KR101379693B1 - Ｋ-252ａ 및 그의 유도체의 중합체 컨쥬게이트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 K-252a 및 그 유도체의 신규한 중합체 컨쥬게이트 및 키나아제-관련 질병의 예방, 경감 및 치료에 유용한 약학적 조성물의 제조를 위한 그들의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 HMGB1-관련 질환의 예방, 경감 및 치료에 관한 것이다. 특정한 양태에서, 본 발명은 신경계 질환, 신경병증 및 중추신경계와 말초신경계의 신경퇴행성 질환의 예방, 경감, 및 치료를 위해 유용한 약학적 조성물의 제조에서 K-252a 및 그 유도체의 신규한 중합체 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 피부 질환, 특히, 과다한 각질세포 증식과 관련된 피부 질환, 특히, 건선의 예방, 경감, 및 치료를 위해 유용한 약학적 조성물의 제조에서 상기 중합체 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 NGF-관련 통증의 예방, 경감, 및는 치료를 위해 유용한 약학적 조성물의 제조에서 상기 중합체 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 K-252a 및 그의 유도체의 중합체 컨쥬게이트로서, 상기 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 또는 메톡시-폴리에틸렌 글리콜인 것인 식 (I)의 중합체 컨쥬게이트에 관한 것이다.
중합체 컨쥬게이트, K-252a, 키나아제 관련 질환, 티로신 키나아제.

Description

Ｋ-252ａ 및 그의 유도체의 중합체 컨쥬게이트{Polymer conjugates of K-252a and derivatives thereof}
본 발명은 K-252a 및 그의 유도체의 신규한 중합체 컨쥬게이트(polymer conjugate) 및 키나아제-관련 질환의 예방, 경감 및 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 그들의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 HMGB1-관련 질환의 예방, 경감 및 치료에 관한 것이다. 특정한 양태에서, 본 발명은 신경계 질환, 신경병증 및 중추신경계 및 말초신경계의 신경퇴행성 질환의 예방, 경감 및 치료를 위해 유용한 약학적 조성물의 제조에서 K-252a 및 그의 유도체의 신규한 중합체 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 피부 질환, 특히, 과도한 각질세포 증식과 관련된 피부 질환, 특히, 건선의 예방, 경감 및 치료를 위해 유용한 약학적 조성물의 제조에서 상기 중합체 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 NGF-관련 통증의 예방, 경감 및 치료에서 상기 중합체 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 K-252a 및 그의 유도체의 중합체 컨쥬게이트로서, 상기 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 또는 메톡시-폴리프로필렌 글리콜인 중합체 컨쥬게이트에 관한 것이다.
K-252a는 노카르디오프시스 종 토양 균류(Nocardiopsis sp soil fungi)(WO 97/38120)로부터 최초로 분리된, 하기의 식을 갖는 인돌로카르바졸 골격을 갖는 친지질성 알칼로이드이다:
Figure 112008021259056-pct00001
K-252a는 세포 기능의 조절에서 중심적인 역할을 수행하고, 평활근 수축을 억제하는 작용(Jpn. 3. Pharmacol. 43(suppl.): 284, 1987), 세로토닌 분비를 억제하는 작용(Yamada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 144:35-40, 1987), 뉴락손(neuraxone)의 신장을 억제하는 작용(Koizumi et al., J. Neurosci. Res. 8:715, 1988), 히스타민 방출을 억제하는 작용(Morita et al., Allergy 43:100-104, 1988), 평활근 미오신 경쇄 키나아제를 억제하는 작용(Nakanishi et al., J. Biol. Chem. 263:6215-6219, 1988), 항-염증 작용(Papp et al., Acta Physiol. Hung. 80: 423-425, 1992), 세포 생존 활성(Glicksman et al., J. Neurochem. 64:1502-1512, 1995), 등과 같은 다양한 활성을 갖는 프로테인 키나아제 C(PKC)를 강하게 억제한다. 또한, K-252a는 IL-2 생성을 억제하는 활성을 갖는다는 것이 Grove et al., Exp. Cell Res., 193: 175-182, 1991에 개시되었다. K-252a의 완전 한 합성도 수행되었다(Wood et al., J. Am. Chem. Soc. 117:10413-10414, 1995).
신경 성장 인자(NGF)는 가장 특성이 잘 규명된 신경영양성(neurotrophic) 인자이고 특정한 감각성 및 콜린성 신경세포의 정상적인 발달 및 기능을 위해 요구된다(Levi-Montalcini, Annu. Rev. Neurosci. 5:341-362, 1982). 고-친화도 신경영양성 수용체(high-affinity neurotrophic receptor)인 trk는 trk A, trk B, 및 trk C로 구성된 단백질의 패밀리를 포함한다(Knusel et al., J. Neurochem. 59:715-722, 1992). 이 수용체 패밀리의 구성물들은 티로신 키나아제 활성을 보이는 막-결합 단백질(membrane-associated protein)이다. 뉴로트로핀 리간드(neutrophin)와 trk 간의 상호작용은 수용체 상의 특정한 티로신 잔기의 인산화를 유도한다. trk의 인산화는 뉴로트로핀 결합에 대한 즉각적인 반응이다. 이는 세포에 의한 뉴트로핀에 대한 기능적 반응을 조절하는 효소 경로의 활성화를 위한 절대적 요건이다(Klein et al., Cell 65:189- 197, 1991 ; Lamballe et al., Cell 66:967-979, 1991). K-252a는 trk를 포함한, 수개의 효소의 억제자이다. 이 효과와 일치하여, K-252a는 일부 인 비트로 세포 분석에서 NGF-매개 세포 생존을 방해하며(Koizumi et al., J. Neurosci. 8:715-721 , 1988; Doherty et al., Neurosci. Lett. 96:1-6, 1989; Matsuda et al., Neurosci. Lett. 87:11-17, 1988), 이는 trk의 인산화 상태에 영향을 미치기 때문이다.
문헌에서, K-252a 및 그의 유도체, 예를 들면, 비스-에틸-티오메틸 유사체 CEP-1347의 신경 퇴행성 질환 치료 잠재력이 입증되었다(Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2004;44:451-74; Neurochem Int. 2001 Nov-Dec;39(5-6):459-68; Neuroport. 2000 Nov 9;11 (16): 3453-6; Neuroscience. 1998 Sep;86(2):461-72; Brains Res. 1994 JuI 4;650(1 ): 170-4).
피부의 항상성(homeostasis) 및 병태생리학적 과정을 위한 핵심적인 세포 성분인 각질세포(keratinocyte)는 다수의 시토킨을 분비하고 여러 성장 인자에 의해 자극된다. NGF는 피부에서 합성되고 투여량-의존적 방식으로 배양에서 정상적인 인간 각질세포의 증식을 유의성 있게 자극한다. 이 효과는 고-친화도 NGF 수용체 (trk) 특이적 억제제인 K-252a의 첨가에 의해 방지되며, 따라서, 인간 각질세포에 대한 NGF 효과는 고-친화도 NGF 수용체에 의해 매개된다는 것을 시사한다. 따라서, NGF는 인간의 피부에서 시토킨으로 작용할 수 있고 각질세포 증식 질환에 참여할 수 있다(Pincelli et al., J. Invest. Dermatol. 103:13-18, 1994). 신경성 염증 및 NGF의 역할이 건선에서 집중적으로 연구되었다. 각질세포에서 NGF의 증가된 수준 및 건선성 플라크(psoriatic plaque)의 피부 신경에서 NGF 수용체의 상향조절이 있다. NGF는 각질세포의 증식, 혈관형성, T 세포 활성화, 부착 분자(adhesion molecule)의 발현, 피부 신경의 증식, 및 뉴로펩티드의 상향조절과 같은, 건선에서 나타나는 모든 현저한 병리적 사건에 영향을 미칠 수 있다. 이중-맹검, 위약-제어 연구(double-blinded, placebo- controlled study)에서, 건선에서 NGF 및 NGF 수용체의 역할은 건선의 SCID(severe combined immunodeficient) 마우스-인간 피부 모델을 이용한 인 비보 시스템에서 다루어졌다. SCID 마우스 상의 이식된 건선성 플라크를 K-252a로 처리하였다. 건선은 2주의 치료법 적용 후에 유의성 있게 개선되었다(Raychaudhuri et al., J. Invest. Dermatol. 122:812-819, 2004).
또한, NGF는 여러 급성 통증 상태 및 만성 통증 상태에서 통증 및 통각과민의 생성에서 중요한 역할을 갖는 것으로 보고되었다. NGF의 발현은 손상된 염증성 조직에서 높고, 통각성 신경세포 상의 NGF 수용체 티로신 키나아제 TrkA의 활성화는 복수의 메카니즘에 의해 통증 신호전달을 유발하고 강화한다. NGF 길항작용(antagonism)은 다수의 통증 상태에서 매우 효과적인 치료방식이고 전통적인 진통제의 부작용을 갖지 않을 것으로 예상된다[Hefti FF et al. Trends Pharmacol. ScL (2006) 27:85-91]. 증거는 TrkA 수용체가 NGF의 통각 작용을 위해 요구된다는 것을 나타낸다. 대부분의 수용체 티로신 키나아제 억제제는 ATP의 촉매성 티로신 키나아제 도메인으로의 결합을 차단한다[Madhusudan S et al. CHn. Biochem. (2004) 37: 618-635]. 알칼로이드 K-252a는 높은 강도로 Trk 신호전달을 억제하고 췌장 통증의 동물 모델에서 과민성(hypersensitivity)을 약화시킨다 [Winston JH et al. J. Pain (2003) 4:329- 337]. 그러나, K-252a는 여러 키나아제에 대한 강력한 억제제이기 때문에, TrkA에 대한 선택성을 갖지 않는다. 이는 K-252a는 TrkA의 억제와 관련되지 않는 많은 부작용을 가질 것이라는 것을 의미한다.
특허 출원 WO 2005/014003은 건선 및 피부 종양과 같은 질환의 특징적인 과다한 각질세포 증식을 억제할 수 있는 국소 약제를 제조하기 위한 K-252 패밀리에 속하는 미생물 기원의 티로신 키나아제 억제제의 용도를 개시한다.
국제 특허출원 PCT/EP2005/008258는 HMGB1-관련 질환의 예방 및 치료에서 K-252a 및 그의 유도체의 용도를 개시한다. HMGB1은 괴사성 세포 또는 사망하는 세포에 의해 방출되어, 인간의 여러 질환에서 염증성 시토킨 캐스캐이드를 초래하는 염증유발성 케모킨(pro-inflammatory chemokine)이다. 바람직한 구체예에서, 전술된 미국 특허 출원은 K-252a 및 그의 유도체의 재협착의 예방 및 치료를 위한 치료제로서의 신규한 용도를 개시한다. K-252a는 실제로 재협착 형성의 기반이 되는 사건인 HMGB1-유도 동맥 평활근 세포 이동 및 증식을 차단/억제하는 능력을 갖는다. 이 목적을 위해, K-252a 및 그 유도체가 인 시투(in situ)로 방출되도록, 의료 장치, 특히, 스텐트 상에 결합, 포매(embed) 또는 흡착에 의해 표면-코팅으로 적재된다.
K-252a 자체 외에, K-252a의 다양한 유도체가 합성되고 생물학적 활성에 대해 테스트되었다. 예로서, K252a의 유도체인 CEP1347은 신경보호적 특성을 보유하나, TrkA를 억제하지 않는다. CEP1347은 MLK3을 포함한 MAPKKK를 직접적으로 억제하는 것으로 확인되었다(Roux et al., J. Biol. Chem. 277:49473-49480, 2002). 또 다른 K-252a 유도체, KT5926은 BHK-21 세포에서 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus: VSV) 복제에 대해 조사되었다(Kim et al., Biol. Pharm. Bull. 21 :498-505, 1998). C31에 보존적 치환을 갖는 K-252a 유사체는 광범위한 키타아제에 대한 효능을 갖는다(Schneider et al., Org. Lett. 7:1695-1698, 2005).
전신적으로 투여되는 약물의 효능은 생리적 pH에서의 열등한 용해도(poor solubility) 및 사구체 여과, 세포 청소(cellular clearance) 및 대사에 의한 제거와 같은 인자에 의해 인 비보(in vivo)에서 방해될 수 있다. 다수의 경우에, 그와 같은 불리한 효과는 그와 같은 작용제의 효과적인 치료적 용도를 방해한다. 작용제의 효능 및 효과의 지속기간을 개선하고 잠재적인 독성(toxicologic) 효과를 감소시키기 위한 성공적인 전략은 생물학적 활성제의 다양한 중합체로의 공유 결합이다. 활성제의 약리적 및 독물학적 특성을 개선시키기 위해 가장 자주 이용되는 중합체 중 하나는 폴리알킬렌옥시드 폴리에틸렌 글리콜, 약자로, PEG이다.
양친매성이고 무독성이며, 면역학적으로 불활성인 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체는 다수의 약동학 및 독성학적 특성을 조작하기 위해 약물에 컨쥬게이트될 수 있다. 약물 전달의 분야에서, PEG 유도체는 면역원성, 단백질 분해 및 신장에 의한 제거(kidney clearance)를 감소시키고 용해도를 증가시키기 위해 공유결합에 의한 부착(covalent attachment)(즉, "페길화(PEGylation)")에서 널리 이용되었다(Zalipsky, Adv. Drug Del. Rev. 16:157-182, 1995). 마찬가지로, PEG는 독성을 경감시키고, 생체내 분포(biodistribution)를 변화시키고, 용해도를 증가시키기 위해 저분자량이고, 비교적 소수성인 약물에 부착되었다. 페길화된 약물들은 컨쥬게이트(conjugate)에 전달된 PEG의 특성에 의해, 그들의 변형되지 않은 모 약물(parent drug)보다 더 효과적일 수 있다(Molineux, Pharmacotherapy 23:3S-8S, 2003).
본 발명의 목적은 인돌로카르바졸 패밀리 약물의 치료적으로 유용한 투여 제형을 개발하기 위해, 일부 중합체, 특히, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 독특한 특성을 이용하는 것이었다. PEG 변형을 통해 중합체에 컨쥬게이션된 인돌로카르바졸 화합물의 개선된 약동학적 및 독물학적 특성을 수득하는 것이 본 발명자들의 목적이었다. 또한, 상기 새로운 컨쥬게이션화(conjugated) 화합물의 활성 및/또는 독성의 변화가 본 발명의 초점이다.
본 발명에 내재된 특정한 과제들 중 하나는 개선된 약동학적 및 독물학적 성능을 가능하게 하여 다양한 투여 경로에서 K-252a 또는 그의 유도체의 최상의 생체이용률(bioavailability)을 달성하는 K-252a의 투여 제형을 개발하기 위해, 일부 중합체, 특히, PEG의 독특한 특성을 이용하는 것이었다. 본 발명의 특정한 양태에서, 과제는 국소 투여의 경우, K-252a 또는 그의 유도체의 감소된 흡수 및 이에 따른 가능한 전신성 독성 및/또는 부작용의 감소 및 제거를 달성하기 위해 중합체의 특성을 이용하는 것이었다.
따라서, 본 발명은 인돌로카르바졸 화합물에 속하는 화합물, 특히, K-252a 또는 그의 유도체의 신규한 중합체 컨쥬게이트, 그들의 제조 및 그들의 용도에 관한 것으로서, 상기 중합체 컨쥬게이트는 컨쥬게이트되지 않은(non-conjugated) 인돌로카르바졸 화합물 또는 K-252a 화합물 또는 그의 유도체 대비, 증가된 수 용해도, 증가된 약물 관리성(pharamaceutical manageability) 및/또는 감소된 독성 및/또는 면역원성을 갖는다.
특히 바람직한 양태에서, 본 발명은 국소 투여 후에, 전신성 흡수가 제한적이어서, 전신성 독성 및/또는 부작용이 감소되거나 또는 심지어 제거되는 것인 K-252a, 또는 그의 유도체의 중합체 컨쥬게이트, 그들의 제조 및 그들의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 제1 양태는 하기 일반식 (I) 및
Figure 112008021259056-pct00002
식 (I)
바람직하게는 하기 일반식 (II)를 가지며
Figure 112008021259056-pct00003
식 (II)
식 중에서, Ra 및 Rb는 독립적으로 수소 또는 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 히드록시, 저급 알콕시. 카르복시 또는 알콕시카르복닐로 구성된 군으로부터 선택된 유기 잔기이거나; 또는
Ra 및 Rb는 함께, 인돌로[2,3,-a]카르바졸 핵 구조에 직접적으로 융합되고, 0, 1 또는 2개의 헤테로 원자, 바람직하게는 질소 원자를 포함하고, 선택적으로 카르보닐 기를 포함하며, 미치환이거나 또는 치환되고, 바람직하게는 카르보닐기 또는 W1 또는 W2로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되고, 고리형 구조의 헤테로원자 성분이 질소인 경우, 상기 질소는 잔기 R3에 의해 치환되는 것인 5-7원 고리형 구조(5-7 member cyclic structure), 바람직하게는 5원 고리형 구조를 형성하며;
Rc 및 Rd는
(a) 독립적으로 수소 또는 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 히드록시, 저급 알콕시. 카르복시 또는 알콕시카르복닐로 구성된 군으로부터 선택된 유기 잔기이거나; 또는
Rc 및 Rd 중 하나는 수소, 치환 또는 미치환 저급 알킬 및 히드록시로부터 선택되고, Rc 및 Rd 중 나머지 하나는 미치환이거나 치환되고, 바람직하게는 중합체 모이어티(polymeric moiety)의 컨쥬게이션을 위해 적합한 하나 이상의 작용기에 의해 치환되고, 보다 바람직하게는 고리의 하나 이상의 위치, 바람직하게는 2개 내지 3개, 및 모든 위치에서 히드록시, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 저급 알콕시, 카르복시, 알콕시카르보닐, 아미노, 저급 알킬아미노, 저급 알킬아미노카르보닐 또는 옥심기에 의해 치환되는 것인 3-7원, 바람직하게는 5원 또는 6원 고리형 모이어티(cyclic moiety), 바람직게는 고리형 탄수화물 모이어티이거나; 또는
(b) Rc 및 Rd는 함께 미치환이거나 치환되고, 바람직하게는 중합체 모이어티의 컨쥬게이션을 위해 적합한 하나 이상의 작용기에 의해 치환되고, 보다 바람직하게는 고리의 하나 이상의 위치, 바람직하게는 2개 내지 3개, 및 모든 위치에서 히드록시, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 저급 알콕시, 카르복시, 알콕시카르보닐, 아미노, 저급 알킬아미노, 저급 알킬아미노카르보닐 및/또는 옥심기에 의해 치환되는 것인 3-7원, 바람직하게는 5원 또는 6원 고리형 모이어티, 바람직하게는 고리형 탄수화물 모이어티를 형성하고,
상기 잔기 R1, R2, R3, W1 및 W2는 하기에 기재되는 바와 같이 정의되는 것인 인돌로카르바졸 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 중합체 컨쥬게이트이다.
화합물 (I) 및 (II)는 중합체 모이어티가 컨쥬게이션되는, 바람직하게는 라디칼 Rc 및/또는 Rd에 위치하는 하나 이상의 작용기를 갖는다. 컨쥬게이트는 하나 또는 여러 개의 중합체 모이어티, 예를 들면, 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 중합체 모이어티를 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 컨쥬게이트 화합물은 하나의 중합체 모이어티를 포함한다.
3-7원 고리형 모이어티, 바람직하게는 고리형 탄수화물 모이어티는 인돌로카르바졸 구조의 하나의 인돌 질소로의 결합 또는 두 개의 인돌 질소로의 결합(attachment)에 의해 인돌로카르바졸 화합물에 결합된다. 따라서, 상기 결합은 하나의 인돌 또는 두 개의 인돌을 포함할 수 있고, 바람직하게는 하나 또는 두 개의 N-글리코시드 결합(N-glycosidic linkage)에 의해 제공된다.
바람직하게는, 상기 3-7원 고리형 모이어티, 바람직하게는 상기 고리형 탄수화물 모이어티는 치환된 푸라노 또는 치환된 피라노기이다. 따라서, 바람직한 중합체 컨쥬게이트 화합물은 시클로푸라노실화 인돌로카르바졸 화합물(cyclofuranosylated indolocarbazole compound), 또는 시클로피라노실화(cyclopyranosylated) 인돌로카르바졸 화합물이다. 본 발명에 따라 중합체 모이어티에 컨쥬게이트된 바람직한 시클로푸라노실화 인돌로카르바졸 화합물은 K-252a, K-252b, ICP-1으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 시클로피라노실화 인돌로카르바졸 화합물은 스타우로스포린, K-252d, TAN-1030a, RK-286c, MLR-52, 레베카마이신(Rebeccamycin), UNC-01, UNC-02 및 RK-1409B로부터 선택된다. .
안정한 컨쥬게이트를 형성하기 위해 하나 이상의 중합체 모이어티가 공유 화학 결합(covalent chemical linkage)에 의해 식 (I) 및/또는 (II)의 화합물에 컨쥬게이트된다. 특히, 상기 중합체 모이어티는 히드록시, 아미노, 카르복시, 알콕시카르보닐 또는 아미노카르보닐로부터 선택된 작용기로의 결합에 의해 일반식 (I) 및/또는 (II)의 화합물에 결합된다. 본 발명의 매우 바람직한 구체예에서, 상기 중합체 모이어티는 잔기 Rc 및 Rd중 하나에서, 바람직하게는 잔기 Rc 및 Rd에 의해 식별되는 고리형 탄수화물 모이어티에서 일반식 (I) 및/또는 (II)의 화합물에 결합된다. 본 발명의 화합물의 중합체 모이어티 및 상기 중합체를 식 (I) 및/또는 (II)의 인돌로카르바졸 화합물에 결합시킬 수 있는 바람직한 화학 결합이 하기에 기재된다.
본 발명의 매우 바람직한 양태는 하기의 식 (III)에 의해 표시되는 중합체 컨쥬게이트이고:
Figure 112008021259056-pct00004
식 (III)
식 중에서, R1 및 R2는 동일하거나 또는 상이한 잔기이고 각각 독립적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
a) 수소, 할로겐, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 히드록시, 저급 알콕시, 카르복시, 저급 알콕시카르보닐, 아실, 니트로, 카르바모일, 저급 알킬아미노카르보닐, R5 및 R6는 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴, 치환 또는 미치환 아랄킬, 치환 또는 미치환 저급 알킬아미노카르보닐, 치환 또는 미치환 저급 아릴아미노카르보닐, 알콕시카르보닐, 카르바모일, 아실로부터 선택되거나 또는 R5 및 R6는 헤테로시클릭기로부터의 질소 원자와 결합되는 것인 -NR5R6,
b) j는 1 내지 6이고, R4는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, -CO(CH2)jR4,
(i) 수소, 할로겐, -N3,
(ii) R5 및 R6는 앞서 정의된 바와 같은 것인 -NR5R6,
(iii) R7은 수소, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴, 치환 또는 미치환 아랄킬, -(CH2)aCO2R10(식 중에서, a는 1 또는 2이고, R10은 수소 및 치환 또는 미치환 저급 알킬로부터 선택됨), 및 -(CH2)aCO2NR5R6(식 중에서, R5 및 R6는 앞서 정의된 바와 같음)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 -SR7,
(iv) R8은 수소, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴로부터 선택되는 것인 -OR8, -OCOR8,
c) j 및 R4는 앞서 정의된 바와 같은 것인, -CH(OH)(CH2)jR4,
d) d는 0 내지 5이고, R11은 수소, -CONR5R6, 또는 -CO2R13(식 중에서, R13은 수소 또는 치환 또는 미치환 저급 알킬임)이고, R12는 수소 또는 치환 또는 미치환 저급 알킬인 것인 -(CH2)dCHR11CO2R12 또는 -(CH2)dCHR11CONR5R6;
e) k는 2 내지 6이고, R14는 할로겐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴, -COOR15, -OR15(식 중에서, R15는 수소, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴 또는 아실임), -SR7(식 중에서, R7은 앞서 정의된 바와 같음), -CONR5R6, -NR5R6 (식 중에서, R5 및 R6는 앞서 정의된 바와 같음) 또는 -N3인 것인 -(CH2)kR14;
f) m은 O 내지 4이고, R16은 수소, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴, -COOR15, -OR15(식 중에서, R15은 앞서 정의된 바와 같음) -CONR5R6 또는 -NR5R6(식 중에서, R5 및 R6는 앞서 정의된 바와 같음)인 것인 -CH=CH(CH2)mR16;
g) R12는 앞서 정의된 바와 같은 것인 -CH=C(CO2R12)2;
h) n은 0 내지 4이고, R16은 앞서 정의된 바와 같은 것인, -C≡C(CH2)nR16;
i) R22는 세 개의 저급 알킬기가 동일하거나 또는 상이한 것인 트리-저급 알킬 실릴이거나 또는 R22는 R8와 동일한 의미를 갖는 것인 -CH2OR22;
j) R23은 저급 알킬, 저급 알케닐 또는 저급 알키닐이고, R7은 정의된 바와 같은 것인 -CH(SR23)2 및 -CH2-SR7.
R3은 수소, 할로겐, 아실, 카르바모일, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐 또는 아미노이고;
X는 -L1-X'을 나타내고 Y는 -L2-Y'을 나타내며, 상기에서 하나 이상의 X' 및 Y'은 L1 및/또는 L2에 의해 식 (III)의 화합물의 테트라히드로푸란 모이어티에 결합된 직선형 또는 분지형 중합체이고; L1 및/또는 L2는 상기 중합체 X' 및/또는 Y'에 상기 테트라히드라푸란을 결합시키는 공유 화학 결합 또는 링커 기이며;
Y'이 중합체이고, X'이 중합체가 아닌 경우, L1은 공유 화학 결합이고, X'은 하기로 구성된 군으로부터 선택되며
(a) 수소, 저급 히드록시알킬, 아실, 카르복시, 저급 알콕시카르보닐,
(b) R17a 및 R17b는 각각 독립적으로
(i) 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐,
(ii) R18은 히드록시인 -CH2R18, 또는
(iii) R19 또는 R20은 각각 독립적으로 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐로부터 선택되거나, 또는 R19 또는 R20은 독립적으로 카르복시기의 히드록시기가 배제된 것인 α-아미노산의 잔기이거나, 또는 R19 또는 R20은 질소 원자와 조합되어 헤테로시클릭 기를 형성하는 것인 -NR19R20;로부터 선택되는 것인 -CONR17aR17b, 및
(c) R21은 히드록시, 저급 알콕시, 아미노, 구아니디노, 또는 이미다졸릴아미노인 것인 -CH=N-R21;
X'이 중합체이고, Y'이 중합체가 아닌 경우, L2는 공유 화학 결합이고, Y'은 히드록시, 저급 알콕시, 아랄킬옥시 또는 아실옥시로부터 선택되며;
W1 및 W2는 독립적으로 수소, 히드록시이거나 또는 W1 및 W2는 함께 산소를 나타내는 것인 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 중합체 컨쥬게이트이다.
단독으로, 또는 다른 작용기와 함께 조합된 용어, "저급 알킬(lower alkyl)"은 1-6개의 탄소 원자, 바람직하게는 1-5개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 1-4개의 탄소 원자 및 특히 바람직하게는 1-3개, 또는 1-2개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄형 또는 분지형 저급 알킬기를 의미한다. 이 작용기는 특히, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 세크-부틸, 터트-부틸, 펜틸, 아밀, 이소아밀, 네오펜틸, 1-에틸프로필, 헥실, 및 그 등가물을 포함한다. "저급 알콕시", "저급 알콕시카르보닐", "저급 알킬아미노카르보닐", "저급 히드록시알킬" 및 "트리-저급 알킬실릴"기의 저급 알킬 모이어티는 앞서 정의된 "저급 알킬"과 동일한 의미를 갖는다.
"저급 알케닐(lower alkenyl)"기는 직쇄형 또는 분지형일 수 있고, Z형 또는 E형일 수 있는 C2-C6 알케닐기로 정의된다. 그와 같은 작용기들은 비닐, 프로페닐, 1-부테닐, 이소부테닐, 2-부테닐, 1-펜테닐, (Z)-2-펜테닐, (E)-2-펜테닐, (Z)-4-메틸-2-펜테닐, (E)-4-메틸-2-펜테닐, 펜타디에닐, 예를 들면, 1,3- 또는 2,4-펜타디에닐, 및 그 등가물을 포함한다. 보다 바람직한 C2-C6 알케닐기는 C2-C5-, C2-C4-알케닐기이고 훨씬 더 바람직하게는 C2-C3-알케닐기이다.
용어 "저급 알키닐(lower alkynyl)"는 직쇄형 또는 분지형일 수 있는 C2-C6-알키닐 기를 의미하고 에티닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-메틸-1-펜티닐, 3-펜티닐, 1-헥시닐, 2-헥시닐, 3-헥시닐 및 그 등가물을 포함한다. 보다 바람직한 C2-C6-알키닐기는 C2-C5-, C2-C4-알키닐기이고, 훨씬 더 바람직하게는 C2-C3-알키닐기이다.
용어 "아릴(aryl)"기는 6개 내지 14개까지의 고리 탄소 원자(ring carbon atom)를 포함하는 C6-C14-아릴기를 의미한다. 이 작용기들은 모노시클릭(monocyclic), 비시클릭(bicyclic) 또는 트리시클릭(tricyclic)일 수 있고, 융합된 고리(fused ring)이다. 바람직한 아릴기는 페닐, 비페닐, 나프틸, 안트라세닐, 페난트레닐 및 그 등가물을 포함한다. "아릴카르보닐" 및 "아릴아미노카르보닐"기의 아릴 모이어티는 앞서 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
용어 "헤테로아릴(heteroaryl)"기는 질소, 황, 또는 산소로부터 독립적으로 선택된 1개 내지 3개의 헤테로원자를 포함할 수 있고 C3-C13-헤테로아릴기를 의미한다. 이 작용기들은 모노시클릭, 비시클릭 또는 트리시클릭일 수 있다. 본 발명의 C3-C13-헤테로아릴기는 헤테로방향족(heteroaromatics) 및 포화 및 부분적으로 포화된 헤테로시클릭 기를 포함한다. 이 헤테로시클릭은 모노시클릭, 비시클릭 또는 트리시클릭일 수 있다. 바람직한 5원 또는 6원 헤테로시클릭기는 티에닐, 푸릴, 피롤릴, 피리딜, 피라닐, 모르폴리닐, 피라지닐, 메틸피롤릴, 및 피리다지닐이다. C3-C13-헤테로아릴기는 비시클릭 헤테로시클릭기일 수 있다. 바람직한 비시클릭 헤테로시클릭기는 벤조푸릴, 벤조티에닐, 인돌릴, 이미다졸릴, 및 피리미디닐이다. 가장 바람직한 C3-C13-헤테로아릴은 푸릴 및 피리딜이다.
용어 "저급 알콕시"는 1개 내지 6개의 탄소 원자, 바람직하게는 1개 내지 5개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 1개 내지 4개의 탄소 원자, 및 특히 바람직하게는 1개 내지 3개, 또는 1개 내지 2개의 탄소 원자를 포함하는 알콕시기를 포함하고 직쇄형 또는 분지형일 수 있다. 이 작용기들은 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 이소프로폭시, 터트-부톡시, 펜톡시, 헥속시 및 그 등가물을 포함한다.
용어 "아실"은 1개 내지 6개의 탄소 원자, 바람직하게는 1개 내지 5개의 탄소 원자, 1개 내지 4개의 탄소 원자, 1개 내지 3개의 탄소 원자, 또는 1개 내지 2개의 탄소 원자를 포함하는 저급 알카노일을 포함하고, 직쇄형 또는 분지형일 수 있다. 이 작용기들은 바람직하게는 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 3차 부티릴(teritiary butyryl), 펜타노일 및 헥사노일이다. "아실옥시"기의 아실 모이어티는 앞서 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
용어 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 및 그 등가물을 포함한다.
용어 "아랄킬(aralkyl)"기는 알킬기가 아릴에 의해 치환된 것인 C7-C15-아랄킬을 의미한다. 상기 알킬기 및 아릴은 C1-C6 알킬기 및 앞서 정의된 바와 같고 탄소 원자의 총 수는 7 내지 15개인 C6-C14-아릴기로부터 선택될 수 있다. 바람직한 C7-C15-아랄킬기는 벤질, 페닐에틸, 페닐프로필, 페닐이소프로필, 페닐부틸, 디페닐메틸, 1,1-디페닐에틸, 1,2-디페닐에틸이다. "아랄킬옥시"기의 아랄킬 모이어티는 앞서 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
치환된 저급 알킬, 알케닐 및 알키닐기는 1개 내지 3개의 독립적으로 선택된 치환기, 예를 들면, 저급 알킬, 히드록시, 저급 알콕시, 카르복실, 저급 알콕시카르보닐, 니트로, 할로겐, 아미노, 모노- 또는 디-저급 알킬아미노, 디옥솔란, 디옥산, 디티올란, 및 디티온을 갖는다. 치환된 저급 알킬, 알케닐 및 알키닐기의 저급 알킬 치환기 모이어티, 및 저급 알콕시, 저급 알콕시카르보닐 및 치환된 저급 알킬, 알케닐 및 알키닐기의 모노- 또는 디-저급 알킬아미노 치환기의 저급 알킬 모이어티는 앞서 정의된 바와 같은 "저급 알킬"과 동일한 의미를 갖는다.
치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴 및 치환된 아랄킬기는 각각 1개 내지 3개의 독립적으로 선택된 치환기, 예를 들면, 저급 알킬, 히드록시, 저급 알콕시, 카르복시, 저급 알콕시카르보닐, 니트로, 아미노, 모노- 또는 디-저급 알킬아미노, 및 할로겐을 갖는다. 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 알콕시카르보닐 및 치환기 중의 모노- 또는 디-저급 알킬아미노기의 저급 알킬 모이어티는 앞서 정의된 저급 알킬과 동일한 의미를 갖는다.
질소 원자와 결합된 R5 및 R6에 의해 형성된 헤테로시클릭기는 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페리디노, 모르폴리닐, 모르폴리노, 티오모르폴리노, N-메틸피페라지닐, 인돌릴, 및 이소인돌릴을 포함한다.
α-아미노산 기는 글리신, 알라닌, 프롤린, 글루탐산 및 라이신을 포함하고, 상기 아미노산은 L-형, D-형, 또는 라세미체(racemate)의 형태일 수 있다.
바람직하게는, R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, 니트로, -CH2OH, -(CH2)kR14, -CH=CH(CH2)mR16, -C≡C(CH2)nR15, R4는 -SR7인 것인 -CO(CH2)jR4 CH2O-(치환 또는 미치환) 저급 알킬(식 중에서, 상기 치환된 저급 알킬은 바람직하게는 메톡시메틸, 메톡시에틸 또는 에톡시메틸임), -NR5R6로 구성된 군으로부터 선택된다.
R1 및 R2의 전술된 바람직한 의미에서, 잔기 R14은 바람직하게는 페닐, 피리딜, 이미다졸릴, 티아졸릴, 테트라졸릴, -COOR15, -OR15(식 중에서, R15는 바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 페닐 또는 아실로부터 선택됨), -SR7(식 중에서, R7은 바람직하게는 치환 또는 미치환 저급 알킬, 2-티아졸린 및 피리딜로부터 선택됨) 및 -NR5R6 (식 중에서, R5 및 R6는바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 페닐, 카르바모일 및 저급 알킬아미노카르보닐로부터 선택됨)로부터 선택된다. 또한, 잔기 R16은 바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 페닐, 이미다졸, 티아졸, 테트라졸, -COOR15, -OR15 및 -NR5R6(식 중에서, 상기 잔기 R15, R5 및 R6는 앞서 정의된 바와 같은 바람직한 의미를 가짐)로부터 선택된다. R1 및 R2의 전술된 바람직한 의미에서, 잔기 R7은 바람직하게는 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 페닐, 피리딜, 피리미딜, 티아졸 및 테트라졸로 구성된 군으로부터 선택된다. 또한, k는 바람직하게는 2, 3, 또는 4이고, j는 바람직하게는 1 또는 2이고, m 및 n은 독립적으로 바람직하게는 0 또는 1이다.
바람직하게는 R3은 수소 또는 아세틸이고, 가장 바람직하게는 수소이다.
바람직하게는, 각 W1 및 W2는 수소이다.
Y'이 중합체이고, X'은 중합체가 아닌 경우, X'은 바람직하게는 카르복시, 히드록시메틸 또는 저급 알콕시카르보닐로부터 선택되고, 메톡시카르복실 및 카르복실이 특히 바람직하다.
X'이 중합체이고, Y'은 중합체가 아닌 경우, Y'은 바람직하게는 히드록시 또는 아세틸옥시로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 히드록시이다.
본 발명의 매우 바람직한 구체예는 X 및/또는 Y 위치에서 중합체에 컨쥬게이트션된 화합물 K252-a를 의미한다. 따라서, 본 발명의 매우 바람직한 구체예에서, 식 (III)의 중합체 컨쥬게이트는 R1, R2, R3, W1, 및 W2는 수소이고, X' 및 Y' 중 하나 이상은 중합체이며, Y'이 중합체이고, X'은 중합체가 아닌 경우, X'은 메톡시카르보닐이고, X'이 중합체이고, Y'은 중합체가 아닌 경우, Y'은 히드록시인 화합물로 표현된다.
본 발명의 매우 바람직한 구체예는 X 및/또는 Y 위치에서 중합체에 컨쥬게이트된 화합물 K252-b를 의미한다. 따라서, 본 발명의 매우 바람직한 구체예에서, 식 (III)의 중합체 컨쥬게이트는 R1, R2, R3, W1, 및 W2는 수소이고, X' 및 Y' 중 하나 이상은 중합체이며, Y'이 중합체이고, X'은 중합체가 아닌 경우, X'은 카르복실이고, X'이 중합체이고, Y'은 중합체가 아닌 경우, Y'은 히드록시인 화합물로 표현된다.
본 발명의 화합물은 염화수소산, 요오드화수소산, 브롬화수소산, 인산, 메타포스포르산, 질산 및 황산과 같은 무기산의 염 및, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 벤조산, 글리콜산, 글루콘산, 숙신산, 아릴술폰산(예를 들면, p-톨루엔 술폰산, 벤젠술폰산), 인산, 말론산 및 그 등가물과 같은 유기산의 염을 포함하는 약학적으로 허용가능한 염으로 제조될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염의 형성을 위해 적합한 산이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려져 있다. 또한, 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용가능한 양이온에 의해 형성될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 양이온(pharmaceutically acceptable cation)은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려져 있으며, 알칼리 양이온(Li+, Na+, K+), 토 알칼리 양이온(earth alkali cation)(Mg2+, Ca2+, Ba2+), 암모늄 및 유기 양이온, 예를 들면, 4차 암모늄 양이온을 포함한다.
일반식 (III)에서 X' 및/또는 Y'에 의해 표시되는 본 발명에 따른 중합체 모이어티는 생체적합해야 하고(biocompatible), 천연 또는 반-합성 또는 합성 기원일 수 있으며 직선형 또는 분지형 구조를 가질 수 있다. 대표적인 중합체는 한정 없이, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥시드, 폴리아크릴산, 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 또는 그의 N-알킬 유도체, 폴리메타크릴산, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸아크릴산, 폴리에틸아크릴레이트, 폴리비닐피롤리딘, 폴리(비닐알코올), 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리(락트-코-글리콜)산(poly(lactic-co-glycolic) acid), 덱스트란, 키토산, 및 폴리아미노산을 포함한다.
본 발명의 매우 바람직한 구체예에서, 중합체는 말단(terminal) OH기가 선택적으로, 예를 들면, C1-C5 알킬 또는 C1-C5 아실기, 바람직하게는 C1-, C2- 또는 C3-알킬기 또는 C1-, C2- 또는 C3-기에 의해 변형될 수 있는 것인 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기이다. 바람직하게는, 변형된 폴리에틸렌 글리콜은 메톡시-폴리에틸렌-글리콜(mPEG)이다.
본 발명에 따라 사용되는 중합체는 100 내지 100,000 Da, 바람직하게는, 200 내지 50,000 Da, 및 보다 바람직하게는 500 내지 10,000 Da 범위의 분자량을 갖는다. 본 발명의 하나의 바람직한 양태에 따르면, 중합체는 바람직하게는 말단 OH 및/또는 메톡시기를 갖고, 200 내지 1500 Da, 바람직하게는 400 내지 1200 Da, 훨씬 더 바람직하게는 550 내지 1100 Da 범위의 분자량을 갖는 단쇄(short-chain) PEG이다. 가장 바람직한 구체예에서, 상기 단쇄 PEG는 550 Da 또는 1100 Da의 평균 분자량을 갖는다. 본 발명의 제2의 바람직한 구체예에 따르면, 중합체는 바람직하게는 말단 OH 및/또는 메톡시기를 갖고, 4,000 내지 6,000 Da, 바람직하게는 4,500 내지 5,500 Da 범위의 분자량을 갖는 장쇄 PEG이다. 본 발명의 이 양태의 가장 바람직한 구체예에서, 평균 분자량 2,000 Da 또는 5,000 Da의 장쇄 PEG 또는 mPEG가 이용된다.
식 (I), (II) 및/또는 (III)의 중합체 컨쥬게이트의 중합체 사슬은 안정한 컨쥬게이트를 제공하기 위해 공유 화학 결합에 의해 활성제에 컨쥬게이트된다. 도 1a 및 도 1b는 예를 들면, 식 (III)의 바람직한 중합체 컨쥬게이트를 보여준다. 중합체는 식 (I) 또는 (II)의 화합물 또는 식 (III)의 K-252a 유도체에 직접 결합될 수 있다. 식 (III)의 경우, L1 및 L2는 공유결합이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 중합체 모이어티는 링커기(linker group)를 이용하여 인돌로카르바졸 유도체에 결합된다. 식 (III)의 화합물의 바람직한 구체예에서, 중합체 모이어티 X' 및/또는 Y'은 링커기에 의해 결합되고, 이에 의해, 본 구체예에서, L1 및 L2는 링커기를 나타낸다. 본 발명의 식 (III)의 바람직한 구체예에서, 용어 링커기 L1 및 L2는 식 (III)의 테트라히드로푸란 모이어티의 C3 위치상에 있는 잔기와 중합체 모이어티상의 반응기 간의 화학 반응에 의해 수득된 작용기를 의미한다. 그러므로, 테트라히드로푸란 고리에 중합체 모이어티 X' 및 Y'을 결합시키는 L1 및 L2는 앞서 정의된 바와 같은 링커기를 나타낸다.
링커기는 중합체 컨쥬게이션의 기술 분야에서 당업자에게 알려진 임의의 잔기일 수 있고, 식 (I) 또는 (II)의 인돌로카르바졸 화합물, 바람직하게는 시클릭 모이어티 Rc 및/또는 Rd, 또는 식 (III)의 테트라히드로푸란 고리 상의 치환기 상의 컨쥬게이션에 적합한 작용기와 중합체 또는 반응성 작용기(reactive group)에 의해 활성화된 중합체의 반응에 의해 수득된다. 대표적인 링커기, 예를 들면, 대표적인 L1 및/또는 L2기는 한정 없이, 에스테르, 에테르, 아세탈, 케탈, 비닐 에테르, 카르바메이트, 우레아, 아민, 아미드, 에나민, 이민, 옥심, 아미딘, 이미노에스테르, 카르보네이트, 오르토에스테르, 포스포네이트, 포스피네이트, 술포네이트, 술피네이트, 술피드, 술페이트, 디술피드, 술핀아미드, 술폰아미드, 티오에스테르, 아릴, 실란, 실록산, 헤테로사이클, 티오카르보네이트, 티오카르바메이트, 및 포스폰아미드 결합을 포함한다. 바람직하게는, 링커기, 또는 특히, L1 및 L2는 카르바메이트, 에테르, 에스테르, 탄소, 아미드 및/또는 아민 결합으로부터 선택된다.
또한, 링커기는 선택적으로 하나 이상의 스페이서기(spacer group)를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 스페이서기는 양 말단에 반응성 작용 말단기(reactive funtional-end group)를 갖는, 이작용성기(bifunctional group)로 정의된다. 하나의 반응성 말단-기에 의해, 스페이서는 중합체 모이어티, 예를 들면, X' 및 Y', 또는 중합체 모이어티 상의 반응성 작용기와 반응한다. 나머지 말단 상의 또 다른 작용기로, 스페이서기는 식 (I) 또는 (II)의 인돌로카르바졸 화합물, 바람직하게는 시클릭 모이어티 Rc 및/또는 Rd상에 있는 컨쥬게이션에 적합한 작용기, 또는 식 (III)의 테트라히드로푸란 고리, 바람직하게는 식 (III)의 테트라히드로푸란 고리의 C3 위치에 있는 잔기에 결합한다. 적합한 스페이서기는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려져 있다. 스페이서기의 예는 헤테로-, 이-작용성 소형 분자 또는 중합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 스페이서기는 이작용성 C6-C12 알킬기 또는 N, S 및 O로부터 선택된 1개 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 헤테로이작용성(heterobifunctional) 알킬기 또는 중간 단쇄 이작용성( intermediary short bifunctional) PEG 사슬로 나타낼 수 있다.
가장 바람직한 구체예에서, 일반식 (III)에서 X' 또는 Y'에 의해 표시되는 중합체는 K-252a 유도체의 테트라히드로푸란 모이어티의 C3 위치상에 있는 히드록시기로부터 유래된 산소 원자에 직접 또는 스페이서기에 의해 공유적으로 결합된다. 이 바람직한 구체예에서, 일반식 (III)에서, Y'은 중합체 모이어티를 나타내고, L2는 바람직하게는 카르바메이트 또는 에테르 결합이다(도 1a). 대안적인 가장 바람직한 구체예에서, 중합체는 K-252a 유도체의 테트라히드로푸란 모이어티의 C3 위치상에 있는 메틸에스테르기로부터 유래된 카르보닐기에 직접 또는 스페이서기에 의해 공유적으로 컨쥬게이트된다. 이 대안적인 구체예에서, 일반식 (III)에서, X'은 중합체 모이어티를 나타내고, L1은 바람직하게는 아미드 또는 아민 결합이다(도 1b).
중합체 모이어티의 식 (I), (II) 또는 (III)의 인돌로카르바졸 화합물로의 공유 결합은 공지된 화학 합성에 의해 수득된다. 특히, 식 (III)의 화합물을 수득하기 위한, 중합체의 K-252a 또는 그의 유도체로의 공유 결합은 공지된 화학 합성 기법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 하나의 대표적인 구체예에서, K-252a 또는 그의 유도체의 중합체 컨쥬게이션은 일반적으로 하기 반응식으로 표현되는 바와 같이 적합한 반응 조건 하에서 이소시아네이트-활성화된 중합체를 K-252a 또는 그의 유도체와 반응시키는 것에 의해 달성될 수 있다:
중합체-NCO + HO-약물 → 중합체-NH-CO-O-약물
이 합성 체계에 따르면, 도 2는 식 (III)의 화합물이 이소시아네이트-활성화된 PEG인 중합체 모이어티 Y'와 K-252a의 테트라히드로푸란 모이어티의 C3 위치에 있는 히드록시기의 반응에 의해 수득된다. 따라서, 중합체와 K-252a 간의 컨쥬게이션은 카르바메이트 링커기인 링커기 L2에 의해 수득된다.
본 발명에서, 놀랍게도, 인돌로카르바졸 화합물, 특히, K-252a 또는 그의 유도체에 비해, 식 (I), (II) 및/또는 (III)의 화합물은 그들의 개선된 생체이용률(bioavailability)을 가져오는, 증가된 용해도 때문에 개선된 약동학 및 독물학적 성능을 보인다는 것이 발견되었다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 식 (I), (II) 및/또는 (III)의 화합물은 국소 적용시, 그들의 증가된 분자 크기 및 친수성 때문에 제한된 전신성 흡수를 보이고, 따라서, 전신 독성 및/또는 부작용을 감소시킨다는 것이 놀랍게도 발견되었다(실시예 2 참조).
또한, 본 발명자들은 놀랍게도 인돌로카르바졸 화합물 자체 및 특히, K-252a 및 그의 유도체의 비-선택적 키나아제 억제 활성에 비해, 식 (I), (II) 및/또는 (III)의 K-252a 중합체 컨쥬게이트는 TrkA 티로신 키나아제에 대한 억제 활성에서 선택성의 유의성 있는 증가를 보인다는 것을 발견했다(실시예 3 참조). 따라서, 본 발명에 따른 인돌로카르바졸 화합물 및 특히, K-252a의 중합체 분자로의 컨쥬게이션은 치료 표적에 대해 선택적이고, 결과적으로 바람직하지 않은 부작용을 감소시키는 활성제의 제공을 가져온다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 약제에서 식 (I), (II) 및/또는 (III)의 화합물의 활성제로서의 용도이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 식 (I), (II) 및/또는 (III)의 화합물은 전신 투여 및 치료를 위한 약제에서 활성제로 이용된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 국소 약제(topical medicament)에서 식 (I), (II) 및/또는 (III)의 화합물의 활성제로의 용도에 관한 것이다.
특히, 본 발명의 컨쥬게이트화(conjugated) 중합체 화합물은 HMGB1-관련 질환의 예방, 경감 및 치료를 위해 유용한 약제에서 활성제로 이용된다.
HMGB1-관련 질환(HMGB1-associated pathology)은 HMGB1 핵 단백질이 실제로 검출가능하지 않은 정상 개체에서의 농도 대비, 아세틸화된 형태 또는 비-아세틸화된 형태(non-acetylated form)의 핵 단백질(nuclear protein) HMGB1 및/또는 HMGB1-상동성 단백질의 증가된 농도가 생물학적 유체(biological fluid) 및 조직에 존재하는 것인 환자의 상태이다. 세포외 HMGB1은 강력한 주화성 염증유발 케모킨(chemotactic pro-inflammatory chemokine)으로 작용한다. 따라서, HMGB1-관련 질환은 강한 염증성 기반을 갖는 질환, TNF-알파, IL-1, IL-6 등과 같은 시토킨의 자극으로부터 유발되는 질환, 또는 중독, 감염, 화상 등과 같은 치명적인 사건들로부터 초래되는 질환이다. 특히, 고농도의 HMGB1 단백질 및 상동성 단백질이 패혈증 환자의 혈장, 류마티스 관절염 환자의 혈장 및 윤활액, 알쯔하이머병 환자의 뇌, 흑색종 환자의 혈장 및 조직, 전신 홍반 루푸스 환자의 혈장, 죽상경화증 환자의 죽상경화판(atherosclerotic plaque) 등에서 발견되고 결정되었다. 생물학적 유체 및 조직에서 HMGB1 단백질 및/또는 상동성 단백질의 결정 및 증거는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 알려진, 예를 들면, ELISA 분석에 의한 검출 등과 같은 통상적인 진단 도구에 의해 검출될 수 있다.
따라서, 다양한 질병이 세포외 HMGB1의 관련된 존재를 특징으로 하며, 이들은 특히, 염증성 질병(inflammatory disease), 협착, 재협착, 죽상경화증, 류마티스 관절염, 자가면역 질환, 종양, 감염성 질환, 패혈증, 급성 염증성 폐 손상, 홍반성 루푸스, 신경퇴행성 질환, 중추신경계 및 말초신경계 질환 및 다발성 경화증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특히 바람직한 구체예에서, 식 (I), (II) 및/또는 (III)의 컨쥬게이트화 중합체 화합물은 심혈관 질환, 특히, 죽상경화증, 및/또는 혈관성형술 동안 또는 그 후에 발생하는 재협착의 예방, 경감 및 치료를 위해 이용된다. 보다 바람직하게는, 상기 약물은 혈관성형술 동안 또는 그 후에 일어나는 재협착에서 결합 조직 재생을 차단, 지연 및/또는 손상시키기 위해 이용된다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 식 (I), (II) 및/또는 (III)의 컨쥬게이트화 중합체 화합물은 신경계 질환, 신경병증 및 중추신경계 및 말초신경계의 신경퇴행성 질환의 예방, 경감 및 치료용 약제의 활성제로의 용도를 위해 효율적이다.
또한, 본 발명자들은 신규한 컨쥬게이트 화합물이 전신 치료에 의해 혈장 시토킨 분비를 경감 및/또는 억제할 수 있다는 것을 입증했다. 따라서, 상기 중합체 컨쥬게이트 화합물은 혈장 시토킨 분비의 증가가 관여되는 질환의 예방, 경감 및/또는 치료를 위해 유용한 전신 투여용 약제에서 활성제로 이용된다. 이 질환들은 바람직하게는 TNF-α, IFN-γ, MCP-1, MIP-1 및/또는 RANTES의 분비가 주로 관여되는 질환이다.
특히, 본 발명에서, 증가된 혈장 시토킨 분비와 관련된 질환은 염증성 질환, 자가면역 질환, 전신성 염증 반응 증후군, 기관 이식 후 재관류 손상, 심혈관 질환(cardiovascular affection), 산부인과 질환(obstetric and gynecologic disease), 감염성 질환, 알레르기 및 아토피성 질환, 고형 종양 및 액체 종양 질환(solid and liquid tumor pathology), 이식 거부 질환, 선천성 질환, 피부 질환, 신경계 질환, 악액질(cachexia), 신장 질환, 의원 중독 상태(iatrogenic intoxication condition), 대사질환 및 특발(idiopathic) 질환, 및 안과 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 화합물은 베체트병(Behcet's disease), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 혈관염, 포도막염, 망막병증의 예방, 경감 및/또는 치료를 위해 유용한 전신 치료용 약제에서 활성제로 이용된다.
본 발명의 또 다른 특정한 양태에서, 본 발명의 컨쥬게이트화 중합체 화합물은 피부 질환의 예방, 경감 및/또는 치료를 위해 유용한 국소 약제(topical medicament)에서 활성제로 이용된다.
본 발명의 맥락에서 바람직한 피부 질환은 각질세포의 과다 증식을 특징으로 하는 질환, 예를 들면, 건선, 아토피성 피부염, 만성 습진, 여드름, 홍색 비강진(pitiriasis rubra pilaris), 켈로이드, 비후성 반흔(hypertrophic scar) 및 각질가시세포종(keratoacanthoma), 편평세포암종, 기저세포암종과 같은 피부암이다. 보다 바람직한 구체예에서, 본 발명의 화합물은 건선의 예방, 경감 및 치료를 위해 유용한 국소 약제에서 활성제로 이용된다.
본 발명의 화합물의 TrkA의 억제에서의 증가된 선택성 때문에, 본 발명의 또 다른 양태는 TrkA가 병태생리적 메카니즘에서 중요한 역할을 수행하여, 질병의 발생을 초래하는 것인 질병의 예방, 경감 및 치료에서 상기 컨쥬게이트화 화합물의 용도이다. 이와 관련하여, 본 발명의 매우 바람직한 구체예에서, 식 (I), (II), 및/또는 (III)의 컨쥬게이트화 K-252a 중합체 화합물은 NGF-관련 통증 및 통각과민의 예방, 경감 및 치료를 위한 약제에서 활성제로 이용된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 앞서 정의된 바와 같은 질병의 예방, 경감 및/또는 치료용 약제의 제조를 위한, 선택적으로 앞서 정의된 바와 같은 식 (I), (II), 및/또는 (III)의 화합물의 용도이다.
식 (I), (II), 및/또는 (III)의 화합물은 단독으로 이용되거나, 또는 하나 또는 수 개의 추가적인 활성제와 조합되어 이용될 수 있다. 특히, 본 발명의 중합체 컨쥬게이트 화합물은 염증성 시토킨 캐스캐이드의 초기 매개체(early mediator)를 억제할 수 있는 하나 이상의 추가적인 작용제, 예를 들면, TNF, IL-1α, IL-1β, IL-Ra, IL-8, MIP-1α, MIF-1β, MIP-2, MIF 및 IL-6으로 구성된 군으로부터 선택된 시토킨의 길항제 또는 억제제와 조합되어 이용될 수 있다.
본 발명의 중합체 화합물과 조합되어 이용될 수 있는 추가적인 작용제는 예를 들면, RAGE의 길항제 및/또는 억제제, HMGB1의 길항제 및/또는 억제제, Toll-유사 수용체(TCR)과 트롬보모듈린의 기능성 N-말단 렉틴-유사 도메인(D1), HMGB1 간의 상호작용의 길항제 및/또는 억제제, 및/또는 국제특허출원 WO 2006/002971에 개시된 바와 같은 만곡 형상 구조(bent shape structure)를 갖는 합성 이중가닥 핵산 또는 핵산 유사체이다.
식 (I), (II), 및/또는 (III)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 그 자체로 또는 약리적 활성 및 투여 목적에 따라 다양한 약학적 조성물의 제형으로 투여될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태는 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 아주반트(adjuvant), 희석제 및/또는 첨가제와 함께 유효량의 하나 이상의 식 (I), (II) 및/또는 (III)의 화합물을 포함하는 약학적 조성물이다. 약학적 담체, 아주반트, 희석제 및/또는 첨가제가 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있으며, 따라서, 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물의 제형으로 적용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자, 예를 들면, 의사에 의해 알려진 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 특히, 본 발명의 약학적 조성물은 주사 또는 주입, 특히, 정맥내, 근육내, 경점막(transmucosal), 피하 또는 복막내 주사 또는 주입 및/또는 경구 투여, 국소 투여, 경피 투여, 비강 투여, 흡입, 에어로졸 및/또는 직장 투여 등에 의해 투여될 수 있다. 투여는 국소성이거나 또는 전신성일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물 및 약학적 조성물의 투여는 비경구 투여에 의해, 특히, 액체 용액 또는 현탁액의 제형으로 이루어지거나 또는 경구 투여, 특히, 정제 또는 캡슐의 제형, 또는 비강내로, 특히, 분말, 점비제(nasal drop), 또는 에어로졸의 제형으로 이루어지거나, 또는 경피로, 예를 들면, 연고, 크림, 오일, 리포좀 또는 경피 패치의 제형으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 약학적 조성물은 전신으로 투여된다. 특히, 중합체 컨쥬게이트 화합물은 주사 또는 주입에 의해, 특히, 정맥내, 근육내, 경점막, 피하, 또는 복막내 주사 또는 주입에 의해 및/또는 경구 투여에 의해 투여될 수 있다.
가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 국소 적용, 특히, 경피 적용에 의해 투여된다. 경피 적용의 경우, 본 발명의 화합물의 투여는 리포좀의 제형으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 가장 바람직한 구체예에서, 약학적 조성물은 의료 장치의 표면에 가역적으로 고정화되어, 특히, 본 발명의 화합물 및 조성물을 스텐트(stent), 카테터(catheter), 외과수술 장비, 삽입관(cannulae), 심장판막, 또는 혈관 삽입물(vascular prostheses)과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 의료 장치에 결합, 코팅, 및/또는 포접(embed)시키는 것에 의해 가역적으로 고정화되어 투여된다. 의료 장치가 체액 또는 신체 조직과 접촉된 후, 가역적으로 고정된 화합물이 방출된다. 결과적으로, 코팅된 의료 장치가 약제를 용출시키는 약물 전달 장치로 작용하고, 그에 의해 약물 전달 동역학이 제어되어, 예를 들면, 즉시 방출, 제어(controlled), 지연(delayed), 또는 연장된(sustained) 약물 전달을 제공할 수 있다. 의료 장치의 코팅 기술은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 진단 또는 치료 용도를 위해 이용될 수 있다. 진단 용도를 위해, 식 (I), (II), 및/또는 (III)의 화합물은 표지된 형태, 예를 들면, 동위원소, 예를 들면, 방사성 동위원소 또는 핵 자기 공명에 의해 검출될 수 있는 동위원소를 포함하는 제형으로 존재할 수 있다. 바람직한 치료적 용도는 국소 적용의 경우, 건선의 예방, 경감 및 치료이고, 전신 적용의 경우, 재협착에서 결합 조직 재생의 예방, 경감 및 치료이다.
본 발명의 화합물은 약학적 조성물에서 유일한 활성제로 이용될 수 있다. 대안적으로, 그들은 다른 활성 성분들, 예를 들면, 전술된 질병의 치료에서 다른 활성 약학적 성분들과 조합되어 이용될 수 있다.
약학적 조성물에서 본 발명의 화합물의 농도는 다양할 수 있다. 농도는 투여될 약물의 총 투여량, 이용되는 화합물의 화학적 특성(예를 들면, 소수성), 투여 경로, 환자의 연령, 체중 및 증상과 같은 인자들에 의존적일 것이다. 본 발명의 화합물은 비경구 투여를 위해 약 0.1 내지 10% w/v의 상기 화합물을 함유한 생리적 완충 수용액(aqueous physiological buffer solution)으로 제공된다. 통상적인 투여량 범위는 약 1 ㎍ 내지 약 1 g/kg 체중/일이고, 바람직한 투여량 범위는 약 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg 체중/일이며, 바람직하게는 약 0.1 내지 20 mg/kg으로 1일 1회 내지 4회 투여이다. 투여되는 약물의 바람직한 투여량은 질병 또는 장애의 유형 및 진행 정도, 특정 환자의 전반적인 건강 상태, 선택된 화합물과 화합물 부형제의 제제의 상대적인 생물학적 효능, 및 그의 투여 경로와 같은 변수에 의존적일 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 베체트병의 예방, 경감 및/또는 치료용 약제의 제조를 위한 비-컨쥬게이트화(non-conjugated) K-252a 화합물 또는 그의 유도체의 용도이다.
바람직한 K-252a 유도체는 합성 및/또는 화학적으로 변형된 화합물, 예를 들면, 고리 시스템 상에 치환기, 예를 들면, C1-C4 알킬기를 갖는 화합물, 메틸 에스테르기가 또 다른 에스테르기, 아미드기, 또는 H 또는 양이온에 의해 치환된 것인 화합물, 및/또는 시클릭 아미드 기에 있는 N-원자가 C1-C4 알킬기에 의해 치환된 것인 화합물을 포함한다.
본 발명은 하기의 도면 및 실시예에 의해 더 예시된다.
도 1a 및 도 1b는 K-252a 및 그의 유도체의 중합체 컨쥬게이트의 구조를 도시한다.
도 2는 PEG가 카르바메이트 결합에 의해 약물에 결합된 것인 K-252a-PEG 컨쥬게이트의 구조를 도시한다.
도 3은 PEG가 카르바메이트 결합에 의해 K-252a에 결합되고 상기 PEG 사슬은 2000 Da의 평균 분자량을 갖는 것인 PEG 컨쥬게이트 정제의 크로마토그램이다. 삽입도에, 주요 피크의 MALDI-TOF 스펙트럼이 도시된다.
도 4a는 K-252a의 국소 투여 후 마우스 혈장 분획에서 검출된 K-252a의 평균 혈장 농도의 결과를 도시한다.
도 4b는 5.07 mg/kg의 K-252a에 해당하는, 약 10 μmol/kg 투여량의 단일 경피 투여 후 평균 혈장 농도 대비 시간의 프로파일을 보여주는 그래프이다.
도 5는 48시간 및 96시간의 접촉 기간 후 MTT-분석법에서 컨쥬게이트 화합물 K252a-PEG(2K)의 각질세포에 대한 증식억제(antiproliferative) 활성을 보여준다.
도 6은 MTT 분석에서 K252a-PEG(2K)의 각질세포에 대한 증식억제 활성을 보여준다. 도 6a는 각각 1시간, 2시간 및 4시간의 접촉 기간 및 세포 계수(cellular counting)는 48시간 후에 수행된 경우이다. 도 6b는 각각 1시간, 2시간 및 4시간의 접촉 기간 및 세포 계수는 96시간 후에 수행된 경우이다.
도 7은 MTT 분석에서 K252a의 각질세포에 대한 증식억제 활성을 보여준다. 도 7a는 각각 1시간, 2시간 및 4시간의 접촉 기간 및 세포 계수는 48시간 후에 수행된 경우이다. 도 7b는 각각 1시간, 2시간 및 4시간의 접촉 기간 및 세포 계수는 96시간 후에 수행된 경우이다.
도 8은 4시간의 접촉 기간 후 및 96시간 후 세포 계수를 수행한 후, K252a 및 K252a-PEG(2K)의 MTT 분석에서 각질세포에 대한 증식억제 활성을 비교하는 그래프이다.
도 9a 내지 도 9c 및 도 9d 내지 9f는 각각 통상적인 티로신 키나아제에 대한 K-252a 및 K-252a-PEG(2K)의 억제 활성을 보여준다.
도 10은 각각 K-252a 및 K-252a-PEG(2K)의 키나아제 억제 프로파일을 보여주고, K-252a-PEG(2K) 대비 K-252a의 키나아제 억제의 선택성의 비교를 보여주는 그래프이다. 도 10에 보고된 데이터는 TrkA 억제 활성에 대해 정규화된 것이다.
도 11은 TrkA에 대한 K-252a 및 K-252a-PEG(2K)의 IC50 및 개별적인 억제 곡선을 보여준다.
도 12는 LPS 처리 전에 비히클 용액만 투여받은 대조구 마우스 대비, LPS-투 여량 주사에 의한 내독소혈증(endotoxemia)의 유도 전에 K-252a-PEG(2K)로 처리된 마우스의 혈장에서 TNF-α 분비 억제를 보여준다. 본 도면에서, 오류 막대(error bar)는 이원 ANOVA(two-way ANOVA) 및 뒤이은 Bonferroni 포스트-검정에 의해 분석된 SEM-Data를 나타낸다.
도 13a) 내지 도 13e)는 LPS 처리 전에 비히클 용액만 투여받은 대조구 마우스 대비, LPS-투여량 주사에 의한 내독소혈증의 유도 전에 비-컨쥬게이트화 K-252a로 처리된 마우스의 혈장에서, 각각 TNF-α, IFN-γ, MCP-1, MIP-1 및 RANTES 분비 억제를 보여준다. 본 도면에서, 기호 "§"는 범위 결과를 벗어난다는 것을 나타낸다.
하기의 실시예에서, 용어 "K-252a-PEG", "K-252a-PEG(2K)" 또는 "CT327"로 식별되는 제품은 K-252a가 카르바메이트 결합에 의해 선형의 2 kDa PEG를 갖는 테트라히드로푸란 모이어티의 -OH기에 컨쥬게이션된 것인 본 발명에 따른 화합물에 해당한다.
실시예 1
K-252a-PEG(2K) 컨쥬게이트(화합물 CT327)의 합성
1.5 mg의 K-252a(3.208 μmol에 해당함)을 가벼운 교반 하에 1.5 ml의 CH2Cl2에 용해시켜 디클로로메탄에 담긴 K-252a의 1 mg/mL 용액을 제조하였다. 상 기 용액을 65.05 mg(32.525 μmol)의 메톡시-PEG-이소시아네이트 2K(2000 Da의 평균 분자량을 갖는 m-PEG-이소시아네이트) 및 염기성 촉매(basic catalyst)로서 CH2Cl2에 담긴 32.684 mg/mL 트리에틸아민 용액 100 ㎕를 포함하는 유리 플라스크에 첨가했다. 상기 중합체 및 촉매는 K-252a 대비 10배의 몰비로 사용하였다. 상기 혼합물을 자력 교반(magnetic stirring)(약 500 rpm의 스핀 속도) 및 가벼운 질소 흐름(gentle nitrogen flux) 하에 실온에서 밤새 유지시켰다(반응 시간 = 16시간 40분). 그 후, 상기 용액을 증발시키고 고형 잔류물을 300 ㎕의 DMSO로 처리하였다. 원하는 생성물을 수득하기 위해 상기 혼합물을 C18 컬럼 상에서 RP-HPLC에 의해 정제하였다(약 59/41 ACN/물 구배에 해당하는 피크). 4회의 후속 정제 공정의 상응하는 분획들을 모으고 ACN 증발에 의해 건조시킨 후, 동결-건조시켰다. MALDI-TOF 분석은 생성물의 K-252a-PEG 컨쥬게이트와의 동일성을 확인했다(2468.81의 최대 m/z 값을 갖는 폴리디스퍼라아제 질량 피크)[도 2 및 도 3].
실시예 2-인 비보 약동학적 연구
실시예 2.1
마우스에서 K-252a 대 K-252a-PEG의 경피 흡수 연구.
본 연구는 컨쥬게이트화되지 않은, 즉, 비-페길화(non-PEGylated) K-252a 분자의 흡수 동력학(absorption kinetics) 대비 마우스에서 K-252a-PEG의 경피 투여 후 흡수 동력학을 측정하고 평가하는 것을 목적으로 수행하였다. 두 제제 모두 3 mg/kg의 활성제의 투여량을 이용하여 실험을 수행하였다. 본 연구의 경우, 매회 Charles River(Calco, Italy)에서 구입한 6마리의 Balb/C 수컷 마우스를 이용하여 인 비보에서 3회의 후속 실험을 수행하였다. 마우스들을 하기의 실험군으로 분배했다(군당 2마리):
- 그룹 1 : 마우스를 경피 투여에 의해 3 mg/kg의 K-252-a로 처리하고, 30분 후 희생시켰다.
- 그룹 2: 마우스를 경피 투여에 의해 3 mg/kg의 K-252-a로 처리하고, 60분 후 희생시켰다.
- 그룹 3: 마우스를 경피 투여에 의해 3 mg/kg의 실시예 1의 K-252-a-PEG(2K)로 처리하고, 60분 후 희생시켰다.
K-252a 및 K-252a-PEG(2K) 제제는 각각 스톡 용액(Calbiochem 배치 번호 B50496로부터의 K252a 스톡 용액, 100㎍/214 ㎕ DMSO; K-252a-PEG(2K) 스톡 용액은 0,226 mg K252a/mL DMSO 용액이었다)을 올리브 오일로 K-252a 0,3 mg/mL 올리브오일/DMSO 6%에 도달할 때까지 희석하여 제조했다. 상기 용액을 각각 하기와 같이 제조하였다: 60 ㎕ K-252a 5 mg/mL DMSO + 940 ㎕ 올리브 오일 및 30 ㎕ K252a-PEG(2K), 5 mg/mL DMSO + 470 ㎕ 올리브 오일. 오일-기반 제제(oil-based preparation)는 반복적인 초음파 처리(sonication)에 의해 균질하게 된 유탁액(emulsion)의 제형이다. 각 동물의 등(실험 72시간 전에 전기 면도기로 면도됨)에 240 ㎕의 K-252a 용액 및 235 ㎕의 K-252a-PEG 용액을 적용하였다(23-24g의 마우스의 평균 체중을 기준으로, 3 mg/kg의 투여량에 해당함). 흡수를 촉진하기 위 해, 적용된 유탁액을 마우스의 등에서 가볍게 마사지하였다. 그 후, 에테르 마취 하에 각각 30분 또는 60분 후에 마우스를 희생시키고 인슐린 주사기로 배 대동맥(ventral aorta)으로부터 혈액을 채취하였다(약 1 mL/동물). 그 후, 상기 혈액을 50 ㎕의 EDTA 5% 수용액을 담은 에펜도르프(Eppendorf)에 넣었다. 상기 혈액 시료를 냉장(4℃) 원심분리기에서 5분간 2000 g에서 원심분리시키고, 고상 추출(SPE)에 의해 정제하고 HPLC 정량 분석을 통해 분석하였다(XTerra C18 컬럼에서의 RT-HPLC, 용리액 물/ACN).
K-252a로 처리된 마우스의 혈장 시료는 상기 두 접촉 기간 모두에 대해 어느 정도의 혈장 농도를 보였다. 그 결과는 도 4에 도시되며, 이에 따르면, 30분 후 희생시킨, 그룹 1의 마우스에서 K-252a의 평균 혈장 농도는 23,33 ng/mL이고, 60분 후에 희생시킨 그룹 2의 마우스에서 K-252a의 평균 혈장 농도는 42,11 ng/ml였다는 것을 알 수 있다. 이는 K-252a의 경피 투여의 경우, 전신성 흡수의 발생을 보여준다. 반면에, 페길화된 컨쥬게이트 K-252a-PEG(2K)의 경피 투여로 처리된 마우스의 혈장 시료는 60분의 접촉 기간 후에도 활성 화합물의 혈장 농도를 전혀 보이지 않았다. 실제로, MALDI-TOF 분석 후에도, 그룹 3의 마우스의 혈장 시료에서 크로마토그래피 피크를 검출하는 것은 불가능했다. 따라서, 경피 투여 후 K-252a-PEG(2K)의 피부를 통한 흡수는 전혀 관찰되지 않았다.
이 데이터는 활성제의 상이한 투여량의 경피 투여에 의한 연구 및 보다 큰 그룹의 테스트 동물에 대한 추가적인 실험에 의해 확인되었다.
실시예 2.2
마우스에서 약동학적(PK) 연구: CT327 대 K-252a의 경피 단일 투여량 및 반복적인 투여
본 실험의 목적은 상기 두 테스트 화합물의 단일 투여 후 마우스에서 K-252a 대비, CT327의 흡수 동력학 및 반복적인 경피 투여 후 상기 두 테스트 화합물의 비교 동력학(comparative kinetics)을 평가하는 것이었다.
- 동물: 마우스 (Balb/c 수컷, 7-9 주령, Charles River Italia, 평균 체중 22.2-22.4g); 5개의 실험군(대조구, K-252a의 단일 투여 및 반복적인 투여, CT327의 단일 투여 및 반복적인 투여), 4 마리/그룹, 무작위 그룹핑.
- 재료: K-252a(Cephalon lot n°04274F1a), CT327(Alchemy lot n° ALC577.02), 디메틸 술폭시드(DMSO) Hybri-max® (Sigma lot n°114K2370), 백색 바셀린 F.U.(AFOM Medical lot n° A908006570), 트윈 20(Sigma lot n° O92K0055), H2O MiIIiQ, 마우스 혈장(스트레인 CD1,OF1 lot n° 50-18/12/05, Charles River Laboratories Italia SpA, Calco), 아세토니트릴(Merck lot n° I260430545), 메탄올(VWR BDH lot n° 05Z4034), EDTA(Fluka lot n° 393230/1).
- 투여량: 단일 경피 투여의 경우, K-252a 5.075 mg/kg 및 CT327 25.27 mg/kg(78.5% 순도 기준, 즉, 32.19 mg/kg, K-252a와 동일 몰 투여량); 반복적인 경피 투여(5일간 1일 1회 투여)의 경우, K-252a 1.03 mg/kg 및 CT327 5.06 mg/kg(78.5% 순도 기준, 즉, 6.45 mg/kg, K-252a와 동일 몰 투여량).
- 테스트 물질의 투여: 경피 투여의 경우, 약 0.25 g의 바셀린 크림을 각 마우스의 목(피부 찰과상을 피하기 위해, 실험 전날 면도함)에 도포했다. 대조구 동물은 동일한 투여량 용량으로 비히클만을 투여받았다.
- 테스트 물질 제형(Test article formulation): 단일 경피 투여를 위한 DMSO 1.1%/백색 바셀린 크림 및 반복적인 경피 투여를 위한 DMSO 0.23%/백색 바셀린 크림.
- 동물 희생 및 혈액 채취: 치료 후 하기의 시점에 혈액 시료를 채취하였다:
- 단일 경피 투여: K-252a 또는 CT327 투여 후, 1, 3, 6, 9, 18, 24, 36, 48 및 72 시간
- 반복적인 경피 투여: K-252a 및 CT327의 마지막 투여 후, 각각 3시간 및 24시간 후.
각 시료채취 시점에, 깊은 에테르 마취 하에 인슐린 주사기를 이용하여 각 동물의 배 대정맥(ventral aorta)으로부터 약 0.4 mL 혈액 시료를 채취하고, 혈액 응고를 방지하기 위해 5% EDTA 수용액 50 ㎕를 포함하는 폴리에틸렌 에펜도르프 튜브에 넣었다. 냉장 원심분리기(2-4℃)에서, 1400g로 5분간 원심분리를 수행 전까지 혈액 시료를 얼음에 보관하였다. 각 튜브로부터, 혈장 시료를 회수하고 새로운 에펜도르프 튜브에 넣고 HPLC 분석 때까지 -20℃에서 동결시켰다.
도 4b는 단일 투여량 투여 연구의 결과를 보여준다. K-252a의 단일 경피 투여 후 K-252a 혈장 농도 곡선이 도시되고, 평균값 ± 오차가 보고된다(95% CI, 신뢰구간)(각 시점당 4 마리의 마우스, 이배수로(in duplicate) 분석함). 대신에, CT237 단일 경피 투여에 대한 혈장 농도 프로파일은 검출되지 않았다. 실제로, K-252로 처리된 마우스 대비 동일 몰량의 투여량의 CT327의 단일 경치 투여를 받은 마우스의 혈장 시료 분석은 어느 시점에도 검출한계(70.6 nM)를 초과하는 테스트 화합물의 수준을 보이지 않았다.
각 실험군의 데이터의 컴퓨터 조정(fitting)을 NCOMP 버전 3.1 프로그램에 의해 수행하였다(P. B. Laub et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 1996, 85(4):393-395). 혈장 농도-시간 프로파일 하 면적 값(values for area under the plasma concentration-time profile), T1 /2, Tmax, Cmax, 등을 이전에 개시된 통상적인 식에 의해 계산하였다(Gibaldi et al., Pharmacokinetics, 1982, Marcel Dekker, Inc., New York). K-252a 및 CT327 혈장 농도 데이터를 조정하는 것에 의해 추정된 PK 파라미터가 하기의 표 1에 기재된다.
표 1: 마우스에서 단일 경피 투여(10 μmol/kg) 후 K-252a 및 CT327의 혈장에서 추정된 약동학적 파라미터
PK 파라미터 K-252a, 경피투여(derm) CT327, 경피 투여
AUC0 -∞(nM·분) 2.85·105 ND
최종(terminal) T1 /2(분) 63.13 ND
Tmax(분) 180.00 ND
Cmax(nM) 907.98 ND
약어: AUC0 -∞ = 0시간차부터 무한대까지의 곡선하 면적(area under the curve from time zero to infinity), T1 /2 =반감기(half-life), Cmax = 최대 혈장 수준(maximal plasma level), Tmax = 최대 혈장 수준에 도달하는 시간(time to maximal plasma level), ND = 미검출(not detected)
본 연구의 결과는 단일 경피 투여 후, K-252a는 투여 후 9시간 이상 혈장에서 검출가능했으나(63분의 반감기), CT327은 K-252a의 투여량과 동일한 투여량에서 72시간의 접촉 기간 후에도 검출되지 않았다는 것을 확인했다.
표 2는 반복적인 경피 투여 연구의 결과를 보여준다. 특히, 표 2는 K-252a 및 CT327의 반복적인 투여에 대한 표준 혈장 수준의 HPLC 분석 결과를 보여준다. 표시된 바와 같이, K-252a는 검출가능하고 정량가능한 혈장 농도를 보이나, CT327의 경우, 반복적인 투여 후 채취된 혈액에서 테스트 화합물의 검출가능한 수준이 관찰되지 않았다.
표 2: 각각 1.03 mg/kg 및 5.06 mg/kg(약 2 μmol/kg)의 투여량으로 반복적인 경피 투여(5일간 QD) 후, K-252a 및 CT327의 평균 혈장 농도.
테스트 물질 및 시점 평균 혈장 농도(nM) 95% CI
K-252a, t=3h 110.19 29.15
CT327, t=24h 미검출 -
따라서, 이 둘째 연구에서, 보다 낮은 투여량(2 μmol/kg)에 의한 반복적인 경피 투여(5일 연속, 1일 1회) 후 흡수를 평가하였다. 이 경우에도, 마우스 혈장 시료에서 페길화된 분자 CT327에 해당하는 크로마토그래피 피크는 검출되지 않았다. 궁극적인 매우 느린 흡수의 증거를 얻고자 혈액 채취를 위한 충분히 긴 시점(24 시간)을 선택했다. 그럼에도 불구하고, 본 연구의 데이터는 K-252a-PEG(2K)의 경피 투여 후 피부를 통한 흡수가 일어나지 않았다는 결론을 내릴 수 있게 한다. 대신에, K-252a 화합물의 경우, 마지막 경피 투여 후 3시간 경과시 결과적으 로 관찰된 K-252a 혈장 수준은 110.2 nM이었고, 이는 단일 경피 투여에 대해 동일한 투여량 및 시점에서 관찰된 농도보다 약간 더 높다(값 ± 95% CI으로 표시하면, 72.9 nM ± 32.5).
결론적으로, 본 연구의 결과는 보다 높은 투여량에 의한 단일 경피 투여 또는 보다 낮은 투여량에 의한 5-일 국소 치료 후에 K-252a의 전신 흡수를 피하는데 있어서 K-252a의 중합체 컨쥬게이션의 효능을 확인한다.
실시예 3. 인 비트로 약리학(In vitro pharmacology)
실시예 3.1
인간 각질세포에 대한 Trka 억제제인 K252a-PEG(2K)의 증식억제 활성을 규명하기 위한 인 비트로 연구.
세포 생명력(cellular vitality)의 테스트로서, 대사(metabolic) MTT-분석을 수행하였다. MTT-분석은 잘 알려지고 검증된 프로토콜을 이용하여 수행하였고, 그에 따르면, 결과는 분광광도 분석(spectrophotometric lecture)을 통해 정량화되고, 살아있는 세포의 수는 MTT([3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움브로미드])의 환원 생성물로 형성된 포르마잔의 양에 직접 비례한다(Mosmann T., Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 1983, Dec. 16, 65(1-2):55-63). 본 연구에서, MTT-분석은 세포 배양용 96-웰 플레이트에 접종된 각질세포의 합류상태 미만의 배양물(subconfluent culture)을 대상으로 수행하였 다(8000개의 세포/웰). 세포를 분석해야 하는 물질에 노출시킨 후, 상기 세포들을 무혈청 각질세포 배양 배지(KGM Clonetics Corp. San Diego, CA, USA)에서 MTT (0,05 %)와 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 디터전트(detergent)로 용해시킨 후, 염료인 포르마잔의 형성을 멀티-웰 플레이트용 분광분석계를 이용하여 540 nm에서 검출하였다. 결과는 광학 밀도 단위(OD)로 표시된다.
컨쥬게이션 생성물 K-252a-PEG(2K)의 증식억제 활성을 웰에 담긴 분리된 각질세포와 테스트될 화합물의 용액과의 48시간 및 96시간의 접촉 시간 각각 및 5, 10, 50 및 100 nM의 K-252a-PEG(2K) 농도에 대해 MTT 분석으로 테스트하였다. 모든 실험은 3회 이상 수행하였다. MTT 분석법의 결과의 통계적 분석은 ANOVA 모델을 이용하였다(오차 막대(error bar)는 95% 신뢰 구간을 나타냄, p= 0,05). 도 5는 K-252a-PEG(2K)에 의한 MTT 분석의 결과를 보여준다. K-252a-PEG는 10 nM 이상의 농도에 대해 48 시간의 접촉 기간 후 각질세포에 대해 억제 작용을 보이고, 반면에, 96시간의 접촉 기간 후에는 억제 효과가 모든 농도에서 확인된다는 것이 명확하게 입증된다.
이 결과들은 K-252a와 중합체 PEG의 컨쥬게이션은 활성 분자 K-252a의 증식억제 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다(도 5). 실제로, 48시간 및 96시간의 접촉 기간 후에, 각질세포의 증식에 대한 억제 작용이 확인되었다.
따라서, (실시예 2에서 확인된 바와 같이) 국소 투여 후 PEG-컨쥬게이션화 K252a의 전신 흡수의 부재 또는 지연 및 각질세포의 증식에 대한 지연된 억제 활성이 컨쥬게이션, 즉, 페길화에 의한, 컨쥬게이션화 K-252a-PEG(2K)의 각질세포로의 지연된 진입의 결과일 수 있다는 것을 입증하기 위해 추가적인 MTT 분석을 수행하였다.
따라서, 각질세포의 증식억제 활성을 테스트하기 위해, K-252a 및 K-252a-PEG(2K)를 테스트 대상 화합물로 이용하여, 웰에 담긴 각질세포와 활성 화합물 간의 접촉 시간은 감소시킨 조건으로 전술된 바와 같이, 추가적인 인 비트로 MTT 분석을 수행하였다. K252a 및 K-252a-PEG(2K)의 농도는 각각 25, 50 및 100 nM이었다. 각 농도별 접촉 시간은 각각 1시간, 2시간 및 4시간이었다. 세포 계수는 48시간 및 96시간 후에 수행하였다.
K-252a-PEG(2K)에 의한 MTT 분석의 결과가 도 6에 도시된다. 48시간 후 및 96시간 후 모두에서, 컨쥬게이트화 화합물 K-252a-PEG(2K)의 각질세포 증식에 대한 효과는 대조구 시료로 수득된 효과와 통계적으로 상이하지 않은 것으로 보인다(도 6a 및 도 6b) .
컨쥬게이션되지 않는 K-252a로 동일한 MTT 분석을 수행하였고, 그 결과는 도 7a(48시간 후 세포 계수) 및 도 7b(96시간 후 세포 계수)에 도시된다. 이 결과들은 임의의 접촉 시간에 대해, 200 nM 이상의 농도에서 및 48시간 후 세포 계수에서 K-252a의 통계적으로 유의성 있는 증식 억제 작용을 보여준다. 96시간 후 세포 계수를 수행하는 경우, 모든 테스트된 농도 및 모든 접촉 시간에서 증식억제 활성이 관찰된다.
도 8은 4시간의 접촉 시간 및 96 시간 후에 수행된 세포 계수에 의한 전술된 바와 같은 MTT 분석에서 각각 10OnM K-252a 및 K-252a-PEG(2K)의 억제 활성의 데이 터 비교를 보여준다.
이 결과들은 컨쥬게이션되지 않은 K-252a 화합물에 비해, 4시간의 접촉 시간은 K-252a-PEG(2K)가 100 nM 이하의 농도에서(세포 계수가 96시간 후에 이루어지는 경우에도) 증식억제 작용을 발휘하기에 충분하지 않다는 것을 보여준다. 컨쥬게이션되지 않은, 즉, 페길화되지 않은 K-252a에 비해, 보다 낮은 농도의 K-252a-PEG(2K)의 경우, 각질세포의 증식억제 활성에 대해 원하는 억제 효과를 수득하기 위해 보다 긴 접촉 시간이 요구된다. K-252a-PEG(2K)의 경우, 따라서, 세포로 진입하는 능력의 명확한 지연 및 이에 따른 세포막 통과의 지연이 확인되었고, 이는 K-252a 분자의 페길화로부터 초래된 것이다.
이는 또한 K-252a 화합물 및 그의 유도체가 K-252a 화합물 및 그의 유도체의 세포내 축적 및 뒤이은 세포 배지의 제거 후까지의 활성 물질의 느린 방출 후 그들의 활성을 이용한다는 가설을 확인하는 것으로 보인다.
실시예 3.2
K-252a 및 CT327의 키나아제 억제 프로파일의 인 비트로 평가
문헌에서 K-252a는 여러 키나아제의 강력한 억제제로 잘 알려져 있다. 본 연구에서, 선별된 통상적인 티로신 키나아제 및 세린/쓰레오닌 키나아제에 대한 K-252a의 억제 활성을 평가하였다. CT327의 억제 활성을 평가하기 위해 유사한 실험을 수행하였다.
K-252a(Acros lot A020265401)를 DMSO에 용해시켜 1mM 스톡 용액을 제조하고 이를 DMSO로 희석시켜 20μM 용액을 수득하고, 그 후, 0.8μM의 농도를 달성하기 위해 분석 완충액(assay buffer)으로 더 희석시켰다. K-252a는 200 nM의 농도에서 테스트하였다. CT327 및 기준 화합물의 제조는 유사한 절차에 따라 수행하였다. 본 발명의 기준 화합물로서, 스타우로스포린(staurosporine), 5-요오도투베리시딘(5-iodotubericidin), NK 억제제 II 및 SB202190와 같은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진(표 3에 표시된 바와 같은) 단백질 키나아제 억제제를 이용하였다.
표 3: 기준 화합물(Reference compound)
기준 화합물 농도(nM) 키나아제
스타우로스포린 0.3-10000 티로신 키나아제,
기타 세린/쓰레오닌 키나아제
5-요오도투베리시딘 10000 ERK1, ERK2
JNK 억제제 II 300 JNK1, JNK2
SB202190 300 p38α, p38β
개별적인 키나아제에 대한 표준 분석법을 이용하여 K-252a 및 C327에 대한 키나아제 억제 연구를 수행하였다.
K-252a에 대한 티로신 키나아제 억제 및 세린/쓰레오닌 키나아제 억제의 결과가 각각 도 9a 내지 9c에 보고된 표 a 및 표 b에 표시된다. 테스트된 티로신 키나아제 및 세린/쓰레오닌 키나아제에 대한 CT327의 억제 활성이 각각 도 9d 내지 9f에 보고된 표 a 및 표 b에 표시된다. 반응 대조구(ATP 포함)의 판독값(readout value)을 0% 억제로 설정하고, 백그라운드(ATP 불포함)의 판독값을 100% 억제로 설정하였다.
K-252a는 200 nM의 농도에서, 테스트된 키나아제(TNK1, JAK2, JAK3, TYK2, FLT3, PDGFRα, PDGFRβ, RET, TrkA, TrkB, TrkC, CHK1, CHK2, JNK1, JNK2, AurA 및 MAP2K3)중 16개에 대해 90% 이상의 매우 강한 억제 활성을 보였고, 테스트된 키나아제 중 다른 7개(MER, JAK1, MET, KIT, BLK, FGR 및 CaMK2a)에 대해 80% 내지 90%의 강한 억제를 보였다.
반면에, CT327은 K-252a(200 nM) 대비 동등한 농도에서, 테스트된 티로신 키나아제 중 TrkA에 대해서만 강한 억제 활성(> 50%)을 보였다. CT327는 JAK2, JAK3 및 FLT3에 대해 낮은 활성(20% 내지 30%)을 보였고, TNK1, EphB4, PDGFRβ, BLK, LCK, TrkB 및 TrkC에 대해 매우 낮은 활성(10% 내지 20%)을 보였다. 대다수의 테스트된 티로신 키나아제에 대해서는 억제가 전혀 관찰되지 않았다.
세린/쓰레오닌 키나아제 내에서, CT327은 MAP2K3에 대해서만 강한 억제 활성(> 40%)을 보이고, JNK3(녹색으로 강조됨)에 대해서는 매우 낮은 억제 활성(14%)을 보이며, 테스트된 나머지 다른 세린/쓰레오닌 키나아제에 대해서는 전혀 억제 활성을 보이지 않았다.
도 10은 K-252a 대비 CT327의 선택성의 비교를 보여준다. 그 결과는 명확하게 K-252a 대비 CT327의 키나아제 억제의 선택성의 현저한 개선을 보여준다. 특히, 그 결과는 티로신 키나아제 그룹 중 TrkA 및 세린/쓰레오닌 키나아제 그룹 중 MAP2K3에 대해 CT327의 키나아제 활성의 증가된 선택성을 보여준다.
이 데이터는 CT327의 억제 선택성은 특히, 주요 표적인 TrkA 및 MAP2K3에 대한 것이며, 그 결과, 다른 키나아제에 대한 억제 활성으로부터 초래되는 결과인 원치않는 생물학적 효과의 잠재적 감소를 시사한다. 따라서, 다른 키나아제가 덜 억 제될수록, 분자의 독성이 더 약할 것이다.
요약하면, 실시예 2 및 3에 개시된 연구의 결과들은 식 (I)의 K-252a의 중합체 컨쥬게이트, 및 특히 K-252a-PEG(2K)가 온전한 생물학적 활성 및 동시에 감소된 부작용의 위험 때문에, 약제에서의 활성제에 대한 유망한 후보가 되게 한다.
실시예 3.3
K-252a 및 CT327의 TRKA에 대한 IC50의 인 비트로 평가
본 연구의 목적은 TrkA 키나아제에 대한 CT327 및 K-252a의 IC50값을 측정하는 것이었다. 테스트 화합물 용액을 100 배 더 낮은 농도로 만들기 위해 DMSO로 희석하고 다시 분석 완충액(15 mM Tris-HCI, pH 7.5, 0.01% Tween-20, 2 mM DTT)으로 25배 더 희석시켜 최종 테스트 용액을 수득하였다. CT327 및 K-252a를 하기의 농도에서 테스트하였다: 1000 nM, 300 nM, 100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 0.3 nM, 0.1 nM, 0.03 nM. 기준 화합물(스타우로스포린)의 준비는 테스트 화합물의 준비와 유사한 방법으로 수행하였다. 스타우로스포린은 하기의 농도에서 테스트하였다: 100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 0.3 nM, 0.1 nM, 0.03 nM, 0.01 nM and 0.003 nM. 분석 절차는 하기와 같았다.
Figure 112008021259056-pct00005
반응 대조구(ATP 포함)의 판독값을 0% 억제로 설정하고, 백그라운드(ATP 불포함)의 판독값은 100% 억제로 설정하고, 각 테스트 용액의 퍼센트 억제를 계산하였다. IC50 값은 4개의 파라미터 로지스틱 곡선(four parameter logistic curve)에 조정하는 것에 의해 농도 대 % 억제 곡선으로부터 계산하였다.
TrkA에 대한 K-252a 및 CT327의 IC50 값은 각각 0.50 nM 및 186 nM이었다. TrkA에 대한 기준 화합물(스타우로스포린)의 상응하는 IC50 값은 0.12 nM이었다. 이 결과가 도 11에 요약된다.
실시예 4
K-252a 대비 CT327의 마우스에서 급성 단일 투여량 독성 연구.
본 연구의 목적은 복막내 경로 및 경구 투여에 의해 마우스에서 단일 투여량으로 투여된 CT327의 독성을 그의 전구체인 K-252a에 대비해 평가하기 위해 비-임상적 독성 연구를 수행하는 것이었다. 총 70마리의 마우스(Balb/c, 수컷 35 마리 및 암컷 35 마리)를 하기의 투여량 수준의 테스트 물질을 투여받도록 14개의 서브그룹(7개의 그룹은 5마리의 수컷 마우스로 구성되고 7개의 그룹은 5마리의 암컷 마우스로 구성됨)으로 나누었다:
- K-252a: 30, 45, 60, 75, 및 90 mg/Kg
- CT327: 316.68 및 475.02 mg/Kg(각각 K-252a 60 및 90 mg에 해당함).
임상적 징후 및 행동 변화를 포함한 관찰을 투여 후 최초 6시간 동안 30분 간격으로 및 그 후 7일간 1일 2회씩 수행하였다.
K-252a로 처리된 수컷 그룹들 중에서, 최저 투여량(30 mg/Kg)을 투여받은 군들만이 생존하고, 다른 나머지 그룹들은 투여 후 최초 22시간 내에 사망한 것으로 발견되었다. 결과적인 LD50은 37.74 mg/kg였다.
또한, 동일한 투여량을 투여받은 수컷의 경우와 같이, K-252a 최저 투여량을 투여받은 암컷 마우스들은 생존했고 매우 약한/약한 진정을 보였으며, 이는 8-10시간 이내에 사라졌다. 45 mg/kg을 투여받은 5마리 중 한 마리의 암컷과 60 mg/kg을 투여받은 5마리 중 한 마리 만이 생존했다. 보다 높은 투여량의 K-252a는 모든 암컷 마우스에 치사적이었다. 따라서, 수컷 및 암컷 모두에 대한 LD50은 39.02 mg/kg 이었다.
각각 K-252a의 60 및 90 mg/kg에 해당하는, CT327의 투여량, 316.68 및 475.02 mg/kg은 테스트된 어느 그룹에서도 투여 직후 수시간 내 또는 7일의 관찰 기간 동안 독성의 행동적 및/또는 임상적 징후를 유도하지 않았다.
경구 투여 후에도 유사한 결과를 수득하였다. 특히, K-252a의 LD50은 78 mg/kg으로 확인되었으며, 반면에, CT327의 최대 투여량 790 mg/kg에서도 사망은 관찰되지 않았다.
실시예 5
LPS-유도 내독소혈증 후 상이한 시점에 마우스의 혈장에서 24개의 시토킨을 정량적으로 결정하고 수득되는 프로파일을 CT-327로 전처리된(pre-treated) 내독소혈증 마우스에서 수득되는 프로파일과 비교할 목적으로 연구를 수행하였다.
본 연구의 프로토콜:
동물을 두 개의 실험군(55 마리의 마우스/그룹)으로 나누고 하기의 일정에 따라 처리하였다:
대조군(n=55) 실험군(n=55)
시간: -15분 비히클 CT-327(105.56 mg/kg; i.p.)
시간:0 LPS(4 mg/kg; i.p.) LPS(4 mg/kg; i.p.)
내독소혈증 유도: 0 시간차에 양 그룹은 복막내로(i.p.) 4 mg/kg에 해당하는 LPS의 투여량을 투여받았다.
CT327 처리: "처리된(treated)" 실험군은 105.56 mg/kg에 해당하는 CT327의 단일 투여량을 복막내로 투여받았다. 이 투여량을 LPS 내독소혈증 유도(0 시간) 15분 전에 투여했다. 동시에, "대조(control)"군은 동량의 비히클 용액을 투여받았다.
각 실험군을 서브그룹당 5마리의 마우스를 갖도록 11개의 서브그룹으로 나누었다. 각 서브그룹을 상이한 시점에 희생시키고 혈액 시료를 채취하였다.
혈액시료 채취 시점은 하기와 같았다:
- 시간: 0시간 차 (기초); LPS 처리 전
- 시간: + 30 분; LPS 처리 후
- 시간: + 1 시간; LPS 처리 후
- 시간: + 2 시간; LPS 처리 후
- 시간: + 3 시간; LPS 처리 후
- 시간: + 6 시간; LPS 처리 후
- 시간: + 12 시간; LPS 처리 후
- 시간: + 18 시간; LPS 처리 후
- 시간: + 24 시간; LPS 처리 후
- 시간: + 48 시간; LPS 처리 후
- 시간: + 72 시간; LPS 처리 후
혈액 시료를 소디움 시트레이트 튜브(100 ㎕ 소디움 시트레이트 0.1 M/900 ㎕ 혈액)에 채취하고 4℃에서 1000 g로 10분간 원심분리시켰다. 혈장 시료를 회수하고 50 ㎕/시료를 다중 시토킨 프로파일링(multiple cytokine profiling)을 위한 테스트 전까지 -80℃에서 동결시켰다. 시료를 Silengo 교수가 이끄는 토리노 대학교 유전학, 생물학 및 생화학과(Dept. of Genetics, Biology and Biochemistry, Torino University)에서 23-플렉스(plex) 패널을 이용하여 Bio-Plex System (Bio-Rad)을 통해 이배수로 분석하였다. 하기와 같은 시토킨의 혈장 수준을 결정하였다: IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-17, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, KC, MIP-1-α, RANTES, TNF-α, IL-9, IL-13, 에오탁신(eotaxin), MCP-1, MIP-1-α.
가장 중요한 결과가 도 12 및 13에 표시된다. 특히, 도 12는 본 발명에 따른 CT327 화합물로 전-처리된 마우스의 혈장 수준에서 TNF-α 분비의 유의성 있는 감소를 보여준다.
도 13a 내지 도 13e는 대신에 K-252로 수행된 병렬 실험(parallel experiment)의 결과를 보여준다. TNF-α 뿐 아니라 IFN-γ, MCP-1 , MlP-α 및 RANTES의 유의성 있는 감소.
실시예 6
K-252a-PEG(1100)(화합물 CT336)의 합성
1)m- PEG 1100 -O- CH 2 - COOEt 합성
불활성 대기 하에서 적합한 반응 플라스크에 t-BuOK(11.2 g, 100.0 mmol)를 실온에서 교반 하에 무수 THF(70.0 ml)에 첨가하였다.
용해가 완료되었을 때, MeO-PEG1100-OH(22.0 g, 20.0 mmol)를 첨가하고 그 후, 30분 이내에 BrCH2CO2Et(16.7 g, 100.0 mmol)를 점적하고 상기 반응 플라스크를 수조(water bath)로 냉각시켰다.
2시간 후에, 40℃, 진공 하에 용매를 제거하였다.
수득된 잔류물(약 65 g)을 H2O(100 ml)에 용해시키고 상기 용액을 CH2Cl2로 신속하게 추출했다(3 x 100 ml). 유기층을 무수화시키고(Na2SO4) 40℃, 진공 하에 용매를 제거하였다.
2)m- PEG 1100 -O- CH 2 - COOH 합성
전술된 바와 같이 수득된, 정제되지 않은 조 m-PEG-O-CH2-COOEt(약 20 g)를 NaOH 수용액(1N, 200 mL)에 용해시키고 교반 하에 60℃에서 3시간 동안 가열하였다.
그 후, 상기 반응 혼합물을 HCl 수용액(1N, 약 165 mL)을 이용하여 pH3까지 산성화시키고 CH2Cl2로 분배시켰다(partition)(5 x 100 ml). 수집된 유기 추출물을 무수화시키고(Na2SO4) 40℃, 진공 하에 용매를 제거하였다.
결과물인 점성 오일(약 18 g)을 차가운 무수 Et2O(75 mL)에 점적하고, 백색 침전물을 여과시켜 회수하며, 잔류 용매를 실온에서 진공 하에 증발시켰다(15 g).
3)m- PEG 1100 -O- CH 2 - NCO 합성
적합한 반응 플라스크에서, m-PEG1100-O-CH2-COOH(10.0 g, 9.1 mmol)를 교반 하에 톨루엔(8OmL)에 용해시켰다. 그 후, 상기 혼합물을 공비 증류(azeotropic distillation)에 의해 건조시키기 위해 약 15 mL의 용매를 증류시켰다.
잔류물을 실온까지 냉각시키고 무수 Et3N(1.1 g, 10.9 mmol) 및 디스페닐 포스포릴 아지드[(C6H5O)2P(O)N3](2.7 g, 10.0 mmol)를 연이어 첨가했다.
실온에서 30분 후에, 상기 혼합물을 2시간 동안 환류시키기 위해 가열하고, 그 후, 60℃, 진공 하에서 용매를 증발시켰다.
결과물인 점성 오일(약 9 g)을 차가운 무수 Et2O(200 mL)에 점적하고, 백색 침전물을 여과시켜 회수하며, 잔류 용매를 실온에서 진공 하에 증발시켰다(6.0 g).
4)K-252a- PEG 1100 컨쥬게이트의 합성
1.5 mg의 K-252a(3.2 μmol에 해당함)를 가벼운 교반 하에 1.5 ml의 CH2Cl2에 용해시켜 DCM에 담긴 K-252a의 1 mg/mL 용액을 제조하였다. 상기 용액을 38.06 mg(32.5 μmol)의 m-PEG1100-O-CH2-NCO 및 염기성 촉매로서 CH2Cl2에 담긴 32.8 mg/mL 트리에틸아민 용액 100 ㎕를 포함하는 유리 플라스크에 첨가했다. 상기 중합체 및 촉매는 K-252a 대비 10배의 몰비로 사용하였다. 상기 혼합물을 자력 교 반(magnetic stirring)(약 500 rpm의 스핀 속도) 및 가벼운 질소 흐름(gentle nitrogen flux) 하에 실온에서 밤새 유지시켰다(반응 시간 = 16시간 40분). 그 후, 상기 용액을 증발시키고 고형 잔류물을 300 ㎕의 DMSO로 처리하였다. 원하는 생성물을 수득하기 위해 상기 혼합물을 C18 컬럼 상에서 RP-HPLC에 의해 정제하였다(약 61/39 ACN/H2O 구배에 해당하는 피크). 4회의 후속 정제 공정의 상응하는 분획들을 모으고 ACN 증발에 의해 건조시킨 후, 동결-건조시켰다. MALDI-TOF 분석은 생성물의 K-252a-PEG1100 컨쥬게이트와의 동일성을 확인했다.
참고문헌
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Delsite R et al., "Antiproliferative effect of the kinase inhibitor K252a on human prostatic carcinoma cell lines", J. Androl. 17:481-490, 1996
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Claims (35)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 하기 식 (III)으로 표시되며:
    Figure 112013055884817-pct00008
    식 (III)
    식 중에서, R1 및 R2는 동일하거나 또는 상이한 잔기이고 각각 독립적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되고,
    수소, 할로겐, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 히드록시, 저급 알콕시, 카르복시, 저급 알콕시카르보닐, 아실, 니트로, 카르바모일, 저급 알킬아미노카르보닐, R5 및 R6는 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴, 치환 또는 미치환 아랄킬, 치환 또는 미치환 저급 알킬아미노카르보닐, 치환 또는 미치환 저급 아릴아미노카르보닐, 알콕시카르보닐, 카르바모일, 아실로부터 선택되거나 또는 R5 및 R6는 헤테로시클릭기로부터의 질소 원자와 결합되는 것인 -NR5R6,
    R3은 수소, 할로겐, 아실, 카르바모일, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐 또는 아미노이고; 및
    W1 및 W2는 독립적으로 수소, 히드록시이거나 또는 W1 및 W2는 함께 산소를 나타내며;
    X는 -L1-X'을 나타내고 Y는 -L2-Y'을 나타내며, 상기에서 X' 및 Y'중 하나 이상은 L1 및 L2중 하나 이상에 의해 식 (III)의 화합물의 테트라히드로푸란 고리에 결합된 직선형 또는 분지형 중합체이고; L1 및 L2는 공유 화학 결합 또는 링커 기이며;
    Y'이 중합체이고, X'이 중합체가 아닌 경우, L1은 공유 화학 결합이고, X'은 하기로 구성된 군으로부터 선택되며:
    (a) 수소, 저급 히드록시알킬, 아실, 카르복시, 저급 알콕시카르보닐,
    (b) R17a 및 R17b는 각각 독립적으로
    (i) 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐,
    (ii) R18은 히드록시인 -CH2R18, 또는
    (iii) R19 또는 R20은 각각 독립적으로 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐로부터 선택되거나, 또는 R19 또는 R20은 독립적으로 카르복시기의 히드록시기가 배제된 것인 α-아미노산의 잔기이거나, 또는 R19 또는 R20은 질소 원자와 조합되어 헤테로시클릭 기를 형성하는 것인 -NR19R20;로부터 선택되는 것인 -CONR17aR17b, 및
    (c) R21은 히드록시, 저급 알콕시, 아미노, 구아니디노, 또는 이미다졸릴아미노인 것인 -CH=N-R21;
    X'이 중합체이고, Y'이 중합체가 아닌 경우, L2는 공유 화학 결합이고, Y'은 히드록시, 저급 알콕시, 아랄킬옥시 또는 아실옥시로부터 선택되는 것인 중합체 컨쥬게이트, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염으로서,
    상기 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 메톡시-폴리에틸렌 글리콜(m-PEG)로부터 선택되고,
    상기에서 용어 "저급 알킬"은 1개 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄형 또는 분지형 알킬기를 의미하고,
    용어 "저급 알콕시"는 1개 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄형 또는 분지형 알콕시기를 의미하며,
    용어 "저급 알케닐"은 직쇄형 또는 분지형일 수 있고, Z형 또는 E형일 수 있는 C2-C6 알케닐기를 의미하고,
    용어 "저급 알키닐"은 직쇄형 또는 분지형일 수 있는 C2-C6-알키닐기를 의미하며,
    용어 "저급 알킬아미노"는 1개 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄형 또는 분지형 알킬기를 갖는 알킬아미노기를 의미하고,
    용어 "저급 알콕시카르보닐"은 1개 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄형 또는 분지형 알콕시기를 갖는 알콕시카르보닐을 의미하며,
    용어 "저급 알킬아미노카르보닐"은 1개 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄형 또는 분지형 알킬기를 갖는 알킬아미노카르보닐을 의미하고,
    용어 "저급 아릴아미노카르보닐"은 6개 내지 14개의 고리 탄소 원자를 포함하는 아릴 모이어티를 갖는 아릴아미노카르보닐기를 의미하며,
    저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 아랄킬, 저급 알킬아미노카르보닐, 및 저급 아릴아미노카르보닐에 부가된 "치환"은 저급 알킬, 히드록시, 저급 알콕시, 카르복실, 저급 알콕시카르보닐, 니트로, 할로겐, 아미노, 모노-저급 알킬아미노, 디-저급 알킬아미노, 디옥솔란, 디옥산, 디티올란, 및 디티온으로부터 독립적으로 선택된 1개 내지 3개의 치환기를 갖는 것을 의미하고,
    치환기 중 저급 알킬 모이어티는 앞서 정의된 "저급 알킬"과 동일한 의미를 갖는 것인 중합체 컨쥬게이트.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제4항에 있어서, 상기 중합체는 100 내지 100,000 Da의 분자량을 갖는 중합체인 것인 중합체 컨쥬게이트.
  8. 제4항에 있어서, 상기 중합체는 2,000 Da 또는 5,000 Da의 평균 분자량을 갖는 PEG 또는 mPEG인 것인 중합체 컨쥬게이트.
  9. 제4항에 있어서, 상기 중합체는 550 Da 또는 1,100 Da의 평균 분자량을 갖는 PEG 또는 mPEG인 것인 중합체 컨쥬게이트.
  10. 제4항에 있어서, 식 (III)의 L1 및 L2중 하나 이상은 카르바메이트, 에테르, 에스테르, 탄소, 아미드 및 아민 결합으로부터 선택되는 것인 중합체 컨쥬게이트.
  11. 제4항에 있어서, 상기 R1, R2, R3, W1, 및 W2는 수소이고, Y'은 중합체이며, X'은 메톡시카르보닐 또는 카르복실인 것인 중합체 컨쥬게이트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 L2은 에테르 또는 카르바메이트 결합인 것인 중합체 컨쥬게이트.
  13. 제4항에 있어서, 상기 R1, R2, R3, W1, 및 W2는 수소이고, X'은 중합체이며, Y'은 히드록시인 것인 중합체 컨쥬게이트.
  14. 제13항에 있어서, 상기 L1은 아민 또는 아미드 결합인 것인 중합체 컨쥬게이트.
  15. 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 아주반트, 희석제 및 첨가제 중 하나 이상과 조합된, 제4항 및 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항의 하나 이상의 중합체 컨쥬게이트를 포함하는, HMGB1-관련 질환의 예방, 경감, 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 HMGB1-관련 질환은 협착, 재협착, 죽상경화증, 류마티스 관절염, 자가면역 질환, 종양, 감염성 질환, 패혈증, 급성 염증성 폐 손상, 홍반성 루푸스, 신경퇴행성 질환, 중추신경계 및 말초신경계 질환 및 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  16. 삭제
  17. 제15항에 있어서, 상기 HMGB1-관련 질환은 협착 또는 재협착인 것인 약학적 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 상기 중합체 컨쥬게이트는 의료 장치의 표면상에 가역적으로 고정화된 것인 약학적 조성물.
  19. 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 아주반트, 희석제 및 첨가제 중 하나 이상과 조합된, 제4항 및 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항의 하나 이상의 중합체 컨쥬게이트를 포함하는, 신경계 질환, 신경병증 및 중추신경계와 말초신경계의 신경퇴행성 질환의 예방, 경감, 또는 치료용 약학적 조성물.
  20. 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 아주반트, 희석제 및 첨가제 중 하나 이상과 조합된, 제4항 및 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항의 하나 이상의 중합체 컨쥬게이트를 포함하는, 피부 질환의 예방, 경감, 또는 치료용 약학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 피부 질환은 각질세포의 과다증식을 특징으로 하는 것인 약학적 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 상기 피부 질환은 건선, 아토피성 피부염, 만성 습진, 여드름, 홍색 비강진(pitiriasis rubra pilaris), 켈로이드, 비후성 반흔(hypertrophic scar) 및 피부 종양으로부터 구성된 군으로부터 선택된 것인 약학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 피부 질환은 건선인 것인 약학적 조성물.
  24. 제20항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 국소 투여용으로 제조되는 것인 약학적 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 투여는 리포좀의 제형으로 이루어지는 것인 약학적 조성물.
  26. 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 아주반트, 희석제 및 첨가제 중 하나 이상과 조합된, 제4항 및 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항의 하나 이상의 중합체 컨쥬게이트를 포함하는, NGF-관련 통증 또는 통각과민의 예방, 경감, 또는 치료용 약학적 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 국소 투여용으로 제조되는 것인 약학적 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 투여는 리포좀의 제형으로 이루어지는 것인 약학적 조성물.
  29. 제26항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 전신 투여용인 것인 약학적 조성물.
  30. 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 아주반트, 희석제 및 첨가제 중 하나 이상과 조합된, 제4항 및 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항의 하나 이상의 중합체 컨쥬게이트를 포함하는, 염증성 질환, 자가면역 질환, 전신성 염증 반응 증후군, 기관 이식 후 재관류 손상, 심혈관 질환(cardiovascular affection), 산부인과 질환(obstetric and gynecologic disease), 감염성 질환, 알레르기 및 아토피성 질환, 고형 종양 및 액체 종양 질환(solid and liquid tumor pathology), 이식 거부 질환, 선천성 질환, 피부 질환, 신경계 질환, 악액질(cachexia), 신장 질환, 의원 중독 상태(iatrogenic intoxication condition), 대사질환 및 특발(idiopathic) 질환, 또는 안과 질환의 예방, 경감 또는 치료용 약학적 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 전신 투여용인 것인 약학적 조성물.
  32. 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 아주반트, 희석제 및 첨가제 중 하나 이상과 조합된, 제4항 및 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항의 하나 이상의 중합체 컨쥬게이트를 포함하는, 베체트병(Behcet's disease), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 혈관염, 포도막염, 또는 망막병증의 예방, 경감 또는 치료용 약학적 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 전신 투여용인 것인 약학적 조성물.
  34. 삭제
  35. 삭제
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