에서 FPF의 개선이 관찰되었다. 그러나, 류신에서 최상의 효과가 수득되었다. 딘키헤일러 (Dinkihaler) 및 120L/min의 유량을 사용하여, 페닐알라닌에 대해 55-60% (w/w)의 FPF가 측정될 수 있었다. 상기 페닐알라닌 비율에 있어서 발명의 공헌을 능가하는 제한이 관찰되었다. 더욱이, 추 (Chew) 등의 연구에서는 3원 혼합물이 사용되지 않았다.

명세서에 기재된 모든 비율 (%)은 농도 데이타, 및 특히 분무 건조에 의해 제조된 분말 중의 건조 고체의 조성 (w/w)을 기준으로 한다.

도 1:

IgG1 항체와 아미노산을 함유하는 분무-건조 분말의 SEM 사진:

사진은 주사 전자 현미경 (SUPRA 55 VP, Messrs. Zeiss SMT, Oberkochen)을 사용하여 촬영하였다. 이를 위해, 분말 샘플을 적당한 샘플 플레이트 위에 직접 뿌렸다. 과량의 물질을 털어내고 불어내었다. 이어서, 적당한 전기전도성을 보장하기 위한 샘플을 10nm의 금/팔라듐으로 피복시켰다.

이차 전자 (secondary electron)를 사용하여 화상을 표시하기 위한 검출을 수행하였다.

a) 분무-건조 분말의 조성: 90% 발린/10 %IgG1

배율: 5000x

분말에서 음극까지의 거리: 8mm

셔터 크기: 20㎛

가속 전압: 6kV

진공: 5.73e-005Pa

b) 분무-건조 분말의 조성: 90% 이소류신/10% IgG1

배율: 3000x

분말에서 음극까지의 거리: 8mm

가속 전압: 6kV

진공: 5.47e-005Pa

c) 분무-건조 분말의 조성: 90% 페닐알라닌/10% IgG1

배율: 5000x

분말에서 음극까지의 거리: 8mm

가속 전압: 6kV

진공: 5.73e-005Pa

도 2:

분무 용액 중의 고체 농도의 함수로서의, 2원 혼합물을 분무건조한 후의 각종 아미노산의 소수성 및 단백질 단량체 함량의 비교 (50% 및 90%의 아미노산 용해도 한계가 달성됨):

상기 도면에서, 분무건조 후의 단백질 안정화를 사용된 아미노산의 소수성 분획과 비교한다. 아미노산의 소수성을 나타내는 다수의 방법이 있다 (문헌 참조; P. Andrew Karplus, Hydrophobicity regained, 단백질 science (1997), 6: 1302-1307). 한 가지 통상의 방법은 성분을 용매에서 물로 옮길 경우의 자유 엔탈피 (예를 들면, △G^o _{trans oct/water})를 나타내는 것이다. 이 방법의 단점은 결과가 측정 조건 (예를 들면, 용매의 선택)에 매우 의존적이라는 사실이다. 특히 극성 성분의 경우에는 결과에 큰 차이가 있을 수 있다. 다른 한편으로, 소수성 표면의 순수한 관찰은 측정 조건과는 무관하다. 따라서, 당해 도면에서는, 아미노산 그룹의 소수성 부분 또는 영역만을 고려한다. 지방족 CH₂ 그룹에는 25cal/Å²의 엔탈피가 할당되고, 방향족 CH 그룹에는 16cal/Å²의 엔탈피가 할당된다. 이러한 관찰은 전기음성도에 의해 생성된 유도 효과 또는 극성 분획을 고려하지 않는다.

단백질 응집물을 형성하는 경향은 배제 크로마토그래피 (HP-SEC)로 측정하였다. 배제는 단백질 또는 이의 응집물 (예를 들면, 이량체)의 분자 크기를 사용하여 수행하였다. 응집물 형성은 단백질 불안정화와 관련된 것으로 공지되어 있다.

분무-건조 분말의 조성:

충전 1: 10% IgG1 / 90% 이소류신, 고체 분획: 3.5%

충전 2: 10% IgG1 / 90% 글리신, 고체 분획: 20.2%

충전 3: 10% IgG1 / 90% 발린, 고체 분획: 5.8%

충전 4: 10% IgG1 / 90% 페닐알라닌, 고체 분획: 3.2%

충전 5: 10% IgG1 / 90% 아스파라긴, 고체 분획: 2.4%

충전 6: 10% IgG1 / 90% 글리신, 고체 분획: 11.18%

충전 7: 10% IgG1 / 90% 이소류신, 고체 분획: 1.95%

충전 8: 10% IgG1 / 90% 발린, 고체 분획: 3.21%

충전 9: 10% IgG1 / 90% 페닐알라닌, 고체 분획: 1.79%

충전 10 10% IgG1 / 90% 아스파라긴, 고체 분획: 1.3%

막대 모양: 아미노산의 소수성

다이아몬드 모양: IgG1-항체의 단량체 함량

도 3

페닐알라닌, 락토수크로즈 및 IgG1-항체를 함유하는 상이한 3원 분말 혼합물의 SEM-사진

사진은 도 1에 기재된 바와 같이 촬영하였다.

a) 분무-건조 분말의 조성:

80% 페닐알라닌 / 10% LS90P / 10% IgG1

배율: 5000x

분말에서 음극까지의 거리: 9mm

셔터 크기: 10㎛

가속 전압: 3kV

진공: 1.72e-005Pa

b) 분무-건조 분말의 조성:

80% 페닐알라닌 / 15% LS90P / 5% IgG1

배율: 5000x

분말에서 음극까지의 거리: 7mm

셔터 크기: 10㎛

가속 전압: 4kV

진공: 9.18e-005Pa

c) 분무-건조 분말의 조성:

60% 페닐알라닌 / 30% LS90P / 10% IgG1

배율: 5000x

분말에서 음극까지의 거리: 8mm

셔터 크기: 10㎛

가속 전압: 4kV

진공: 9.18e-005Pa

d) 분무-건조 분말의 조성:

70% 페닐알라닌 / 25% LS90P / 5% IgG1

배율: 5000x

분말에서 음극까지의 거리: 8mm

셔터 크기: 9㎛

가속 전압: 4kV

진공: 9.3e-005Pa

도 4

출발값을 기준으로 한 상대적인 단량체 함량. 단량체 함량은 도 2에 기재된 바와 같이 측정하였다. 상대적인 단량체 함량은 100%로 설정된 출발값을 기준으로 한다. 당해 도면은 출발값으로부터의 단량체 함량의 변화를 예시하며, 이에 따라 저장 시간에 따른 변화를 반영한다.

다이아몬드 모양: 분무-건조 분말: 60% 페닐알라닌 / 10% LS90P / 30% IgG1

사각형 모양: 분무-건조 분말: 80% 페닐알라닌 / 10% LS90P / 10% IgG1

삼각형 모양: 분무-건조 분말: 60% 페닐알라닌 / 30% LS90P / 10% IgG1

도 5

각종 분말 조성물의 미립자 분획의 비교

미립자 분획은 원-스테이지 임펙터 (one-stage impactor) (Impactor Inlet, TSI)를 공기역학적 입자 크기 측정기 (Aerodynamic Particle Sizer) (APS, TSI)와 함께 사용하여 측정하였다. 임펙터 노즐의 분리 한계치는 5.0㎛였다. 미립자 분획 이외에, 공기역학적 입자 크기는 APS를 사용하여 측정하고, 입자 크기 분포는 비행 시간 (time of flight)을 측정하여 결정하였다. 이를 위해, 분말을 샘플 도입 포트 (Sample Induction Ports)를 통해 통과시킨 후에 분할하였다. 0.2%의 분획을 등속 (isokinetic) 조건하에서 작은 모세관에 흡인시키고 비행 시간 측정 단위를 도입하였다. 나머지 분획을 사용하여 미립자 분획을 측정하였다.

측정을 위해, 분말을 사이즈 3 캡슐에 포장하고, 흡입기 (제품명; HandiHaler^R, 제조원; Boehringer Ingelheim)를 사용하여 배출시켰다. 4kPa의 압력 강하가 핸디헤일러를 통해 보급되도록, 분말을 배출하기 위한 유량을 조절하였다. 공기 용적은 PharmEur에 따르면 4ℓ였다. 임펙터 스테이지 위에 침착된 입자의 "리바운싱 (rebouncing)"을 방지하기 위해, 임펙터 플레이트를 측정용의 고점성 브리즈 (Brij) 용액으로 피복하였다.

검정색 막대 모양: 분무-건조 분말: 65% 덱스트란 1 / 5% 이소류신 / 30% IgG1

밝은색 막대 모양: 분무-건조 분말: 60% 페닐알라닌 / 10% LS90P / 30% IgG1

도 6

각종 분말 조성물의 상대적인 미립자 분획의 비교

상대적인 미립자 분획은 출발값의 미립자 분획을 기준으로 하며, 이에 따라 저장에 따른 FPF의 변화를 반영한다. 따라서, 미립자 분획은 도 5와 관련한 설명에서와 같이 측정한다.

도 7

페닐알라닌 또는 이소류신을 함유하는 분무-건조 분말의 SEM 사진:

사진은 도 1에 기재된 바와 같이 촬영하였다.

a) 분무-건조 분말의 조성:

60% 페닐알라닌 / 10% LS90P / 10% IgG1

배율: 250x

분말에서 음극까지의 거리: 7mm

셔터 크기: 10㎛

가속 전압: 6kV

진공: 5.35e-005Pa

b) 분무-건조 분말의 조성:

60% 페닐알라닌 / 10% LS90P / 10% IgG1

배율: 5000x

분말에서 음극까지의 거리: 7mm

셔터 크기: 10㎛

가속 전압: 6kV

진공: 5.60e-005Pa

도 8

65% 덱스트란 1, 5% 이소류신 및 30% IgG1으로 이루어진 분무-건조 분말의 SEM 사진:

사진은 도 1에 기재된 바와 같이 촬영하였다.

a) 분무-건조 분말의 조성:

65% 덱스트란 1 / 5% 이소류신 / 30% IgG1

배율: 250x

분말에서 음극까지의 거리: 9mm

셔터 크기: 10㎛

가속 전압: 4kV

진공: 6.70e-005Pa

b) 분무-건조 분말의 조성:

65% 덱스트란 1 / 5% 이소류신 / 30% IgG1

배율: 7500x

분말에서 음극까지의 거리: 5mm

셔터 크기: 10㎛

가속 전압: 5kV

진공: 7.17e-005Pa

도 9

다양한 비율의 페닐알라닌을 함유하는 분무-건조 분말의 미립자 분획 (FPF) 및 배출량의 측정

미립자 분획은 원-스테이지 임펙터 (Impactor Inlet, TSI)를 공기역학적 입자 크기 측정기 (APS, TSI)와 함께 사용하여 측정하였다 (도 5의 설명 참조). 배출량은 임펙터 입구/APS를 통한 배제 전후에 사용된 캡슐의 질량과 관련된다. 캡슐의 질량에 있어서의 차이가 배출량에 상응한다. 배제의 방법은 실시예 5에 기재되어 있다.

막대 모양: 캡슐 중의 중량을 기준으로 한 미립자 분획 (FPF) (%)

다이아몬드 모양: 임펙터 입구/TSI로의 전달시의 분말의 배출량

분말 1: 다음 조성의 분무 용액으로부터 분무 건조에 의해 제조된 분말: .29g/100mL 페닐알라닌, 1.15g/100mL IgG1, 383mg/100mL LS90P, 완충액: 1.6mM 글리신, 25mM 히스티딘, pH 4.2

분말 2: 다음 조성의 분무 용액으로부터 분무 건조에 의해 제조된 분말: .29g/100mL 페닐알라닌, 1.15g/100mL IgG1, 383mg/100mL LS90P, 완충액: 25mM TRIS, pH 7.4

분말 3: 다음 조성물의 분무 용액으로부터 분무 건조에 의해 제조된 분말: .29g/100mL 페닐알라닌, 1.15g/100mL IgG1, 383mg/100mL LS90P, 완충액: 25mM TRIS, pH 9.0

도 10

분무-건조 분말의 SEM-사진

사진은 도 1에 기재된 바와 같이 촬영하였다.

a) 분무-건조 분말의 조성:

50% 페닐알라닌 / 20% LS90P / 30% IgG1

배율: 2000x

분말에서 음극까지의 거리: 10mm

셔터 크기: 10㎛

가속 전압: 5kV

진공: 2.23e-004Pa

b) 분무-건조 분말의 조성:

40% 페닐알라닌 / 30% LS90P / 30% IgG1

배율: 3000x

분말에서 음극까지의 거리: 10mm

셔터 크기: 10㎛

가속 전압: 5kV

진공: 2.23e-004Pa

c) 분무-건조 분말의 조성:

30% 페닐알라닌 / 40% LS90P / 30% IgG1

배율: 3000x

분말에서 음극까지의 거리: 10mm

셔터 크기: 10㎛

가속 전압: 5kV

진공: 2.23e-004Pa

d) 분무-건조 분말의 조성:

20% 페닐알라닌 / 50% LS90P / 30% IgG1

배율: 3000x

분말에서 음극까지의 거리: 8mm

셔터 크기: 10㎛

가속 전압: 5kV

진공: 2.26e-004Pa

도 11

분무-건조 분말의 미립자 분획 (FPF) 및 배출량의 측정

분말 1: 분무-건조 분말: 60% 페닐알라닌, 10% IgG1, 30% LS90P

분말 2: 분무-건조 분말: 60% 페닐알라닌, 10% 리소자임, 30% LS90P

분말 3: 분무-건조 분말: 60% 페닐알라닌, 10% 칼시토닌, 30% LS90P

도 12

분무-건조 분말의 미립자 분획 (FPF) 및 배출량의 측정

분말 1: 분무-건조 분말: 60% 페닐알라닌, 10% IgG1, 30% 사카로즈

분말 2: 분무-건조 분말: 60% 페닐알라닌, 10% IgG1, 30% 만니톨

분말 3: 분무-건조 분말: 60% 페닐알라닌, 10% IgG1, 30% 글리신

분말4: 분무-건조 분말: 60% 페닐알라닌, 10% IgG1, 30% PVP

도 13

LS90P의 결정화 엔탈피를 측정하기 위한 DSC 측정

결정화 엔탈피는 분말의 가열 동안 열 전류를 측정함으로써 결정하였다. 무정형 분말을 가열하는 경우, 유리 전이 온도를 통과한 후에 입자 구성분의 이동성이 증가하며 결정화될 수 있다. 유리 전이 온도를 통과하는 것은 흡열 공정이다. 다른 한편으로, 이후의 결정화는 발열 반응이다. 분말을 가열함에 따라, 추가로 용융 또는 분해될 수 있다.

DSC 측정을 위해, 가능한 균질하고 조밀한 분말의 상을 형성하도록 분말 몇 mg을 도가니 (crucible) 속에서 약간 압축시켰다. 이어서, 도가니를 냉각 용접 (cold welding)에 의해 밀봉하였다. 측정은 천공되지 않은 도가니를 사용하여 수행하였다.

다른 파라미터는 다음과 같다:

측정 장치: DSC 821 / Mettler Toledo

평가 소프트웨어: STAR 버전 4.20

노 가스 (furnace gas): 질소/40mL/min

수세 가스 (flushing gas): 질소/150mL/min

도가니: 알루미늄 도가니, 40㎕

스캔 속도: 온도 10℃/min

분말 1: 분무-건조 분말: 60% 페닐알라닌 / 40% LS90P

분말 2: 분무-건조 분말 : 60% 페닐알라닌 / 30% LS90P / 10% IgG1

분말 3: 분무-건조 분말 : 60% 페닐알라닌 / 30% LS90P / 10% 리소자임

분말 4: 분무-건조 분말 : 60% 페닐알라닌 / 30% LS90P / 10% 칼시토닌

분말 5: 동결-건조 분말: 100% LS90P

도 14

분무-건조 분말의 미립자 분획 (FPF)의 측정

미립자 분획은 원-스테이지 임펙터 (Impactor Inlet, TSI)를 공기역학적 입자 크기 측정기 (APS, TSI)와 함께 사용하여 측정하였다 (도 5의 설명 참조).

배출량은 흡입기 (제품명; HandiHaler^R, 제조원; Boehringer Ingelheim)를 통한 배제 전후의 캡슐의 중량에 있어서의 차이로부터 수득된다.

빈 막대 모양: 분무 건조 직후의 FPF의 측정치

점선 막대 모양: 습기에 노출시킨 후의 FPF의 측정치 (20시간에 걸쳐 주위 온도에서 50% RH)

삼각형 모양: 분무 건조 직후의 배출량

사각형 모양: 습기에 노출시킨 후의 배출량 (20시간에 걸쳐 주위 온도에서 50% RH)

분말 1: 분무-건조 분말: 20% 트립토판 / 50% LS90P / 30% IgG1

분말 2: 분무-건조 분말 : 20% 히스티딘 / 50% LS90P / 30% IgG1

분말 3: 분무-건조 분말 : 20% 페닐알라닌 / 50% LS90P / 30% IgG1

정의

본 명세서의 범위내에서 사용되는 용어 및 명칭은 아래에 정의된 의미를 갖는다. 중량 및 중량%의 상세는, 달리 언급하지 않는 한, 조성물의 건조 질량 또는 용액/현탁액의 고체 함량을 기준으로 한다.

일반적인 표현 "함유한" 또는 "함유한다"는 "이루어진"의 보다 구체적인 용어를 포함한다. 더욱이, "하나의" 및 "다수의"는 한정적으로 사용되지 않는다.

"분말"은 매우 미세한, 분쇄된 물질을 나타낸다. "분무-건조 분말"은 분무 건조에 의해 생성된 분말을 의미한다.

"입자"는 물질의 작은 단편을 말한다. 본 발명에서, 입자라는 용어는 본 발명에 따르는 분말에서의 입자를 나타낸다. 입자 및 분말이라는 용어는 때때로 본 발명에서 상호교환가능하게 사용된다. 또한, 분말이라는 용어는 이의 구성분, 입자를 포함한다. 따라서, 입자는 모든 입자, 즉 분말을 말한다.

본 발명의 의미에서, 용어 "혼합물" 또는 "혼합물들"은 모든 성분의 순수한 용액으로부터 생성된 혼합물 또는 하나 이상의 성분이 현탁되어 있는 용액으로부터 생성된 혼합물 둘 다를 말한다. 그러나, 본 발명의 의미에서 용어 "혼합물"은 또한 이들 성분의 고체 입자로부터 물리적 혼합 공정에 의해 제조되거나, 이들 성분의 용액 또는 현탁액을 하나 이상의 고체 성분에 적용하여 형성된 혼합물을 나타내기도 한다.

용어 "조성물"은 적어도 2개의 출발 물질의 액체, 반고체 또는 고체 혼합물을 말한다.

용어 "약제학적 조성물"은 환자에게 투여하기 위한 조성물을 말한다.

용어 "약제학적으로 허용되는 부형제"는 본 발명의 범위내에서 제형 중에 가능하게 존재할 수 있는 부형제를 말한다. 부형제는, 예를 들면, 대상체 또는 대상체의 폐에 상당한 독성학적으로 해로운 효과를 갖지 않으면서 폐 경로로 투여될 수 있다.

용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 예를 들면 다음의 염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 무기 산의 염, 예를 들면, 클로라이드, 설페이트, 포스페이트, 디포스페이트, 브로마이드 및 니트레이트 염. 또한, 유기 산의 염, 예를 들면, 말레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 타르트레이트, 석시네이트, 에틸석시네이트, 시트레이트, 아세테이트, 락테이트, 메탄설포네이트, 벤조에이트, 아스코르베이트, 파라톨루엔설포네이트, 팔모에이트, 살리실레이트 및 스테아레이트, 및 또한 에스톨레이트, 글루셉테이트 및 락토비아네이트 염.

용어 "활성 물질"은 유기체에서 활성 또는 반응을 일으키는 성분을 의미한다. 활성 물질이 치료 목적으로 사람 또는 동물 체내에 투여되는 경우, 이를 약제학적 조성물 또는 약제라고 한다.

"단백질 활성 물질"은, 본 발명에서, 단백질로서 구조적으로 존재하거나 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 구조적으로 구성하는 활성 물질을 의미한다.

활성 물질의 예는 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, 사람 성장 호르몬 (hGH) 및 다른 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA), 에리트로포이에틴 (EPO), 사이토카인, 예를 들면, 인터루킨 (IL), 예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 인터페론 (IFN)-알파, -베타, -감마, -오메가 또는 -타우, 종양 괴사 인자 (TNF), 예를 들면, TNF-알파, 베타 또는 감마, TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF이다. 다른 예는 모노클로날, 폴리클로날, 다중특이적 및 단일 쇄 항체 및 이의 단편, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')₂, Fc 및 Fc' 단편, 경쇄 (L) 및 중쇄 (H) 면역글로불린 및 이의 불변, 가변 또는 과가변 부위 뿐만 아니라 Fv 및 Fd 단편이다 (문헌 참조; Chamov et al., 1999). 항체는 사람 또는 사람 이외의 기원일 수 있다. 사람화 항체 및 키메릭 항체도 가능하다. 유사하게, 이것은, 예를 들면, 방사능 물질 또는 화학적으로 한정된 약제에 연결된 접합 단백질 및 항체를 말한다.

Fab 단편 (항원 결합 단편 = Fab)은 인접한 불변 부위에 의해 함께 보유된 두 쇄의 가변 부위로 이루어진다. 이들은, 예를 들면, 통상의 항체로부터, 파파인와 같은 프로테아제로 처리하거나 DNA 클로닝에 의해 생성될 수 있다. 또 다른 항체 단편은 펩신에 의한 단백질분해적 소화 (proteolytic digestion)에 의해 생성될 수 있는 F(ab')₂ 단편이다.

유전자 클로닝에 의해, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 부위만으로 이루어진 단축된 항체 단편을 제조할 수 있다. 이들은 Fv 단편 (가변 단편 = 가변 부분의 단편)로서 공지되어 있다. 이들 Fv 단편에서는 불변 쇄의 시스테인 그룹을 통한 공유결합이 가능하지 않기 때문에, 이들은 종종 다른 몇 가지 방법으로 안정화된다. 이러한 목적으로, 중쇄 및 경쇄의 가변 부위가 종종 약 10개 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 15개의 아미노산의 짧은 펩타이드 단편에 의해 함께 결합된다. 이것은 VH 및 VL이 펩타이드 링커에 의해 함께 결합되어 있는 단일 폴리펩타이드 쇄를 생성한다. 이러한 항체 단편은 또한 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이라고 한다. scFv 항체의 예는 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌 (참조; Huston et al., 1988)에 기재되어 있다.

과거에 다량체 scFv 유도체를 제조하기 위한 다양한 전략들이 개발되었다. 의도는 개선된 약력학적 특성과 증가된 결합능을 갖는 재조합 항체를 제조하기 위한 것이다. scFv 단편의 다량체화 (multimerisation)를 달성하기 위해, 이들은 다량체화 도메인을 갖는 융합 단백질로서 제조된다. 다량체화 도메인은, 예를 들면, IgG의 CH3 부위 또는 나선형 구조 ("꼬인 코일 구조"), 예를 들면, 류신 지퍼 도메인 (Leucine Zipper domain)일 수 있다. 다른 전략에서, scFv 단편의 VH 및 VL 부위 사이의 상호작용이 다량체화 (예를 들면, 디아-, 트리- 및 펜타바디)를 위해 사용된다.

용어 디아바디 (diabody)는 2가 동종이량체성 (homodimeric) scFv 유도체를 나타내기 위해 당업계에서 사용된다. scFv 분자에서 펩타이드 링커를 5개 내지 10개의 아미노산으로 단축시키면 VH/VL 쇄의 중첩에 의해 동종이량체가 형성된다. 디아바디는 삽입된 디설파이트 브릿지에 의해 추가로 안정화될 수 있다. 디아바디의 예는, 예를 들면, 문헌 (참조; Perisic et al., 1994)에서 찾아볼 수 있다.

용어 미니바디 (minibody)는 2가 동종이량체성 scFv 유도체를 나타내기 위해 당업계에서 사용된다. 이것은 이량체화 부위로서 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG1의 CH3 부위를 함유하는 융합 단백질로 이루어진다. 이는 힌지 부위 (hinge region), 또한 IgG의 힌지 부위 및 링커 부위에 의해 scFv 단편을 연결한다. 이러한 미니바디의 예가 문헌 (참조; Hu et al., 1996)에 기재되어 있다.

용어 트리아바디 (triabody)는 3가 동종삼량체성 scFv 유도체를 나타내기 위해 당업계에서 사용된다 (문헌 참조; Kortt et al., 1997). 링커 시퀀스 (linker sequence)를 사용하지 않고 VH-VL을 직접 융합시키면 삼량체가 형성된다.

2가, 3가 또는 4가 구조를 갖는 미니 항체로서 당업계에 공지된 단편 또한 scFv 단편의 유도체이다. 다량체화는 이량체성, 삼량체성 또는 사량체성 꼬인 코일 구조에 의해 달성된다 (문헌 참조; Pack et al., 1993 and 1995; Lovejoy et al., 1993).

용어 "부형제"는 제형, 본 발명에서는 분말, 특히 분무-건조 분말에 첨가되는 물질을 말한다. 부형제는 통상적으로 자체 활성, 특히 약제학적 활성을 갖지 않으며, 실제 성분, 예를 들면, 활성 물질의 제형화를 개선시키거나 이의 특정 양태 (예를 들면, 저장 안정성)을 최적화하는 작용을 한다.

약제학적 "부형제"는 약제 또는 약제학적 조성물의 일부이며, 특히 활성 물질이 활성 부위에 도달하여 거기서 방출되는 것을 보장한다. 부형제는 세 가지 기본적인 업무를 담당한다: 담체 기능, 활성 물질의 방출 조절 및 안정성 증가. 또한, 부형제를 사용하여 약제학적 형태를 생성함으로써 효과의 지속 시간 또는 속도가 변경된다.

용어 "아미노산"은 하나 이상의 아미노 및 하나 이상의 카복실 그룹을 함유하는 화합물을 나타낸다. 아미노 그룹이 통상적으로 카복실 그룹에 대해 α-위치에 존재하지만, 분자내의 다른 배열도 생각할 수 있다. 아미노산은 또한 다른 관능 그룹, 예를 들면, 아미노, 카복스아미드, 카복실, 이미다졸, 티오 그룹 및 기타 그룹을 함유할 수 있다. 각종 입체이성체 비율을 포함하는 천연 또는 합성 기원의 라세미성 또는 광학 활성 (D- 또는 L-) 아미노산이 사용될 수 있다. 예를 들면, 이소류신이라는 용어는 D-이소류신, L-이소류신, 라세미성 이소류신 및 다양한 비율의 두 가지 에난티오머를 포함한다.

용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 두 개 이상의 아미노산 그룹으로 이루어진 아미노산의 중합체를 나타낸다.

추가로, 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 10개 이상의 아미노산 그룹으로 이루어진 아미노산의 중합체를 나타낸다.

용어 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 약어로서 사용되며, 호모- 및 헤테로펩타이드 둘 다, 즉 동일하거나 상이한 아미노산 그룹으로 이루어진 아미노산의 중합체를 포함한다. 따라서, "디-펩타이드"는 2개의 펩타이드 결합된 아미노산으로 이루어지고, "트리-펩타이드"는 3개의 펩타이드 결합된 아미노산으로 이루어진다.

본원에서 사용되는 용어 "단백질"은 20개 이상, 특히 100개 이상의 아미노산 그룹을 갖는 아미노산의 중합체를 말한다.

용어 "작은 단백질 (small protein)"은 50kD 이하 또는 30kD 이하 또는 5 내지 50kD의 단백질을 말한다. 용어 "작은 단백질"은 또한 500개 미만의 아미노산 그룹 또는 300개 미만의 아미노산 그룹을 갖는 아미노산 그룹의 중합체 또는 50개 내지 500개의 아미노산 그룹을 갖는 중합체를 말한다. 바람직한 작은 단백질은, 예를 들면, 성장 인자, 예를 들면, "사람 성장 호르몬/인자", 인슐린, 칼시토닌 등이다.

용어 "올리고당" 또는 "다당류"는 세 개 이상의 단량체성 당 분자로 이루어진 다당류를 말한다.

용어 "% (w/w)"는 매쓰 (mass)를 기준으로 한 분무-건조 분말 중의 활성 물질 또는 부형제의 양 (%)을 나타낸다. 나타낸 비율은 분말의 건조 성분을 기준으로 한다. 따라서, 분말 중의 잔류 수분은 고려하지 않는다.

용어 "무정형"은 분말상 제형이 결정성 분획을 10% 미만, 바람직하게는 7% 미만, 보다 바람직하게는 5% 미만, 가장 바람직하게는 4, 3, 2 또는 1% 미만으로 함유하는 것을 의미한다.

용어 "흡입성"은 분말이 폐 투여에 적합하다는 것을 의미한다. 흡입성 분말은, 입자가 폐로 들어가서 임의로 폐포를 통해 전신 활동을 전개할 수 있도록 흡입기에 의해 분산되어 흡입될 수 있다. 흡입성 입자는 평균 입자 직경이, 예를 들면, 0.4 내지 30㎛ (MMD = 질량 중위 직경), 통상적으로 0.5 내지 20㎛, 바람직하게는 1 내지 10㎛ 및/또는 평균 공기역학적 입자 직경 (MMAD = 질량 중위 공기역학적 직경)이 0.5 내지 10㎛, 바람직하게는 0.5 내지 7.5㎛, 보다 바람직하게는 0.5 내지 5.5㎛, 보다 더 바람직하게는 1 내지 5㎛, 가장 바람직하게는 1 내지 4.5㎛ 또는 3 내지 10㎛일 수 있다.

"질량 중위 직경 (Mass Median Diameter)" 또는 "MMD"는 본 발명에 따르는 분말이 일반적으로 다분산되기 때문에 평균 입자 크기 분포의 측정치이다. 결과는 50% 총 관통유동 (throughflow)에서의 총 용적 분포의 직경으로서 표현된다. MMD 값은, 예를 들면, 레이저 회절법에 의해 측정할 수 있지만, 물론 다른 통상의 방법을 사용할 수도 있다 (예를 들면, 전자 현미경법, 원심분리 침강법).

용어 "평균 공기역학적 입자 직경 (mean aerodynamic particle diameter)" (= 평균 중위 공기역학적 직경 (MMAD))은 분말의 질량을 기준으로 하여 입자의 50%가 통상적으로 보다 작은 공기역학적 직경을 갖는 공기역학적 입자 크기를 나타낸다. 의심스러운 경우, MMAD를 측정하기 위한 기준 방법은 당해 출원 명세서에 명시된 방법이다.

MMD 및 MMAD는 서로 다를 수 있으며, 예를 들면, 분무 건조에 의해 생성된 중공 구체는 MMAD보다 MMD가 더 클 수 있다.

용어 "미립자 분획" (FPF)은 MMAD가 5㎛ 이하인 입자 크기를 갖는 입자로 이루어진 분말의 흡입성 부분을 기술한다. 용이하게 분산 가능한 분말에서 FPF는 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 특히 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 더 바람직하게는 55% 이상이다. 본 명세서에서 사용되는 표현 "컷 오프 직경(Cut Off Diameter)"은 FPF를 측정할 때에 입자가 고려되는 것을 나타낸다. 컷 오프 직경이 5㎛인 30%의 FPF(FPF₅)는 분말 중의 모든 입자의 적어도 30%가 5㎛ 미만의 평균 공기역학적 입자 직경을 갖는 것을 의미한다.

용어 "비행 시간"은 실시예 부분에 보다 상세하게 기재된 바와 같은 표준 측정방법의 명칭이다. 비행 시간의 측정시, MMAD는 한정된 측정 거리에 걸쳐 입자의 비행 시간을 측정함으로써 결정된다. MMAD는 비행 시간과 상관성이 있다. 이것은 더 큰 MMAD를 가진 입자가 상응하게 보다 작은 입자보다 비행하는 데 더 오랜 시간이 소요된다는 것을 의미한다 (실시예, 방법 참조).

용어 "배출량"은 흡입기가 사용되는 경우에 전달된 분말의 양을 나타낸다. 전달은, 이 경우, 예를 들면, 캡슐을 사용하여 배제 (expulsion) 전후에 캡슐을 칭량함으로써 측정한다. 배출량은 배제 전후의 캡슐의 질량 차이에 상응한다.

용어 "분산성"은 비행할 수 있음을 의미한다. 분말이 비행할 수 있는 능력을 위한 기본적인 필수 요건은 개별 입자로의 분말의 분해 및 공기중에서의 개별 입자의 분포이다. 입자 덩어리는 너무 커서 폐로 들어갈 수 없으므로 흡입 요법에 적합하지 않다.

용어 "주위 온도"는 약 20 내지 25℃ (+/-10%)의 온도를 나타낸다. 주위 온도라는 용어는 특히 25℃의 온도를 나타낸다.

용어 "단량체 함량" 및 "단량체"는 단백질의 단일 아단위로 이루어진 단백질의 비율 %를 나타낸다. 단량체 함량 및 수 개의 아단위로 이루어진 단량체 및 이량체 또는 올리고머의 작은 단편으로 이루어진 분획은 구분되어야 한다. 단량체 함량은, 예를 들면, 배제 크로마토그래피로 측정한다.

용어 "응집물"은 본래 상태의 단일 아단위로 이루어진 단백질의 이량체 및 올리고머의 부분을 말한다.

본 발명에 따르는 조성물

분무-건조 입자의 비행 특성을 결정하는 요인 (여기서 미립자 분획 FPF가 관련된다)은 입자의 크기 (MMD 또는 특히 MMAD, 이는 비행 시간 측정에 의해 결정된다) 및 분말의 분산 특징이다. 입자 표면의 화학적 조성 및 입자의 형태가 분말의 분산 특징에 중요하다. 따라서, 분말의 분산 특징은 분말 구성분, 특히 부형제의 의도적인 선택에 의해 결정적인 영향을 받을 수 있다.

입자의 크기 및 형태는 다음과 같이, 분무 건조기에서 분무한 다음 개별 점적을 건조시켜 수득한다:

흡입성 분말은 통상적으로 2-물질 노즐 (two-substance nozzle)을 사용하여 제조한다. 차후의 입자 크기에 대한 출발점으로서 관련되는 점적 크기 (MMD)는 분무기 가스 (atomiser gas)의 속도에 따라 약 8 내지 20㎛이다. 점적은 2단계에 걸쳐 건조시킨다. 제1 단계에서, 고체가 형성되지 않으면서 물이 증발된다. 증발은 확산-제한적이지 않다. 용액에 함유된 성분의 용해도 한계에 도달한 후, 고체/액체 이중 상이 전개되고, 최종적으로 밀봉된 고체 층이 형성된다. 형성되는 입자의 핵은 물, 및 이미 침전된 성분보다 상응하게 더 높은 용해도를 갖는 용해된 성분을 또한 함유한다.

입자 형성의 제2 단계는 밀봉된 고체 층이 형성된 후에 개시된다. 물의 증발 속도는 고체 층에 의해 급격하게 감소된다. 제2 단계에서, 물의 증발 속도는 입자 층을 통한 물의 확산 속도에 따라 좌우된다. 증기 확산이 심하게 억제되면, 형성되는 입자의 핵에서의 온도 상승이 증기압 증가를 야기한다. 이를 균형잡기 위해, 입자가 팽창하여 중공 구체를 형성한다. 물이 증발한 후 또는 입자 냉각 동안, 입자의 핵에서는 감압이 형성된다. 입자 층의 안정성에 따라, 입자는 팽창된 형태로 고화되거나 입자는 붕괴된다.

입자가 붕괴되는 경향은 성분의 크기 또는 공정에 의해서만 좌우되는 것은 아니다. 오히려, 이것은 고체의 소수성, 도달되는 용해도 한계 및 분무 용액의 고체 분획의 복잡한 함수이다. 분무 용액의 용해도 한계와 고체 분획의 조합은 또한 입자 층의 두께를 조절한다. 영향을 미치는 다른 변수, 예를 들면, 유리 전이 온도 및 이로부터 유도되는 분무 건조기에서의 분말의 점도 또한 붕괴 경향에 영향을 미칠 수 있다.

요약하자면, 개략적으로 말해, 초기 입자가 팽창하는 경향은 소수성 및 부형제의 감소된 용해도에 따라 증가한다. 다른 한편으로 팽창된 입자의 붕괴 경향은 성분-특이적인 특성인 것으로 보인다. 본 명세서에서 페닐알라닌은, 특히 단백질-함유 분말 및 분무-건조 분말에서 놀랍게도 우수하고 예기치못한 분말 형태를 야기하는 것으로 나타났다. 상기 효과는 이러한 분말의 흡입을 위해 특히 유리하다. 유사한 소수성 또는 용해도의 부형제 (발린, 이소류신)는 필적하는 형태를 나타내지 않으며, 이에 따라 필적하는 공기역학적 특징을 나타내지 않는다.

본 발명은 적어도 30% (w/w)의 페닐알라닌을 함유함을 특징으로 하는, 단백질 및 페닐알라닌을 함유하는 분말 (적어도 2원 복합체)에 관한 것이다.

본 발명은 특히 적어도 30% (w/w)의 페닐알라닌을 함유함을 특징으로 하는, 단백질, 페닐알라닌 및 하나 이상의 다른 부형제, 예를 들면, 당 또는 폴리올을 함유하는 분말 (적어도 3원 복합체)에 관한 것이다.

본 발명은 적어도 40% (w/w)의 페닐알라닌을 함유함을 특징으로 하는, 단백질 및 페닐알라닌을 함유하는 분말 (적어도 2원 복합체)에 관한 것이다.

본 발명은 특히, 적어도 40% (w/w)의 페닐알라닌을 함유함을 특징으로 하는, 단백질, 페닐알라닌 및 하나 이상의 다른 부형제, 예를 들면, 당 또는 폴리올을 함유하는 분말 (적어도 3원 복합체)에 관한 것이다.

바람직한 양태에서, 본 발명의 분말 (적어도 2원 또는 적어도 3원)은 분무-건조 분말이다.

특수한 양태에서, 본 발명은 적어도 30% (w/w)의 페닐알라닌, 바람직하게는 적어도 40% (w/w)의 페닐알라닌을 함유함을 특징으로 하는, 단백질 또는 단백질-활성 물질 및 부형제로서의 페닐알라닌 및 임의로 추가의 부형제, 예를 들면, 당 또는 폴리올을 함유하는 분말에 관한 것이다. 임의로, 다른 성분, 특히 다른 부형제가 분말에 함유될 수 있다. 추가로, 본 발명의 이러한 특수한 양태는, 분말이 적어도 30% (w/w)의 페닐알라닌, 바람직하게는 적어도 40% (w/w)의 페닐알라닌으로 이루어지며, 단백질 또는 단백질-활성 물질 및 부형제로서의 페닐알라닌 및 임의로 추가의 부형제, 예를 들면, 당 또는 폴리올로 이루어진 분말을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이기도 하다.

추가의 양태에서, 본 발명의 분말은 적어도 30% (w/w), 31% (w/w), 32% (w/w), 33% (w/w), 34% (w/w), 35% (w/w), 36% (w/w), 37% (w/w), 38% (w/w), 39% (w/w), 40% (w/w), 41% (w/w), 42% (w/w), 43% (w/w), 44% (w/w), 45% (w/w), 46% (w/w), 47% (w/w), 48% (w/w), 49% (w/w), 50% (w/w), 51% (w/w), 52% (w/w), 53% (w/w), 54% (w/w), 55% (w/w), 56% (w/w), 57% (w/w), 58% (w/w), 59% (w/w), 60% (w/w), 61% (w/w), 62% (w/w), 63% (w/w), 64% (w/w), 65% (w/w), 66% (w/w), 67% (w/w), 68% (w/w), 69% (w/w), 70% (w/w), 75% (w/w), 80% (w/w), 85% (w/w), 90% (w/w), 95% (w/w), 99% (w/w) 또는 99.99% (w/w)의 페닐알라닌을 함유한다. 높은 비율의 페닐알라닌은 매우 강력한 단백질, 예를 들면, 사이토카인 및 인터페론 (IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, IFN-오메가, 페길화 IFN 등)에서 특히 바람직한데, 그 이유는 이들 단백질은 소량만이 필요하기 때문이다 (0.01% (w/w) 내지 10% (w/w), 특히 0.01% (w/w) 내지 5% (w/w) 및 특히 0.01% (w/w) 내지 1% (w/w)).

바람직한 양태에서, 본 발명의 분말은 페닐알라닌을 30% (w/w) 내지 99.99% (w/w), 바람직하게는 40% (w/w) 내지 99.99% (w/w), 바람직하게는 40% (w/w) 내지 70% (w/w), 60% 내지 90% 또는 특히 바람직하게는 60% 내지 80% 범위의 비율로 함유한다.

추가의 양태에서, 본 발명의 분말은 이당류 및 올리고당으로부터 선택된 비환원당을 함유한다. 바람직하게는, 이당류는 사카로즈 또는 트레할로즈이고, 올리고당은 삼당류, 예를 들면, 락토수크로즈이다.

또 다른 양태에서, 당의 비율은 최대 50% (w/w), 바람직하게는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45% (w/w), 특히 바람직하게는 10 내지 20% (w/w)이다.

추가의 양태에서, 본 발명의 분말은 폴리올을 함유한다. 바람직하게는, 폴리올은 만니톨이다.

추가의 양태에서, 당 대 단백질의 질량비는 1:10 내지 10:1, 바람직하게는 1:3 내지 5:1이다.

추가의 바람직한 양태에서, 본 발명의 분말은 결정화 억제제, 예를 들면, HSA(사람 혈청 알부민)을 함유한다. 바람직하게는, 분말은 적어도 0.1% (w/w) HSA, 적어도 0.5% (w/w) HSA, 적어도 1% (w/w) HSA, 적어도 5% (w/w) HSA, 적어도 10% (w/w) HSA, 적어도 15% (w/w) HSA를 함유한다. 추가로, 분말은 바람직하게는 0.1% (w/w) 내지 60%(w/w) HSA, 0.5% (w/w) 내지 60% (w/w) HSA, 1% (w/w) 내지 60% (w/w) HSA, 10% (w/w) 내지 60% (w/w) HSA, 0.1% (w/w) 내지 40% (w/w) HSA, 0.5% (w/w) 내지 40% (w/w) HSA, 1% (w/w) 내지 40% (w/w) HSA, 10% (w/w) 내지 40% (w/w) HSA, 0.1% (w/w) 내지 20% (w/w) HSA, 0.5% (w/w) 내지 20% (w/w) HSA, 1% (w/w) 내지 20% (w/w) HSA, 10% (w/w) 내지 20% (w/w) HSA, 0.1% (w/w) 내지 1% (w/w) HSA, 0.5% (w/w) 내지 1% (w/w) HSA, 0.1% (w/w) 내지 0.90% (w/w) HSA, 0.5% (w/w) 내지 0.9% (w/w) HSA, 0.1% (w/w) 내지 3% (w/w) HSA, 0.5% (w/w) 내지 3% (w/w) HSA를 함유한다. 추가로, 분말은 바람직하게는 1% (w/w) 미만의 HSA, 0.9% (w/w) 미만의 HSA를 함유한다.

추가의 바람직한 양태에서, 본 발명의 분말의 pH는 > 6.0, > 6.5, > 7.0, > 7.4, > 8이다. 6.0 내지 9.0 또는 7.0 내지 8.0의 pH 범위가 특히 바람직하다.

추가의 특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 분말은 생리학적 pH를 갖는다. 추가의 특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 분말의 pH는 7.0 내지 7.4이다. 추가의 바람직한 양태에서, 본 발명의 분말은 페닐알라닌의 등전점 (isoelectric point)에 상응하지 않는 pH를 갖는다.

바람직한 양태에서, 단백질은 활성 물질, 바람직하게는 약제학적 활성 물질, 예를 들면, 항체, 항체 단편, 항체의 일부 또는 접합 항체를 갖는 융합 단백질, 성장 인자, 호르몬, 효소, 사이토카인 또는 인터페론이다. 특히 바람직한 양태에서, 약제학적 활성 물질은 인슐린 또는 칼시토닌이다.

추가의 양태에서, 약제학적 활성 물질은 신생아 Fc-수용체에 결합된 항체 단편 또는 융합 단백질이다.

추가의 양태에서, 단백질 함량은 0.01-70% (w/w), 0.01-60% (w/w), 0.01-50% (w/w), 0.01-40% (w/w), 1-50% (w/w), 10-50% (w/w) 및 바람직하게는 30-50% (w/w)이다.

바람직한 양태에서, 페닐알라닌/당/단백질의 비는 40/10/50, 99.89/0.1/0.01, 90/9/1, 90/1/9, 80/10/10, 30/10/60, 바람직하게는 60/10/30 또는 50/10/40이다.

특히 바람직한 양태에서, 분말은 60/10/30의 질량비의 페닐알라닌/락토수크로즈 또는 사카로즈/작은 단백질로 이루어진다.

추가의 양태에서, 분말 입자의 평균 공기역학적 입자 크기 (MMAD = 평균 중위 공기역학적 직경)는 10㎛ 미만, 바람직하게는 7.5㎛ 미만, 보다 더 바람직하게는 1 내지 6㎛ 또는 3 내지 6㎛ 또는 5 내지 7㎛이다.

추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 분말을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 약제학적으로 허용되는 부형제, 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 염, 완충액, 세제 등을 추가로 함유한다.

본 발명은 추가로,

a) 페닐알라닌 용액을 제조하는 단계,

d) 형성된 입자를 건조 가스로부터 분리하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따르는 분말의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르는 방법의 바람직한 양태에서, 용매는 물, 에탄올, 이소프로판올 등이다.

본 발명의 방법의 특히 바람직한 양태에서, 단백질은 약제학적 활성 물질이다. 약제학적 활성 물질은 바람직하게는 작은 단백질, 항체, 항체 단편, 항체의 일부 또는 접합 항체를 갖는 융합 단백질, 성장 인자, 호르몬, 효소, 사이토카인 또는 인터페론이다. 특히 바람직한 양태에서, 약제학적 활성 물질은 인슐린, 칼시토닌이다. 추가의 가장 특히 바람직한 양태에서, 약제학적 활성 물질은 IgG1, IgG2 IgG3, IgG4 종류의 항체, 항체 단편, 인터페론 등이다.

본 발명의 방법의 추가의 바람직한 양태에서, 단계 (b)에서 무엇보다도 당 또는 폴리올과 같은 추가의 부형제를 가한 다음 활성 물질을 가한다.

본 발명의 방법의 추가의 양태에서, 다음의 단계들이 단계 (a)와 단계 (b) 사이에 수행된다:

- 페닐알라닌 용액을 바람직하게는 80℃로 가열하는 단계,

- 페닐알라닌 용액을, 각각의 경우에 첨가되는 특정 단백질의 변성 온도 미만, 바람직하게는 주위 온도로 냉각시키는 단계.

본 발명의 방법의 바람직한 양태에서, 용액 또는 현탁액은 하나 이상의 압력 노즐 또는 하나 이상의 회전 증발기 또는 하나 이상의 벤추리 노즐 (venturi nozzle) 또는 하나 이상의 초음파 분무기 또는 하나 이상의 2-물질 노즐에 의해 단계 (c)에서 분무한다. 특히 바람직한 양태에서, 용액 또는 현탁액은 하나 이상의 2-물질 노즐을 사용하여 단계 (c)에서 분무한다.

본 발명의 방법의 추가의 바람직한 양태에서, 단계 (d)에서 입자의 분리는 하나 이상의 입자 분리기, 바람직하게는 하나 이상의 사이클론을 사용하여 수행한다.

추가로, 본 발명은 본 발명에 따르는 분말 또는 본 발명에 따르는 약제학적 조성물의 약제로서의 용도 (제1 의학적 표시)에 관한 것이다. 바람직한 의학적 용도에서, 약제는 본 발명에 따르는 분무-건조 분말을 함유한다.

추가로, 본 발명은 본 발명에 따르는 분말 또는 본 발명에 따르는 약제학적 조성물의 흡입 약제로서의 용도에 관한 것이다. 바람직한 의학적 용도에서, 흡입성 약제학적 조성물은 본 발명에 따르는 분무-건조된 분말을 함유한다.

추가로, 본 발명은 본 발명에 따르는 분말 또는 본 발명에 따르는 약제학적 조성물의, 호흡기병 또는 전신 질환 치료용 약제를 제조하기 위한 용도 (제2 의학적 표시)에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 호흡기병 또는 전신 질환 치료용 약제를 제조하는 데 사용되는 본 발명에 따르는 분말 또는 본 발명에 따라 사용되는 약제학적 조성물은 분무-건조된다.

특히 바람직한 양태에서, 호흡기 질환 또는 전신 질환은 폐암, 폐 염증, 다낭성 섬유증, COPD (만성 폐색성 폐 질환), 천식, 항-염증 질환, 바이러스 질환, 예를 들면, 호흡기 합포체 바이러스 (RSV)에 의해 야기되는 바이러스 질환으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 양태는 첨가된 마그네슘 스테아레이트를 함유하지 않는 본 발명의 분말, 바람직하게는 분무-건조 분말에 관한 것이다. 마그네슘 스테아레이트는 물에 거의 불용성이기 때문에 분무 건조에 의해 입자 표면에 소수성을 부여하는 데 부적합하며, 따라서, 마그네슘 스테아레이트 현탁액이 사용되어야 한다. 이 경우, 목적하는 입자 피복을 보장하기 위해서는 비교적 높은 마그네슘 스테아레이트 농도가 필요하다. 따라서, 보다 적합한 방법은 별도의 공정 단계, 예를 들면, (분무-건조) 분말을 마그네슘 스테아레이트와 혼합하는 것이다.

추가의 바람직한 양태에서, 바람직하게는 분무-건조된 본 발명의 분말 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 페닐알라닌 이외에 아미노산을 함유하지 않는다. (분무-건조) 분말은 또한 바람직하게는 오직 아미노산 페닐알라닌만을 함유한다. 이러한 양태는, 다른 아미노산이 페닐알라닌의 놀라운 공기역학적 효과를 감소시키거나 희석시키기 때문에 바람직하다.

본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 첨가된 발린을 함유하지 않는 본 발명의 분말, 바람직하게는 분무-건조 분말에 관한 것이다. 바람직한 분말은 발린을 함유하지 않는다.

본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 첨가된 이소류신을 함유하지 않는 본 발명의 분말, 바람직하게는 분무-건조 분말에 관한 것이다. 바람직한 분말은 이소류신을 함유하지 않는다.

본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 첨가된 류신을 함유하지 않는 본 발명의 분말, 바람직하게는 분무-건조 분말에 관한 것이다. 바람직한 분말은 류신을 함유하지 않는다.

추가의 바람직한 양태에서, 바람직하게는 분무-건조된 분말은 트윈 (Tween) 20과 같은 첨가된 계면활성제를 함유하지 않는다. 상기 양태는, 계면활성제가 단백질 분말, 특히 분무-건조된 단백질 분말에 대해 불안정화 효과를 갖는 경향이 있기 때문에 바람직하다.

본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 첨가된 덱스트란을 함유하지 않는 본 발명의 분말, 바람직하게는 분무-건조 분말에 관한 것이다. 바람직한 분말은 덱스트란을 함유하지 않는다. 덱스트란-함유 분말은 손상된 분산성을 가지므로 덜 바람직하다.

보다 소수성인 아미노산이 입자를 팽창시킨다는 것은 하기 실험으로부터 자명하다. 다른 한편으로, 함유된 아미노산의 함수로서의 붕괴 경향은 예측불가능하며 구조적으로 기초하는 법칙을 따르지 않는다. 하기 실시예에서, 붕괴 경향은 놀랍게도 발린, 이소류신, 페닐알라닌 순서로 증가한다. 발린은 둥근 입자를 형성하는 반면에, 페닐알라닌-함유 입자는 거의 전부 붕괴된다. 페닐알라닌-함유 입자는 놀랍게도 매우 우수한 공기역학적 특징을 갖는다. 아미노산의 포화도에 관계없이, 65 내지 72%의 미립자 분획 (FPF)이 달성될 수 있다.

또한, 페닐알라닌-함유 분말에 의해 달성된 최대 FPF는 페닐알라닌이 아닌 다른 부형제를 함유하는 분말, 특히 분무-건조 분말에 비해 매우 높다는 것이 강조되어야 한다. 달성 가능한 최대 FPF는 임펙터 스테이지 (impactor stage)에 의해 결정된 FPF와 비행 시간을 측정하여 결정된 5㎛ 미만의 비율을 비교함으로써 나타내어진다. 이에 따르면, 용이하게 분산 가능한 분말의 경우, 임펙터 스테이지의 FPF와 비행 시간 측정에 의해 결정된 5㎛ 미만 분획 사이에는 단지 약간의 차이가 있다. 다른 한편으로, 불량하게 분산 가능한 분말의 경우, 임펙터 스테이지를 통해 수득될 수 있는 FPF는 상당히 더 작은 것이 자명하다. 이러한 이유는 임펙터 공정에서, 미립자 분획이 모든 분획에 걸쳐 측정되기 때문이다. 이것은, 예를 들면, 캡슐, 흡입기 및 샘플 도입 포트에 잔류하는 분말에 의해 야기되는 손실이 측정되는 FPF를 감소시킨다는 것을 의미한다. 다른 한편으로 비행 시간 측정시, 이미 분산된 분말을 통해서만 균형이 달성되는데, 이것은 상기한 손실이 측정치에 들어가지 않는다는 것을 의미한다.

입자의 공기역학적 특징은 입자 형태 및 표면 성질에 크게 좌우되는 것으로 추측된다. 따라서, 페닐알라닌-함유 입자의 경우에서와 같이 입자 또는 매우 붕괴된 입자에서의 다중 함입 (multiple indentation)이 흡입을 위해 이상적이다. 붕괴 및 관련된 불균일한 형태는 반데르 발스 힘을 약화시킨다. 또한, 페닐알라닌-함유 입자는, 발린- 및 이소류신-함유 입자와는 달리, 상당히 거친 표면 구조를 갖는다. 거친 표면 구조는 결정화에 의해 야기될 수 있다.

하기 실시예에서, 페닐알라닌은 자체로 및 특히 당과 함께, 특히 분무 건조 후에, 분말의 매우 우수한 공기역학적 특징을 야기한다는 것을 보여줄 수 있다. 그러나, 페닐알라닌 자체는 모든 단백질, 예를 들면, 실시예 1 및 2에서 사용된 IgG1-항체를 안정화시킬 수 없다. 그러나, 이러한 단백질의 경우, 당을 첨가하여 안정화시킬 수 있다.

실시예는 단백질을 거의 전적으로 안정한 조건에서 1개월, 2개월 및 3개월의 시험된 저장 기간에 걸쳐 25℃ 및 40℃ 둘 다에서 건조 저장 조건하에서 저장할 수 있음을 보여준다. 습한 조건하에서는, 실시예에서 사용된 항체에서와 같이 단백질에 약간의 손상이 있을 수 있다.

또한, 하기 실시예는 페닐알라닌-함유 분말이 덱스트란-함유 분말에 비해 상당히 더 양호한 FPF를 가짐을 보여준다 (33.7%에 비해 59.6%). 두 가지 분말의 공기역학적 입자 크기가 단지 약간 다르거나 페닐알라닌-함유 분말이 심지어 약간 더 높은 MMAD를 갖기 때문에, FPF의 차이는 이들이 캡슐로부터 배출됨에 따라 분말의 분산 특징에 기여할 수 있다. 이것은 페닐알라닌-함유 분말이, 상응하는 덱스트란-함유 분말과 비교하여, 상당히 더 양호하게 분산될 수 있고, 이에 따라 미립자간 상호작용이 감소된다는 것을 의미한다.

또한, 실시예는, 덱스트란-함유 분말과 비교하여, 페닐알라닌-함유 분말이 저장 시간에 걸쳐 FPF에 있어서 상당히 더 작은 붕괴를 나타냄을 보여준다. 페닐알라닌은 높은 습도 (예를 들면, 25℃/60% 상대 습도)에서 특히 유리하다. 덱스트란-함유 분말에서는 FPF가 초기 값의 45-49%로 떨어지는 반면에, 페닐알라닌-함유 분말은 25℃/60% 상대 습도에서 2개월간 저장한 후 FPF의 증가를 보이고 3개월 후에는 출발 값의 89%로 단지 약간 저하된다.

실시예의 결과는 특히 증가된 습도에서의 3원 분말 조성물의 적합성을 강조한다. 통상의 분말, 특히 분무-건조 분말은 일반적으로 높은 습도에 노출시 이들의 공기역학적 특징에 있어서 주요한 붕괴를 나타낸다. 다른 한편으로, 페닐알라닌은, 높은 습도 (예를 들면, 60% 상대 습도)에서 저장하는 경우, 공기역학의 안정화를 초래하거나, 실시예에 나타낸 바와 같이, 심지어 이를 개선시킨다.

분말의 형태:

하기 실시예에 예시되어 있는 바와 같이, 분말, 페닐알라닌-함유 분말 및 덱스트란-함유 분말 중의 어느 것도 분말의 큰 응집물을 함유하지 않는다. 더욱이, 제형에서 다중 함입을 볼 수 있다. 두 가지 형태 간의 본질적인 차이는 페닐알라닌-함유 분말의 보다 높은 표면 조도 (roughness)이다. 이러한 증가된 표면 조도는 또한 보다 양호한 분산 특징에 대한 이유라고 생각된다.

실시예 1: 2원 복합체

2원 용액은 IgG1 및 용해도와 소수성이 상이한 각종 아미노산으로부터 제조하였다. 분무 용액 중의 아미노산의 농도는 사용된 아미노산의 50%이고, 다른 일련의 시험에서는 특정 아미노산의 달성 가능한 최대 농도의 90%였다 (표 1 참조). IgG1 및 아미노산의 질량비는 95/5였다. 아미노산의 상이한 용해도의 결과로서, 상응하게 상이한 고체 분획이 수득되었다.

용액은 다음 분무 조건하에서 분무건조시켰다:

분무건조기: SD-Micro (Messrs. Niro)

입구 온도: 120℃

출구 온도: 90℃

분무기 가스 속도: 5kg/h

건조 가스 속도: 28kg/h

보다 소수성인 아미노산은 입자를 팽창시키는 것으로 밝혀졌다. 붕괴 경향은 발린, 이소류신 및 페닐알라닌 순서로 증가하였다. 발린은 둥근 입자를 형성하는 반면에, 페닐알라닌은 거의 완전히 붕괴되었다 (도 1a-1c 참조). 페닐알라닌-함유 분말은 놀랍게도 매우 우수한 공기역학적 특징을 갖는다. 아미노산의 포화도와는 무관하게 65 내지 72%의 미립자 분획 (FPF)을 달성할 수 있었다 (표 2 참조).

페닐알라닌-함유 분말에서 달성 가능한 최대 FPF는 표 1에 열거된 부형제를 갖는 분무-건조 분말과 비교하여 매우 높다는 것이 또한 강조되어야 한다. 달성 가능한 최대 FPF는 임펙터 스테이지에 의해 결정된 FPF와 비행 시간을 측정하여 결정된 5㎛ 미만의 비율을 비교함으로써 수득된다. APS 방법이 도 5/6의 설명부에 상세하게 설명되어 있다. 이에 따르면, 쉽게 분산 가능한 분말의 경우, 임펙터 스테이지의 FPF와 비행 시간을 측정함으로써 결정된 5㎛ 미만의 분획 사이에는 단지 약간의 차이가 있다. 다른 한편으로, 불량하게 분산 가능한 분말의 경우, 임펙터 스테이지를 통해 수득되는 FPF는 상당히 더 작은 것이 명백하다. 그 이유는 임펙터 방법에서, 미립자 분획은 전체 분획에 걸쳐 측정되기 때문이다. 이것은, 예를 들면, 캡슐, 흡입기 및 샘플 도입 포트에 잔류하는 분말에 의해 야기되는 손실이 측정되는 FPF를 감소시킨다는 것을 의미한다. 다른 한편으로 비행 시간 측정시, 이미 분산된 분말을 통해서만 균형이 달성되는데, 이것은 상기한 손실이 측정치에 들어가지 않는다는 것을 의미한다.

입자의 공기역학적 특징은 입자 형태 및 표면 성질에 크게 좌우되는 것으로 추측된다. 따라서, 페닐알라닌-함유 입자의 경우에서와 같이 입자 또는 매우 붕괴된 입자에서의 다중 함입이 흡입을 위해 이상적이다.

붕괴 및 관련된 불균일한 형태는 반데르 발스 힘을 약화시킨다. 또한, 페닐알라닌-함유 입자는, 발린- 및 이소류신-함유 입자와는 달리, 상당히 거치 표면 구조를 갖는다. 거친 표면 구조는 결정화에 의해 야기될 수 있다.

^a MMAD는 비행 시간 측정법 (time-of-flight measurement; TOF)을 사용하여 측정하였다. 이를 위해, 분말을 샘플 도입 포트 (SIP)를 통해 39.0L/min의 유량에서 핸디헤일러를 사용하여 배출시킨다. SIP를 통해 통과시킨 후, 분말 에어로졸을 분리한다. 입자 집단의 99.8%의 분획이 원-스테이지 임펙터를 통해 통과한다. 0.2%의 분획은 모세관을 통해 TOF 측정 셀을 통과한다.

^b FPF는 원-스테이지 임펙터를 사용하여 측정한다. 임펙터 스테이지의 컷-오프는 39.0L/min의 유량에서 5.0㎛에서 수행한다.

^c 달성 가능한 최대 FPF는 TOF 측정 셀에서 측정된 5㎛ 미만의 비율과 같다. 임펙터 스테이지를 바로 통과한 분말 에어로졸을 TOF 측정 셀에서 측정한다. 따라서, TOF 측정은 측정 장치 (캡슐, 핸디헤일러, SIP)에 미리 침착된 입자 분획과는 관련이 없다. 다른 한편으로, FPF는 캡슐에서의 중량을 기준으로 한다. 이는 임펙터 스테이지에 도달하기 전에 침착된 입자 분획을 포함한다. FPF가 TOF 측정 셀에서 발견된 5.0㎛ 미만의 입자 분획과 동일하다면, 결과적으로 분말은 완전히 분산된 것이며 핸디헤일러 및 SIP에는 분말 침착물이 없다.

도 2는 분무건조 후의 항체의 단량체 함량을 보여준다. 이로부터, 덜 소수성인 아미노산 (글리신, 아스파라긴)이 항체에 대해 안정화 효과를 갖는다는 것이 자명하다. 이와 달리, 소수성 아미노산 (발린, 이소류신 및 페닐알라닌)은 항체에 대해 충분한 안정화 가능성을 갖지 않았다.

실시예 2: 3원 복합체

실시예 1을 기초로 하여, IgG1, 페닐알라닌 및 다른 부형제로부터 3원 혼합물을 제조하였다. 제3 성분은 매우 용이하게 물에 용해되는 삼당류 락토수크로즈 LS90P였다.

4개의 분무 용액을 제조하였다 (표 3 참조). 용매는 정제수였다. 분무 용액 중의 고체 분획은 각각의 경우에 3.83% (w/v)였다.

용액을 다음 분무 조건하에서 분무-건조시켰다:

분무 건조기: SD-Micro (Messrs. Niro)

입구 온도: 120℃

출구 온도: 90℃

분무기 가스 속도: 4kg/h

건조 가스 속도: 28kg/h

도 3a 내지 3d는 상이한 3원 분말의 SEM 사진을 보여준다. 4개의 분말은 페닐알라닌 및 IgG1의 분말 조성물 (실시예 1 참조)과 동일한 주름 (creasing)을 나타낸다. 4개의 3원 분말은 서로 유의적인 차이를 보이지 않는다.

표 4는 4가지 분말의 공기역학적 특징을 나타낸다. 락토수크로즈를 첨가한 결과로, FPF는 2원 조성물과 비교하여 단지 약간 떨어진다. 다른 한편으로, 3원 분말 조성물의 분무건조 후의 단백질 안정화는 매우 우수하다. 모든 제형에 대한 단량체 함량은 98 내지 99%였다 (표 5a 참조).

실시예 3: 저장 안정성

상기 실시예에서, 페닐알라닌은 자체로 및 특히 당과 함께, 분무 건조 후 분말의 매우 우수한 공기역학적 특징을 야기하는 것이 입증되었다. 그러나, 페닐알라닌 자체로는 모든 단백질, 예를 들면, 실시예 1 및 2에서 사용되는 IgG1-항체를 안정화시킬 수 없다. 그러나, 이러한 단백질의 경우, 당을 첨가하여 안정화시킬 수 있다. 당해 실시예에서, 분무 건조 후의 저장 안정성을 조사하였다. 한편으로, 페닐알라닌 함량은 변화시켰다 (분말을 기준으로 하여 80-60%). 다른 한편으로, 단백질 안정성에 미치는 LS90P의 비율의 영향을 검사하였다. 단백질 대 당을 상이한 비율로 사용하였다 (표 5b 및 6 참조).

페닐알라닌을 용액 속에서 가열 (80℃)하면서 용해시켰다. 용액을 주위 온도로 냉각시킨 후, 단백질 및 당을 가하였다.

용액을 다음의 분무 건조하에서 분무-건조시켰다:

분무 건조기: SD-Micro (Messrs. Niro)

입구 온도: 150℃

출구 온도: 90℃

분무기 가스 속도: 4kg/h

건조 가스 속도: 28kg/h

저장 조건: 분말을 상이한 저장 조건 (25℃/건조, 40℃/건조, 25℃/60% RH)하에서 3개월 동안 저장하였다 (표 7 및 8 참조). 25℃/건조 및 40℃/건조의 저장 조건을 위해, 분말을 건조 조건 (<30 %RH) 하에서 유리병에 옮겨 고무 마개 및 플랜지 캡으로 밀봉하였다.

25℃ 및 60% 상대 습도에서의 저장은 건조기 (desiccator) 속에서 포화 염수 용액을 사용하여 실시하였다. 건조기는 건조 컵보드에서 조정되었다.

MMAD는 충전 및 저장 조건 간에 유의적인 의존성을 나타내지 않는다.

제조 직후, 즉 저장 전의 FPF는 46% (분말 3) 내지 60% (분말 1)이다. 페닐알라닌 함량을 80% (분말 2)에서 60% (분말 3)로 낮추면 미립자 분획에 불리한 영향을 미친다.

분무 건조 및 저장 후의 단백질 안정성이 표 9에 나타나 있다. 표 9는 IgG1 항체의 단량체 함량 %를 보여준다. 도 4는 출발 값을 기준으로 한 상대적인 단량체 함량을 보여준다.

실시예는, 단백질이 거의 전적으로 안정화된 조건하에서 25℃ 및 또한 40℃ 둘 다에서 건조 저장 조건 하에, 시험된 저장 기간에 걸쳐 저장할 수 있음을 보여준다. 습한 조건하에서는 실시예에서 사용된 항체가 약간 손상된다.

따라서, 3원 분말은 우수한 미립자 분획 및 추가로 또한 우수한 저장 안정성을 갖는다.

실시예 4: 비교 (덱스트란- 및 페닐알라닌-함유 분말)에 의한 저장 안정성

페닐알라닌-함유 분말의 특성을 또 다른 통상적인 분말의 특성과 비교하였다 (표 10 참조). 두 가지 분말 모두에 대해, 저장 기간에 걸쳐 공기역학적 입자 크기가 단지 약간 변한다 (표 11).

페닐알라닌-함유 분말은 덱스트란-함유 분말에 비해 실질적으로 더 양호한 FPF를 갖는다 (33.7%에 비해 59.6%, 표 12/도 5 참조). 두개의 분말의 공기역학적 입자 크기가 단지 약간 상이하거나 페닐알라닌-함유 분말이 약간 더 높은 MMAD를 갖기 때문에 (표 11 참조), FPF의 차이는 분말이 캡슐로부터 배출됨에 따른 분말의 분산 특징에 기인할 수 있다. 이것은 페닐알라닌-함유 분말이 상응하는 덱스트란-함유 분말에 비해 실질적으로 더 양호하게 분산될 수 있으며, 이에 따라 미립자간 상호작용이 감소됨을 의미한다.

도 6은 안정성의 출발 값을 기준으로 한 상대적인 FPF를 보여준다. 페닐알라닌-함유 분말은 저장 기간에 걸쳐 FPF에 있어서 실질적으로 더 작은 붕괴를 나타냄이 자명하다. 페닐알라닌은 보다 높은 습도에서 특히 유리하다. 덱스트란-함유 분말에서는 FPF가 초기 값의 45-49%로 떨어지는 반면, 페닐알라닌-함유 분말에서는 2개월간의 저장후에도 FPF의 증가를 보이며, 3개월 후에는 출발 값의 89%로 단지 약간 감소한다.

이러한 결과는 특히 증가된 습도에서의 3원 분말 조성물의 적합성을 강조한다. 통상의 분무-건조 분말은 일반적으로 이의 공기역학적 특징에 있어서 상당한 붕괴를 나타낸다. 다른 한편으로, 페닐알라닌은 공기역학의 안정화를 초래하거나, 당해 실시예에서 나타나는 바와 같이, 심지어 이를 개선시킨다.

분말의 형태:

도 7 및 도 8에 도시되어 있는 바와 같이, 어떠한 분말 (도 7의 페닐알라닌-함유 분말, 도 8의 덱스트란-함유 분말)도 분말의 큰 응집물을 함유하지 않는다. 더욱이, 두 가지 제형 모두에서 다중 함입을 볼 수 있다. 두 가지 형태 사이의 본질적인 차이는 페닐알라닌-함유 분말의 보다 높은 표면 조도이다. 이러한 증가된 표면 조도가 또한 보다 양호한 분산 특징에 대한 이유라고 생각된다.

소수성 아미노산 (이소류신 또는 페닐알라닌)의 첨가는 두 가지 분말 모두에서 입자의 표면을 적어도 부분적으로 소수성으로 만들어야 한다. 여기서 다시, 단순히 표면을 소수성으로 만드는 것은, 페닐알라닌의 경우에서와 같이, 거친 표면 구조를 유도하는 것보다 공기역학적 특징을 위해 훨씬 덜 효율적임이 입증된다.

실시예 5: 상이한 pH -값에서의 분무 건조

당해 실시예에서, 정의한 조성 (표 13 참조)의 분무 용액을 상이한 pH 값으로 조절하여 분무하였다.

분무 조건은 표 14에 제시되어 있다.

표 15에 나타낸 분말의 공기역학적 특징 (FPF, 배출량)은 본질적인 차이가 없는 것으로 나타났다. 제조된 분말은 각각의 경우 부분적으로 결정성이었다. 따라서, 분무 용액의 pH 값은 분말 특징 (분산성/흡입성) 및 페닐알라닌의 분무 특성에 중요하지 않다.

단백질 안정화는 분무 용액의 pH 값에 의존적이다. 사용된 항체는 낮은 pH 값에서 더 안정하다. 그러나, 특히 2원 조성물 (도 2 참조)과 비교한 단백질 안정화는 9.0의 높은 pH 값에서도 달성될 수 있다.

실시예 6: 상이한 양의 페닐알라닌의 분무 건조

당해 실시예에서, 분무-건조 분말 중의 페닐알라닌 함량을 50% w/w에서 20% w/w로 감소시킨다. 분말의 조성은 표 16을 따른다. 분무 조건은 표 17에 제시되어 있다.

도 9는 분말 중의 페닐알라닌 함량의 함수로서의 분무-건조 분말의 공기역학적 특징을 보여준다. 상기 도면에 따르면, 분무-건조 분말 중의 페닐알라닌 함량을 30% (w/w)로 감소시킬 수 있다. 페닐알라닌 함량을 20% (w/w)로 더욱 낮추면, 미립자 분획 및 배출량 둘 다 실질적으로 감소된다.

입자 형태는 분무-건조 분말 중의 페닐알라닌 함량에 크게 의존적이다. 50% (w/w), 40% (w/w) 및 30% (w/w)의 페닐알라닌 함량에서는, 매우 주름진 건포도형 입자가 수득된다 (도 10a 내지 10c 참조). 페닐알라닌 함량이 20%로 감소되는 경우, 접힘 강도 (intensity of folding)는 급격하게 감소한다. 입자 형태의 변화는 분말의 공기역학적 특징의 저하와 상관성이 있다. 이것은 분무 용액의 분무건조시 페닐알라닌의 긍정적인 효과는 30% (w/w) 이상에서만 명백해짐을 의미한다.

실시예 7: 각종 단백질의 분무건조

당해 실시예에서는, IgG 타입 항체 이외에, 호르몬 칼시토닌 및 효소 리소자임을 분무건조시켰다. 제조된 분말의 조성이 표 18에 제시되어 있고, 분무 조건은 표 19에 명시되어 있다.

도 11은 분무-건조 분말 1 내지 3의 미립자 분획 및 배출량을 보여준다. 따라서, 단백질의 성질은 분무-건조 분말의 공기역학적 특징에 중요하지 않다.

실시예 8: 상이한 추가의 부형제를 사용한 분무-건조 분말의 제조

이러한 일련의 실험에서, LS90P 대신에, 다른 부형제를 페닐알라닌 및 IgG1 항체와 함께 분무-건조시켰다. 제조된 분말의 조성이 표 20에 제시되어 있고, 분무 조건이 표 21에 제시되어 있다.

도 12는 미립자 분획 및 배출량을 보여준다. 미립자 분획은 시험된 부형제 사용시 매우 높다 (사카로즈: 46%, 만니톨: 60%, 글리신: 62%, PVP: 63%). 또한, 부형제의 탁월한 선택에 의해, 분무 건조 공정에 대한 페닐알라닌의 긍정적인 효과가 더욱 개선될 수 있는 것으로 나타났다. 추가의 부형제는 하나의 카테고리의 물질로 제한되지 않는다. 이것은, 당해 실시예에서와 같이, 당 또는 당 알콜, 아미노산 또는 중합체일 수 있다. 추가의 부형제 사용에 중요한 것은 분무 건조 동안의 단백질의 안정화이다. 표 22는 사용된 항체의 단량체 함량을 보여준다. 또 다른 부형제를 첨가함으로써, 페닐알라닌과 IgG1의 2원 혼합물 (도 2 참조)과 비교하여, 단백질을 안정화시킬 수 있음이 명백하다.

실시예 9: 결정화 억제제를 사용한 분무 건조

당해 실시예는, 결정화 억제제를 사용하여 분무-건조 분말을 최적화시킬 수 있음을 입증하기 위한 것이다. 이러한 목적으로, 표 23에 제시된 바와 같이 상이한 분말을 제조하였다.

Buchi B191 및 SDMicro에서의 분무 조건은 표 24에 제시되어 있다.

LS90P 용액을 동결-건조하는 목적은 X-선 무정형 분말을 제조하기 위한 것이었다. 이를 위해, 작은 고체 분획 (5g/100mL)을 갖는 수용액을 제조하여 표 25에 기재된 바와 같이 동결-건조시켰다.

도 13은 DSC 장치 (DSC821/Mettler Toledo)에서 분말을 가열한 후의 LS90P의 재결정화 엔탈피를 보여준다. 사용된 단백질의 질량에 의해 비율을 기준으로 한 결정화 엔탈피는 단백질에 크게 의존하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 결정화 엔탈피는 IgG1 (6.8J/g), 리소자임 (13.9J/g), 칼시토닌 (21.3J/g)의 순서로 증가하며, 따라서 분무 건조 후의 LS90P의 무정형 분획도 마찬가지다. 해당 분말 제형에서의 LS90P가 분말에서의 단백질-안정화 성분이기 때문에, 분말 중에 LS90P의 높은 무정형 분획을 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 추가의 일련의 실험에서, HSA를 결정화 억제제로서 분무 용액에 가하였다. 분무 건조는 표 26에서와 유사하게 수행하였다. 분말의 조성은 다음과 같다: 60% 페닐알라닌 / 30% LS90P / 1% HSA / 9% IgG1. LS90P의 결정화 엔탈피는 24.3J/g이고, X선-무정형 LS90P (23.8J/g)에 상응하였다. IgG1-함유 분말 2를 기준으로 하여, 분말의 무정형 성질을 기준으로 한 분말 특징은 소량의 HSA를 첨가함으로써 최적화될 수 있다.

실시예 10: 각종 방향족 아미노산의 비교

당해 실시예는 방향족 아미노산 트립토판 및 히스티딘을 필적하는 페닐알라닌-함유 분말과 비교하기 위해 설정되었다. 방향족 아미노산 티로신은, 충분히 수용성이 아니기 때문에, 분무건조를 위한 잠재적인 부형제로서 제외된다. 트립토판 또한 페닐알라닌에 비해 수용성이 매우 불량하므로, 20% w/w 이하의 트립토판 함량을 사용하여 약제학적으로 유용한 분말을 제조할 수 있다.

방향족 아미노산의 분무 특성을 비교하기 위해, 각각의 경우 20% 아미노산을 함유하는 분말을 제조하였다. 표 27은 분말의 조성을 나타내고, 표 28은 분무 조건을 나타낸다.

미립자 분획은 페닐알라닌-함유 분말을 분무 건조한 후에 약간 더 좋아졌다 (도 14 참조). 히스티딘-함유 분말을 능가하는 페닐알라닌-함유 분말의 주요 잇점은 이의 낮은 습기-민감성이다. 히스티딘-함유 분말의 FPF는 50% 상대 습도에 노출시킨 후에 분해되는 반면에, 페닐알라닌-함유 분말의 경우 FPF는 습기에 노출시킨 후에도 개선된다. 상응하는 특성은 배출량과 관련해서도 관찰할 수 있다. 히스티딘-함유 분말의 경우, 배출량은 습기에 노출시 감소하는데 반해, 페닐알라닌-함유 분말의 경우에는 증가한다.

트립토판-함유 분말은 습도의 결과로서 FPF 및 배출량에 있어서 변화를 보이지 않는다. 페닐알라닌과 비교하여 이들 아미노산의 단점은, 앞서 이미 언급한 바와 같이, 매우 낮은 수용해도이다.

히스티딘을 상응하는 페닐알라닌-함유 분말과 추가로 비교하였다 (표 29 참조). 제조방법은 표 28에 명시된 분무 조건과 유사하였다.

분말 4 및 6은 유사한 공기역학적 특징을 갖는데 반해, 페닐알라닌-함유 분말 7은 상응하는 히스티딘-함유 분말 5에 비해 상당히 더 양호한 미립자 분획을 나타낸다 (표 30 참조).

특히 주목할만한 것은 습기에 노출시킨 후의 공기역학에 있어서의 차이이다 (표 31 참조). 수분 영향의 결과로서, FPF가 시험된 히스티딘-함유 분말에서 거의 전적으로 분해된다. 다른 한편으로 페닐알라닌-함유 분말은 공기역학적 특징에 있어서 약간의 개선을 나타낸다.

요약하면, 분무 건조에 대한 페닐알라닌의 긍정적인 효과는 다른 방향족 아미노산을 사용해서는 달성될 수 없다고 할 수 있다.

Claims

단백질 및 페닐알라닌을 함유하는 조성물로서, 페닐알라닌이 조성물의 총 중량에 대해 30% (w/w) 이상의 양으로 포함됨을 특징으로 하는, 흡입용의 분무 건조된 분말 조성물.
제1항에 있어서, 조성물이 당 및 폴리올로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 부형제를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제2항에 있어서, 당이 이당류 및 올리고당으로부터 선택된 비환원당임을 특징으로 하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질이 활성 물질임을 특징으로 하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 분말 입자의 평균 공기역학적 입자 크기 (MMAD = 질량 중위 공기역학적 직경)가 10㎛ 미만임을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 페닐알라닌이 조성물의 총 중량에 대해 40% (w/w) 이상의 양으로 포함됨을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서, 활성 물질이 항체, 항체 단편, 항체의 일부 또는 접합 항체를 갖는 융합 단백질, 성장 인자, 호르몬 및 효소로부터 선택되는 약제학적 활성 물질임을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서, 분말 입자의 MMAD가 7.5㎛ 미만임을 특징으로 하는 조성물.
제8항에 있어서, 분말 입자의 MMAD가 1 내지 6㎛, 3 내지 6㎛ 또는 5 내지 7㎛임을 특징으로 하는 조성물.
(a) 페닐알라닌 용액을 제조하는 단계,

(b) 하나 이상의 단백질 및 임의로, 당 또는 폴리올로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 부형제를 가하는 단계,

(c) 수득된 용액 또는 현탁액을 90 내지 200℃의 유입 온도 및 40 내지 150℃의 유출 온도에서 분무하는 단계, 및

(d) 형성된 입자를 건조 가스로부터 분리하는 단계를 수행함을 특징으로 하는, 제1항 또는 제2항에 따르는 흡입용의 분무 건조된 분말 조성물의 제조방법.
제10항에 있어서, 단백질이 약제학적 활성 물질임을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 단계 (a)와 단계 (b) 사이에 추가의 단계들로서

- 페닐알라닌 용액을 가열하는 단계 및

- 페닐알라닌 용액을, 각각의 경우에 첨가되는 특정 단백질의 변성 온도 미만으로 냉각시키는 단계를 수행함을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 용액 또는 현탁액을, 하나 이상의 압력 노즐 또는 하나 이상의 회전 증발기 또는 하나 이상의 벤추리 노즐(venturi nozzle) 또는 하나 이상의 초음파 분무기 또는 하나 이상의 2-물질 노즐에 의해 단계 (c)에서 분무함을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 단계 (d)에서의 입자의 분리를 하나 이상의 입자 분리기를 사용하여 수행함을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 페닐알라닌 용액을 가열하는 단계에서 페닐알라닌 용액을 80℃로 가열함을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 페닐알라닌 용액을 냉각시키는 단계에서 페닐알라닌 용액을 주위 온도로 냉각시킴을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 단계 (d)에서의 입자의 분리를 하나 이상의 사이클론을 사용하여 수행함을 특징으로 하는 방법.
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